ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σταμάτης Κουσίσης, Δημοσθένης Κίζης, Δήμητρα Χούχουλα Βασική αρχή της Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης Η αλυσιδωτή αντίδραση ς (polymerase chain reaction PCR) ανακαλύφθηκε το 98 στην Καλλιφόρνια από τον Kerry Mullis και δημοσιεύτηκε το 985. Ο Mullis κέρδισε το 99 το βραβείο Nobel Χημείας για την ανακάλυψη. Η PCR ανήκει σε μια γενικότερη κατηγορία μεθόδων πολλαπλασιασμού του DNA-στόχου (target amplification methods). Οι μέθοδοι αυτές επιδιώκουν τον in vitro ενζυμικό πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας βάσεων του DNA, σε τέτοια ποσότητα ώστε να μπορεί να ανιχνευθεί και να ταυτοποιηθεί εύκολα. Το τελικό προϊόν της αντίδρασης είναι πιστό αντίγραφο του DNA που αποτελεί το στόχο. Η PCR χρησιμοποιεί θερμοάντοχες DNA πολυμεράσες και ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές (primers) σε συνδυασμό και με άλλα αντιδραστήρια τα οποία είναι απαραίτητα για την αντίδραση, για να κατευθύνει το θερμικό πολλαπλασιασμό της αλληλουχίας - στόχου, μέσω επανειλημμένων γύρων αποδιάταξης, σύνδεσης με εκκινητές και επιμήκυνσης. Η αντίδραση χωρίζεται σε στάδια και πραγματοποιείται σε συσκευή που ονομάζεται θερμοκυκλοποιητής (Τhermal Cycler): I. Το στάδιο της αποδιάταξης όπου το υπόστρωμα του DNA-στόχου επωάζεται σε υψηλή θερμοκρασία (περίπου 95 ο C), με αποτέλεσμα την αποδιάταξη της διπλής έλικας του DNA (σχήμα (Α)). II. Το στάδιο όπου με τη μείωση της θερμοκρασίας, οι εκκινητές της αντίδρασης υβριδίζονται με τη συμπληρωματική αλληλουχία του υποστρώματος (μονή έλικα του DNA στόχου) (σχήμα (Β)).. III. Το στάδιο της επέκτασης του DNA όπου σε θερμοκρασία (7-74 ο C), το τμήμα του DNA μεταξύ των εκκινητών συντίθεται με βάση τη συμπληρωματική αλληλουχία του υποστρώματος, από την (σχήμα (Γ)). Σχήμα : Βασική αρχή της PCR
Αυτά τα στάδια λαμβάνουν χώρα σε ένα θερμικό κύκλο. Συνήθως τα πρωτόκολλα της PCR περιλαμβάνουν 0-50 θερμικούς κύκλους (στο σχήμα παρουσιάζονται οι τέσσερις πρώτοι κύκλοι και τα προϊόντα που προκύπτουν σε αυτούς)). Η διαδικασία πολλαπλασιασμού της αλληλουχίας - στόχου διαρκεί -4 ώρες και ο πλήρης έλεγχος με την ανίχνευση του ηλεκτροφορητικά ή χρωματομετρικά με υβριδισμό νουκλεϊνικών οξέων (probes), ολοκληρώνεται σε 48 ώρες. Σχήμα : Οι 4 πρώτοι κύκλοι μιας PCR Έχουν αναπτυχθεί και άλλες μέθοδοι που βασίζονται στην ιδέα της συμβατικής PCR και αποτελούν παραλλαγές της αρχικής μεθόδου, όπως είναι η HotStart PCR, η Multiplex PCR, η Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) και η μέθοδος της Real Τime PCR. H μέθοδος της Real Τime PCR αποτελεί μια παραλλαγή της συμβατικής μεθόδου, η οποία μπορεί να ενισχύσει, να ανιχνεύσει και να ποσοτικοποιήσει μια αλληλουχίαστόχο με μεγαλύτερη ταχύτητα και αποτελεσματικότητα. Μεγάλο πλεονέκτημα της μεθόδου αποτέλεσε η δυνατότητα παρακολούθησης της εξέλιξης της αντίδρασης σε οποιοδήποτε στάδιο της βρίσκεται η αντίδραση. Η λειτουργία της τεχνολογίας Real Τime PCR βασίζεται στην χρήση μηχανισμών ανίχνευσης, με τη βοήθεια ειδικών χρωστικών που διεγείρονται και εκπέμπουν συγκεκριμένου μήκους κύματος φώς, (λ), όπως η SybrGreen καθώς και ιχνηθέτων (probes) αλλά και στις ειδικά διαμορφωμένες συσκευές Real Τime PCR που χρησιμοποιούνται για την εφαρμογή της. Οι συσκευές της Real Τime PCR βασίζονται τόσο στο σύστημα ανίχνευσης που διαθέτουν, για την ανίχνευση του σήματος που εκπέμπει ο εκάστοτε μηχανισμός ανίχνευσης, όσο και στο ειδικό λογισμικό με το οποίο αναλύονται τα αποτελέσματα που προκύπτουν κατά την διάρκεια της αντίδρασης.
Thermal Cycler (Θερμοκυκλοποιητής) συμβατικής PCR Thermal Cycler (Θερμοκυκλοποιητής) Real time PCR Ο ρόλος του κάθε συστατικού στο μίγμα της αντίδρασης Το DNA στόχος (target DNA): Προέρχεται από ποικιλία δειγμάτων. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί και σε μη καθαρό δείγμα, σε ελάχιστη ποσότητα DNA, αλλά και σε διασπασμένο DNA αρκεί η αλληλουχία στόχος που θα μεγεθυνθεί να είναι ακέραια, ώστε να εξασφαλιστεί η αντιγραφή της στο ο κύκλο της αντίδρασης. Η δομή της αλληλουχίας βάσεων του DNA είναι δυνατόν να είναι άγνωστη αλλά θα πρέπει να γνωρίζουμε την αλληλουχία βάσεων των πλευρικών περιοχών του ώστε να κατασκευασθούν τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (primers). Εκκινητές (primers): Ολιγονουκλεοτίδια μεγέθους 8-0 βάσεων. Με τους εκκινητές επιλέγεται το τμήμα DNA στόχος το οποίο θα μεγεθυνθεί μεταξύ των αφετηριών. Το προϊόν της αντίδρασης είναι το τμήμα DNA το οποίο έχει μεγεθυνθεί και το οποίο καθορίζεται από τις αφετηρίες που αποτελούν και τα άκρα του. Δεοξυριβονουκλεοτίδια (): Χρησιμοποιούνται ως υποστρώματα της αντίδρασης. : Μορφή θερμοάντοχης DNA ς η οποία έχει απομονωθεί από το βακτηρίδιο Thermus aquaticus (). H χρησιμοποίηση αυτής της θερμοάντοχης ς εξασφαλίζει την πραγματοποίηση της αντίδρασης σε υψηλή θερμοκρασία που απαιτείται για τον υβριδισμό (ειδική σύνθεση) των αφετηριών στο DNA στόχο και τη σύνθεση του νέου κλώνου DNA. MgCl και ρυθμιστικό : συγκεκριμένου ph για τη δράση του ενζύμου.
Η εφαρμογή της PCR στην ανάλυση των τροφίμων Η δυνατότητα ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης μίας προεπιλεγμένης αλληλουχίας DNA ή RNA μπορεί να αποτελέσει σημαντικό εργαλείο σε τομείς όπως η ιατρική (π.χ. για διάγνωση ασθενειών), η μοριακή βιολογία, η ιατροδικαστική, η εγκληματολογία και η βιομηχανία τροφίμων για ανίχνευση στα τρόφιμα: γενετικά τροποιημένων οργανισμών (GMO) αλλεργιογόνων ουσιών, νοθείας μικροοργανισμών Ένα γενικό πρωτόκολλο για την ενίσχυση τμημάτων DNA είναι το εξής: Συστατικά αντίδρασης Πυκνό Διάλυμα Τελική Συγκέντρωση PCR 0 x x mm 00μΜ εκκινητής μm 00nM εκκινητής μm 00nM MgCl 5 mm Ποικίλει (Βασική,,5 mm) DNA μήτρα - pg έως ng DNA Πολυμεράση 5 units/μl unit HPLC H O - Μέχρι τελικού όγκου 50μl Κάθε ένα από τα συστατικά της αντίδρασης τοποθετείται σε σωλήνα χωρητικότητας 0.ml κατάλληλο για αντιδράσεις PCR. Μόλις προστεθούν αναμειγνύονται καλά, φυγοκεντρούνται για λίγο ώστε να συγκεντρωθούν στην άκρη του σωλήνα και τοποθετούνται στην κεφαλή του θερμικού κυκλοποιητή που έχει προγραμματιστεί με το κατάλληλο πρόγραμμα. Πρόγραμμα αντίδρασης: Αριθμός κύκλων x x 0 x x Στάδιο Αποδιάταξη του DNA μήτρα για min στους 94 ο C Αποδιάταξη στους 94 ο C για 5 sec Υβριδισμός εκκινητών στους 5-55 ο C () για 5 sec Επιμήκυνση στους 7 ο C για 0 sec () Τελική επιμήκυνση προϊόντος στους 7 ο C για 0 min Διατήρηση στους 0 ο C ( ) Η θερμοκρασία υβριδισμού εξαρτάται από τη θερμοκρασία τήξης Tm του εκκινητή που υπολογίζεται από τον τύπο: 69, + 0,4 GC% - 650/αριθμό βάσεων εκκινητή. () Ο χρόνος επιμήκυνσης εξαρτάται από το μέγεθος του τμήματος DNA που ενισχύεται με βάση τις προδιαγραφές της θερμοανθεκτικής ς και οι οποίες για μια τυπική είναι,kb -.5kb/ min. 4
Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Θα πραγματοποιηθούν αντιδράσεις PCR για την ποιοτική ανίχνευση (ανά περίπτωση) γενετικής τροποποίησης και ύπαρξης ή όχι γενετικού υλικού συγκεκριμένου φυτικού ή βακτηριακού είδους (Σόγια, Σουσάμι, Listeria). Απαιτούμενες συσκευές, υλικά και διαλύματα - Θερμικός κυκλοποιητής - Αυτόματες πιπέτες και tips - α αντίδρασης 0,5 ml - Εκχυλίσματα DNA (αναφέρονται αναλυτικά παρακάτω) - Αντιδραστήρια PCR (αναφέρονται αναλυτικά παρακάτω) - Γάντια από latex Πειραματική διαδικασία - Οι σπουδαστές χωρίζονται σε ομάδες των ατόμων. Κάθε ομάδα θα πραγματοποιήσει αντιδράσεις. - Κάθε ομάδα ετοιμάζει τα δείγματα βάση του πίνακα που ακολουθεί. Χρησιμοποιούνται τα δεδομένα (θεωρητικό μέρος) για τον υπολογισμό των τελικών συγκεντρώσεων των αντιδραστηρίων στα σωληνάκια αντίδρασης, σε συνδυασμό με τον αριθμό των δειγμάτων που θα προετοιμάσει η κάθε ομάδα. Ο τελικός όγκος κάθε αντίδρασης είναι 5 μl. Οι ποσότητες σε μl καταγράφονται στην αντίστοιχη θέση του πίνακα και εν συνεχεία ετοιμάζονται οι αντιδράσεις - Το πρότυπο δείγμα για τις ομάδες, και είναι DNA αλεύρου σόγιας που περιέχει % άλευρο γενετικά τροποποιημένης σόγιας. Το πρότυπο δείγμα για την ομάδα 4 είναι DNA βακτηριακού στελέχους Listeria. - Όταν ολοκληρωθεί η προετοιμασία των δειγμάτων τα σωληνάκια με τα αντιδρώντα φυγοκεντρούνται στιγμιαία για - δευτερόλεπτα και τοποθετούνται στον θερμικό κυκλοποιητή για την έναρξη της διαδικασίας αντίδρασης της ς. - Όταν ολοκληρωθεί η αντίδραση τα προϊόντα των αντιδράσεων (amplicons) χρησιμοποιούνται για ηλεκτροφόρηση ώστε να ελεγχθεί(?) το αποτέλεσμα των αντιδράσεων. Θεωρητικά τα αναμενόμενα αποτελέσματα είναι τα ακόλουθα: Ομάδα Ομάδα θετικό? αρνητικό θετικό? αρνητικό Ομάδα Ομάδα 4 αρνητικό θετικό αρνητικό θετικό? αρνητικό 5
Πίνακας : Αντιδρασεις PCR για την ποιοτική ανίχνευση γενετικής τροποποίησης, σόγιας, σουσαμιού και Listeria. DNA Ομάδα Ομάδα Πρότυπο Μπισκότο Πρότυπο Μπισκότο δείγμα με σουσάμι DNA δείγμα με σουσάμι 5 S 5 S Soy Soy MgCl MgCl H O H O DNA Ομάδα Ομάδα 4 DNA από Μπισκότο Πρότυπο δείγμα με σουσάμι DNA δείγμα τυριού ή κρέατος Πρότυπο δείγμα Sesamy Sesamy List List MgCl MgCl H O H O Βιβλιογραφικές πηγές - Εργαστηριακές Ασκήσεις Βιοχημείας Ι, 00, Γ. Βαρθολομαίος, Κ. Δράϊνας, Γ. Κολιός - Βιοχημεία Ι, 006, J.Berg, J. Tymoczko, L. Stryer - Instant Notes in Molecular Biology, 998, P.C. Turner et al. - An Introduction to Practical Biochemistry, 988, D.T. Plummer - Laboratory Manual In Biochemistry, 988, J. Jayaraman - Molecular Biology of the Cell, 00, B. Alberts et al. - Short Protocols in Molecular Biology, 00, Ausubel et al. 6