Biochimia moleculelor informaţionale 11.I. 2018-1100-1500 Metabolismul ADN-ului 3 Degradarea ADN-ului si a nucleotidelor
Catabolismul ADN-ului Structura şi mecanismele de reparaţie fac ca molecula de ADN să fie una deosebit de stabilă comparativ cu alte macromolecule molecule biologice. ADN-ul genomic al unei celule nu este degradat în procesele metabolice normale pe parcursul vieţii celulare. Nu se poate vorbi despre un timp de înjumătăţire al moleculei (sau moleculelor) de ADN din genomul unei celule. Procesele catabolice prin care sunt degradate molecule de ADN apar în pentru: 1. molecule de ADN străin ajuns prin deiverse mecanisme în interiorul celulei (Cum?) 2. fragmente rezultate din mecanismele de reparaţie, cu predilecţie NER Enzimele implicate în degradarea acizilor nucleici se numesc nuclease fosfodiesteraze ce pot acţiona asupra ADN-ului - Deoxiribonucleaze (DN-aze) sau asupra ARN-ului - Ribonucleaze (RNaze). Funcţie de modul de acţiune şi produşii rezultaţi, nucleazele se clasifică în: 1. exonucleaze hidrolizeză căte o bază azotată din unul din capetele moleculei de ADN; - pot funcţiona într-o singură direcţie, fie 3 5 fie 5 3 ; - produsul de reacţie sunt nucleotide libere; 2. endonucleaze hidrolizează o legătură fosfodiesterică din interiorul moleculei de ADN. - pot hidroliza o singura catena sau simultan ambele catene; - produsul de reacţie este reprezentat din 2 molecule de ADN rezultate prin clivarea substratului
Endonucleazele de restricţie O clasă specifică de nucleaze este reprezentată de endonuclezele de restrictie (sau restrictaze). Restrictazele clivează specific moleculele de ADN dublu catenar după recunoaşterea unei scurte secvenţe (4-8 nucleotide) de nucleotide palidromice. Secvenţa specifică se numeşte situs de restricţie, iar enzima clivează 2 legături fosfodiesterice, una de pe o catenă, alta de pe cealaltă catenă. Restrictazele se clasifică în: 1. restrictaze de de tip I cliveză în mod aleatoriu molecula de ADN şi produc fragmente cu fosfat în 5 şi OH în 3 ; 2. restrictaze de de tip II cliveză molecula de ADN dublucatenar în mod specific, în situsuri foarte clar definite. Clivarea se poate realiza la nivelul axei de simetrie a situsul de restricţie, fragmentele rezultate având extremităţile drepte, sau decalat fată de axa de simetrie, fragmentele rezultate avănd capetele monocatenare şi complementare (capete coezive); 3. restrictaze de de tip III recunosc specific situsuri foarte clar definite din molecula de ADN pe care o clivează la o distanţă dată de situs; capetele formate sunt coezive; 3. restrictaze de de tip IV acţioneză asupra ADN-ului modificat chimic; Iniţiala numelui genului urmată de primele 2 litere ale denumirii speciei Cu numere romane se indică a căta restrictază este identificată în tulpina dată Tulpina specifică din care a fost izolată EcoRV Palidrom ( palin -inapoi, dromos drum) cuvinte, fraze sau secvenţe ce au aceeaşi semnificaţie indiferent de sensul în care sunt citite.
Degradarea nucleotidelor Sinteza de-novo a nucleotidelor este un proces complex si costisitor din punct de vedere energetic. De accea, bazele şi nucleotidele libere rezultate din liza ADN-ului nu sunt degradate ci sunt reultilizate. În organismul uman, 90% din bazele purinice libere (adenină şi guanină) sunt reconvertite în nucleotid monofosfat prin cuplarea cu fosforibozil-pirofosfat. Bazele pirimidinice sunt mai putin reutilizate. a. Degradarea nucleotidelor purinice se iniţiază prin clivarea restului ribozofosfat şi modificarea bazei azotate cu obţinerea acidului uric. Acesta poate fi excretat ca atare sau convertit la alantoină. Adenozină Xantină Xantin-oxidază Excretat la primate, păsări şi reptile Inozină Guanozină Acid uric Acidul uric are o solubilitate redusă în apă. Acumularea lui în exces datorită unor disfuncţionalităţi metabolice duce la depunerea sub formă de cristale în articulaţii gută. Uricază Excretată la majoritatea mamiferelor Hipoxantină Alantoină Acid alantoic Xantină Guanină
Degradarea nucleotidelor b. Degradarea nucleotidelor pirimidinice - se iniţiază în mod similar prin clivarea restului ribozo-fosfat şi eliberarea bazelor azotate. Acestea sunt apoi degradate prin clivarea inelului pirimidinic cu obţinerea de intermediari solubili în apă. Citozină Timină Uracil Dihidrouracil N-carbamoilβ-alanină β-alanină Dihidrotimină N-carbamoil-βamino-izobutirat β-amino-izobutirat
Metabolismul ARN 11.I. 2018-1600-2000
DOGMA CENTRALĂ A BIOLOGIEI MOLECULARE Transcriere (transcripție) ADN Secvenţă de nucleotide (A;T;G;C) Nucleu Informaţie ARN Secvenţă de nucleotide (A;U;G;C) Traducere (translație) Informaţie Proteine Secvenţă de aminoacizi Ribozomi (citoplasmă) Expresia informației genetice stocate în ADN presupune realizarea a 2 procese distincte: Transcrierea (transcripția, transcription, engl.) informației genetice procesul de copiere a informație genetice din molecula de ADN prin sinteza pe baza complementarității bazelor azotate a unei molecule de ARN. Sinteza este realizată de o ARN-polimerază ADN dependentă. informația este simultan copiată și transpusă din limbajul ADN (A;T;G;C) în limbajul ARN (A;U;G;C) are ca rezultat sinteza a trei tipuri distincte de ARN: ARN ribozomal (ARNr) împreună cu proteinele ribozomale alcătuiesc ribozomii ARN mesager (ARNm) copii ale secvenței de ADN ce asigură transportul informației din nucleu spre ribozom și specifică ce aminoacizi vor fi încorporați în structura catenei de aminoacizi ARN de transfer (ARNt) asigură atât transportul aminoacizilor din citosol în ribozomi cât și poziționarea corectă a acestora în catena polipeptidică Traducerea (translația, translation, engl.) informației genetice procesul de convertire a secvenței de nucleotide din molecula de ARNm într-o secvență de aminoacizi ce va forma catenă polipeptidică. Procesul are loc la nivelul ribosomilor (ARNr) cu participarea activă a ARNt
Sinteza ARN-ului sau transcrierea Sinteza ARN-ului se realizeză prin copierea secvenţei de nucleotide de pe una din catenele de ADN în cadrul procesului numit transcriere şi realizat de enzima ARNpolimerază. Enzima catalizează formarea legăturilor fosfodiesterice între ribonucleotide şi sinteza unei molecule de ARN pe baza complementarităţii cu o catenă de ADN matriţă conform reacţiei: (NMP)n + NTP -> (NMP)n+1 + PPi Catena de ADN ce nu este folosită ca matriţă are acceaşi secvenţă cu a copiei ARN (T este înlocuit cu U) şi se numeşte catenă codificatoare (sens sau +) deoarece conţine informaţia genetică. Catena matriţă se numeşte catenă antisens (-). La eucariote au fost descrise 3 ARN-polimeraze distincte: ARN polimeraza I transcrie regiunile ce codifică ARNr ARN - polimeraza II sintetizează ARNm ARN polimeraza III - transcrie regiunile ce codifică ARNt ARN-polimeraza de la bacterii conţine 5 subunităţi: două subunităţi a implicate în mecanismele de reglaj ale transcrierii o subunitate b' ce se leagă de catena ADN matriţă o subunitat b ce leagă nucleotidele necesare sintezei ARN o subunitate s ce recunoaște promotorul şi iniţiază transcrierea propriu-zisă. Indiferent de tipul de polimerază, iniţierea transcrierii este dependentă de ataşarea enzimei de catena ADN matriţă la nivelul unei secvenţe promotor amplasată pe catena de ADN în amonte de locul de start al transcrierii. La procariote, promotorul este alcătuit din 2 secvenţe: secvenţa 35 - succesiunea de baze TTGACA amplasată cu 35 de nucleotide înainte de locul de start al transcrierii. secvenţa 10 succesiunea de baze TATAAT amplasată cu 10 de nucleotide înainte de locul de start al transcrierii. La eucariote, promotorul conţine secvenţa TATAAA numită TATA box şi amplasată cu 25 de nucleotide înainte de locul de start al transcrierii.
Etapele sintezei ARN 1. Iniţierea constă în recunoaşterea de către subunitatea s a secvenţei -10 a promotorului (TATA box la eucariote) şi legarea ARN-polimerazei de promotor. Odată legată, enzima de-spiralizează dublul helix ADN pe o porțiune de aprox. 17 nucleotide şi expune cele două catene. 2. Elongarea transcrierea propriu-zisă începe prin ataşarea unei molecule de ATP sau GTP ce oferă un capăt 5' liber. De aici, pe baza complementarităţii cu catena anti-sens se sintetizeză o catenă ARN în direcţia 5'->3'. Ansamblul alcătuit din ARN-polimerază, porţiunea de ADN despiralizat şi copia ARN alcătuiesc aşa numita bulă de transcriere. În interiorul bulei, primele 8-12 baze ale copiei ARN formează temporar un dublu helix cu catena antisens. Bula de transcriere se mișcă de-a lungul catenei moleculei ADN cu viteza de 50-90 baze/sec. Bula de transcriere Catenă sens Despiralizare Respiralizare Catenă matriţă (antisens) ARN-polimeraza Copie ARN Complex ADN-ARN Situs activ Direcția de deplasare 3. Terminarea la finalul mesajului de copiat există semnale de terminare a transcrierii sub forma unor zone bogate în GC. ARN-polimeraza este frânată de aceste zone şi complexul ADN-ARN se desprinde de bula de transcriere.
Catena sens vs catenă antisens Catenă sens (+) 5' ATGGCTAGGGCCGCAAGGGAAATGGAGAGGGAATAA 3' 3' TACCGATCCCGGCGTTCCCTTTACCTCTCCCTTATT 5' ADN Catenă antisens (-) Transcriere 5' AUGGCUAGGGCCGCAAGGGAAAUGGAGAGGGAAUAA 3' ARNm M A START Traducere Catenă polipeptidică R A A R E M E R E STOP Cadru de lectură cu sens MARAAREMERE 5' AUGGCUAGGGCCGCAAGGGAAAUGGAGAGGGAAUAA 3' C L G P Q G L W R Cadru de lectură fără sens (non-sens)
Modificări post-transcriere ale ARN-ului Molecula nou sintetizată de ARN reprezintă o copie primară ce este apoi modificată în mod specific printr-un proces numit procesarea sau maturarea ARN-ului. Modificările au în principal rolul de a proteja molecula de ARN de RN-azele celulare, dar şi rol funcţional. Principalele tipuri de modificări post-transcreire ale ARN-ului sunt: 1. Adăugarea la capătul 5 al ARNm a 7-metil-guanozinei 5 - cap; 2. Splicing-ul intronilor şi exonilor în cazul ARNm; 3. Adăugarea unei cozi polia la capătul 3 al ARNm poli(a) tail; 4. modificarea chimică a bazelor azotate în ARNt şi ARNr Modificările 1-3 sunt în general specifice eucariotelor, iar 4 apare EK și la PK
1. Procesarea la capătul 5 al ARNm Majoritatea moleculelor de ARNm la EK au în capătul 5 un aşa numit 5 -cap alcătuit din: 1. un rest de 7-metil-guanozină legat printr-o legătură 5 5 trifosfat de prima nucleotidă a catenei ARNm. Ataşarea nucleotidei modificate se face printr-o reacţie de condensare între GTP şi trifosfatul de la capătul 5 al catenei ARN, urmată de o metilare la N7. 2. În mod frecvent, dar nu întodeauna, grupe metil în poziţiile 2 pentru primele 2 nucleotide din copia ARN. Rolul modificărilor din 5 : - protejarea împotriva RN-azelor; - recunoaşterea de către ribozomi a ARNm ce trebuie tradus 7-metilguanozina Legătură 5,5 trifosfat Uneori metilat Uneori metilat
2. Splicing-ul ARNm La bacterii, genele sunt continuii, în sensul că o porțiune de ADN este colineară cu catena polipeptidică (proteina) pe care o codifică. La eucariote însă, genele contin porţiuni ce se regasesc în catena polipeptidică (sunt copiate în ARNm şi traduse, se numesc exoni) şi zone care nu se re-găsesc în catena polipetidică finală (sunt copiate în ARNm dar nu sunt traduse în aminoacizi, introni). Exoni codifică în general 30-60 de aminoacizi şi au deci dimensiuni între 100-200 nucleotide (rar peste 1000 de nucleotide). Intronii au între 50 şi 20 000 nucleotide. ARN-ul mesager primar la eucariote, dar şi la câteva eubacterii şi arheobacterii, este așadar un mozaic de exoni ce alternează cu introni, aceşia din urmă fiind majoritari. Înainte de a fi tradus în proteine, intronii sunt eliminaţi prin procesul de splicing ARNm. Funcţie de mecanismul molecular al procesului de splicing, au fost descrişi 4 clase de introni: 1. grupa I intronii se elimină autocatalitic, prin reacţii de trans-esterificare în care este implicată o guanozină; 2. grupa II - intronii se elimină autocatalitic, prin reacţii de trans-esterificare în care este implicat un rest de A din structura intronului; 3. introni spliceosomali introni ce sunt eliminaţi prin acţiune catalitică a unui ansamblu molecular complex numit spliceosom; 4. introni ARNt intronii sunt eliminați prin acţiunea catalitică a unor endonuclease specifice.
2. 1. Mecanismul molecular al eliminării intronilor din grupa I Intronii din grupa I se găsesc în gene nucleare mitocondriale şi cloroplastice ce codifică ARNm, ARNr sau ARNt şi reprezintă unul din rarele exemple de splicing la bacterii. Procesul de splicing: - necesită un rest de guanozină pentru ca procesul catalitic să se desfășoare, dar cofactorul Copie primară nu este folosit ca sursă de energie; - nu necesită intervenția altor proteine; - este auto-catalitic moleculele de ARN ce conțin acest tip de introni au fost numite ribozime; - restul OH din 3 al guanozinei are rol nucleofil și formează o legătură 3,5 obişnuită cu capătul 5 al intronului; grupa OH formată la capătul 3 al exonului joacă acelaşi rol de reactant nucleofil şi realizeză aceeași recţie cu capătul 3 al intronului. OH din 3 al guanozinei atacă restul fosfat 5 al intronului; 3 OH din exon realizeză un atac nucleofilic şî finalizeză reacţia ARNm procesat Mecanismul chimic al atacului nucleofil şi realizarea reacţiei de transesterificare
2. 2. Mecanismul molecular al eliminării intronilor din grupa II Intronii din grupa II se găsesc în gene nucleare mitocondriale şi cloroplastice din fungi, alge, plante şi rar în bacterii. Intron Procesul de splicing: - este auto-catalitic şi nu necesită intervenția Copie ARNm primară altor molecule; - mecanismul de reacţie este similar cu al intronilor din grupa I, însă atacul nucleofil este realizat de OH 2 al unei A din structura OH 2 al unei A specifice atacă în 5 situsul de intronului splicing ce desparte exonul Legătură 2, 5 fosfodiesterică - apare un intermediar ARNm circular similar cu de intron un lasso în care A formează trei legături fosfodiesterice; - OH 3 al exonului funcţionează ca nucleofil şi atacă capătul 5 al exonului următor. Intronul este eliminat sub forma unui molecule circulare ramificate, iar exonii sunt legaţi formând ARNm Intermediar circular matur. OH 3 al exonului atacă în situsul de splicing al intronului cu exonul următor ARNm procesat Adenoyina implicată în reacţie formează 3 legături fosfodiesterice
2. 3. Procesarea intronilor spliceosomali În cazul majorităţii intronilor, procesul de splicing nu este auto-catalitic. Aceşti introni nu sunt denumiţi cu un număr de grupă şi includ intronii din genele nucleare. Mecanismul de splicing presupune formarea aceluiași intermediar circular similar cu un lasso, dar este catalizată de un complex nucleoproteic de dimensiuni mari numit spliceosom ce este alcătuit din: - nucleoproteine numite small nuclear ribonucleoproteins snrnps - cinci tipuri de ARN nuclear de 100-200 nucleotide numite small nuclear RNAs (snrnas) şi notate U1, U2, U4, U5, U5. Fiecare snrnp conţine câte un tip de snrna. Intronii spliceosomali au în general secvenţele dinucleotidice GU şi AG la capătul 5 şi respectiv 3 ce marchează situsul de clivare. snrna U1 conţine o secvenţă complementară cu cea din 5 a intronilor şi se leagă de aceasta, ceea ce permite apoi legare U2, U4, U5 şi U6 şi formarea spliceosomului propriu-zis. Procesul de ansamblare a complexului molecular necesită energie, dar clivarea intronului şi ligarea exonilor nu.
3. Procesarea la capătul 3 al ARNm La capătul 3 majoritatea moleculelor de ARNm eucariot au o secvenţă de 80 250 resturi de A ce alcătuiesc aşa numita coadă poli(a). De această coadă se asociază proteine specifice protejează molecula de ARN împotriva degradării de către RN-aze. Coada se atașează în timpul transcrierii, într-un situs marcat de: - secvenţa înalt conservată 5 AAUAAA3 amplasată 10-30 nucleotide în amonte de situsul de ataşare; - o zonă bogată în G şi U aplasată 20-40 de nucleotide în aval de situsul de ataşare Procesul ataşării cozii poli(a) presupune parcurgerea mai multor etape: - transcrierea moleculei de ARNm depăşeşte locul de ataşare şi se sintetizează astfel ARN în exces; - o endonuclează se ataşează de ARN polimeraza II şi secționează excesul de nucleotide; - se generează astfel un OH 3 liber la care sunt ataşate A de către o poliadenilat-polimerază după reacţia: ARN + natp --- ARN-(AMP)n + nppi
Imagine generală asupra procesării moleculei de ARNm
4. Procesarea ARNr şi ARNt Atât la PK cât şi la EK, ARNr este produs sub forma unui pre-arn ribozomal sintetizat de polimeraza Pol I cu dimensiuni mari și care conține toate tipurile de ARNr. Astfel, la bacterii pre-arnr are 6500 de nucleotide şi conţine ARN-ul 16S, 23S şi 5S. La eucariote, prearnr are 45S şi conține ARNr specific, adică 18S, 28S şi 5,8S. După sinteză, prearnr este maturat prin metilări specifice şi clivări similare procesului de splicing. Clivările sunt realizate de RNaze specifice precum RN-aza P, RN-aza III sau RN-aza E, iar excesul de nucleotide este înlăturat de nucleaze. Procesarea pre-arnr la bacterii Procesarea pre-arnr la eucariote
4. Procesarea ARNr şi ARNt ARNt este şi el sintetizat sub forma unui precursor de dimensiuni mult mai mari decât produsul final. Maturarea ARNt preuspune: - clivarea enzimatică dacă ARNt primar conţine mai multe tipururi de ARNr; - eliminarea excesului de nucleotide din capătul 5 prin acţiunea RN-azei P; - eliminarea excesului de nucleotide din capătul 3 prin acţiunea RN-azei D; - ataşarea la capătul 3 al trinucleotidei CCA de care se va ataşa aminoacidul specific ARNt. Ataşarea este realizată de o RNAt-nucleotidil-transferază ce nu are nevoie de ADN pt a sintetiza secvenţa de 3 nucleotide ARN; - metilarea, deaminarea sau reducerea specifică a unor baze azotate.
Catabolismul RNA Spre deosebire de ADN, moleculele de ARN sunt mult mai puţin stabile. Concentraţia citoplasmatică a ARN (sau oricărei molecule) depinde de 2 factori: - viteza de producere vs. rata de degradare. În cazul ARNm, echilibrul dintre cele 2 procese face parte integrantă din procesul de reglaj al activităţii genelor. Timpul de înjumăţăţire mediu al unei molecule de ARNm la EK este de 3 ore, iar la PK este de 1.5 min. Timpul de înjumătăţire al ARNm variază însă în limite foarte mari: - căteva secunde dacă produsul unei gene este necesar în cantiţăţi mici (factori de transcriţie); - căteva generaţii celulare dacă produsul este necesar constant în celulă (tubulină); ARN- ul este degradat de ribonucleazele celulare. În PK, procesul contă în atacul unor endoribonucleaze urmate de atacul 3 5 al exoribonucleazelor; La EK inferioare, este eliminată coada polia, apoi capătul 5`, molecula fiind degradată în direcţia 3 5 La EK superioare, ARN-ul este degradată în direcţia 5 3 de un complex de 10 exoribonucleaze ce poartă numele de exozom. Nucleotidele eliberate sunt fie refolosite pentru sinteza de catene noi de ARN, fie degradate prin căi similare cu deoxinucleotidele (discutate anterior).