Clasificarea enzimelor Baze de date pentru enzime Baze de date generale Baze de date specifice Shewale Enzyme everywere - 1996
Bazele de date generale ExplorEnz http://www.enzyme-database.org/
Bazele de date generale
ExplorEnz Bazele de date generale
Bazele de date generale SIB-ENZYME https://enzyme.expasy.org/
Bazele de date generale IntEnz Integrated relational Enzyme database (nomenclatura) http://www.ebi.ac.uk/intenz/
IntEnz Bazele de date generale
Baze de date pentru enzime BRENDA http://www.brenda-enzymes.org/index.php
Baze de date pentru enzime BRENDA - gamă largă de proprietăți enzimatice o clasificare și nomenclatură o reacții și specificitate (substrate naturale/artificiale) o parametri funcționali o informații legate de organismul din care provin o structura enzimelor o izolarea și prepararea o referințe bibliografice o aplicații și inginerie o enzimele - responsabile pentru anumite boli
Baze de date pentru enzime KEGG - gamă largă de proprietăți enzimatice
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate MEROPS (https://www.ebi.ac.uk/merops/)
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate MEROPS specificitate de clivare aminopeptidase A (Homo sapiens) Ectoenzimă degradează angiotensina II Dostal, D.E. Baker, K. M. Circulation Research. 1999;85:643-650
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate MEROPS substrate cu relevanță fiziologică (P) sau nu (N) substrate sintetice (S)
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate MetaCyc (https://metacyc.org)
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate MetaCyc
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate REBASE (http://rebase.neb.com/rebase/rebadvsearch.html)
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate REBASE
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate CAZY Carbohydrate-Active enzyme Database http://www.cazy.org/
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate CAZYpedia
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate PhosphaBase (PhB) baza de date pentru fosfataze http://bioinf.man.ac.uk/phosphabase/index.html
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate PhosphaBase (PhB) baza de date pentru fosfataze http://depod.bioss.uni-freiburg.de/
Baze de date pentru enzime Baze de date cu enzime specializate PKR the Protein Kinase Resource http://www0.nih.go.jp/mirror/kinases/
Baze de date pentru enzime TECRDB The Thermodynamics of Enzyme-catalyzed Reactions Database https://randr.nist.gov/enzyme/default.aspx
TECRDB Baze de date pentru enzime
Baze de date pentru enzime EFI (Enzyme Function Initiative) http://enzymefunction.org/projects
2. Caracterizarea enzimei 3.2. Determinarea structurii primare Scindarea legaturilor peptidice din lanturile proteinelor (enzimelor) Proteaza Natura legaturii peptidice clivate N-terminal -----XY Z----------C-terminal Tripsina Clostripaina Chimotripsina Elastaza Papaina Endoproteaza Glu-C Pepsina X Y Z - Lys, Arg - - Arg - - Trp, Tyr, Phe - - Leu, Met, Ala - Phe Lys Leu si Trp - Glu, Asp - - Phe Phe, Trp, Tyr
2. Caracterizarea enzimei 3.2. Determinarea structurii primare Scindarea legaturilor peptidice din lanturile proteinelor (enzimelor) CLASA Caracteristici inhibitor exemple functia Serin proteaze situsul activ fluorofosfat tripsina digestia H57, D102, S195 trombina coagulare sange plasmina scindare cheaguri subtilisina digestia Cistein proteaze situsul activ iodoacetat papaina digestia C25, H159, N175 strept. proteinaza digestia catepsin B digestia Acid proteaze ph optim acid diazocetone pepsina digestia D32, D215 chimozina coagulare lapte Metaloproteaze Zn 2+, E270 o-phenanthroline carboxipeptidazele digestia Zn 2+, Ca 2+ o-phenanthroline termolizina digestia E143, H231
3. Caracterizarea enzimei 3.2. Determinarea structurii primare Exemplu de proteaze Tripsina-scindeaza la legaturile peptidice Lys/Arg
3. Caracterizarea enzimei 3.2. Determinarea structurii primare Scindare chimica Scindarea metioninei
2. Caracterizarea enzimei 2.2. Determinarea structurii primare Enzima pura Etapa 1 Reactii de clivare Amestec de fragmente Etapa 2 Separarea fragmentelor Fragmente purificate Etapa 4 -clivarea alternativa; -separarea si secventierea Set de secvente individuale Etapa 3 secventierea Secventa completa Amestec complex Proteoliza Tripsina Peptide HPLC Separarea fragmentelor Fragmente purificate LC-MS/MS Baza de date Fragmentare (Spectru de masa) Izolare peptida Secvente Complete
3. Caracterizarea enzimei 3.2. Determinarea structurii primare Pehr Edman 1972-secventa fibrinogenului
3. Caracterizarea enzimei 3.2. Determinarea structurii primare Mw Structura primara Localizare AA Identificarea de parti functionale Determinarea pi Stabilirea unor relatii de evolutie
Baze de date pentru proteine/enzime NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed Cea mai mare baza de date Structuri 3D determinate experimental http://www.rcsb.org/pdb/ Expert Protein Analysis System ExPASy http://www.expasy.org/proteomics http://www.uniprot.org/ (pir.georgetown.edu) 5 milioane proteine http://www.nextprot.org/ Proteine umane http://string-db.org/ Interactiuni dintre proteine
2. Caracterizarea enzimei 2.2. Determinarea structurii secundare Structura secundara descrie modalitatile de impachetare ale lantului polipeptidic -helix -pliata paralela
2. Caracterizarea enzimei 2.2. Determinarea structurii secundare Enzima/proteina noua Secventa primara noua Fara omologi in bazele de date Transmembranara? Situsuri de fosforilare Structura secundara care poate fi intuita
2. Caracterizarea enzimei 2.2. Determinarea structurii secundare Predictia elementelor de structura secundara Elementele de tip -helix Elementele de tip -pliat Intoarceri de tip Glu, Leu, Ala >30-40% Val, Ile >40-50% Gly, Pro Ser, Asp, Asn >30% http://nptel.ac.in/courses/
2. Caracterizarea enzimei 2.2. Determinarea structurii secundare Baze de date structura secundara Elementele de -helix http://www-nmr.cabm.rutgers.edu/bioinformatics/ Proteomic_tools/Helical_wheel/ Elementele de -helix si -pliate - GARNIER http://biotools.umassmed.edu/cgi-bin/biobin/garnier Structura primara a mioglobinei umane P02144 (UniParc) MGLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQE VLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKA SE DLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIK PLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKH PGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG
JPRED 2. Caracterizarea enzimei 2.2. Determinarea structurii secundare Baze de date structura secundara http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/ PSI PRED http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ COILS (elemente spiralate) http://www.ch.embnet.org/cgi-bin/coils_form_parser
2. Caracterizarea enzimei 2.2. Determinarea structurii secundare/supersecundare Motivele structurale sunt segmente scurte cu regiuni similare Majoritatea 10-20 AA Motivele comune lanturi de AA domeniile transmembranare situsuri de fosforilare Motivul Michael Rossmann Structura butoi TIM
2. Caracterizarea enzimei 2.2. Determinarea structurii secundare/supersecundare Alte motivele structurale Situsul activ al aspartil proteazelor NCBI protease, partial [Human T-lymphotropic virus 1] PROSITE http://prosite.expasy.org/ HPTPKKLHRGGGLTSPPTLQQVLPNQDLASILPVIPLDPARRPVIKAQV DTQTSHPKTIEALLDTG ADMTVLPIALFSNNTPLKDTSVLGAGGQTQD HFKLTSLPVLIRLPFRTTPIVLTSCLVDTKNNWAI IGRDALQQCQGVLYL PEAKRPPVILPIQAPAVLGLEHLPRPPEISQFPLNQNASRPCNTWSGR PWR QAISNPTPGQEITQYSQLKKPMEPGDSSTTCGPLTL Protein kinaza C situsuri de fosforilare din proteine ST-xRK
Determinarea structurii tertiare Puterea catalitica Structura primara Structura tertiara Specificitatea enzimelor Difractie raze X Structura 3D RMN
Difractia cu raze X
K Difractia cu raze X
Difractia cu raze X Determinarea structurii proteinelor prin difractie cu raze X: 1. Cristalizarea proteinei 2. Imprestierea radiatiei X de catre planurile cristalului 3. Din diagrama de difractie este modelata harta densitatii electronice 4. Contruirea unui model de proteina pe baza densitatii electronice
Deducerea fazei razelor imprastiate Hg Insertie atomi grei U Pt E-CH 2 -SH + CH 3 -Hg-NO 3 catena laterala a cisteinei Densitate electronic a mare Imprastierea razelor X E-CH 2 -S-Hg- CH 3 + NO 3 - + H + I E-CH 2 OH + I 2 E-CH 2 OH + HI catena laterala a tirozinei
Cristalografie cu raze X Harta tridimensionala de densitate electronica Harta densitatii electronice a complexului Proteina talomera-adn
Harta de densitate electronica a moleculeler unghi de refractie mic Rezolutie modesta (5-6 Å) Forma generala Spoturi cu unghi de refractie mai mare Spoturi cu unghi de refractie mai mare Spoturi cu unghi de refractie mai mare Spoturi cu unghi de refractie mai mare cristal omogen Rezolutie medie (3,5 Å) Rezolutie medie (3 Å) Rezolutie buna (2,5 Å) Rezolutie mare (1,9 Å) Traseu lant polipetidic Catena laterala Determinarea pozitiei atomilor ±0,4 Å Pozitia atomilor ±0,2 Å
Harta densitatii electronice Structura primara Structura tridimensionala Legaturi amidice Resturi din catena laterala Structura quasistatica rotatii vibratii
Legarea ligandului la substrat Modificari conformationale hexokinaza
Accesul oxigenului la hemul hemoglobinei Structura oxi- si deoxihemoglobinei
Localizarea atomilor de H Difractia cu raze X Pozitia atomilor de H Atomi de H Densitate de e - redusa Difractie cu neutroni Imprastierea neutronilor
Sincroton-producerea de neutroni The beam makes about 104 orbits inside the synchrotron as it is accelerated before being kicked in a single revolution into the extracted proton beam line, delivering 4 μc of protons in two 100 ns long pulses to a tungsten spallation target. The entire acceleration process is repeated 50 times per second, so that a mean current of 200 μa
Determinarea structurii in solutie Stingerea fluorescentei Schimb izotopic (H-D) RMN Dicroism circular in solutie Structuri flexibile
Tripsinogen Clivare proteolitica Tripsina N-terminal Lant flexibil Difractie cu neutroni Mioglobina In 95%D 2 O Modificarea legaturilor amidice
RMN tirozina fenilalanina
Structura 3D a enzimelor Modele teoretice Mecanisme de reactie Similaritati structurale Resturi implicate cataliza stabilitate Motivul Rossman Caseta de legare a nucleotidelor lactate dehidrogenaza alcool dehidrogenaza Motiv Rossman
Structura cuaternara
Interactiuni dintre monomeri Aldolaza KDPG trimer Neuramidaza tetramer
Interactiuni dintre monomeri Insulina hexamer Kinaza-octamer
Subunități diferite situsuri diferite Freeman, Biochemistry, 2012 http://oregonstate.edu/ Aspartat carbamoilaza R6C6
Situsul activ al enzimelor 10-20% din volumul total al enzimei Interactiunea enzima-substrat in absenta sau prezenta cofactorului Bugg, T.-Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry,Blackwell Publishing, 2004 Deschizatura hidrofoba O retea de grupari din catena laterala a aminoacizilor Situsul activ
Situsul activ al enzimelor Luciferaza luciferin-amp http://photobiology.info/ 4 tipuri de interactiuni enzima-substrat Interactiuni electrostatice Rest de acid dicarboxilic Rest de acid dicarboxilic Substrat-Grupare (+) Legaturi de hidrogen Substrat/ligandul grupari polate
Situsul activ al enzimelor Interactiuni enzima-substrat Interactiuni nepolare (Van der Waals, distante mici 2-4 A) Interactiuni hidrofobe http://faculty.samford.edu/ Mentinerea structurii tertiare Interactiuni ale izoniazidei (gri) cu arilamin N-Acetil transferaza Areej M. et al. Probing the architecture of the Mycobacterium marinum arylamine N-acetyltransferase active site, Prot Cell, 2010, 1(4): 384-392
Situsul activ al enzimelor Grupari din situsul catalitic Situsul activ al fosfatazei alcaline din Ecoli Millab-Mammalian Alkaline Phosphatase,Willey, 2006
Obtinerea de enzime mutante 1982 Beta-lactamaza Tirozil-transfer ARN sintaza https://www.neb.com/ Mutageneza Proprietatile enzimelor Modificarea specificitatii stabilitate Eficienta catalitica k cat /K m
Stabilizarea enzimelor Temolizin proteaza B.Strearothermophilus Van den Burg et al. PNAS 95 (1998) Mutatii specifice: A4T, T56A, G58A, T63F, S65P, A69P Introducere 2 cisteine: N60C si G8C 8 mutatii specifice temperatura optima 58 0 C 37 0 C (nativa)
Stabilizarea enzimelor McGrath-Directory of therapeutic enzymes-crc Press-2006 O noua xiloz-izomeraza producerea siropului de fructoza Stabila in solutie 60 70 C Mai putin susceptibila la glicozilare (T ) t1/2 (60 C) >1550h nativa 607 h. Whiterhouse-Enzyme in food technology-crc Press-2002
Stabilizarea enzimelor McGrath-Directory of therapeutic enzymes-crc Press-2006
Structura enzimei Primara Secundara Super-secundara Tertiara Cuaternara
Subunități diferite situsuri diferite Triptofan sintaza indol-3-glicerol-fosfat Subunitatea indol + 3-glicerol-fosfat indol + serina Subunitatile 2 triptofan Busch,F. et al., Ancestral Tryptophan Synthase Reveals Functional Sophistication of Primordial Enzyme Complexes, Cell Chemical Biology, 23, 1-7, 2016 Hur,O., Leja, C., Dunn, MF., Biochemistry, 35, 7378-7386,1996.
Complexul piruvat dehidrogenazei - purtator grupe acil Complex multienzimatic - 60 subunitati: 24 - dihidrolipoil transacetilaza 24 - piruvat dehidrogenaza 12 - dihidrolipoil dehidrogenaza Diagrama de reacție catalizată de complexul enzimatic al piruvat dehidrogenazei (L- gruparea lipoamidica)
Complexul piruvat dehidrogenazei - purtator grupe acil
E 2 dihidrolipoil transacetilaza 8 trimeri aranjati dupa o simetrie cubica
Complexul din biosinteza pirimideinelor Trei enzime: CPSaza carbamil fosfat sintetaza GLN activitate amido trensferazica/glutamina SYN activitate sintetazica ATCaza Aspartat transcarbamilaza DHOaza - dihidrorotaza
Alte complexe enzimatice Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GPDH) Fosfoglicerat kinaza (PGK) https://encrypted-tbn2.gstatic.com/
Avantajele complexelor multienzimatice http://www.frontiersin.org Difuzia rapida a intermediarului de la o enzima la alta Canalizarea compusilor de-a lungul complexului Protejarea intermediarilor instabili Transfer intermolecular rapid Evitarea reactiilor nedorite Toate reactiile au loc in cadrul aceluiasi complex