ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΓΝΩΣΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΑΔΥΟΜΕΝΩΝ ΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ 1 Κέλλυ Θεοδωρίδου, Ακαδημαϊκή Υπότροφος Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ
2 Περιεχόμενα ομιλίας 1. Ποιοι μύκητες μας ενδιαφέρουν; 2. Γιατί θέλουμε να βελτιώσουμε τη διάγνωση των λοιμώξεων από μύκητες; 3. Διαγνωστικές τεχνικές νεότερα δεδομένα - Κλασικές (άμεση μικροσκοπική καλλιέργεια) - Ορολογικές - - Μοριακές 4.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
Ποιοι μύκητες μας ενδιαφέρουν; 3 Ζυμομύκητες Υφομύκητες Candida Cryptococcus Trichosporon Rhodotorula Saccharomyces Malassezia Aspergillus Mucorales (Zygomycetes) Τα πιο συχνά παθογόνα: Hyaline Candida, hyphomycetes Aspergillus, Cryptococcus και Pneumocystis υπεύθυνα Fusarium για >90% των θανάτων από μυκητική Scedosporium λοίμωξη Pneumocystis Phylum: Ascomycota Acremonium Brown GD, et al. Hidden killers: human fungal infections. Sci Transl Med. 2012;4:165rv13 Dematiaceous hyphomycetes Alternaria Bipolaris...
Γιατί θέλουμε να βελτιώσουμε τη διάγνωση; 4 Candida 4η αιτία νοσοκομειακής μικροβιαιμίας Αλλαγή επιδημιολογίας: αύξηση Candida non-albicans & υφομυκήτων Διεισδυτική καντιντίαση: 49% σε ΜΕΘ των ΗΠΑ (1,2) Διεισδυτική ασπεργίλλωση: 60% σε αιματολογικούς Α (3,4) Κρυπτοκοκκική μηνιγ: 625.000 80% αυτών (500.000) στην υπο-σαχάρια Αφρική (5) ΗΠΑ: Μέσο κόστος αντιμετώπισης ΔΑ 96.310 $ (6) Αυστραλία : αντιμετώπιση της ΔΜ σε ασθενείς με αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων και σε ασθενείς με ΟΜΛ (7): 30,957 AU$/περιστατικό 80.291 AU $/περιστατικό, αν χρειαζόταν νοσηλεία σε ΜΕΘ Ευρώπη: Καντινταιμία αύξηση του κόστους νοσηλείας σε >23,000 / επεισ. (8) 1. Wisplinghoff H, Clin Infect Dis.2004. 2. Gudlaugsson O. Clin Infect Dis. 2003 3. Neofytos D,. Clin Infect Dis. 2009; 4. Lortholary O, Clin Microbiol Infect. 2011;. 5. Park BJ, AIDS. 2009; 6. Tong KB, Int J Infect Dis. 2009; 7. Ananda-Rajah MR, Antimicrob Agents Chemother. 2011; 8. Masterton RG J Med
Έγκαιρη και Έγκυρη Διάγνωση: Πότε Από πού Με ποιο τρόπο ; Δείγμα Ασθενής Test
+ Μικροσκοπική Ιστολογική Καλλιέργεια 6 + = Εργαστηριακά τεκμηριωμένη (Proven) Ασθενής με Ειδικά κλινικά προδιαθεσικούς + + παράγοντες ευρήματα Εργαστηριακά ευρήματα = Κλινικά Τεκμηριωμένη (Probable) Ασθενής με προδιαθεσικούς Ειδικά κλινικά ευρήματα παράγοντες + + Αρνητικά ή δεν έγιναν = Πιθανή (Possible) Αρνητικά ή Ασθενής με προδιαθεσικούς Μη ειδικά κλινικά + παράγοντες ευρήματα + δεν έγιναν = Ασθενής με προδιαθεσικούς Εργαστηριακά + κανένα + = παράγοντες ευρήματα Αταξινόμητα Ασθενής με προδιαθεσικούς κανένα + + παράγοντες Αρνητικά ή δεν έγιναν = Oρισμοί EORTC/IFCG. Clinical Infectious Diseases 2008;
7 Διάγνωση διεισδυτικών μυκητιάσεων Μικροβιολογική Συμβατικές (κλασικές) Νεότερες Άμεση μικροσκοπική Καλλιέργεια Ορολογικές Galactomannan β-d glucan Mannan / Anti-Mannan Cryptococcal Capsular Polysaccharide Μοριακές
Η Αξία της Άμεσης Μικροσκοπικής Εξέτασης Calcofluor white-stain: Aspergillus Fluorescence microscopy (x100) showing Calcofluor white staining of centrifuged BAL from a patient with AML presenting with febrile neutropenia and cough. Bright fluorescent dichotomous branching septate hyphae can be seen, which were later confirmed by culture to be Aspergillus fumigatus. Schelenz S. et al. Lancet Infect Dis 2015; 15: 461 9
10 Ταυτοποίηση Έλεγχο ευαισθησίας Schelenz S. et al. Lancet Infect Dis 2015; 15: 461 74
11 The matrix-assisted laser desorption ionization time-off light mass spectrometry Δημιουργία χαρακτηριστικών εικόνων φασμάτων μάζας (πρωτεϊνικό προφίλ) μοναδικών για κάθε μικροοργανισμό Ακριβής ταυτοποίηση σε επίπεδο γένους και είδους Χρησιμοποίησή της σε τυποποίηση στελεχών a.i. 6000 4000 2000 0-2000 -4000-6000 Profiling results from different Bacillus strains Εύκολα και γρήγορα προετοιμαζόμενο δείγμα Ιονισμός μακρομορίων, κυρίως πρωτεϊνών Επιτάχυνση των ιόντων προς την περιοχή του ανιχνευτή κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες και σε περιβάλλον κενού B. globigii Ανίχνευση και ανάλυση των προκυπτουσών B. licheniformis φασμάτων μάζας ταυτοποίηση των B. subtilis μακρομορίων μέσω του προσδιορισμού του λόγου μάζας προς φορτίο m/z B. thuringiensis (χρόνος 2 min)
Ταυτοποίηση ζυμομυκήτων & υφομυκήτων 12 Singhal N, et al. Front. Microbiol. 2015;6:791.
Technology in use in Europe for >10 years. Acquired 13 by over 1.100 labs worldwide
Γαλακτομαννάνη GM Μέθοδος Ενδείξεις Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Galactomannan (GM) Πρώιμη ανίχνευση ΙΑ (1) 2 δείγματα ορού/εβδ (1) cut-off index >=0.5 (2,5) Screening test σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές μεθόδους σε ασθενείς υψηλού κινδύνου ΙΑ (1) Σε μη ουδετεροπενικούς ασθενείς: όχι η ίδια διαγνωστική και προγνωστική αξία (4,5) Δείγματα επαναλμβανόμενα ΌΧΙ αν mold-active προφύλαξη Μυκητολογικό κριτήριο Σε ουδετεροπενικούς ενήλικες & σε ουδετεροπενικά παιδιά Τιμές >1 ένδειξη θεραπευτικής αποτυχίας σε ενήλικες & παιδιά (2) Μέτρηση στο BAL (cut-off>1) και ENY (cut-off>0.5): χρήσιμα σε ουδετεροπενικούς και μη ασθενείς (2) Θεραπεία με αντιμυκητικά έναντι υφομυκήτων επηρεάζει την (mold-active) ανίχνευση GM (1) Eμμένουσα GM αντιγοναιμία: κακός προγνωστικός δείκτης και χρειάζεται επανεκτίμηση του περιστατικού (3,5)
Γαλακτομαννάνη GM Απόδοση ανάλογα πληθυσμού ασθενών και επίπτωση νόσου καλύτερη ευαισθησία (70% 89%) και ειδικότητα (85% 92%) σε HM/HSCT ασθενείς αύξηση ευαισθησίας στο BAL, σε σχέση με τον ορό σε πνευμονική IA μετά HM/HSCT και SOT Ψευδώς θετικά αποτελέσματα έχουν συσχετιστεί με: 15 άλλους υφομύκητες (Penicillium spp., Paecilomyces spp./ Purpureocillium licacinum, και Histoplasma spp.) λήψη ορισμένων αντιβιοτικών (αλλά όχι πλέον με PIP/TAZO) κατανάλωση ορισμένων τροφίμων (π.χ. τύποι γάλακτος, και popsicles) ύπαρξη Bifidobacterium στο έντερο των νεογνών Ανίχνευση GM στο BAL δε διαφοροποιεί αποικισμό από διεισδυτική λοίμωξη Powers-Fletcher M, Hanson K. Infect Dis Clin N Am 2016; 30:37 49
16 Clinical Microbiology and Infection, 2018;24(Suppl):e1-e38
17 Ανοσοχρωματογραφία και ΙΑ Clinical Microbiology and Infection, 2018;24(Suppl):e1-e38
18 1-3 β D-γλυκάνη (BG) Μέθοδος Ενδείξεις Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα β-d-glucan (BG) Διάγνωση ΔΜ 2 δείγματα/εβδ. (minimum) (4) Μυκητολογικό κριτήριο Παν-μυκητιακός δείκτης (*) για ασθενείς σε κρίσιμη κατάσταση και σε πνευμονία από P. jiroveci (3) Συχνότητα 2 δ/εβδ επαρκής ως screening (2) 37% ΨΘ 1 Χ 80 pg/ml 23% ΨΘ 2 Χ 80 pg/ml Αύξηση ειδικότητας, αλλά μείωση ευαισθησίας Διεισδυτική καντιντίαση: ευαισθησία 75-80%, ειδικότητα 80% Θέση λοίμωξης σημαντική: ασθενείς με ιστικές λοιμώξεις δεν καταφέρνουν να μειώσουν τα επίπεδα BD παρά την επιτυχή έκβαση (3) (*) ΕΚΤΟΣ Cruptococcus & Mucorales ΨΘ σε βακτηριαιμία (2) ΟΧΙ μουκορμύκητες και C. neoformans (3) Περιορισμένη εμπειρία σε σχέση με GM (1,5) ΌΧΙ εμπειρία εφαρμογής σε άλλα δείγματα (πλην ορού/πλάσματος) Όριο θετικού αποτελέσματος ανάλογα μεθοδολογίας (5): Fungitell >=80 pg/ml (3,5), Wako > 11 pg/ml (5) Βραδεία μείωση σε ασθενείς με ΙΑ, IC και PCP παρά την επιτυχή θεραπεία. Παραμένει θετική για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά την επιτυχή θεραπεία (4) Λιγότερο ακριβής σε αιματολογικούς Α (1)
1-3 β D-γλυκάνη (BG) Απόδοση ανάλογα με το μύκητα, δηλαδή: 19 μεγαλύτερη ευαισθησία (96%) και ειδικότητα (84%) σε πνευμονία από Pneumocystis παρόμοια ευαισθησία με αυτή της GM ορού σε λοίμωξη από Aspergillus μεγαλύτερη ευαισθησία σε σχέση με αιμοκ/α σε διεισδυτική καντιντίαση, με σχετικά καλή ειδικότητα (63% 73%) Ψευδώς θετικά αποτελέσματα σχετίζονται με: κάποιες μεμβράνες αιμοδιάλυσης ενδοφλέβια χορηγούμενη ανοσοσφαιρίνη χειρουργικούς σπόγγους και γάζες μεταμόσχευση πνεύμονα, λόγω υποκείμενου αποικισμού λήψη β-λακταμών (αν και πιστεύεται ότι δεν είναι τόσο μεγάλο το πρόβλημα) Μη καθορισμός cut-off στον παιδιατρικό πληθυσμό
20 β-d-γλυκάνη και ΙΑ γίνεται αλλά περιορισμένος ο ρόλος της Clinical Microbiology and Infection, 2018;24(Suppl):e1-e38
21 Μοριακές τεχνικές Μέθοδος Ενδείξεις Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Μέθοδοι PCR Μεγαλύτερη εμπειρία με τις in-house τεχνικές (1) Ανίχνευση DNA κυρίως Aspergillus Μικρότερη εμπειρία για Candida ΔΕΝ είναι Μυκητολογικό κριτήριο Πρώιμη διάγνωση (ταχείες τεχνικές), υψηλή NPV (2,3) Υψηλή ευαισθησία (αν γονίδια σε πολλά αντίγραφα) Δυνατότητα: τυποποίησης σε επίπεδο είδους ποσοτικοποίησης (2,3) Ανίχνευση μικρού φορτίου σε καντινταιμίες: <10 CFU/mL (σε 25% <1 CFU/mL) (περιπτώσεις περιοδικής ελευθέρωσης από φλεγμένων όργανο στην κυκλοφορία ή λόγω κάθαρσης στο ήπαρ) (3) Επιπρόσθετες τεχνικές Σε εργαστήρια αναφοράς (μη ευρέως διαδεδομένες τεχνικές) Υψηλό κόστος, εξειδικευμένο προσωπικό, εξοπλισμός Δυσκολίες στην απομόνωση επαρκούς ποσότητας DNA από διάφορα δύσκολα δείγματα (2,4) Ασαφής η επίδραση των αντιμυκητικών στην ευαισθησία Λίγα δεδομένα από ασθενείς αποικισμένους με Candida, αλλά τάση μείωσης ειδικότητας
22 Μοριακές τεχνικές σε διεισδυτική ασπεργίλλωση Δεν υπάρχουν FDA εγκεκριμένες τεχνικές Συνήθως πρόκειται για in house μεθοδολογίες PCR χρήσιμη στον καθορισμό preemptive και στοχευμένης θεραπείας Arvanitis M & Mylonakis E. Eur J Clin Invest 2015; 45: 646 652
23 PCR και ΙΑ: ορός, πλάσμα ή ολικό αίμα Clinical Microbiology and Infection, 2018;24(Suppl):e1-e38
24 Συστάσεις για εφαρμογή PCR στο αίμα Χρήση προτυποποιημένων μεθοδολογιών Συνδυασμός 2 τεχνικών GM + PCR: καλύτερο από PCR μόνο Συνδυασμός 2 ειδών δειγμάτων Πλάσμα + γενική αίματος καλύτερα από μόνο ένα είδος δείγματος Ένα αρνητικό αποτέλεσμα PCR αποκλεισμός ΙΑ!!!! Δύο θετικά αποτελέσματα επιβεβαίωση διάγνωσης ΙΑ!!!! (μεγαλύτερη ειδικότητα) [BII]
Εμπορικές μέθοδοι: διάκριση ανάλογα με το είδος δείγματος 28 Θετική καλλιέργεια - αιμοκαλλιέργεια - άλλο κλινικό δείγμα Nucleic-acid-based methods - Probes hybridization - Microarrays - Multiplex PCR MALDI-TOF MS Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry Κλινικό δείγμα - γενική αίματος - άλλο κλινικό δείγμα (π.χ. BAL) Nucleic-acid-based methods - Multiplex real-time PCR - π.χ. SeptiFast - Broad range PCR (16S / 18S rrna) - π.χ. SeptiTest PCR/ESI-MS (PCR & electrospray ionization mass spectrometry)
29 FilmArray platform: Nucleic-acid-based method Multiplex PCR Δείγματα: θετική αιμοκαλλιέργεια κόπρανα δείγμα αναπνευστικού (φαρυγγικό) ΕΝΥ Αυτόνομο σακουλάκι με όλα τα αντιδραστήρια ενσωματωμένα: Αποθηκεύει όλα τα αντιδραστήρια (θ o C περιβάλλοντος) Εκτελεί την εκχύλιση, ενίσχυση και ανίχνευση Είναι «κλειστό» σύστημα (=ελαχιστοποίηση επιμολύνσεων) FilmArray Blood Culture Identification (BCID) Panel: Information Sheet. BioFire Website. www.biofiredx.com/pdfs/filmarray/info%20sheet,%20filmarray%20bcid%20panel-0069.pdf.
30 FilmArray τεχνική FilmArray Torch Απλό: Μόνο 2 λεπτά διαδικασία χειρισμού Eύκολο: Δεν απαιτείται πιπετάρισμα ακριβείας C. albicans C. glabrata C. krusei C. parapsilosis Γρήγορο: Χρόνος ανάλυσης περίπου 1 ώρα C. tropicalis The FilmArray System. BioFire Website. www.filmarray.com/the-filmarray-system
31 Άλλα είδη δείγματος; - Multiplex PCR - FilmArray platform Εγκεφαλονωτιαίο FilmArray Meningitis/Encephalitis (ME) 14 πιο συχνά παθογόνα (7 ιοί, 6 βακτήρια, 1 ζυμομύκητα) Ιοί Βακτήρια Μύκητες Cytomegalovirus (CMV) Enterovirus Herpes simplex virus 1 (HSV-1) Herpes simplex virus 2 (HSV-2) Human herpes virus 6 (HHV-6) Human parechovirus Varicella zoster virus (VZV) Escherichia coli K1 Haemophilus influenzae Listeria monocytogenes Neisseria meningitidis Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae Cryptococcus neoformans/gattii
32 LightCycler SeptiFast SepsiTest Detection limit: 3-30 CFU/mL 20-40 for S. aureus Time: 6 h 8-12 h panel: ~ 25 παθογόνα (90% αιτιών σήψης) >345 παθογόνα
SeptiFast panel: Pathogens detection and identification 33 Gram-negative bacteria Gram-positive bacteria Fungi Escherichia coli Staphyloccus aureus Candida albicans Klebsiella (pneumoniae / oxytoca) CoNS (Coagulase negative Staphylococci) Candida tropicalis Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae Candida parapsilosis Enterobacter (cloacae / aerogenes) Streptococcus spp. Candida krusei Proteus mirabilis Enterococcus faecium Candida glabrata Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Asperigillus fumigatus Acinetobacter baumannii Stenotrophomonas maltophilia CoNS: S. epidermidis, S. haemolyticus, S. xylosus, S. hominis, S. cohnii, S. lugdunensis, S. saprophyticus, S. saprophyticus, S. capitis, S. pasteuri, S. warneri. Streptococci: S. pyogenes, S. agalactiae, S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. anginosus, S. bovis, S. constellatus, S. cristatus, S. vestibularis., S. gordonii, S. intermedius, S. milleri, S. salivarius, S. sanguinis, S. thermophilus, S. parasanguinis.
35 Ενδείξεις εφαρμογής SeptiFast Test Ποιες κατηγορίες ασθενών ωφελούνται περισσότερο: 1. Μεταμοσχευμένοι ασθενείς 2. Ογκολογικοί-Αιματολογικοί ασθενείς 3. Ασθενείς υψηλού κινδύνου 4. Παιδιά και νεογνά 5. Ασθενείς με σοβαρά εγκαύματα Ύπαρξη διαγνωστικών κριτηρίων σηψαιμίας για την επιλογή των ασθενών που θα υποβληθούν στη δοκιμασία
36 SeptiFast Μυκηταιμία 18 μελέτες Ευαισθησία 0.61 (95% CI: 0.48 0.72) και ειδικότητα 0.99 (95 % CI 0.99 0.99) LC-SF test είναι χρήσιμο ΜΟΝΟ στην επιβεβαίωση της μυκηταιμίας (for ruling in fungemia, LR+: 66.8 vs LR-: 0.44) Αύξηση ευαισθησίας σε ασθενείς ΜΕΘ (0.71) ή αν σύγκριση με αιμοκαλλιέργεια (0.65) σε σχέση με σύγκριση με κλινικό κριτήριο λοίμωξης (0.55) Ειδικότητα και rule-in value σταθερά Μικρή προ-test πιθανότητα (low pretest probability) μυκηταιμίας αρνητικό αποτέλεσμα LC- SF test αποτελεί χρήσιμη πληροφορία κλινικής απόφασης διακοπή αντι-μυκητικής αγωγής Chang S-S, et al., PLoS ONE (2013) 8: e62323
37 Μοριακές τεχνικές σε διεισδυτική καντιντίαση Έγκριση FDA για T2Candida τεχνική The T2Candida Panel and the T2Dx Instrument: T2 Magnetic Resonance (T2MR) technology platform. T2MR combines proven magnetic resonance with innovative nanotechnology to accurately identify Candida pathogens
Ταχύτητα και ακρίβεια T2Candida 38 greatest benefit of T2Candida appears to be the ability to confidently withhold or stop empirical antifungal therapy in low-tomoderate-risk patients who are unlikely to benefit from treatment. Walker B, et al. J Clin Microbiol. 2016;54:718 26 Pfaller MA, Future Microbiol 2015; Mylonakis E, CID 2015
Συμπεράσματα 40 Πρότυπες εργαστηριακές μέθοδοι Άμεση μικροσκοπική σε πρόσφατο δείγμα Ιστολογική εξέταση υλικού βιοψίας Καλλιέργεια ( απομόνωση, ταυτοποίηση και έλεγχο ευαισθησίας) Ορολογικές / μοριακές τεχνικές: εκτέλεσή τους σε κέντρα αναφοράς η ακρίβειά τους εξαρτάται από το υποκείμενο νόσημα χρήσιμα ως screening tests, αλλά το αποτέλεσμά τους μπορεί να επηρεάζεται από την λήψη αντιμυκητικής αγωγής
Απαραίτητη και αναγκαία συνθήκη η καταγραφή των ΔΜ για την κατανόησή τους και την κατάρτιση διαγνωστικών και 41 θεραπευτικών πρωτοκόλλων και οδηγιών η συνεργασία διαφόρων ειδικοτήτων (Κλινικός, Ακτινολόγος, Μικροβιολόγος, Παθ/ανατόμος)
Ευχαριστώ πολύ 42