οκιμασία ευαισθησίας Μηχανισμοί αντοχής Ι. Παπαπαρασκευάς, Λέκτορας ΕΚΠΑ Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή ipapapar@med.uoa.gr
Ερωτήματα για τον έλεγχο ευαισθησίας Θα πρέπει να γίνεται έλεγχος ευαισθησίας και πότε Με ποια μέθοδο θα πρέπει να γίνεται Σε ποια αντιβιοτικά θα πρέπει να γίνεται Υπάρχει αντοχή στα αναερόβια και τι σημαίνει στην κλινική πράξη
Ερωτήματα για τον έλεγχο ευαισθησίας Θα πρέπει να γίνεται έλεγχος ευαισθησίας και πότε Με ποια μέθοδο θα πρέπει να γίνεται Σε ποια αντιβιοτικά θα πρέπει να γίνεται Υπάρχει αντοχή στα αναερόβια και τι σημαίνει στην κλινική πράξη
Θα πρέπει να γίνεται δοκιμασία ευαισθησίας και πότε Τοπικό επίπεδο (νοσοκομείο) Ανάλογα με δυνατότητες και εξειδίκευση του εργαστηρίου Γενική οδηγία: δεν είναι απαραίτητο να γίνεται ρουτίνα (υψηλό κόστος, χρονοβόρο, μη αποδοτικό) Συγκεκριμένα δείγματα και στελέχη Πολυκεντρικό επίπεδο (κέντρο αναφοράς) Γιαεπιδημιολογικόέλεγχοκαιεπιτήρησητηςαντοχής Για έλεγχο νέων αντιμικροβιακών Αποδοτικό από άποψη κόστους (agar dilution) Καλύτερη προτυποποίηση μεθοδολογίας, παροχή υπηρεσιών, ανατροφοδότηση αποτελεσμάτων (feed-back). CLSI, M11-A6. Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 6th Edition
Σε ποια στελέχη θα πρέπει να γίνεται Σοβαρές λοιμώξεις Αίμα, ΕΝΥ, άλλα άσηπτα υγρά Ενδοκαρδίτιδα, οστεομυελίτιδα, αρθρίτιδα, προσθετικές συσκευές Κατά περίπτωση, ύστερα από συνεννόηση με την κλινική Λοιμώξεις που δεν απαντούν στην θεραπεία Λοιμώξεις που απαιτούν μακροχρόνια θεραπεία πιθανότητα ανάπτυξης αντοχής CLSI, M11-A6. Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 6th Edition
Ερωτήματα για τον έλεγχο ευαισθησίας Θα πρέπει να γίνεται έλεγχος ευαισθησίας και πότε Με ποια μέθοδο θα πρέπει να γίνεται Σε ποια αντιβιοτικά θα πρέπει να γίνεται Υπάρχει αντοχή στα αναερόβια και τι σημαίνει στην κλινική πράξη
Οδηγίες οργανισμών - εταιριών CLSI (πρώην NCCLS) Αραιώσεις σε άγαρ: Ναι στην χρήση Μικροαραιώσεις σε ζωμό: Ναι στην χρήση ιάχυση δισκίων: Όχι στην χρήση Etest Εμπορικά συστήματα: εν καλύπτονται Υλικό: Brucella agar + 5% ερυθρά + vitk + haemin BSAC Screening ταχέως αναπτυσσομένων (24h): διάχυση δισκίων Υλικό: Wilkins-Chalgren agar + 5% ερυθρά Επιβεβαίωση αντοχής με μέτρηση ΕΑΠ Για απαιτητικά: μέτρηση ΕΑΠ
Με ποια μέθοδο θα πρέπει να γίνεται η δοκιμασία ευαισθησίας Αραιώσεις σε άγαρ (agar dilution) Μέθοδος αναφοράς Χαμηλό κόστος Μαζικός έλεγχος Ακατάλληλο για ρουτίνα
0,125 μg/ml 0,25 μg/ml 0,5 μg/ml 1 μg/ml
Με ποια μέθοδο θα πρέπει να γίνεται η δοκιμασία ευαισθησίας Etest Ευελιξία Αξιοπιστία Κατάλληλο για ρουτίνα Υψηλό κόστος
Με ποια μέθοδο θα πρέπει να γίνεται η δοκιμασία ευαισθησίας ιάχυση δισκίων κατά Kirby-Bauer Μη αποδεκτή μέθοδος Οδηγία μόνο ως έλεγχος διαλογής(screening) εν υπάρχουν όρια διαμέτρων σύγκριση με διάμετρο προτύπου (συγκριτική δοκιμασία)
ιάχυση δισκίων - Οδηγίες BSAC Σωστό Λάθος British Society for Antimicrobial Chemotherapy http://www.bsac.org.uk/_db/_documents/version_4_january_2005_final_nh_april_2.pdf
Με ποια μέθοδο θα πρέπει να γίνεται η δοκιμασία ευαισθησίας Μικροαραιώσεις σε ζωμό (broth micro-dilution) Για ταχέως αναπτυσσόμενα Προσοχή στις συνθήκες Κατάλληλο για ρουτίνα Σε εξέλιξη εμπορικά συστήματα (Vitek, Microscan κλπ.) ιαφορετικά όρια ερμηνείας (breakpoints) της ΕΑΠ από τα όρια της μεθόδου αραιώσεων σε άγαρ
Ερωτήματα για τον έλεγχο ευαισθησίας Θα πρέπει να γίνεται έλεγχος ευαισθησίας και πότε Με ποια μέθοδο θα πρέπει να γίνεται Σε ποια αντιβιοτικά θα πρέπει να γίνεται Υπάρχει αντοχή στα αναερόβια και τι σημαίνει στην κλινική πράξη
Gram-αρνητικά αναερόβια Έλεγχος β-λακταμάσης (νιτροσεφίνη) Αρνητικός Θετικός Πρώτης επιλογής Πενικιλλίνη Κλινδαμυκίνη Μετρονιδαζόλη εύτερης επιλογής Κεφοξιτίνη, κεφτριαξόνη Πιπερακιλλίνη ή τικαρκιλλίνη Μοξιφλοξασίνη CLSI, Document M11-A6, 2004 Πρώτης επιλογής β-λακταμικό+αναστολέας Κεφοξιτίνη Ιμιπενέμη, ερταπενέμη Μετρονιδαζόλη εύτερης επιλογής Κεφτριαξόνη Χλωραμφαινικόλη Μοξιφλοξασίνη
Gram-θετικά αναερόβια Clostridium spp. (εκτός από C. perfrigens Πρώτης επιλογής Πενικιλλίνη ή αμπικιλλίνη β-λακταμικό+αναστολέας Κεφοξιτίνη Κλινδαμυκίνη Μετρονιδαζόλη Ιμιπενέμη, Ερταπενέμη εύτερης επιλογής Κεφτριαξόνη C. perfrigens, Gram(+) κόκκοι, μη σπορογόνα Gram(+) βακτήρια Πρώτης επιλογής Πενικιλλίνη ή αμπικιλλίνη Κλινδαμυκίνη Μετρονιδαζόλη εύτερης επιλογής Κεφτριαξόνη Κεφοξίτίνη Τετρακυκλίνη Πιπερακιλλίνη ή τικαρκιλλίνη Τετρακυκλίνη CLSI, Document M11-A6, 2004
Ερωτήματα για τον έλεγχο ευαισθησίας Θα πρέπει να γίνεται έλεγχος ευαισθησίας και πότε Με ποια μέθοδο θα πρέπει να γίνεται Σε ποια αντιβιοτικά θα πρέπει να γίνεται Υπάρχει αντοχή στα αναερόβια και τι σημαίνει στην κλινική πράξη
Μετρονιδαζόλη - Μηχανισμός δράσης Είναι προ-φάρμακο Απαιτείται αναγωγή σε αυστηρά αναερόβιο περιβάλλον. Προκαλεί βλάβη στο DNA και στα άλλα μακρομόρια του μικροβιακού κυττάρου. Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual 6th Edition
Μετρονιδαζόλη Επιδημιολογία αντοχής Σπάνια η εμφάνιση αντοχής Παγκόσμια 0-3% για ΕΑΠ 32 mg/l Υψηλότερα ποσοστά: ARC, HPA, Cardiff, UK 7% J. Brazier et al, JAC, 1999 Ελληνικά δεδομένα 4% (κυρίως Prevotella spp.) J. Papaparaskevas CMI, 2005
Μετρονιδαζόλη Μηχανισμοί αντοχής Ομάδα γονιδίων nim (nima, B, C, D, E, F, G) Κωδικοποιούν για νιτροαναγωγάση μετατρέπει την 5- νιτροϊμιδαζόλη στο ανενεργό παράγωγο αμινοϊμιδαζόλη Ανεύρεση και σε ευαίσθητα στελέχη (ΕΑΠ 16 mg/l) απαιτούνται αλληλουχίες εισδοχής για έκφραση της αντοχής Άλλοι μηχανισμοί Ελαττωμένη δράση αναγωγάσης (για μετατροπή προφαρμάκου) Ελαττωμένη πρόσληψη στο βακτηριακό κύτταρο
Κατανομή nim γονιδίων Ελληνικά δεδομένα Στέλεχος ΕΑΠ Mz Nim γονίδια P. melaninogenica 4 B. merdae 4 nime B. distasonis 4 nima B. ureolyticus 8 P. buccalis 8 B. fragilis 16 nimd P. oralis >32 nimc P. oralis >32 nime P. oralis >32 Fusobacterium spp. >32 nimd P. buccalis >32 nime Porphyromonas spp. >32 nimc P. bivia >32 M 1 2 NC 458 bp Bacteroides fragilis, ΕΑΠ 16 mg/l, nimd J. Papaparaskevas, CMI, 2005
Μετρονιδαζόλη Μηχανισμοί αντοχής Η έκθεση στην μετρονιδαζόλη έχει ενοχοποιηθεί για μη αναστρέψιμη αύξηση της ΕΑΠ (2-6 >256 mg/l), χωρίς απαραίτητα την εμφάνιση nim γονιδίων Πιθανολογείται μια συνολική προσαρμογή των μεταβολικών μηχανισμών του κύτταρου στην αντιμικροβιακή πίεση M Gal and J Brazier, JAC, 2004 CG Diniz et al, AAC, 2002
Μετρονιδαζόλη Έλεγχος ευαισθησίας Προσοχή στις σωστές αναερόβιες συνθήκες!!!!! Συχνά τα ψευδώς ανθεκτικά στελέχη (ανεπαρκής τεχνική) Έλεγχος των συνθηκών (κυανό μεθυλενίου, ρεσαζουρίνη) Έλεγχος αποτελεσμάτων (B. fragilis ATCC 25285, B. thetaiotaomicron ATCC 29741) Η μέθοδος Etest δίνει επαρκή αποτελέσματα Επιβεβαίωση στελεχών με αυξημένη ΕΑΠ (>1 mg/l) Έλεγχος διαλογής (screening): δισκίο Mz 5 μg, σύγκριση της διαμέτρου με την αντίστοιχη του προτύπου στελέχους Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual 6th Edition
Έλεγχος μετρονιδαζόλης Ανεξάρτητα της μεθόδου, προσοχή στις αναερόβιες συνθήκες!!
Καρβαπενέμες - Μηχανισμός δράσης Ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη β-λακταμικό αντιβιοτικό, σύνδεση με PBPs αναστολή σύνθεσης τοιχώματος Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual 6th Edition
Καρβαπενέμες Επιδημιολογία αντοχής Σε χαμηλά επίπεδα η εμφάνιση αντοχής Παγκόσμια 0-2% για ΕΑΠ 16 mg/l Υψηλότερα ποσοστά: Ιαπωνία 6% Kato et al, AAC, 2003 Ελληνικά δεδομένα Bacteroides, Prevotella spp: Ιμιπενέμη 0,5%, Eρταπενέμη 3% C. difficile: Ιμιπενέμη 7%, Μεροπενέμη 0% Papaparaskevas et al, CMI, 2005, Malamou-Ladas et al, 2005
Καρβαπενέμες Μηχανισμοί αντοχής Καρβαπενεμάση που υδρολύει όλα τα β-λακταμικά Κωδικοποίηση από το cfia γονίδιο Ανεύρεση και σε ευαίσθητα στελέχη (ΕΑΠ 8 mg/l) απαιτούνται αλληλουχίες εισδοχής για έκφραση της αντοχής Άλλοι μηχανισμοί Μεταβολές στις PBP NC 1 2 3 4 5 6 M 340 bp Στελέχη Bacteroides spp. ΕΑΠ < 8 mg/l, cfia (+)
Φαινοτυπικά ευαίσθητα στελέχη που διαθέτουν γενετικούς μηχανισμούς αντοχής Το πρόβλημα με την μετρονιδαζόλη και την ιμιπενέμη?? Είναι δυνατό τα στελέχη κάτω από την πίεση της επιλογής να μετατραπούν σε φαινοτυπικά ανθεκτικά?
Φαινοτυπικά ευαίσθητα στελέχη που διαθέτουν γενετικούς μηχανισμούς αντοχής Το πρόβλημα με την μετρονιδαζόλη και την ιμιπενέμη Σε σχέση με την μετρονιδαζόλη, η in vitro έκθεση μπορεί να προκαλέσει μη αναστρέψιμη αύξηση της ΕΑΠ Όσον αφορά την ιμιπενέμη, ίσως έχει σχέση με την ποσότητα της καρβαπενεμάσης που παράγεται δεν είναι επαρκής για να αυξήσει την τιμή της ΕΑΠ Η έκθεση του στελέχους σε ιμιπενέμη in vitro ή in vivo μπορεί να επάγει την παραγωγή του μεταλλο-ένζυμου M Gal and J Brazier, JAC, 2004
β-λακταμικά - Μηχανισμός αντοχής Πενικιλλίνη β-λακταμάσες >95% αντοχή στα στελέχη Bacteroides spp. 60% αντοχή στα στελέχη Prevotella spp. 57% αντοχή στα στελέχη C. difficile Κεφοξιτίνη αλλαγές στις PBPs, β-λακταμάσες (cfxa) 30% αντοχή στο σύνολο (κυρίως Bacteroides spp.) 6% στα στελέχη Prevotella spp. β-λακταμικά+αναστολείς αλλαγές στις PBPs 2% αντοχή στην πιπερακιλλίνη+ταζομπακτάμη (κυρίως Bacteroides) Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual 6th Edition Papaparaskevas et al, CMI, 2005, Malamou-Ladas et al, 2005
Κλινδαμυκίνη - Μηχανισμός αντοχής Μεθυλίωση ριβοσώματος (erm γονίδια, MLS B αντοχή) ιεθνώς αντοχή 25-45% (αυξημένη στην Ν. Ευρώπη) Ελλάδα: συνολικά 30% αντοχή στα Gram-αρνητικά (ομοιόμορφη κατανομή στα είδη) και 56% αντοχή στο C. difficile Ικανότητα μεταβίβασης MLS B γονιδίων μεταξύ αερόβιων και αναερόβιων ειδών της φυσιολογικής στοματοφαρυγγικής χλωρίδας Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual 6th Edition Papaparaskevas et al, CMI, 2005, Malamou-Ladas et al, 2005
Κινολόνες - Μηχανισμός αντοχής Οι παλαιότερες φθοριοκινολόνες δεν είναι δραστικές έναντι αναεροβίων Νεότερες ποικίλη δραστικότητα Μεταλλαγές στα γονίδια gyra, parc ιεθνώς σχετικά καλή η δραστικότητα της μοξιφλοξασίνης Ελληνικά δεδομένα: αντοχή έως 30% στα Bacteroides spp. Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual 6th Edition Papaparaskevas et al, CMI, 2005
Νεότερα αντιβιοτικά Τιγκεκυκλίνη (γλυκυλ-κυκλίνη), παράγωγο τετρακυκλινών Καλή in vitro δραστικότητα 10% αντοχή στα Gramαρνητικά (60% αντοχή στην τετρακυκλίνη) A. Katsandri et al, DMID, 2006
www.mednet.gr/whonet
Συντελεστές ΓΝΑ Λαϊκό : Α. Αυλάμη, Α. Πανταζάτου, Α. Κατσανδρή ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς : Ε. Μαλάμου-Λαδά, Γ. Γκαντέρης, Μ. Ορφανίδου Εργαστήριο Μικροβιολογίας Ιατρικής Σχολής: Καθ. Ν.Ι. Λεγάκης, Ι. Παπαπαρασκευάς Νοσοκομεία που συμμετέχουν: ΓΝΑ Ασκληπιείο, ΓΝΕ Θριάσειο, ΓΝΑ Ιπποκράτειο, ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς, ΓΝΑ Λαϊκό, ΓΝΠΑ Η ΑγίαΣοφία, ΓΝΠΑ Π. & Α. Κυριακού, ΓΝ Παίδων Πεντέλης, ΓΝΑ Σισμανόγλειο, ΠΓΝΑ Αττικόν, ΓΝ υτικής Αττικής, ΓΝΝ Κέρκυρας, ΓΝΝ Βόλου Χρηματοδοτήσεις Πρόγραμμα Καποδίστριας (ΕΚΠΑ) Πρόγραμμα ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ Πυθαγόρας (Υπ. Παιδείας)