STRUKTURNE LASTNOSTI AMINOKISLIN

AMINOKISLINE Amino-karboksilne kisline (izjema: prolin, iminokarboksilna kislina) Vloga aminokislin: 1. Gradniki proteinov 2. Vir energije 3. Izhodišče za sintezo drugih pomembnih biomolekul (nukleinske kisline, hormoni.) STRUKTURNE LASTNOSTI AMINOKISLIN -C atom Radikal Amino skupina Karboksilna skupina Krogljično-paličasti model Tetraeder AMINOKISLINE SE POVEZUJEJO S PEPTIDNO VEZJO Aminokislini Izločitev vode Peptidna vez Tvorba peptidne vezi N-konec C-konec

AMINOKISLINE - NOMENKLATURA Tri- in enočrkovna koda: Glicin Gly G Treonin Thr T Alanin Ala A Cistein Cys C Valin Val V Tirozin Tyr Y Leucin Leu L Asparagin Asn N Izoleucin Ile I Glutamin Gln Q Prolin Pro P Aspartat Asp D Metionin Met M Glutamat Glu E Fenilalanin Phe P Lizin Lys K Triptofan Trp W Arginin Arg R Serin Ser S istidin is AMINOKISLINE - DELITEV Glede na polarnost stranske skupine: 1. Nepolarne alifatske AK 2. idrofobne aromatske AK 3. Polarne nenabite AK 4. Polarne nabite AK Glede na pojavljanje: 1. AK beljakovinskega izvora (20): - nemodificirane - posttranslacijsko spremenjene 2. Ne beljakovinskega izvora (več kot 100 različnih) NEPOLARNE ALIFATSKE AMINOKISLINE C glicin C C 3 alanin C C valin C 3 C3 C 2 N C 2 C C 2 prolin C C 2 C C 3 C3 C C 2 C C 2 C 3 C 3 leucin izoleucin

IDROFOBNE AROMATSKE AMINOKISLINE C C 2 fenilalanin C C 2 N C C 2 tirozin O triptofan POLARNE NENABITE AMINOKISLINE C C 2 asparagin C O C C 2 serin O C 3 C C 2 C 2 S metionin C C 2 C 2 C O C C C 3 O C C 2 S glutamin treonin cistein POLARNE NABITE AMINOKISLINE C C 2 aspartat C O O C C 2 C 2 lizin C 2 C 2 N 3 + C N + C C 2 C N C C C 2 C 2 C O O C C 2 C 2 C 2 N C + histidin glutamat arginin

NEOBI- ČAJNE 5-hidroksilizin 5-hidroksiprolin Tiroksin 3-metilhistidin AMINO- KISLINE ε-n-metilhistidin ε-n,n,ntrimetillizin Piroglutaminska Aminoadipinska γ-karboksiglutaminska kislina kislina kislina Kemijsko spremenjene po translaciji Pomembne za strukturo in funkcijo proteina Fosfoserin Fosfotreonin Fosfotirozin N-metilarginin N-acetillizin DERIVATI AMINOKISLIN Z BIOLOŠKO FUNKCIJO C 2 C 3 C C C C C C N C 3 C C C C C N Fe 2+ N C 2 C C N C C C 2 C C C C C C COO - C 2 C 2 COO - C 3 C 3 C C 2 Porfirini Nukleotidi Biogeni amini Nevrotransmiterji N N N N N N purini pirimidini + N 3 C 2 C 2 N N histamin O em + O C C 2 O adrenalin C 3 ormoni Dušikov oksid N 3 + - OOCC 2 C 2 C 2 γ-aminobutirat (GABA) DISOCIACIJA AMINOKISLIN Amfoterne snovi, topne v vodi, netopne v organskih topilih. p 1 Neto naboj 1 p 7 Neto naboj 0 p 13 Neto naboj -1 Kation Zwitterion (nevtralen) Anion

pk a VREDNOSTI AMINOKISLIN -karboksilna skupina (-): pk a ~2 -amino skupina ( N 3+ ): pk a ~9 Tudi stranske skupine nekaterih AK (npr. Glu, Asp, Lys, is, Arg) lahko disociirajo i prispevajo k njihovem naboju. Izoelektrična točka (pi) vrednost p, ko je amfoterna molekula nazven elektronevtralna! TITRACIJA GLICINA Izoelektrična točka Ekvivalenti + Ekvivalenti O - Ekvivalenti O - Ekvivalenti + TITRACIJA GLUTAMATA

STEREOKEMIJA AMINOKISLIN Asimetrični -ogljikov atom - vse razen Gly so kiralne D,L-nomenklatura zasnovana na D- in L-gliceraldehidu L-aminokisline prevladujejo v naravi R,S-nomenklatura (za AK z več kiralnimi centri) L- IN D-OBLIKA AMINOKISLIN L-Gliceraldehid D-Gliceraldehid L-Serin D-Serin SPEKTROSKOPSKE LASTNOSTI AMINOKISLIN Vse absorbirajo svetlobo v infrardečem območju Phe, Tyr in Trp absorbirajo UV Absorbcija pri λ = 280 nm - pomoč za zasleditev aromatičnih AK (Phe, Tyr in Trp) NMR spektri značilni za vsako AK CD-spektroskopija - za pojasnitev 3D-zgradbe beljakovin (AK sukajo ravnino polarizirane svetlobe)

ABSORPCIJSKI SPEKTRI AROMATSKI AMINOKISLIN Molarna absorbcija, ε Valovna dolžina λ (nm) PROTEINI (BELJAKOVINE) Linearni polimeri aminokislin, ki se povezujejo s peptidnimi vezmi. Do 10 kda peptidi Več kot 10 kda -proteini Tvorba dipeptida Peptidna vez (amidna) Aminokislina 1 Aminokislina 2 Dipeptid PEPTIDNA VEZ trans položaj ima 40%-ten značaj dvojne vezi dolžina 0.133 nm krajša od enojne in daljša od dvojne vezi dvojna vez zato je 6 atomov peptidne vezi ko-planarnih! N-atom delno elektropozitiven, O-atom elektronegativen

DIMENZIJE PEPTIDNE VEZI KOPLANARNA NARAVA PEPTIDNE VEZI Amidna ravnina -C-atom Radikal Amidna ravnina PEPTIDI Krajši polimeri aminokislin (do cca. 100 AK) Vsako aminokislinsko enoto imenujemo tudi aminokislinski (AK) ostanek N-terminus, C-terminus 2 AK ostanka dipeptid, 3 ostanki tripeptid, itd. 12-20 AK ostankov oligopeptid veliko AK ostankov- polipeptid Biološko pomembni peptidi: - glutation - oksitocin, vazopresin - insulin - enkefalini -aspartam

PROTEINI SESTAVA (I) Sestavljeni iz ene ali več polipeptidnih verig: Ena veriga - monomerni protein >1 veriga - multimerni protein omomultimer ena vrsta polipeptidne verige eteromultimer 2 ali več različnih verig (primer: hemoglobin heterotetramer (2- in 2βverigi) PROTEINI SESTAVA (II) Enostavni: samo aminokisline Sestavljeni: AK + prostetična(e) skupina(e) - glikoproteini - lipoproteini -nukleoproteini - fosfoproteini - metaloproteini (K +, Ca 2+, Zn 2+, itd.) - kromoproteini (hemoproteini, flavoproteini...) PROTEINI VELIKOST Velikost beljakovinskih molekul Velikost: Cca. 10 2,000 kda 5.7 kda 12.5 kda 13.9 kda 17 kda 64.5 kda 150 kda 600 kda

PROTEINI VLOGA VLOGA: Encimi Regulacija Transport Obrambna strukturni proteini Premikanje Komunikacija Shranjevanje PRIMERI: lizocim, polimeraza insulin, transkripcijski faktorji hemoglobin, lipoproteini protitelesa, komplement kolagen, keratin aktin, miozin receptorji, G-proteini feritin PROTEINI ZGRADBA Oblika: globularna (kroglasta), fibrilarna (nitasta) in vse vmes Ravni beljakovinske strukture: - primarna sekvenca AK (kovalentne vezi) - sekundarna - lokalne strukture -vezi - terciarna - celotna 3-D zgradba (tudi: konformacija beljakovine) - kvartarna več podenot organizacija Sekundarno, terciarno in kvartarno strukturo stabilizirajo disulfidne vezi in šibke vezi (vodikove, van der Waalsove, ionske, hidrofobne). RAVNI PROTEINSKE STRUKTURE Primarna Sekundarna -heliks β-ploskev Terciarna Kvartarna

PRIKAZI PROTEINSKE STRUKTURE Primarna zgradba kimotripsina Terciarna zgradba polipeptidna veriga Prostorsko-izpolnjeni model Trakasti model AMINOKISLINSKA SEKVENCA PROTEINA Edinstvena za vsak protein posebej Določena z nukleotidnim zaporedjem DNA (1 gen ~ 1 polipeptidna veriga) Delavna oblika genske informacije Sekvenca: dogovor: zapis od N-konca (aminskega) do C- konca (karboksilnega) (tudi: N- in C-terminus) ZNAČILNOSTI AMINOKISLINSKI ZAPOREDIJ Zaporedje odraža funkcijo proteina Aminokislinski motivi: membranski proteini imajo več hidrofobnih ostankov, fibrilarni imajo netipične sekvence, itd. omologni proteini iz različnih organizmov imajo homologne sekvence AK (npr. citokrom c) Mutacija sprememba AK zaporedja-posledice

Pomen: DOLOČANJE AMINOKISLINSKE SEKVENCE PROTEINA 1. Iskanje homolognih proteinov v podatkovnih zbirkah (Blast, Entrez) 2. Študij evolucijskih odnosov, tvorba filogenetskih dreves 3. Iskanje mutacij 4. Poznavanje zaporedja olajša sklepanje o 3D strukturi proteina DOLOČANJE AMINOKISLINSKE SEKVENCE PROTEINA a) Edmanova degradacija (kemijska metoda) b) Iz cdna (če je znan gen) Iskanje homolognih proteinov v podatkovnih zbirkah ISKANJE OMOLOGNI ZAPOREDIJ V PODATKOVNI ZBIRKA (I) Primer: citolitični protein ostreolizin iz užitne gobe bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) AK sekvenca proteina, določena z Edmanovo degradacijo (40 ostankov): AYAQWVIILINVGQQNVKIKNLNASWGKLYADGDKDTEV Rezultati iskanja v podatkovni zbirki Blast: ostreol. -------------------AYAQWVIILIN-VGQQNVKIKNLNASWGKLYADGDKDTEV 40 Aa-Pri1 -----------MDSNKDERAYAQWVIIILN-VGSSPFKIANLGLSWGKLYADGNKDKEV 48 Asp-hemol. --------------MASVQAYAQWVTVLINSMSSETLSIKNASLSWGKWYKDGDKDAEI 46 Cbm17.2 MNNNCEVNCENTEENKSNRAYRQWVKFIEA--VSNLKIRNASLTWGKFDPYNKDIPI 58 Cbm17.1 MNNNCEVNCENTEENKSNRAYRQWVKFIEA--VNEGLKIRNASLKWGKFDPNNKDIPI 58 Sekvenca ostreolizina Sekvence proteinov, že prisotnih v podatkovnih bazah

ISKANJE OMOLOGNI ZAPOREDIJ V PODATKOVNI ZBIRKA (II) Ime (oznaka v bazi podatkov) Ident. Organizem Referenca 1 Ostreolizin protein (50 ak) (P83467) 80% 2 PriA mrna (AAL57035) 79% 3 PlyA mrna (AB177869) 79% 4 13 klonov cdna iz EMBL EST 79% 5 6 Prekurzor aegerolizina Aa-Pri1 mrna (O42717) Prekurzor Asp-hemolizina Asp-S mrna (Q00050) Pleurotus ostreatus Pleurotus ostreatus Pleurotus ostreatus Pleurotus ostreatus 62% Agrocybe aegerita 44% Aspergillus fumigatus 7 Klon cdna iz EMBL EST (BQ583143) 38% Beta vulgaris 8 Klon cdna iz EMBL EST (AU250367) 38% 9 1 0 emolizinu podoben protein gen cbm17.1 (CAA71483) ipotetičen protein v genomu P. aeruginosa, sev UCBPP-PA14 (ZP_00140537) 32% 32% Lolium multiflorum Clostridium bifermentans Pseudomonas aeruginosa Berne in sod., 2002 Ma in Kwan, 2000 (neobjavljeno) Sakurai in sod., 2004 Lee in sod., 2002 Fernandez- Espinar in Labarère, 1997 Ebina in sod., 1994 erwig in sod., 2002 Ikeda,S., 2004 (neobjavljeno) Barloy in sod., 1998 Montgomery in sod., 2002, 2003 (neobjavljeno) CITOKROM c RAZNOLIKOST PRI RAZLIČNI ORGANIZMI Število razlik v AK-ostankih FILOGENETSKO DREVO CITOKROMA c Razlika! Prednik Cit c

MUTACIJE Mutacija sprememba AK zaporedja. Sprememba primarne zgradbe ima posledice: - za višje ravni zgradbe - za funkcijo - za razvoj genskih bolezni Primer: hemoglobinske mutante bs (več različic proteina v populaciji): pojav anemije srpastih eritrocitov SRPASTOCELIČNA ANEMIJA (I) emoglobin: heterotetramer (2- in 2β-verigi) β Mutacija v β-podenoti: Gluβ6Val (bs-hemoglobin) pojav genske bolezni β Afrika: lokalno do 40% populacije heterozigotov za anemijo bs - heterozigoti: odpornost na Plasmodium falciparum - malarijo - homozigoti: smrt Normalni eritrocit Srpasti eritrocit KEMIJSKE VEZI, KI STABILIZIRAJO STRUKTURO PROTEINA Primarna struktura: - peptidna (kovalentna) vez Primarna zgradba določa način zvitja in vse višje zgradbe proteina, ter njegovo funkcijo. Sekundarna, terciarna in kvartarna struktura: - disulfidna (kovalentna) vez - šibke vezi (vodikove vezi, ionske interakcije, van der Waalsove interakcije, hidrofobne interakcije)

ZVIJANJE POLIPEPTIDNE VERIGE Celotna informacija o načinu zvijanja je zapisana v primarni strukturi proteina. Amidna ravnina Peptidna vez je v fizioloških pogojih vrtljiva samo med C-atomom in atomi peptidne vezi. -C-atom Radikal Amidna ravnina SEKUNDARNA STRUKTURA PROTEINA Lokalne strukture, stabilizirane s -vezmi, ki jih ponavadi tvorijo karbonilni O in amidni : 1) -heliks (-vijačnica) in druge vrste vijačnic (periodična) 2) β-struktura (nagubana ravnina, β-plošča) (sestavljena iz "βvrvice") (periodična) 3) Zanke (β-obrati) (neperiodična) 4) Naključna struktura (neperiodična) -ELIKS Linus Pauling in Robert Corey, 1951 Kasneje: Perutz (analiza keratina) Grafične upodobitve -heliksa: Mioglobin

LASTNOSTI -ELIKSA Število AK-ostankov na obrat: 3.6 Višina dviga na ostanek : 1.5 Å Višina zavoja : 3.6 x 1.5 Å = 5.4 Å Vodikove vezi med n in n+3 AK ostankom 3.6 AK ostanka β-nagubana RAVNINA Linus Pauling in Robert Corey, 1951 N R C O OBLIKE β-nagubane RAVNINE Paralelna Antiparalelna

β-obrat povezuje periodični strukturi (-heliks, β-trak) omogoča spremembo smeri polipeptidne verige karbonilni O enega ostanka je s -vezjo povezan z amidnim vodikom (3 AK ostanka nižje) prolin in glicin prevladujeta TERCIARNA STRUKTURA PROTEINA (KONFORMACIJA) Nastane zaradi zvijanja polipeptidne verige v prostoru idrofobne AK ne morejo tvoriti -vezi z vodo, zato se polipeptidna veriga zvije, da tvorijo najstabilnejšo konformacijo: - voda tvori -vezi s stranskimi skupinami na površini proteina - vode v hidrofobni sredici globularnih proteinov ponavadi ni - disulfidne vezi dodatno stabilizirajo terciarno strukturo proteina PROTEINI OBLIKA Fibrilarni (nitasti) Globularni (kroglasti) -večina polipeptidnih verig v -večina polarnih AK ostankov na površini smeri ene osi molekule v interakciji s topilom (vodo) - prevladuje en tip sek. zgradbe - fibrilarne beljakovine so mehansko -večina nepolarnih ostankov v notranjosti molekule hidrofobne interakcije odporne -običajno netopni v vodi -pakiranje ostankov je tesno -običajno imajo v celicah in ekstracelularno strukturno-mehansko -včasih v notranjosti nekaj molekul vode vlogo - primeri: hemoglobin, mioglobin... - primeri: keratin, fibroin, sericin, kolagen...

-KERATIN - v laseh, nohtih, parkljih, rogovi, perje - AK-zaporedje iz -heliksov (vsak 311-314 AK-ostankov), na N- in C- koncih nehelične strukture - primarna struktura heliksov je iz ponavljajočih se 7 AK-ostankov dolgih zaporedij: (a-b-c-d-e-f-g) n, kjer sta a in d nepolarni AK. Težnja k tvorbi vijačnice N-terminalna domena centralna, -helikalna domena C-terminalna domena -heliks vijačnica iz 2 -heliksov protofilament filament (4 desno-zasukani protofilamenti) FIBROIN - β-nagubana antiparalelna ravnina - sestavina svile - ponavlja se zaporedje: Gly-Ala/Ser-Gly-Ala/Ser... -v β-nagubani ravnini alternirata Gly na eni strani ter Ser in Ala na drugi strani ravnine, kar omogoča tesno pakiranje ostankov iste vrste iz ene in druge β-plošče SERICIN Pajčevina Radialna nit pajčevine

KOLAGEN - poglavitna sestavina vezivnih tkiv (kite, hrustanec, medceličnina...) - M = 285,000 Da - osnovna enota: tropokolagen (3 medsebojno ovite polipeptidne verige, vsaka po 1000 AK) - sestava: - veliko Gly in Pro - neobičajne AK (4-hidroksi-prolin, 3-hidroksi-prolin, 5-hidroksi-lizin), - ogljikovi hidrati (Gal, Glc) - hidroksipiridin 4-hidroksiprolin 3-hidroksiprolin 5-hidroksilizin STRUKTURA KOLAGENSKEGA VLAKNA fibrila mikrofibrila vlakno tropokolagen luknje med posameznimi vzdolžno povezanimi pari molekul tropokolagena -veliko bolj številčni od fibrilarnih GLOBULARNI PROTEINI -obstajajo v velikem številu konformacij -nekateri segmenti so zelo fleksibilni in neurejeni: osnova za konformacijske spremembe -polipeptidna veriga se zvije (skrči), da zakrije hidrofobne ostanke v sredi molekule, stran od vode ( hidrofobno jedro ) -zvijanje se začne v tim. iniciacijskih jedrih -šaperoni: proteini, ki povečajo hitrost nekaterih počasnih stopenj zvijanja (fra. chaperone spremljevalka), sp 60, sp 70 - razvijanje proteinov: denaturacija!

KVARTARNA STRUKTURA PROTEINOV Nekovalentna povezava 2 ali več podenot enake podenote (homomultmeri) različne podenote (heteromultimeri) Tipična K d za dve podenoti: 10-8 do 10-16 M (energija od 50-100 kj/mol pri 37 0 C) Interakcija med podenotami: - izologna (interakcija med identičnimi površinami 2 podenot) - heterologna (interakcija med različnimi površinami 2 podenot) Proteini s kvartarno strukturo so običajno simetrični PREDNOSTI KVARTARNE STRUKTURE Strukturne: - stabilnost: zmanjšanje razmerja površina/volumen molekule Funkcionalne: - genetična ekonomičnost in učinkovitost -kopičenje več katalitičnih mest (npr. multiencimski kompleksi) - kooperativnost pozitivna negativna EMOGLOBIN IN MIOGLOBIN emoglobin (b) in mioglobin (Mb) prenašata in hranita molekulski kisik (O 2 ) Mioglobin: - monomeren - sestavljen iz 153 AK-ostankov - 17,200 Da - vezavna krivulja za O 2 hiperbolična emoglobin: - tetrameren (2 -podenoti (141 AK) + 2 β-podenoti (146 AK) - vezavna krivulja za O 2 sigmoidna - primer pozitivne kooperativnosti in alosterije

VEZAVA KISIKA NA b IN Mb Delujoča mišica Mirujoča mišica Procent nasičenja O 2 Venozni Mioglobin Arterijski Parcialni tlak kisika (po 2 mm g) MIOGLOBIN, IN β-globin Mioglobin (Mb) -globin (b) β-globin (bβ) Funkcija: skladiščenje kisika v mišici em: -v fero (Fe 2+ )-obliki: veže kisik -v feri (Fe 3+ )-obliki: ne veže kisika (metmioglobin) MIOGLOBIN hem (Fe 2+ ) hematin, (Fe 3+ )

EM IN VEZAVA O 2 IN CO Mb brez vezanega liganda: deoksimioglobin Prosti hem in imidazol Mb : CO kompleks Oksi-mioglobin MIOGLOBIN VEZAVA KISIKA Vezava O 2 spremeni konformacijo Mb: Brez vezanega O 2 je Fe 2+ izven ravnine hema - vezava O 2 potegne Fe 2+ v ravnino hema Fe 2+ potegne is F8 s seboj F-heliks se med vezavo O 2 premakne Celoten premik Fe 2+ : 0.029 nm (0.29 A) Ta sprememba je bolj pomembna v b vpliv na druge podenote! eterotetramer ( 2 β 2 ), 64.45 kda EMOGLOBIN Funkcija: veže kisik v pljučih (po 2 = 100 torr) in ga oddaja v kapilarah (po 2 = 40 torr) Kontakti 1 β 1 in 2 β 2 : obsežni in pomembni za tvorbo IV-strukture, negibljivi Kontakti 1 β 2 in 2 β 1 : gibljivi, omogočajo konformacijske spremembe Od spredaj: Od strani:

KONFORMACIJSKA SPREMEMBA EMOGLOBINA Deoksi-b Oksi-b Konformacija 1 Napeto stanje (T-stanje) Konformacija 2 Sproščeno stanje (R-stanje) VEZAVA KISIKA NA b IN Mb Delujoča mišica Mirujoča mišica Procent nasičenja O 2 Venozni Mioglobin Arterijski Parcialni tlak kisika (po 2 mm g) BOROV EFEKT Vezava + zmanjša vezavo O 2 na b in Mb, in obratno pomembne fiziološke posledice! Tudi 2,3-bifosfoglicerat ima podoben efekt! goli b % nasičenja

bf in ba VEZAVA KISIKA ba adultni b bf fetalni b