vaja Kvan*ta*vno določanje proteinov. 6. vaja Kvan*ta*vno določanje proteinov. 6. vaja Kvan*ta*vno določanje proteinov

Transcript

1 UV- spektrofotometrija Biuretska metoda Absorbanca pri λ=28 nm (A28) UV- spektrofotometrija Biuretska metoda vstopni žarek intenziteta I Lowrijeva metoda Bradfordova metoda Bradfordova metoda Lowrijeva metoda lučka izstopni žarek intenziteta I monokromator λ=28 nm absorbanca kiveta z vzorcem (debelina l) 1

2 Absorbanca pri λ=28 nm (A 28 ) T = I I transmitanca A = - log T absorbanca molarni ekslnkcijski koeficient [M - 1 cm - 1 ] A 28 = ε 28 c l množinska koncentracija [M] dolžina opične pol (debelina kivete) [cm] Velja približek: če je absorbanca = 1 je koncentracija enaka 1 mg/ml Metoda temelji na spremljanju absorbance pri λ=28 nm, kjer absorbirata predvsem aminokislini triptofan in Lrozin. 2 3 µg/ml hitra nedestruklvna poceni močno odvisna od aminokislinske sestave sestava pufra vpliva na absorbanco SICER HITRA IN POCENI METODA, A NENATANČNA TER ODVISNA OD SESTAVE PROTEINA 2

3 y Kolorimetrične metode Kolorimetrične metode niso absolutne, kar pomeni, da za določevanje koncentracije proteinov potrebujemo UMERITVENO KRIVULJO. x y 35 Za določevanje koncentracije proteinov v neznanem vzocu moramo pripravil umeritveno krivuljo, kar pomeni, da za znane koncentracije znanega proteina izmerimo absorbance pri želeni λ. - umeritvena krivulja ni linearna v celotnem območju umeritvena krivulja - pozorni moramo bil na izbiro znanega proteina za izdelavo umeritvene krivulje - umeritvena krivulja mora bil narejena v ustreznem območju x y = 3x za izdelavo umeritvene krivulje uporabimo protein v enakem pufru, kot se nahaja naš vzorec, da pri meritvi upoštevamo prispevek raztopine Za določevanje koncentracije proteinov v neznanem vzocu moramo pripravil umeritveno krivuljo, kar pomeni, da za znane koncentracije znanega proteina izmerimo absorbance pri želeni λ. C (BSA) [µg/ml] A 28 5,25 1,2 1 - najpogosteje kot znan protein uporabimo BSA (angl. Bovine serum albumin). - sicer bi bilo najbolje dobil protein, ki je čimbolj podoben našem (npr. če želimo v vzorcu določal koncentracijo prolteles IgG kot standard uporabimo znane koncentracije čistega IgG). - pazimo na ustrezno koncentracijsko območje! 1,5 2,1 3,15 5,25 1,5 2 1 c(prot.) [µg/ml]? A 28,35 A (28 nm),8,6,4, c(bsa) [mikrog/l] c(prot.) = 7 µg/ml Series1 y =,5x (, ), ker če ni proteina, ni absorbance!!! 3

4 Biuretska metoda 1,2 1 Protein + CuSO 4 vijolično obarvana snov 2 µl vzorca 8 µl dh 2 O A (28 nm),8,6,4, c(bsa) [mikrog/l] Series1 y =,5x c(prot.) = 7 µg/ml Če, da smo vzorec v kivel redčili (5x redčenje), moramo to upošteval pri podaji končnega rezultata! V tem primeru je končna koncentracija proteinov v našem vzorcu 35 µg/ml. hpp://en.wikipedia.org/wiki/biuret_test; Biuretska metoda Metoda temelji na reakciji pepldne vezi z bakrom v bazičnem in v prisotnosl kalij- natrijevega tartrata, kar povzroči formacijo violičnega kompleksa mg/ml primerna metoda za vse proteine dobro ponovljiva METODA PRIMERNA ZA VSE PROTEINE, A PREVEČ SLABO OBČUTLJIVA ZA RUTINSKO UPORABO obupno slabo občutljiva metoda dolgotrajna priprava reagentov, slaba obstojnost (sveža priprava) vpliv drugih snovi v raztopini (urea...) deluje samo za večje od tripepldov Lowrijeva metoda Protein + CuSO 4 + Folin- Ciocalteu r. 3H2O x P2O5 x 13WO3 x 5MoO3 x 1H2O" 3H2O x P2O5 x 14WO3 x 4MoO3 x 1H2O modro obarvana snov hpp://

5 Lowrijeva metoda Podobno kot biuretska metoda temelji na reakciji med pepldno vezjo in bakrom, vendar redukcija Folin- Ciocalteujevega reagenta povzroči nastanek violočno obarvanega kompleksa. 2 1 µg/ml primerna metoda za vse proteine občutljiva na širokem področju zelo občutljiva v primerjavi tudi z UV METODA JE ZELO OBČUTLJIVA, A JO MOTI VELIKO SNOVI, KI SE JIH UPORABLJA PRI IZOLACIJAH PROTEINOV metodo mol veliko snovi (citrate, cistein, DTT, EDTA, HEPES, merkaptoetanol, Nonidet P- 4, fenol, Tricin, TRIS in Triton X- 1). razkrajanje molibdenskega barvila nujna prisotnost Lrozina Bradfordova metoda Bradford ina! 47 nm 595 nm Bradfordova metoda Metoda temelji na vezavi Coomassie Brilliant Blue (CBB) na proteine v kislem, saj se veže na pozilvno nabite (arginin, hisldin, lizin) in aromatske aminokisline. Vezava povzroči spremembo absorbcijskega vrha CBB s 47 na 595 nm. 1 2 µg/ml hitra in poceni visoko specifična za proteine zelo občutljiva kompalbilna z mnogimi snovmi nelinearnost, prekrivanje obeh spektrov NAJPRIMERNEJŠA METODA ZA OBČUTLJIVO DOLOČEVANJE KONCENTRACIJE PROTEINOV Potek vaje - priprava umeritvene krivulje z znanimi koncentracijami BSA - priprava vzorcev za meritve z Bradfordovo metodo - določanje absorbance (28 nm) in določitev koncentracije proteinov v vzorcih 5