Μοπιακοί μησανιζμοί ελέγσος ηηρ μεηάδοζηρ ηος ζήμαηορ ηηρ αςξηηικήρ οπμόνηρ ζε παιδιά με ζοβαπή ανεπάπκεια ζηην αύξηζη

Transcript

1 2010 ΓΙΓΑΚΣΟΡΙΚΗ ΓΙΑΣΡΙΒΗ ΚΑΡΑΓΕΩΡΓΟΥ ΙΟΥΛΙΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ, MSc Μοπιακοί μησανιζμοί ελέγσος ηηρ μεηάδοζηρ ηος ζήμαηορ ηηρ αςξηηικήρ οπμόνηρ ζε παιδιά με ζοβαπή ανεπάπκεια ζηην αύξηζη ΠΑΝΔΠΙΣΗΜΙΟ ΠΑΣΡΩΝ ΣΜΗΜΑ ΙΑΣΡΙΚΗ

2 Περιεχόμενα ΔΤΥΑΡΗΣΗΔ... 4 ΔΗΑΓΧΓΖ H ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ ΣΟ ΜΟΡΗΟ GH ΜΟΝΣΔΛΑ ΔΚΚΡΗΖ ΣΖ GH ΣΑ ΜΔΣΑΒΟΛΗΚΑ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ ΣΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ ΦΤΗΟΛΟΓΗΚΖ ΑΝΑΠΣΤΞΖ ΑΝΑΠΣΤΞΗΑΚΔ ΓΗΑΣΑΡΑΥΔ ΑΝΔΠΑΡΚΔΗΑ IGF-I ΝΔΤΡΟ-ΔΚΚΡΗΣΗΚΖ ΓΤΛΔΗΣΟΤΡΓΗΑ GH ΒΗΟ-ΑΝΔΝΔΡΓΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ ΗΓΗΟΠΑΘΔ ΚΟΝΣΟ ΑΝΑΣΖΜΑ ΠΟΡΔΗΑ ΜΔΣΑΓΧΓΖ ΣΟΤ ΖΜΑΣΟ ΑΡΝΖΣΗΚΟΗ ΡΤΘΜΗΣΔ ΣΖ ΖΜΑΣΟΓΟΣΖΖ ΣΖ GH ΑΛΛΔ ΠΟΡΔΗΔ ΜΔΣΑΓΧΓΖ ΖΜΑΣΟ ΠΟΤ ΔΝΔΡΓΟΠΟΗΟΤΝΣΑΗ ΑΠΟ ΣΖΝ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ: Ζ ΓΗΑΣΑΤΡΧΖ (CROSSTALKING) ΣΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ ΜΔ ΣΟΝ EGF Ο EGF ΚΑΗ Ζ ΠΟΡΔΗΑ ΜΔΣΑΓΧΓΖ ΣΟΤ ΖΜΑΣΟ ΣΟΤ: ΣΔΡΟΔΗΓΖ ΦΤΛΟΤ ΚΑΗ ΡΤΘΜΗΖ ΣΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ: OΗΣΡΑΓΗΟΛΖ ΠΟΡΔΗΑ ΜΔΣΑΓΧΓΖ ΖΜΑΣΟ ΣΧΝ ΟΗΣΡΟΓΟΝΧΝ: ΘΔΡΑΠΔΗΑ ΜΔ hgh (αλζξψπηλε ζπλζεηηθή απμεηηθή νξκφλε) ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ ΞΔΚΗΝΧΝΣΑ ΣΖΝ ΠΔΗΡΑΜΑΣΗΚΖ ΔΡΓΑΗΑ: ΛΖΦΖ ΚΑΗ ΓΗΑΥΔΗΡΗΖ ΒΗΟΦΗΧΝ: ΛΖΦΖ ΗΝΟΒΛΑΣΧΝ ΑΠΟ ΣΗ ΒΗΟΦΗΔ ΚΑΗ ΑΝΑΚΑΛΛΗΔΡΓΔΗΑ ΣΟΤ: ΠΑΓΧΜΑ, ΑΠΟΘΖΚΔΤΖ Δ ΤΓΡΟ ΑΕΧΣΟ ΚΑΗ ΑΠΟΦΤΞΖ ΚΤΣΣΑΡΧΝ: ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ, ΔΠΗΓΔΡΜΗΚΟ ΑΤΞΖΣΗΚΟ ΠΑΡΑΓΟΝΣΑ (EGF) ΚΑΗ ΣΖΝ 17Β-ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ ΣΗ ΚΑΛΛΗΔΡΓΔΗΔ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ: ΑΠΟΜΟΝΧΖ ΟΛΗΚΧΝ ΠΡΧΣΔΨΝΧΝ: ΑΠΟΜΟΝΧΖ RNA: ΑΠΟΜΟΝΧΖ ΠΤΡΖΝΗΚΧΝ ΔΚΥΤΛΗΜΑΣΧΝ:

3 2.9 SDS-PAGE ΖΛΔΚΣΡΟΦOΡΖΖ: ΖΛΔΚΣΡΟΜΔΣΑΦΟΡΑ Δ ΜΔΜΒΡΑΝΖ ΝΗΣΡΟΚΤΣΣΑΡΗΝΖ: ΑΝΟΟΑΝΗΥΝΔΤΖ ΠΡΧΣΔΨΝΧΝ: ΠΡΟΓΗΟΡΗΜΟ ΣΖ ΤΓΚΔΝΣΡΧΖ ΣΟΤ RNA: ΤΝΘΔΖ CDNA ΑΠΟ RNA ΜΔ ΑΝΣΗΣΡΟΦΖ ΜΔΣΑΓΡΑΦΖ (RT-PCR): PCR ΑΝΑΛΤΖ: ΑΝΑΛΤΖ ΣΧΝ ΠΡΟΨΟΝΣΧΝ ΣΖ PCR Δ ΠΖΚΣΧΜΑ ΑΓΑΡΟΕΖ: REAL-TIME PCR: ΠΡΟΓΗΟΡΗΜΟ ΤΓΚΔΝΣΡΧΖ ΠΡΧΣΔΨΝΖ: ΑΝΟΟΚΑΣΑΚΡΤΜΝΗΖ (IMMUNOPRECIPITATION): ΑΝΟΟΤΝΚΑΣΑΚΡΤΜΝΗΖ (CO-IMMUNOPRECIPITATION): ΚΟΠΟ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ ΔΠΗΚΟΠΖΖ: ΠΡΟΖΓΟΤΜΔΝΔ ΔΡΔΤΝΔ ΣΟΤ ΔΡΓΑΣΖΡΗΟΤ Α ΜΔΡΟ : PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ PIAS ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200 NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ PIAS ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000 NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ CIS, ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200 NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ PCR αλάιπζε ηνπ κνξίνπ CIS κεηά ηελ επαγσγή ησλ θπηηάξσλ κε 1000 ng/ml GH, ζε αζζελείο θαη κάξηπξεο ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΧΖ ΚΑΣΑ WESTERN ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ CIS ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200 NG/ML GH ΚΑΗ Δ ΥΡΟΝΟΤ 0 ΚΑΗ 30 Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΦΤΗΟΛΟΓΗΚΑ ΠΑΗΓΗΑ ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΧΖ ΚΑΣΑ WESTERN ΣΖ ΦΧΦΟΡΤΛΗΧΜΔΝΖ ΜΟΡΦΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ JAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200NG/ML GH ΚΑΗ Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ Δ ΜΑΡΣΤΡΔ ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΧΖ ΚΑΣΑ WESTERN ΣΖ ΦΧΦΟΡΤΛΗΧΜΔΝΖ ΜΟΡΦΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ JAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000NG/ML GH ΚΑΗ Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ Δ ΜΑΡΣΤΡΔ ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΧΖ ΚΑΣΑ WESTERN ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ JAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200NG/ML GH ΚΑΗ Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ Δ ΜΑΡΣΤΡΔ ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΧΖ ΚΑΣΑ WESTERN ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ JAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000NG/ML GH ΚΑΗ Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ Δ ΜΑΡΣΤΡΔ Β ΜΔΡΟ :

4 4.4.1 ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ PSTAT3 Δ ΚΤΣΣΑΡΑ ΑΘΔΝΧΝ ΚΑΗ ΦΤΗΟΛΟΓΗΚΧΝ ΠΑΗΓΗΧΝ, ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 200NG/ML GH ΚΑΗ 50NM EGF PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΣΟΤ ΔΠΗΓΔΡΜΗΚΟΤ ΑΤΞΖΣΗΚΟΤ ΠΑΡΑΓΟΝΣΑ (EGFR) ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΣΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ (GHR) ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΣΟΤ ΔΠΗΓΔΡΜΗΚΟΤ ΑΤΞΖΣΗΚΟΤ ΠΑΡΑΓΟΝΣΑ (EGFR) ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΣΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ (GHR) ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ COIMMUNOPRECIPITATION ΓΗΑ ΣΟΝ ΔΛΔΓΥΟ CROSS-TALKING ΣΖ GH ΜΔ ΣΟΝ EGF Γ ΜΔΡΟ : ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ PSTAT3 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 17Β- ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ Δ ΗΝΟΒΛΑΣΔ ΑΘΔΝΟΤ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΧΝ ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ PJAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 17Β- ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ Δ ΗΝΟΒΛΑΣΔ ΑΘΔΝΟΤ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΧΝ ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ STAT3 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 17β-ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ Δ ΗΝΟΒΛΑΣΔ ΑΘΔΝΟΤ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΧΝ ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ JAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 17Β-ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ Δ ΗΝΟΒΛΑΣΔ ΑΘΔΝΟΤ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΧΝ ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ CIS ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 17Β-ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ Δ ΗΝΟΒΛΑΣΔ ΑΘΔΝΟΤ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΧΝ ΤΕΖΣΖΖ ΤΜΠΔΡΑΜΑΣΑ ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ

5 ΔΤΥΑΡΙΣΙΔ Ζ παξνχζα δηδαθηνξηθή εξγαζία πξαγκαηνπνηήζεθε ζην Δξγαζηήξην Μνξηαθήο Αλαηνκηθήο, ηνπ Καζεγεηνχ θ. Ησάλλε Βαξάθε, ηεο Ηαηξηθήο ρνιήο ηνπ Παλεπηζηεκίνπ Παηξψλ, θαηά ην αθαδεκατθφ έηνο Θα ήζεια θαηαξρήλ λα εθθξάζσ ηηο επραξηζηίεο κνπ ζηνπο αλζξψπνπο απηνχο πνπ βνήζεζαλ κε ηνλ ηξφπν ηνπο ζηελ εθπφλεζε ηεο. Δπραξηζηψ ζεξκά ηελ αλαπιεξψηξηα θαζεγήηξηα Παηδηαηξηθήο Δλδνθξηλνινγίαο θπξία Γθξέθα πειηψηε Βαζηιηθή, γηα ηελ ηηκή πνπ κνπ έθαλε λα κε εκπηζηεπζεί θαη ζπκπεξηιάβεη ζην εξεπλεηηθφ ηεο πξφγξακκα, γηα ηηο πνιχηηκεο ζπκβνπιέο πνπ κνπ έδσζε θαηά ηε δηάξθεηα ηνπ πεηξακαηηθνχ κέξνπο, αιιά θαη ηεο ζπγγξαθήο ηεο παξνχζαο εξγαζίαο, φπσο επίζεο θαη γηα ηελ πξνζπκία κε ηελ νπνία δερφηαλ θαη απαληνχζε θάζε απνξία κνπ. Καζψο επίζεο θαη ηελ επθαηξία πνπ κνπ έδσζε λα παξαθνινπζήζσ Παγθφζκηα πλέδξηα. ηνλ Καζεγεηή Αλαηνκίαο θαη Γηεπζπληή ηνπ Δξγαζηεξίνπ Μνξηαθήο Αλαηνκίαο θαη Ηζηνινγίαο, θχξην Ησάλλε Βαξάθε, ν νπνίνο κε δέρηεθε εγθάξδηα ζην ρψξν ηνπ εξγαζηεξίνπ ηνπ θαη κνπ έδσζε ηε δπλαηφηεηα λα δηεθπεξαηψζσ αβίαζηα ηελ παξνχζα εξγαζία ζην εξγαζηήξην ηνπ. Καζψο επίζεο γηα ηελ πνιχηηκε θαη θαζνξηζηηθή ζπκπαξάζηαζή ηνπ ζε θάζε δπζθνιία κνπ. Σε εξεπλήηξηα θαη κεηαδηδάθηνξα, θχξηα Rojas, Paola γηα ηε βνήζεηα θαη θαζνδήγεζε ηεο ζην πεηξακαηηθφ κέξνο ηεο παξνχζαο εξγαζίαο θαη ηελ πξνζπκία ηεο λα κε βνεζήζεη λα αληαπεμέιζσ ζε δπζθνιίεο πνπ αληηκεηψπηζα θαζ φιε ηε δηάξθεηα ηεο πνξείαο κνπ ζην Δξγαζηήξην. Σελ επίθνπξε θαζεγήηξηα Αλαηνκίαο θχξηα Μάξζα Αζεκαθνπνχινπ γηα ηε θηιηθή δηάζεζε πνπ έδεημε απέλαληί κνπ, ηεο ζπκβνπιέο ηεο θαζψο θαη γηα ηελ πξνζπκία ηεο λα ζπκκεηάζρεη ζηελ ηξηκειή εμεηαζηηθή επηηξνπή. Σέινο ζα ήζεια πξαγκαηηθά λα επραξηζηήζσ ηελ νηθνγέλεηά κνπ, πνπ αλ θαη βξηζθφηαλ καθξηά, κνπ έδηλε ηελ αγάπε φια απηά ηα ρξφληα θαη ςπρηθή δχλακε, ψζηε λα ζπλερίδσ αθάζεθηε θαη ηηο ζπκβνπιέο ψζηε λ αληηκεησπίδσ θάζε εκπφδην. Ζ εκπηζηνζχλε ηνπο ζε έκελα, είλαη θαηαιπηηθή φια απηά ηα ρξφληα. 4

6 ΔΗΑΓΧΓΖ 1.1 H ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ Ζ απνηειεζκαηηθφηεηα ηνπ ελδνθξηληθνχ ζπζηήκαηνο βαζίδεηαη ζηελ ζπγθεθξηκέλε αιιειεπίδξαζε κηαο νξκφλεο κε ηνλ ππνδνρέα ηεο. ηελ πεξίπησζε ησλ πεπηηδηθψλ νξκνλψλ θαη ησλ θπηηαξνθηλψλ απηφ αθνξά πνιχπινθεο αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ πξσηετλψλ θαη πνιιαπιψλ γεγνλφησλ θπηηαξηθήο αλαγλψξηζεο. Έλα απφ ηα παξαδείγκαηα απηψλ ησλ αιιειεπηδξάζεσλ, ην νπνίν έρεη κειεηεζεί επηζηακέλα, είλαη κεηαμχ ηεο απμεηηθήο νξκφλεο (growth hormone- GH) θαη ηνπ ππνδνρέα ηεο (GHR).(1) Οη πξψηνη πνπ αλαθάιπςαλ έλαλ ππνθπζηαθφ παξάγνληα ν νπνίνο απμάλεη ηελ αλάπηπμε ζηα δψα, θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο δεθαεηίαο ηνπ 1920, ήηαλ νη Evans θαη Simpson. Οη επηζηήκνλεο απηνί έδεημαλ πσο έλα ππνθπζηαθφ εθρχιηζκα βννεηδψλ ζπλέβαιε ζηελ αλάπηπμε ησλ αξνπξαίσλ. Με βάζε ηελ παξαηήξεζε απηή, ε δξαζηεξηφηεηα νλνκάζηεθε, απμεηηθή νξκφλε (GH). Καηά ηελ δηάξθεηα ηεο επφκελεο δεθαεηίαο, έγηλαλ κειέηεο πνπ έδεημαλ πσο θαη ηα εθρπιίζκαηα ηνπ πξφζζηνπ ινβνχ ηεο ππφθπζεο είραλ κεηαβνιηθά απνηειέζκαηα, φπσο ε κείσζε ηνπ ιίπνπο θαη ε αχμεζε ηνπ γάιαηνο ζηα δψα. Ζ απνκφλσζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο απφ ηνλ πξφζζην ινβφ ηεο ππφθπζεο επηηεχρζεθε ην 1945, θαη ε δξαζηεξηφηεηα ηεο ζηελ αχμεζε ηεο αλάπηπμεο θαη ηνπ γαιαθηηζκνχ ζπζρεηίζηεθε κε ηα αξρηθά αθαηέξγαζηα εθρπιίζκαηα ηνπ πξφζζηνπ ινβνχ ηνπ αδέλα ηεο ππφθπζεο. Ζ πξφνδνο ζηελ κνξηαθή βηνινγία θαη ζηε γελεηηθή κεραληθή ζηα ηέιε ηεο δεθαεηίαο ηνπ 1970 θαη ζηηο αξρέο ηεο δεθαεηίαο ηνπ 1980 επέηξεςε ηελ ρξήζε ηνπ αλαζπλδπαζκέλνπ DNA γηα ηελ παξαγσγή κεγάισλ πνζνηήησλ απμεηηθήο νξκφλεο βννεηδψλ (bgh) απφ βαθηεξηαθά πιαζκίδηα πνπ πεξηείραλ ην γνλίδην bgh. Ζ δηαζεζηκφηεηα κεγάισλ πνζνηήησλ bgh καο παξείρε αξθεηή πξσηεΐλε γηα λα ηελ ρξεζηκνπνηήζνπκε ζηελ έξεπλα ζρεηηθά κε ηα απνηειέζκαηα ησλ πξσηετλψλ πάλσ ζηα δψα. Πξηλ ηελ εκθάληζε ηεο γελεηηθήο κεραληθήο, ε κνλαδηθή πεγή ηεο αλζξψπηλεο απμεηηθήο νξκφλεο ήηαλ ηα πηψκαηα πξσηεπφλησλ. Απφ ηα πηψκαηα αθαηξνχληαλ νη αδέλεο ηεο ππφθπζεο θαη ζηελ ζπλέρεηα γηλφηαλ ε επεμεξγαζία ησλ νξκνλψλ, νη νπνίεο θαηφπηλ ρνξεγνχληαλ ζε αλζξψπνπο πνπ παξνπζίαδαλ έιιεηςε απμεηηθήο νξκφλεο. (2) 5

7 Σν 1981, κηα ακεξηθαληθή θαξκαθεπηηθή εηαηξεία αλέπηπμε ηελ πξψηε ζπλζεηηθή αλζξψπηλε απμεηηθή νξκφλε, ε νπνία έγηλε γλσζηή ζαλ αλαζπλδπαζκέλε αλζξψπηλε απμεηηθή νξκφλε (rhgh). Απηή ε κνξθή ζπλζεηηθήο απμεηηθήο νξκφλεο είλαη ρεκηθά παξφκνηα κε ηελ απμεηηθή νξκφλε πνπ παξάγεηαη απφ ηελ ππφθπζε. ήκεξα ε αλζξψπηλε απμεηηθή νξκφλε δηαηίζεηαη απφ πνιιέο θαξκαθεπηηθέο εηαηξείεο, ζε φιν ηνλ θφζκν. (3-5) Πνιιέο κειέηεο έδεημαλ πσο νη πεξηζζφηεξεο ζπλέπεηεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο είλαη έκκεζεο, θαη απηφ νθείιεηαη ζην φηη έλα απφ ηα ζεκαληηθφηεξα φξγαλα-ζηφρνπο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο είλαη ην ήπαξ. Με ηελ δηέγεξζε απφ ηελ GH, ην ήπαξ ζπλζέηεη θαη εθθξίλεη ηνλ insulin like growth factor-1 ( IGF-1), πνπ δξα ζαλ νξκφλε γηα λα πξνθαιέζεη πνιιά απφ ηα απνηειέζκαηα ηα νπνία αξρηθά ζεσξνχζακε πσο είλαη άκεζα απνηειέζκαηα ηεο GH ζε άιινπο ηζηνχοζηφρνπο, φπσο είλαη ν κπο, ηα νζηά θαη ν ιηπψδεο ηζηφο. (2) 1.2 ΣΟ ΜΟΡΗΟ GH Ζ απμεηηθή νξκφλε, πνπ είλαη γλσζηή θαη ζαλ ζσκαηνηξνπίλε, ζπληίζεηαη θαη εθθξίλεηαη απφ ηα ζσκαηνηξφπα θχηηαξα ηνπ πξφζζηνπ ινβνχ ηεο ππφθπζεο. Σα θχηηαξα απηά απνηεινχλ ην 40-50% ησλ θπηηάξσλ ηνπ πξφζζηνπ ινβνχ ηεο ππφθπζεο. Αληαπνθξίλνληαη απειεπζεξψλνληαο hgh αληηδξψληαο ζηελ Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH) (ζσκαηνηξνπίλε), ή αλαζηέιινληαη απφ ηελ Growth Hormone Inhibiting Hormone (GHIH) (ζσκαηνζηαηίλε). Καη νη δπν πξνέξρνληαη απφ ηνλ ππνζάιακν. Σα ζσκαηνηξφπα θχηηαξα ηαμηλνκνχληαη ζαλ νμεφθηια θχηηαξα. (5) ΑΥΞΗΤΙKΗ ΟΡΜΟΝΗ (GH) Ζ GH είλαη κηα πξσηεΐλε κηαο αιπζίδαο, κε κνξηαθφ βάξνο γχξσ ζηα 22,000 Daltons. ηα πεξηζζφηεξα είδε ην βαζηθφ ηζφκνξθν ηεο GH απνηειείηαη απφ 191 ακηλνμέα. Ζ δνκή ηεο πεξηέρεη δπν δηζνπιθηδηθνχο δεζκνχο, πνπ δηαηεξνχλ ηελ ηξηζδηάζηαηε δνκή ηεο, θαη πεξηιακβάλεη ηέζζεξηο έιηθεο πνπ είλαη αλαγθαίεο γηα ηελ ιεηηνπξγηθή αιιειεπίδξαζε κε ηνλ ππνδνρέα GH. H GH ηαμηλνκείηαη σο κηα 6

8 πεπηηδηθή νξκφλε. Δπηπιένλ, ε αθνινπζία ακηλνμέσλ ηεο πξσηεΐλεο GH είλαη παξφκνηα κε ηεο πξνιαθηίλεο (PRL) θαη ηεο πιαθνπληηθήο γαιαθηνγφλνπ (PL) ή θαη ηεο αλζξψπηλεο ρνξηνληθήο ζσκαηνπξνιαθηίλεο (hcs). Ζ πξνιαθηίλε είλαη ε νξκφλε ε νπνία ζπκκεηέρεη θπξίσο ζηελ επαγσγή ηεο ζχλζεζεο γάιαθηνο ζηα ζειαζηηθά. Ζ PL ζπληίζεηαη ζηνλ πιαθνχληα θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο εγθπκνζχλεο, θαη ζεσξείηαη ζαλ ν ξπζκηζηήο ηεο πξνκήζεηαο γιπθφδεο ζην έκβξπν, ηεο κεηξηθήο πξνιαθηηλνγέλεζεο θαη, ζε νξηζκέλα είδε, ηεο εκβξπτθήο αλάπηπμεο. Δμαηηίαο απηήο ηεο επηθαιππηφκελεο νκνινγίαο ακηλνμέσλ, νη PRL, PL, GH έρνπλ επηθαιππηφκελεο βηνινγηθέο δξάζεηο. (2) Δικόνα 1: Δηθόλα 1: 1Οη δνκέο ηεο απμεηηθήο νξκόλεο θαη ηεο πξνιαθηίλεο, εκθαλίδνπλ δύν κόξηα θπζηείλεο ηα νπνία ζρεκαηίδνπλ ελδνκνξηαθνύο δηζνπιθηδηθνύο δεζκνύο, έρνπλ ακηλνμέα θαη νη αιιεινπρίεο ηνπο παξνπζηάδνπλ πνιιέο ηαπηόζεκεο πεξηνρέο.. Σν ζεκαληηθφ γνλίδην γηα ηελ αλζξψπηλε απμεηηθή νξκφλε, καδί κε άιια ηέζζεξα ζρεηηθά γνλίδηα, βξίζθεηαη ζηελ πεξηνρή q22-24 ηνπ ρξσκνζψκαηνο 17. ηελ ζέζε απηή είλαη δηάζπαξηα ζηνλ ίδην κεηαγξαθηθφ πξνζαλαηνιηζκφ. Πξφθεηηαη γηα κηα δηάηαμε πνπ ζεσξνχκε πσο έρεη πξνθχςεη κέζσ κηαο ζεηξάο γνληδηαθψλ δηπιαζηαζκψλ. (6) Δικόνα 2: Δηθόλα 2: Aπεηθνλίδνληαη νη δύν παξαιιαγέο ηηο απμεηηθήο νξκόλεο θαζώο επίζεο θαη νη ηξείο ρνξηνληθέο ζσκαηνπξνιαθηνηξνπίλεο ζην ρξσκόζσκα 17. 7

9 Όπσο έρνπκε ήδε αλαθέξεη, ππάξρνπλ πέληε γνλίδηα πνπ ζρεηίδνληαη κε ηελ απμεηηθή νξκφλε. Απηφ ην ζπγθεθξηκέλν κέινο ηεο νηθνγέλεηαο, ην GH1 (GH-N), εθθξάδεηαη θπξίσο ζηελ ππφθπζε φρη φκσο θαη ζηνλ ηζηφ ηνπ πιαθνχληα. Τπάξρνπλ επίζεο θαη άιιεο παξαιιαγέο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, νη GH2 (GH-V), θαη νη ηξείο ρνξηνληθέο ζσκαηνπξνιαθηνηξνπίλεο (CS-L, CS-A, CS-B). O Lewis θαη νη ζπλεξγάηεο ηνπ πεξηέγξαςαλ ην 1978 ηελ δνκηθή παξαιιαγή ηεο αλζξψπηλεο απμεηηθήο νξκφλεο, ηελ GH2. Ζ κνξηαθή ηεο κάδα ππνινγίζηεθε ζηα 20 kd πεξίπνπ. Ζ παξαιιαγή είρε αξθεηέο δηαθνξέο ακηλνμέσλ θαη δελ ήηαλ ζπλαθήο κε ηα αληίζσκαηα σο πξνο ηελ αλζξψπηλε απμεηηθή νξκφλε. Σν 1982 ν Seeburg κειέηεζε ηελ δνκή ηνπ γνληδίνπ GH2, ην νπνίν νλφκαδε γνλίδην GHV. To GHV γνλίδην θαη νη άιιεο ηξεηο ρνξηνληθέο ζσκαηνπξνιαθηηλνηξνπίλεο δελ εθθξάδνληαη ζηελ ππφθπζε, φκσο, φπσο έδεημε ν Liebhaber θαη νη ζπλεξγάηεο ηνπ ην 1989, εθθξάδνληαη απφ ην επηζήιην ηεο ζπγθχηην-ηξνθνβιάζηεο ηνπ πιαθνχληα, θαη επνκέλσο παξάγνληαη απφ ηνλ εκβξπτθφ γνλφηππν. Σα 5 γνλίδηα ζπλδένπλ λνπθιενηίδηα ζηελ δηάηαμε: 5 GH-N CS-L- CS-A- GH-V- CS-B- 3. Οη πξσηεΐλεο GH1, GH2 δηαθέξνπλ ζε 13 θαηάινηπα. Δπίζεο, νη ψξηκεο κνξθέο ησλ CS-A, CS-B είλαη παξφκνηεο. Ζ νκνηφηεηα ζηελ αλαπηπμηαθή θαη ζηελ εηδηθή ηζηηθή έθθξαζε κε απηή ησλ ζρεηηθψλ γνληδίσλ CSA, CSB ππνδεηθλχεη πσο ηα γνλίδηα απηά κπνξεί λα κνηξάδνληαη θνηλά ξπζκηζηηθά ζηνηρεία. (7) Σν CS-L θαίλεηαη πσο είλαη έλα ςεπδφγνλίδην, ελψ δελ έρεη εληνπηζηεί πνηέ κηα πξσηεΐλε CS-L. Κάζε γνλίδην απνηειείηαη απφ πέληε εμφληα πνπ ζπλδπάδνπλ 1500 λνπθιενηίδηα. Σα πέληε γνλίδηα παξνπζηάδνπλ κηα αμηνζεκείσηε νκνηφηεηα φζνλ αθνξά ηελ αθνινπζία. Σν ελαιιαθηηθφ κάηηζκα παξάγεη πξφζζεηα ηζφκνξθα θάζε κηαο απφ ηηο πέληε απμεηηθέο νξκφλεο, δεκηνπξγψληαο πξφζζεηε δηαθνξεηηθφηεηα θαη ελδερφκελε εμεηδίθεπζε. Απηά ηα κε-22- kda ηζφκνξθα κπνξεί λα είλαη αδχλακνη αγσληζηέο ή αθφκε θαη αληαγσληζηέο ηεο δέζκεπζεο GHR, έρνληαο ζαλ απνηέιεζκα αιιαγκέλν νκνδηκεξηζκφ θαη αιιαγκέλε ελεξγνπνίεζε ππνδνρέα, πνπ εμαξηψληαη απφ ηηο ζρεηηθέο ζπγγέλεηεο γηα ηηο ζέζεηο δέζκεπζεο ζηoλ GHR. Μεηαιιάμεηο ή εμαιείςεηο ηνπ γνληδίνπ έρνπλ ζαλ απνηέιεζκα ηελ έιιεηςε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Ζ απμεηηθή νξκφλε πνπ εμάγεηαη απφ δψα πνπ βξίζθνληαη πην ρακειά ζηελ εμειηθηηθή θιίκαθα δελ επεξεάδεη ηνπο αλζξψπνπο. Σα θαηνηθίδηα αληαπνθξίλνληαη θαιχηεξα ζηελ απμεηηθή νξκφλε απφ ην δηθφ ηνπο είδνο. Απηφ νθείιεηαη ζηελ δηαθνξεηηθφηεηα ησλ πξσηετλψλ, πνπ παξνπζηάδνπλ δηαθνξεηηθή πεξηεθηηθφηεηα ακηλνμέσλ κεηαμχ ησλ εηδψλ. Γηα παξάδεηγκα, ε νκνηφηεηα ακηλνμέσλ κεηαμχ ησλ 8

10 βννεηδψλ θαη ησλ πξνβάησλ φζνλ αθνξά ηελ απμεηηθή νξκφλε είλαη 99,5%, ελψ απηή ησλ ρνίξσλ βξίζθεηαη ζην 90% ζε ζρέζε κε ηα βννεηδή. Αληίζεηα, ε hgh έρεη νκνηφηεηα ακηλνμέσλ κφλν 68% κε ηελ bgh. Οη δηαθνξέο απηέο ζηελ αθνινπζία κεηαμχ ησλ εηδψλ παίδνπλ ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ δέζκεπζε ησλ επαηηθψλ ππνδνρέσλ. Δπνκέλσο, ε hgh είλαη κφλν θαηά ην έλα-δέθαην απνηειεζκαηηθή ζηελ δέζκεπζε ηνπ ππνδνρέα bgh ζε ζρέζε κε ηελ bgh. Γηα ηνλ ιφγν απηφ, ε απμεηηθέο νξκφλεο ησλ βννεηδψλ, ησλ ρνίξσλ θαη ησλ πξνβάησλ δελ έρνπλ θαλέλα απνηέιεζκα πάλσ ζηνπο αλζξψπνπο. Ζ GHR θαη ε νξκφλε ηεο έρνπλ βαζηθή ζεκαζία ζηελ ξχζκηζε ηνπ κεηαβνιηζκνχ ζηνπο αλζξψπνπο, θαη γηα ηνλ ιφγν απηφ ε θπηηαξηθή ηεο βηνινγία ζα πξέπεη λα ξπζκίδεηαη πξνζεθηηθά θαη κε αθξίβεηα. (2,6,8) 1.3 ΜΟΝΣΔΛΑ ΔΚΚΡΗΖ ΣΖ GH Ζ έθθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, φπσο θαη θάζε άιιεο νξκφλεο ηνπ πξφζζηνπ ινβνχ ηεο ππφθπζεο, ξπζκίδεηαη κέζσ ελφο πνιχπινθνπ λεχξνελδνθξηληθνχ ζπζηήκαηνο ειέγρνπ, ην νπνίν απνηειείηαη απφ δπν βαζηθνχο ππνζαιάκηνπο ξπζκηζηέο θαη κηα νξκφλε απφ ην ζηνκάρη. Ζ πξψηε θαη ε δεχηεξε αλαθέξνληαη ζαλ νξκφλε απειεπζέξσζεο GH (GHRH) θαη ζαλ ζσκαηνζηαηίλε (SRIH, SS) θαη ε ηξίηε ζαλ Ghrelin. Οη SS, GHRH αζθνχλ αλαζηαιηηθέο θαη δηεγεξηηθέο επηδξάζεηο αληίζηνηρα, πάλσ ζην ζσκαηφηξνπν θχηηαξν. Καη νη δπν, πνπ ππφθεηληαη ζε ξχζκηζε απφ άιια ππνζαιάκηα πεπηίδηα θαη απφ πνιχπινθα δίθηπα λεπξνδηαβηβαζηψλ λεπξψλσλ, απνηεινχλ ηνπο ηειηθνχο κεζνιαβεηέο ησλ κεηαβνιηθψλ, ελδνθξηληθψλ, λεπξηθψλ θαη αλνζνπνηεηηθψλ επηξξνψλ γηα ηελ έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο ζηελ ππφθπζε. Ζ Ghrelin αληίζηξνθα πξνζδέλεηαη ζε ππνδνρείο ζε ζσκαηνηξφπα θχηηαξα θαη δηεγείξεη ηελ έθθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Ζ παξαγσγή ηεο απμεηηθήο νξκφλεο εμαξηάηαη απφ πνιινχο παξάγνληεο, ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ θαη ηνπ ζηξεο, ηεο άζθεζεο, ηεο δηαηξνθήο, ηνπ χπλνπ θαη ηεο ίδηαο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. (9,10) 9

11 Δικόνα 3: Ζ GHRH είλαη επίζεο γλσζηή θαη ζαλ ζσκαηνθξηλίλε ή ζαλ παξάγνληαο απειεπζέξσζεο απμεηηθήο νξκφλεο. Δίλαη κηα πεπηηδηθή νξκφλε 44 ακηλνμέσλ πνπ παξάγεηαη ζηνλ ηνμνεηδή ππξήλα ηνπ ππνζαιάκνπ καδί κε άιινπο ηζηνχο, γηα παξάδεηγκα, ηζηνχο ηνπ αλνζνπνηεηηθνχ, ηνπ πιαθνχληα, ησλ εληέξσλ θαη γνλαδηθνχο. ( Ζ GHRH απειεπζεξψλεηαη απφ λεπξνεθθξηηηθνχο λεπξηθνχο αθξέκνλεο ησλ ηνμνεηδψλ λεπξψλσλ θαη κεηαθέξεηαη κέζσ ηεο ππνζαιάκηαο-ππνθπζηαθήο ππιαίαο θπθινθνξίαο ζηνλ πξφζζην ππνθπζηαθφ αδέλα, φπνπ δηεγείξεη ηελ έθθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Απειεπζεξψλεηαη κε παικηθφ ηξφπν, δηεγείξνληαο κηα παξφκνηα παικηθή απειεπζέξσζε απμεηηθήο νξκφλεο. Έρνπλ εληνπηζηεί GHRH άλνζν-ζεηηθνί λεπξψλεο (IR) ζε ζηεθαληαίεο θαη νβειηαίεο θξπνηνκέο ππνζαιάκσλ βννεηδψλ θαη ρνίξσλ. GHRH άλνζν-ζεηηθέο ίλεο πξνβάινπλ ζηελ θνηιηαθά κέζα ζηελ ΜΠ (κέζε πεξηνρή) θαη ζηα δπν απηά είδε δψσλ. ηελ κεηαγσγή ηνπ ζήκαηνο ζπκκεηέρνπλ ε πξσηεΐλε Gs, ε αδελπιηθή θπθιάζε (ηζφκνξθν ΗΗ θαη/ ή IV), θπθιηθφ 39, 59αδελνζίληληθε camp θαη ε πξσηετληθή θηλάζε Α. Τπάξρεη έλα ζηνηρείν αληίδξαζεο camp αλνδηθά ηεο θσδηθεχνπζαο πεξηνρήο ηνπ γνληδίνπ GH. Ζ GHRH απμάλεη ηελ έθθξαζε ηεο GH. Οη ελδνθπηηαξηθέο ζπγθεληξψζεηο Ca2+ απμάλνληαη απφ ηελ GHRH. Απηφ αθνξά θαη ηελ εηζξνή Ca2+ (κέζσ L-, T- ηχπνπ επαίζζεηα ζε ηάζε θαλάιηα Ca2+), θαη κέζσ ηεο πδξφιπζεο θσζθνιηπάζεο C ηεο θσζθαηηδπινηλνζηηφιεο, νδεγψληαο ζηελ θηλεηνπνίεζε ελδνθπηηαξηθψλ απνζεθεχζεσλ Ca2+. (11) 10

12 Δικόνα 4: Ζ ζσκαηνζηαηίλε (SRIF), πνπ είλαη επίζεο γλσζηή θαη σο αλαζηαιηηθή νξκφλε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο (GHIH) ή ζαλ αλαζηαιηηθφο παξάγνληαο απειεπζέξσζεο ζσκαηνηνηξνπίλεο (SRIF). Πξφθεηηαη γηα κηα πεπηηδηθή νξκφλε ε νπνία ξπζκίδεη ην ελδνθξηληθφ ζχζηεκα θαη επεξεάδεη ηελ λεπξνδηαβίβαζε θαη ηνλ θπηηαξηθφ πνιιαπιαζηαζκφ κέζσ ηεο αιιειεπίδξαζεο ηεο κε ππνδνρείο ζσκαηνζηαηίλεο ζπλδπαζκέλνπο κε πξσηεΐλε-g θαη ηεο αλαζηνιήο ηεο απειεπζέξσζεο αξθεηψλ νξκνλψλ. Βξέζεθε πσο εθθξίλεηαη απφ κηα επξεία γθάκα ηζηψλ, ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ ηνπ παγθξέαηνο, ηνπ εληέξνπ, θαη πεξηνρψλ ηνπ θεληξηθνχ λεπξηθνχ ζπζηήκαηνο έμσ απφ ηνλ ππνζάιακν. (12) Ζ ζσκαηνζηαηίλε έρεη δπν ελεξγέο κνξθέο, κηα κε 14 θαη κηα δεχηεξε κε 28 ακηλνμέα. Καη νη δπν κνξθέο ηεο ζσκαηνζηαηίλεο παξάγνληαη απφ πξσηενιπηηθή ζράζε ηεο πξνζσκαηνζηαηίλεο, ε νπνία πξνέξρεηαη απφ ηελ πξν-πξνζσκαηνζηαηίλε (Δηθ.5). Γπν θαηάινηπα θπζηείλεο ζηελ SS-14 επηηξέπνπλ ζην πεπηίδην λα ζρεκαηίζεη έλαλ εζσηεξηθφ δηζνπιθηδηθφ δεζκφ. Μηα ζεκαληηθή ιεηηνπξγία ηεο SRIF είλαη ε θαηαζηνιή ηεο απειεπζέξσζεο, αιιά φρη ηεο ζχλζεζεο, ηεο GH απφ ηα ζσκαηνηξφπα θχηηαξα. Έρνπλ εληνπηζηεί λεπξψλεο SRIF-IR ζε ηζηνχο ηνπ ππνζαιάκνπ ζε βννεηδή θαη ζε ρνίξνπο. Γηπνιηθά SRIF-IR πεξηθάξπα βξίζθνληαη πεξίπνπ ζηελ ηξίηε θνηιία ζηνλ πεξηθνηιηαθφ ππξήλα. Οη ίλεο SRIF-IR πξνβάιινληαη θνηιηαθψο κέζα ζην ΜΔ. Ίλεο SRIF-IR λεπξψλνπλ ππθλά ηνλ κέζν θνηιηαθφ θαη ηνλ ηνμνεηδή ππξήλα ζηνπο ρνίξνπο, φκσο δελ είλαη ηφζν δηαθξηηνί φζν είλαη ζηα βννεηδή. Ζ δηπιή αλνζνρξψζε απνθαιχπηεη κηα απφζεζε ηλψλ SRIF-IR κε πεξηθάξπα GHRH-IR ζην ARC θαη ζηνλ κέζν θνηιηαθφ ππξήλα θαη κηα απφζεζε θηξζψλ SRIF-, GHRH-IR ζην ΜΔ. Ο 11

13 ππνδνρέαο ηεο ζσκαηνζηαηίλεο (SSTR) θσδηθνπνηείηαη απφ πέληε δηαθνξεηηθά γνλίδηα (SSTR1-5), πνπ φια είλαη κέιε ηεο ππέξ-νηθνγέλεηαο ησλ ππνδνρέσλ πνπ ζπδεχγλπληαη κε G-coupled πξσηεΐλεο. Κάζε έλαο απφ ηνπο ππνδνρείο ελεξγνπνηεί δηαθξηηνχο κεραληζκνχο ζεκαηνδφηεζεο κέζα ζηα θχηηαξα, αλ θαη φινη αλαζηέιινπλ ηελ αδελπιίθε θπθιάζε. Σέζζεξηο απφ ηνπο πέληε ππνδνρείο δελ δηαθνξνπνηνχλ ηελ SS-14 απφ ηελ SS-28. Σν θπξίαξρν γνλίδην ην νπνίν επεξεάδεη ηελ απειεπζέξσζε απμεηηθήο νξκφλεο απφ ην ζσκαηφηξνπν θαίλεηαη πσο είλαη ην SSTR-2 (αξνπξαίνη). Ζ κεηαγσγή ηνπ ζήκαηνο πεξηιακβάλεη ηε ειάηησζε ηεο G coupled πξσηεΐλεο ζε L-, T- ηχπνπ επαηζζεηνπνηεκέλα ζε εηζξνή Ca2+ θαλάιηα θαη ζε θαλάιηα κε απμεκέλν Κ+. (11) Δικόνα 5: Δηθόλα 5: Απεηθνλίδεηαη ε ζράζε ηνπ πεπηηδίνπ γηα ηελ δεκηνπξγία ησλ δπν κνξίσλ ζσκαηνζηαηίλεο. H Γκρελίνη (Ghrelin) αξρηθά ζπληίζεηαη ζαλ κηα πξν-πξν νξκφλε, θαη ζηε ζπλέρεηα γίλεηαη επεμεξγαζία ηεο πξσηενιπηηθά, ε νπνία παξάγεη έλα πεπηίδην 28 ακηλνμέσλ. Μηα ελδηαθέξνπζα θαη κνλαδηθή ηξνπνπνίεζε γίλεηαη ζηελ νξκφλε θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο ζχλζεζεο κε ηελ κνξθή ελφο δεζκνχ λ-νθηαλνηθνχ νμέσο κε έλα απφ ηα ακηλνμέα. Ζ ηξνπνπνίεζε απηή είλαη αλαγθαία γηα ηελ βηνινγηθή δξαζηεξηφηεηα. Ζ ζχλζεζε ηεο Ghrelin γίλεηαη θπξίσο ζηα επηζήιηα θχηηαξα πνπ βξίζθνληαη ζηνλ ζφιν ηνπ ζηνκάρνπ, ελψ κηθξφηεξεο πνζφηεηεο παξάγνληαη ζηνλ πιαθνχληα, ζηα λεθξά, ζηελ ππφθπζε θαη ζηνλ ππνζάιακν. Πξνηνχ θαλ αλαθαιπθζεί ε Ghrelin ήηαλ γλσζηφο ν ππνδνρέαο ηεο. Σα θχηηαξα κέζα ζηνλ πξφζζην ινβφ ηεο ππφθπζεο έρνπλ έλαλ ππνδνρέα, ν νπνίνο, φηαλ ελεξγνπνηεζεί, δηεγείξεη έληνλα ηελ έθθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Οη ππνδνρείο γηα ηελ Ghrelin εθθξάδνληαη κε λεπξψλεο ζηνλ ηνμνεηδή ππξήλα θαη ζηνλ κέζν-θνηιηαθφ ππνζάιακν. Ο ππνδνρέαο ηεο είλαη έλαο δηακεκβξαληθφο ππνδνρέαο επηά πεξηνρψλ πνπ ζπδεπγλχεηαη κε G coupled-πξσηεΐλεο, γλσζηφο ζαλ GHS-R. O GHS-R έρεη εληνπηζηεί ζηνλ ππνζάιακν, ζηελ θαξδηά θαη ζηνλ ιηπψδε ηζηφ. Ζ Ghrelin παίδεη 12

14 ζεκαληηθφ λεπξνηξνθηθφ ξφιν, θπξίσο ζηνλ ηππφθακπν, θαη είλαη πνιχ ζεκαληηθή γηα ηελ γλσζηηθή πξνζαξκνγή ζηα κεηαβαιιφκελα πεξηβάιινληα θαη ζηελ επεμεξγαζία ηεο γλψζεο. Έρεη επίζεο έλαλ πνιχ ζεκαληηθφ ξφιν ζηνλ έιεγρν ηεο φξεμεο, δηεγείξνληαο ηελ πξφζιεςε ηξνθήο. Πξφζθαηεο έξεπλεο έδεημαλ πσο ελεξγνπνηεί ην ελδνζειηαθφ ηζφκνξθν ηεο ζπλζεηάζεο ληηξηθνχ νμεηδίνπ ζε κηα δηαδηθαζία πνπ εμαξηάηαη απφ δηάθνξεο θηλάζεο, ζπκπεξηιακβαλνκέλεο θαη ηεο Akt. Σν ζήκα Ghrelin ζπλδπάδεηαη κε απηφ ηεο GHRH θαη ηεο ζσκαηνζηαηίλεο γηα λα ειέγμεη ην ρξφλν θαη ην κέγεζνο ηεο έθθξηζεο απμεηηθήο νξκφλεο. Ζ κεηαγσγή ζήκαηνο αθνξά ηελ ελεξγνπνίεζε ηεο θσζθνιηπάζεο C (κέζσ πξσηεΐλεο G), ηελ παξαγσγή ηεο θσζθνξηθήο ηλνζηηφιεο θαη δηαθεηπιν-γιπθεξφιεο θαη απμεκέλν ελδνθπηηαξηθφ Ca +2. H Ghrelin δηεγείξεη ηελ έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο θαη άκεζα, δξψληαο ζην επίπεδν ηνπ πξφζζηνπ ινβνχ ηεο ππφθπζεο, θαη απμάλνληαο ηελ απειεπζέξσζε ηεο GHRH. Μπνξνχκε λα ζεσξήζνπκε πσο ε κνηηιίλε (motilin) έρεη αλάινγα απνηειέζκαηα κε ηελ Ghrelin. Ζ κνηηιίλε είλαη έλα πνιππεπηίδην 22- ακηλνμέσλ, πςειήο δηαηήξεζεο εμειηθηηθά, ην νπνίν εθθξίλεηαη απφ ηα έληεξνρξσκηφθηια θχηηαξα ηνπ ιεπηνχ εληέξνπ. Σν πεπηίδην απηφ δηεγείξεη ηελ γαζηξεληεξηθή θηλεηηθή δξαζηεξηφηεηα θαη θαίλεηαη πσο παίδεη έλαλ θπζηνινγηθφ ξφιν ζηελ ξχζκηζε ησλ κνληέισλ ηεο λεζηηδηθήο θηλεηηθφηεηαο. Ο ππνδνρέαο ηνπ, πνπ απνκνλψζεθε απφ ην αλζξψπηλν ζηνκάρη, θαη ε ζεηξά ησλ ακηλνμέσλ ηνπ βξέζεθαλ πσο είλαη θαηά 52% φκνηα κε ηεο αλζξψπηλεο GHRH. Ζ κεγάιε νκνηφηεηα ζηελ ζεηξά ησλ ακηλνμέσλ κεηαμχ ηνπ ππνδνρέα ηεο κνηηιίλεο θαη ηεο GHRH ππνδεηθλχεη έλαλ ξφιν γηα ηελ κνηηιίλε ζηνλ έιεγρν ηεο έθθξηζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. (11,13,14) Δικόνα 6: 13

15 Δηθόλα 6: Ο κεραληζκόο έθθξηζεο ηεο GH, απεηθόληζε όινπ ηνπ ζπζηήκαηνο ελεξγνπνηήζεο. Ζ αλάδξνκε ξχζκηζε ηεο έθθξηζεο απμεηηθήο νξκφλεο γίλεηαη απφ απμεηηθνχο παξάγνληεο πνπ κνηάδνπλ κε ηελ ηλζνπιίλε (Insulin-like Growth Factor), θπξίσο απφ ηνλ IGF-I. Οη IGFs είλαη επίζεο γλσζηνί θαη ζαλ ζσκαηνκεδίλεο. ηηο ζεκαληηθέο ζσκαηνκεδίλεο ζπκπεξηιακβάλνληαη ε ζσκαηνκεδίλε Α (SM-A), ε ζσκαηνκεδίλε C (SM-C), o IGF-I, θαη ν IGF-II. Ο IGF-I θαη IGF-II είλαη επίζεο γλσζηνί θαη ζαλ NSILAS-I, II (Non- suppressible insulin-like acting substance I, II). Πξφθεηηαη γηα κηα νηθνγέλεηα πεπηηδηθψλ νξκνλψλ πνπ είλαη δνκηθά παξφκνηεο κε ηελ ηλζνπιίλε κε κηηνγφλεο ηδηφηεηεο θαη κε απνηειέζκαηα πνπ κνηάδνπλ κε απηά ηεο ηλζνπιίλεο, πνπ ξπζκίδνπλ ηελ δξάζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο πάλσ ζηνλ ζθειεηηθφ ηζηφ. Απμάλνπλ ηελ αλάπηπμε ησλ ρφλδξσλ, δηεγείξνπλ ηελ ζχλζεζε πξσηεΐλεο, δηεγείξνπλ ηελ ελζσκάησζε ζπκηδίλεο ζην DNA, θαη δηεγείξνπλ ηελ κίησζε. Δικόνα 7: Δηθόλα7: Ο άμνλαο ηεο έθθξηζεο θαη αλάδξνκεο ξύζκηζεο ηεο GH. 14

16 Πην ζεκαληηθφο είλαη ν IGF-I, γηαηί απηή ε πξσηεΐλε παίδεη ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ αλάπηπμε θαηά ηελ παηδηθή ειηθία θαη ζπλερίδεη λα έρεη αλαβνιηθά απνηειέζκαηα θαη ζηνπο ελήιηθεο. Ο IGF-I ζπληίζεηαη θπξίσο απφ ην ήπαξ ζαλ κηα ελδνθξηληθή νξκφλε, φπσο επίζεο θαη ζε ηζηνχο ζηφρνπο φπσο είλαη ε ππφθπζε, ν εγθέθαινο θαη δηάθνξα εκβξπτθά φξγαλα κε έλαλ παξαθξηλή/ απηνθξηλή ηξφπν. Δικόνα 8: Δηθόλα 8: Δλεξγνπνίεζε ηνπ IGF-1 κέζσ ηεο GH θαη ε δξάζε ηνπ ζηνλ ηζηό ζηόρν. Ο IGF-I απνηειείηαη απφ 70 ακηλνμέα ζε κηα κνλαδηθή αιπζίδα κε ηξείο ελδνκνξηαθέο δηζνπιθηδηθέο γέθπξεο. Έρεη κνξηαθφ βάξνο 7649 Daltons. Δικόνα 9: Ζ παξαγσγή ηνπ δηεγείξεηαη απφ ηελ απμεηηθή νξκφλε θαη κπνξεί λα κεησζεί ιφγσ ππνζηηηζκνχ, κεησκέλεο επαηζζεζίαο ζηελ απμεηηθή νξκφλε θαη έιιεηςεο ππνδνρέσλ απμεηηθήο νξκφλεο. Ο IGF-I παξνπζηάδεη δνκηθέο νκνηφηεηεο κε ηελ ηλζνπιίλε θαη ηνλ IGF-II. Με ηελ ηλζνπιίλε έρεη θαηά 60% θνηλά ακηλνμέα. Χζηφζν, αληίζεηα κε ηελ ηλζνπιίλε, ε νπνία θπθινθνξεί ζε ζπγθεληξψζεηο picomolar, θαη έρεη ζχληνκε εκηδσή, ν IGF-I θπθινθνξεί ζε nanomolar ζπγθεληξψζεηο θαη έρεη πνιχ 15

17 κεγαιχηεξε εκηδσή, γηαηί είλαη δεζκεπκέλνο ζε κηα πνηθηιία πξσηετλψλ δέζκεπζεο, έμη απφ ηηο νπνίεο έρνπλ ραξαθηεξηζηεί. Οη ζσκαηνκεδίλεο έρνπλ πνιχ κεγάιε εκηδσή (Σ ½) πεξίπνπ 20 σξψλ θαη κεηαθέξνληαη ζην αίκα δεζκεπκέλεο ζηηο πξσηεΐλεο ηνπ πιάζκαηνο, φπσο βιέπνπκε γηα ηελ απμεηηθή νξκφλε. Οη πξσηετληθνί κεηαθνξείο εμαζθαιίδνπλ κηα δηαξθή παξνρή ζσκαηνκεδηλψλ ζηα θχηηαξα ζηφρνπο. Με φινπο απηνχο ηνπο κεραληζκνχο ν IGF-I αλαζηέιιεη ηελ κεηά-κεηαθξαζηηθή επεμεξγαζία ηεο απμεηηθήο νξκφλεο θαη κεηψλεη ηελ εμσθχησζε αληαγσληδφκελνο ηε δξάζε ηεο GHRH θαη ακβιχλνληαο ηελ απειεπζέξσζε απμεηηθήο νξκφλεο, ηεο θνξζθνιίλεο, θαη ησλ camp. ήκεξα έρνπκε θαηαλνήζεη πσο ν ζρεηηθφο ξφινο ησλ IGFBPs (insulin-like growth factor binding proteinζ) ζην απνηέιεζκα ηνπ πεπηηδίνπ είλαη ζεκαληηθφο. Δίλαη επνκέλσο πηζαλφ, νη δηαθνξέο ησλ εηδψλ ζηα απνηειέζκαηα ησλ IGFBPs, ζηελ έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο λα ζρεηίδνληαη κε ηελ δηαθνξεηηθή έθθξαζε ησλ IGFBPs ζην θεληξηθφ λεπξηθφ ζχζηεκα. Γεληθά, ηα πςειά επίπεδα αίκαηνο ζε IGF-I νδεγνχλ ζε κεησκέλε έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο, φρη κφλν θαηαζηέιινληαο άκεζα ηελ ζσκαηνηξφπν αιιά θαη δηεγείξνληαο ηελ απειεπζέξσζε ζσκαηνζηαηίλεο απφ ηνλ ππνζάιακν, πνπ θαηαζηέιιεη ηελ έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο απφ ηελ ππφθπζε, θαη, καθξνπξφζεζκα, δξψληαο άκεζα ζηελ ππφθπζε. (9,15) Δικόνα 10: Δηθόλα 10: Νεπξνελδνθξηληθόο έιεγρνο ηεο έθθξηζεο ηεο Απμεηηθήο νξκόλεο (Neuroendocrine Control of Growth Hormone Secretion. 16

18 Σα γλσκοκορηικοειδή ξπζκίδνπλ θαη απηά ηελ έθθξηζε θαη ηελ ζχλζεζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο επεξεάδνληαο ηελ ιεηηνπξγία θαη ηνπ ππνζαιάκνπ θαη ηεο ππφθπζεο. Σα θνξηηθνζηεξνεηδή είλαη ζεκαληηθνί θπζηνινγηθνί ξπζκηζηέο ηεο ζχλζεζεο θαη ηεο έθθξηζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Μειέηεο έδεημαλ πσο αζθνχλ ζεκαληηθά θαηαζηαιηηθά απνηειέζκαηα ζηνλ άμνλα απμεηηθήο νξκφλεο ζηα ζειαζηηθά, πξνθαιψληαο θαζπζηέξεζε ηεο αλάπηπμεο ζε εξγαζηεξηαθνχο αξνπξαίνπο θαη κεησκέλνπο ξπζκνχο αλάπηπμεο ζε παηδηά πνπ ππφθεηληαη ζε ρξφληα ζεξαπεία. Σα γιπθνθνξηηθνεηδή θαίλεηαη πσο έρνπλ ηα απνηειέζκαηα απηά δξψληαο ζε πνιιαπιά επίπεδα ζηελ πνξεία ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Οη νξκφλεο απηέο ησλ επηλεθξηδίσλ επεξεάδνπλ ηνπο κεζνιαβεηέο ηεο δξάζεο, φπσο είλαη o IGF-I, ξπζκίδνπλ ηνπο κεραληζκνχο feedback ηεο GH κεηαβάιινληαο ηελ έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ ηνπ ππνδνρέα ηεο GH,θαη ηξνπνπνηνχλ ηελ ιεηηνπξγία θαη ηνπ ππνζαιάκνπ θαη ηεο ππφθπζεο. Σα γιπθνθνξηηθνεηδή επεξεάδνπλ ηνλ ππνζαιάκην έιεγρν ζηελ έθθξαζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο δηαηεξψληαο κηα ηζνξξνπία κεηαμχ ησλ ζεηηθψλ θαη ησλ αξλεηηθψλ επηξξνψλ ησλ GHRH θαη SS. Σα γιπθνθνξηηθνεηδή πξνθαινχλ κεηαβνιέο ζηελ έθθξαζε ησλ GHRH, SS ζην επίπεδν ηνπ ππνζαιάκνπ πνπ είλαη παξφκνηεο κε ηηο κεηαβνιέο ζηελ ππνθπζηαθή έθθξαζε ησλ ππνδνρέσλ GHRH, SS ζηελ αληαπφθξηζε ζηελ ζεξαπεία κε γιπθνθνξηηθνεηδή. Έρεη σζηφζν απνδεηρζεί πσο ε δηάξθεηα ηεο ζεξαπείαο κε γιπθνθνξηηθνεηδή έρεη πνιχ ζεκαληηθά απνηειέζκαηα ζηελ αληαπφθξηζε GHRH. Δίλαη επίζεο πνιχ ζεκαληηθφ πσο θάπνηεο άιιεο κειέηεο in vivo έρνπλ απνδείμεη πσο ε ζεξαπεία κε γιπθνθνξηηθνεηδή κε ηελ παξνπζία αλαζηνιέσλ SS ή αληηζσκάησλ εηδηθψλ γηα ηελ SS εληζρχεη ηελ αληαπφθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζηε GHRH. Έρεη απνδεηρζεί πσο ηα γιπθνθνξηηθνεηδή αζθνχλ δηαθνξεηηθά απνηειέζκαηα ζηελ δέζκεπζε GHRH θαη ζηελ SS. Οη αιιαγέο πνπ έρνπλ παξαηεξεζεί ζηελ δέζκεπζε GHRH θαη ηεο SS, δελ πξνθαινχληαη απφ ηελ αιιαγή ζηελ ζπγγέλεηα πξνο ηνλ ππνδνρέα, ππνδεηθλχνληαο πσο νη δηαθνξέο ζηνπο αξηζκνχο ησλ ππνδνρέσλ επζχλνληαη γηα ηα απνηειέζκαηα ησλ θνξηηθνζηεξνεηδψλ.(16) Έρνπκε ήδε αλαθέξεη πσο ε απμεηηθή νξκφλε ξπζκίδεη ηελ αλάπηπμε θαη ηελ ζχλζεζε ηνπ ζψκαηνο κέζσ κηαο πνιχπινθεο δηαδηθαζίαο, ε νπνία ζπλδπάδεη δξάζεηο κηηνγέλεζεο θαη κεηαβνιηζκνχ, κέζσ κεραληζκψλ πνπ είηε εμαξηψληαη είηε είλαη αλεμάξηεηνη απφ ηνλ IGF-I. Σν ήπαξ παίδεη έλαλ βαζηθφ ξφιν ζηελ κεηαβνιηθή δηαδηθαζία. Δίλαη ην φξγαλν ζηφρνο ηεο δξάζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, θαη ε βαζηθή 17

19 πεγή θπθινθνξίαο ηνπ IGF-I, θαη ηαπηφρξνλα έλα θπιεηηθφ φξγαλν αληαπνθξηλφκελν ζηα ζηεξνεηδή. Αξθεηέο κειέηεο έρνπλ δείμεη πσο νη γνλαδηθέο νξκφλεο παίδνπλ ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ ζσκαηφηξνπε ιεηηνπξγία. Έρεη βξεζεί πσο ε βαζηθή θαη ε παικηθή απειεπζέξσζε απμεηηθήο νξκφλεο ξπζκίδνληαη δηαθνξεηηθά απφ ζηεξνεηδείο θαη νξκφλεο ηνπ ιηπψδνπο ηζηνχ. Σα οιζηρογόνα είλαη ππεχζπλα γηα ηελ αλάπηπμε ησλ δεπηεξεπφλησλ θπιεηηθψλ ραξαθηεξηζηηθψλ θαη παίδνπλ έλα ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ αλαπαξαγσγηθή ιεηηνπξγία ζηηο γπλαίθεο, ελψ επεξεάδνπλ επίζεο θαη άιια φξγαλα, ζπκπεξηιακβαλνκέλεο θαη ηεο δνκήο ησλ νζηψλ. πγθεθξηκέλα, άηνκα ρσξίο νηζηξαδηφιε (ή άιια νηζηξνγφλα), ζα γίλνπλ ςειά θαη επλνπρνεηδή, θαζψο ππάξρεη θαζπζηέξεζε ζηνλ επηθπζηαθφ ηεξκαηηζκφ ή κπνξεί απηφο λα κελ γίλεη θαζφινπ. Δπεξεάδεηαη ε δνκή ησλ νζηψλ θαη απηφ έρεη ζαλ απνηέιεζκα πξψηκε νζηενπελία θαη νζηενπφξσζε, ιφγσ ηεο ζρεηηθήο έιιεηςεο ζε νηζηξνγφλα. Δπίζεο, νη γπλαίθεο κεηά ηελ εκκελφπαπζε βηψλνπλ κηα επηηαρπλφκελε απψιεηα νζηηθήο κάδαο. Τπάξρεη ζηελή αιιειεπίδξαζε κεηαμχ ησλ νηζηξνγφλσλ θαη ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζηελ ξχζκηζε ηεο αλάπηπμεο θαη ηεο εμέιημεο, φπσο γηα παξάδεηγκα ζηελ εθεβεία. Οη απμήζεηο ζε νηζηξνγφλα θαη ζε απμεηηθή νξκφλε πξνθαινχλ κηα απφηνκε αχμεζε ηεο αλάπηπμεο, ε νπνία ζπλνδεχεηαη απφ δξακαηηθέο κεηαβνιέο ζηελ θπζηθή αλάπηπμε, έρνληαο ζαλ απνηέιεζκα ηελ ζχλζεζε ηνπ ζψκαηνο αλάινγε κε ην θχιν. Ζ ξπζκηζηηθή αιιειεπίδξαζε ησλ νηζηξνγφλσλ πάλσ ζηελ απμεηηθή νξκφλε κπνξεί λα γίλεη ζε πνιιά επίπεδα: ζηελ έθθξηζε, ζηελ δξάζε ή ζηελ θάζαξζε. Πνιιέο πξνεγνχκελεο κειέηεο έρνπλ εζηηαζηεί ζηα απνηειέζκαηα ησλ νηζηξνγφλσλ πάλσ ζηελ έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο ζε επίπεδν ππνζαιάκνπ θαη ππφθπζεο. Τπάξρνπλ ελδείμεηο πσο ηα νηζηξνγφλα ξπζκίδνπλ ηελ δξάζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο αλεμάξηεηα απφ ηελ έθθξηζε κέζσ δξάζεο πάλσ ζην ήπαξ. Απηφ πξνθχπηεη απφ παξαηεξήζεηο πσο απφ ηνπο ζηφκαηνο θαη φρη δηαδεξκηθά ρνξεγεζέληα νηζηξνγφλα βιάπηνπλ ηελ κεηαβνιηθή δξάζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο θαη πσο ηα νηζηξνγφλα επεξεάδνπλ ηελ αληαπφθξηζε ζε ζεξαπεία ππνθαηάζηαζεο GH ζε ελήιηθεο. Ζ κεηαβνιηθή πνξεία ηεο παξαγσγήο IGF-I πνπ έρεη θαηαζηαιεί θαη ε νμείδσζε ησλ ιηπηδίσλ κπνξεί λα παίδνπλ θαη απηέο ζεκαληηθφ ξφιν, ιφγσ ηεο εθηεηακέλεο ρξήζεο ζηνκαηηθψλ νηζηξνγφλσλ θαη ρεκηθψλ ελψζεσλ πνπ ζρεηίδνληαη κε ηα νηζηξνγφλα. Ζ αιιειεπίδξαζε κεηαμχ νηζηξνγφλσλ θαη CPGF (circulating 18

20 peptide growth factors) έρεη αθφκε ζεκαζία φζνλ αθνξά ηνλ θαξθίλν θαη ηα θάξδηναγγεηαθά λνζήκαηα. (17,18) Πίνακαρ 1: Ο πην θάησ πίλαθαο ζπλνςίδεη ηνπο αλαζηνιείο θαη ηνπο δηεγέξηεο ηεο έθθξηζεο GH. (19,20) ΔΙΕΓΕΡΤΕΣ Σωμαηοηροπίνη (Growth hormone releasing hormone) Σωμαηοζηαηίνη ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ Γκρελίνη (Ghrelin) κσκλοθοριακές ζσγκενηρώζεις GH Και IGF-I (αρνηηικό feedback) Ύπνος διαιηηηικοί σδαηάνθρακες Άζκηζη Γλσκοκορηικοειδή Χαμηλά επίπεδα ζακτάροσ ηοσ αίμαηος (σπογλσκαιμία) Διαιηηηική πρωηεΐνη Οιζηραδιόλη Αργινίνη Ζ επεηζνδηαθή απειεπζέξσζε απμεηηθήο νξκφλεο απφ ηηο ππνθπζηαθέο ζσκαηνηξφπα θχηηαξα έρεη ζαλ απνηέιεζκα αθαλφληζηεο απμήζεηο ζηα επίπεδα απμεηηθήο νξκφλεο ηνπ νξνχ πνπ δηαθφπηνληαη απφ πεξηφδνπο ρακειψλ επηπέδσλ ή επηπέδσλ πνπ δελ κπνξνχλ λα πξνζδηνξηζηνχλ, φπνπ ε έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο είλαη ειάρηζηε. Ζ παικηθή θχζε ηεο έθθξηζεο GH έρεη απνδεηρζεί απφ ηνλ ζπρλφ δεηγκαηηζκφ νξνχ, ζε ζπλδπαζκφ κε ηελ ρξήζε επαίζζεησλ άλνζν-ξαδηνκεηξηθψλ αλαιχζεσλ ή αλαιχζεσλ ρεκεηνθσηηζκνχ. Κάησ απφ θαλνληθέο ζπλζήθεο, ηα επίπεδα GH νξνχ είλαη κηθξφηεξα απφ 0.04 κg/l κεηαμχ εθθξηηηθψλ ψζεσλ. Δπνκέλσο δελ είλαη πξαθηηθφ λα αμηνινγήζνπκε ηελ έθθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο κε ηπραίν ηπραία δείγκαηα νξνχ. Δθηεηακέλεο κειέηεο κε ζπρλέο αηκνιεςίεο, ζε δηαθνξεηηθέο ειηθίεο, ζε θπζηνινγηθά άηνκα θαη ζε πνιιέο αλψκαιεο θαηαζηάζεηο έρνπλ θαζνξίζεη ηελ θαηά ψζεηο έθθξηζή ηεο GH, ηελ βαζηθή έθθξηζε θαη ηελ εκεξήζηα κεηαβιεηφηεηα. Έρνπλ αλαπηπρζεί πξνγξάκκαηα ππνινγηζηψλ πνπ δείρλνπλ αλ νη αιιαγέο ζηα επίπεδα απμεηηθήο νξκφλεο ζε δηάθνξεο ειηθηαθέο πεξηφδνπο θαη θάησ απφ 19

21 δηαθνξεηηθέο θιηληθέο ζπλζήθεο ζπκβαίλνπλ ιφγσ κηαο αιιαγήο ηνπ κεγέζνπο ηεο ψζεο έθθξηζεο ή ζηελ ζπρλφηεηα ησλ ψζεσλ, ιφγσ κεηαβνιήο ηεο θάζαξζεο (altered clearance) ή εμαηηίαο ελφο ζπλδπαζκνχ φισλ απηψλ ησλ δηαδηθαζηψλ. Σα θχηηαξα πνπ εθθξίλνπλ απμεηηθή νξκφλε έρνπλ αλαγλσξηζηεί θαηά ηελ 9 ε κε 12 ε εβδνκάδα εκβξπτθήο αλάπηπμεο θαη ε παξνπζία ππνθπζηαθήο GH κε αλνζνκεηξηθέο κεζφδνπο αληρλεχεηαη απφ ηελ 7 ε κε ηελ 9 ε εβδνκάδα θπνθνξίαο. Σα εκβξπτθά ππνθπζηαθά θχηηαξα εθθξίλνπλ GH in vitro απφ ηελ 5 ε εβδνκάδα, πξνηνχ ην ππνζαιάκην-ππιαίν αγγεηαθφ ζχζηεκα δηαθνξνπνηεζεί θαη ν κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο Pit-1 εθθξάδεηαη ηνπιάρηζηνλ κεηά ηελ 6 ε εβδνκάδα ηεο θχεζεο θαη ζπκκεηέρεη ζηελ εκβξπνγέλεζε. Ο παξάγνληαο απηφο ελέρεηαη ζηε δηαθνξνπνίεζε θαη σξίκαλζε ησλ ζσκαηνηξφπσλ, γαιαθηνηξφπσλ θαη ζπξενεηδνηξφπσλ θπηηάξσλ ηεο ππφθπζεο θαη ειέγρεη ζε ζεκαληηθφ βαζκφ ηελ παξαγσγή ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, ηεο πξνιαθηίλεο θαη ηεο ζπξενηξνπίλεο. Ζ άθζνλε παξνπζία ηνπο απφ πνιχ λσξίο θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο θχεζεο ππνδεηθλχεη πσο έρνπλ έλαλ ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ δηαθνξνπνίεζε ησλ θπηηάξσλ θαη ζηνλ πνιιαπιαζηαζκφ. Ζ απμεηηθή νξκφλε κπνξεί λα αλαγλσξηζηεί ζηνλ εκβξπτθφ νξφ απφ ην ηέινο ηνπ πξψηνπ ηξηκήλνπ, κε αλψηαηα επίπεδα γχξσ ζηα 150κg/L θαηά ηα κέζα ηεο θχεζεο. Σα επίπεδα νξνχ πέθηνπλ ζε φιν ην επφκελν κέξνο ηεο εγθπκνζχλεο θαη είλαη ρακειφηεξα ζε ζχγθξηζε κε ηα πξφσξα βξέθε, ίζσο αληαλαθιψληαο αλάδξνκε ξχζκηζε απφ ηα πςειφηεξα επίπεδα νξνχ ησλ πεπηηδηθψλ IGF πνπ είλαη ραξαθηεξηζηηθά ησλ ηειεπηαίσλ ζηαδίσλ ηεο θχεζεο. Ο κέζνο φξνο ησλ επηπέδσλ απμεηηθήο νξκφλεο πέθηεη απφ ηηο ηηκέο ησλ 25 κε 35 κg/l ηεο λενγληθήο πεξηφδνπ, ζε πεξίπνπ 5-7κg/L γηα φιε ηελ δηάξθεηα ηεο παηδηθήο ειηθίαο θαη ηεο εθεβείαο. Ζ έθθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο εθεβείαο ζπκβάιιεη αλακθίβνια ζηελ πςειά επίπεδα IGF-I, πνπ παξαηεξνχληαη θαη ραξαθηεξίδνπλ ηελ πεξίνδν απηή. Ζ αχμεζε ζηελ παξαγσγή ηεο απμεηηθήο νξκφλεο θαηά ηα κέζα κέρξη θαη ην ηέινο ηεο εθεβείαο νθείιεηαη θαη ζην απμεκέλν εχξνο πιάηνο παικνχ θαη ζηελ απμεκέλε αλά ψζε έθθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο θαη φρη ζε κηα κεηαβνιή ζηελ ζπρλφηεηα ησλ ψζεσλ. Ζ έληνλε θαηά ψζεηο έθθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο αληηζηνηρεί ζε κεγαιχηεξε γξακκηθή αλάπηπμε. Μπξνζηά ζηα ζηαζεξά επίπεδα ηεο GHBP (growth hormone binding protein), ε απμεκέλε παξαγσγή απμεηηθήο νξκφλεο ζηελ εθεβεία θαίλεηαη λα ζρεηίδεηαη κε κεγαιχηεξα επίπεδα ειεχζεξεο απμεηηθήο νξκφλεο, απμάλνληαη ελδερνκέλσο ηα επίπεδα ηνπ IGF-I ζηνπο ηζηνχο ζηφρνπο. Απηή 20

22 ε απμεκέλε δξαζηεξηφηεηα ηνπ άμνλα GH-IGF ζπκβάιεη ζηελ αληίζηαζε ηλζνπιίλεο πνπ ζπκβαίλεη θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο εθεβείαο. Ζ παξαγσγή ησλ GH, IGF αξρίδεη λα κεηψλεηαη ζηα ηέιε ηεο εθεβείαο θαη ζπλερίδεη λα πέθηεη ζε φιε ηελ δηάξθεηα ηεο ελήιηθεο δσήο. Οη θπζηνινγηθνί λένη ελήιηθεο άληξεο ζπλήζσο βηψλνπλ 6 κε 10 εθθξηηηθέο ψζεηο απμεηηθήο νξκφλεο ην 24/ψξν, κηα ηηκή πνπ είλαη παξφκνηα κε απηή ησλ λεαξφηεξσλ παηδηψλ θαη ησλ εθήβσλ. Δλ αληηζέζεη ε 24σξε παξαγσγή ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζε θπζηνινγηθνχο ψξηκνπο άληξεο θπκαίλεηαη απφ 0.25 κέρξη 0.52 mg/m 2 επηθάλεηαο, πνπ αληηζηνηρεί ζε πεξίπνπ ην 20% κε 30% ησλ εθεβηθψλ επηπέδσλ. Απηφ νθείιεηαη ζε κεγάιν βαζκφ ζηελ κείσζε ηνπ εχξνπο παικνχ ηεο GH πνπ παξαηεξείηαη κε ηελ πάξνδν ηεο ειηθίαο. Πξάγκαηη, ε εθεβεία κπνξεί λα ζεσξεζεί ζαλ κηα πεξίνδνο θπζηνινγηθήο αθξνκεγαιίαο ελψ ε γήξαλζε, κε ηελ κείσζε πνπ παξνπζηάδεηαη ζηελ έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο, κπνξεί λα νλνκαζηεί, ζσκαηφπαπζε. (21,22) Δικόνα 11: Δηθόλα 11: Σπζρέηηζε κεηαμύ ηεο κέζεο ηηκήο ηεο 24-σξεο έθθξηζεο ηεο απμεηηθήο νξκόλεο θαη ηεο ειηθίαο ζε έθεβνπο θαη ελήιηθεο άληξεο. Οη κπάξεο αληηπξνζσπεύνπλ ηε κέζε ηηκή (θαη ηνπ ηππηθνύ ηεο ζθάικαηνο) ηεο εθθξηλόκελεο απμεηηθήο νξκόλεο ζε 24-σξε βάζε(αξηζηεξόο θάζεηνο άμνλαο). Φξεζηκνπνηήζεθαλ εμήληα 24-σξα πξόηππα πγηώλ εθήβσλ θαη ελειίθσλ θαηεγνξηνπνηεκέλα ζύκθσλα κε ηελ ειηθία ηνπο. Η ζπλνδόο πξόηππε θακπύιε έρεη δεκηνπξγεζεί βάζεη ησλ ηηκώλ ηνπ 50νύ εθαηνζηεκόξηνπ ηνπ εηήζηνπ ξπζκνύ αλάπηπμεο ησλ εθήβσλ ζηε Β. Ακεξηθή (21,22) Δικόνα 12: 21

23 Δηθόλα 12: A. Απεηθνλίδεηαη ε κέζε ηηκή (θαη ην ηππηθό ζθάικα) ηνπ 24-ώξνπ επηπέδνπ ηεο απμεηηθήο νξκόλεο ζε νκάδεο λεαξώλ ζε δηάθνξα ζηάδηα εθεβηθήο αλάπηπμεο.(the mean (+SE) 24-hour levels of growth hormone (GH) for groups of normal boys at varied stages of pubertal maturation.) B, Απεηθνλίδεηαη ην εύξνο ηεο κέζεο ηηκήο ηεο ρακειήο έθθξηζεο απμεηηθήο νξκόλεο ζε ζρέζε κε ην ρξόλν έθθξηζεο ηεο ζηε θάζε νκάδα μερσξηζηά Φαίλεηαη ν αξηζκόο ησλ επηπέδσλ ηεο απμεηηθήο νξκόλεο όπσο αληρλεύζεθε ζηελ θάζε νκάδα 24ώξεο έθθξηζεο ηεο GH ζηα πξόηππα ησλ εθήβσλ ζε θάζε νκάδα ειηθίαο. Σεκεηώλεηαη όηη νη αιιαγέο ζηε κέζε ηηκή 24-σξεο εθθξηλόκελεο απμεηηθήο νξκόλεο ζρεηίδεηαη κε αιιαγέο ζην πνζνζηό ηεο έθθξηζεο ηεο απμεηηθήο νξκόλεο ζε θάζε επίπεδν, θαη όρη ζηε ζπρλόηεηα ησλ εθθξίζεσλ. (22) Δικόνα 13: Δηθόλα 13: Απεηθνλίδνληαη ηα επίπεδα ηεο GH θαη ηεο growth hormone binding protein (GHBP) ηα νπνία πξνέθπςαλ από κεηξήζεηο ζε θπζηνινγηθά άηνκα θαηά ηε δηάξθεηα ηεο εθεβείαο. Τα επίπεδα ηεο GHBP δελ αιιάδνπλ ζεκαληηθά θαηά ηε δηάξθεηα ηεο εθεβείαο αιιά σζηόζν είλαη κηα ζνβαξή έλδεημε ηεο παξαγσγήο απμεηηθήο νξκόλεο θαη άξα ησλ επηπέδσλ ηεο απμεηηθήο νξκόλεο ηε ζπγθεθξηκέλε πεξίνδν. Τα ζηνηρεία απηά δείρλνπλ όηη κπνξεί λα ππάξρνπλ κεγαιύηεξεο πνζόηεηεο ειεύζεξεο απμεηηθήο νξκόλεο θαηά ηε δηάξθεηα απηήο ηεο πεξηόδνπ πνπ νδεγνύλ ζε κεγαιύηεξε παξαγσγή ηνπ IGF-I. 22

24 Οη θπζηνινγηθέο θαηαζηάζεηο πνπ επεξεάδνπλ ηελ έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο, εθηφο απφ ηελ σξηκφηεηα θαη ηελ γήξαλζε, πεξηιακβάλνπλ ηνλ χπλν, ηελ δηαηξνθηθή θαηάζηαζε, ηε λεζηεία, ηελ άζθεζε, ην ζηξεο θαη ηα γνλαδηθά ζηεξνεηδή. Ζ κέγηζηε έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο γίλεηαη θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο λχθηαο, θπξίσο θαηά ηελ έλαξμε ηνπ πξψηνπ αξγνχ θχκαηνο χπλνπ (ζηάδηα 3 θαη 4). Ζ γξήγνξε θίλεζε ησλ νθζαικψλ ζρεηίδεηαη κε ηελ έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο. Έλαο θηξθαδηθφο ξπζκφο έθθξηζεο ζσκαηνζηαηίλεο, ζηνλ νπνίν παξεκβάιινληαη επεηζνδηαθέο ψζεηο απειεπζέξσζεο GHRH, κπνξεί λα βνεζήζεη ζηελ εμήγεζε ηεο λπρηεξηλήο αχμεζεο ζηελ παξαγσγή απμεηηθήο νξκφλεο. Όηαλ ρνξεγήζεθε ηεζηνζηεξφλε ζε αγφξηα κε θαζπζηεξεκέλε εθεβεία, απμήζεθε ε απηφκαηε απειεπζέξσζε απμεηηθήο νξκφλεο, ε αιιαγή απηή φκσο δελ επαλαιήθζεθε κε ηελ ρνξήγεζε κε αξσκαηνπνηεκέλσλ αλδξνγφλσλ, ηνλίδνληαο ηελ πηζαλή κνλαδηθή ζεκαζία ησλ νηζηξνγφλσλ ζηελ έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο. Σα απνηειέζκαηα ηεο ηεζηνζηεξφλεο ζηα επίπεδα IGF-I νξνχ κπνξεί λα είλαη ελ κέξεη αλεμάξηεηα απφ ηελ GH, κηα πνπ άηνκα κε κεηαιιάμεηο ηνπ ππνδνρέα ηεο GH (GHR) εμαθνινπζνχλ λα εκθαλίδνπλ κηα κέηξηα αχμεζε ηνπ IGF-I νξνχ θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο εθεβείαο. Oη Veldhuis θαη ζπλεξγάηεο αλέιπζαλ πνιχ πξνζεθηηθά ηα δεδνκέλα ζπρλψλ αηκνιεςηψλ απμεηηθήο νξκφλεο, πνπ κεηξήζεθαλ κε επαίζζεηνπο πξνζδηνξηζκνχο GH, ζε παηδηά θαη ησλ δπν θχισλ ζηελ πξν-εθεβεία θαη ηελ εθεβεία. Δθηφο απφ ηελ απμεκέλε αλά ψζε έθθξηζε πνπ νθεηιφηαλ ζην απμεκέλν εχξνο θαη δηάξθεηα ησλ ψζεσλ ηεο απμεηηθήο νξκφλεο βξήθαλ πσο ηα θπιεηηθά ζηεξνεηδή επεξεάδνπλ επηιεθηηθά ηνλ λεχξν-εθθξηηηθφ έιεγρν ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Σα νηζηξνγφλα απμάλνπλ ηελ αλαινγία ηεο βαζηθήο έθθξηζεο απμεηηθήο νξκφλεο, ελψ ε ηεζηνζηεξφλε πξνθαιεί κεγαιχηεξε έθθξηζε αλά ψζε απμεηηθήο νξκφλεο θαη κεγαιχηεξεο ζπγθεληξψζεηο IGF-I. Ζ παρπζαξθία ραξαθηεξίδεηαη απφ κεησκέλε παξαγσγή GH, πνπ αληαλαθιάηαη ζε έλαλ κεησκέλν αξηζκφ εθθξηηηθψλ ψζελ απμεηηθήο νξκφλεο θαη ζε κηθξφηεξε δηάξθεηα εκηδσήο ησλ ψζεσλ. Ζ παρπζαξθία ζηελ παηδηθή ειηθία θαη ζηελ εθεβεία ραξαθηεξίδεηαη θαη απηή απφ κεησκέλε παξαγσγή απμεηηθήο νξκφλεο, αιιά απφ θπζηνινγηθά επίπεδα IGF, απμεκέλα επίπεδα GHBP θαη ζπρλά απμεκέλε γξακκηθή αλάπηπμε. Ο ππέξ-ηλζνπιηληζκφο πνπ ζπρλά ζρεηίδεηαη κε ηελ παρπζαξθία πξνθαιεί κεησκέλα επίπεδα IGFBP-1 θαη, ίζσο, απμεκέλα επίπεδα ειεχζεξνπ IGF- I. Ζ ελδνγελήο έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο θαη ηα επίπεδα πνπ παξαηεξνχληαη θαηά ηελ δηάξθεηα ησλ πξνθιεηηθψλ ηεζη ζε απηά ηα παρχζαξθα άηνκα πξνζεγγίδνπλ ηελ 23

25 δηαγλσζηηθή δηαθχκαλζε ηεο έιιεηςεο απμεηηθήο νξκφλεο. Ζ λεζηεία απμάλεη θαη ηνλ αξηζκφ θαη ην πιάηνο ησλ εθθξηηηθψλ ψζεσλ απμεηηθήο νξκφλεο, αληαλαθιψληαο πηζαλψο ηελ κεησκέλε έθθξηζε ζσκαηνζηαηίλεο θαη ηελ απμεκέλε απειεπζέξσζε GHRH. Οη γξήγνξεο κεηαβνιέο ζηα επίπεδα ηεο IGFBP ζε αληίδξαζε ζηελ κεηαβιεζείζα δηαηξνθή θαη ζηηο κεηαβνιέο ζηα επίπεδα ηλζνπιίλεο κπνξεί λα ηξνπνπνηνχλ ην απνηέιεζκα ηεο IGF-I ζηηο πεξηνρέο ησλ ηειεζηψλ ηεο (αλαζηνιέσλ) θαη αξλεηηθνχ feedback. Ζ ζσκαηηθή κάδα επεξεάδεη θαη απηή ηελ παξαγσγή απμεηηθήο νξκφλεο ζηα θπζηνινγηθά παηδηά θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο πξν-εθεβείαο θαη ηεο εθεβείαο, θαη ζηνπο ελήιηθεο. (21,22) 1.4 ΣΑ ΜΔΣΑΒΟΛΗΚΑ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ ΣΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ Σα απνηειέζκαηα ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζηνπο ζσκαηηθνχο ηζηνχο κπνξνχλ γεληθά λα πεξηγξαθνχλ ζαλ αλαβνιηθά. χκθσλα κε ηελ ππφζεζε ηεο ζσκαηνκεδίλεο, νη αλαβνιηθέο δξάζεηο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ξπζκίδνληαη κέζσ ησλ IGFs. Αλ θαη ε ζεσξία απηή ηζρχεη γεληθά, ε απμεηηθή νξκφλε είλαη επίζεο ηθαλή λα πξνθαιεί απνηειέζκαηα πνπ είλαη αλεμάξηεηα απφ ηελ δξάζε ησλ IGFs. Πξάγκαηη, ζε νξηζκέλεο πεξηπηψζεηο, νη δξάζεηο ησλ GH θαη ησλ IGFs είλαη αληίζεηεο ε κηα απφ ηελ άιιε, φπσο θαίλεηαη θαη ζηηο δηαβεηνγφλεο δξάζεηο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο θαη ηεο δξάζεο ησλ IGFs πνπ πξνθαινχλ κείσζε ηεο γιπθφδεο. Ο Green θαη νη ζπλεξγάηεο ηνπ πξνζπάζεζαλ λα επηιχζνπλ θάπνηεο απφ ηηο δηαθνξέο απηέο ζε έλα κνληέιν δηπινχ ηειεζηή, φπνπ ε απμεηηθή νξκφλε δηεγείξεη πξφδξνκα θχηηαξα, φπσο είλαη ηα ςεπδφ-ρνλδξνθχηηαξα, ψζηε λα δηαθνξνπνηεζνχλ. Όηαλ ηα δηαθνξνπνηεκέλα θχηηαξα, ή νη γείηνλεο ηνπο, εθθξίλνπλ ζηε ζπλέρεηα IGF, ηφηε ηα πεπηίδηα απηά δξνπλ ζαλ κηηνγφλα θαη πξνθαινχλ θισληθή επέθηαζε. Ζ ππφζεζε απηή βαζίδεηαη πάλσ ζηελ ηθαλφηεηα ησλ IGF πεπηηδίσλ λα ιεηηνπξγνχλ φρη κφλν ζαλ νξκφλεο πνπ κεηαθέξνληαη κέζσ ηνπ αίκαηνο, αιιά θαη ζαλ απμεηηθνί παξάγνληεο παξαθξηλείο ή απηνθξηλείο. Ζ απμεηηθή νξκφλε έρεη κηα πνηθηιία απφ κεηαβνιηθέο δξάζεηο, νξηζκέλεο απφ ηηο νπνίεο θαίλνληαη λα είλαη αλεμάξηεηεο απφ ηελ παξαγσγή IGFs, φπσο είλαη ε αχμεζε ηεο ιηπφιπζεο θαη ηελ κεηαθνξά ακηλνμέσλ ζην δηάθξαγκα θαη ηελ θαξδηά, θαη ε αχμεζε ηεο ζχλζεζεο ησλ πξσηετλψλ ζην ήπαξ. Δπνκέλσο, ππάξρνπλ πνιιαπιά 24

26 ζεκεία δξάζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, θαη, ζπρλά, δελ είλαη απνιχησο μεθάζαξν πνηα απφ ηηο δξάζεηο απηέο ξπζκίδεηαη κέζσ ηνπ ζπζηήκαηνο IGF θαη πνηα κπνξεί λα αληηπξνζσπεχεη απνηειέζκαηα ηεο απμεηηθήο νξκφλεο αλεμάξηεηα απφ ηνπο IGFs. ηηο ελδερφκελεο πεξηνρέο φπνπ ε απμεηηθή νξκφλε δξα αλεμάξηεηα απφ ηελ IGF πεξηιακβάλνληαη: (1) Δπίθπζε νζηψλ: δηέγεξζε ηεο επηθπζηαθήο αλάπηπμεο (2) Οζηά: δηέγεξζε ηεο νζηενθιαζηηθήο δξαζηεξηφηεηαο θαη αχμεζε ηεο νζηηθήο κάδαο κέζσ ηνπ ζρεκαηηζκνχ ελδνρνλδξηθνχ νζηνχ (3) Ληπψδεο ηζηφο: έληνλα απνηειέζκαηα ηα νπνία αθνινπζνχληαη απφ απμεκέλε ιηπφιπζε, αλαζηνιή ηεο ιηπν-πξσηείληθεο ιηπάζεο, δηέγεξζε ηεο νξκνλνεπαίζζεηεο ιηπάζεο, κεησκέλε κεηαθνξά γιπθφδεο θαη κεησκέλε ιηπνγέλεζε (4) Μπο: απμεκέλε κεηαθνξά ακηλνμέσλ, απμεκέλε θαηαθξάηεζε αδψηνπ, απμεκέλε άιηπε κάδα κπφο θαη απμεκέλε δαπάλε ελέξγεηαο. Ζ ζεσξία ησλ δξάζεσλ πνπ είλαη αλεμάξηεηεο απφ ηνπο IGFs ππνζηεξίδεηαη θαη απφ κειέηεο in vivo, φπνπ o IGF-I δελ κπνξεί λα πξνθαιέζεη φιεο ηηο δξάζεηο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, φπσο είλαη γηα παξάδεηγκα ε θαηαθξάηεζε αδψηνπ θαη ε αληίζηαζε ζηελ ηλζνπιίλε. Σν εξψηεκα αλ ε απμεηηθή νξκφλε έρεη θάπνην απνηέιεζκα πάλσ ζηελ αλάπηπμε ην νπνίν λα κελ ξπζκίδεηαη απφ ηνπο IGFs έρεη απαζρνιήζεη κειέηεο πνπ αθνξνχλ ηελ ηαπηφρξνλε ζηνρεπφκελε απάιεηςε ησλ γνληδίσλ ησλ IGF-I θαη GH-R ζε πνληίθηα. Ζ απάιεηςε απηή είρε ζαλ απνηέιεζκα κηα πην ζνβαξή κείσζε ηεο κεηάβξεθηθήο αλάπηπμεο ζε ζρέζε κε απηή πνπ παξαηεξήζεθε κε ηελ απάιεηςε ηνπ θάζε ελφο γνληδίνπ κφλνπ ηνπ, ππνδεηθλχνληαο πσο νη GH θαη ν IGF-I πξνσζνχλ ηελ αλάπηπμε θαη κε αλεμάξηεηεο θαη κε θνηλέο ιεηηνπξγίεο. Ζ εκπεηξία σζηφζν, ηνπιάρηζηνλ ζε αλζξψπνπο, δείρλεη πσο ε ζπκβνιή ηεο GH, πέξα απφ ηελ ηθαλφηεηα ηεο λα δηεγείξεη ηνλ άμνλα IGF (ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ θαη ησλ IGF-I, IGHBP-3 θαη ηεο νμενεπαίζζεηεο ππνκνλάδαο) είλαη κέηξηα, θαη πσο ην ζχζηεκα IGF ζα πξέπεη λα ζεσξεζεί ζαλ ν θχξηνο ξπζκηζηήο ησλ δξάζεσλ ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζηελ ζθειεηηθή αλάπηπμε. Ζ παξαηήξεζε πσο νη παξαιιαγέο ζηελ αλάπηπμε πνπ ζρεηίδνληαη κε ηελ απάιεηςε ηνπ εμφληνπ-3 ηνπ GH-R δελ αληαλαθιψληαη ζε αιιαγέο ζηα επίπεδα ηνπ IGF-I, ππνδεηθλχεη ηελ πηζαλφηεηα λα ππάξρεη κηα αλεμάξηεηε δξάζε ηνπ IGF πάλσ ζηνλ αλαπηπζζφκελν ρφλδξν.(23,10,24,25) 25

27 1.5 ΦΤΗΟΛΟΓΗΚΖ ΑΝΑΠΣΤΞΖ Ζ παηδηθή ειηθία είλαη ε πεξίνδνο ηεο αλάπηπμεο. Ζ αλάπηπμε είλαη θνηλή ζε φινπο ηνπο πνιπθπηηαξηθνχο νξγαληζκνχο θαη γίλεηαη κε ηελ κεγέζπλζε θαη ηνλ αλαδηπιαζηαζκφ ησλ θπηηάξσλ καδί κε ηηο κε-νκνγελείο δηαδηθαζίεο ηεο δηαθνξνπνίεζεο ησλ θπηηάξσλ θαη ησλ νξγάλσλ. Σν ηειηθφ απνηέιεζκα ηεο αλάπηπμεο θαζνξίδεηαη απφ ηελ γελεηηθή ζχλζεζε ηνπ αηφκνπ ε νπνία αιιειεπηδξά κε εμσηεξηθά θαηλφκελα, φπσο είλαη ε πνηφηεηα θαη ε πνζφηεηα ηεο δηαηξνθήο, φπσο επίζεο θαη ςπρφ-θνηλσληθνί θαη νηθνλνκηθνί παξάγνληεο. Ζ θχζε ηεο γξακκηθήο αλάπηπμεο ηνπ χςνπο, ην αλ ζπκβαίλεη ζαλ κηα ζπλερήο δηαδηθαζία ή κε πεξηνδηθέο ψζεηο αλάπηπμεο θαη δηαθνπήο, είλαη δχζθνιν λα ραξαθηεξηζηεί. Παξφια απηά, αλ θαη ε δηαδηθαζία ηεο αλάπηπμεο είλαη πνιχπινθε θαη πνιχ-παξαγνληηθή, ηα παηδηά ζπλήζσο αλαπηχζζνληαη κε έλαλ εληππσζηαθά πξνβιέςηκν ηξφπν. Ζ απφθιηζε απφ έλα ηέηνην θπζηνινγηθφ κνληέιν αλάπηπμεο κπνξεί λα απνηειεί ηελ πξψηε έλδεημε κηαο κεγάιεο πνηθηιίαο παζνινγηθψλ δηαηαξαρψλ, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ θαη ελδνθξηληθψλ θαη κε-ελδνθξηληθψλ δηαηαξαρψλ, νη νπνίεο κπνξεί λα αθνξνχλ νπνηνδήπνηε φξγαλν ηνπ ζψκαηνο. Δπνκέλσο, ε ζπρλή θαη αθξηβήο αμηνιφγεζε ηεο αλάπηπμεο έρεη ηεξάζηηα ζεκαζία φζνλ αθνξά ηελ θξνληίδα ησλ παηδηψλ. Ζ αλάπηπμε ζπκβαίλεη κε δηαθνξεηηθέο ηαρχηεηεο θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο δσήο κέζα ζηελ κήηξα, θαηά ηελ πξψηκε θαη ηελ κέζε παηδηθή ειηθία θαη θαηά ηελ εθεβεία. Ζ ελδνκήηξηα αλάπηπμε είλαη θαηά κέζν φξν 1.2 κε 1.5 εθαηνζηά αλά εβδνκάδα, πνηθίιεη φκσο πάξα πνιχ, ελψ ε αλάπηπμε ζηα κέζα ηεο θπνθνξίαο απφ 2.5 εθαηνζηά αλά εβδνκάδα κεηψλεηαη ζε ζρεδφλ 0.5 εθαηνζηά αλά εβδνκάδα ιίγν πξηλ ηελ γέλλεζε. Ζ ηαρχηεηα αλάπηπμεο θαηά ηελ δηάξθεηα ησλ πξψησλ 2 ρξφλσλ ηεο δσήο είλαη θαηά κέζν φξν 15 εθαηνζηά αλά έηνο, θαη κεηψλεηαη ζε ζρεδφλ 6 εθαηνζηά αλά έηνο θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο κέζεο παηδηθήο ειηθίαο. Ζ εθεβηθή αλάπηπμε αξρίδεη λσξίηεξα ζηα θνξίηζηα, είλαη φκσο 3 κε 5 εθαηνζηά κεγαιχηεξε ζε κέγεζνο ζηα αγφξηα. Φπζηθά, ε πξαγκαηηθή αμηνιφγεζε ηεο ζπλνιηθήο εθεβηθήο αλάπηπμεο εμαξηάηαη απφ ηνλ ρξφλν έλαξμεο ηεο. Απηφο θαζνξίδεηαη απφ ηα θαζνξηζκέλα ζηάδηα Tanner πνπ πξνζδηνξίδνπλ ηελ έλαξμε ηεο εθεβηθήο αλάπηπμεο, ή απφ πην πνιχπινθεο αμηνινγήζεηο ηεο πξαγκαηηθήο έλαξμεο ηεο αλάπηπμεο κέζσ ηερληθψλ κνληεινπνίεζεο. Πεξίπνπ ην 40% ηεο ζπλνιηθήο εθεβηθήο αλάπηπμεο ζπκβαίλεη πξηλ ηελ Tanner 2 αλάπηπμε ζηήζνπο ζηα θνξίηζηα θαη ην 23% πξηλ ν 26

28 νξρηθφο φγθνο μεπεξάζεη ηα 3 ml ζηα αγφξηα. Σν κέγεζνο ηεο εθεβηθήο αλάπηπμεο, κε ηελ ρξήζε απηήο ηεο κεζνδνινγίαο, είλαη κεγαιχηεξν θαηά 30 εθαηνζηά θαη έρεη κηθξφηεξε θπιεηηθή δηαθνξά. Ζ αλάπηπμε ζηακαηά φηαλ ν ζθειεηφο θηάλεη ζηελ ελήιηθε σξηκφηεηα. Απηφ ζπκβαίλεη φηαλ ν πνιιαπιαζηαζκφο ησλ ρνλδξνθπηηάξσλ θαζπζηεξεί θαη αξρίδνπλ λα ζπκβαίλνπλ νη κεηαβνιέο ηεο γήξαλζεο. Δικόνα 14: Δηθόλα 14: Σηελ εηθόλα απεηθνλίδεηαη ην πνζνζηό ηεο γξακκηθήο αλάπηπμεο θαη ην βάξνο ζηε θύεζε θαη θαηά ηε δηάξθεηα ησλ πξώησλ 40 εβδνκάδσλ κεηά από ηε γέλλεζε. Σεκεηώζηε όηη ε κεηαβνιή κήθνπο εθθξάδεηαη ζε εθαηνζηόκεηξα ηελ εβδνκάδα. Η ζπλερήο γξακκή απεηθνλίδεη ην πξαγκαηηθό γξακκηθό πνζνζηό αύμεζεο, ε δηαθεθνκκέλε γξακκή πνπ ζπλδέεη ηελ ελδνκήηξηα θαη κεηά ηελ γέλλεζε ηαρύηεηα ηεο αλάπηπμεο απεηθνλίδεη ηε ζεσξεηηθή θακπύιε γηα θαλέλαλ πεξηνξηζκό αξγόηεξα ζηελ θύεζε. Η δεύηεξε γξακκή απεηθνλίδεη ηελ ηαρύηεηα αύμεζεο ηνπ βάξνπο. (26) Δικόνα 15: Δηθόλα 15: Γηάγξακκα ηεο αύμεζεο ηνπ ύςνπο ζηα αγόξηα πνπ πξνέθπςε από παξαηεξήζεηο ησλ παηδηώλ ζηε Βξεηαλία. Οη ηξείο θακπύιεο θαζνξίδνπλ ην γεληθό ηξόπν αύμεζεο θαηά ηε δηάξθεηα ηεο εθεβείαο. Οη ζθηαζκέλεο πεξηνρέο θαζνξίδνπλ ηελ ηαρύηεηα αλάπηπμεο ησλ παηδηώλ ηα νπνία έρνπλ ηηο κέγηζηεο ηαρύηεηεο ζηηο ειηθίεο κέρξη 2 ζηαζεξέο απνθιίζεηο πξηλ ή κεηά ηε κέζε ειηθία. Τα βέιε θαη ηα δηακάληηα ραξαθηεξίδνπλ εθαηνζηεκόξηα ηεο κέγηζηεο αλάπηπμεο ηαρύηεηαο όηαλ εκθαλίδεηαη ε αηρκή αλάπηπμεο ζε απηά ηα πξόσξα όξηα (26) 27

29 Δικόνα 16: Δηθόλα 16: Γηάγξακκα ηεο ηαρύηεηαο αύμεζεο ηνπ ύςνπο ζηα θνξίηζηα (26) Ο Karlberg θαη νη ζπλεξγάηεο ηνπ έρνπλ αλαιχζεη ηελ θπζηνινγηθή θακπχιε γξακκηθήο αλάπηπμεο ζε ηξεηο δηαθξηηέο θάζεηο. (82) ηα ζηνηρεία απηνχ ηνπ κνληέινπ πεξηιακβάλνληαη κηα βξεθηθή θάζε,ε νπνία μεθηλά ζηα κέζα ηεο θχεζεο θαη ζηε ζπλέρεηα επηβξαδχλεηαη πνιχ γξήγνξα, θηάλνληαο κέρξη ηελ ειηθία ησλ 3 κε 4 εηψλ. Δπίζεο, κηα θάζε παηδηθήο ειηθίαο, ε νπνία επηβξαδχλεηαη αξγά, θηάλνληαο κέρξη ηηο αξρέο ηεο εθεβείαο, θαη κηα ζηγκνεηδήο θάζε εθεβείαο. Έρνπλ πξνηαζεί νξκνληθά ζπλαθφινπζα ησλ θάζεσλ απηψλ. Ζ αιιειεπίδξαζε ηνπ άμνλα GH/ IGF, ησλ γνλαδηθψλ ζηεξνεηδψλ θαη ηεο ζπξνμίλεο είλαη πνιχπινθε, θαη πξνζπάζεηεο λα πξνζδηνξηζηεί ε θπξηαξρία κηαο ζπγθεθξηκέλεο νξκφλεο ζε νπνηαδήπνηε ρξνληθή πεξίνδν ηεο δσήο θαίλεηαη πνιχ πηζαλφ λα απνηεινχλ κηα ππέξαπινχζηεπζε. (27) Ο ππνινγηζκφο ηεο αλάπηπμεο απαηηεί αθξηβείο πξνζδηνξηζκνχο ηνπ χςνπο, νη νπνίνη ζα πξέπεη λα κπνξνχλ λα επαλαιεθζνχλ. πλήζσο ζε παηδηά ειηθίαο θάησ ησλ δχν εηψλ κεηξηέηαη ην χπηην χςνο, ελψ ζε κεγαιχηεξα παηδηά ππνινγίδεηαη ην χςνο ζε φξζηα ζηάζε. Οη εγγελείο αλαθξίβεηεο ηεο κέηξεζεο ηνπ χςνπο ζηα βξέθε ζπρλά δελ είλαη εκθαλείο ιφγσ ηεο πνιχ γξήγνξεο ζθειεηηθήο αλάπηπμεο πνπ παξαηεξείηαη θαηά ηελ δηάξθεηα απηήο ηεο πεξηφδνπ. Σα κήθε θαη ηα χςε ζα πξέπεη λα κεηξψληαη ηξεηο θνξέο, έηζη ψζηε λα κελ ππάξρεη απφθιηζε κεγαιχηεξε ησλ 0.3 εθαηνζηψλ, θαη ζα πξέπεη λα θαηαγξάθεηαη ν κέζνο φξνο χςνπο. Αθφκε θαη φηαλ έρεη θαηαβιεζεί θάζε πξνζπάζεηα γηα λα παξζνχλ αθξηβείο κεηξήζεηο χςνπο, είλαη αλαγθαίν λα ππάξρεη έλα ειάρηζην κεζνδηάζηεκα 6 κελψλ γηα λα γίλεη έλαο ζσζηφο ππνινγηζκφο ηεο ηαρχηεηαο χςνπο. Δίλαη κάιηζηα θαιχηεξα λα ππάξρνπλ εκεξνκελίεο κέηξεζεο 28

30 πνπ λα απέρνπλ κεηαμχ ηνπο 9 κε 12 κήλεο, έηζη ψζηε λα ειαρηζηνπνηνχληαη ηπρφλ ιάζε. (27) Δικόνα 17: Δηθόλα 17: Σερληθή κέηξεζεο κήθνπο. Δικόνα 18: Δηθόλα 18: Σερληθή κεηξήζεσο ηνπ χςνπο ρξεζηκνπνηψληαο ην ζηαδηφκεηξν Harpenden κε απεπζείαο ςεθηαθή κέηξεζε ηνπ χςνπο. Ζ αμηνιφγεζε ηνπ χςνπο ελφο παηδηνχ ζα πξέπεη λα γίλεηαη βάζεη ησλ θπζηνινγηθψλ θακππιψλ αλαθνξάο. Οη πεξηζζφηεξεο Ακεξηθαληθέο Παηδηαηξηθέο Δλδνθξηλνινγηθέο θιηληθέο ζπλερίδνπλ λα ρξεζηκνπνηνχλ ηα δεδνκέλα, ηα νπνία παξέρνληαη απφ ην National Center for Health Statistics (NCHS), ηα νπνία ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα πξψηε θνξά ην Σν NCHS πξφζθαηα έδσζε ζηελ δεκνζηφηεηα δηαγξάκκαηα αλάπηπμεο. Σα δηαγξάκκαηα απηά δείρλνπλ κηθξή κεηαβνιή ζην κέζν φξν χςνπο θαηά ηελ δηάξθεηα ησλ ηειεπηαίσλ 25 ρξφλσλ, θαη απηφ έξρεηαη ζε αληίζεζε κε ηελ αληίιεςε πσο ηα ζεκεξηλά παηδηά είλαη ςειφηεξα απφ φηη ήηαλ ηα παηδηά πξηλ απφ 3 πεξίπνπ δεθαεηίεο. (27) 29

31 Δικόνα 19: Σα δηαγξάκκαηα απηά απεηθνλίδνπλ ην χςνο ησλ παηδηψλ ζην 5 ν, 10 ν, 25 ν, 50 ν, 75 ν, 90 ν, θαη 95 ν εθαηνζηεκφξην ησλ θπζηνινγηθψλ παηδηψλ. Σα δεδνκέλα απηά είλαη ρξήζηκα ζην ππνινγηζκψλ ησλ πνζνζηψλ πξφηππεο απφθιηζεο (SDS), πνπ είλαη πνιχ πην ρξήζηκα, γηαηί έλα θνληφ παηδί κπνξεί λα πεξηγξαθεί, γηα παξάδεηγκα, ζαλ 4.2 ή 2.5 SDS απφ ην θπζηνινγηθφ. Χζηφζν, επεηδή απηά πξνζδηνξίδνληαη απφ δεδνκέλα ηεο ίδηαο ειηθίαο, ηα παηδηθά SDS δελ είλαη άκεζα ζπγθξίζηκα κε ηα SDS ηεο εθεβείαο, φηαλ ε απφθιηζε ζηελ αλαινγία αλάπηπμεο θαη ζηνλ ξπζκφ σξίκαλζεο κπνξεί λα είλαη κεγάιε. Γεχηεξνλ, ηα transectional δεδνκέλα έρνπλ κεγαιχηεξε αμία θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο βξεθηθήο θαη ηεο παηδηθήο ειηθίαο παξά θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο εθεβείαο, ιφγσ δηαθνξψλ ζηνλ ρξνληθφ ππνινγηζκφ ηεο έλαξμεο ηεο εθεβείαο, πνπ κπνξεί λα επεξεάζνπλ ζε πνιχ κεγάιν βαζκφ ηνπο ξπζκνχο θπζηνινγηθήο αλάπηπμεο. Ο Tanner θαη νη ζπλεξγάηεο ηνπ πξνζπάζεζαλ λα αληηκεησπίζνπλ ην πξφβιεκα απηφ κε ηελ αλάπηπμε δηαγξακκάησλ αλάπηπμεο απφ κειέηεο παξαθνινχζεζεο. Σα δηαγξάκκαηα απηά είλαη πνιχ ρξήζηκα ηδηαίηεξα γηα ηελ αμηνιφγεζε ηεο αλάπηπμεο θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο εθεβείαο, αιιά θαη γηα ηνλ ζρεδηαζκφ θακπχισλ αλάπηπμεο γηα θάζε παηδί μερσξηζηά. Σα δεδνκέλα απφ κειέηεο παξαθνινχζεζεο έρνπλ ρξεζηκνπνηεζεί γηα ηελ αλάπηπμε ησλ πξφηππσλ θακπχισλ ηαρχηεηαο αλάπηπμεο. Δίλαη ζεκαληηθφ λα ηνλίζνπκε πσο ηα πξνζεθηηθά θαηαγεγξακκέλα δεδνκέλα ηαρχηεηαο αλάπηπμεο έρνπλ πνιχ κεγάιε ζεκαζία γηα ηελ αμηνιφγεζε ελφο παηδηνχ κε αλσκαιίεο ζηελ αλάπηπμε. Αλ ππάξρεη ζεκαληηθή δηαθνξά ζηελ θπζηνινγηθή ηαρχηεηα αλάπηπμεο ζηα παηδηά δηαθνξεηηθψλ ειηθηψλ, κεηαμχ ηεο ειηθίαο ησλ 2 εηψλ θαη ηεο έλαξμεο ηεο εθεβείαο, ηα παηδηά ζπλήζσο αλαπηχζζνληαη κε αμηνζεκείσηε πηζηφηεηα ζε ζρέζε κε ηηο θακπχιεο θπζηνινγηθήο αλάπηπμεο. Κάζε απφθιηζε απφ ηα εθαηνζηεκφξηα χςνπο θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο 30

32 πεξηφδνπ απηήο ζα πξέπεη λα ζεσξείηαη ζαλ κε θπζηνινγηθή θαη πάληα ζα πξέπεη λα γίλεηαη πεξαηηέξσ αμηνιφγεζε. Δπηπιένλ, ε ζθειεηηθή σξίκαλζε κπνξεί λα ζπγθξηζεί κε θπζηνινγηθά πξφηππα πνπ ζρεηίδνληαη κε ηελ ειηθία. Απηή είλαη ε βάζε γηα ηελ νζηηθή ειηθία, ηνλ κνλαδηθφ άκεζα δηαζέζηκν πνζνηηθφ πξνζδηνξηζκφ ηεο θαζαξήο ζσκαηηθήο σξίκαλζεο, πνπ απνηειεί επνκέλσο θαη έλαλ θαζξέπηε ηνπ ξπζκνχ αλάπηπμεο θαη σξίκαλζεο. Γελ είλαη μεθάζαξν πνηνη παξάγνληεο θαζνξίδνπλ απηφ ην κνληέιν θπζηνινγηθήο σξίκαλζεο, είλαη σζηφζν μεθάζαξν πσο ζπκπεξηιακβάλνληαη γελεηηθνί παξάγνληεο θαη πνιιέο νξκφλεο, πεξηιακβαλνκέλσλ ηεο ζπξνμίλεο, ηεο απμεηηθήο νξκφλεο θαη ησλ ζηεξνεηδψλ. (27) Μειέηεο πνπ έρνπλ γίλεη ζε αζζελείο κε κεηαιιαγέο ηνπ γνληδίνπ γηα ηνπ νηζηξνγνληθφπ ππνδνρέα ή απηνχ ηνπ ελδχκνπ ηεο αξσκαηάζεο, έρνπλ δείμεη πσο βαζηθά ππεχζπλν γηα ην θιείζηκν ησλ επηθχζεσλ είλαη ην νηζηξνγφλν, αλ θαη θαίλεηαη κάιινλ απίζαλν λα είλαη ην νηζηξνγφλν απνθιεηζηηθά ππεχζπλν γηα φιεο ηηο πιεπξέο ηεο ζθειεηηθήο σξίκαλζεο. Γίλεηαη φιν θαη πην πξνθαλέο πσο ην νξκνληθφ πεξηβάιινλ, φπσο επίζεο θαη ε ελδνγελήο ηθαλφηεηα ησλ ρνλδξνθπηηάξσλ λα πνιιαπιαζηάδνληαη, νδεγνχλ ηειηθά ζηελ παχζε ηεο αλάπηπμεο. Ζ ειηθία ησλ νζηψλ απνηειεί κηα αληαλάθιαζε ηνπ βαζκνχ ηεο σξίκαλζεο θαη επνκέλσο είλαη έλα ρξήζηκν ζπκπιήξσκα ζηνλ ππνινγηζκφ ηεο αλάπηπμεο. (27) 1.6 ΑΝΑΠΣΤΞΗΑΚΔ ΓΗΑΣΑΡΑΥΔ Οη αλαπηπμηαθέο δηαηαξαρέο ρσξίδνληαη ζε ηξεηο νκάδεο. Ζ πξψηε πεξηιακβάλεη ηηο πξσηνγελείο αλσκαιίεο αλάπηπμεο, ε δεχηεξε ηηο δεπηεξνγελείο δηαηαξαρέο ζηελ αλάπηπμε θαη ε ηξίηε ην ISS (ηδηνπαζέο θνληφ αλάζηεκα). (Πίλ.2) ηηο πξσηνγελείο αλαπηπμηαθέο αλσκαιίεο, νη αλσκαιίεο θαίλεηαη πσο είλαη ελδνγελείο ηνπ ζπδεπθηηθνχ ρφλδξνπ. ε απηέο πεξηιακβάλνληαη ε νζηενρνλδξνδπζπιαζία θαη πνιιέο ρξσκνζσκηθέο δηαηαξαρέο. ηηο δεπηεξνγελείο αλαπηπμηαθέο δηαηαξαρέο, ε δηαηαξαρή ζηελ αλάπηπμε είλαη ην απνηέιεζκα ρξφληαο αζζέλεηαο ή ελδνθξηληθψλ δηαηαξαρψλ. Ζ θαηεγνξία ηεο έιιεηςεο IGF κπνξεί λα πξνθχςεη δεπηεξνγελψο εμαηηίαο αλεπάξθεηαο ζε GHRH, GHRH-R, GH ή, πξσηνγελψο, απφ GH-R, GH signaling ή κεηάιιαμε ηνπ IGF. (28) Σν ISS πεξηιακβάλεη απνθιίζεηο απφ ην θπζηνινγηθφ, φπσο είλαη ε θαηαζθεπαζηηθή θαζπζηέξεζε (structural growth delay) ηεο αλάπηπμεο θαη ηεο σξίκαλζεο θαη ην γελεηηθφ θνληφ αλάζηεκα. Δίλαη ζεκαληηθφ λα ζεκεηψζνπκε εδψ 31

33 πσο φξνη φπσο ην ISS αληαλαθινχλ ζε κεγάιν βαζκφ ηελ άγλνηα καο φζνλ αθνξά ηελ πνιχ-γνληδηαθή ξχζκηζε ηεο αλάπηπμεο. Δίλαη βέβαην πσο πνιιέο πεξηπηψζεηο ISS θαη γελεηηθνχ θνληνχ αλαζηήκαηνο αληαλαθινχλ ήπηα γελεηηθή κεηαβιεηφηεηα, ζπκπεξηιακβαλνκέλεο θαη ηεο εηεξνδπγσηίαο γηα κεηαιιαγέο ησλ γνληδίσλ γηα ηνλ GHR, IGF-1R, IGF-I, θαη άιισλ αλαπηπμηαθψλ παξαγφλησλ.(28) Πίνακαρ 2: (83) 1.7 ΑΝΔΠΑΡΚΔΗΑ IGF-I Ζ νινέλα θαη απμαλφκελε εθηίκεζε γηα ηνλ βαζηθφ ξφιν ηνπ ζπζηήκαηνο IGF ζηελ αλάπηπμε ησλ ζειαζηηθψλ, καδί κε ηελ αλαγλψξηζε ησλ πεξηνξηζκψλ φζνλ αθνξά ηελ θιηληθή θαη βηνρεκηθή δηάγλσζε ηεο αλεπάξθεηαο απμεηηθήο νξκφλεο, έρνπλ νδεγήζεη ζηελ πξφηαζε πσο ε έλλνηα ηεο αλεπάξθεηαο ζε IGF (IGF- Deficiency) κπνξεί λα καο πξνζθέξεη έλαλ πην ρξήζηκν ηξφπν γηα ηελ αμηνιφγεζε θαη ηελ θαηεγνξηνπνίεζε αζζελψλ κε νξηζκέλεο κνξθέο αλαπηπμηαθήο βιάβεο. Όζν 32

34 ρξήζηκε θαη αλ κπνξεί λα θαλεί απηή ε θαηεγνξηνπνίεζε, είλαη πνιχ ζεκαληηθφ λα αλαγλσξίζνπκε πσο, ηνπιάρηζηνλ πξνο ην παξφλ, απηή πεξηνξίδεηαη απφ δεηήκαηα πνπ αθνξνχλ ηηο αλαιχζεηο IGF, φπσο είλαη: 1. ε ειηθηαθή θαη ε εθεβηθή δηαθχκαλζε ζηηο ζπγθεληξψζεηο IGF-I νξνχ 2. ην απνηέιεζκα ηεο δηαηξνθήο θαη ηεο ρξφληαο θιεγκνλήο ζηηο ζπγθεληξψζεηο IGF-I νξνχ 3. ηελ ζπρλά αξγή κείσζε ζηηο ζπγθεληξψζεηο IGF-I νξνχ ζε αζζελείο κε εμειηζζφκελε GHD, θπξίσο κεηά απφ θξαληαθή αθηηλνβνιία, θαη 4. ηελ έιιεηςε πξνηχπσλ αλαθνξάο. (29) Παξφια απηά, ε ηαμηλφκεζε απηή είλαη ρξήζηκε γηα ηελ αλαγλψξηζε ηεο ζεκαληηθήο δηαγλσζηηθήο αμίαο ησλ αλαιχζεσλ IGF ζηελ αμηνιφγεζε ησλ παηδηψλ κε αλαπηπμηαθέο δηαηαξαρέο. Δπίζεο βνεζά ζην λα δνζεί έκθαζε ζηνλ πνιχ ζεκαληηθφ ξφιν ηνπ IGF-I θαη ζηελ εκβξπηθή θαη λενγληθή αλάπηπμε. (29) Ζ IGFD κπνξεί λα δηαηξεζεί ζε δπν θαηεγνξίεο κε βάζε ηηο αηηίεο ηεο (βιέπε Πίλαθα 3). ηελ δεπηεξνγελή IGFD πεξηιακβάλνληαη νη δηαηαξαρέο φπνπ ε αλεπάξθεηα ζε IGF είλαη ην απνηέιεζκα βιαβψλ ζηελ παξαγσγή απμεηηθήο νξκφλεο, είηε ζην επίπεδν ηνπ ππνζαιάκνπ ή ηεο ππφθπζεο. Ζ δεπηεξνγελήο IGFD κπνξεί λα είλαη ε ζπλέπεηα κηαο βιάβεο ζηνλ ππνζάιακν θαη/ ή ζηελ ππφθπζε, πνπ λα είλαη ην απνηέιεζκα ηξαχκαηνο, φγθσλ, κφιπλζεο, αθηηλνβνιίαο, θιεγκνλήο θ.ιπ., φπσο επίζεο θαη ε ζπλέπεηα κηαο νκάδαο κνξηαθψλ αηειεηψλ ζηελ αλάπηπμε ηεο ππφθπζεο. Ζ πξσηνγελήο IGFD αληηπξνζσπεχεη κηα νκάδα δηαηαξαρψλ πνπ ραξαθηεξίδνληαη απφ ηελ κεησκέλε παξαγσγή IGF-I κε θπζηνινγηθή ή αθφκε θαη απμεκέλε έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο (θαηαζηάζεηο GHI [insensitivity to GH action). ηελ Δηθ.21 απεηθνλίδεηαη έλα ελδερφκελν ζχζηεκα γηα αλάιπζε γλσζηψλ θαη ελδερφκελσλ γελεηηθψλ δηαηαξαρψλ ζε αζζελείο κε ζχλδξνκν έιιεηςεο απμεηηθήο νξκφλεο. (29) 33

35 Πινάκαρ 3: (29) Δικόνα 20: Δηθόλα 20: Σηελ εηθόλα απηή παξνπζηάδεηαη ν άμνλαο ππνζάιακνο-ππόθπζε- IGF-I θαη εκθαλίδνληαη όιεο νη πεξηνρέο (ηνληζκέλε γξακκαηνζεηξά) θαη νη ελδερόκελεο αλσκαιίεο (θπζηνινγηθή γξακκαηνζεηξά) ( ALS, Acid-labile subunit; GH, growth hormone; GHBP, GH-binding protein; GHRH, GH-releasing hormone; IGF, insulin-like growth factor; IGF-BP, IGF-binding protein; JAK, Janus kinase; MAPK, mitogen-activated protein kinase; STAT, signal transducer and activator of transcription. 34

36 Δικόνα 21: Δηθόλα 21: Σηελ παξαπάλσ εηθόλα θαίλεηαη ην δέληξν γηα ηελ δηεξεύλεζε ησλ γελεηηθώλ αλσκαιηώλ ζε αζζελείο κε αλεπάξθεηα IGF-. Οη ππνζεηηθέο γελεηηθέοδηαηαξαρέο παξνπζηάδνληαη ζηηο παξελζέζεηο #, Αλσκαιίεο ζε άιια όξγαλα θαη νη δνκέο εθηόο από ηνλ άμνλα ππνζάιακνπ-ππόθπζεο- igf άμνλα, αλακέλεηαη λα πξνθύςνπλ σο απνηέιεζκα απηώλ ησλ γελεηηθώλ αλσκαιηώλ. ACTH, Adrenocorticotropic hormone; CPHD, combined pituitary hormone deficiencies; FSH, follicle-stimulating hormone; GH, growth hormone; GHR, GH receptor; GHRHR, GH-releasing hormone receptor; IGF, insulin-like growth factor; IGFIR, IGF-I receptor; LH, luteinizing hormone; PRL, prolactin; STAT5, signal transducer and activator of transcription 5; TSH, thyroid-stimulating hormone. Ζ λενγληθή αλάπηπμε είλαη παζνινγηθή ζηελ ζνβαξή ζπγγελή έιιεηςε IGF. Οη πεξηζζφηεξεο έξεπλεο ησλ GHD, GHI δείρλνπλ πσο ε βιάβε κπνξεί λα ζπκβεί θαηά ηελ δηάξθεηα ησλ πέληε πξψησλ κελψλ ηεο δσήο. Απφ ηνπο 6 κέρξη ηνπο 12 κήλεο ηεο δσήο, ν ξπζκφο αλάπηπμεο είλαη αξγφο θαη απνθιίλεη απφ ηελ θακπχιε θπζηνινγηθήο αλάπηπμεο, 3 κε 4 SD θάησ απφ ηνλ κέζν φξν. Απηφ ηνλίδεη ηελ ζεκαζία ηεο θπζηνινγηθήο παξαγσγήο θαη δξάζεο ηνπ IGF-I θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο λενγληθήο πεξηφδνπ θαη ησλ αξρψλ ηεο παηδηθήο ειηθίαο. (29) Σνλίδνπκε πσο ε πην ζεκαληηθή θιηληθή εθδήισζε ηεο έιιεηςεο IGF, φισλ ησλ αηηηνινγηψλ, είλαη ε αλεπαξθήο αλάπηπμε, θαη ε πξνζεθηηθή θαηαγξαθή ησλ ξπζκψλ αλάπηπμεο είλαη ηδηαίηεξα ζεκαληηθή φζνλ αθνξά ηελ ζσζηή δηάγλσζε. Ζ απφθιηζε απφ ηελ θακπχιε θπζηνινγηθήο αλάπηπμεο ζα πξέπεη πάληα λα πξνθαιεί αλεζπρία. Μεηαμχ ηεο ειηθίαο ησλ 2 εηψλ θαη ηεο έλαξμεο ηεο εθεβείαο, ε κείσζε ηνπ ξπζκνχ αλάπηπμεο ζα πξέπεη πάληα λα ζεσξείηαη παζνινγηθή. (30) Οη ζσκαηηθέο αλαινγίεο ηείλνπλ λα είλαη ζρεηηθά θπζηνινγηθέο, αιιά ζπζρεηίδνληαη θαιχηεξα κε ηελ νζηηθή ειηθία παξά κε ηελ ρξνλνινγηθή ειηθία. Ζ νζηηθή ειηθία κπνξεί λα έρεη θαζπζηεξήζεη θαηά 60% ηεο ρξνλνινγηθήο ειηθίαο, φκσο, απνπζία ππνζπξενεηδηζκνχ, είλαη παξφκνηα κε ηελ ειηθία χςνπο. ην επίθηεην GHD, φπσο ζπκβαίλεη θαη απφ έλαλ φγθν Κ.Ν. (Κεληξηθνχ Νεπξηθνχ ζπζηήκαηνο) πνπ πξνθαιεί απμεκέλε ελδνθξαληαθή πίεζε, έηζη θαη εδψ ε νζηηθή ειηθία κπνξεί λα είλαη 35

37 παξφκνηα κε ηελ ρξνλνινγηθή ειηθία. Δπνκέλσο, ε θαζπζηεξεκέλε ζθειεηηθή σξίκαλζε δελ ζα πξέπεη λα ζεσξείηαη απαξαίηεηε γηα ηελ δηάγλσζε ηνπ GHD. Ζ θαηαλνκή ιίπνπο είλαη ζπρλά βξεθηθή ή φκνηα κε θνχθιαο ( doll-like ). Ζ αλάπηπμε ησλ νζηψλ ηνπ πξνζψπνπ κπνξεί λα παξνπζηάδεη θαζπζηέξεζε, κε κηα ππαλάπηπθηε ξηληθή γέθπξα θαη πξφζζην χβν. Ζ ζπλνιηθή αλάπηπμε ηνπ θξαλίνπ είλαη θπζηνινγηθή, ελψ ζπρλά είλαη θαζπζηεξεκέλε ε ζχγθιηζε ησλ πεγψλ, θάηη πνπ έρεη ζαλ απνηέιεζκα θεθαιηθή/ πξνζσπηθή δπζαλαινγία θαη ηελ εκθάληζε πδξνθέθαινπ. Ζ θσλή είλαη βξεθηθή, ιφγσ ηεο δπζπιαζίαο ηνπ ιάξπγγα. Σα καιιηά είλαη αξαηά θαη ιεπηά, θπξίσο θαηά ηελ δηάξθεηα ησλ αξρψλ ηεο δσήο. Αξγή είλαη επίζεο θαη ε αλάπηπμε ησλ λπρηψλ. Αθφκε θαη κε θπζηνινγηθή παξαγσγή γνλαδνηξνπίλεο, ην πένο είλαη κηθξφ θαη ε εθεβεία είλαη ζπλήζσο θαζπζηεξεκέλε. Γελ ππάξρνπλ πνιιά ηειηθά δεδνκέλα γηα αζζελείο κε έιιεηςε GH ζηνπο νπνίνπο δελ έρεη γίλεη ζεξαπεία. (30) Δικόνα 22: Δηθόλα 22: Απεηθόληζε ηνπ θαηλνηύπνπ αηόκσλ κε GHD Ζ κέηξεζε ηεο εθθξηηηθήο εθεδξείαο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο βαζίδεηαη ζηελ ρξήζε θπζηνινγηθψλ ή θαξκαθνινγηθψλ εξεζηζκάησλ, θαη ηέηνηεο πξνθιεηέο δνθηκαζίεο έρνπλ απνηειέζεη ηελ βάζε γηα ηελ δηάγλσζε ηεο GHD γηα πάλσ απφ 50 ρξφληα. ηα θπζηνινγηθά εξεζίζκαηα πεξηιακβάλνληαη ε λεζηεία, ν χπλνο θαη ε άζθεζε, θαη ζηα θαξκαθνινγηθά εξεζίζκαηα πεξηιακβάλνληαη ε ρνξήγεζε ηλζνπιίλεο, γιπθαγφλεο, θινληδίλεο, πξνπξαλνιφιεο, αξγηλίλεο θαη levodopa. Οη δνθηκαζίεο δηέγεξζεο ζπρλά ρσξίδνληαη ζε δνθηκαζίεο δηαινγήο (άζθεζε, λεζηεία, θινληδίλε, levodopa) ηα νπνία ραξαθηεξίδνληαη απφ επθνιία ρνξήγεζεο, κηθξή 36

38 ηνμηθφηεηα, κηθξφ θίλδπλν θαη κηθξή εμεηδίθεπζε, θαη ζε θαζνξηζηηθά ηεζη, (αξγηλίλε, ηλζνπιίλε, γιπθαγφλε). (30) Μηα άιιε δηαγλσζηηθή πξνζέγγηζε ζρεηίδεηαη κε ηελ κέηξεζε ηεο απηφκαηεο έθθξηζεο απμεηηθήο νξκφλεο. Απηή κπνξεί λα γίλεη είηε κε πνιιαπιή δεηγκαηνιεςία (θάζε 30 ιεπηά) ζε κηα ρξνληθή πεξίνδν 24- σξψλ, ή κε ηελ ζπλερή ιήςε αίκαηνο γηα 12 κε 24 ψξεο. Ζ πξψηε κέζνδνο επηηξέπεη ηελ αμηνιφγεζε θαη ησλ ραξαθηεξηζκφ ηεο παικηθφηεηαο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, ελψ ε δεχηεξε επηηξέπεη κφλν ηνλ πξνζδηνξηζκφ ηνπ κέζνπ φξνπ ζπγθέληξσζεο απμεηηθήο νξκφλεο. Καη νη δπν απηέο πξνζεγγίζεηο έρνπλ πνιινχο παξφκνηνπο πεξηνξηζκνχο. Ζ θαηαγξαθή ησλ θπζηνινγηθψλ (ή ησλ απμεκέλσλ) επηπέδσλ απμεηηθήο νξκφλεο είλαη αλαγθαία γηα ηελ δηάθξηζε κεηαμχ πξσηνγελνχο θαη δεπηεξνγελνχο έιιεηςεο IGF-Η. Σέινο, ε ηαμηλφκεζε ηνπ GHD, είηε κφλνπ ηνπ είηε ζε ζπλδπαζκφ κε άιιεο ππνθπζηαθέο αλεπάξθεηεο, κπνξεί λα απνηειεί βάζηκν ιφγν γηα ηελ αλαδήηεζε κνξηαθψλ δηαηαξαρψλ ζηελ παξαγσγή απμεηηθήο νξκφλεο. (30) 1.8 ΝΔΤΡΟ-ΔΚΚΡΗΣΗΚΖ ΓΤΛΔΗΣΟΤΡΓΗΑ GH Ζ θαηάζηαζε απηή ραξαθηεξίδεηαη απφ ην θνληφ αλάζηεκα θαη ηελ θαθή αλάπηπμε, θπζηνινγηθή αληαπφθξηζε GH νξνχ ζηηο πξνθιεηέο δνθηκαζίεο θαη κεησκέλα επίπεδα IGF-I, GH νξνχ 24σξψλ. Ζ πην ζπλεζηζκέλε αηηία ησλ επξεκάησλ απηψλ είλαη ε θξαληαθή αθηηλνβνιία. Φαίλεηαη πσο ππάξρνπλ πνιχ ιίγεο ακθηβνιίεο ζρεηηθά κε ην φηη νξηζκέλα παηδηά κε λεχξν-εθθξηηηθή δπζιεηηνπξγία απμεηηθήο νξκφλεο εθθξίλνπλ αλεπαξθείο πνζφηεηεο απμεηηθήο νξκφλεο, αθφκε θαη αλ έρνπλ θπζηνινγηθή πξνθιεηή δνθηκαζία. (31) 1.9 ΒΗΟ-ΑΝΔΝΔΡΓΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ ηελ θαηάζηαζε απηή φιεο νη πξνθιεηέο δνθηκαζίεο είλαη θπζηνινγηθά, σζηφζν ηα παηδηά έρνπλ θαζπζηέξεζε ζηελ αλάπηπμε. ε κηα απφ ηηο πην πεηζηηθέο πεξηπηψζεηο βίν-αλελεξγνχο GH πνπ έρνπλ αλαθεξζεί κέρξη ζήκεξα, ν Besson θαη νη ζπλεξγάηεο ηνπ βξήθαλ κηα νκφδπγε παξεξκελεχζηκε κεηάιιαμε (G705C), ε νπνία είρε ζαλ απνηέιεζκα ηελ απνπζία δπν δηζνπιθηδηθψλ γεθπξψλ, ζε έλα θνληφ παηδί απφ ηελ εξβία (-3.6 SDS). Σφζν ε δέζκεπζε ηεο GH ζηνλ GHR φζν θαη ε δξαζηεξηφηεηα ζεκαηνδφηεζεο JAK2/STA5 ήηαλ ζεκαληηθά κεησκέλεο. (87) 37

39 Δπίζεο, κειέηεο έρνπλ δείμεη πσο, ζε έλα παηδί κε πνιχ θνληφ αλάζηεκα (-6.1 SDS), κηα κεηαιιαγκέλε GH πνπ πξνθιήζεθε απφ κηα θαη κνλαδηθή εηεξφδπγε κεηάιιαμε (cys to arg, codon 77 ηνπ γνληδίνπ GH-1), είρε κεγαιχηεξε ζπγγέλεηα πξφζδεζεο απφ ηελ θπζηνινγηθή ζηε GHBP θαη ζηνλ ππνδνρέα-gh θαη αλέζηειιε ηελ δξάζε ηεο θπζηνινγηθήο απμεηηθήο νξκφλεο. Σν παηδί κεγάισζε πεξηζζφηεξν (6 ζε ζχγθξηζε κε 3.9 cm/ yr) θαηά ηελ πεξίνδν εμσγελνχο απμεηηθήο νξκφλεο κε κέζε δνζνινγία. Πεξηέξγσο, ν παηέξαο είρε ηελ ίδηα γελεηηθή αλσκαιία αιιά δελ παξνπζίαδε ηε κεηαιιαγή. ηνλ δεχηεξν αζζελή κε ζεκαληηθά θνληφ αλάζηεκα (-3.6 SDS), κηα εηεξφδπγε κεηάιιαμε αληηθαηάζηαζεο Α ζε G ζην εμφλην 4 ηεο απμεηηθήο νξκφλεο νδήγεζε ζε κηα αληηθαηάζηαζε γιπθίλεο ζε αξγηλίλε. Ζ κεηαιιαγή απηή εληνπίδεηαη ζηε ζέζε 2 ηεο κνξηαθήο πξφζδεζεο ηεο GH ζηνλ ππνδνρέα ηεο, θαη πξνθαλψο νδήγεζε ζην λα κελ γίλεη ζσζηά ε θαηάιιειε κνξηαθή δηακφξθσζε ηνπ δηκεξηζκέλνπ ππνδνρέα θαη ζπλεπψο ζε κεησκέλε θσζθνξπιίσζε ηπξνζίλεο θαη κεησκέλε ζεκαηνδφηεζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ελδνθπηηάξηα. Ζ απνπζία κεηαιιάγσλ ηνπ GH1 δείρλεη ηελ ζπνπδαηφηεηα ησλ δηαηαξαρψλ ησλ κεηάκεηαθξαζηηθψλ ηξνπνπνηήζεσλ ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ή άιισλ πεξηθεξεηαθψλ κεραληζκψλ. (32) 1.10 ΗΓΗΟΠΑΘΔ ΚΟΝΣΟ ΑΝΑΣΖΜΑ Δμαθνινπζεί αθφκε θαη ζήκεξα λα ππάξρεη έλαο κεγάινο αξηζκφο απφ θνληά παηδηά, γηα ηα νπνία είλαη άγλσζηε ή ηδηνπαζήο ε αηηία ηνπ θνληνχ αλαζηήκαηνο. Πνιιά παηδηά θαη πνιινί έθεβνη ζηηο αξρέο ηεο εθεβείαο ηνπο είλαη θνληνί (<3 νο εθαηνζηηαίνο), έρνπλ αξγή γξακκηθή ηαρχηεηα αλάπηπμεο (<25 νο εθαηνζηηαίνο), θαη κπνξεί λα έρνπλ θαζπζηεξεκέλε ζθειεηηθή σξίκαλζε θαη κηα αηειή ή εμαζζελεκέλε εθεβηθή αλαπηπμηαθή αηρκή, κε ή ρσξίο νηθνγελεηαθφ ηζηνξηθφ κε έλα ή φια απηά ηα θιηληθά ραξαθηεξηζηηθά. Δπίζεο, δελ έρνπλ ρξφληεο αζζέλεηεο ή πξνθαλείο ελδνθξηλνπάζεηεο. (33) Σα παηδηά απηά ζπλήζσο έρνπλ θπζηνινγηθφ εθθξηηηθφ δπλακηθφ απμεηηθήο νξκφλεο, αλ θαη ηα πξνθιεηά ηεζη κπνξεί ζε νξηζκέλεο πεξηπηψζεηο λα κελ είλαη μεθάζαξα. Σα εμαξηψκελα απφ ηελ απμεηηθή νξκφλε πεπηίδηα είλαη ζπρλά (αιιά φρη πάληα) ρακειφηεξα απφ ην αλακελφκελν, ζε κηα ρξνλνινγηθή ειηθηαθή βάζε. ηα πεξηζζφηεξα απφ ηα παηδηά απηά δελ έρεη πξνζδηνξηζηεί ε αηηηνινγία ηελ αξγήο αλάπηπμεο θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο παηδηθήο ειηθίαο, νχηε θαη ε ζπρλά παξαηεξνχκελε 38

40 θαζπζηεξεκέλε εθεβηθή αηρκή αλάπηπμεο. Δπεηδή απηή είλαη ε κεγαιχηεξε νκάδα θνληψλ παηδηψλ, γίλνληαη δηαξθψο πξνζπάζεηεο γηα ηελ αλάπηπμε κηαο ινγηθήο θαηεγνξηνπνίεζεο αιιά θαη ηνλ πξνζδηνξηζκφ ησλ πηζαλψλ αλσκαιηψλ ηνπ άμνλα GH-IGF. (33) ηελ πνιχ επξεία απηή θαηεγνξία πεξηιακβάλνληαη πνιιέο νκάδεο αζζελψλ, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ θαη εθείλσλ κε θαζπζηέξεζε ζηελ αλάπηπμε θαη ηελ σξίκαλζε θαη ην νλνκαδφκελν γελεηηθφ ή νηθνγελέο θνληφ αλάζηεκα (familial). (33) Σν νηθνγελεηαθφ θνληφ αλάζηεκα αθνξά έλαλ ελήιηθα ηνπ νπνίνπ ην χςνο είλαη θνληά ζην θαηψηεξν φξην ηεο θπζηνινγηθήο θιίκαθαο ή ρακειφηεξα απφ απηφ, θαηάιιειν φκσο γηα ηελ νηθνγέλεηα ηνπ. Θα πξέπεη λα ζεκεησζεί πσο απηφ δελ ζα πξέπεη λα ζεσξείηαη πάληα θαζεζπραζηηθφ, κηα πνπ ππάξρεη κηα απμαλφκελε αλαγλψξηζε ήπησλ γελεηηθψλ ειαηησκάησλ πνπ ζπκβάινπλ ζηελ θαθή αλάπηπμε. Σν ISS είλαη ε ηειεπηαία κεγάιε θαη κε ραξαθηεξηζκέλε νκάδα παηδηψλ κε θνληφ αλάζηεκα. Σα παηδηά απηά έρνπλ πην ήπηεο δηαηαξαρέο ηνπ άμνλα ππνζάιακνοππφθπζε- IGF ζε ζρέζε κε απηέο πνπ πεξηγξάςακε ζηελ αλάιπζε ηεο πξσηνγελνχο IGFD (βιέπε Πίλαθα 23-10). Γελ έρνπλ αθφκε πεξηγξαθεί νη εηεξφδπγεο κεηαιιάμεηο ζε φιν ην αλαπηπμηαθφ ζχζηεκα, κηα ζρεηηθά κεγαιχηεξε θπξηαξρία ησλ θξαγκψλ ηνπ θαηαξξάθηε ζεκαηνδφηεζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, φπσο ε απμεκέλε δξαζηεξηφηεηα θσζθαηάζεο θαη ε παξαγσγή παξαγφλησλ ζεκαηνδφηεζεο φπσο νη SOC2, CIS, θαη νη κεηαβνιέο πνπ ξπζκίδνληαη απφ ηα γνλίδηα ζηα κνληέια παξαγσγήο ησλ GH, IGF. (33) 1.11 ΠΟΡΔΗΑ ΜΔΣΑΓΧΓΖ ΣΟΤ ΖΜΑΣΟ Οη νξκφλεο εθθξίλνληαη ζην αίκα θαη δξνπλ ζε θχηηαξα ζηφρνπο ζε απφζηαζε απφ ηνλ εθθξηηηθφ αδέλα. Γηα λα αληαπνθξηζεί ζε κηα νξκφλε, έλα θχηηαξν ζηφρνο πξέπεη λα πεξηέρεη ηα βαζηθά ζπζηαηηθά κηαο νδνχ ζεκαηνδφηεζεο. Πξψηνλ, ζα πξέπεη λα ππάξρεη έλαο ππνδνρέαο πνπ ζα δεζκεχζεη ηελ νξκφλε. Γεχηεξνλ, ζα πξέπεη λα ππάξρεη έλαο ηειεζηήο- γηα παξάδεηγκα κηα ελδπκαηηθή δξαζηεξηφηεηα ε νπνία ξπζκίδεηαη φηαλ ε νξκφλε δεζκεχεηαη απφ ηνλ ππνδνρέα ηεο. Σέινο, ζα πξέπεη λα ππάξρνπλ νη θαηάιιειεο νδνί ζεκαηνδφηεζεο πεξηθεξηθφηεξα γηα λα ξπζκίζνπλ ηηο θπζηνινγηθέο αληηδξάζεηο ζηελ νξκφλε. ηελ πξαγκαηηθφηεηα απηνχ ηνπ είδνπο ν κεραληζκφο πνπ πεξηιακβάλεη ππνδνρείο, ηειεζηέο θαη πεξηθεξηθέο νδνχο ζεκαηνδφηεζεο θαηάξξνπ είλαη αξθεηά ζπλεζηζκέλνο θαη ιεηηνπξγεί θαη ζε κε 39

41 ελδνθξηληθά ζπζηήκαηα, φπσο απηά πνπ ξπζκίδνληαη απφ ηνπο λεπξνδηαβηβαζηέο, ηηο θπηηαξνθίλεο θαη παξαθξηλείο θαη απηνθξηλείο παξάγνληεο. (1) ηηο αξρέο ηεο ηζηνξίαο ηεο ελδνθξηλνινγίαο, ε πξνζνρή είρε επηθεληξσζεί ζηελ ξχζκηζε ηεο έθθξηζεο κηαο νξκφλεο, γηαηί απηή ζεσξνχληαλ ζαλ ν πην ζεκαληηθφο κεραληζκφο ηεο ξπζκηζηηθήο θπζηνινγίαο. Έρεη σζηφζν γίλεη πξνθαλέο πσο ην θχηηαξν ζηφρνο δελ παξακέλεη παζεηηθφ. Αληίζεηα, ππάξρνπλ πνιιέο επηξξνέο πνπ κπνξνχλ λα κεηαβάινπλ ηελ επαηζζεζία ηεο αληαπφθξηζεο ελφο θπηηάξνπ ζηφρνπ ζε κηα δεδνκέλε ζπγθέληξσζε νξκφλεο. Γηα παξάδεηγκα, κπνξεί λα ηξνπνπνηεζεί ν αξηζκφο ησλ ππνδνρέσλ. Αλ φια ηα ππφινηπα είλαη ίδηα, ε νξκνληθή επαηζζεζία ζρεηίδεηαη άκεζα κε ηνλ αξηζκφ ησλ νξκνληθψλ ππνδνρέσλ πνπ εθθξάδνληαη ζηελ θπηηαξηθή επηθάλεηα. Δπηπιένλ, νη κεηά-κεηαθξαζηηθέο ηξνπνπνηήζεηο ηνπ ππνδνρέα κπνξνχλ λα ηξνπνπνηήζνπλ είηε ηελ ζπγγέλεηα ηεο νξκνληθήο δέζκεπζεο, είηε ηελ απνηειεζκαηηθφηεηα ηεο ζχδεπμεο κε ηηο νδνχο ζεκαηνδφηεζεο πεξηθεξηθφηεξα. Δπίζεο, φια ηα πεξηθεξηθά ζηνηρεία ζηελ πνξεία δξάζεο κηαο νξκφλεο ππφθεηληαη ζε παξφκνηνπο ηχπνπο ξπζκηζηηθψλ επηξξνψλ, πνπ κπνξεί λα έρνπλ ζεκαληηθή επίδξαζε ζηελ ηθαλφηεηα ηνπ θπηηάξνπ ζηφρνπ λα αληαπνθξηζεί ζηελ νξκφλε. Αθξηβψο φπσο ε νξκνληθή επαηζζεζία ππφθεηηαη ζε θπζηνινγηθή ζσκαηηθή ξχζκηζε, έηζη θαη νη παζνινγηθέο επηξξνέο κπνξεί λα πξνθαιέζνπλ αζζέλεηεο ζηνρεχνληαο ζηνηρεία ηεο νδνχ δξάζεο ηεο νξκφλεο. (1,34) Πνιιαπινί αηηηνινγηθνί παξάγνληεο κπνξεί λα πξνθαιέζνπλ βιάβε ζηελ νδφ δξάζεο ηεο νξκφλεο, φπσο είλαη γηα παξάδεηγκα νη γελεηηθέο επηξξνέο, απηνάλνζνη δηαδηθαζίεο θαη εμσγελείο ηνμίλεο. Τπάξρνπλ πνιιέο ηάμεηο ππνδνρέσλ πνπ ελδηαθέξνπλ ηελ ελδνθξηλνινγία. Οξηζκέλνη ππνδνρείο βξίζθνληαη κέζα ζην θχηηαξν θαη ιεηηνπξγνχλ ζαλ παξάγνληεο κεηαγξαθήο, φπσο είλαη γηα παξάδεηγκα ππνδνρείο γηα ηηο ζηεξνεηδείο θαη ηηο ζπξενεηδείο νξκφλεο. Άιινη ππνδνρείο βξίζθνληαη πάλσ ζηελ επηθάλεηα ηνπ θπηηάξνπ θαη ιεηηνπξγνχλ θπξίσο ζαλ κεηαθνξείο ηνπ πξνζδέηε ηνπο ζην θχηηαξν κέζσ κηαο δηαδηθαζίαο πνπ νλνκάδεηαη ελδνθπηηάξσζε πνπ ξπζκίδεηαη απφ ηνλ ππνδνρέα, θαη ηέηνηνη είλαη, γηα παξάδεηγκα, νη ππνδνρείο ιηπνπξσηεΐλεο ρακειήο ππθλφηεηαο. Σέινο, ππάξρνπλ νη ππνδνρείο ηεο επηθάλεηαο ηνπ θπηηάξνπ πνπ δηεγείξνπλ ελδνθπηηαξηθέο νδνχο ζεκαηνδφηεζεο. (1) Απηνί νη ππνδνρείο ηεο επηθάλεηαο ησλ θπηηάξσλ κπνξνχλ λα ηαμηλνκεζνχλ αλάινγα κε ηνπο κνξηαθνχο κεραληζκνχο κέζσ ησλ νπνίσλ πεηπραίλνπλ ηελ ιεηηνπξγία ηεο ζεκαηνδφηεζεο, φπσο: 40

42 Γίαπινη ηφλησλ κε πχιεο ππνθαηαζηαηψλ (γηα παξάδεηγκα, ληθνηηληθνί ππνδνρείο αθεηπινρνιίλεο) Τπνδνρείο θηλάζεο ηπξνζίλεο (γηα παξάδεηγκα, ππνδνρείο γηα ηελ απμεηηθή νξκφλε, ηελ ηλζνπιίλε θαη ηνλ IGF-I) Τπνδνρείο θηλάζεο ζεξίλεο/ ζξενλίλεο (γηα παξάδεηγκα ππνδνρείο γηα activins, inhibins) Τπνδνρέαο γνπαληιηθήο θπθιάζεο (γηα παξάδεηγκα, ππνδνρέαο ηνπ θνιπηθνχ λαηξηνπξεηηθνχ παξάγνληα) Τπνδνρείο ζπδεπγκέλνη κε G-coupled πξσηεΐλεο (γηα παξάδεηγκα, ππνδνρείο ησλ αλδξνγφλσλ, γιπθν-πξσηετληθέο νξκφλεο, κνπζθαξηληθνχο ρνιελεξγηθνχο παξάγνληεο, γιπθαγφλε θαη παξαζνξκφλε) Τπνδνρείο θπηηαξνθηλψλ (γηα παξάδεηγκα, ππνδνρείο γηα ηελ απμεηηθή νξκφλε, ηελ πξνιαθηίλε θαη ηελ ιεπηίλε). (81,36) Οη ηειεπηαίνη δπν ηχπνη ππνδνρέσλ έρνπλ ηελ ηθαλφηεηα λα δεζκεχνπλ ηελ νξκφλε, πξέπεη φκσο λα ρξεζηκνπνηήζνπλ έλα μερσξηζηφ κφξην γηα λα θαηαιχζνπλ ηελ ιεηηνπξγία ηειεζηή. Γηα παξάδεηγκα, νη ππνδνρείο θπηηαξνθηλψλ ρξεζηκνπνηνχλ θπηηαξνπιαζκαηηθέο θηλάζεο ηπξνζίλεο ( γηα παξάδεηγκα, θηλάζεο ηπξνζίλεο ηεο νηθνγέλεηαο Janus, ή JAK),ζαλ ηειεζηέο γηα λα δηεγείξνπλ ηηο νδνχο ζεκαηνδφηεζεο πεξηθεξηθά. (1) Ο Leung θαη νη ζπλεξγάηεο ηνπ θισλνπνίεζαλ cdna αλζξψπσλ θαη θνπλειηψλ γηα ηνλ ππνδνρέα ηεο απμεηηθήο νξκφλεο (GHR). Σν θαζέλα πεξηέρεη έλα αλνηθηφ πιαίζην αλάγλσζεο 638 ακηλνμέσλ θαη θσδηθνπνηεί έλαλ ψξηκν ππνδνρέα 620 ακηλνμέσλ θαη κε κνξηαθφ βάξνο 70 kda. Τπάξρνπλ ηξεηο ζπγθεθξηκέλεο πεξηνρέο- κηα έμσ-θπηηάξηα πεξηνρή δέζκεπζεο ηεο νξκφλεο, κηα δηακεκβξαληθή πεξηνρή θαη κηα θπηηαξνπιαζκαηηθή πεξηνρή. Ζ εμσθπηηάξηα πεξηνρή ηνπ GHR απνηειείηαη απφ δπν ππν-πεξηνρέο (ακηλνμέα θαη ακηλνμέα ) πνπ ζπλδένληαη κε έλα ηεηξαπεπηίδην (ακηλνμέα ). Κάζε ππν-πεξηνρή πεξηέρεη επηά β θιψλνπο πνπ είλαη έηζη ηνπνζεηεκέλνη ψζηε ζρεκαηίδνπλ έλα ζάληνπηηο απφ δπν αληί-παξάιιειεο β- επηθάλεηεο. Ζ ακηλνηειηθή πεξηνρή (Ν-terminal) πεξηέρεη έμη θπζηεΐλεο πνπ ζρεκαηίδνπλ ηξεηο δηζνπιθηδηθνχο δεζκνχο κεηαμχ Cys 38-48, Cys 83-94, Cys θαη κηα ειεχζεξε θπζηείλε. Ο πξψηνο απφ απηνχο ηνπο δηζνπιθηδηθνχο δεζκνχο είλαη πνιχ ζεκαληηθφο γηα ηελ δέζκεπζε ησλ πξνζδεηψλ. Γεζκνί πδξνγφλνπ πνπ ππάξρνπλ κεηαμχ Arg 43- Glu 169, θαη κηα αιαηνχρα γέθπξα 41

43 κεηαμχ Arg 39- Asp 123 ζηαζεξνπνηνχλ αθφκε πεξηζζφηεξν ηνλ GHR. Δπηπιένλ, έρεη αλαγλσξηζηεί κηα δηαιπηή κνξθή ηνπ ππνδνρέα,ε νπνία νλνκάδεηαη GHBP- growth hormone binding protein. H GHBP είλαη παξφκνηα κε ηελ εμσθπηηαξηθή πεξηνρή ηνπ GHR θαη δηαθέξεη απφ είδνο ζε είδνο. ηνπο αλζξψπνπο, ε πην ζεκαληηθή θπθινθνξνχζα GHBP θαίλεηαη πσο παξάγεηαη απφ πξσηενιπηηθή ζράζε ηεο εμσθπηηάξηαο πεξηνρήο ηνπ ππνδνρέα. Ζ θσδηθνπνηνχζα θαη νη 3 -κε κεηαθξαζκέλεο πεξηνρέο ηνπ αλζξψπηλνπ GH-R είλαη θσδηθνπνηεκέλνη ζε ελληά εμφληα, αξηζκεκέλα απφ ην 2 κέρξη ην 10. Σν γνλίδην γηα ην αλζξψπηλν GH-R βξίζθεηαη ζην ρξσκφζσκα 5p13.1-p12, κε πάλσ απφ 8 kb. Σα εμφληα 3 κέρξη 7 θσδηθνπνηνχλ ηελ εμσθπηηαξηθή πεξηνρή δέζκεπζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. (37) ηνπο αλζξψπνπο έρνπλ βξεζεί δπν ηζφκνξθα ηνπ GH-R, κηα κνξθή πιήξνπο κήθνπο θαη κηα εμάιεηςε ηνπ εμνλίνπ 3 κε απψιεηα ελφο ηκήκαηνο 22 ακηλνμέσλ. Ο GH-R παξνπζηάδεη νκνινγία αιιεινπρίαο κε ηνλ ππνδνρέα πξνιαθηίλεο θαη κε ππνδνρείο γηα ηελ IL-2, -3, -4, -6, -7, φπσο επίζεο θαη κε ππνδνρείο γηα ηελ εξπζξνπξσηετλε θαη ηελ ηληεξθεξφλε. Ο GH-R είλαη κέινο ηεο ηάμεο 1 ηεο νηθνγέλεηαο ησλ αηκαηνπνηεηηθψλο θπηηαξνθηλψλ. Ο ππνδνρέαο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, αλ θαη δελ είλαη κέινο ηεο νηθνγέλεηαο ησλ ππνδνρέσλ κε θηλάζε ηπξνζίλεο, ρξεζηκνπνηεί ηνλ κεραληζκφ δξάζεο ηνπο. (88) Ζ εμέηαζε ηεο θξπζηαιιηθήο δνκήο ηνπ ζπκπιέγκαηνο GH-GHR απνθάιπςε πσο ην ζχκπιεγκα απνηειείηαη απφ έλα κφξην απμεηηθήο νξκφλεο πξνζδεκέλν ζε δπν κφξηα GHR, ππνδεηθλχνληαο αξρηθά πσο ε απμεηηθή νξκφλε πξνθαινχζε ηνλ δηκεξηζκφ ηνπ ππνδνρέα ζαλ αλαγθαίν βήκα γηα ηελ δξάζε ηεο. Χζηφζν κειέηεο πνπ έγηλαλ ζηελ ζπλέρεηα έδεημαλ πσο ν ππνδνρέαο κπνξεί λα δηκεξίδεηαη ηδηνζπζηαηηθά θαη πσο ε ελεξγνπνίεζε ηνπ ππνδνρέα αθνξά κηα πξνθαινχκελε απφ ηελ απμεηηθή νξκφλε κεηαβνιήο ηεο ζηεξενδνκήο ηνπ. (88) Δικόνα 23: Δηθόλα 23: Απεηθνλίδεη ηνλ ηξόπν πξόζδεζεο ηνπ κνξίνπ ζηνπο ππνδνρείο ηνπ θαη ην δηκεξηζκό ηνπ. 42

44 Μεηά ηελ πξφζδεζε ζηνλ ππνδνρέα ηεο, ε απμεηηθή νξκφλε δηεγείξεη ηεο θσζθνξπιίσζε κηαο πξσηεΐλεο κε έλα θαηλνκεληθφ κνξηαθφ βάξνο 120 kda. Αλ θαη αξρηθά ππνπηεπφκαζηαλ πσο ν ππνδνρέαο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο κπνξεί λα ήηαλ ηθαλφο γηα απηφ-θσζθνξπιίσζε, ζήκεξα είλαη πηα πξνθαλέο πσο ε δξαζηηθφηεηα ηεο θηλάζεο ηπξνζίλεο πνπ ζπλεξγάδεηαη κε ηνλ ππνδνρέα, πσο δελ είλαη δειαδή ε ίδηα ν ππνδνρέαο. Οη ππνδνρείο θπηηαξνθηλψλ δεζκεχνπλ κέιε ηεο νηθνγέλεηαο Janus ησλ θηλαζψλ ηπξνζίλεο (JAKs) κέζσ κηαο πεξηνρήο πινχζηαο ζε πξνιίλε (βιέπε εηθ.24). (88) Δικόνα 24: Δηθόλα 24: Σρεκαηηθή απεηθόληζε ηνπ δηκεξηζκέλνπ ππνδνρέα ηεο GH θαη ηελ ζέζε ησλ πξνζδεκέλσλ JAKs. Τπάξρνπλ ηέζζεξηο γλσζηνί JAKs, νη JAK1, JAK2, JAK3, θαη TYK2. Οξηζκέλνη ππνδνρείο δείρλνπλ κηα ηζρπξή πξνηίκεζε γηα έλα ζπγθεθξηκέλν JAK, άιινη ρξεηάδνληαη δπν δηαθνξεηηθνχο JAKs, θαη άιινη θαίλεηαη πσο ελεξγνπνηνχλ πνιιαπιά κέιε ηεο νηθνγέλεηαο ησλ JAKs. O JAK2 (Janus θηλάζε 2), έρεη αλαγλσξηζηεί ζαλ ε βαζηθή ηπξνζηληθή θηλάζε πνπ ζρεηίδεηαη κε ηνλ ππνδνρέα ηεο απμεηηθήο νξκφκεο. Απηφ ην έρνπλ ππνζηεξίμεη κειέηεο πνπ δείρλνπλ πσο ε απψιεηα ηεο ηθαλφηεηαο ηεο GHR λα δεζκεχεη ην JAK2 έρεη ζαλ απνηέιεζκα ηελ απψιεηα ηεο ζεκαηνδφηεζεο GHR πνπ πξνθαιεί ε απμεηηθή νξκφλε. (39,40) Ζ ελεξγνπνίεζε ηνπ JAK απαηηεί ηνλ νιηγνκεξηζκφ ηνπ ππνδνρέα, πξνθαλψο γηα λα έξζνπλ νη δπν ή πεξηζζφηεξνη JAKs αξθεηά θνληά ψζηε λα δηαθσζθνξπιηψζνπλ ν έλαο ηνλ άιιν ζηελ ελεξγνπνηνχζα ηπξνζίλε ζηελ πεξηνρή ηεο θηλάζεο. Γηα ηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ ππνδνρέα θαίλεηαη πσο ρξεηάδνληαη θαη ν δηκεξηζκφο ηνπ ππνδνρέα θαη ε νη πξνθαινχκελεο απφ ηνλ πξνζδέηε κεηαβνιέο ζηελ δηακφξθσζε ηνπ ππνδνρέα. Πηζηεχνπκε πσο ε δηα-θσζθνξπιίσζε πξνθαιεί κηα δηακνξθσηηθή αιιαγή ε νπνία εθζέηεη ην ΑΣΡ- ή ην ππφζηξσκα- ζέζε δέζκεπζεο, ή θαη ηηο δπν. Αθνχ ελεξγνπνηεζνχλ νη JAKs, θσζθνξπιηψλνπλ ηνπο εαπηνχο ηνπο θαη ηηο ζρεηηθέο ππνκνλάδεο ππνδνρέσλ ζε πνιιαπιέο ηπξνζίλεο. χκθσλα κε απηά, ε αλάθηεζε θαη/ ή ε ελεξγνπνίεζε ησλ κνξίσλ JAK2 απφ ηελ GH-R πξνσζεί ηελ 43

45 ελδπκαηηθή ηνπο δξαζηεξηφηεηα κέζσ δηα-θσζθνξπιίσζεο, θαη ζηελ ζπλέρεηα νη ελεξγέο θηλάζεο θσζθνξπιηψλνπλ ζεκαληηθέο ηπξνζίλεο ζην ελδνθπηηαξηθφ ηκήκα ηνπ ίδηνπ ηνπ GH-R, παξέρνληαο κε ηνλ ηξφπν απηφ ζέζεηο πξφζδεζεο γηα ζεκαληηθέο ελδηάκεζεο πξσηεΐλεο, φπσο είλαη νη STATs (signal transducers and activators of transcription). (88,40,41) Δικόνα 25: Δηθόλα 25: Τν ζεκαηνδνηηθό κνλνπάηη ηεο GH. Οη πξσηεΐλεο STAT είλαη κηα νηθνγέλεηα παξαγφλησλ κεηαγξαθήο, νη νπνίνη ζπδεπγλχνπλ ηελ δέζκεπζε πξνζδεηψλ κε κνξηαθνχο ππνδνρείο κε ηελ ελεξγνπνίεζε ηεο κεηαγξαθήο ηνπ γνληδίνπ. Έρνπλ αλαθεξζεί νη αθνινπζίεο επηά γνληδίσλ απφ ζειαζηηθά πνπ θσδηθνπνηνχλ κέιε ηεο νηθνγέλεηαο STAT. Ζ νηθνγέλεηα απηή πεξηέρεη πνιιά δηαηεξεκέλα εμειηθηηθά ραξαθηεξηζηηθά: (α) Γηαηεξνχληαη ηα 140 ακηλνμέα ηνπ ακηλνηειηθνχ άθξνπ (β) ηελ παξνπζία κηαο πεξηνρήο επαλάιεςεο πινχζηαο ζε ιεπθίλε, ε νπνία βξίζθεηαη πεξίπνπ 200 θαηάινηπα απφ ην Ν-άθξν (ε εμάιεηςε ηεο πεξηνρήο έρεη ζαλ απνηέιεζκα ηελ αδξαλνπνίεζε ησλ STAT) (γ) κηα πεξηνρή SH2 πνπ είλαη πνιχ ζεκαληηθή γηα ηελ δέζκεπζε ησλ θαηάινηπσλ ηπξνζίλεο πνπ έρεη ππνζηεί θσζθνξπιίσζε (δ) έλα θαηάινηπν ηπξνζίλεο πνπ βξίζθεηαη ζην θαξβνμπιηθφ άθξν, ην νπνίν είλαη ππφζηξσκα γηα ην JAK2,θαη (ε) κηα ζέζε θσζθνξπιίσζεο ζεξίλεο. (42) Έρεη βξεζεί πσο ε απμεηηθή νξκφλε κπνξεί λα ελεξγνπνηήζεη ηα STAT1, STAT3 θαη ηα δπν ηζφκνξθα ηνπ STAT5 ην STAT5a θαη ην STAT5b. Σν STAT1 είρε αξρηθά αλαγλσξηζηεί ζαλ έλαο παξάγνληαο κεηαγξαθήο κε επαγσγείο ηηο 44

46 ηληεξθεξφλεο, ην STAT3/ APRF είρε αλαγλσξηζηεί ζηελ ζεκαηνδφηεζε LIF, IL-6, θαη ην STAT5 θισλνπνηήζεθε αξρηθά ζαλ έλαο παξάγνληαο αληαπνθξηλφκελνο ζηελ πξνιαθηίλε, θαη είρε αξρηθά νλνκαζηεί ζαλ παξάγνληαο ηνπ καζηηθνχ αδέλα. Σα STATs δεζκεχνληαη, κέζσ ησλ πεξηνρψλ ηνπο SH2, ζε κηα ή πεξηζζφηεξεο ηπξνζίλεο πνπ έρνπλ ππνζηεί θσζθνξπιίσζε ζε ελεξγνπνηεκέλα ζπκπιέγκαηα ππνδνρέα- JAK2. Αθνχ δεζκεπηνχλ, ππφθεηληαη θαη απηνί ζε θσζθνξπιίσζε ηπξνζίλεο, κάιινλ απφ ηε ζπλδεδεκέλε κε ηνλ ππνδνρέα JAK2 ζηελ ζπληεξεκέλε ηπξνζίλε C-άθξνπ. ηελ ζπλέρεηα νη STATs απνζπψληαη απφ ηα ζπκπιέγκαηα ηνπ ππνδνρέα JAK2, νκνδηκεξίδνληαη ή εηεξνδηκεξίδνληαη κε άιιεο πξσηεΐλεο STAT, κεηαθηλνχληαη ζηνλ ππξήλα θαη πξνζδέλνληαη νη STAT1, STAT3 ζην c-sis-inducible ζηνηρείν ηνπ c-fosπξναγσγνχ/ εληζρπηή. (88,81,41,42) Παξνκνίσο, ε απμεηηθή νξκφλε πξνσζεί ηελ πξφζδεζε ηνπ STAT5 ζην GHαληαπνθξηλφκελν ζηνηρείν 2, ζηελ πεξηνρή ηνπ ππνθηλεηή ηνπ γνληδίνπ. Ζ ελεξγνπνίεζε ησλ δηαθφξσλ STATs απφ ηελ GH δηαθέξεη κεηαμχ ησλ ηζηψλ θαη ησλ θπηηαξηθψλ ζεηξψλ. Έρνπλ ραξηνγξαθεζεί νη πεξηνρέο ηνπ GHR πνπ απαηηνχληαη γηα ηελ ελεξγνπνίεζε ησλ δηαθνξεηηθψλ STATs. Οη STAT1, STAT3 θαη STAT5 ρξεηάδνληαη ην ηκήκα ηνπ GHR πνπ βξίζθεηαη θνληά ζηελ κεκβξάλε, θαη επνκέλσο ηελ ελεξγνπνίεζε ηεο JAK2 απφ ηελ GH γηα λα θσζθνξπιησζνχλ θαη λα ελεξγνπνηεζνχλ. Δπηπιένλ, ε ελεξγνπνίεζε ηνπ STAT5 απφ ηελ GH είλαη πνιχ πηζαλφ λα πξνθχπηεη ζαλ ζπλέπεηα ηεο δέζκεπζεο ηνπ STAT5 ζε πνιιαπιέο ζέζεηο δέζκεπζεο κέζα ζηνλ GHR, φπσο θσζθνξπιησκέλεο ηπξνζίλεο πνπ ππάξρνπλ θαη κέζα ζην θαξβνμπηειηθφ ήκηζπ θαη ζην ακηλνηειηθφ ήκηζπ ηεο θπηηαξνπιαζκαηηθήο πεξηνρήο ηνπ GHR. (40,42,43) Δικόνα 26: Δηθόλα 26: Σρεκαηηθή απεηθόληζε ηνπ ππνδνρέα ηεο απμεηηθήο νξκόλεο. 45

47 Ζ ππνηηζέκελε αθνινπζία ησλ βεκάησλ ηεο δξάζεο ηεο GH είλαη: 1. Γέζκεπζε ελφο κνξίνπ GH, ζηηο δπν ζπγθεθξηκέλεο ζέζεηο ηνπ δηκεξηζκέλν GH-R. 2. Αιιειεπίδξαζε ηνπ GH-R κε ηε JAK2. Φσζθνξπιίσζε ζε ηπξνζίλεο ησλ JAK2 θαη ζε βαζηθά θαηάινηπα ζην ελδνθπηηαξηθφ ηκήκα ηνπ GH-R, δίλνληαο κε ηνλ ηξφπν απηφ ζέζεηο πξφζδεζεο γηα άιινπο ξπζκηζηέο ηνπ ζήκαηνο. 3. Γέζκεπζε ησλ STATs ( δελ είλαη μεθάζαξν αλ θάπνηνο απφ ηνπο άιινπο STATs, ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ θαη ηνπ STAT5a, παίδνπλ θάπνην ξφιν ζηελ κεηαγξαθή ηνπ γνληδίνπ IGF-I ζηνπο αλζξψπνπο), ζε θαηάινηπα θσζθνξπιησκέλεο ηπξνζίλεο ζε ελεξγνπνηεκέλνπο ππνδνρείο. 4. Φσζθνξπιίσζε ησλ STATs. 5. Απνκάθξπλζε ηνπ θσζθνξπιησκέλνπ STAT απφ ηνλ GH-R. 6. Γηκεξηζκφο ηνπ STAT θαη είζνδνο κέζα ζηνλ ππξήλα. 7. Γέζκεπζε ζην DNA θαη έλαξμε ηεο κεηαγξαθήο γνληδίνπ. (81,40,41,44) Δικόνα 27: Δηθόλα 27: Λεπηνκεξήο απεηθόληζε ηνπ κεηαγσγηθνύ άμνλα ηνπ ζήκαηνο ηεο GH. 46

48 1.12 ΑΡΝΖΣΗΚΟΗ ΡΤΘΜΗΣΔ ΣΖ ΖΜΑΣΟΓΟΣΖΖ ΣΖ GH Ζ εμαξηψκελε απφ ηελ GH- θαη ηνλ JAK2 θσζθνξπιίσζε θαη ελεξγνπνίεζε έρνπλ απνδεηρζεί γηα πνιιά θπηηαξνπιαζκαηηθά κφξηα ζεκαηνδφηεζεο, ηα νπνία, κεηά ηνλ ζρεκαηηζκφ νκνδηκεξψλ ή εηεξνδηκεξψλ, κεηαθηλνχληαη κέζα ζηνλ ππξήλα, δεζκεχνπλ DNA, θαη ελεξγνπνηνχλ ηελ κεηαγξαθή. Όπσο ζπκβαίλεη θαη γηα ηελ πεξίπησζε ησλ ηπξνζηλψλ θηλαζψλ ηνπ ππνδνρέα, έηζη θαη εδψ αξθεηά βήκαηα έρνπλ ππνηεζεί πσο ιεηηνπξγνχλ ζαλ ζεκεία ηεξκαηηζκνχ ηνπ ζήκαηνο γηα ηελ ζεκαηνδφηεζε ηεο θπηηαξνθίλεο. Ζ ελδερφκελε αξλεηηθή ξχζκηζε ηεο πνξείαο απηήο πεξηιακβάλεη, γηα παξάδεηγκα,ηελ απνδφκεζε ηνπ ππνδνρέα,κέζσ κηαο πνξείαο πξσηενζψκαηνο/νπβηθνπηηίλεο, πξσηεΐλεο πνπ πξνζδέλνληαη ζε ζπγθεθξηκέλνπο STATs θαη ξπζκίδνπλ αξλεηηθά ηελ δξαζηεξηφηεηα ηνπο, φπσο είλαη νη αλαζηνιείο πξσηεΐλεο ησλ ελεξγνπνηεκέλσλ STATs (PIAS), θαη απνθσζθνξπιίσζε ησλ ηπξνζηλψλ ηνπ ππνδνρέα ή ηεο JAK γηα παξάδεηγκα, απφ κηα θσζθαηάζε ηπξνζίλεο πνπ δεζκεχεηαη ζε ζπκπιέγκαηα ηνπ GHR - JAK. Αλ θαη απηφ καο δίλεη κηα γεληθή εηθφλα, ζα πξέπεη λα αλαγλσξίζνπκε πσο ε εηθφλα απηή γίλεηαη νινέλα θαη πην πνιχπινθε. Θεσξνχκε πσο νη θαηαζηνιείο ησλ θπηηαξνθηλψλ ζεκαηνδφηεζεο (SOCSs), είλαη πνιχ ζεκαληηθνί φζνλ αθνξά ηνλ ηεξκαηηζκφ ή ηελ θαηαζηνιή ηεο πνξείαο ζεκαηνδφηεζεο ηεο θπηηαξνθίλεο. Οη πξσηεΐλεο SOCSs απνηεινχλ έλα εμαηξεηηθφ παξάδεηγκα ελφο αξλεηηθήο παιίλδξνκεο ξχζκηζεο. (45) Ζ νηθνγέλεηα ησλ SOCSs, ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ ηνπ εγγχηαηνπ πξψηκνπ γνληδίνπ CIS,απνηειείηαη απφ ηνπιάρηζηνλ νθηψ πξσηεΐλεο (SOCS-1 SOCS-7, CIS) κε παξφκνηεο δνκέο. Γεληθά ζπληίζεληαη ζε αληαπφθξηζε ζηηο θπηηαξνθίλεο. Οη πξσηεΐλεο απηέο πεξηέρνπλ κηα κεηαβιεηή πεξηνρή ζην ακηλνηειηθφ άθξν, κηα πεξηνρή SH2 ζε θεληξηθφ ζεκείν πνπ ξπζκίδεη ηελ δέζκεπζε ζε θσζθνηπξνζίλεο ζε πξσηεΐλεο ζηφρνπο, θαη κηα πεξηνρή νκνινγίαο ζην θαξβνμπηειηθφ άθξν, ε νπνία νλνκάδεηαη SOCS box. Οη πξσηεΐλεο SOCS κε ηελ ζεηξά ηνπο δεζκεχνληαη, κέζσ ηεο πεξηνρήο ηνπο SH2, ζε θσζθνξπιησκέλεο ηπξνζίλεο κέζα ζην ζχκπιεγκα ππνδνρέα θπηνθίλεο-jak, θαη αλαζηέιινπλ ηελ ζεκαηνδφηεζε ηεο θπηνθίλεο. (54,47,52) ε νξηζκέλεο πεξηπηψζεηο (γηα παξάδεηγκα, SOCS1), νη πξσηεΐλεο SOCS ζεσξνχληαη πσο δεζκεχνληαη ζε θσζθνηπξνζίλεο ζηελ πεξηνρή ηεο θηλάζεο ηνπ JAK,θαη αλαζηέιινπλ ηελ δξαζηεξηφηεηα ηεο θηλάζεο. ε άιιεο πεξηπηψζεηο (γηα παξάδεηγκα, SOCS3), νη πξσηεΐλεο απηέο δεζκεχνληαη ζε θσζθνξπιησκέλεο 47

49 ηπξνζίλεο ζηνλ ππνδνρέα θαη αλαζηέιινπλ ηελ δξαζηεξηφηεηα ηεο JAK. Σέινο, ζε άιιεο πεξηπηψζεηο, ε πξσηεΐλε CIS δεζκεχεηαη ζε θσζθνξπιησκέλεο ηπξνζίλεο ζηνλ ππνδνρέα θαη εκπνδίδεη ηελ δέζκεπζε θαη ηελ ελεξγνπνίεζε ησλ STAT. Οη πξσηεΐλεο SOCS κπνξνχλ επίζεο λα ζπληεζνχλ ζε αληαπφθξηζε ζε ππνδνρείο κε θπηηαξνθίλεο, ππνδεηθλχνληαο καο έηζη ηελ χπαξμε ελφο κεραληζκνχ κέζσ ηνπ νπνίνπ ε πξνεγνχκελε έθζεζε ζε έλαλ πξνζδέηε (νξκφλε) αλαζηέιιεη ζηε ζπλέρεηα ηελ αληαπφθξηζε ζε άιιν ππνθαηαζηάηε. Γηα παξάδεηγκα, νη πξσηεΐλεο SOCS έρνπλ εκπιαθεί ζηελ πνιχ θαιά γλσζηή ηθαλφηεηα ηεο ελδνηνμίλεο λα πξνθαιεί αληίζηαζε ζηελ GH.(46-51) Ζ έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ CIS ξπζκίδεηαη απφ ηνπο STAT5 θαη STAT3 θαη είλαη ζεκαληηθή γηα ηελ έθθξαζε ηεο SOCS-1, ζρεκαηίδνληαο έλα θιαζζηθφ feedback loop,ην νπνίν ξπζκίδεη ηελ κεηαγσγή ηνπ ζήκαηνο ησλ θπηηαξνθηλψλ. Έρεη βξεζεί πσο ε CIS δεζκεχεηαη ζηελ θσζθνξπιησκέλε ηπξνζίλε θαη ζηνπο ππνδνρείο IL-3, θαη εκπνδίδεη ηελ θσζθνξπιίσζε ηνπ STAT5 θαη ηηο κεηαγξαθηθέο αληαπνθξίζεηο πνπ εμαξηψληαη απφ ην STAT-5 πεξηθεξηθά, θαηαζηέιινληαο κε ηνλ ηξφπν απηφ ηνλ πνιιαπιαζηαζκφ ησλ αηκαηνπνηεηηθψλ θπηηάξσλ ζε αληαπφθξηζε ζηελ IL-3. Ζ έθθξαζε ηεο CIS mrna κπνξεί λα πξνθιεζεί ζε επαηηθά θχηηαξα ζε αληαπφθξηζε ζε κία εθθξηηηθή ψζε ηεο GH. Δπηπιένλ, νη SOCS-2 θαη CIS ξπζκίδνληαη θαη απηνί απφ ηελ GH, αλ θαη ζε κηθξφηεξν βαζκφ ζε ζρέζε κε ην SOCS-3, θαη κε δηαθνξεηηθή θηλεηηθή.(54,47,51,52,53) Οη πξσηεΐλεο SOCS/ CIS αλαζηέιινπλ ηελ πξνθαινχκελε απφ ηελ απμεηηθή νξκφλε θσζθνξπιίσζε ηνπ STAT5b ζε ηπξνζίλεο θαη ηελ εμαξηψκελε απφ ην STAT-5b κεηαγξαθή γνληδίνπ κέζσ ηξηψλ δηαθνξεηηθψλ κεραληζκψλ. Ζ αλαζηνιή απφ ηηο CIS θαη SOCS-2 ηεο ζεκαηνδφηεζεο GHR- JAK2 ζην STAT5 κπνξεί λα είλαη ην απνηέιεζκα ηνπ άκεζνπ αληαγσληζκνχ κεηαμχ ηνπ STAT5 θαη είηε ηνπ CIS ή ηεο SOCS-2 γηα ζέζεηο δέζκεπζεο θσζθνξπιησκέλεο ηπξνζίλεο ζηελ GHR. ηελ πεξίπησζε ησλ CIS θαη SOCS-2, φρη φκσο θαη γηα ηελ SOCS-3, ηα θαηάινηπα ηνπ GHR ήηαλ επαξθή γηα ηελ δέζκεπζε ησλ SOCS/ CIS ζηνλ ππνδνρέα. Ζ απμεηηθή νξκφλε δηεγείξεη ηελ θσζθνξπιίσζε ησλ δπν ηπξνζηλψλ κέζα ζηελ πεξηνρή απηή (hghr tyr 548, 609), νη νπνίεο παξέρνπλ ιεηηνπξγηθέο ζέζεηο πξφζδεζεο γηα ην STAT5.(55,53,49,52) Δλαιιαθηηθά, ε αλαζηνιή ηεο ζεκαηνδφηεζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο απφ ην CIS θαη ην SOCS-2 κπνξεί λα ζρεηίδεηαη κε ηελ νπβηθηηηληιίσζε ηεο πξσηεΐλεο SOCS/ CIS, πνπ αθνινπζείηαη απφ απνδφκεζε ηνπ ζπκπιέγκαηνο GHR-JAK2. Έρεη 48

50 αλαθεξζεί πσο ην SOCS box δεζκεχεη elongins Β θαη C (134). Έρεη δεηρζεί πσο ην ζχκπιεγκα απηφ δεζκεχεη elongin A γηα λα ζρεκαηίζεη έλα ελεξγφ ζχκπιεγκα κεηαγξαθηθήο επηκήθπλζεο. Οη ζέζεηο αιιειεπίδξαζεο ζηελ elongin A αιιειεπηδξνχλ κε ηελ elongin C θαη είλαη νκφινγεο κε ην ακηλνηειηθφ ήκηζπ ηνπ SOCS box, ππνδεηθλχνληαο έηζη πσο ε αξρηθή αιιειεπίδξαζε ζπκβαίλεη κεηαμχ ηνπ SOCS box θαη ηεο elongin C. Δίλαη πνιχ ελδηαθέξνλ ην φηη ε elongin B πεξηέρεη κηα αθνινπζία UBL ζην ακηλνηειηθφ άθξν ηεο, ππνδεηθλχνληαο καο έηζη έλα κνληέιν γηα ηελ δξάζε ησλ πξσηετλψλ SOCS. Καη αξρήλ, νη πεξηνρέο SH2 ησλ SOCS-1, SOCS- 3, ηνπιάρηζηνλ, ρξεηάδνληαη γηα ηελ αλαγλψξηζε θαη ηελ δέζκεπζε ζε ελεξγνπνηεκέλα JAKs. Απφ ηελ άιιε, ην SOCS box κεηαθέξεη ζην ζχκπιεγκα απηφ ησλ elongins B, C. Σν κνληέιν απηφ ππνδεηθλχεη πσο, είηε κέζσ άκεζσλ αιιειεπηδξάζεσλ ηεο πεξηνρήο elongin B UBL κε ην πξσηεφζσκα ή κέζσ ηεο πξνθαινχκελεο απφ Cullin-2 νπβηθηηηληιίσζεο ησλ ππνζηξσκάησλ, ε JAK2 θαη νη ζρεηηθέο πξσηεΐλεο SOCS κπνξεί λα θαηαζηξαθνχλ. (56,57,58,59) χκθσλα κε ην κνληέιν απηφ έρεη απνδεηρζεί πσο ην CIS αλαζηέιιεη ηελ ζεκαηνδφηεζε GHR- JAK2 κέζσ δχν κεραληζκψλ: Πξψηνλ, κέζν κηαο κεξηθήο αλαζηνιήο ε νπνία κεηψλεηαη ζηα απμεκέλα επίπεδα STAT5b, θαη ε νπνία κπνξεί λα ζρεηίδεηαη κε ηνλ αληαγσληζκφ κεηαμχ ησλ CIS, STAT5b γηα δέζκεπζε ζε θνηλέο θσζθνηπξνζίλεο ηνπ GHR. Γεχηεξνλ, έρεη δεηρζεί πσο ε απμεηηθή νξκφλε πξνθαιεί ππνβάζκηζε ηνπ CIS, φρη φκσο θαη ηνπ SOCS-3, θαη πσο ν πξσηενζσκαηηθφο αλαζηνιέαο MG132 εκπνδίδεη ηελ ππνβάζκηζε ηνπ CIS φπσο επίζεο θαη ηελ αλαζηαιηηθή ηνπ δξάζε ζηελ ζεκαηνδφηεζε ηνπ STAT5b, θαη, ηέινο, παίδεη έλαλ ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ εζσηεξίθεπζε ηνπ GHR. Σν CIS είλαη έλαο ζεκαληηθφο παξάγνληαο θαη κηα απαξαίηεηε πξνυπφζεζε γηα ηνλ ηεξκαηηζκφ ηεο ζεκαηνδφηεζεο ηνπ ππνδνρέα ηεο GH. Μπνξεί επνκέλσο λα ιεηηνπξγεί ζαλ κηα πξσηεΐλεπξνζαξκνζηήο, κέζσ ηνπ SOCS box ηνπ ελψ πξνζδέλεηαη ζηνλ GHR θσζθνξπιησκέλεο ηπξνζίλεο κέζσ ηεο SH2 πεξηνρήο ηνπ. Απηφ, κε ηελ ζεηξά ηνπ, νδεγεί ζηελ νπβηθηηηληιίσζε ηνπ GHR ζηελ θπηηαξηθή επηθάλεηα, εηζάγνληαο έλα ζήκα δηαινγήο γηα ηελ εζσηεξίθεπζε ηνπ ππνδνρέα, ηελ ελδνθπηηαξηθή θπθινθνξία θαη ηελ απνδφκεζε ηνπ. (56-59) 49

51 Δικόνα 28: Δηθόλα 28: Τν ζύζηεκα απνδόκεζεο δηακέζνπ CIS-νπβπηθνπηηίλεο. Ζ εμαξηψκελε απφ ην πξσηεφζσκα απνδφκεζε ηνπ CIS, πηζαλφηαηα κε ηελ κνξθή ελφο ζπκπιέγκαηνο ( GHR-JAK2) - CIS, ζεσξείηαη επνκέλσο ζαλ έλα ζεκαληηθφ βήκα ηνπ εμαξηψκελνπ απφ ηνλ ρξφλν κεραληζκνχ αλαζηνιήο CIS. Ζ αλαζηνιή ηεο ζεκαηνδφηεζεο GHR-JAK2 ζε STAT5b πνπ βιέπνπκε ζηα θχηηαξα πνπ έρνπλ ππνζηεί ζεξαπεία κε απμεηηθή νξκφλε, κπνξεί ίζσο λα απνηξαπεί κέζσ κηαο ζεξαπείαο κε δηαθνξεηηθνχο αλαζηνιείο πξσηενζψκαηνο, ππνδεηθλχνληαο έηζη πσο νη πξσηεΐλεο SOCS απνηεινχλ ηνπο βαζηθνχο ξπζκηζηέο ηεο αληαπφθξηζεο απεπαηζζεηνπνίεζεο θπηηαξνθίλεο- JAK- STAT πνπ παξαηεξνχκε ζε θχηηαξα θαη ηζηνχο πνπ έρνπλ εθηεζεί ζε δηαθνξεηηθέο θπηηαξνθίλεο. (58,59) Δικόνα 29: Δηθόλα 29: Σρεκαηηθή απεηθόληζε ησλ δύν ζπζηεκάησλ νπβνπηθνπηηηληιίσζεο. 50

52 1.13 ΑΛΛΔ ΠΟΡΔΗΔ ΜΔΣΑΓΧΓΖ ΖΜΑΣΟ ΠΟΤ ΔΝΔΡΓΟΠΟΗΟΤΝΣΑΗ ΑΠΟ ΣΖΝ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ: ε πνιιέο πεξηπηψζεηο, νη ππνδνρείο ελεξγνπνηνχλ δηαθνξεηηθέο νδνχο ζεκαηνδφηεζεο. Ζ ζηξαηεγηθή ηεο ρξήζεο ζπλδπαζκψλ απφ νδνχο δίλεη έλαλ ζεκαληηθφ κεραληζκφ γηα ηελ παξαγσγή εηδηθψλ θπηηαξηθψλ αληαπνθξίζεσλ. Έρεη αλαγλσξηζηεί έλαο αξηζκφο απφ πξσηεΐλεο ζεκαηνδφηεζεο θαη νδνχο ζεκαηνδφηεζεο πνπ ελεξγνπνηνχληαη απφ ηελ απμεηηθή νξκφλε, ζπκπεξηιακβαλνκέλεο ηεο νδνχο ησλ ΜΑΡΚ θαη ηεο νδνχ ΡΗ3Κ (θσζθαηηδπιηλνζηηφιε 3 θηλάζε)(δηθ.27). Ο Bertics αιιά θαη άιινη επηζηήκνλεο έρνπλ δείμεη πσο ε απμεηηθή νξκφλε πξνάγεη ηελ θσζθνξπιίσζε ζε ηπξνζίλεο θαη ηελ ελεξγνπνίεζε ησλ θηλαζψλ ΜΑΡ. Ζ απμεηηθή νξκφλε ελεξγνπνηεί ηηο θηλάζεο ΜΑΡΚ κέζσ δπν νδψλ. Ζ πξψηε ζρεηίδεηαη κε ηελ θηλάζε ΡΗ-3 θαη ε δεχηεξε κε ηελ πνξεία Grb2/she/Ras/Raf/MEK/MAPK. Ζ νδφο Ras/ Map θηλάζεο έρεη εκπιαθεί ζηελ ξχζκηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο θ ηνπ γνληδίνπ fos κέζσ παξαγφλησλ ηνπ ζπκπιέγκαηνο ternary (TCF), νη νπνίνη ιεηηνπξγνχλ ζε ζπλεξγαζία κε ηνλ παξάγνληα SRF. Έρεη δεηρζεί πσο ε ζεκαηνδφηεζε ηνπ GH-R πξνθαιεί ηελ θσζθνξπιίσζε ηπξνζίλεο άιισλ ελδνθπηηαξηθψλ πξσηετλψλ ζεκαηνδφηεζεο, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ θαη ησλ IRS-1 θαη Shc, πνπ ζρεηίδνληαη κε ηελ ξ85 ππνκνλάδα ηεο ΡΗ 3-θηλάζεο θαη ηηο Grb-2, αληίζηνηρα. Δηδηθφηεξα, ε θσζθνξπιίσζε ηεο ηπξνζίλεο ησλ πξσηετλψλ IRS απφ ηνλ JAK2 δίλεη κηα ζέζε πξφζδεζεο γηα ηελ πεξηνρή SH2 ηεο ξπζκηζηηθήο ππνκνλάδαο 85kDA ηεο θσζθαηηδπινηλνζηηφιεο (ΡΗ) 3 θηλάζεο. Χζηφζν, ε αλαζηνιή ηεο ΡΗ 3-θηλάζεο εκπνδίδεη ηε ζχλζεζε ιηπηδίσλ πνπ πξνθαιεί ε απμεηηθή νξκφλε θαη ηελ αληί-ιηπνιπηηθή δξάζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, ππνδεηθλχνληαο πσο ε δξαζηεξηφηεηα ηεο ΡΗ3-θηλάζεο είλαη ζεκαληηθή γηα ηελ φκνηα κε ηεο ηλζνπιίλεο δξάζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Δπηπιένλ, άιιεο έξεπλεο δείρλνπλ πσο ε απμεηηθή νξκφλε κπνξεί επίζεο λα ιεηηνπξγεί κέζσ ηεο δξάζεο ηεο θηλάζεο ζεξίλεο/ ζξενλίλεο, PKC. Έλα άιιν ραξαθηεξηζηηθφ ησλ νδψλ κεηαγσγήο ζήκαηνο είλαη ην ελδερφκελν γηα δηαζπλνκηιίεο (crosstalking), φπνπ ε κηα νδφο κπνξεί λα ελεξγνπνηεί ή λα αλαζηέιιεη κηα άιιε νδφ θαη λα πξνθχπηνπλ δηαθνξεηηθέο αληαπνθξίζεηο. Δπεηδή νη απμεηηθνί παξάγνληεο πξνθαινχλ κηα πνηθηιία απφ θπηηαξηθέο αληαπνθξίζεηο, ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ θαη ηνπ πνιιαπιαζηαζκνχ, ππάξρεη κεγάιν ελδηαθέξνλ 51

53 ζρεηηθά κε ηελ ιεπηνκεξή πεξηγξαθή ησλ νδψλ πνπ ξπζκίδνπλ ηηο αληαπνθξίζεηο ησλ απμεηηθψλ παξαγφλησλ. (60-64) 1.14 Ζ ΓΗΑΤΝΟΜΗΛΗΑ (CROSSTALKING) ΣΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ ΜΔ ΣΟΝ EGF. Ζ δέζκεπζε ηνπ πξνζδέηε ζηνλ ππνδνρέα ηνπ επηδεξκηθνχ απμεηηθνχ παξάγνληα έρεη ζαλ απνηέιεζκα ηελ ελεξγνπνίεζε ηεο ελδνθπηηάξηαο θηλάζεο ηεο ηπξνζίλεο ηνπ ππνδνρέα θαη ηελ απηνθσζθνξπιίσζε ηνπ ππνδνρέα. ηελ ζπλέρεηα ζηηο ζέζεηο απηνθσζθνξπιίσζεο πξνζδέλνληαη άιιεο πξσηεΐλεο πνπ ζπκκεηέρνπλ ζηε κεηαγσγή ηνπ ζήκαηνο ζην εζσηεξηθφ ηνπ θπηηάξνπ. Δίλαη γλσζηφ πσο ε δέζκεπζε πξνζδεηψλ (ligands) ζηνλ GHR έρεη κεηαβνιηθά απνηειέζκαηα φκνηα κε ηεο ηλζνπιίλεο. Ο Yamauchi, ζε κηα εθηεηακέλε αλάιπζε, ρξεζηκνπνηψληαο πνληίθηα κε έιιεηςε ζην ππφζηξσκα-1 ηνπ ππνδνρέα ηλζνπιίλεο (IRS-1), έδεημε πσο ε θσζθνξπιίσζε ηπξνζίλεο ηνπ IRS-1, πνπ είλαη ην βαζηθφ ππφζηξσκα ηεο θηλάζεο ηπξνζίλεο ηνπ ππνδνρέα ηλζνπιίλεο, παίδεη έλα πνιχ ζεκαληηθφ ξφιν ζηα βηνινγηθά απνηειέζκαηα ηεο ηλζνπιίλεο, ζπκπεξηιακβαλνκέλεο θαη ηεο δηέγεξζεο ηνπ κεηαβνιηζκνχ ηεο γιπθφδεο. Έδεημε επίζεο πσο νη ιεηηνπξγίεο ηνπ IRS-1 ππνθαζίζηαληαη απφ ηελ θσζθνξπιίσζε ζε ηπξνζίλεο ηνπ IRS-2 ζηα πνληίθηα κε έιιεηςε IRS-1. Με άιια ιφγηα, έδεημε πσο ν IRS-2 κπνξεί λα παίμεη έλαλ ζεκαληηθφ ξφιν φζνλ αθνξά ηηο δξάζεηο ηεο ηλζνπιίλεο, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ θαη ησλ επηδξάζεσλ ηεο ζηνλ κεηαβνιηζκφ ηεο γιπθφδεο. Σελ ίδηα πεξίπνπ ρξνληθή πεξίνδν ππήξμαλ αλαθνξέο ζηελ βηβιηνγξαθία ζρεηηθά κε έλα εχξεκα πνπ ζρεηηδφηαλ κε ηελ πξφθιεζε κεηαβνιηθψλ δξάζεσλ φκνησλ κε ηεο ηλζνπιίλεο απφ ηελ απμεηηθή νξκφλε. Αλαθέξζεθε πσο ν IRS-1 ππφθεηληαη ζε θσζθνξπιίσζε ζε ηπξνζίλεο αληαπνθξηλφκελνο ζηελ GH ζε θαιιηέξγεηο θπηηάξσλ. Σφηε ν Yamauchi πξνζπάζεζε λα θαζνξίζεη αλ ν IRS-2 ππφθεηηαη ζε θσζθνξπιίσζε ζε ηπξνζίλεο κε εξέζηζκα ηελ απμεηηθή νξκφλε, θαη αλ ν IRS-1 ή ν IRS-2 παίδνπλ έλαλ πην ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ νδφ κεηαγσγήο ηνπ ζήκαηνο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζην ήπαξ, πνπ είλαη έλα θπζηνινγηθφ φξγαλν- ζηφρνο γηα ηελ απμεηηθή νξκφλε. Παξαηήξεζε πσο ν IRS-1 παίδεη πνιχ πην ζεκαληηθφ ξφιν ζε ζρέζε κε ηνλ IRS-2 ζηελ πξνθαινχκελε απφ ηελ απμεηηθή νξκφλε ελεξγνπνίεζε ηεο θηλάζεο ηξηθσζθνξηθήο ηλνζηηφιεο, ε νπνία ζεσξείηαη ζεκαληηθή γηα ηελ έθθξαζε ησλ κεηαβνιηθψλ δξάζεσλ ηεο ηλζνπιίλεο. 52

54 Χζηφζν πξνθαινχζε εληχπσζε πσο ε πξσηεΐλε πνπ είρε ππνζηεί θσζθνξπιίσζε ζε ηπξνζίλεο ζηηο κειέηεο απηέο βξηζθφηαλ ζε κηα ζέζε 10 kda ςειφηεξα ζε ζρέζε κε ηνλ IRS-1, ήηαλ πεξίπνπ ζηελ ίδηα ζέζε κε ηελ δψλε IRS-2, θαη πσο δελ δεζκεπφηαλ ζηελ ξ85 ΡΗ 3-θηλάζε. Τπέζεζε πσο ε πξσηεΐλε δελ ήηαλ νχηε ν IRS-1, νχηε ν IRS-2. Ζ πξσηεΐλε θαηλφηαλ πσο ήηαλ ζεκαληηθή φρη κφλν εμαηηίαο ηνπ επηπέδνπ ηεο θσζθνξπιίσζεο ζε ηπξνζίλεο, αιιά επίζεο γηαηί ελεξγνπνηεί ηελ θηλάζε ΜΑΡ ζε πνιχ κεγαιχηεξε έθηαζε ζε ζχγθξηζε κε ηελ ΡΗ 3-θηλάζε, θαη γηαηί ε πξσηεΐλε δεζκεπφηαλ θαιά ζηελ Grb2, πνπ ζεσξείηαη πνιχ ζεκαληηθή ζηελ ελεξγνπνίεζε ηεο θηλάζεο ΜΑΡ. Δπηπιένλ, ν Yamauchi ζηελ κειέηε ηνπ θαζάξηζε ηελ πξσηεΐλε. Ζ πξσηεΐλε ραξαθηεξίζηεθε ζαλ κηα κεκβξαληθή πξσηεΐλε 180-kD κεκβξάλεο, πνπ δεζκεπφηαλ ζηελ Grb2 αιιά φρη ζηελ ξ85 ΡΗ 3-θηλάζε. ηελ ζπλέρεηα ν Yamauchi ππέζεζε πσο ε πξσηεΐλε κπνξεί λα ήηαλ ν ππνδνρέαο ηνπ επηδεξκηθνχ απμεηηθνχ παξάγνληα (EGF) (EGFR), πνπ αθζνλεί ζην ήπαξ. Όπσο πεξίκελε, ε πξσηεΐλε απνξξνθήζεθε πιήξσο απφ κηα ζηήιε κε θαζεισκέλν αληηζψκα έλαληη ηνπ EGFR. O Yamauchi παξαηήξεζε πσο ν EGFR ππφθεηηαη ζε θσζθνξπιίσζε ηπξνζίλεο θαη πσο δεζκεπφηαλ ζηελ Grb2 κε έλαλ ηξφπν πνπ εμαξηηφηαλ απφ ηνλ ρξφλν θαη ηελ ζπγθέληξσζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Οη αλαθαιχςεηο αθνινχζεζαλ ε κηα κεηά ηελ άιιε. Αλαγλσξίζηεθε κηα πεξηνρή φπνπ ν EGFR ππφθεηλην ζε θσζθνξπιίσζε ζε ηπξνζίλεο ζε αληαπφθξηζε ζηελ απμεηηθή νξκφλε. Ζ JAK2 θσζθνξπιηψλεη ζε ηπξνζίλεο ηνλ EGFR αλεμάξηεηα απφ ηελ ελδνγελή δξαζηεξηφηεηα ηεο ηπξνζηληθήο θηλάζεο ηνπ EGFR. ηελ ζπλέρεηα, ν EGFR ιεηηνπξγψληαο ζαλ πξσηεΐλε πξφζδεζεο, παξέρεη κηα ζέζε δέζκεπζεο ζηελ Grb2 θαη επνκέλσο παίδεη έλαλ ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ πξφθιεζε ησλ βηνινγηθψλ απνηειεζκάησλ φπσο είλαη ε ελεξγνπνίεζε ηεο ΜΑΡ θηλάζεο θαη ε έθθξαζε ηεο c- fos. Απηφ θαίλεηαη πσο είλαη κηα θαηλνχξηα δηαζπλνκηιία κεηαμχ ηεο ππέξνηθνγέλεηαο ηνπ ππνδνρέα ησλ θπηηαξνθηλψλ θαη ηεο νδνχ κεηαγσγήο ηνπ ζήκαηνο ηνπ επηδεξκηθνχ απμεηηθνχ παξάγνληα, φπνπ ν ππνδνρέαο GHR ή θάπνην άιιν κέινο ηεο ππέξ-νηθνγέλεηαο ππνδνρέα θπηηαξνθίλεο ελεξγνπνηεί κηα ηπξνζηληθή θηλάζε (JAK, Src, θ.ιπ.), επηηξέπνληαο ηνπ έηζη λα ππνβάιιεη ζε θσζθνξπιίσζε ηπξνζίλεο ηνλ ππνδνρέα ηνπ επηδεξκηθφ απμεηηθνχ παξάγνληα (EGFR, θ.ιπ.), πνπ κπνξεί ζαλ απνηέιεζκα λα ιεηηνπξγήζεη ζαλ πξσηεΐλε δέζκεπζεο. (Discovery of novel cross-talk between the cytokine receptor superfamily and the growth factor receptor signal transduction pathway) (65,66,67) 53

55 Γηα λα ζπλνςίζνπκε, ε ελεξγνπνίεζε ησλ STATs ζπκβαίλεη φηαλ θαηάινηπα ηπξνζίλεο ππφθεηληαη ζε θσζθνξπιίσζε απφ ηελ θηλάζε Janus (JAK) πνπ πξνθαιεί ηνλ δηκεξηζκφ ησλ STATs. ηελ ζπλέρεηα ηα δηκεξή κεηαηνπίδνληαη ζηνλ ππξήλα, φπνπ ελεξγνπνηνχλ ηελ κεηαγξαθή ησλ γνληδίσλ. Χζηφζν, ε ελεξγνπνίεζε ησλ STATs κπνξεί λα ζπκβεί αλεμάξηεηα απφ ηηο JAKs, γηα παξάδεηγκα, ξπζκηδφκελε άκεζα απφ ηελ δξαζηεξηφηεηα ηεο θηλάζεο ηνπ EGFR. Ζ κείσζε ηνπ EGFR νδεγεί ζε απψιεηα ηεο ελεξγνπνίεζεο ησλ STAT, θαη έρεη αλαγλσξηζηεί πσο εηδηθέο ζέζεηο δέζκεπζεο γηα ηα STAT1 θαη STAT3 ζηελ θπηηαξνπιαζκαηηθή πεξηνρή ηνπ EGFR επηηξέπνπλ ηελ ζεηηθή θαη ηελ αξλεηηθή ξχζκηζε ηεο δξαζηεξηφηεηαο ησλ STATs (65-67) Ο EGF ΚΑΗ Ζ ΠΟΡΔΗΑ ΜΔΣΑΓΧΓΖ ΣΟΤ ΖΜΑΣΟ ΣΟΤ: Ο επηδεξκηθφο απμεηηθφο παξάγνληαο (EGF) παίδεη έλαλ ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ ξχζκηζε ηεο θπηηαξηθήο αλάπηπμεο, ζηνλ πνιιαπιαζηαζκφ θαη ηελ δηαθνξνπνίεζε ησλ θπηηάξσλ. Ο αλζξψπηλνο EGF είλαη κηα πξσηεΐλε 6045-Da, κε 53 θαηάινηπα ακηλνμέσλ θαη ηξεηο ελδνκνξηαθνχο δηζνπιθηδηθνχο δεζκνχο. Ο EGF δξα δεζκεπφκελνο κε πςειή ζπγγέλεηα ζηνλ EGFR ζηελ θπηηαξηθή επηθάλεηα θαη δηεγείξνληαο ηελ ελδνθπηηάξηα δξαζηεξηφηεηα ηεο πξσηετληθήο-ηπξνζηληθήο θηλάζεο ηνπ ππνδνρέα. (68) Ο ππνδνρέαο ηνπ επηδεξκηθνχ απμεηηθνχ παξάγνληα (EGFR, ErbB-1. HER 1 ζηνπο αλζξψπνπο) απνηειεί ηνλ ππνδνρέα ηεο θπηηαξηθήο επηθάλεηαο γηα ηα κέιε ηεο νηθνγέλεηαο EGF. Ο EGFR είλαη κέινο ηεο νηθνγέλεηαο ππνδνρέσλ ErbB, κηαο ππφ-νηθνγέλεηαο ηεζζάξσλ ππνδνρέσλ κε ηδηφηεηεο θηλάζεο ηπξνζίλεο πνπ ζπλδένληαη ζηελά: EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB2), Her 3 (ErbB-3), Her 4 (ErbB-4). Μεηαιιάμεηο πνπ επεξεάδνπλ ηελ έθθξαζε ή ηελ δξαζηεξηφηεηα ηνπ EGFR κπνξεί λα πξνθαιέζνπλ θαξθίλν. O EGFR ππάξρεη ζηελ θπηηαξηθή επηθάλεηα θαη ελεξγνπνηείηαη δεζκεπφκελνο ζηα εηδηθά ππνζηξψκαηα ηνπ. Με ηελ ελεξγνπνίεζε, ν EGFR ππφθεηηαη ζε κεηαβνιή απφ αλελεξγφ κνλνκεξέο ζε έλα ελεξγφ νκνδηκεξέο. Ο δηκεξηζκφο ηνπ ελεξγνπνηεί ηελ ελδνθπηηάξηα δξαζηεξηφηεηα ηεο θηλάζεο ηεο ηπξνζίλεο ηνπ ππνδνρέα. αλ απνηέιεζκα ζπκβαίλεη απηνθσζθνξπιίσζε αξθεηψλ θαηαινίπσλ ηπξνζίλεο (Τ) ζηελ θαξβνμπηειηθή πεξηνρή ηνπ EGFR. (68) 54

56 Δικόνα 30: Δηθόλα 30: Αλαπαξάζηαζε ηεο δνκήο ηνπ ππνδνρέα ηνπ EGF. Ζ απηνθσζθνξπιίσζε πξνθαιεί ηελ ελεξγνπνίεζε ελφο θαηαξάθηε ζεκαηνδφηεζεο άιισλ πξσηεΐλσλ κέζσ θσζθνξπιίσζεο ζε ηπξνζίλεο κεηά ηελ πξφζδεζε ηνπ EGFR ζε πεξηνρέο SH2. Απηέο νη πξσηεΐλεο ελεξγνπνηνχλ δηάθνξεο νδνχο κεηαγσγήο ηνπ ζήκαηνο, θπξίσο ηηο νδνχο ΜΑΡΚ, Akt, JNK, νδεγψληαο ζηελ ζχλζεζε DNA θαη ζε θπηηαξηθφ πνιιαπιαζηαζκφ. Ζ ελεξγνπνίεζε ησλ πξσηετλψλ απηψλ επάγεη ηελ κεηαλάζηεπζε θπηηάξσλ, ηελ θπηηαξηθή πξνζθφιιεζε θαη ηνλ θπηηαξηθφ πνιιαπιαζηαζκφ. Δπίζεο, ε πεξηνρή ηεο θηλάζεο ηνπ EGFR κπνξεί λα δηαθσζθνξπιηψζεη θαηάινηπα ηπξνζίλεο άιισλ ππνδνρέσλ κε ηνπο νπνίνπο ζπζζσκαηψλεηαη, θαη κπνξεί θαη ε ίδηα λα ελεξγνπνηεζεί θαη κε ηνλ ηξφπν απηφ. (69,68) Δικόνα 31: Δηθόλα 31: Τν ζεκαηνδνηηθό κνλνπάηη ηνπ EGF. 55

57 1.16 ΣΔΡΟΔΗΓΖ ΣΟΤ ΦΤΛΟΤ ΚΑΗ ΡΤΘΜΗΖ ΣΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ: Σα ζηεροειδή ηοσ θύλοσ, είλαη ζηεξνεηδείο νξκφλεο πνπ αιιειεπηδξνχλ κε ηνπο ππνδνρείο αλδξνγφλσλ ή νηζηξνγφλσλ ζηα ζπνλδπισηά. Οη δπν βαζηθέο θαηεγνξίεο ζηεξνεηδψλ ηνπ θχινπ είλαη ηα αλδξνγφλα θαη ηα νηζηξνγφλα, ηα ζεκαληηθφηεξα κέιε ησλ νπνίσλ γηα ηνπο αλζξψπνπο είλαη ε ηεζηνζηεξφλε θαη ε νηζηξαδηφιε, αληίζηνηρα. Γεληθά, ηα αλδξνγφλα ζεσξνχληαη νξκφλεο ηνπ αλδξηθνχ θχινπ, επεηδή πξνθαινχλ αξξελνπνηήζε, ελψ ηα νηζηξνγφλα ζεσξνχληαη νξκφλεο ηνπ γπλαηθείνπ θχινπ. Καη νη δπν ηχπνη σζηφζν ππάξρνπλ θαη ζηα δπν θχια, ζε δηαθνξεηηθά φκσο επίπεδα. Σα νηζηξνγφλα έρνπλ νλνκαζηεί έηζη ιφγσ ηεο ζεκαζίαο ηνπο ζηνλ θχθιν ηνπ νίζηξνπ, θαη ιεηηνπξγνχλ ζαλ ε βαζηθή νξκφλε ηνπ γπλαηθείνπ θχινπ. Όπσο φιεο νη ζηεξνεηδείο νξκφλεο, έηζη θαη ηα νηζηξνγφλα δηαρένληαη εχθνια κέζα απφ ηελ θπηηαξηθή κεκβξάλε. Μέζα ζην θχηηαξν, αιιειεπηδξνχλ κε ηνπο νηζηξνγνληθνχο ππνδνρείο. Σα ηξία βαζηθά θπζηθά νηζηξνγφλα ζηηο γπλαίθεο είλαη ε νηζηξαδηφι, ε νηζηξφλε θαη ε νηζηξηφιε. ην ζψκα απηά παξάγνληαη απφ αλδξνγφλα κέζσ ελδπκηθψλ δξάζεσλ. (70) Ζ ζχλζεζε ησλ νηζηξνγφλσλ μεθηλά ζηα θχηηαξα ηεο έζσ ζήθεο ησλ σνζεθψλ, κε ηελ ζχλζεζε ηεο αλδξνζηεληδηφλεο απφ ηελ ρνιεζηεξφιε. Ζ αλδξνζηεληδηφλε είλαη αζζελέο αλδξνγφλν, δηαρέεηαη κέζσ ηεο βαζηθήο κεκβξάλεο ζηα πεξηβάιινληα θνθθηψδε θχηηαξα, φπνπ κεηαηξέπεηαη ζε νηζηξφλε ή ζε νηζηξαδηφιε, είηε άκεζα είηε κέζσ ηεο ηεζηνζηεξφλεο. Ζ κεηαηξνπή ηεο ηεζηνζηεξφλεο ζε νηζηξαδηφιε, θαη ηεο αλδξνζηεληδηφλεο ζε νηζηξφλε, θαηαιχεηαη απφ ην έλδπκν αξσκαηάζε. Ζ αξσκαηάζε είλαη έλα έλδπκν ηνπ θπηνρξψκαηνο Ρ450 (CYP19), ην νπνίν πξνάγεη ηελ κεηαηξνπή ησλ αλδξνγφλσλ (C19) ζε νηζηξνγφλα (C18). Βξίζθεηαη ζην ρξσκφζσκα 15 θαη εθθξάδεηαη ζε δηάθνξνπο ηζηνχο, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ ησλ θπηηάξσλ ηνπ σρξνχ ζσκαηίνπ, ησλ θνθθησδψλ θπηηάξσλ, ησλ θπηηάξσλ sertolli θαη θπηηάξσλ leydig ζηνπο φξρεηο. Δπίζεο εθθξάδεηαη ζηνλ εγθέθαιν, ζηα ιηπνθχηηαξα, ζηνπο κχεο, ζηνπο ζχιαθεο ησλ ηξηρψλ θαη ζηα νζηά. Ζ παξαγσγή ηεο αξσκαηάζεο εληνπίδεηαη ηνπηθά ζε δηάθνξα ζεκεία ηνπ νξγαληζκνχ θαη ε θαηάζηαζε απηή δηθαηνινγεί ηελ χπαξμε πςειψλ ζπγθεληξψζεσλ νηζηξνγφλσλ ζε ζπγθεθξηκέλεο πεξηνρέο φπσο είλαη ν καδηθφο αδέλαο, ζε ζχγθξηζε κε ηα επίπεδα πνπ βξίζθνληαη ζηνλ νξφ. (71) Αλ θαη ηα νηζηξνγφλα είλαη παξφληα θαη ζηνπο άλδξεο θαη ζηηο γπλαίθεο, σζηφζν ζπλήζσο είλαη 56

58 παξφληα ζε ζεκαληηθά πςειφηεξα επίπεδα ζηηο γπλαίθεο ηεο αλαπαξαγσγηθήο ειηθίαο. Πξνάγνπλ ηελ αλάπηπμε ησλ δεπηεξεπφλησλ ραξαθηεξηζηηθψλ ηνπ θχινπ ζηηο γπλαίθεο. ηνπο άλδξεο ην νηζηξνγφλν ξπζκίδεη νξηζκέλεο ιεηηνπξγίεο ηνπ αλαπαξαγσγηθνχ ζπζηήκαηνο. Δπηπιένλ, ππάξρνπλ θαη αξθεηέο άιιεο δνκηθέο κεηαβνιέο πνπ πξνθαινχλ ηα νηζηξνγφλα, αιιά θαη άιιεο ιεηηνπξγίεο ηνπο. (70) 1.17 β-oησραγηολζ Ζ νηζηξαδηφιε (17β- νηζηξαδηφιε) ζεσξείηαη ιαλζαζκέλα ζαλ ε γπλαηθεία νξκφλε, αθνχ ππάξρεη φκσο θαη ζηνπο άλδξεο. Αληηπξνζσπεχεη ην βαζηθφ νηζηξνγφλν ζηνπο αλζξψπνπο. Ζ νηζηξαδηφιε φρη κφλν έρεη ζεκαληηθφηαηε επίδξαζε ζηελ αλαπαξαγσγηθή θαη ζεμνπαιηθή ιεηηνπξγία, αιιά επεξεάδεη επίζεο θαη άιια φξγαλα, ζπκπεξηιακβαλνκέλεο θαη ηε δνκή ησλ νζηψλ. (70,72) Σα άηνκα ρσξίο νηζηξαδηφιε (ή άιια νηζηξνγφλα), ζα γίλνπλ ςειά θαη επλνπρνεηδή, θαζψο ν επηθπζηαθφο ηεξκαηηζκφο θαζπζηεξεί ή κπνξεί θαη λα κελ ζπκβεί θαζφινπ. Δπεξεάδεηαη επίζεο ε δνκή ησλ νζηψλ, έρνληαο ζαλ απνηέιεζκα πξψηκε νζηενπελία θαη νζηενπφξσζε. Δπίζεο, νη γπλαίθεο κεηά ηελ εκκελφπαπζε βηψλνπλ κηα επηηαρπλφκελε απψιεηα νζηηθήο κάδαο, ιφγσ κηαο ζρεηηθήο αλεπάξθεηαο ζε νηζηξνγφλα. Αλ θαη ηα αλδξνγφλα θαη ηα νηζηξνγφλα δελ ζπκβάιινπλ ζεκαληηθά ζηελ θπζηνινγηθή αλάπηπμε πξηλ ηελ εθεβεία, ε εθεβηθή αχμεζε ησλ επηπέδσλ ησλ γνλαδηθψλ ζηεξνεηδψλ απνηειεί έλα ζεκαληηθφ παξάγνληα ηεο επηηάρπλζεο ηεο εθεβηθήο αλάπηπμεο. (72,73) Καηαζηάζεηο κε ππεξέθθξηζε αλδξνγφλσλ ή νηζηξνγφλσλ πξηλ ην θιείζηκν ησλ επηθχζεσλ πξνθαινχλ γξήγνξε γξακκηθή αλάπηπμε θαη ζθειεηηθή σξίκαλζε. Δπνκέλσο, φπσο αθξηβψο ε κείσζε ηεο ηαρχηεηαο ηεο αλάπηπμεο απαηηεί αμηνιφγεζε, έηζη θαη ε επηηάρπλζε ηεο αλάπηπμεο κπνξεί λα είλαη εμίζνπ παζνινγηθή θαη λα απνηειεί κηα έλδεημε πξφσξεο εθεβείαο ή ππεξπιαζίαο ησλ επηλεθξηδίσλ. Παηδηά κε αλεπάξθεηα απμεηηθήο νξκφλεο δελ έρνπλ κηα θπζηνινγηθή αληαπφθξηζε νχηε ζηα ελδνγελή νχηε ζηα εμσγελή αλδξνγφλα. Σα ζηεξνεηδή ιεηηνπξγνχλ, ελ κέξεη, απμάλνληαο ηελ έθθξηζε απμεηηθήο νξκφλεο θαη δηεγείξνληαο άκεζα ηελ παξαγσγή ηνπ IGF-I, φπσο θαίλεηαη απφ ηελ αχμεζε ησλ επηπέδσλ ηνπ IGF-I θαηά ηελ εθεβηθή αηρκή ηεο αλάπηπμεο ζηα παηδηά κε παζνινγηθφ ππνδνρέα ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Καη ηα αλδξνγφλα θαη ηα νηζηξνγφλα απμάλνπλ ηελ ζθειεηηθή σξίκαλζε. Δίλαη πηζαλφ ηα αλδξνγφλα λα δξνπλ 57

59 κε ηνλ ηξφπν απηφ κεηά ηελ κεηαηξνπή ηνπο ζε νηζηξνγφλα απφ ηελ αξσκαηάζε ζε εμψ-αδεληθνχο ηζηνχο, είλαη φκσο πηζαλφ λα έρνπλ θαη αλεμάξηεηε δξάζε. Ζ απνπζία ιεηηνπξγηθνχ ππνδνρέα νηζηξνγφλσλ ζε έλαλ άλδξα ζρεηίζηεθε κε ςειφ αλάζηεκα θαη αλνηθηέο νζηηθέο επηθχζεηο, θαη παξφκνηα επξήκαηα ππάξρνπλ ζε αζζελείο κε κεηαιιάμεηο ηνπ γνληδίνπ πνπ θσδηθνπνηεί ην έλδπκν αξσκαηάζε. Δπίζεο, νη γπλαίθεο κε έλαλ ππνδνρέα νηζηξνγφλνπ έρνπλ απμεκέλν χςνο, ελψ νη πνιπκνξθηζκνί ηνπ ππνδνρέα νηζηξνγφλνπ, φρη φκσο θαη ηα επίπεδα νηζηξαδηφιεο νξνχ, ζρεηίδνληαη κε ηελ ππθλφηεηα ησλ νζηψλ θαη ην χςνο ζηνπο άλδξεο. Ζ ζθειεηηθή αλάπηπμε, φζνλ αθνξά ηελ αχμεζε ηεο νζηηθήο κάδαο, απνηειεί έλα ζεκαληηθφ θαηλφκελν ηεο εθεβείαο θαη ξπζκίδεηαη ζε κεγάιν βαζκφ απφ ηελ δξάζε ησλ νηζηξνγφλσλ. Παξαθνινχζεζεζηνλ ρξφλν ηεο ελαπφζεζεο ηνπ αζβεζηίνπ ζηα νζηά βξήθε πσο πεξίπνπ ην 26% ηνπ αζβεζηίνπ ελειίθσλ ελαπνηίζεηαη θαηά ηελ δηάξθεηα ησλ δπν εθεβηθψλ ρξφλσλ κέγηζηεο αλάπηπμεο. Πάλσ απφ ην 90% ηεο ζθειεηηθήο κάδαο έρεη απνθηεζεί ήδε ζηελ ειηθία ησλ 18 εηψλ, θαη ηα νηζηξνγφλα θαίλεηαη πσο ξπζκίδνπλ ηελ ρξνληθή ζηηγκή ηεο αλαπηπμηαθήο αηρκήο, ηελ ζηαζεξνπνίεζε ηεο αλαθαηαζθεπήο ησλ νζηψλ, θαη ηελ ελδνζηηθή απφζεζε κεηαιιηθψλ αιάησλ. (72) Ο Rubin έρεη πεξηγξάςεη έλα ζρήκα βάζεη ηνπ νπνίνπ ε αξρή θαη ε κέζε ηεο εθεβείαο απνηεινχλ ηηο ρξνληθέο πεξηφδνπο γξακκηθήο αλάπηπμεο θαη απμεκέλεο ελαπφζεζεο κεηαιιηθψλ αιάησλ ζηα νζηά. Μηα αληαλάθιαζε ηεο νζηηθήο αλάπηπμεο, πνπ πηζαλφ λα ξπζκίδεηαη ζε κεγάιν βαζκφ απφ ηελ ζπλεξγία GΖ- IGF-Ηνηζηξνγφλνπ. Φαίλεηαη πσο νη άλδξεο ζηελ εθεβεία έρνπλ πην δπλαηά νζηά απφ ηηο γπλαίθεο, ίζσο ιφγσ ηεο κεγαιχηεξεο απφζεζεο νζηνχ ζηελ πεξηνζηηθή επηθάλεηα ζε αληίζεζε κε ηελ απμεκέλε απφζεζε νζηνχ ζηελ ελδνθινζηηθή επηθάλεηα ζηηο γπλαίθεο. Σα ηέιε ηεο εθεβείαο ραξαθηεξίδνληαη απφ ηελ νζηηθή σξίκαλζε (επηθπζηαθή ζχγθιηζε) θαη ηελ απμεκέλε ππθλφηεηα (ε πξαγκαηηθή νζηηθή ππθλφηεηα κεηάιισλ ε νπνία δελ βαζίδεηαη ζην κέγεζνο), πνπ ξπζκίδνληαη απφ ην νηζηξνγφλν. (72) Ζ θαζπζηεξεκέλε εθεβεία θαη ε θαζπζηεξεκέλε εκκελαξρή θαίλεηαη πσο απνηεινχλ παξάγνληεο θηλδχλνπ γηα νζηενπελία, ππάξρνπλ σζηφζν θάπνηα δεδνκέλα πνπ δείρλνπλ πσο ε κηθξή νζηηθή κάδα ίζσο λα ππάξρεη ήδε απφ ηελ πξν-εθεβεία ζηα άηνκα απηά. Αλεμάξηεηα θαη ζπλεξγηζηηθά απνηειέζκαηα ησλ ζηεξνεηδψλ, ηεο απμεηηθήο νξκφλεο θαη ηνπ IGF-I ζπκβάιινπλ επίζεο ζηελ επίηεπμε ηεο κέγηζηεο νζηηθήο κάδαο ζηνπο ελήιηθεο. (72) 58

60 1.18 ΠΟΡΔΗΑ ΜΔΣΑΓΧΓΖ ΖΜΑΣΟ ΣΧΝ ΟΗΣΡΟΓΟΝΧΝ: Οη βηνινγηθέο δξάζεηο ησλ νηζηξνγφλσλ εθθξάδνληαη κέζσ ησλ ππνδνρέσλ ησλ νηζηξνγφλσλ (ER) α θαη β, πνπ απνηεινχλ κέιε κηαο κεγάιεο ππέξ-νηθνγέλεηαο ππξεληθψλ ππνδνρέσλ. Οη ππνδνρείο απηνί δξνπλ ζαλ παξάγνληεο κεηαγξαθήο πνπ ελεξγνπνηνχληαη απφ πξνζδέηεο. Ο θιαζζηθφο κεραληζκφο ηεο δξάζεο ησλ ER μεθηλά κε ηελ δέζκεπζε ηνπ νηζηξνγφλνπ ζε ππνδνρείο ζηνλ ππξήλα, κεηά απφ ηελ νπνία νη ππνδνρείο δηκεξίδνληαη θαη πξνζδέλνληαη ζε εηδηθέο αθνινπζίεο βάζεσλ γλσζηέο ζαλ αθνινπζίεο αληαπφθξηζεο ζηα νηζηξνγφλα (EREs), πνπ βξίζθνληαη ζηνπο ππνθηλεηέο ησλ γνληδίσλ ζηφρσλ. Ζ δέζκεπζε ηεο νξκφλεο πξνθαιεί επίζεο κηα αιιαγή ηεο ζηεξενδνκεο ηεο πεξηνρήο δέζκεπζεο ηνπ πξνζδέηε ησλ ππνδνρέσλ, θαη απηή ε αιιαγή ζηελ δνκή επηηξέπεη ηελ ζχλδεζε κε πξσηεηλεο ζπλελεξγνπνηεηέο. Έρνπλ σζηφζν αξρίζεη λα γίλνληαη γλσζηέο ελδείμεηο γηα νδνχο ζεκαηνδφηεζεο πνπ απνθιίλνπλ απφ απηφ ην θιαζζηθφ κνληέιν, θαη έηζη ζήκεξα γίλεηαη πηα απνδεθηφ πσο νη ER κπνξνχλ λα ξπζκίζνπλ ηελ γνληδηαθή έθθξαζε κέζσ ελφο αξηζκνχ απφ δηαθνξεηηθνχο κεραληζκνχο. Πεξίπνπ ην έλα ηξίην ησλ γνληδίσλ ζηνπο αλζξψπνπο πνπ ξπζκίδνληαη απφ ηνπο ER δελ πεξηέρεη αθνινπζίεο πνπ κνηάδνπλ κε ηα EREs (estrogen response elements). (73-75) Οη κνξηαθνί κεραληζκνί κέζσ ησλ νπνίσλ νη ERs ξπζκίδνπλ ηελ κεηαγξαθή κέζσ ζηνηρείσλ ελαιιαθηηθήο αληαπφθξηζεο δελ έρνπλ αθφκε γίλεη πιήξσο θαηαλνεηνί, ε πξφνδνο φκσο ζηνλ ηνκέα απηφ είλαη ζπλερήο. Οη ERs κπνξνχλ λα ξπζκίζνπλ ηελ γνληδηαθή έθθξαζε ρσξίο λα δεζκεπηνχλ άκεζα ζην DNA επεξεάδνληαο ηελ ιεηηνπξγία άιισλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ κέζσ αιιειεπηδξάζεσλ πξσηεΐλεο- πξσηεΐλεο ζηνλ ππξήλα. Ζ αιιειεπίδξαζε ησλ ERs κε ην ζχκπιεγκα ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα πξσηεΐλεο ελεξγνπνηεηή-1 (ΑΡ-1) απνηειεί έλα ηππηθφ παξάδεηγκα απηψλ ησλ γνληδηαθψλ δξάζεσλ πνπ είλαη αλεμάξηεηεο απφ ηα ERE. Δπηπιένλ, έλαο αξηζκφο απφ γνλίδηα πνπ αληαπνθξίλνληαη ζηα νηζηξνγφλα, ηα νπνία δελ έρνπλ ERE πεξηέρνπλ εκί-ζέζεηο ERE ή ζέζεηο δέζκεπζεο γηα ηνλ νξθαλφ ππξεληθφ νξκνληθφ ππνδνρέα SF-1 (SFRE), πνπ ιεηηνπξγνχλ ζαλ άκεζεο ζέζεηο δέζκεπζεο ER. Ο ERa, φρη φκσο θαη ν ERb, είλαη ηθαλφο λα δεζκεπηεί ζηα SFRE. Σα νηζηξνγφλα αζθνχλ θάπνηεο απφ ηηο δξάζεηο ηνπο κέζσ ηεο δξάζεο ησλ ERs ζηελ γνληδηαθή έθθξαζε, έλαο άιινο φκσο αξηζκφο δξάζεσλ ησλ νηζηξνγφλσλ 59

61 είλαη ηφζν πνιχ γξήγνξνο ψζηε δελ κπνξεί λα εμαξηάηαη απφ ηελ κεηαγξαθή ηνπ RNA θαη ηελ ζχλζεζε πξσηετλψλ. Οη δξάζεηο απηέο είλαη γλσζηέο ζαλ κε-γελσκηθέο δξάζεηο θαη πηζηεχεηαη πσο ξπζκίδνληαη κέζσ ησλ ζρεηηθψλ κε ηελ κεκβξάλε ER. Οη δξάζεηο ζρεηίδνληαη ζπρλά κε ηελ εθξεθηηθή αχμεζε ηεο πξσηετληθήο θηλάζεο. Μπνξεί σζηφζν νη κε-γελσκηθέο δξάζεηο ησλ νηζηξνγφλσλ λα επεξεάδνπλ έκκεζα ηελ γνληδηαθή έθθξαζε, κέζσ ηεο ελεξγνπνίεζεο ησλ νδψλ κεηαγσγήο ζήκαηνο πνπ δξνπλ ηειηθά ζηνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο -ζηφρνπο. (73-75) Οη ιεηηνπξγίεο πνιιψλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ θαη ηνπ ΑΡ-1, ξπζκίδνληαη κέζσ θσζθνξπιίσζεο πνπ ξπζκίδεηαη απφ ηελ πξσηετληθή θηλάζε, θαη επνκέλσο νη παξάγνληεο απηνί κπνξεί λα απνηεινχλ ζηφρνπο ησλ κεγελσκηθψλ δξάζεσλ ησλ νηζηξνγφλσλ. Απηή ε νδφο ζεκαηνδφηεζεο κπνξεί λα νλνκαζηεί κε-γελσκηθή- πξνο- γελσκηθή νδφ. Πξνβιέπεη έλαλ κεραληζκφ, μερσξηζηφ απφ ηηο αιιειεπηδξάζεηο πξσηεΐλεο- πξσηεΐλεο ζηνλ ππξήλα, κέζσ ηνπ νπνίνπ νη ERs κπνξνχλ λα ηξνπνπνηήζνπλ ηηο ιεηηνπξγίεο ησλ παξαγφλησλ κεηαγξαθήο, θαη επνκέλσο λα ξπζκίζνπλ ηελ έθθξαζε ησλ γνληδίσλ πνπ δελ πεξηέρνπλ ERE. (73-75) Ζ δηεζλήο βηβιηνγξαθία ππνζηεξίδεη φηη νη ERs κπνξνχλ λα ξπζκίζνπλ ηελ κεηαγξαθή ρσξίο λα δεζκεπηνχλ άκεζα ζην DNA. ηηο πεξηπηψζεηο απηέο νη ππνδνρείο πξνζδέλνληαη κέζσ αιιειεπηδξάζεσλ πξσηεΐλεο-πξσηεΐλεο ζε έλα ζχκπιεγκα παξάγνληα κεηαγξαθήο πνπ έξρεηαη ζε επαθή κε ην DNA, φπσο απεηθνλίδεηαη θαη ζηελ εηθφλα 32. Οη ERs ξπζκίδνπλ κε ηνλ κεραληζκφ απηφ ηελ έθθξαζε ελφο κεγάινπ αξηζκνχ γνληδίσλ πνπ αληαπνθξίλνληαη ζηα νηζηξνγφλα,ηα νπνία δελ πεξηέρνπλ ERE. Ο κεραληζκφο ρξεζηκνπνηείηαη ζπλήζσο απφ κέιε ηεο ππέξ-νηθνγέλεηαο ηνπ ππξεληθνχ ππνδνρέα θαη ζπρλά αλαθεξφκαζηε ζε απηφλ ζαλ κεηαγξαθηθή δηαζπλνκηιία. 60

62 Δικόνα 32: Τπάξρνπλ αξθεηά γνλίδηα ηα νπνία ελεξγνπνηνχληαη απφ ηελ 17β-νηζηξαδηφιε κέζσ ηεο αιιειεπίδξαζεο κε ηνπο ER κε πξσηεΐλεο Fos, Jun ζε ζέζεηο δέζκεπζεο ΑΡ-1. ηα γνλίδηα απηά ζπκπεξηιακβάλνληαη απηά γηα ηελ σ-αιβνπκίλε, IGF-I, θνιιαγελάζε θαη θπθιίλε D1. Δπίζεο, ηα ER ξπζκίδνπλ γνλίδηα, φπσο είλαη ην γνλίδην β-θαδεΐλε ηα νπνία πεξηέρνπλ ζέζεηο δέζκεπζεο γηα ην STAT5, ηα απνηειέζκαηα φκσο ηεο αιιειεπίδξαζεο ησλ ER κε ηνλ παξάγνληα κεηαγξαθήο STAT5 είλαη αληηθαηηθφ. Οξηζκέλνη ζπγγξαθείο έρνπλ πξνηείλεη πσο ε εμαξηψκελε απφ ηνλ STAT5 κεηαγξαθή θαηαζηέιιεηαη απφ ER πνπ ελεξγνπνηνχληαη απφ ηελ 17β-νηζηξαδηφιε, θαη πσο απηή ε θαηαζηνιή απαηηεί κηα αλέπαθε πεξηνρή ER AF-2. Άιινη ζπγγξαθείο πάιη έρνπλ πξνηείλεη πσο ε κεηαγξαθηθή δξαζηεξηφηεηα ηνπ STAT5 απμάλεηαη απφ ηνπο ER κε έλαλ ηξφπν ν νπνίνο δελ εμαξηάηαη απφ ηελ πεξηνρή ER AF-2. Πιεζαίλνπλ νη ελδείμεηο πσο ηα νηζηξνγφλα αζθνχλ κεγνληδησκαηηθέο δξάζεηο- δξάζεηο νη νπνίεο είλαη ππεξβνιηθά γξήγνξεο θαη δελ κπνξνχλ λα εμεγεζνχλ απφ ηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ RNA θαη ηελ ζχλζεζε πξσηετλψλ. Οη κε -γνληδησκαηηθέο δξάζεηο είλαη θνηλή ηδηφηεηα ησλ ζηεξνεηδψλ νξκνλψλ θαη ζπρλά ζρεηίδνληαη κε ηελ ελεξγνπνίεζε δηαθφξσλ νδψλ ζεκαηνδφηεζεο πξσηεηληθψλ -θηλάζψλ. (73-75) ηηο κε-γνληδησκαηηθέο δξάζεηο ηεο 17β-νηζηξαδηφιεο πνπ έρνπλ αλαθεξζεί ζπκπεξηιακβάλνληαη ε θηλεηνπνίεζε ηνπ ελδνθπηηάξηνπ αζβεζηίνπ, ε δηέγεξζε ηεο δξαζηεξηφηεηαο ηεο αδελπιηθήο θπθιάζεο θαη ε παξαγσγή camp. Ζ ελεξγνπνίεζε ηεο πνξείαο ζεκαηνδφηεζεο ηεο ΜΑΡΚ απφ ηελ 17β-νηζηξαδηφιε έρεη κειεηεζεί εθηεηακέλα ζε δηάθνξνπο ηχπνπο θπηηάξσλ, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ ησλ θπηηάξσλ ηνπ θαξθίλνπ ηνπ καζηνχ, ησλ ελδνζειηαθψλ, ησλ νζηψλ, θαη ησλ θπηηάξσλ ηνπ 61

63 λεπξνβιαζηψκαηνο. Δπίζεο, ε 17β-νηζηξαδηφιε ελεξγνπνηεί ηελ πνξεία ζεκαηνδφηεζεο ηεο θηλάζεο ηεο ηξηθσζθνξηθήο ηλνζηηφιεο (ΡΗ3-θηλάζεο) ζηα θχηηαξα ηνπ ελδνζειηαθνχ, ηνπ θαξθίλνπ ηνπ καζηνχ θαη ηνπ ήπαηνο. Άιιεο ιεηηνπξγηθέο πεξηνρέο ησλ ππνδνρέσλ κπνξεί λα ζπκβάιινπλ ζην κέγεζνο ησλ δξάζεσλ απηψλ ζπκκεηέρνληαο ζε δηάθνξεο αιιειεπηδξάζεηο πξσηεΐλεο-πξσηεΐλεο Δίλαη πνιχ πηζαλφ ε αιιειεπίδξαζε ησλ ER κε δηάθνξα κφξηα ζεκαηνδφηεζεο ή πξσηεΐλεο πξφζδεζεο πνπ αιιειεπηδξνχλ κε άιιεο πξσηεΐλεο θαη λα δηεπθνιχλεηαη κε απηφ ηνλ ηξφπν ε δξαζηεξηφηεηα ηνπο. Οη ERs ζηελ θπηηαξνπιαζκαηηθή κεκβξάλε ζρεηίδνληαη κε ηελ πξσηεΐλε (ηθξίσκα) θαβενιίλε-1, θαη κε κηα ζεηξά απφ κφξηα ζεκαηνδφηεζεο, φπσο νη πξσηεΐλεο G, Src θηλάζε θαη ras, ηελ ξ85α ξπζκηζηηθή ππνκνλάδα ηεο θηλάζεο ΡΗ3 θαη Shc. Δπηπιένλ, ε πξσηεΐλε scaffold MNAR πξνσζεί ηελ αιιειεπίδξαζε κε ηνλ ERa,ελεξγνπνηεκέλε απφ ηελ 17β-νηζηξαδηφιε, έρνληαο ζαλ απνηέιεζκα κηα αχμεζε ηεο δξαζηεξηφηεηαο ηεο Src θηλάζεο. (73-75) Ο ERa ελεξγνπνηεκέλνο απφ ηελ 17β-νηζηξαδηφιε, αιιειεπηδξά άκεζα κε ηνλ ππνδνρέα IGF-I, θαη ελεξγνπνηεί έηζη ηελ πνξεία ζεκαηνδφηεζεο ησλ ΜΑΡΚ. Δπίζεο, ν ERa αιιειεπηδξά άκεζα κε ηελ ErbB2 (HER-2/neu). Δπηπιένλ, ν ER a ελεξγνπνηεκέλνο απφ ηελ 17β-νηζηξαδηφιε ελεξγνπνηεί ηνλ ππνδνρέα ηνπ επηδεξκηθνχ απμεηηθνχ παξάγνληα (EGF) κέζσ ελφο κεραληζκνχ πνπ ζρεηίδεηαη κε ηελ ελεξγνπνίεζε ησλ πξσηετλψλ G, ηελ Src θηλάζε, νδεγψληαο ζε κηα αχμεζε ηεο δξαζηεξηφηεηαο ησλ ΜΑΡΚ, Akt (πξσηετληθή θηλάζε Β). ηελ ζπλέρεηα, νδνί κεηαγσγήο ηνπ ζήκαηνο κπνξεί λα ζπλδένπλ ηηο κε-γνληδησκαηηθέο δξάζεηο ησλ νηζηξνγφλσλ κε γνληδησκαηηθέο αληαπνθξίζεηο. Ο ηχπνο απηφο κε γνληδησκαηηθήο-ζεγνληδηνκαηηθή ζεκαηνδφηεζε απνηειεί έλαλ δηαθξηηφ κεραληζκφ κέζσ ηνπ νπνίνπ νη ER κπνξνχλ λα ξπζκίδνπλ ηελ κεηαγξαθή ζηνηρείσλ ελαιιαθηηθήο αληαπφθξηζεο. Ο κεραληζκφο απηφο ιεηηνπξγεί καδί κε ηηο ERE- αλεμάξηεηεο δξάζεηο πνπ πεξηγξάςακε πην πάλσ θαη αθνξνχλ ηηο αιιειεπηδξάζεηο πξσηεΐλεο-πξσηεΐλεο ζηνλ ππξήλα. Ζ θσζθνξπιίσζε ζε ηπξνζίλεο ησλ παξαγφλησλ κεηαγξαθήο ηεο νηθνγέλεηαο STAT είλαη απαξαίηεηε γηα ηελ ππξεληθή ηνπο κεηαηφπηζε θαη ηελ δξαζηεξηφηεηα δέζκεπζεο ζην DNA. Έρεη πξνηαζεί πσο ε θσζθνξπιίσζε ζεξίλεο δηακνξθψλεη ηελ κέγηζηε κεηαγξαθηθή δξαζηεξηφηεηα ησλ STATs. Έρεη αλαθεξζεί πσο ε θσζθνξπιίσζε ηνπ ελδνγελνχο STAT3 θαη STAT5 ζε θαηάινηπα ηπξνζίλεο θαη ζεξίλεο πξνθαιείηαη απφ ηελ 17β-νηζηξαδηφιε ζε ελδνζειηαθά θχηηαξα, θαη πσο ε εμαξηψκελε απφ ηνπο STATs κεηαγξαθή, κέζσ ελφο κεραληζκνχ ν νπνίνο εμαξηάηαη απφ ηνπο ERs θαη απαηηεί αλέπαθεο δξαζηεξηφηεηεο ησλ ΜΑΡΚ, ηεο ΡΗ3 62

64 θηλάζεο θαη θηλάζεο ηνπ Src, ελεξγνπνηείηαη απφ ηελ 17β-νηζηξαδηφιε. Οη παξαηεξήζεηο απηέο έξρνληαη ζε αληίζεζε κε κηα πξνεγνχκελε κειέηε,ε νπνία έδεημε πσο ε θσζθνξπιίσζε ζε ηπξνζίλεο θαη ε δέζκεπζε ζην DNA ηνπ ππέξεθθξαζκέλνπ STAT5 κεηψλεηαη απφ ηνπο ERs ζηα θχηηαξα COS-1, κε ή ρσξίο ηελ παξνπζία ηεο 17β-νηζηξαδηφιεο. Οη δηαθνξέο απηέο πνπ ππάξρνπλ ζηηο δηάθνξεο κειέηεο κπνξνχλ λα εμεγεζνχλ απφ ηηο δηαθνξέο ζηηο πεηξακαηηθέο ζπλζήθεο, φπσο είλαη ε ρξήζε δηαθφξσλ ηχπσλ θπηηάξσλ θαη ε αλάιπζε ελδνγελψλ ή ππέξεθθξαζκέλσλ πξσηετλψλ. (73-75) Δίλαη ζεκαληηθφ λα ζεκεηψζνπκε εδψ πσο νη ERa θαη ERb απνηεινχλ επίζεο ζηφρνπο θσζθνξπιίσζεο απφ ηελ νδφ ζεκαηνδφηεζεο ησλ ΜΑΡΚ. Δπνκέλσο, νη κε δξάζεηο ησλ νηζηξνγφλσλ κπνξεί λα ηξνπνπνηνχλ ηηο ιεηηνπξγίεο ησλ ER, θαη λα απμάλνπλ κε ηνλ ηξφπν απηφ ηνλ θιαζζηθφ κεραληζκφ δξάζεο ησλ ER. Δπηπιένλ, ε θσζθνξπιίσζε ηνπ ζπλ-ελεξγνπνηεηή-3 ησλ ππνδνρέσλ ζηεξνεηδψλ πξνθαιείηαη απφ ηελ 17β-νηζηξαδηφιε, νδεγψληαο ζε απμεκέλε κεηαγξαθηθή δξαζηηθφηεηα ησλ ER. Όηαλ δελ ππάξρνπλ νηζηξνγφλα, άιιεο νδνί ζεκαηνδφηεζεο, φπσο είλαη νη νδνί ζεκαηνδφηεζεο ηνπ IGF-1 θαη ηνπ EGF, κπνξνχλ λα ηξνπνπνηήζνπλ ηηο ιεηηνπξγίεο ησλ ER κέζσ θσζθνξπιίσζεο ησλ ππνδνρέσλ ζε νξηζκέλα θαηάινηπα, φπσο απεηθνλίδεηαη ζην ζρήκα 1. (73-75) Δικόνα 33: Δηθόλα 33: Τα δηάθνξα κνλνπάηηα ζεκαηνδόηεζεο πνύ ελεξγνπνηνύληαη κέζσ ησλ ERs. 63

65 Δίλαη πξνθαλέο πσο ε ξχζκηζε ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο απφ ηνπο ER γίλεηαη κέζσ πνιιψλ παξαγφλησλ, θαη αθνξά θαη δξάζεηο, νη νπνίεο ζπρλά ζπγθιίλνπλ ζε νξηζκέλα ζηνηρεία αληαπφθξηζεο πνπ βξίζθνληαη ζηνπο πξναγσγνχο ησλ γνληδίσλ - ζηφρσλ. Χζηφζν, νη ηειηθέο γνληδηαθέο αληαπνθξίζεηο κπνξεί λα εμαξηψληαη απφ δηάθνξεο ζπλζήθεο, φπσο είλαη ν ζπλδπαζκφο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ είλαη δεζκεπκέλνη ζε έλαλ ζπγθεθξηκέλν γνληδηαθφ πξναγσγφ, ε θπηηαξηθή ζέζε ησλ ER, ηα επίπεδα έθθξαζεο ησλ δηαθφξσλ ξπζκηζηηθψλ πξσηετλψλ θαη ησλ ζηνηρείσλ κεηαγσγήο ηνπ ζήκαηνο, θαη ηέινο απφ ηελ θχζε ησλ έμσ-θπηηάξησλ εξεζηζκάησλ. Οη κεηαβιεηέο απηέο είλαη ηδηαίηεξα ζπγθεθξηκέλεο γηα θάζε θπηηαξηθφ ηχπν. Έηζη ηα νηζηξνγφλα κπνξεί λα ρξεζηκνπνηνχλ δηαθνξεηηθέο νδνχο ζεκαηνδφηεζεο αλάινγα κε ην θπηηαξηθφ ηνπο πεξηβάιινλ, θαη κε ηνλ ηξφπν απηφ λα πξνθαινχλ δηαθνξεηηθέο γνληδηαθέο απνθξίζεηο ζε δηαθνξεηηθνχο ηχπνπο θπηηάξσλ-ζηφρσλ, φπσο απεηθνλίδεηαη ζηελ εηθφλα 33. (73-75) Δικόνα 34: 1.19 ΘΔΡΑΠΔΗΑ ΜΔ hgh (ανθπώπινη ζςνθεηική αςξηηική οπμόνη) Ζ αλεπάξθεηα ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζεξαπεχεηαη κε ηελ ρνξήγεζε εμσγελνχο GH. Ζ GH πνπ ζπληαγνγξαθείηαη είλαη αλζξψπηλε ζπλζεηηθή απμεηηθή νξκφλε, ε νπνία θαηαζθεπάδεηαη κε ηελ ηερλνινγία ηνπ αλαζπλδπαζκέλνπ DNA. Δπεηδή ε GH είλαη έλα κεγάιν πξσηετληθφ κφξην, πξέπεη λα ρνξεγεζεί. Όηαλ έλα άηνκν έρεη κηα καθξφρξνλε αλεπάξθεηα απμεηηθήο νξκφλεο, ηα νθέιε ηεο ζεξαπείαο είλαη ζπρλά πξνθαλή, θαη νη παξελέξγεηεο ηεο ζεξαπείαο είλαη ζπάληεο. Έλα παηδί κε αλεπάξθεηα GH, φηαλ ππνβάιιεηαη ζε ζεξαπεία κε απμεηηθή νξκφλε, κεγαιψλεη γξεγνξφηεξα κέζα ζε κήλεο. Μπνξνχλ λα παξαηεξεζνχλ θαη άιια νθέιε, φπσο είλαη ε απμεκέλε κπτθή ηζρχο, ε πξφνδνο ζηελ θηλεηηθή αλάπηπμε θαη ε κείσζε ηνπ 64

66 ζσκαηηθνχ ιίπνπο. Οη παξελέξγεηεο ηεο θπζηνινγηθήο ππνθαηάζηαζεο είλαη πνιχ ζπάληεο. Πην θάησ ζα αλαιχζνπκε ηνπο πηζαλνχο θηλδχλνπο θαη ηα δηάθνξα δεηήκαηα γηα ηα νπνία δελ ππάξρεη μεθάζαξε απάληεζε, σζηφζν πξέπεη λα ζεκεηψζνπκε πσο ηα παηδηά κε αλεπάξθεηα πνπ παίξλνπλ δφζεηο ππνθαηάζηαζεο αληηκεησπίδνπλ ηνλ πην κηθξφ θίλδπλν πξνβιεκάησλ ελψ ηαπηφρξνλα έρνπλ θαη ηα κέγηζηα νθέιε. Ζ ζεξαπεία ζηα παηδηά ζπλήζσο γίλεηαη κε θαζεκεξηλή ρνξήγεζε απμεηηθήο νξκφλεο, ζπλήζσο γηα φζν ρξφλν ην παηδί αλαπηχζζεηαη. Γηα εθείλνπο πνπ παξνπζηάδνπλ ζνβαξή αλεπάξθεηα ζαλ ελήιηθεο, κπνξεί λα πξέπεη λα γίλεηαη ζεξαπεία γηα φιε ηελ δηάξθεηα ηεο δσήο ηνπο. Οη πεξηζζφηεξνη παηδίαηξνη ελδνθξηλνιφγνη παξαθνινπζνχλ ηελ αλάπηπμε θαη πξνζαξκφδνπλ ηελ δφζε θάζε 3-4 κήλεο. Ζ αμηνιφγεζε ηεο ςπρνινγηθήο αμίαο ηεο ζεξαπείαο είλαη δχζθνιε, φκσο ηα πεξηζζφηεξα παηδηά θαη νη νηθνγέλεηεο ηνπο δείρλνπλ ελζνπζηαζκφ κφιηο αξρίζνπλ λα θαίλνληαη ηα πξψηα νθέιε. Σν κφλν αξλεηηθφ ζηνηρείν είλαη ην θφζηνο ηεο ζεξαπείαο ησλ παηδηψλ κε ζνβαξή αλεπάξθεηα, θαη έηζη ηα πεξηζζφηεξα παηδηά ζηνλ αλαπηπγκέλν θφζκν κε ζνβαξή αλεπάξθεηα ζε απμεηηθή νξκφλε παίξλνπλ ζεξαπεία. Ζ ηζηνξία είλαη πνιχ δηαθνξεηηθή φζνλ αθνξά ηελ αλεπάξθεηα ζηνπο ελήιηθεο. Καηά ηελ δηάξθεηα ησλ δπν ηειεπηαίσλ δεθαεηηψλ, ε απμεηηθή νξκφλε έρεη αξρίζεη λα ρξεζηκνπνηείηαη νινέλα θαη πεξηζζφηεξν ζε παηδηά θαη ελήιηθεο πνπ δελ παξνπζηάδνπλ ζνβαξή αλεπάξθεηα, είηε γηα λα απμήζεη ηελ αλάπηπμε, είηε γηα άιινπο ιφγνπο. (76) Ζ ζπληζηψκελε δφζε έλαξμεο ηεο ζεξαπείαο είλαη 0.18 κε 0.35 mg/kg ζσκαηηθνχ βάξνπο αλά εβδνκάδα, πνπ ρνξεγείηαη ζε επηά εκεξήζηεο δφζεηο, κε ηελ κέζε δφζε ζηηο ΖΠΑ λα είλαη 0.3 mg/kg/wk. ηηο ελαιιαθηηθέο ζεξαπείεο πεξηιακβάλνληαη έλα πξφγξακκα 6 εκεξψλ/ εβδνκάδα ή 3 εκεξψλ/ εβδνκάδα, κε ηελ ίδηα εβδνκαδηαία δφζε, φκσο απηά δελ έρνπλ ηελ ίδηα επηηπρία. Γεληθά, ε αλαπηπμηαθή απφθξηζε ζηελ απμεηηθή νξκφλε απνηειεί ζπλάξηεζε ηεο δφζεο θαη ηνπ ρξφλνπ πνπ ρνξεγείηαη, έηζη ψζηε ε αχμεζε ησλ δφζεσλ απμάλεη πεξαηηέξσ ηελ ηαρχηεηα αλάπηπμεο, σζηφζν ε θαζεκεξηλή δφζε κπνξεί λα απνηειεί ηελ πην ζεκαληηθή ζεξαπεπηηθή παξάκεηξν.(102) Οη αλαπηπμηαθέο απνθξίζεηο ζηελ εμσγελή απμεηηθή νξκφλε πνηθίινπλ, αλάινγα κε ηελ ζπρλφηεηα ρνξήγεζεο, ηελ δφζε, ηελ ειηθία (κεγαιχηεξν απφιπην θέξδνο ζηα κηθξφηεξα παηδηά, αλ θαη φρη αλαγθαζηηθά ηεο ηαρχηεηαο αλάπηπμεο SDS), ην βάξνο, ηνλ ηχπν ππνδνρέα απμεηηθήο νξκφλεο θαη ηελ πνζφηεηα, φπσο αμηνινγνχληαη απφ ηα επίπεδα GHBP νξνχ θαη,ίζσο, ηελ επνρηθφηεηα. Παξφια απηά, ζηελ ζπλήζε ζεξαπεπηηθή αγσγή θαζεκεξηλήο ρνξήγεζεο απμεηηθήο νξκφλεο ζηηο 65

67 ζπληζηψκελεο δφζεηο, έλα ζπλεζηζκέλν παηδί κε αλεπάξθεηα απμεηηθήο νξκφλεο επηηαρχλεη ηελ αλάπηπμε ηνπ απφ κηα πξν-ζεξαπεπηηθή ηαρχηεηα 3 κε 4 cm/yr ζε 10 κε 12 cm/yr θαηά ην πξψην ρξφλν ζεξαπείαο, θαη ζε 7 κε 9 cm/ yr ζην 2 ν θαη 3 ν ρξφλν ζεξαπείαο. Παξαηεξείηαη πξννδεπηηθή κείσζε ηεο απνηειεζκαηηθφηεηαο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, ηελ νπνία δελ θαηαλννχκε πιήξσο. Ο κέζνο φξνο ηνπ ζπλνιηθνχ θέξδνπο ζε χςνο θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο πεξηφδνπ απηήο ήηαλ 9.7 εθαηνζηά κεγαιχηεξνο ζηνπο αζζελείο πνπ αθνινπζνχλ ηελ θαζεκεξηλή δνζνινγία κε παξφκνηα πνζνζηά ζηελ ζθειεηηθή σξίκαλζε θαη ρσξίο επηηάρπλζε ζηελ έλαξμε ηεο εθεβείαο. Ο κέζνο φξνο χςνπο SDS ζην ηέινο ησλ 4 ρξφλσλ ήηαλ +0.2 ή ζηε κέζε εθαηνζηηαία ζέζε ηνπ θπζηνινγηθνχ γηα ηελ ειηθία.(77) Μειέηεο πνπ ρξεζηκνπνίεζαλ δηάθνξεο δνζνινγίεο απμεηηθήο νξκφλεο κε βάζε ην θχιν, ηελ αλαπηπμηαθή απφθξηζε θαη ηηο ζπγθεληξψζεηο ηνπ IGF-I, δείρλνπλ ηελ αλάγθε γηα κεγαιχηεξε εμαηνκίθεπζε ηεο ζεξαπεπηηθήο αγσγήο πνπ αθνινπζνχληαη κέρξη ζήκεξα. Ζ ζπληζηψκελε δφζε απμεηηθήο νξκφλε γηα ηελ έλαξμε ηεο ζεξαπείαο ζε παηδηά κε αλεπάξθεηα είλαη 0.18 κε 0.35 mg/kg ζσκαηηθνχ βάξνπο αλά εβδνκάδα, πνπ ρνξεγείηαη ζε επηά εκεξήζηεο δφζεηο, κε ηνλ κέζν φξν ηεο ακεξηθάληθεο δφζεο λα είλαη 0.3 mg/kg/wk. (77) ηηο ελαιιαθηηθέο ζεξαπεπηηθέο αγσγέο πεξηιακβάλνληαη πξνγξάκκαηα 6 εκεξψλ/ εβδνκάδα ή 3 εκεξψλ/ εβδνκάδα, κε ηελ ίδηα εβδνκαδηαία δνζνινγία, απηά φκσο δελ έρνπλ ηελ ίδηα επηηπρία. Όηαλ ρνξεγείηαη απμεηηθή νξκφλε ζε παηδηά θαη ζε ελήιηθεο πνπ δελ παξνπζηάδνπλ αλεπάξθεηα, ηφηε ηα επίπεδα IGF1 είλαη πηζαλφ λα αλέβνπλ πάλσ απφ ην θπζηνινγηθφ. Αλ θαη δελ ππάξρνπλ πξνθαλή απνηειέζκαηα, ζηελ αθξνκεγαιία παξαηεξνχληαη εμαηξεηηθά πςειά επίπεδα IGF1, θαη ππάξρνπλ νξηζκέλεο ελδείμεηο ( φρη πνιιέο), πνπ δείρλνπλ πσο ηα πςειφηεξα επίπεδα ζε IGF1 ζηνπο κεγαιχηεξνπο ζε ειηθία ελήιηθεο (πνπ δελ ιακβάλνπλ απμεηηθή νξκφλε) ζρεηίδνληαη κε ειαθξά πςειφηεξν θίλδπλν γηα νξηζκέλνπο θαξθίλνπο. Γελ έρεη σζηφζν πξνζδηνξηζηεί θάπνηα αηηηψδεο ζρέζε. Όηαλ ε απμεηηθή νξκφλε ρνξεγείηαη ζε έλα παηδί ζε κεγάιεο δφζεηο γηα κεγάιν ρξνληθφ δηάζηεκα, κπνξεί λα επεξεάζεη ήπηα ηελ νζηηθή δνκή ηνπ πξνζψπνπ. Απηφ ζπάληα αλαγλσξίδεηαη ζαλ αιιαγή απφ ηνπο γνλείο θαη ηνπο αζζελείο, θαη αθφκε ζπαληφηεξα δεκηνπξγεί πξνβιήκαηα.(77) 66

68 ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ 2.1 ΞΔΚΗΝΧΝΣΑ ΣΖΝ ΠΔΗΡΑΜΑΣΗΚΖ ΔΡΓΑΗΑ: Βαζηθή πξνυπφζεζε γηα ηελ έλαξμε κίαο πεηξακαηηθήο εξγαζίαο είλαη ε επηινγή-ζπιινγή ζπγθεθξηκέλνπ πεηξακαηηθνχ πιηθνχ. Γηα ην ζθνπφ απηφ επηιέρζεθαλ, απφ έλα κεγάιν αξηζκφ αηφκσλ ηεο Παηδηαηξηθήο Δλδνθξηλνινγίαο θαη Γηαβήηε ηεο Παηδηαηξηθήο Κιηληθήο ηνπ Παλεπηζηεκηαθνχ Ννζνθνκείνπ Παηξψλ, 11 παηδία ηα νπνία έπαζραλ απφ ηδηνπαζέο θνληφ αλάζηεκα. Σα παηδηά απηά παξνπζίαδαλ θαζπζηέξεζε ζηελ νζηηθή ηνπο ειηθία, δειαδή δελ βξίζθνληαλ ζηα θαζνξηζκέλα απφ ηνλ δηεζλή νξγαληζκφ πγείαο(ποτ), θπζηνινγηθά φξηα θαη ν ξπζκφο αλάπηπμεο ηνπο ήηαλ θάησ απφ ηελ δεχηεξε εθαηνζηηαία ζέζε, ζε ζρέζε κε παηδηά πνπ έρνπλ θπζηνινγηθή αλάπηπμε. Αξρηθά θξίζεθε απαξαίηεην λα πξαγκαηνπνηεζνχλ ζπγθεθξηκέλεο ηαηξηθέο εμεηάζεηο ζηελ Κιηληθή, φπσο: α) πξνθιεηέο εμεηάζεηο ηεο έθθξηζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο κε L-DOPA θαη θινληδίλε, β) έιεγρνο ηεο 24σξεο έθθξηζεο ηεο GH θαη γ) IGF-I generation test, ψζηε λα απνθιεηζζεί ην ελδερφκελν νπνηαζδήπνηε άιιεο πάζεζεο. πκπεξαζκαηηθά, απηφ είρε σο απνηέιεζκα λα απνδεηρζεί φηη ηα ζπγθεθξηκέλα παηδηά δελ παξνπζίαδαλ θαλέλα πξφβιεκα ζηελ έθθξηζε ηεο GH. 2.2 ΛΖΦΖ ΚΑΗ ΓΗΑΥΔΗΡΗΖ ΒΗΟΦΗΧΝ: Ζ ζπλέρηζε αιιά θαη ε εμέιημε ηεο έξεπλαο, ζε έλα δεχηεξν πεηξακαηηθφ επίπεδν, ζηεξίδεηαη ζηε ιήςε πξσηνγελνχο πιηθνχ (θχηηαξσλ) απφ παηδία κε θπζηνινγηθφ αλάζηεκα θαη απφ παηδηά κε ηδηνπαζέο θνληφ αλάζηεκα. Αλαιπηηθφηεξα, ε ιήςε ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ πιηθνχ πξνήιζε απφ βηνςίεο νχισλ. Σα ηζηνηεκάρηα ησλ νχισλ, ακέζσο κεηά ηελ ιήςε ηνπο, ηνπνζεηνχληαη ζε ζσιήλεο Falcon ησλ 15ml, νη νπνίνη πεξηέρνπλ 5ml πιήξνπο ζξεπηηθνχ πιηθνχ. Σν ζξεπηηθφ πιηθφ πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε ήηαλ ην DMEM (Doulbeccos Modified Eagle Medium Gibco) εκπινπηηζκέλν κε 10% Fetal calf serum (FCS-Gibco) θαη 1% αληηβηνηηθφ ζηξεπηνκπθίλε-πεληθηιίλε [Seromed Biochrom, 10,000un, 10,000mg.ml (50 ml) A2212]. Βαζηθή πξνυπφζεζε, γηα ηελ δηαρείξηζε ηνπ θπηηαξηθνχ πιηθνχ, είλαη νη άζεπηεο ζπλζήθεο, πνπ πξέπεη λα ηεξνχληαη απαξαίηεηα γηα ηελ απνθπγή ελδερφκελεο κνιχλζεσο. Καηφπηλ, ηα ηζηνηεκάρηα κεηαθέξζεθαλ ζε ηξηβιηά, 67

69 δηακέηξνπ 35x10mm θαη ηεκαρίζηεθαλ κε ηε ρξήζε απνζηεηξσκέλσλ ιεπίδσλ ζε κηθξφηεξα. Απηφ είρε σο άκεζε ζπλέπεηα, ηελ επηηπρή πξνζθφιιεζε ηνπ ηζηνχ ζην ππφζηξσκα ηνπ ηξηβιίνπ. Σαπηφρξνλα, απαξαίηεηε θξίλεηαη ε πξνζζήθε πιήξνπο ζξεπηηθνχ πιηθνχ, ε πνζφηεηα ηνπ νπνίνπ αλέξρεηαη ζηα 5 ml θαη θαζνξίδεηαη κε βάζε ην πξσηφθνιιν. ην ζπγθεθξηκέλν ζεκείν, εμέρνπζαο ζεκαζίαο είλαη ε πξνζζήθε επηπιένλ αλζξψπηλεο βηνζπλζεηηθήο απμεηηθήο νξκφλεο (Genotropin, Pharmacia 5.3mg) ηειηθήο ζπγθεληξψζεσο 4κg/ml ζε θάζε ηξηβιίν. Έρεη παξαηεξεζεί απφ πξνεγνχκελεο πεηξακαηηθέο κειέηεο ηνπ εξγαζηεξίνπ, φηη ε δηαδηθαζία απηή βνεζάεη ζηελ εμαγσγή ηλνβιαζηψλ απφ ηνπο ηζηνχο ησλ αζζελψλ. ε αληίζεζε κε ηα παξαπάλσ, ε ζπγθεθξηκέλε δηαδηθαζία δελ πξαγκαηνπνηείηαη ζηα ηξηβιία πνπ πεξηέρνπλ ηζηνχο θπζηνινγηθψλ αηφκσλ. ηελ ζπλέρεηα ηα ηξηβιία κεηαθέξνληαη ζηνλ επσαζηηθφ ζάιακν κε ζηαζεξέο ζπλζήθεο, αηκφζθαηξα 5%CO2 θαη ζεξκνθξαζία 37 ν C. Σέινο, ηα ηξηβιία παξακέλνπλ ζην ζάιακν, έσο ηξεηο εβδνκάδεο, ψζηε λα πξαγκαηνπνηεζεί ε εμαγσγή ησλ ηλνβιαζηψλ απφ ηα ηζηνηεκάρηα, ζχκθσλα κε ην πξσηφθνιιν. Δικόνα 35: Δηθόλα 35: α)ιζηνηεκάρην βηνςίαο ζην πξώην ζηάδην επεμεξγαζίαο ηεο. b) Μεηά από 1 εβδνκάδα εμέξρνληαη ηα πξώηα θύηηαξα (θεξαηηλνθύηηαξα). c) 3 εβδνκάδεο αξγόηεξα θαίλεηαη λα έρνπλ εμέιζεη ήδε ηλνβιάζηεο. d) Καιιηέξγεηα ηλνβιαζηώλ απνκαθξπζκέλε από ηε βηνςία. 68

70 2.3 ΛΖΦΖ ΗΝΟΒΛΑΣΧΝ ΑΠΟ ΣΗ ΒΗΟΦΗΔ ΚΑΗ ΑΝΑΚΑΛΛΗΔΡΓΔΗΑ ΣΟΤ: Πξνρσξψληαο ζηελ πεηξακαηηθή εξγαζία, γηα ηελ ιήςε ησλ ηλνβιαζηψλ, ηα ηξηβιία ειέγρνληαη ζε ηαθηά ρξνληθά δηαζηήκαηα κε κεγάιε πξνζνρή, ψζηε λα κελ απνθνιιεζνχλ ηα ηζηνηεκάρηα, θαη ην ζξεπηηθφ πιηθφ αλαλεψλεηαη έσο φηνπ νη ηλνβιάζηεο θαηαιάβνπλ ην 80-90% ηνπ ππζκέλα ηνπ ηξηβιίνπ. ηε ζπλέρεηα ιακβάλεη κέξνο ε δηαδηθαζία αλαθαιιηέξγεηάο ησλ θπηηάξσλ νη νπνία πξαγκαηνπνηείηαη σο εμήο: Αξρηθά, ην ζξεπηηθφ πιηθφ ηνπ ηξηβιίνπ αθαηξείηαη κε ηελ ρξήζε αληιίαο θαη ζηελ ζπλέρεηα ηα θχηηαξα μεπιέλνληαη κε ηε ρξήζε απνζηεηξσκέλνπ δηαιχκαηνο, PBS (Phosphate Buffer Saline) αξαηψζεσο 1x απφ 10x. Γηα ηελ παξαζθεπή δηαιχκαηνο PBS 10x ζε ηειηθφ φγθν 1000ml ρξεηάζηεθαλ, 80g NaCl, 2g KCl, 14.4g Na 2 HPO 4, 2,4g KH 2 PO 4, ηα νπνία αλακηγλχνληαη ζε 800ml απηνληζκέλνπ λεξνχ, ην ph ηνπ δηαιχκαηνο ξπζκίδεηαη ζην 7,4 θαη ζηε ζπλέρεηα πξνζηίζεηαη επηπιένλ δηο απεζηαγκέλν λεξφ γηα λα θαιπθζεί ε πνζφηεηα ηνπ φγθνπ ησλ 1000ml. ε δεχηεξν ζηάδην, πξνζηίζεηαη 1ml ζξπςίλεο (Seromed Biochrom) ζε θάζε ηξηβιίν, ην νπνίν ηνπνζεηείηαη ζηνλ επσαζηηθφ ζάιακν γηα 1-2 ιεπηά. Έπεηηα ε ζξπςίλε αθαηξείηαη ζην κεγαιχηεξν βαζκφ ηεο θαη ην ηξηβιίν επαλαηνπνζεηείηαη ζηνλ επσαζηηθφ ζάιακν γηα αθφκα 10 ιεπηά, ψζηε λα δξάζεη ην ππνιεηπφκελν έλδπκν. Ζ ζξπςίλε είλαη κία παγθξεαηηθή πξσηεάζε ηεο ζεξίλεο, έλδπκν πνπ έρεη ηελ ηδηφηεηα λα απνθνιιά ηα θχηηαξα απφ ην ηξηβιίν. Μεηά ηε δξάζε ηεο ζξπςίλεο, νη ηλνβιάζηεο απνθνιιψληαη θαη έρνπλ απνθηήζεη ζθαηξηθή κνξθή, ζε αληίζεζε κε ηελ ραξαθηεξηζηηθή επηκήθε πνπ είραλ φληαο πξνζθνιιεκέλνη ζην ππφζηξσκα ηνπ ηξηβιίνπ. Έπεηηα, 4ml πιήξνπο ζξεπηηθνχ πιηθνχ πξνζηίζεληαη ζε θάζε ηξηβιίν, ηα θχηηαξα αλαδπαιχνληαη θαη 2ml απφ ην ελαηψξεκα απηφ κεηαθέξεηαη ζε λέν. Σέινο, πξνζηίζεληαη ζε θάζε θαιιηέξγεηα 6ml πιήξνπο ζξεπηηθνχ πιηθνχ, ψζηε ν ηειηθφο φγθνο ηνπ δηαιχκαηνο λα αλέξρεηαη ζηα 8 ml. Σν ζξεπηηθφ πιηθφ ησλ θαιιηεξγεηψλ αλαλεψλεηαη θάζε 2-3 εκέξεο. Απηφ έρεη σο ζθνπφ ηελ απνκάθξπλζε ηεο ππνιεηπφκελεο ζξπςίλεο, ηνμίλσλ θαη λεθξψλ θπηηάξσλ απφ ηελ θάζε θαιιηέξγεηα. Ζ δηαδηθαζία ηεο αλαθαιιηέξγεηαο γίλεηαη έσο έμη θνξέο, δηφηη κεηά ην πέξαο απηψλ, ηα θχηηαξα απφ πξψηκα ζεσξνχληαη γεξαζκέλα θαη δελ κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ ζε κειινληηθέο κειέηεο. 69

71 2.4 ΠΑΓΧΜΑ, ΑΠΟΘΖΚΔΤΖ Δ ΤΓΡΟ ΑΕΧΣΟ ΚΑΗ ΑΠΟΦΤΞΖ ΚΤΣΣΑΡΧΝ: Σν πάγσκα ησλ θπηηάξσλ είλαη κία δηαδηθαζία, ε νπνία αξρίδεη κεηά ηελ απνθφιιεζε ησλ θπηηάξσλ απφ ην ηξηβιίν, κε ηε ρξήζε ηεο ζξπςίλεο, ηξφπνο πνπ παξνπζηάζηεθε παξαπάλσ. Γηα ηελ δηεξγαζία απηή ρξεζηκνπνηείηαη δηάιπκα θαηάιιειν γηα ην πάγσκα ησλ θπηηάξσλ (Freezing medium) ην νπνίν πεξηέρεη DMEM (GIBCO), 20%FCS (GIBCO) θαη 10%DMSO (dimethyl sulfoxide) (Applichem). Σν DMSO είλαη έλα θξπνζπληεξεηηθφ απαξαίηεην γηα ηε βησζηκφηεηα ησλ θπηηάξσλ ζε ρακειέο ζεξκνθξαζίεο, είλαη φκσο ηνμηθφ. πγθεθξηκέλα είλαη κία νπζία, ε νπνία εμνκαιχλεη ηηο απφηνκεο αιιαγέο ζεξκνθξαζίαο πνπ ππφθεηληαη ηα θχηηαξα θαηά ην πάγσκα θαη ην μεπάγσκα ηνπο. Όηαλ απνθνιιεζνχλ νη ηλνβιάζηεο απφ ηνλ ππζκέλα ηνπ ηξηβιίνπ, ζπιιέγνληαη ζε 1-1,5ml απφ ην παξαπάλσ δηάιπκα, κεηέπεηηα ηνπνζεηνχληαη ζε θξπνθπαιίδηα. Σν πάγσκα ησλ θπηηάξσλ γίλεηαη ζηαδηαθά, δειαδή ζηελ αξρή γηα έλα ζχληνκν ρξνληθφ δηάζηεκα ηα θχηηαξα απνζεθεχνληαη ζε ςχμε ζηνπο -80 ν C θαη αξγφηεξα θπιάζζνληαη ζε πγξφ άδσην (-197 ν C), γηα κεηέπεηηα ρξήζε. Δίλαη γεληθά απνδεθηφ φηη ν ηξφπνο απηφο θχιαμεο είλαη ν κφλνο ν νπνίνο εμαζθαιίδεη βησζηκφηεηα γηα απεξηφξηζην ρξνληθφ δηάζηεκα, αθνχ νπζηαζηηθά ζε ηφζν ρακειή ζεξκνθξαζία "ζηακαηάεη ην βηνινγηθό ξνιόη ησλ θπηηάξσλ". Έρεη ππνινγηζηεί φηη ζηνπο -196 βαζκνχο C ζα έπξεπε λα πεξάζνπλ ρξφληα γηα λα εκθαληζζεί θάπνηα δεκηά ζηα θχηηαξα. Ζ απφςπμε ησλ θπηηάξσλ απφ ην πγξφ άδσην, γίλεηαη σο εμήο: Σν θξπνθπαιίδην κεηά ηελ απνκάθξπλζή ηνπ απφ ην πγξφ άδσην, θαηαβπζίδεηαη απεπζείαο ζε πδαηφινπηξν ζεξκνθξαζίαο 37 ν C. ε ρξνληθφ δηάζηεκα πεξίπνπ 2 ιεπηψλ ην δείγκα έρεη μεπαγψζεη θαη κεηαθέξεηαη θαηεπζείαλ, ζε ηξηβιίν ην νπνίν πεξηέρεη 8ml πιήξεο ζξεπηηθφ πιηθφ. Ζ δηαδηθαζία απηή είλαη ηδηαίηεξα επίπνλε γηα ηα θχηηαξα, κε απνηέιεζκα πνιιά απφ απηά λα κελ επηβηψλνπλ. Σα λεθξά απηά θχηηαξα εάλ παξακείλνπλ ζην ελαηψξεκα είλαη ηνμηθά γηα ηα ππφινηπα βηψζηκα θχηηαξα, γηα ην ιφγσ απηφ ην ζξεπηηθφ πιηθφ πξέπεη λα αληηθαηαζηαζεί ζε 24 ψξεο. 70

72 2.5 ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ, ΔΠΗΓΔΡΜΗΚΟ ΑΤΞΖΣΗΚΟ ΠΑΡΑΓΟΝΣΑ (EGF) ΚΑΗ ΣΖΝ 17Β-ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ ΣΗ ΚΑΛΛΗΔΡΓΔΗΔ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ: Όηαλ νη ηλνβιάζηεο έρνπλ θηάζεη ζε πιεξφηεηα 80% ζην ηξηβιίν, ζε εθείλν ην ρξνληθφ δηάζηεκα ζπληζηάηαη βάζε πξσηνθφιινπ λα γίλεη ε επαγσγή ηνπο κε ηνπο παξάγνληεο πνπ επηζπκνχκε. Αξρηθά, ην ζξεπηηθφ πιηθφ απνκαθξχλεηαη απφ ην ηξηβιίν θαη ηα θχηηαξα μεπιέλνληαη κε απνζηεηξσκέλν δηάιπκα PBS 1x ηξεηο θνξέο. Απηφ έρεη σο απνηέιεζκα λα απνκαθξπλζνχλ φινη νη απμεηηθνί παξάγνληεο θαζψο θαη ε πεξίζζεηα ζξεπηηθνχ πιηθνχ απφ ηελ θάζε θαιιηέξγεηα. Έπεηηα ζξεπηηθφ πιηθφ λεζηείαο (DMEM, 1% ζηξεπηνκπθίλε-πεληθηιίλε, 1% charcoal stripped FCS, 500ml απφ GIBCO INVITROGEN) πξνζηίζεηαη ζην ηξηβιίν θαη θαηφπηλ νη θαιιηέξγεηεο ηνπνζεηνχληαη ζηνλ επσαζηηθφ ζάιακν γηα 18 ψξεο. Ζ ρξήζε ηνπ ζξεπηηθνχ πιηθνχ λεζηείαο είλαη απαξαίηεηε, δηφηη ζέινπκε λα εξεπλήζνπκε ηελ θαζαπηή δξάζε ηνπ παξάγνληα κε ηνλ νπνίν επάγνπκε ηελ θαιιηέξγεηα θαη φρη ησλ άιισλ απμεηηθψλ παξαγφλησλ νη νπνίνη πεξηέρνληαη ζην πιήξεο ζξεπηηθφ πιηθφ. Καηά ηελ θαιιηέξγεηα ησλ θπηηάξσλ κε ηελ παξαπάλσ νπζία επηηπγράλνπκε θαη ηνλ θαιχηεξν ζπγρξνληζκφ ησλ θπηηαξηθψλ δηαηξέζεσλ. Με ην πέξαο ησλ 18 σξψλ, πξνζζέηνπκε ζηελ θαιιηέξγεηα ηνλ παξάγνληα πνπ καο ελδηαθέξεη, ζηελ θαηάιιειε δφζε θαη ζηα επηζπκεηά ρξνληθά δηαζηήκαηα. πγθεθξηκέλα, νη επαγσγή ησλ ηλνβιαζηψλ κε ηνπο δηάθνξνπο παξάγνληεο έγηλε σο εμήο: Αςξηηική οπμόνη (hgh-genotropin 5.3mg PHARMACIA): ζε δνζνινγία 200ng/ml θαζψο επίζεο θαη 1000ng/ml ζε ρξφλνπο επαγσγήο 5, 10, 15, 30, 40, 60 ιεπηά, 3 θαη 5 ψξεο. Δπιδεπμικόρ αςξηηικόρ παπάγονηαρ(recombinant Human EGF-biomol Prod.N O 50349): ηειηθήο ζπγθέληξσζεο 50nΜ θαη ζε ρξφλν επαγσγήο 40 ιεπηψλ 17β-οιζηπαδιόλη(17β-estradiol-powder cell culter tested, Sigma,E2758): δνζνινγία 20κg/ml θαη ζε ρξφλνπο επαγσγήο 20, 40 θαη 60 ιεπηψλ. 71

73 2.6 ΑΠΟΜΟΝΧΖ ΟΛΗΚΧΝ ΠΡΧΣΔΨΝΧΝ: Όηαλ ην επηζπκεηφ ρξνληθφ δηάζηεκα επαγσγήο νινθιεξσζεί, ηα ηξηβιία κεηαθέξνληαη ζε πάγν. Απηφ ρξεηάδεηαη γηα λα ζηακαηήζεη ε νπνηαδήπνηε θπηηαξηθή ιεηηνπξγία θαη ε δξάζε ηνπ εθάζηνηε παξάγνληα. Αθνινχζσο ην ζξεπηηθφ πιηθφ απνβάιιεηαη θαη ηα θχηηαξα μεπιέλνληαη 3 θνξέο κε 5ml δηαιχκαηνο PBS 1x. Γηα ηελ απνκφλσζε νιηθψλ πξσηετληθψλ εθρπιηζκάησλ απφ ηνπο ηλνβιάζηεο, ρξεηάδεηαη ην ιεγφκελν δηάιπκα ιχζεο ησλ θπηηάξσλ 2x (lysis buffer). Απηφ παξαζθεπάδεηαη ζε 10ml ηειηθφ φγθν ρξεζηκνπνηψληαο: 2,5ml απφ 0,5Μ δηάιπκα ΣRIS-HCl (ph6.8), 2ml δηαιχκαηνο 20% SDS (sodium dodecyl sulfate, είλαη έλα αληνληθφ απνξξππαληηθφ ην νπνίν δεζκεχεηαη ζηηο πξσηεΐλεο), 2ml 100% Γιπθεξφιε, 3,5ml δηο απεζηαγκέλν λεξφ θαη 0.001gr ρξσζηηθήο Bromophenol Blue (SIGMA). Όηαλ ην δηάιπκα είλαη έηνηκν θαη ιίγν πξηλ ηε ρξήζε ηνπ πξνζηίζεηαη ζε απηφ 5% β- κεξθαπηναηζαλφιε. Ζ νπζία απηή έρεη απνδηαηαθηηθφ ραξαθηήξα πνπ ζπάεη ηνπο δηζνπιθηδηθνχο δεζκνχο ησλ πξσηετλψλ, έηζη ψζηε απηέο λα είλαη εληειψο μεδηπισκέλεο. ηε ζπλέρεηα, πξνζηίζεηαη ζε θάζε ηξηβιίν αλάινγα κε ην κέγεζνο ηνπ θαηάιιειε πνζφηεηα lysis buffer θαη ρξεζηκνπνηψληαο ζην θαζέλα κηα εηδηθή θαζαξή μχζηξα (cell scraper) ζαξψλνληαη ηα θχηηαξα ζηνλ ππζκέλα ηνπ ηξηβιίνπ. Με ηνλ ζπγθεθξηκέλν ηξφπν, ηα θχηηαξα απνκαθξχλνληαη απφ ηνλ ππζκέλα θαη ζπιιέγνληαη ζε εηδηθνχο ζσιελίζθνπο (eppendorfs). Σειηθά, ην δείγκα ζεξκαίλεηαη γηα δέθα ιεπηά ζηνπο 90 ν C, φπνπ αλά ηξία ιεπηά αθνινπζεί αλάδεπζε ηνπο. Απηφ βνεζάεη ζηελ πην απνηειεζκαηηθή εμαγσγή ησλ πξσηετληθψλ εθρπιηζκάησλ απφ ηα θχηηαξα. Σν δείγκα, ζηελ ζπλερεία κπνξεί λα απνζεθεπηεί ζηνπο -20 ν C γηα κεηέπεηηα ρξήζε ηνπ. 2.7 ΑΠΟΜΟΝΧΖ RNA: Ζ ζπιινγή RNA απφ ηα θχηηαξα έγηλε κε ηε ρξήζε εηδηθνχ θηη ηεο εηαηξείαο SIGMA (Gen elute total RNA Miniprep kit). 2.8 ΑΠΟΜΟΝΧΖ ΠΤΡΖΝΗΚΧΝ ΔΚΥΤΛΗΜΑΣΧΝ: Με ην πέξαο ηνπ ρξφλνπ ηεο επαγσγήο ησλ ηλνβιαζηψλ κε ηνλ εθάζηνηε παξάγνληα, δηεθπεξαηψζεθε εθηφο ησλ άιισλ θαη ε απνκφλσζε ππξεληθψλ εθρπιηζκάησλ απφ ηα ηξηβιία. Απηφ ζπληειέζηεθε κε ηελ ρξήζε δχν δηαθνξεηηθψλ 72

74 δηαιπκάησλ. Σα δηαιχκαηα απηά νλνκάδνληαη Α θαη Β. Όζν αλαθνξά ην δηάιπκα Α παξαζθεπάδεηαη σο εμήο: ε αξρηθή πνζφηεηα δηο απεζηαγκέλνπ λεξνχ πξνζηίζεληαη 0,13gr HEPES, 0,037gr KCl θαη 0,00186gr EDTA θαη αθνινπζεί ε ξχζκηζε ηνπ ph ζην 7,9 θαη δηάιπκα νγθνκεηξήηαη κε δηο απεζηαγκέλν λεξφ ζε ηειηθφ φγθν 50ml. Αληίζηνηρα ην δηάιπκα Β παξαζθεπάδεηαη σο εμήο: ζε αξρηθή πνζφηεηα δηο απεζηαγκέλνπ λεξνχ πξνζηίζεληαη 0,052gr HEPES, 0,23gr NaCl, 0,003722gr EDTA, 1ml 10% γιπθεξφιε, θαηφπηλ αθνινπζεί ξχζκηζε ηνπ ph ζην 7,9 θαη νγθνκέηξεζε ηνπ ζε ηειηθφ φγθν 10ml. Πξηλ απφ ηε ρξήζε ηνπ θάζε δηαιχκαηνο πξνζηίζεληαη 1% δηαιχκαηνο αλαζηνιέσλ πξσηεαζψλ, 1% δηαιχκαηνο 0,5mM PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride, ην PMSF είλαη πνιχ ηνμηθφ, είλαη ν πην θνηλφο αλαζηνιέαο ησλ πξσηεαζψλ, ρξεζηκνπνηείηαη ζηελ απνκφλσζε ησλ πξσηετλψλ θαη δηαιχεηαη ζηελ ηζνπξνπαλφιε), 1% δηαιχκαηνο 1mM DTT. Δπηπιένλ ζην δηάιπκα Α πξνζηίζεηαη θαη 4% δηαιχκαηνο NP-40. Όια ηα δηαιχκαηα δηαηεξνχληαη θαηά ηε δηάξθεηα ηεο δηαδηθαζίαο απηήο ζηνλ πάγν. Ζ δηαδηθαζία ηεο απνκφλσζεο ησλ εθρπιηζκάησλ γίλεηαη σο εμήο: Πξψηνλ, αθνχ αθαηξεζεί ην ζξεπηηθφ πιηθφ λεζηείαο, ηα θχηηαξα μεπιέλνληαη 3 θνξέο κε 5ml δηαιχκαηνο PBS 1x. Έπεηηα, πξνζηίζεηαη θαηάιιειε πνζφηεηα δηαιχκαηνο Α ζην θάζε ηξηβιίν κε ηελ νπνία θαη επσάδεηαη απηφ γηα 10 ιεπηά ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ. Ο ππζκέλαο ηνπ ηξηβιίνπ ζαξψλεηαη ζηε ζπλέρεηα, κε απνζηεηξσκέλε μχζηξα θαη ην ελαηψξεκα κεηαθέξεηαη ζε eppendorf. Αθνινπζεί ε θπγνθέληξεζε ησλ δεηγκάησλ ζηα g γηα 3 ιεπηά ζηνπο 4 ν C. Καηφπηλ, ην ππεξθείκελν απνκαθξχλεηαη απφ ην θάζε ζσιελάθη θαη ην ίδεκα δηαιχεηαη ζε 150ι δηαιχκαηνο Β. Σα δείγκαηα αθήλνληαη λα επσαζηνχλ 40 ιεπηά ζηνλ πάγν, φπνπ αλά 3 ιεπηά αλαδεχνληαη. Σέινο θπγνθεληξνχληαη ζηα g γηα 5 ιεπηά ζηνπο 4 ν C, γίλεηαη εκβάπηηζε ησλ δεηγκάησλ γηα κεξηθά δεπηεξφιεπηα ζε πγξφ άδσην θαη απνζήθεπζή ηνπο ζηνπο -80 ν C γηα κειινληηθή ρξήζε. 2.9 SDS-PAGE ΖΛΔΚΣΡΟΦOΡΖΖ: Ο φξνο ειεθηξνθφξεζε αλαθέξεηαη ζην θαηλφκελν κεηαλάζηεπζεο ειεθηξηθά θνξηηζκέλσλ ζσκαηηδίσλ-ηφλησλ κε ηελ επίδξαζε ειεθηξηθνχ πεδίνπ. Με απηφ ηνλ ηξφπν, ρξεζηκνπνηψληαο ηα δηαθνξεηηθά θνξηία θαη κνξηαθά βάξε ησλ πξσηετλψλ πνπ πθίζηαληαη ηελ ειεθηξνθφξεζε, θαηνξζψλεηαη ν δηαρσξηζκφο ηνπο. ηελ SDS- PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) σο κέζν 73

75 δηαρσξηζκνχ ρξεζηκνπνηείηαη ην αθξπιακίδην. πγθεθξηκέλα ην πήθησκα δεκηνπξγείηαη απφ ηνλ πνιπκεξηζκφ ησλ κνλνκεξψλ ηνπ αθξπιακηδίνπ θαη απηφ νδεγεί ζην ζρεκαηηζκφ νιφθιεξσλ αιπζίδσλ πνιπαθξπιακηδίνπ(πιέγκα). Ο πνιπκεξηζκφο απηφο είλαη έλα παξάδεηγκα θαηαιπηηθήο δξάζεο ησλ ειεχζεξσλ ξηδψλ. Ζ θαηάιπζε ζπκβαίλεη κε ηε ρξήζε κηαο βάζεο ην TEMED (ΝΝΝ Ν ηεηξακεζπιαηζπιελνδηακίλεο), θαη κφλν κε ηε βνήζεηα ειεχζεξσλ ξηδψλ πνπ δεκηνπξγνχληαη ρεκηθά κε ππεξζεηηθά ηφληα (S 2 O 3 ) ιφγσ ηεο παξνπζίαο ηνπ ammonium persulphate (APS- θαηαιχηεο). Σειηθά, ζηε ζπγθεθξηκέλε ειεθηξνθφξεζε αλαιχνληαη πξσηεΐλεο πνπ έρνπλ απνθηήζεη θαζαξφ αξλεηηθφ θνξηίν, κε ηε ρξήζε ηνπ SDS. Αξρίδνληαο ηε δηαδηθαζία, ηα δείγκαηα απνκαθξχλνληαη απφ ηνπο -20 ν C θαη ηνπνζεηνχληαη ζε πδαηφινπηξν ζηνπο 90 ν C φπνπ θαη ζεξκαίλνληαη γηα 5 ιεπηά. Ζ πςειή απηή ζεξκνθξαζία απνδηαηάζζεη ηνπο δεζκνχο πδξνγφλνπ ησλ πξσηετλψλ. ηε ζπλέρεηα ηα δείγκαηα θπγνθεληξνχληαη γηα κεξηθά δεπηεξφιεπηα θαη είλαη έηνηκα γηα εηζαγσγή ηνπο ζην πήθησκα. ηελ εηδηθή κεραλή θάζεηεο ειεθηξνθφξεζεο θαηαζθεπάδνληαη δχν εηδψλ πεθηψκαηα πνιπαθξπιακηδίνπ κε δηαθνξεηηθφ ph. Δικόνα 36: Δηθόλα 36: Απεηθόληζε ηνπ ηξόπνπ πξνεηνηκαζίαο ηεο θαηάιιειεο ζπζθεπήο ππνδνρήο θαη παξαζθεπήο ηνπ πεθηώκαηνο. Αξρηθά, δεκηνπξγείηαη ην πήθησκα δηαρσξηζκνχ κε pζ 8,8 θαη ηνπνζεηείηαη ζηελ ζπζθεπή γηα λα πνιπκεξηζηεί θαη λα πήμεη (πεξίπνπ 45 ιεπηά). ην πήθησκα δηαρσξηζκνχ, ε ζπγθέληξσζε πνιπαθξπιακηδίνπ εμαξηάηαη απφ ην κέγεζνο ηεο θάζε πξσηεΐλεο. Όζν κεγαιχηεξν είλαη ην κνξηαθφ βάξνο ηεο, ηφζν ιηγφηεξε είλαη θαη ε πεξηεθηηθφηεηα πνιπαθξπιακηδίνπ θαη αληίζηξνθα. Ο πνιπκεξηζκφο ηνπ πεθηψκαηνο φπσο πξναλαθέξζεθε γίλεηαη κε ηελ ρξήζε ΝΝΝ Ν -ηεηξακεζπιελνδηακίλε (TEMED). Σα πεθηψκαηα πεξηέρνπλ θαη SDS (sodium didocyl sulfate) πνπ πξνζδίδεη ζηηο πξσηεΐλεο πεξίζζεηα αξλεηηθψλ θνξηίσλ ψζηε λα εμαιείθνληαη νη δηαθνξέο ζηα θνξηία ηνπο θαη λα θηλνχληαη βάζε κφλν ηνπ κνξηαθνχ ηνπο βάξνπο. 74

76 ηελ ζπλέρεηα θαηαζθεπάδεηαη ην πήθησκα παθεηαξίζκαηνο κε ph 6,8. ην πνζνζηφ αθξπιακηδίνπ ζε απηφ είλαη ζηαζεξφ (5%) θαη αλεμάξηεην απφ ην κέγεζνο ησλ πξσηετλψλ πνπ επξφθεηην λα κειεηεζνχλ. Ο ξφινο ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ πεθηψκαηνο είλαη λα ζπζζσξεχζεη ηηο δηάθνξεο πξσηεΐλεο γηα λα εηζέιζνπλ απηέο ηαπηφρξνλα ζην πήθησκα δηαρσξηζκνχ. Όηαλ ηνπνζεηεζεί ην πήθησκα παθεηαξίζκαηνο πάλσ απφ ηνπ δηαρσξηζκνχ βπζίδεηαη ζε απηφ νδνλησηή κήηξα, απφ φπνπ θαη ζα πξνθχςνπλ ηα θξεάηηα ζηα νπνία ζα θνξησζνχλ ηα δείγκαηα ηεο πξσηεΐλεο. Γηα λα ζηαζεξνπνηεζεί ην πήθησκα απηφ απαηηείηαη ρξφλνο πεξίπνπ 30 ιεπηψλ. ηε ζπλέρεηα, ε ζπζθεπή ζπλαξκνινγείηε φπσο θαίλεηαη ζηε θηγνχξα 2 θαη ην δνρείν γεκίδεη κε ξπζκηζηηθφ δηάιπκα πνπ νλνκάδεηαη Running buffer 1x (Running Buffer 10x- ζε ηειηθφ φγθν 1ιίηξνπ πξνζηίζεληαη 30gr trizma base, 144gr glycine θαη 5gr SDS). Δικόνα 37: ε θάζε θξεάηην εηζάγνληαη 10ι πξσηετληθνχ κάξηπξα (Benchmark prestained protein ladder-biorad), θαη ζηα ππφινηπα ηα δείγκαηα ησλ πξσηετλψλ. Ζ ζπζθεπή ζπλδέεηαη κε ηξνθνδνηηθφ ελέξγεηαο πνπ θέξεη ζηαζεξή ηάζε γηα θάζε πήθησκα. ην πήθησκα ηνπ παθεηαξίζκαηνο ε ηάζε ξπζκίδεηαη ζηα 70volts, ελψ ζην πήθησκα δηαρσξηζκνχ ζηα 120 volts ΖΛΔΚΣΡΟΜΔΣΑΦΟΡΑ Δ ΜΔΜΒΡΑΝΖ ΝΗΣΡΟΚΤΣΣΑΡΗΝΖ: Αθνχ ε ειεθηξνθφξεζε έρεη μεθηλήζεη, ην δηάιπκα πνπ ζα ρξεζηκνπνηεζεί ζην δεχηεξν ζηάδην ηεο δηαδηθαζίαο, πνπ είλαη ε κεηαθνξά θαη θαζήισζε ησλ ειεθηξνθνξεηηθά δηαρσξηζκέλσλ πξσηετλψλ απφ ην πήθησκα δηαρσξηζκνχ ζε κεκβξάλε ληηξνθπηηαξίλεο, πξέπεη λα εηνηκαζζεί. Γηα ην ιφγσ απηφ παξαζθεπάδεηαη ην δηάιπκα κεηαθνξάο 1x (Transfer Buffer 10x- ζε ηειηθφ φγθν 1ιίηξνπ πξνζηίζεληαη 30gr trizma base, 144gr glycine) θαη ηνπνζεηείηε ζηνπο 4 ν C. ην ξπζκηζηηθφ απηφ δηάιπκα ηνπνζεηνχληαη νη κεκβξάλεο ληηξνθπηηαξίλεο θαη ην δηεζεηηθφ ραξηί, 20 75

77 ιεπηά πξηλ ηελ ρξήζε ηνπο, γηα λα θνξεζηνχλ. ηε ζπλέρεηα φηαλ ε ειεθηξνθφξεζε έρεη νινθιεξσζεί, κε πξνζνρή αθαηξνχληαη ηα πεθηψκαηα απφ ηε ζπζθεπή θαη ην πήθησκα παθεηαξίζκαηνο απνξξίπηεηαη. Καηφπηλ ζηελ θαζεηίλα κεηαθνξάο ηνπνζεηνχληαη κε ηελ αθφινπζε ζεηξά ηα παξαθάησ: έλα ζθνπγγαξάθη, 3 δηεζεηηθά ραξηηά, ην πήθησκα δηαρσξηζκνχ, ε κεκβξάλε ληηξνθπηηαξίλεο, 3 δηεζεηηθά ραξηηά θαη έλα αθφκα ζθνπγγαξάθη. Ζ θαζεηίλα θιείλεη θαη ηνπνζεηείηαη ζηελ ζπζθεπή κεηαθνξάο Σν πήθησκα ηνπνζεηείηαη πξνο ηελ κεξηά ηνπ αξλεηηθνχ πφινπ θαη ε κεκβξάλε πξνο ην ζεηηθφ. Δικόνα 38: Ζ ζπζθεπή γεκίδεη κε ην ξπζκηζηηθφ δηάιπκα κεηαθνξάο 1x ην νπνίν πεξηέρεη 10% κεζαλφιε. Αθνινχζσο, ηνπνζεηείηαη ζηελ ζπζθεπή έλαο αλαδεπηήξαο θαη κία παγνζήθε. Σν φιν ζχζηεκα κεηαθέξεηαη ζε ςπρφκελν δσκάηην θαη ζπλδέεηαη κε ηξνθνδνηηθφ, κε ζηαζεξά 300mΑ. Ο ρξφλνο κεηαθνξάο εμαξηάηαη απφ ην κέγεζνο ηεο πξσηεΐλεο. Όζν πην κεγάιν είλαη ην κνξηαθφ βάξνο ηεο πξσηεΐλεο ηφζν πεξηζζφηεξνο είλαη ν ρξφλνο κεηαθνξάο θαη αληίζηξνθα. Όηαλ νινθιεξσζεί ε κεηαθνξά, ε ζπζθεπή απνζπλαξκνινγείηαη θαη ε κεκβξάλε ζεκαδεχεηαη ψζηε λα είλαη γλσζηφ πξνο πνηα θαηεχζπλζε έγηλε ε κεηαθνξά ησλ κνξίσλ. Καηφπηλ ε κεκβξάλε πθίζηαηαη πιχζε κε δηο απεζηαγκέλν λεξφ θαη έπεηηα ρξσκαηίδεηαη κε Ponceau S, ψζηε λα είλαη εθηθηή ε παξαηήξεζε ησλ πξσηετλψλ πνπ κεηαθεξζήθαλ. Δηδηθφηεξα, ζην ζηάδην απηφ γίλεηαη ε δηαπίζησζε ηεο επηηπρνχο ή κε κεηαθνξάο ησλ κνξίσλ, ηεο ηζνθφξησζεο ησλ δεηγκάησλ θαζψο επίζεο θαη ε αληηζηνηρία ησλ δσλψλ ηνπ πξσηετληθνχ κάξηπξα ζηελ επηθάλεηα ηεο κεκβξάλεο, ψζηε ζην ηειηθφ ζηάδην ηεο κεζφδνπ λα είλαη εθηθηφ λα ππνινγηζηεί ην κνξηαθφ βάξνο ησλ πξσηετλψλ πνπ ζέινπκε λα κειεηήζνπκε. Ζ κεκβξάλε απνρξσκαηίδεηαη κε πιχζεηο κε δηο απεζηαγκέλν λεξφ θαη TBS-Tween 20 1x. Ζ επηηπρία ηεο κεηαθνξάο πηζηνπνηείηαη επίζεο θαη κε ηε ρξψζε ηνπ πεθηψκαηνο δηαρσξηζκνχ κε Coomasie Blue. Δάλ έρεη γίλεη ζσζηή κεηαθνξά δηάθνξεο δσλψζεηο ζα εκθαληζηνχλ ζην πήθησκα. Απηφ απνρξσκαηίδεηαη κε ζεξκαηλφκελν απεζηαγκέλν 76

78 λεξφ. Αθνχ απνρξσκαηηζηεί ζα εκθαληζηεί ζην πήθησκα ην πνζνζηφ πξσηετλψλ πνπ δελ κεηαθέξζεθε. θνπφο είλαη λα παξνπζηαζηνχλ φζν ην δπλαηφλ ιηγφηεξεο έσο θαζφινπ πξσηεΐλεο ΑΝΟΟΑΝΗΥΝΔΤΖ ΠΡΧΣΔΨΝΧΝ: Πξηλ πξαγκαηνπνηεζεί ε επψαζε ησλ κεκβξαλψλ κε ηα αληίζσκα πνπ επηζπκνχκε, γίλεηαη δέζκεπζε ησλ κε εηδηθψλ ζέζεσλ πξνζδέζεσο ησλ αληηζσκάησλ, κε πξνεπψαζε ηεο κεκβξάλεο ζε δηάιπκα blocking (5% απνβνπηπξσκέλν γάια ζε κνξθή ζθφλεο δηαιπκέλν ζε TBS-Tween 1x). Ζ παξαζθεπή ηνπ δηαιχκαηνο TBS 10x γίλεηαη σο εμήο: ζε αξρηθή πνζφηεηα δηο απεζηαγκέλνπ λεξνχ πξνζηίζεληαη 60,55gr Trizma Base θαη 87,66gr NaCl, αθνινπζεί ξχζκηζε ηνπ ph ζηα 7.5 θαη νγθνκέηξεζε ηνπ δηαιχκαηνο κε απηνληζκέλν λεξφ ζην 1 ιίηξν. ε θάζε ιίηξν δηαιχκαηνο TBS 1x πξνζηίζεηαη επηπιένλ θαη 1ml δηαιχκαηνο TWEEN-20. Ο ειάρηζηνο ρξφλνο πνπ απαηηείηαη γηα ηελ δηαδηθαζία απηή είλαη 60 ιεπηά. Αθνινπζεί επψαζε ηεο κεκβξάλεο κε ην πξσηνγελέο αληίζσκα, ην νπνίν θαηάιιεια αξαηψλεηαη ζε δηάιπκα blocking, ζε ζεξκνθξαζία 4 ν C, ζε θηλνχκελε πιάθα. Ο ρξφλνο επψαζεο εμαξηάηαη απφ ηνλ παξάγνληα πξνο κειέηε. πγθεθξηκέλα γηα ηελ κειέηε ησλ παξαγφλησλ: CIS, PIAS, pstat3, pegfr, pjak1 θαη pjak2 ε επψαζε έγηλε γηα 12 ψξεο, ελψ γηα ηελ κειέηε ησλ: STAT3, EGFR, JAK1 θαη JAK2 ε επψαζε έγηλε γηα 90 ιεπηά. Σα αληηζψκαηα πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ ήηαλ ηα : CIS: 200mg IgG /1ml PBS,0,1% sodium azide, 0,2% gelatin (Santa-Cruz H-80,sc ) Rabbit polyclonal, κνξηαθά βάξε 46,52,66 kda. PIAS1/3: 200mg IgG /1ml PBS,0,1% sodium azide, 0,2% gelatin (Santa-Cruz N-18, sc-8153) Goat polyclonal, κνξηαθφ βάξνο 68kDa. pstat3: Phospho-STAT3 (tyr705) UPSTATE rabbit polyclonal, 100κl, κνξηαθφ βάξνο 80kDa STAT3: STAT3 (tyr705) UPSTATE rabbit polyclonal, 100κl, κνξηαθφ βάξνο 80kDa pegfr: 100κl rabbit antiserum, 0.05% sodium azide, 30% glycerol [UPSTATE, Cell signaling, Anti-phospho-EGFR (Tyr1069)] κνξηαθφ βάξνο 180kDa EGFR: 200mg IgG, 200ml (0.1 M TRIS-Glycine, 0.15M NaCl, 0.05% sodium azide, 30% glycerol [UPSTATE, Cell signaling, Anti- EGFR] Rabbit polyclonal, κνξηαθφ βάξνο 180kDa 77

79 pjak1: phospho-jak1, rabbit polyclonal, 100κl, CHEMICON, κνξηαθφ βάξνο 130kDa. JAK1: Chemicon, 100κl, rabbit polyclonal, κνξηαθφ βάξνο 130kDa. pjak2: Phospho-Jak2 (tyr1007/1008) Cell-signalling technology, 100κl, κνξηαθφ βάξνο 125kDa. Rabbit polyclonal JAK2: Anti-JAK2 (UPSTATE- 100κl) rabbit polyclonal, κνξηαθφ βάξνο 125kDa. β- Tubulin: anti-tubulin beta, mouse monoclonal, (UPSTATE-100κl) κνξηαθφ βάξνο 55kDa. Με ην πέξαο ηνπ ρξφλνπ επψαζεο, νη κεκβξάλεο μεπιέλνληαη ππφ TBS-Tween 1x, 3 θνξέο απφ δέθα ιεπηά. Έπεηηα αθνινπζεί επψαζε κε ην δεπηεξνγελέο αληίζσκα ζηελ επηζπκεηή αξαίσζε κε δηάιπκα blocking, ην νπνίν είλαη ζπλδεδεκέλν κε ην έλδπκν ηεο ππεξνμεηδάζεο (HRP). Ζ πβξηδνπνίεζε πξαγκαηνπνηείηαη ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ, ζε θηλνχκελε πιάθα θαη γηα ρξφλν 60 ιεπηψλ. Αθνινπζνχλ ηξεηο δεθάιεπηεο πιχζεηο κε TBS-Tween 1x. Δλ ζπλερεία, νη κεκβξάλεο ηνπνζεηνχληαη ζε δηεζεηηθφ ραξηί θαη εκπνηίδνληαη γηα έλα ιεπηφ κε δηάιπκα εληζρπκέλεο θσηαχγεηαο ECL (Amersham), πνπ πεξηέρεη H 2 O 2 θαη ινπκηλφιε (louminol-νπζία ηεο θαηεγνξίαο ησλ θπθιηθψλ δηαθπιπδξαδηδίσλ, πνπ έρεη ηελ ηδηφηεηα φηαλ είλαη ελεξγεηαθά νμεηδσκέλε λα κεηαπίπηεη ζηαδηαθά ζε πην ζηαζεξή ελεξγεηαθά θαηάζηαζε κε ηαπηφρξνλε εθπνκπή θσηνλίσλ θηγ. 4), γηα ηελ αλίρλεπζε ηνπ ζήκαηνο. Δικόνα 39: 78

80 Φσηαχγεηα είλαη ε εθπνκπή θσηφο, ε νπνία πξνέξρεηαη απφ ηελ απψιεηα ελέξγεηαο απφ έλα ππφζηξσκα πνπ βξίζθεηαη ζε δηεγεξκέλε κνξθή. πγθεθξηκέλα ζηελ ρεκεηνθσηαχγεηα, ε εθπνκπή βαζίδεηαη ζε κία ρεκηθή αληίδξαζε. ην ζχζηεκα απηφ ην έλδπκν ηεο ππεξνμεηδάζεο θαηαιχεη ζε αιθαιηθφ πεξηβάιινλ ηελ νμείδσζε ηεο ινπκηλφιεο, θάησ απφ ηελ επίδξαζε ηνπ H 2 O 2. πλερίδνληαο ηε κέζνδν, ην ECL απνζηξαγγίδεηαη, νη κεκβξάλεο ηνπνζεηνχληαη ζε δειαηίλε θαη έπεηηα ζε θαζεηίλα εκθάληζεο θαη επάλσ απφ απηέο ελαπνηίζεηαη θσηνγξαθηθφ θηικ (KODAK). Ζ έθζεζε ζην θσηνγξαθηθνχ θηικ δειαδή ε εθπνκπή ησλ θσηνλίσλ δηαξθεί 5-20 ιεπηά θαη γίλεηαη ζε κήθνο θχκαηνο 428nm. Ζ φιε δηεξγαζία ιακβάλεη ρψξα ζε ζθνηεηλφ ζάιακν. Με ην πέξαο ηνπ ρξφλνπ ην θηικ απνκαθξχλεηαη απφ ηελ θαζεηίλα θαη εκβαπηίδεηαη ζηα δηαιχκαηα εκθάληζεο (developer,fixer- KODAK) ΠΡΟΓΗΟΡΗΜΟ ΣΖ ΤΓΚΔΝΣΡΧΖ ΣΟΤ RNA: Γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ ηεο ζπγθέληξσζεο RNA ε αθφινπζε δηαδηθαζία ιακβάλεη ρψξα. Αξρηθά, ζε έλα eppendorf ηνπνζεηείηαη 1 ml DEPC-Ζ 2 Ο θαη 1 ι RNA. Γηα ηελ κέηξεζε ρξεζηκνπνηνχληαη θπςειίδεο ραιαδία θσηφκεηξνπ. Πξηλ απφ κέηξεζε θάζε δείγκαηνο, ρξεζηκνπνηείηαη δηο απεζηαγκέλν λεξφ αληί γηα δείγκα ζηελ θπςειίδα, σο ηπθιφ γηα ην κεδεληζκφ ηνπ θσηφκεηξνπ. ηε ζπλέρεηα, ζε κηα δεχηεξε θπςειίδα, ηνπνζεηείηε ην δείγκα RNA ζε αξαίσζε 1:1000. Έπεηηα θάζε δείγκα θσηνκεηξείηαη ζε U.V., ζε δπν δηαθνξεηηθά κήθε θχκαηνο, ζηα 260 nm εθεί απνξξνθνχληαη ηα λνπθιετθά νμέα θαη ζηα 280 nm, πνπ απνξξνθνχληαη νη πξσηεΐλεο. Ζ ζπγθέληξσζε ηνπ RNA ππνινγίδεηαη απφ ηνλ ηχπν: σγκένηρωζη RNA = Optimal. Density. 260nm x 40 x 1000 (αξαίσζε) Ζ ζπγθέληξσζε ππνινγίδεηαη ζε nanograms/microlitre. Ο ιφγνο ηεο νπηηθήο απνξξφθεζεο ζηα 260 nm σο πξνο ηελ νπηηθή απνξξφθεζε ζηα 280 nm είλαη έλαο δείθηεο πνπ νξίδεη ηελ θαζαξφηεηα ηνπ δείγκαηνο. Γηα λα ζεσξήζνπκε φηη ην RNA καο είλαη αξθεηά θαζαξφ, ζα πξέπεη ν παξαπάλσ ιφγνο λα είλαη > 1,8. 79

81 2.13 ΤΝΘΔΖ CDNA ΑΠΟ RNA ΜΔ ΑΝΣΗΣΡΟΦΖ ΜΔΣΑΓΡΑΦΖ (RT-PCR): Ζ εθαξκνγή ηεο Reverse Transcriptase-PCR, έρεη ζθνπφ ηε κειέηε ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο, δεδνκέλνπ φηη επηηξέπεη ηελ ηαρεία αλάιπζε ηνπ αγγειηνθφξνπ RNA (mrna). Πξσηαξρηθφ ζηάδην ηεο δηαδηθαζίαο απηήο είλαη, αθνχ ην RNA, έρεη απνκνλσζεί απφ ηα θχηηαξα, λα κεηαηξαπεί ζε ζπκπιεξσκαηηθφ DNA (cdna) κε ηε ρξήζε, ελφο ελδχκνπ πνπ νλνκάδεηαη αληίζηξνθε κεηαγξαθάζε. Σν ζπγθεθξηκέλν έλδπκν απαηηεί δίθισλν DNA γηα ηελ παξαγσγή cdna. Απηφ επηηπγράλεηαη κε ηνπο εηδηθνχο εθθηλεηέο πνπ ζα πβξηδηζηνχλ, κε ην ζπκπιεξσκαηηθφ θνκκάηη ηνπ mrna, ππφ θαηάιιειεο ζπλζήθεο. ηε ζπλέρεηα ην cdna πνιιαπιαζηάδεηαη, κε ηε ρξήζε ηεο DNA πνιπκεξάζεο θαη ησλ θαηάιιεισλ εθθηλεηψλ. Ζ DNA πνιπκεξάζε είλαη έλα έλδπκν πνπ πξνάγεη, ηελ πξνζζήθε λνπθιενηηδίσλ (dntps), θαηαιχνληαο ηε ζχλδεζε ηνπο ζην πνιπκεξέο ηνπ DNA. Βαζηθφ ζηνηρείν είλαη φηη ηα dntps ηνπνζεηνχληαη απεπζείαο ζην εθκαγείν DNA πνπ ήδε ππάξρεη. πγθεθξηκέλα, ε δηαδηθαζία πνπ αθνινπζήζεθε γηα ηελ δεκηνπξγία ηνπ cdna είλαη ε εμήο: ε PCR eppendorf πνπ βξίζθνληαη ζε πάγν πξνζηίζεληαη: 8ι 5Υ First strand buffer, 5ι 0,1Μ DTT, 1ι 25 mm dntp mix, 0,25ι ηπραίνη εθθηλεηέο (3κg/ι), 0,25ι RNasin Ribonuclease inhibitor (30U/ι), RNA ψζηε ζε ηειηθφ φγθν 50ι λα έρεη ζπγθέληξσζε 1κg θαη depc H 2 O γηα ηε ζπκπιήξσζε φγθνπ κέρξη ηα 40ι. Σα παξαπάλσ αληηδξαζηήξηα είλαη ηεο εηαηξείαο INVITROGEN (SuperScript. III One- Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase). ηελ ζπλέρεηα επσάδνπκε ηα δείγκαηα ζηνπο 70 ν C γηα 3 ιεπηά θαη κεηαθέξνπκε ζε πάγν μαλά. ηε ζπλέρεηα πξνζηίζεληαη 7ι depc H 2 O, 2ι 5Υ First strand buffer θαη 1ι Superscript Reverse Transcriptase (200U/ι) ζε θάζε eppendorf. Αθνινπζεί ε επψαζε ηνπο ζηνπο 37 ν C γηα 60 min θαη ζηνπο 70 ν C γηα 1 min. Σν cdna πνπ παξάρζεθε απνζεθεχεηαη ζηνπο -20 ν C PCR ΑΝΑΛΤΖ: Ζ αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο (PCR) είλαη κία ηερληθή Μνξηαθήο Βηνινγίαο πνπ ζθνπφ ηεο είλαη ε απνκφλσζε θαη ν πνιιαπιαζηαζκφο κηαο αιιεινπρίαο DNA, κέζσ ελδπκηθήο αλαπαξαγσγήο ηνπ ρσξίο ηε ρξήζε δσληαλψλ κηθξννξγαληζκψλ φπσο ε E. coli ή νη δχκεο. Ζ PCR είλαη κία in vitro κέζνδνο. πγθεθξηκέλα DNA ηκήκαηα κπνξνχλ λα θισλνπνηεζνχλ ζε έλα δνθηκαζηηθφ 80

82 ζσιήλα (απνπζία δσληαλψλ θπηηάξσλ) κε ηε ρξήζε ηεο αιπζηδσηήο αληίδξαζεο πνιπκεξάζεο (PCR). Με ηελ PCR κηα ζπγθεθξηκέλε πεξηνρή ηνπ γνληδηψκαηνο πνιιαπιαζηάδεηε κέρξη θαη δηζεθαηνκκχξηα θνξέο, δεδνκέλνπ φηη είλαη γλσζηή ε αιιεινπρία ησλ λνπθιενηηδίσλ ηνπ. Ζ αιιεινπρία ηνπ γνληδίνπ είλαη απαξαίηεηε γηα ην ζρεδηαζκφ ησλ ζπλζεηηθψλ νιηγνλνπθιενηηδίσλ, πνπ ην θάζε έλα είλαη ζπκπιεξσκαηηθφ κε κία απφ ηηο αιπζίδεο ηνπ δίθισλνπ DNA. Σα νιηγνλνπθιενηίδηα πνπ ζα ρξεζηκνπνηεζνχλ σο εθθηλεηέο πξέπεη λα είλαη ηθαλά λα δεζκεχνληαη ζε ζέζεηο αληίζεηεο απφ ηελ αιιεινπρία πνπ πξφθεηηαη λα εληζρπζεί, κε άιια ιφγηα θαζνξίδνπλ ηα άθξα ηνπ DNA ηκήκαηνο πνπ πξφθεηηαη λα κειεηεζεί. Ζ ηερληθή βαζίδεηαη ζηνλ επαλαιακβαλφκελν θχθιν ηξηψλ αληηδξάζεσλ, νη νπνίεο δηαθέξνπλ θαηά ηε ζεξκνθξαζία θαη ην ρξφλν. Ο θάζε θχθινο απνηειείηαη απφ ηα ζηάδηα πνπ αθνινπζνχλ. Πξψηνλ, ιακβάλεη ρψξα ε απνδηάηαμε ηνπ DNA. ην ζηάδην απηφ ηνπ θχθινπ, απνδηαηάζζεηαη ε αιιεινπρία απμάλνληαο ηε ζεξκνθξαζία ηεο αληίδξαζεο κεηαμχ 92 θαη 96 ν C. Λφγσ απηνχ νη ζπκπιεξσκαηηθνί θιψλνη ηνπ DNA απνκαθξχλνληαη. Σν δεχηεξν ζηάδην απνηειεί ηνλ πβξηδηζκφ ησλ εθθηλεηψλ κε ηελ αιιεινπρία πνπ κειεηάκε. πγθεθξηκέλα, απηφ ζπκβαίλεη θαζψο ε ζεξκνθξαζία ηεο αληίδξαζεο κεηψλεηαη θαη παίξλεη ηηκέο απφ 50 έσο 65 ν C. Οη εθθηλεηέο είλαη ζπλζεηηθά νιηγνλνπθιενηίδηα, κε κήθνο βάζεηο θαη θαζνξίδνπλ ηελ αιιεινπρία ηνπ DNA πξφθεηηαη λα πνιιαπιαζηαζηεί. Απηά ηα νιηγνλνπθιενηίδηα, απνηεινχληαη απφ κε ζπκπιεξσκαηηθέο βάζεηο ψζηε λα απνθεχγεηαη ν πβξηδηζκφο κεηαμχ ηνπο αιιά θαη κε ηηο ζπκπιεξσκαηηθέο αιιεινπρίεο ηνπ DNA. ην ηξίην θαη ηειηθφ ζηάδην ηνπ θχθινπ γίλεηαη ε ζχλζεζε ησλ ζπκπιεξσκαηηθψλ θιψλσλ ηνπ DNA κε επέθηαζε ηνπ 3 νπ άθξνπ ησλ εθθηλεηψλ κε ηελ βνήζεηα ηεο Taq πνιπκεξάζεο θαη ζε ζεξκνθξαζία 72 ν C. H Taq πνιπκεξάζε, πξνέξρεηαη απφ έλα βαθηήξην (Thermus aquaticus), ην νπνίν είλαη αλζεθηηθφ ζε πνιχ πςειέο ζεξκνθξαζίεο. Σν έλδπκν απηφ ζπλζέηεη 2000 λνπθιενηίδηα ην ιεπηφ, ν ρξφλνο πνπ ρξεηάδεηαη γηα ηελ αληηγξαθή ηνπ DNA πνπ εξεπλνχκε, εμαξηάηαη απφ ην κήθνο ηνπ πξντφληνο ηεο PCR. Σα παξαπάλσ ζηάδηα επαλαιακβάλνληαη πνιιέο θνξέο (30-40 θχθινη) θαη θαηαιήγνπλ ζηε δεκηνπξγία πεξηζζφηεξσλ απφ 1 δηζεθαηνκκχξην θιψλνπο ηνπ αξρηθνχ ηκήκαηνο DNA. Όζν αλαθνξά ηε ζπγθεθξηκέλε κειέηε, ην cdna πνπ δεκηνπξγήζεθε κε ηνλ παξαπάλσ ηξφπν, (αληίζηξνθε κεηαγξαθή RNA) ρξεζηκνπνηήζεθε γηα ηνλ έιεγρν ηνπ επηπέδνπ ηεο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ πνπ εμεηάδνπκε. Οη ζπλζήθεο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ είλαη νη παξαθάησ: 81

83 Πίνακαρ 3: ΓΟΝΙΓΙΟ PCR dntps Sense Antisense MgCl 2 DMSO Taqpolymerase H 2O cdna Buffer Primer Primer CIS 5ι 0,4ι 0,5ι 0,5ι 1,5ι 0,5ι 0,5ι 36,1ι 5ι PIAS 5ι 0,4ι 0,5ι 0,5ι 1ι 0,5ι 0,5ι 36,6ι 5ι EGFR 5ι 0,4ι 0,5ι 0,5ι 1,5ι 0,5ι 0,5ι 36,1ι 5ι GHR 5ι 0,4ι 0,5ι 0,5ι 1,5ι 0,5ι 0,5ι 36,1ι 5ι b-actin 5ι 0,4ι 0,5ι 0,5ι 1,5ι 0,5ι 0,5ι 36,1ι 5ι Οη PCR αληηδξάζεηο πξαγκαηνπνηήζεθαλ ζε ζεξκηθφ θπθινπνηεηή (RTC-2000 Peltier Thermal Cycler) ζχκθσλα κε ην παξαθάησ πξφγξακκα: 95 0 C γηα 1 ιεπηφ (αξρηθή απνδηάηαμε) 94 0 C γηα 30 δεπηεξφιεπηα (απνδηάηαμε)? 0 C γηα 45 δεπηεξφιεπηα (πβξηδνπνίεζε ησλ εθθηλεηψλ) 72 0 C γηα 1 ιεπηφ (επηκήθπλζε ηεο αιπζίδαο) 35 θχθινη επαλάιεςε ησλ βεκάησλ 2 έσο C γηα 20 ιεπηά (ζπκπιήξσζε κνλφθισλσλ άθξσλ) θαη 4 0 C νινθιήξσζε ηεο δηαδηθαζίαο. Ζ ζεξκνθξαζία πβξηδνπνίεζεο θαζψο θαη ε αιιεινπρία ησλ εθάζηνηε εθθηλεηψλ θαίλνληαη ζηνλ παξαθάησ πίλαθα. ΓΟΝΙΓΙΟ ΑΛΛΗΛΟΤΥΙΑ Σm ΤΒΡΙΓΟΠΟΙΗΗ CIS-sense 56 o C CIS-antisense PIAS-sense GATTGGGAAGGAGGGCACAGG 58 o C PIAS-antisense ACTTCCCCTGCCTCCTACTCC EGFR-sense (400bp) TGAAGGAGCTGCCCATGAGA 54 o C EGFR-antisense GGGCAGGTGTCCTTGCACGT GHR-sense ACACTCAAGAATGGACTCAAG 50 o C GHR-antisense TGTAAATTGGCTCATCTGAG β-actin sense AAGGCCAACCGTGAAAAGATGACC (400bp) β-actin antisense ACCGCTCGTTGCCAATAGTGATGA 82

84 2.15 ΑΝΑΛΤΖ ΣΧΝ ΠΡΟΨΟΝΣΧΝ ΣΖ PCR Δ ΠΖΚΣΧΜΑ ΑΓΑΡΟΕΖ: Ζ αμηνιφγεζε ησλ πξντφλησλ πνπ πξνθχπηνπλ απφ ηελ δηαδηθαζία ηεο ΡCR, γίλεηαη ζε πεθηή αγαξφδεο ή αθξπιακηδίνπ. Ζ πεθηή αγαξφδεο είλαη απηή πνπ ρξεζηκνπνηείηαη ζην δηαρσξηζκφ ηκεκάησλ DNA, κήθνπο απφ ιίγεο εθαηνληάδεο έσο βάζεηο. Σν ηκήκαηα DNA γίλνληαη νξαηά κε ηε ρξήζε ηνπ βξσκηνχρνπ αηζηδίνπ. Σν κήθνο ηνπ θάζε πξντφληνο ζπγθξίλεηαη ηαπηφρξνλα κε ην κήθνο γλσζηνχ κάξηπξα (DNA ladder) ν νπνίνο ειεθηξνθνξείηαη ηαπηφρξνλα. Ζ δηαδηθαζία πεξηιακβάλεη ηα εμήο. ε κία θσληθή θηάιε πξνζηίζεληαη 1,4gr αγαξφδεο (INVITROGEN) θαη 140ml δηαιχκαηνο TBE 1X (TBE 10x- ζε αξρηθή πνζφηεηα απηνληζκέλνπ λεξνχ πξνζηίζεληαη 108gr Trizma Base, 55gr βνξηθφ νμχ, 5,845gr EDTA, θαη αθνινπζεί νγθνκέηξεζε ζε ηειηθφ φγθν 1 ιίηξν). Έπεηηα, ε θηάιε ηνπνζεηήζεθε ζε θνχξλν κηθξνθπκάησλ ( 1 ιεπηφ) ζηε κέγηζηε ζεξκνθξαζία, έσο φηνπ δηαιπζεί ε αγαξφδε. Όηαλ ε ζεξκνθξαζία ηνπ δηαιχκαηνο θαηέβεη ζηνπο C πξνζηίζεληαη κεξηθέο ζηαγφλεο ππθλνχ δηαιχκαηνο βξσκηνχρνπ αηζηδίνπ (ΔtBr). Σν βξσκηνχρν αηζίδην έρεη ηελ ηδηφηεηα λα ζπκπιέθεηαη κε ηηο βάζεηο ηνπ DNA θαη λα θσζθνξίδεη φηαλ απηφ εθηεζεί ζε U.V. ζεκαηνδνηψληαο ηα δείγκαηα ζηελ πεθηή αγαξφδεο. ηελ ζπλέρεηα ε κεραλή ζπλαξκνινγείηαη θαη ην δηάιπκα εηζάγεηαη ζε θαινχπη ειεθηξνθφξεζεο, αθνχ πξψηα έρεη ηνπνζεηεζεί ε θαηάιιειε κήηξα ζηε ζπζθεπή, γηα λα ζρεκαηηζηνχλ ηα θξεάηηα, ζηα νπνία κέζα ζα εηζαρζνχλ ηα δείγκαηα. Αθνχ πνιπκεξηζηεί ην πήθησκα, ε κήηξα απνκαθξχλεηαη θαη ζηε ζπζθεπή πξνζηίζεηαη ξπζκηζηηθφ δηάιπκα TBE 1X, ηφζν ψζηε λα θαιχπηεηαη πιήξσο ε επηθάλεηα ηεο πεθηήο. ηα ζσιελάξηα eppendorfs πνπ πεξηέρνπλ 50ι ηειηθνχ πξντφληνο απφ ηελ PCR, πξνζηίζεληαη 12ι loading buffer. Σν loading buffer πεξηέρεη: 0,25w/v bromphenol blue, 0,25w/v xylene cyanole FF, 40%w/v sucrose, 0,1M EDTA, 0,5%w/v SDS. Καηφπηλ, ηα δείγκαηα εηζάγνληαη ζην πήθησκα θαη ειεθηξνθνξνχληαη εθαξκφδνληαο ζηαζεξή ηάζε ζηε ζπζθεπή 100Volt. Ζ πεθηή αγαξφδεο ηνπνζεηείηαη κε θαηεχζπλζε απφ ηνλ αξλεηηθφ πξνο ην ζεηηθφ πφιν, ιφγσ ηνπ φηη απηή είλαη ε πνξεία ηεο θίλεζεο ηνπ DNA. Δλ αληηζέζεη, ην βξσκηνχρν αηζίδην θηλείηαη απφ ην ζεηηθφ πξνο ηνλ αξλεηηθφ πφιν. 83

85 Ζ πνξεία ηεο δηαδηθαζίεο ηεο ειεθηξνθφξεζεο παξαθνινπζείηαη απφ ην κέησπν ηεο ρξσζηηθήο πνπ πεξηέρεηαη ζην loading buffer. Όηαλ απηφ πιεζηάδεη ζην ηέινο ηνπ πεθηψκαηνο, ε ειεθηξνθφξεζε δηαθφπηεηαη θαη ην πήθησκα παξαηεξείηαη θάησ απφ ππεξηψδε αθηηλνβνιία. Ζ ηαπηνπνίεζε ηνπ κεγέζνπο ηνπ πξντφληνο ηεο PCR γίλεηαη ζε ζχγθξηζε κε ην κάξηπξα. πγθεθξηκέλα ρξεζηκνπνηήζεθε κάξηπξαο κνξηαθνχ βάξνπο (1kb DNA ladder, INVITROGEN) REAL-TIME PCR: Γείγκαηα RNA ζηάιζεθαλ ζε εμσηεξηθφ ζπλεξγάηε (BIOGENOMIKA) γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ ησλ επηπέδσλ έθθξαζεο ηνπ γνληδίνπ IGF-1 ζε επίπεδν mrna ΠΡΟΓΗΟΡΗΜΟ ΤΓΚΔΝΣΡΧΖ ΠΡΧΣΔΨΝΖ: Βαζηθή πξνυπφζεζε πξηλ ηελ δηεμαγσγή νπνηαζδήπνηε ηερληθήο είλαη ε δεκηνπξγία ησλ θαηάιιεισλ πξνυπνζέζεσλ, νχησο ψζηε λα ειαρηζηνπνηνχληαη νη απνθιίζεηο θαη ηα απνηειέζκαηα λα είλαη επαλαιακβαλφκελα θαη αθξηβή. Όζν αλαθνξά ηηο ηερληθέο αλίρλεπζεο πξσηετλψλ, είλαη ζεκαληηθφ λα γλσξίδνπκε ηελ πνζφηεηα ηεο πξσηεΐλεο πνπ εκπεξηέρεηαη ζε θάζε eppendorf. Με ην λα πξνζδηνξίδεηαη ε ζπγθέληξσζε ηεο πξσηεΐλεο ηνπ δείγκαηνο, μέξνπκε θαη πφζε πνζφηεηα λα θνξηψζνπκε απφ απηφ ζηελ ειεθηξνθφξεζε, ψζηε λα ηθαλνπνηήζνπκε ηα δηαθξηηηθά φξηα ηεο κεζφδνπ. Ζ δηαδηθαζία πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε γηα ην ιφγσ απηφ θαη ζα πεξηγξαθεί ζηε ζπλέρεηα. Λφγσ ηεο ρακειήο ζρεηηθά επαηζζεζίαο ηεο απαηηεί ε πνζφηεηά ηεο θάζε πξσηεΐλεο λα είλαη ην ιηγφηεξν 50 κg ψζηε λα είλαη δπλαηφλ λα αληρλεπζεί. Ο πξνζδηνξηζκφο ηεο ζπγθέληξσζεο ησλ πξσηετλψλ πξαγκαηνπνηήζεθε κε ηελ ηερληθή Bradford. Ζ ρξσζηηθή Bradford ζπλδέεηαη κε θάζε πξσηεΐλε ζε δηαθνξεηηθφ βαζκφ, φκσο βνεζάεη πνιχ ην γεγνλφο φηη ε ζπγθεθξηκέλε αληίδξαζε είλαη πνζνηηθή. Έηζη καο επηηξέπεηαη κε κηα απιή θσηνκέηξεζε λα πιεξνθνξνχκαζηε ηε ζπγθέληξσζε ηνπ θάζε δείγκαηνο. Ζ δηαδηθαζία πνπ αθνινπζήζεθε ήηαλ ε εμήο : ζε ζσιελάξην eppendorf πξνζηίζεηαη 1 ml αληηδξαζηεξίνπ Bradford (αληηδξαζηήξην-ρξσζηηθήο Bradford ηεο 84

86 εηαηξίαο Fluca: αλακηγλχνληαη 4 κέξε απηνληζκέλν λεξφ κε έλα κέξνο ηνπ αληηδξαζηεξίνπ) θαη 2κl απφ ην eppendorf πνπ πεξηέρεη ην δείγκα ηεο πξσηεΐλεο. Έπεηηα πξνεηνηκάδνληαη άιια 5 eppendorfs ζηα νπνία πξνζηίζεληαη αληίζηνηρα 1, 2, 4, 8, 16 κg/ml πξφηππνπ δηαιχκαηνο ΒSA (Bovine serum albumin- ην πξφηππν δηάιπκα BSA παξαζθεπάδεηαη σο εμήο, ζε 1ml 2x lysis buffer δηαιχνπκε, 1mg BSA, Sigma). Σα 5 απηά eppendorfs ζα ρξεζηκνπνηεζνχλ γηα ηελ θαηαζθεπή κηαο πξφηππεο θακπχιεο, κε βάζε ηεο νπνίαο ζα πξνζδηνξηζηεί ε ζπγθέληξσζε ζην θάζε δείγκα καο. Αθνινχζσο ζε θάζε eppendorf ηεο πξφηππεο θακπχιεο πξνζηίζεληαη θαη 2 κl - 2x lysis buffer. ηε ζπλέρεηα παξαζθεπάδνληαη 2 ηπθιά ηα νπνία πεξηέρνπλ κφλν αληηδξαζηήξην ηεο Bradford, θαη ρξεζηκνπνηνχληαη σο ηηκή αλαθνξάο γηα ην θσηφκεηξν. Σα δηαιχκαηα ησλ ηπθιψλ, ηεο πξφηππεο θακπχιεο θαζψο θαη ησλ δεηγκάησλ αλαθηλνχληαη θαη θνξηψλνληαη ζε πιαζηηθέο θπβέηεο ηνπ 1ml. Οη θπβέηεο απηέο ηνπνζεηνχληαη ζην θσηφκεηξν (ζε κήθνο θχκαηνο 595nm, νξαηφ θσο) κε ηελ αθφινπζε ζεηξά: ηπθιά δηαιχκαηα, δηαιχκαηα πξφηππεο θακπχιεο, θαη δηαιχκαηα δεηγκάησλ. Σειηθά ην θσηφκεηξν ζηέιλεη ηα δεδνκέλα πνπ πξνέθπςαλ ζε ππνινγηζηή ν νπνίνο κέζσ εηδηθνχ πξνγξάκκαηνο ππνινγίδεη θαη ηε ζπγθέληξσζε ηεο πξσηεΐλεο ζην θάζε δείγκα ΑΝΟΟΚΑΣΑΚΡΖΜΝΗΖ (IMMUNOPRECIPITATION): Ζ κειέηε ησλ επηπέδσλ έθθξαζεο ηνπ αλαζηνιέα PIAS ζε πξσηετληθφ επίπεδν πξαγκαηνπνηήζεθε κε ηε κέζνδν ηεο αλνζνθαηαθξχκληζεο. Ζ αλνζνθαηαθξχκληζε είλαη κία ηερληθή ζηελ νπνία έλα αληηγφλν θαηαθξεκλίδεηαη απφ έλα δηάιπκα κε ηε ρξήζε ελφο αληηζψκαηνο ν νπνίν είλαη εηδηθφ γηα ην ζπγθεθξηκέλν αληηγφλν. Ζ δηαδηθαζία απηή κπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί είηε γηα λα εκπινπηίζεη κηα πξσηεΐλε, ε νπνία δελ έρεη πςειφ βαζκφ θαζαξφηεηαο ή γηα λα ζπγθεληξψζεη κία πξσηεΐλε πνπ ην επίπεδν αθζνλίαο ηεο είλαη ρακειφ. 85

87 Δικόνα 40: Σα βήκαηα πνπ αθνινπζήζεθαλ γηα ηελ επίηεπμε ηεο δηαδηθαζίαο απηήο είλαη ηα παξαθάησ. Αξρηθά, 5γ ππξεληθψλ εθρπιηζκάησλ ηνπνζεηήζεθαλ ζε ζσιελάθη eppendorf καδί κε 5ι αληηζψκαηνο PIAS. ηε ζπλέρεηα ηα δείγκαηα ηνπνζεηήζεθαλ ζε πεξηζηξεθφκελε ξφδα θαη επσάζηεθαλ κέζα ςπρξφ ζάιακν γηα 8 ψξεο. Έπεηηα, 25ι protein sepharose A beads (UPSTATE) πξνζηέζεθαλ ζηα ζσιελάθηα θαη φγθνο ζπκπιεξψζεθε έσο ηα 500ι κε RIPA buffer (lysis buffer + 0,1% δηάιπκα πξσηετληθψλ αλαζηνιέσλ, 0,1% δηάιπκα 1mM DTT, 0,2% δηαιχκαηνο 500mM PMSF θαη 2.5% δηαιχκαηνο DOC). Όζν αλαθνξά ηελ παξαζθεπή ηνπ lysis buffer: ζε αξρηθή πνζφηεηα απηνληζκέλνπ λεξνχ πξνζηέζεθαλ 15ml δηαιχκαηνο NaCl (1M), 1ml δηαιχκαηνο TritonX-100, 2ml δηαιχκαηνο Tris-HCl (1M) θαη 1ml δηαιχκαηνο EDTA (500mM), ην δηάιπκα ζπκπιεξψλεηαη ζηα 100ml κε απηνληζκέλν λεξφ. Καηφπηλ ηα δείγκαηα επσάδνληαη εθ λένπ ζηνλ ςπρξφ ζάιακν γηα αθφκα 12 ψξεο. Με ην πέξαο ηνπ απαηηνχκελνπ ρξφλνπ, ηα δείγκαηα θπγνθεληξνχληαη γηα κεξηθά δεπηεξφιεπηα ζε g ζε ςπρνκέλε θπγφθεληξν. Με απηφ ηνλ ηξφπν ην ζχκπινθν ζθαηξίδηα-πξσηεΐλε-αληίζσκα θαηαθξεκλίδεηαη ζηνλ ππζκέλα ηνπ eppendorf, ελψ ην ππεξθείκελν δηάιπκα αθαηξείηαη. ηε ζπλέρεηα, αθνινπζεί ε επαλαδηάιπζε ηνπ ηδήκαηνο απηνχ, ζε 500ι RIPA buffer θαη θπγνθέληξεζε εθ λένπ. Ζ δηαδηθαζία απηή ρξεηάδεηαη λα επαλαιεθζεί 3 θνξέο. Σειηθά ην ίδεκα δηαιχεηαη ζε 50ι δηαιχκαηνο 2x Sample buffer + 5% β-κεξθαπηναηζαλφιε θαη ηα δείγκαηα είλαη έηνηκα λα αθνινπζήζνπλ ηηο γλσζηέο δηαδηθαζίεο ειεθηξνθφξεζεο, ειεθηξνκεηαθνξάο θαη αλνζναλίρλεπζεο. Οη κεκβξάλεο ληηξνθπηηαξίλεο πνπ πξνθχπηνπλ κεηά ην πέξαο ηεο ειεθηξνκεηαθνξάο, επσάδνληαη κε ην ίδην αληίζσκα πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε ζην ζηάδην ηεο αξρηθήο επψαζεο ησλ δεηγκάησλ. 86

88 2.19 ΑΝΟΟΤΝΚΑΣΑΚΡΖΜΝΗΖ (CO- IMMUNOPRECIPITATION): ηφρνο ηεο δηαδηθαζία ηεο αλνζνζπλθαηαθξήκληζεο είλαη ην λα πξνζδηνξίδεη θαη λα αληρλεχεη πξσηεΐλεο πνπ βξίζθνληαη ζε αιιειεπίδξαζε ή νιφθιεξα πξσηετληθά ζχκπινθα πνπ βξίζθνληαη ζηα εθρπιίζκαηα πνπ έρνπλ απνκνλσζεί.(103) ηελ ζπγθεθξηκέλε κειέηε ειέγρζεθε ε πηζαλή αιιειεπίδξαζε ηνπ κνξίνπ JAK2 κε ηνλ EGFR. Ο έιεγρνο απηφο αθνξνχζε ηφζν ηελ βαζηθή φζν θαη ηελ θσζθνξπιησκέλε κνξθή ησλ δχν απηψλ κνξίσλ. Δλ αληηζέζεη κε ηελ γλσζηή δηαδηθαζία ζπιινγήο ησλ νιηθψλ πξσηετληθψλ εθρπιηζκάησλ ζε δηάιπκα 2x Sample buffer, ζε απηή ηελ πεξίπησζε ηα δείγκαηα ζπιιέγρζεζαλ ζε RIPA buffer. Αλαιπηηθφηεξα, χζηεξα απφ ηελ απνκάθξπλζε ηνπ ζξεπηηθνχ πιηθνχ λεζηείαο θαη ηηο 3 ζπλερείο πιχζεηο κε δηάιπκα 1x PBS ηα ηξηβιία κε ηα θχηηαξα, επσάζηεθαλ κε 150ι RIPA buffer γηα 20 ιεπηά ζε πάγν. ηε ζπλέρεηα, ην ελαηψξεκα ζπγθεληξψζεθε ζε eppendorf κε ηε ρξήζε απνζηεηξσκέλεο μχζηξαο θαη αθνινχζεζε ε θπγνθέληξεζε ηνπο γηα 5 ιεπηά ζηνπο 4 ν C ζε κέγηζηε ηαρχηεηα. Σειηθά, ην ππεξθείκελν δηάιπκα απνζεθεχηεθε γηα κειινληηθή ρξήζε ηνπ. ην ζεκείν απηφ αμίδεη λα αλαθεξζεί φηη ηα θχηηαξα είραλ επαρζεί κε 200ng/ml απμεηηθήο νξκφλεο ζε ρξφλνπο 20, 40 θαη 60 ιεπηά, ελψ σο καξηπξάο ρξεζηκνπνηήζεθαλ κε επαγφκελα θχηηαξα. Καηφπηλ, ε δηαδηθαζία πνπ αθνινχζεζε, είλαη ε ίδηα κε απηή ηεο αλνζνθαηαθξήκληζεο, εμαηξείηαη ην γεγνλφο φηη ζην ζηάδην ηεο αλνζναλίρλεπζεο ρξεζηκνπνηήζεθε έλαο αξηζκφο δηαθνξεηηθψλ αληηζσκάησλ (pjak2, JAK2) απφ εθείλνλ κε ην νπνίν αξρηθά είραλ επσαζηεί ηα νιηθά πξσηετληθά εθρπιίζκαηα (pegfr, EGFR). Με ηνλ ηξφπν απηφ, ειέγρεηαη θάζε πηζαλή δεκηνπξγία ζπκπιφθνπ κεηαμχ ησλ πξναλαθεξζέλησλ κνξίσλ. 87

89 3. ΚΟΠΟ Ο βαζηθφο ζθνπφο ηεο κειέηεο απηήο ήηαλ λα ειέγμεη ηνπο κνξηαθνχο κεραληζκνχο ειέγρνπ ηεο κεηάδνζεο ηνπ ζήκαηνο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζε παηδηά κε ζνβαξή αλεπάξθεηα ζηελ αχμεζε. Οη θχξηνη ζηφρνη ηνπ εξεπλεηηθνχ έξγνπ δηαθξίλνληαη ζε ηξία κέξε. Αξρηθά, κειεηήζεθε ην ζεκαηνδνηηθφ κνλνπάηη ηεο αξλεηηθήο ξχζκηζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζε θαιιηεξγεκέλνπο ηλνβιάζηεο παηδηψλ κε ηελ αζζέλεηα Growth Hormone Transduction Defect (GHTD) θαη ζε θπζηνινγηθά παηδηά. Σν δεχηεξν κέξνο ηεο έξεπλαο αθνξνχζε ηελ κειέηε ηεο πηζαλήο ζπζρέηηζεο ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο GH θαη ηνπ Δπηδεξκηθνχ Απμεηηθνχ Παξάγνληα (EGF) ζηα παηδηά απηά. Με ηελ νινθιήξσζε θαη ηνπ δεχηεξνπ κέξνπο, ε κειέηε ζπλερίζηεθε ζηελ δηεξεχλεζε πηζαλήο ζπζρέηηζεο ησλ ζηεξνεηδψλ ηνπ θχιινπ κε ηε ζεκαηνδφηεζε ηεο GH ζε έλα παηδί κε GHTD. (78) 88

90 4 ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ 4.1 ΔΠΗΚΟΠΖΖ: Αξρηθά, 11 παηδηά επηιέρζεθαλ απφ έλα κεγάιν αξηζκφ απφ ηελ παηδνελδνθξηλνινγηθή κνλάδα ηνπ Παλεπηζηεκηαθνχ Ννζνθνκείνπ Παηξψλ, ηα νπνία χζηεξα απφ θιηληθέο κειέηεο δηαπηζηψζεθε φηη είραλ αλεπάξθεηα ζηελ αλάπηπμή ηνπο. Χο κάξηπξεο ρξεζηκνπνηήζεθαλ άηνκα ηα νπνία δελ παξνπζίαδαλ δπζιεηηνπξγία ζηελ αχμεζε ηνπο. Βηνςίεο νχισλ εμήρζεζαλ απφ απηά γηα ηελ παξαγσγή θπηηάξσλ (πξσηνγελέο πιηθφ), νη νπνίεο θαη ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα λα νινθιεξσζεί ε ζπγθεθξηκέλε έξεπλα. Αλαιπηηθφηεξα, νη ηλνβιάζηεο πνπ παξάρζεθαλ απφ ηηο βηνςίεο απηέο ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα ησλ έιεγρν ησλ κνξίσλ πνπ εμεηάδνπκε ηφζν ζε θπηηαξηθφ φζν θαη ζε κνξηαθφ επίπεδν. Σν γεληθφ πιάλν ζπκπεξηιάκβαλε ηελ απνκφλσζε νιηθψλ, ππξεληθψλ πξσηετληθψλ εθρπιηζκάησλ θαζψο θαη RNA, ηελ αλνζναλίρλεπζε ησλ αλαζηνιέσλ ηεο GH ζε πξσηετληθφ θαη κνξηαθφ επίπεδν, ηελ πηζαλφηεηα cross talking κε ηνλ EGF θαη ηελ επίδξαζε ησλ ζηεξνεηδψλ ηνπ θχιινπ ζην κνλνπάηη ηεο GH θαη ζπγθεθξηκέλα ηεο 17βνηζηξαδηφιεο. Σα βήκαηα πνπ αθνινπζήζεθαλ γηα ηελ δηεθπεξαίσζε ηεο έξεπλαο θαζψο θαη ηα απνηειέζκαηα πνπ απνθνκίζηεθαλ παξνπζηάδνληαη κε ιεπηνκέξεηα παξαθάησ. 89

91 ΠΡΟΖΓΟΤΜΔΝΔ ΔΡΔΤΝΔ ΣΟΤ ΔΡΓΑΣΖΡΗΟΤ Σν αξρηθφ ζηάδην ηεο έξεπλαο αθνξνχζε ηελ επηινγή ησλ αηφκσλ ηα νπνία παξνπζίαδαλ ηελ αζζέλεηα GHTD. 11 άηνκα επηιέρζεθαλ απφ έλα κεγάιν αξηζκφ παηδηψλ κε βάζε ηελ θιηληθή ηνπο εηθφλα. ηελ ζπλέρεηα ηα παηδηά απηά ππνβιήζεθαλ ζηηο θαηάιιειεο θιηληθέο εμεηάζεηο, νχησο ψζηε λα απνθιεηζηνχλ νπνηεζδήπνηε άιιεο πηζαλέο αηηίεο γηα ην κε-θπζηνινγηθφ ηνπο αλάζηεκα. Απφ ηα 11 παηδία πνπ ειέρζεζαλ, 4 εκθάληζαλ ηελ λέα πάζεζε GHTD (104) πγθεθξηκέλα ηα παηδηά απηά παξνπζίαδαλ θνληφ αλάζηεκα θάησ απφ ηελ 3 ε εθαηνζηηαία ζέζε ηνπ δηεζλνχο πίλαθα γηα ην αλάζηεκα, είραλ θπζηνινγηθφ βάξνο, ρακειφ IGF-I, θπζηνινγηθή ηηκή GH (Φ.Σ. 10 ng/ml) έπεηηα απφ θαξκαθνινγηθή δηέγεξζε, θπζηνινγηθή έθθξηζε ηεο GH θαη θπζηνινγηθή αληαπφθξηζε IGF-I κεηά απφ ηέζζεξηο εκέξεο ρνξήγεζεο hgh, (IGF-I generation test >100% αχμεζε). Δικόνα 41: Δικόνα 42: ηελ ζπλέρεηα βηνςίεο νχισλ εμήρζεζαλ απφ ηνπο αζζελείο θαη κάξηπξεο, γηα ηελ θαιιηέξγεηα ηλνβιαζηψλ.(δηθ.43) 90

92 Δικόνα 43: α. β. γ. Α. Βηνςίεο νύισλ ζε DMEM ρσξίο εηζαγσγή GH Β. Βηνςίεο νύισλ ζε DMEM ρσξίο εηζαγσγή GH Γ. Βηνςίεο νύισλ ζε DMEM θαηόπηλ εηζαγσγήο 5κg/ml GH. H εηζαγσγή 5κg/ml GH ζηηο βηνςίεο ησλ νχισλ ησλ αζζελψλ, είλαη απαξαίηεηε γηα ηελ επαγσγή ηεο θπηηαξνθαιιηέξγεηαο απφ ην ηζηνηεκάρην, ελψ θάηη ηέηνην δελ είλαη απαξαίηεην ζηα θπζηνινγηθά άηνκα. Μεηέπεηηα, ηα θχηηαξα πνπ εμήρζεζαλ απφ ηνπο αζζελείο ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα ηελ κειέηε ηνπο ζε κνξηαθφ επίπεδν. Πξνγελέζηεξα πεηξάκαηα είραλ δείμεη φηη ηα 4 απηά παηδηά αδπλαηνχζαλ λα θσζθνξπιηψζνπλ ην STAT3. Απηφ επηβεβαηψζεθε κε Western blot αλάιπζε ζηνπο ηλνβιάζηεο αζζελψλ θαη θπζηνινγηθψλ αηφκσλ θαηφπηλ επαγσγήο ηνπο κε 200ng/ml hgh. Σα 200ng/ml GH είλαη δνζνινγία ε νπνία πξνηείλεηαη απφ ηελ βηβιηνγξαθία σο ε πιένλ απαξαίηεηε γηα ηνλ νξγαληζκφ. Δικόνα 44: Δηθόλα 44: Oη αζζελείο δελ είλαη ηθαλνί λα θσζθνξπιηώζνπλ ην STAT3 κεηά από 30 ιεπηά κε επαγσγή ησλ θπηηάξσλ ηνπο κε 200ng/ml GH. Δλ αληηζέζεη νη κάξηπξεο θσζθνξπιηώλνπλ ην STAT3. ηε ζπλέρεηα, δηαθνξεηηθέο δνζνινγίεο hgh εηζήρζεζαλ ζηα θχηηαξα ησλ αζζελψλ θαη έδεημαλ φηη ε αδπλακία ησλ παηδηψλ απηψλ λα θσζθνξπιηψζνπλ ην STAT3 μεπεξάζηεθε κε δφζε 1000ng/ml hgh. (78) (Δηθ.45) 91

93 Δικόνα 45: Δηθόλα 45: ηελ εηθφλα θαίλεηαη φηη ε αληθαλφηεηα ησλ GHTD παηδηψλ λα θσζθνξπιηψζνπλ ην STAT3 πξνζπεξάζηεθε κε πςειφηεξε δφζε απμεηηθήο νξκφλεο, ζην κάξηπξα δε ζπκβαίλεη ην ίδην. Αθφκα νη αζζελείο κε GHTD παξνπζίαζαλ θπζηνινγηθή ελεξγνπνίεζεο ησλ κνξίσλ GHR, JAK2, STAT1 θαη STAT5 κεηά απφ 30 ιεπηά επαγσγήο ησλ θπηηάξσλ ηνπο κε 200ng/ml GH. Δικόνα 46: Δπίζεο, κεηά απφ πεηξάκαηα sequencing πνπ δηεμήρζεζαλ, ηα απνηειέζκαηα πνπ απνθνκίζηεθαλ έδεημαλ φηη ηα παηδηά απηά δελ παξνπζίαδαλ θακία κεηαιιαγή, ζε θαλέλα εμφλην ηνπ GH1 θαη GHR γνληδίνπ. (Δηθ.47) 92

94 Δικόνα 47: Υξεζηκνπνηψληαο ηα επξήκαηα ησλ πεξαζκέλσλ κειεηψλ ηνπ εξγαζηεξίνπ σο αθεηεξία, ζπλερίζηεθε ε έξεπλα κε ηελ κειέηε ησλ αλαζηνιέσλ ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο GH. (78) 93

95 4.3 Α ΜΔΡΟ : Ζ κειέηε ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο αξλεηηθήο ξχζκηζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο (GH) ζε ηλνβιάζηεο παηδηψλ κε ηελ αζζέλεηα Growth Ζormone Σransduction Defect (GHTD) θαη ζε θπζηνινγηθά παηδηά. 94

96 4.3.1 PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ PIAS ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200 NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ. Αξρηθά έγηλε απνκφλσζε RNA απφ ηηο θαιιηέξγεηεο ησλ θπηηάξσλ ησλ αζζελψλ θαη ησλ καξηχξσλ, αθνινχζεζε ε αληίζηξνθε κεηαγξαθή ηνπ RNA ζε cdna θαη ηειηθά πξαγκαηνπνηήζεθε PCR αλάιπζε γηα ηελ αλίρλεπζε ηνπ αλαζηνιέα PIAS ζε ηλνβιάζηεο ρσξίο θαη κε επαγσγή κε 200ng/ml GH κεηά απφ 40 ιεπηά. Δικόνα 48: PIAS ΑΘ.1 ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΑΘ.4 ΑΘ.5 ΑΘ ACTIN ΑΘ.1 ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΑΘ.4 ΑΘ.5 ΑΘ Έπεηηα απφ ηελ εμαγσγή ησλ απνηειεζκάησλ, απηά αλαιχζεθαλ θαη κε ην πξφγξακκα Scion Image γηα ηελ επηβεβαίσζε ηεο νπηηθήο παξαηήξεζεο θαη πνζνηηθνπνίεζεο. Γπάθημα 1: 2,5 2 1,5 1 0,5 0 ΑΘ.1 (0') ΑΘ.1 (40') ΑΘ.4 (0') ΑΘ.4 (40') ΑΘ.5 (0') ΑΘ.5 (40') ΑΘ.2 (0') ΑΘ.2 (40') ΜΑΡΣ.1 (0') ΜΑΡΣ.1 (40') ΜΑΡΣ.2 (0') ΜΑΡΣ.2 (40') 95

97 ηελ εηθφλα απνηππψλνληαη ηα απνηειέζκαηα ηεο PCR αλάιπζεο γηα ην γνλίδην PIAS. πγθεθξηκέλα έγηλε εηζαγσγή ίδηαο πνζφηεηαο cdna ζηα θξεάηηα ρξεζηκνπνηψληαο σο control ηελ έθθξαζε ηεο αθηίλεο. Απφ ην γξάθεκα παξαηεξνχκε φηη θαλέλαο απφ ηνπο αζζελείο δελ εκθαλίδεη απμεκέλε έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ ήδε απφ ην ρξφλν 0, δειαδή ρσξίο ηελ επαγσγή κε GH θάηη πνπ ζα ππνδήισλε φηη ην PIAS ίζσο είλαη ππεχζπλν γηα ηελ κε θσζθνξπιίσζε ηνπ STAT3. Δπίζεο θαη ηα γεληθφηεξα επίπεδα έθθξαζεο ησλ αζζελψλ είλαη ρακειφηεξα απφ απηά ησλ καξηχξσλ. Απφ απηφ ζπκπεξαίλεηαη φηη ην PIAS δελ θαίλεηαη λα είλαη ν αλαζηνιέαο ηνπ κνλνπαηηνχ ηεο ζεκαηνδφηεζεο ηεο GH ν νπνίνο είλαη ππεχζπλνο γηα ηελ αδπλακία πνπ παξνπζηάδνπλ νη αζζελείο λα θσζθνξπιηψζνπλ ην STAT3. 96

98 4.3.2 PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ PIAS ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000 NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ. πλερίδνληαο ηελ πεηξακαηηθή κειέηε έγηλε PCR αλάιπζε γηα ηνλ έιεγρν ηεο έθθξαζεο ηνπ PIAS, ζηνπο ηλνβιαζηέο ησλ ίδησλ παηδηψλ φκσο θαηφπηλ επαγσγήο ηνπο κε 1000ng/ml GH. Δικόνα 49: PIAS ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΑΘ.1 ΑΘ.2 ΑΘ ACTIN ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΑΘ.1 ΑΘ.2 ΑΘ Γπάθημα 2: 1,5 1 0,5 0 ΜΑΡΣ. 1 (0') ΜΑΡΣ.1 (40') ΜΑΡΣ.2 (0') ΜΑΡΣ.2 (40') ΑΘ.1 (0') ΑΘ.1 (40') ΑΘ.2 (0') ΑΘ.2 (40') ΑΘ.5 (0') ΑΘ.5 (40') ηελ εηθφλα 49 απνηππψλνληαη ηα απνηειέζκαηα ηεο αιπζηδσηήο αληίδξαζεο ηεο πνιπκεξάζεο γηα ην γνλίδην PIAS θαη ζε αζζελείο αιιά θαη ζε θπζηνινγηθά παηδηά κεηά απφ επαγσγή ησλ θπηηάξσλ ηνπο κε πςειφηεξε δφζε απμεηηθήο νξκφλεο (1000ng/ml). Απφ ην γξάθεκα 2 ηεο πνζνηηθήο αλάιπζεο ησλ απνηειεζκάησλ γηα ηελ επηβεβαίσζε ηεο αθεξαηφηεηαο ηνπο βιέπνπκε φηη θαη νη δχν νκάδεο αηφκσλ (αζζελείο θαη κάξηπξεο) εκθαλίδνπλ ηα ίδηα επίπεδα έθθξαζεο ηνπ αλαζηνιέα PIAS. 97

99 Απφ ηα παξαπάλσ ζπκπεξαίλεηαη φηη ηνπιάρηζηνλ ζηνπο αζζελείο ηνπ ελδηαθέξνληνο καο ην PIAS δελ θαίλεηαη λα είλαη ππεχζπλν γηα ηελ δπζιεηηνπξγία πνπ ηα παηδηά απηά παξνπζηάδνπλ PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ CIS, ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200 NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ. Πξνρσξψληαο ε έξεπλα, ειέγρζεθε κε ηε ζεηξά ν δεχηεξνο αλαζηνιέαο ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο GH, θαη ζπγθεθξηκέλα ηνπ GHR-JAK2-STAT3 o CIS. Οη κειέηεο έγηλαλ ζε cdna δείγκαηα πνπ είραλ δεκηνπξγεζεί κε RT-PCR αλάιπζε ζε θαιιηεξγεκέλνπο ηλνβιάζηεο παηδηψλ κε GHTD θαη θπζηνινγηθψλ αηφκσλ ρσξίο θαη κεηά απφ επαγσγή ηνπο κε 200ng/ml GH. Αθνινχζεζε PCR αλάιπζε γηα ηελ έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ CIS θαη ζηηο δχν απηέο νκάδεο. Σα απνηειέζκαηα πνπ απνθνκίζζεθαλ παξνπζηάδνληαη ζηελ εηθφλα 50. Δικόνα 50: CIS ΑΘ.4 ΜΑΡΣ.1 ΑΘ.1 ΜΑΡΣ.2 ΜΑΡΣ.3 ΑΘ CIS ΑΘ.5 ΜΑΡΣ.4 ΑΘ ACTIN ΑΘ.4 ΜΑΡΣ.1 ΑΘ.1 ΜΑΡΣ.2 ΜΑΡΣ.3 ΑΘ ACTIN ΑΘ.5 ΜΑΡΣ.4 ΑΘ

100 Γπάθημα 3: 2 1,5 1 0,5 0 ΑΘ.4 (0') ΑΘ.4 (40') ΑΘ.1 (0') ΑΘ.1 (40') ΑΘ.2 (0') ΑΘ.2 (40') ΑΘ.5 (0') ΑΘ.5 (40') ΑΘ.3 (0') ΑΘ.3 (40') ΜΑΡΣ. 1 (0') ΜΑΡΣ.1 (40') ΜΑΡΣ.2 (0') ΜΑΡΣ.2 (40') ΜΑΡΣ. 3 (0') ΜΑΡΣ.3 ΜΑΡΣ.4 ΜΑΡΣ.4 (40') (0') (40') Σν γξάθεκα καο δείρλεη ηα επίπεδα έθθξαζεο ηνπ CIS θαη ζηνπο αζζελείο θαη ζηνπο κάξηπξεο. Απφ απηά βιέπνπκε φηη ν Αζζελήο 2 εκθαλίδεη πςειή έθθξαζε ηνπ CIS απφ ην ρξφλν 0, θαη ζε ζρέζε κε ηνπο κάξηπξεο. Γειαδή ηα επίπεδα ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ αλαζηνιέα είλαη πνιχ απμεκέλα ήδε ρσξίο ηελ εηζαγσγή απμεηηθήο νξκφλεο. Γεληθφηεξα, θαίλεηαη απφ ην γξάθεκα φηη φινη ζρεδφλ νη αζζελείο εθηφο ηνπ αζζελή 1, έρνπλ πςειφηεξε έθθξαζε ηνπ αλαζηνιέα ζε ρξφλν 0. Σν γεγνλφο απηφ νδήγεζε ην εξεπλεηηθφ έξγν, ζην λα δηεξεπλεζεί πεξαηηέξσ ε δξάζε ηνπ αλαζηνιέα CIS ζηνλ ζπγθεθξηκέλν αζζελή. 99

101 4.3.4 PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ CIS ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000 NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ. Μεηέπεηηα ειέγρζεθε ην επίπεδν έθθξαζεο ηνπ CIS ζηηο δχν νκάδεο κεηά απφ επαγσγή ησλ ηλνβιαζηψλ κε 1000ng/ml GH. (Δηθ.51) Δικόνα 51: CIS ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΑΘ.1 ΑΘ ACTIN ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΑΘ.1 ΑΘ Σα απνηειέζκαηα πνζνηηθνπνηήζεθαλ φπσο πξνεγνπκέλσο θαη δίλνληαη ζην γξάθ.4. Γπάθημα 4: Απφ ηα παξαπάλσ απνηειέζκαηα ζπκπεξαίλεηαη φηη ηα επίπεδα ηνπ CIS είλαη απμεκέλα ζην ρξφλν 0 ζηνπο αζζελείο 1 θαη 2, γεγνλφο πνπ έξρεηαη ζε αληίζεζε κε απηφ ησλ θπζηνινγηθψλ αηφκσλ. Σα νπνία ινγηθά έρνπλ ππεξέθθξαζε ηνπ CIS κεηά ηελ απμεκέλε δνζνινγία ζε GH πνπ ηνπο ρνξεγήζεθε. πκπεξαζκαηηθά, παξαηεξνχκε φηη ην CIS θαη ε ππεξέθθξαζε ηνπ, θαίλεηαη λα είλαη ελδερνκέλσο έλαο απφ ηνπο ιφγνπο πνπ νη αζζελείο αδπλαηνχλ λα θσζθνξπιηψζνπλ ην STAT3. 100

102 4.8 PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΖ ΚΗΝΖΣΗΚΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ CIS, ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ. πλερίδνληαο ηηο κειέηεο έγηλε PCR αλάιπζε γηα ην γνλίδην CIS αιιά ζε ηαθηά ρξνληθά δηαζηήκαηα, ψζηε λα εξεπλεζεί ε θηλεηηθή έθθξαζε ηνπ παξάγνληα, ζε επαγφκελα θχηηαξα κε 200ng/ml GH. Δικόνα 52: ΑΘ.2 ΑΘ.1 ΑΘ ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ ΑΘ.2 ΑΘ.1 ΑΘ ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ Γπάθημα 5: 1,5 1 0,5 0 ΑΘ.2 (0') ΑΘ.2 (10') Σα παξαπάλσ απνηειέζκαηα επηβεβαηψλνπλ φηη είρε παξαηεξεζεί θαη ζηηο πξνεγνχκελεο αλαιχζεηο κε PCR. ΑΘ.2 (40') ΑΘ.2 (60') ΑΘ.2 (180') ΑΘ.1 (0') ΑΘ.1 (10') ΑΘ.1 (40') ΑΘ.1 (60') ΑΘ.1 (180') ΑΘ.3 (0') ΑΘ.3 (10') ΑΘ.3 (40') ΑΘ.3 (60') ΑΘ.3 (180') ΜΑΡΣ.1 (0') ΜΑΡΣ.1(10') ΜΑΡΣ.1 (40') ΜΑΡΣ.1 (60') ΜΑΡΣ.1 (180') ΜΑΡΣ.2 (0') ΜΑΡΣ.2 (10') 101 ΜΑΡΣ.2 (40') ΜΑΡΣ.2 (60') ΜΑΡΣ.2 (180')

103 4.3.5 ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΧΖ ΚΑΣΑ WESTERN ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ CIS ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200 ng/ml GH ΚΑΗ Δ ΥΡΟΝΟΤ 0 ΚΑΗ 30 Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΦΤΗΟΛΟΓΗΚΑ ΠΑΗΓΗΑ. Σν επφκελν ζηάδην πεξηειάκβαλε ηελ δηεξεχλεζε ηεο έθθξαζεο ηνπ παξάγνληα CIS ζε πξσηετληθφ επίπεδν. Οιηθά εθρπιίζκαηα πξσηετλψλ απφ ηνπο αζζελείο θαη ηα θπζηνινγηθά άηνκα, ζπιιέρζεθαλ κε ηνλ ηξφπν πνπ πεξηγξάθεηαη ζην θεθάιαην πιηθά θαη κέζνδνη. πγθεθξηκέλε πνζφηεηα ησλ εθρπιηζκάησλ απηψλ ηνπνζεηήζεθε ζηα θαηάιιεια θξεάηηα ηεο Western Blot αλάιπζεο θαη απηφ επηβεβαηψζεθε θαη κε ηελ ρξήζε ηνπκπνπιίλεο. Δικόνα 53: CIS ΜΑΡΣ.1 ΑΘ.1 ΑΘ.4 ΜΑΡΣ kda kda 37 kda ΑΘ.2 ΜΑΡΣ kda kda 37 kda ΣΟΤΜΠΟΤΛΗΝΖ ΜΑΡΣ.1 ΑΘ.1 ΑΘ.4 ΜΑΡΣ ΑΘ.2 ΜΑΡΣ

104 Σν CIS είλαη γλσζηφ απφ ηε βηβιηνγξαθία φηη παξνπζηάδεη 3 ηζνκνξθέο θπζηνινγηθά, 66, 52 θαη 46 kda. Δίλαη ελδηαθέξνλ φηη ηξεηο αζζελείο, εθ ησλ νπνίσλ νη δχν είλαη εθείλνη πνπ εκθάληδαλ ππεξέθθξαζε ηνπ CIS απφ ην ρξφλν κεδέλ ζηα πξνεγνχκελα πεηξάκαηα, εκθαλίδνπλ κία αθφκα δψλε ζην χςνο ησλ 37 kda. Ζ δψλε απηή, ζχκθσλα κε κειέηε ηεο βηβιηνγξαθίαο θαίλεηαη φηη είλαη ε νπβπθνπτηηληιησκέλε κνξθή ηνπ κνξίνπ CIS. πκπεξαζκαηηθά, βιέπνπκε φηη νη αζζελείο εκθαλίδνπλ ήδε απφ ην ρξφλν κεδέλ ηελ νπβπθνπτηηληιηψκέλε κνξθή ηνπ κνξίνπ, ε νπνία είλαη ππεχζπλε ζην λα θαηεπζχλεη ην κφξην ζην νπνίν δεζκεχεηαη ζε απνδφκεζε ζην πξσηεάζσκα. 103

105 4.3.6 ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΧΖ ΚΑΣΑ WESTERN ΣΖ ΦΧΦΟΡΤΛΗΧΜΔΝΖ ΜΟΡΦΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ JAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200NG/ML GH ΚΑΗ Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ Δ ΜΑΡΣΤΡΔ. Σα παξαπάλσ απνηειέζκαηα εηζεγνχληαη ηελ πεξαηηέξσ κειέηε ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο απμεηηθήο νξκφλεο θαη έιεγρν άιισλ κνξίσλ, πξνθεηκέλνπ λα δηεπθξηληζηεί ν κεραληζκφο δξάζεο ηνπ CIS θαη νη ζπλέπεηεο ηεο νπβπθνπτηηληιησκέλεο κνξθήο ηνπ. Γηα ην ιφγν απηφ εμεηάζζεθε ε ελεξγνπνίεζε θσζθνξπιίσζε ηνπ JAK2 κε απνηχπσζε θαηά western ζε ρξφλν-εμαξηψκελε κειέηε. Οιηθά εθρπιίζκαηα ζπιιέρζεζαλ απφ αζζελείο θαη θπζηνινγηθά παηδηά ζηα θχηηαξα ησλ νπνίσλ είρε γίλεη επαγσγή κε 200ng/ml GH ζε δηάθνξνπο ρξφλνπο. Σα απνηειέζκαηα θαίλνληαη ζηελ εηθφλα 54 θαη πνζνηηθνπνηνχληαη ζην Γξάθεκα 6. Δικόνα 54: pjak2 Αζθενής Μάρησρας ΤΟΥΜΠΟΥΛΙΝΗ Αζθενής Μάρησρας

106 Γπάθημα 6: 1 0,5 0 ΑΘ. 0 ΑΘ. 5' ΑΘ.10' ΑΘ.15' ΑΘ.30' ΑΘ.40' ΑΘ.60' ΑΘ.5Ω ΜΑΡΣ.0 ΜΑΡΣ.5' ΜΑΡΣ.10' ΜΑΡΣ.15' ΜΑΡΣ.30' ΜΑΡΣ.40 ΜΑΡΣ.60 ΜΑΡΣ.5Ω Μεηά ηελ αλάιπζε ησλ παξαπάλσ απνηειεζκάησλ παξαηεξνχκε φηη ν αζζελήο παξνπζηάδεη θαζπζηέξεζε ζηε θσζθνξπιίσζε ηνπ JAK2 κνξίνπ. Δηδηθφηεξα, εληνπίδνπκε φηη ελψ ζην κάξηπξα θπζηνινγηθά ε ελεξγνπνίεζε ηνπ JAK2 αξρίδεη 10 ιεπηά αθφηνπ έρεη γίλεη επαγσγή κε απμεηηθή νξκφλε, ζηνλ αζζελή θαίλεηαη φηη ε ελεξγνπνίεζε ηνπ κνξίνπ αξρίδεη κεηά απφ 30 ιεπηά αθνχ έρεη επαρζεί κε GH. 105

107 4.3.7 ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΧΖ ΚΑΣΑ WESTERN ΣΖ ΦΧΦΟΡΤΛΗΧΜΔΝΖ ΜΟΡΦΖ ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ JAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000ng/ml GH ΚΑΗ Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ Δ ΜΑΡΣΤΡΔ. Σα πεηξάκαηα ηεο πξνεγνχκελεο παξαγξάθνπ επαλαιήθζεθαλ, κε ηελ δηαθνξά φηη ρξεζηκνπνηήζεθαλ ηλνβιάζηεο ζηνπο νπνίνπο είρε ρνξεγεζεί απμεηηθή νξκφλε ζε δφζε 1000ng/ml. Ζ κειέηε πάιη θηλεηηθφ ραξαθηήξα. Δικόνα 55: pjak2 Αζθενής h Μάρησρας h Σοσμποσλίνη Αζθενής Η Μάρησρας Η Γπάθημα 7: 1 0,5 0 ΑΘ. 0 ΑΘ. 5' ΑΘ.10' ΑΘ.15' ΑΘ.30' ΑΘ.40' ΑΘ.60' ΜΑΡΣ.0 ΜΑΡΣ.5' ΜΑΡΣ.10' ΜΑΡΣ.15' ΜΑΡΣ.30' ΜΑΡΣ.40 ΜΑΡΣ.60 ΜΑΡΣ.5Ω Απφ ηελ κειέηε ησλ αλσηέξσ απνηειεζκάησλ πξνθχπηεη φηη ε θαζπζηέξεζε πνπ εκθαληδφηαλ ζηελ θσζθνξπιίσζε ηνπ JAK2 κνξίνπ θαίλεηαη φηη απνθαζηζηάηε φηαλ γίλεηαη επαγσγή ησλ ηλνβιαζηψλ κε πςειφηεξε δφζε απμεηηθήο νξκφλεο. Σα απνηειέζκαηα πξνθχπηνπλ κεηά απφ ζπγθξηηηθή κειέηε κε θπζηνινγηθά άηνκα. 106

108 4.3.8 ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΧΖ ΚΑΣΑ WESTERN ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ JAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200NG/ML GH ΚΑΗ Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ Δ ΜΑΡΣΤΡΔ. ηελ ζπλέρεηα ειέγρζεθε ην επίπεδν έθθξαζεο ηεο κε-θσζθνξπιησκέλεο κνξθήο ηνπ JAK2, ζε ρξφλν-εμαξηψκελε κειέηε, ζηνπο θαιιηεξγεκέλνπο ηλνβιάζηεο ηνπ αζζελή θαη ηνπ κάξηπξα κε 200ng/ml GH. Δικόνα 56: JAK2 Αζθενής 2 5H Μάρησρας 5H ΣΟΤΜΠΟΤΛΙΝΗ Αζθενής H Μάρησρας H Γπάθημα 8: 1,5 1 0,5 0 ΑΘ. 0 ΑΘ. 5' ΑΘ.10' ΑΘ.15' ΑΘ.30' ΑΘ.40' ΑΘ.60' ΑΘ. 5Ω ΜΑΡΣ.0 ΜΑΡΣ.5' ΜΑΡΣ.10' ΜΑΡΣ.15' ΜΑΡΣ.30' ΜΑΡΣ.40 ΜΑΡΣ.60 ΜΑΡΣ.5Ω Απφ ην πείξακα παξαηεξνχκε φηη ηα επίπεδα ηνπ κνξίνπ JAK2 ηφζν ζηνλ αζζελή, φζν θαη ζηνλ κάξηπξα αθνινπζνχλ ην ίδην κνηίβν κεηαβνιψλ. Σα επίπεδα ηνπ JAK2 είλαη θπζηνινγηθά. 107

109 4.3.9 ΑΝΟΟΑΠΟΣΤΠΧΖ ΚΑΣΑ WESTERN ΣΟΤ ΜΟΡΗΟΤ JAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000ng/ml GH ΚΑΗ Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ Δ ΜΑΡΣΤΡΔ. Tν παξαπάλσ πείξακα επαλαιήθζεθε, κφλν πνπ ηα θχηηαξα ηνπ αζζελή θαη ηνπ κάξηπξα, ζηε ζπγθεθξηκέλε κειέηε είραλ επαρζεί κε 1000ng/ml GH. Δικόνα 57: JAK2 Αζθενής H Μάρησρας H Σοσμποσλίνη Αζθενής Η Μάρησρας Η Γπάθημα 9: 1 0,5 0 ΑΘ. 0 ΑΘ. 5' ΑΘ.10' ΑΘ.15' ΑΘ.30' ΑΘ.40' ΑΘ.60' ΜΑΡΣ.0 ΜΑΡΣ.5' ΜΑΡΣ.10' ΜΑΡΣ.15' ΜΑΡΣ.30' ΜΑΡΣ.40 ΜΑΡΣ.60 Απφ ην γξάθεκα δηαπηζηψλεηαη φηη θαη ζηελ πςειφηεξε δφζε απμεηηθήο νξκφλεο, ηα επίπεδα ηνπ JAK2 αθνινπζνχλ απηά ηνπ κάξηπξα. Δίλαη θπζηνινγηθά. 108

110 4.4 Β ΜΔΡΟ : Mειέηε ηεο πηζαλήο ζπζρέηηζεο ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο GH θαη ηνπ επηδεξκηθνχ απμεηηθνχ παξάγνληα [Epidermal Growth Factor (EGF)] ζε παηδηά πνπ εκθάληδαλ αλεπάξθεηα ζηελ αχμεζε. 109

111 Σν δεχηεξν κέξνο ηνπ εξεπλεηηθνχ έξγνπ πεξηειάκβαλε, ηελ κειέηε γηα πηζαλφ Cross-talking κεηαμχ ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο GH θαη ηνπ Δπηδεξκηθνχ Απμεηηθνχ Παξάγνληα (EGF). Πξνθεηκέλνπ λα δηαπηζησζεί ν ζηφρνο απηφο κηα ζεηξά πεηξακάησλ έιαβε ρψξα, ηα απνηειέζκαηα ησλ νπνίσλ παξνπζηάδνληαη παξαθάησ ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ PSTAT3 Δ ΚΤΣΣΑΡΑ ΑΘΔΝΧΝ ΚΑΗ ΦΤΗΟΛΟΓΗΚΧΝ ΠΑΗΓΗΧΝ, ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 200ng/ml GH ΚΑΗ 50nM EGF. Αξρηθή ηδέα ήηαλ ην λα ειεγρζεί ε θσζθνξπιίσζε ηνπ STAT3 κνξίνπ θαηφπηλ επαγσγήο ησλ θπηηάξσλ ησλ παηδηψλ κε GHTD θαη θπζηνινγηθψλ αηφκσλ κε 50nm EGF. Ζ δνζνινγία πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε πξνηείλεηαη απφ ηελ βηβιηνγξαθία. Γηα ην ιφγσ απηφ έγηλε κηα ζπγθξηηηθή κειέηε ηεο ελεξγνπνίεζεο ηνπ STAT3 ζε ηλνβιάζηεο αζζελψλ θαη καξηχξσλ θαη κε ηνλ επηδεξκηθφ απμεηηθφ παξάγνληα αιιά θαη κε απμεηηθή νξκφλε. Δικόνα 58: pstat3 ΜΑΡΣ.1 ΑΘ.1 ΜΑΡΣ.2 EGF GH EGF GH EGF GH ΑΘ.2 ΑΘ.3 EGF GH GH EGF Tubulin ΜΑΡΣ.1 ΑΘ.1 ΜΑΡΣ.2 EGF GH EGF GH ΔGF GH ΑΘ.2 ΑΘ.3 EGF GH EGF GH

112 Σα απνηειέζκαηα ηνπ πεηξάκαηνο δείρλνπλ φηη ηλνβιάζηεο αζζελψλ φπσο ήδε είλαη γλσζηφ αδπλαηνχλ λα θσζθνξπιηψζνπλ ην STAT-3 ζε ζρέζε πάληα κε θπζηνινγηθνχο ηλνβιάζηεο. Χζηφζν, φκσο θαίλεηαη φηη νη ηλνβιάζηεο αζζελψλ, κπνξνχλ λα θσζθνξπιηψζνπλ ην STAT3, φηαλ ηα θχηηαξα ηνπο επαρζνχλ κε ηνλ EGF. ε αληίζεζε, νη θπζηνινγηθνί ηλνβιάζηεο θαίλεηαη φηη θσζθνξπιηψλνπλ ην STAT 3 φηαλ ηα θχηηαξά ηνπο επαρζνχλ κε απμεηηθή νξκφλε θαη φρη κε ηνλ EGF PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΣΟΤ ΔΠΗΓΔΡΜΗΚΟΤ ΑΤΞΖΣΗΚΟΤ ΠΑΡΑΓΟΝΣΑ (EGFR) ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ. ηελ ζπλέρεηα εθαξκφζζεθε PCR αλάιπζε, γηα λα αληρλεπζεί ην επίπεδν ηνπ ππνδνρέα ηνπ EGF ζηα θχηηαξα ησλ αζζελψλ θαη ησλ καξηχξσλ θαηφπηλ επαγσγήο ηνπο κε 200ng/ml GH. (Δηθ.59 θαη Γξαθεκα 10) Δικόνα 59: EGFR ΜΑΡΣ.1 ΑΘ.2 ΜΑΡΣ.2 ΑΘ.1 ΜΑΡΣ.3 MAPT ACTIN ΜΑΡΣ.1 ΑΘ.2 ΜΑΡΣ.2 ΑΘ.1 ΜΑΡΣ.3 MAPT Γπάθημα 10: 1,5 1 0,5 ΑΣΘ.2 (0') ΑΣΘ.2 (40') ΜΑΡΤ.1 (0') ΜΑΡΤ.1 (40) ΜΑΡΤ.2 (0') ΜΑΡΤ.2 (40') ΜΑΡΤ.3 (0') ΜΑΡΤ.3 (40') ΜΑΡΤ.4 (0') ΜΑΡΤ.4 (40') Απφ ην πείξακα δηαπηζηψζεθε φηη δελ ππήξρε αμηφινγε δηαθνξά ζην επίπεδν ηνπ EGFR κεηαμχ αζζελψλ θαη θπζηνινγηθψλ αηφκσλ. 111

113 4.4.3 PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΣΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ (GHR) ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 200ng/ml GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ. Σν παξαπάλσ πείξακα έιαβε ρψξα θαη γηα ηνλ ππνδνρέα ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Δικόνα 60: GHR ΑΘ.1 ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΑΘ ACTIN ΑΘ.1 ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΑΘ Γπάθημα 11: 2 1,5 1 0,5 0 ΑΘ.1 (0') ΑΘ.1 (40') ΑΘ.2 (0') ΑΘ.2 (40') ΜΑΡΣ. 1 (0') ΜΑΡΣ.1 (40') ΜΑΡΣ.2 (0') ΜΑΡΣ.2 (40') Απφ ηα παξαπάλσ ζπκπεξαίλεηαη φηη νχηε ζην επίπεδν ησλ ππνδνρέσλ ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ππάξρεη αμηφινγε δηαθνξά κεηαμχ αζζελψλ θαη καξηχξσλ. Γπάθημα 12: 2 1,5 EGFR 1 0,5 0 GHR ΑΘ.1 (0') ΑΘ.1 (40') ΑΘ.2 (0') ΑΘ.2 (40') ΑΘ.1 (0') ΑΘ.1 (40') ΑΘ.2 (0') ΑΘ.2 (40') εκαληηθφηεξεο φκσο ζεκαζίαο είλαη λα δηεξεπλεζεί εάλ ππάξρεη δηαθνξά ζηελ πνζφηεηα κεηαμχ ησλ ππνδνρέσλ EGF θαη ηεο GH. Σν γξάθεκα καο δείρλεη φηη δελ ππάξρεη πνζνηηθή δηαθνξά αλάκεζα ζηα επίπεδα ησλ δχν ππνδνρέσλ ζηνπο αζζελείο. 112

114 4.4.4 PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΣΟΤ ΔΠΗΓΔΡΜΗΚΟΤ ΑΤΞΖΣΗΚΟΤ ΠΑΡΑΓΟΝΣΑ (EGFR) ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000ng/ml GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ Σα αλσηέξσ πεηξάκαηα επηηεχρζεθαλ θαη ζηνπο ηλνβιάζηεο αζζελψλ πνπ είραλ επαρζεί κε 1000ng/ml απμεηηθήο νξκφλεο. Δικόνα 61: EGFR ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΜΑΡΣ.3 ΑΘ.1 ΑΘ ACTIN ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΜΑΡΣ.3 ΑΘ.1 ΑΘ Γπάθημα 13: 1,5 1 0,5 0 ΜΑΡΣ.1 (0') ΜΑΡΣ.1 (40') ΜΑΡΣ.2 (0') ΜΑΡΣ.2 (40') ΜΑΡΣ.3 (0') ΜΑΡΣ.3 (40') ΑΘ.1 (0') ΑΘ.1 (40') ΑΘ.2 (0') ΑΘ.2 (40') Απφ ην γξάθεκα θαίλεηαη φηη δελ ππάξρεη δηαθνξά ζηα επίπεδα ηνπ ππνδνρέα ηνπ Δπηδεξκηθνχ Απμεηηθνχ Παξάγνληα ζε παηδηά κε GHTD θαη θπζηνινγηθά άηνκα. 113

115 4.4.5 PCR ΑΝΑΛΤΖ ΣΟΤ ΤΠΟΓΟΥΔΑ ΣΖ ΑΤΞΖΣΗΚΖ ΟΡΜΟΝΖ (GHR) ΜΔΣΑ ΣΖΝ ΔΠΑΓΧΓΖ ΣΧΝ ΚΤΣΣΑΡΧΝ ΜΔ 1000NG/ML GH, Δ ΑΘΔΝΔΗ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΔ. Δικόνα 62: GHR ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΜΑΡΣ.3 ΑΘ.1 ΑΘ ACTIN ΜΑΡΣ.1 ΜΑΡΣ.2 ΜΑΡΣ.3 ΑΘ.1 ΑΘ Γπάθημα 14: Γπάθημα 15: EGFR GHR 114

116 4.4.6 COIMMUNOPRECIPITATION ΓΗΑ ΣΟΝ ΔΛΔΓΥΟ CROSS- TALKING ΣΖ GH ΜΔ ΣΟΝ EGF. Δλ ζπλέρεηα κε ζθνπφ λα δηεπθξηλίζνπκε εάλ ζηα παηδηά απηά κε GHTD ππάξρεη πηζαλφ Cross-Talking κεηαμχ ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο GH θαη ηνπ EGF, δηεθπεξαηψζεθε πείξακα Coimmunoprecipitation. Αλαιπηηθφηεξα, θχηηαξα αζζελψλ θαη θπζηνινγηθψλ αηφκσλ επάρζεθαλ κε απμεηηθή νξκφλε (200ng/ml) ζε ρξφλνπο 0, 5, 15, 30, 40, 60 ιεπηά. Σα θχηηαξα απηά επσάζηεθαλ θαηά ηε δηάξθεηα ηεο ηερληθήο κε αληη-pegfr θαη αληη-egfr. πγθεθξηκέλα νη δχν απηνί παξάγνληεο δεζκεχηεθαλ ζηα πξσηετληθά εθρπιίζκαηα θαη κεηά ειέγρζεθε ηπρφλ αιιειεπίδξαζε ηνπο κε ηα κφξηα pjak2 θαη JAK2, ρξεζηκνπνηψληαο αληηζψκαηα ησλ παξαγφλησλ απηψλ. Δικόνα 63: pegfr Αζθενής w.c.e (whole cell extract) pjak2 Δικόνα 64: EGFR Μάρησρας w.c.e pjak2 pjak2 Αζθενής pjak2 Μάρησρας

117 Απφ ηα απνηειέζκαηα πνπ απνθνκίζηεθαλ δηαπηζηψλνπκε φηη ζε ηλνβιάζηεο αζζελψλ ν EGFR είλαη ελεξγνπνηεκέλνο θσζθνξπιησκέλνο δελ ππάξρεη θαζπζηέξεζε ζην λα θσζθνξπιηψζε ην JAK2. Σν ίδην ηζρχεη θαη γηα ην κάξηπξα. φπσο θαίλεηαη θαη απφ πξνεγνχκελα πεηξάκαηα φλησο έρεη θαζπζηέξεζε λα θσζθνξπιηψζεη ην JAK2 (40 ) ελψ ν κάξηπξαο ην θσζθνξπιηψλεη απφ ηα πξψηα 15. ε αληίζεζε κε απηφ, φηαλ ν EGFR δελ είλαη θσζθνξπιησκέλνο, ππάξρεη κεγάιε θαζπζηέξεζε ζηελ θσζθνξπιίσζε ηνπ JAK2, ζπγθεθξηκέλα ε ελεξγνπνίεζε ηνπ κνξίνπ επέξρεηαη κε ην πέξαο ησλ 60 ιεπηψλ. Σν παξαπάλσ δελ ηζρχεη ζηνλ κάξηπξα, ν νπνίνο θπζηνινγηθά θσζθνξπιηψλεη ην JAK2 ζηα 15 πξψηα ιεπηά. 116

118 4.5 Γ ΜΔΡΟ : Ζ κειέηε ηεο πηζαλήο ζπζρέηηζεο ησλ ζηεξνεηδψλ ηνπ θχιινπ κε ηε ζεκαηνδφηεζε ηεο GH ζε έλα παηδί κε GHTD. 117

119 Σν ηειεπηαίν κέξνο ηνπ εξεπλεηηθνχ κέξνπο πεξηιακβάλεη, ηελ κειέηε γηα πηζαλή ζπζρέηηζε ησλ ζηεξνεηδψλ ηνπ θχιινπ, κε ην ζεκαηνδνηηθφ κνλνπάηη ηεο GH, ζε έλαλ αζζελή κε GHTD. πγθεθξηκέλα ν αζζελήο απηφο είρε ην θαηλφηππν ελφο GHTD παηδηνχ θαη νη θιηληθέο ηνπ εμεηάζεηο επηβεβαηψλνπλ ηελ εηθφλα απηή. ηνλ αζζελή απηφ δελ ρνξεγήζεθε απμεηηθή νξκφλε, σζηφζν κε ηελ είζνδφ ηνπ ζηελ εθεβεία α αζζελήο απηφο μεπέξαζε ην πξφβιεκα ηνπ θαη μεθίλεζε ε είζνδνο ηνπο ηελ θπζηνινγηθή αλάπηπμε. Ζ δηαπίζησζε απηή καο νδήγεζε λα εξεπλήζνπκε ηνλ ιφγσ πνπ ν αζζελήο απηφο μεπέξαζε ηε δπζιεηηνπξγία ηνπ. Έηζη, ειέγρζεθε ε επίδξαζε ησλ ζηεξνεηδψλ ηνπ θχιινπ θαη ζπγθεθξηκέλα ηεο 17β-νηζηξαδηφιεο ζην παηδί απηφ ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ PSTAT3 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 17Β- ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ Δ ΗΝΟΒΛΑΣΔ ΑΘΔΝΟΤ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΧΝ. Ξεθηλψληαο ηεο πεηξακαηηθέο κειέηεο εξεπλήζεθε ε ελεξγνπνίεζε ηνπ STAT3 κνξίνπ ζε θχηηαξα ηνπ αζζελή πξν θαη κεηά- εθεβηθά κεηά απφ επαγσγή ηνπο κε 17β-νηζηαδηφιε. ε πξνεγνχκελα πεηξάκαηα παξαηεξήζεθε φηη ν αζζελήο απηφο δελ θσζθνξπιίσλε ην STAT3 κεηά απφ επαγσγή ησλ ηλνβιαζηψλ ηνπ κε 200ng/ml GH. Δπίζεο έγηλε θαη ζε θχηηαξα θπζηνινγηθψλ αηφκσλ επαγσγή κε 17βνηζηξαδηφιε, γηα λα επέιζεη ε ζπγθξηηηθή ηνπο κειέηε. Δικόνα 65: pstat3 Αζθενής (ζηην εθηβεία) Αζθενής (Προ-εθηβείας) Μάρησρας 1 Μάρησρας 2 Μάρησρας Αζθενής (Προ-εθηβείας) Αζθενής (ζηην εθηβεία) Μάρησρας 1 Μάρησρας 3 Μάρησρας

120 Γπάθημα 16: 1 0,5 0 ΑΘΕΝΗ 0' ΑΘ- ΠΡΟ.ΕΦ. 20' ΑΘ- ΠΡΟ.ΕΦ. 40' ΑΘ- ΠΡΟ.ΕΦ. 60' ΑΘ.ΕΦ. 20' ΑΘ.ΕΦ. 40' ΑΘ.ΕΦ. 60' ΜΑΡΣ. 0' ΜΑΡΣ. 20' ΜΑΡΣ. 40' ΜΑΡΣ. 60' Γπάθημα 17: 1 0,5 0 ΜΑΡΣ.2 (0') ΜΑΡΣ.2 (20') ΜΑΡΣ.2 (40') ΜΑΡΣ.2 (60') ΜΑΡΣ.3 (0') ΜΑΡΣ.3 (20') ΜΑΡΣ.3 (40') ΜΑΡΣ.3 (60') Απφ ηα απνηειέζκαηα πνπ πξνθχπηνπλ είλαη θαλεξφ φηη ν αζζελήο αδπλαηεί λα θσζθνξπιηψζε ην STAT3, πξν εθεβηθά. Ζ αδπλακία απηή πξνζπεξλάηε θαζψο εηζέξρεηαη ζηελ εθεβεία. Δηδηθφηεξα θαηά ηελ πεξίνδν ηεο εθεβείαο ην κνηίβν έθθξαζεο ηνπ pstat3 είλαη ίδην κε απηφ ησλ καξηχξσλ. 119

121 4.5.2 ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ PJAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 17Β- ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ Δ ΗΝΟΒΛΑΣΔ ΑΘΔΝΟΤ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΧΝ. Ζ κειέηε ζπλερίζηεθε εξεπλψληαο θαη ηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ κνξίνπ pjak2, κε αλνζναπνηχπσζε θαηά western, ζε πξν θαη κεηά-εθεβηθά θχηηαξα ηνπ αζζελή, αιιά θαη ζε κάξηπξεο. Δικόνα 66: pjak2 Αζθενής (ζηην εθηβεία) Αζθενής (Προ-εθηβείας) Μάρησρας 1 Μάρησρας 3 Μάρησρας Σοσμποσλίνη Αζθενής (Προ-εθηβείας) Αζθενής (ζηην εθηβεία) Μάρησρας 1 Μάρησρας 3 Μάρησρας Γπάθημα 18: 1 0,5 0 ΑΘΕΝΗ 0' ΑΘ- ΑΘ- ΑΘ- ΑΘ.ΕΦ. ΠΡΟ.ΕΦ. 20' ΠΡΟ.ΕΦ. 40' ΠΡΟ.ΕΦ. 60' 20' ΑΘ.ΕΦ. 40' ΑΘ.ΕΦ. 60' ΜΑΡΣ. 0' ΜΑΡΣ. 20' ΜΑΡΣ. 40' ΜΑΡΣ. 60' 120

122 Γπάθημα 19: 1 0,5 0 ΜΑΡΣ.2 (0') ΜΑΡΣ.2 (20') ΜΑΡΣ.2 (40') ΜΑΡΣ.2 (60') ΜΑΡΣ.3 (0') ΜΑΡΣ.3 (20') ΜΑΡΣ.3 (40') ΜΑΡΣ.3 (60') Ζ εμαγσγή ησλ παξαπάλσ απνηειεζκάησλ καο δείρλεη φηη ν αζζελήο θσζθνξπιηψλεη θπζηνινγηθά ην JAK2 θαη πξν θαη θαηά ηε δηάξθεηα ηεο εθεβείαο. Σα απνηειέζκαηα ζπζρεηίδνληαη πάληα κε απηά ησλ καξηχξσλ. 121

123 4.5.3 ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ STAT3 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 17β- ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ Δ ΗΝΟΒΛΑΣΔ ΑΘΔΝΟΤ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΧΝ. Καηφπηλ, έγηλε αλίρλεπζε θαη ησλ επηπέδσλ ηεο κε-θσζθνξπιησκέλεο κνξθήο ηνπ STAT3, ζηα πξν εθεβηθά θαη εθεβηθά θχηηαξα ηνπ αζζελνχο θαη ζε απηά ησλ καξηχξσλ. Δικόνα 67: STAT3 Αζθενής (Προ-εθηβείας) Αζθενής (ζηην εθηβεία) Μάρησρας 1 Μάρησρας 2 Μάρησρας ' ΣΟΤΜΠΟΤΛΙΝΗ Αζθενής (Προ-εθηβείας) Αζθενής (ζηην εθηβεία) Μάρησρας 1 Μάρησρας 3 Μάρησρας Γπάθημα 20: 1 0,5 0 ΑΘΕΝΗ 0' ΑΘ- ΠΡΟ.ΕΦ. 20' ΑΘ- ΠΡΟ.ΕΦ. 40' ΑΘ- ΠΡΟ.ΕΦ. 60' ΑΘ.ΕΦ. 20' ΑΘ.ΕΦ. 40' ΑΘ.ΕΦ. 60' ΜΑΡΣ. 0' ΜΑΡΣ. 20' ΜΑΡΣ. 40' ΜΑΡΣ. 60' 122

124 Γπάθημα 21: 1,5 1 0,5 0 ΜΑΡΣ.2 (0') ΜΑΡΣ.2 (20') ΜΑΡΣ.2 (40') ΜΑΡΣ.2 (60') ΜΑΡΣ.3 (0') ΜΑΡΣ.3 (20') ΜΑΡΣ.3 (40') ΜΑΡΣ.3 (60') Απφ ηα παξαπάλσ απνηειέζκαηα, κπνξεί λα δηαπηζησζεί φηη ην επίπεδν ηνπ STAT3 θαη ζηνλ αζζελή (πξν θαη κεηά ηελ εθεβεία) αιιά θαη ζηνπο κάξηπξεο είλαη θπζηνινγηθφ. 123

125 4.5.4 ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ JAK2 ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 17Β- ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ Δ ΗΝΟΒΛΑΣΔ ΑΘΔΝΟΤ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΧΝ Σα πεηξάκαηα ζπλερίζηεθαλ αληρλεχνληαο θαη ην επίπεδν έθθξαζεο ηνπ JAK2 ζηνπο ηλνβιάζηεο ηνπ αζζελή θαη ζηνλ καξηχξσλ. Δικόνα 68: JAK2 Αζθενής (Προ-εθηβείας) Αζθενής (ζηην εθηβεία) Μάρησρας1 Μάρησρας 2 Μάρησρας ΣΟΤΜΠΟΤΛΙΝΗ Αζθενής (Προ-εθηβείας) Αζθενής (ζηην εθηβεία) Μάρησρας 1 Μάρησρας 3 Μάρησρας

126 Γπάθημα 22: Γπάθημα 23: 2,5 2 1,5 1 0,5 0 ΜΑΡΣ.2 (0') ΜΑΡΣ.2 (20') ΜΑΡΣ.2 (40') ΜΑΡΣ.2 (60') ΜΑΡΣ.3 (0') ΜΑΡΣ.3 (20') ΜΑΡΣ.3 (40') ΜΑΡΣ.3 (60') Απφ ηα παξαπάλσ πεηξάκαηα πξνθχπηεη φηη ζηνλ αζζελή ην επίπεδν ηνπ JAK2, ζηα πξν θαη ζηα εθεβηθά ηνπ θχηηαξα, κεηά απφ επαγσγή ηνπο κε 17-β νηζηξαδηφιε, είλαη θπζηνινγηθφ θαη απηφ πξνθχπηεη πάληα κε ζπγθξηηηθή κειέηε κε ηνπο κάξηπξεο. 125

127 4.5.5 ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΣΟΤ CIS ΜΔΣΑ ΑΠΟ ΔΠΑΓΧΓΖ ΜΔ 17Β- ΟΗΣΡΑΓΗΟΛΖ Δ ΗΝΟΒΛΑΣΔ ΑΘΔΝΟΤ ΚΑΗ ΜΑΡΣΤΡΧΝ. Σν ηειηθφ πείξακα ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ εξεπλεηηθνχ έξγνπ, απνηεινχζε ε αλίρλεπζε ηνπ αλαζηνιέα CIS, ζηα θχηηαξα ηνπ παηδηνχ κε GHTD θαη ζηα θχηηαξα ησλ καξηχξσλ ηα νπνία είραλ επαρζεί κε 17β-νηζηξαδηνιή. Δικόνα 69: CIS Αζθενής (Προ-εθηβείας) Αζθενής (ζηην εθηβεία) kDa 52+46kDa 37kDa ub Μάρησρας kDa 52kDa Μάρησρας 2 Μάρησρας kDa 52kDa ΣΟΤΜΠΟΤΛΙΝΗ Αζθενής (Προ-εθηβείας) Αζθενής (ζηην εθηβεία) Μάρησρας 1 Μάρησρας 3 Μάρησρας

128 Σα απνηειέζκαηα ηνπ παξαπάλσ πεηξάκαηνο καο θαλεξψλνπλ φηη ν αζζελήο πξν-εθεβηθά παξνπζίαδε ηελ νπβπθνπτηηλπιησκέλε κνξθή ηνπ CIS θαη κεηά απφ επαγσγή ησλ ηλνβιαζηψλ ηνπ κε 17β-νηζηξαδηφιε. Χζηφζν, κε ηελ είζνδν ηνπ ζηελ εθεβεία, ε νπβπθνπτηηλπιησκέλε κνξθή ηνπ CIS δελ εκθαλίδεηαη θαη ην επίπεδν ηνπ αλαζηνιέα είλαη φκνην κε απηφ ησλ καξηχξσλ. 127

129 6 ΤΕΖΣΖΖ Ζ απνηειεζκαηηθφηεηα ηνπ ελδνθξηληθνχ ζπζηήκαηνο βαζίδεηαη ζηελ ζπγθεθξηκέλε αιιειεπίδξαζε κηαο νξκφλεο κε ηνλ ππνδνρέα ηεο. Έλαο ππνδνρέαο εθηελψο κειεηεκέλνο είλαη απηφο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. Ζ απμεηηθή νξκφλε, φπσο ήδε έρεη αλαθεξζεί, είλαη απφ ηεο θπξηφηεξεο νξκφλεο ζην αλζξψπηλν ζψκα, ε νπνία δηαδξακαηίδεη θχξην ξφιν ζε βαζηθέο ιεηηνπξγίεο ηνπ αλζξψπηλνπ νξγαληζκνχ. Ζ δξάζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζηνπο δηάθνξνπο ηζηνχο αζθείηαη θπξίσο κε ηε δηέγεξζε ηεο παξαγσγήο ησλ ηλζνπιηλφκνξθσλ απμεηηθψλ παξαγφλησλ (Insulinlike Growth Factors) IGF-I θαη IGF-II, απφ ηνπο νπνίνπο ν IGF-I είλαη ν ζεκαληηθφηεξνο ζηελ κεηεκβξπηθή δσή. H δξάζε ηνπ IGF-I ζηνπο ηζηνχο αζθείηαη κέζσ ηνπ ππνδνρέα ηνπ, θαη ηξνπνπνηείηαη απφ ηελ παξνπζία ησλ δεζκεπηηθψλ ηνπ πξσηετλψλ (IGF-Binding Proteins: IGFBPs απφ 1 έσο 6 ). Οη IGFBPs κπνξνχλ λα εληζρχνπλ ή λα θαηαζηέιινπλ αλάινγα ηε δξάζε ηνπ IGF-I, αλάινγα κε ην ζήκα πνπ δέρνληαη απφ ηνπο θπηηαξηθνχο ξπζκηζηέο ηνπο (79). Πξφζθαηεο κειέηεο έρνπλ δείμεη φηη κηα πνηθηιία κνξίσλ θσζθνξπιηψλεηαη ζε ζέζεηο ηπξνζίλεο, κέζσ ηεο JΑΚ2, κεηά ηε δέζκεπζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο κε ηνλ ππνδνρέα ηεο. ε απηά ηα κφξηα αλήθνπλ: 1) νη πξσηεΐλεο STATs (27), 2) νη Shc πξσηεΐλεο, πνπ νδεγνχλ ζηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ RAS-MAPK κνλνπαηηνχ (28), 3) νη Insulin Receptor Substrate (IRS) πξσηεΐλεο, πνπ ελεξγνπνηνχλ ηελ θηλάζε ηεο 3- θσζθαηηδπινηλνζηηφιεο (θαη άιιεο πξσηεΐλεο) (29), 4) ε SH2-B θπηηαξνπιαζκαηηθή πξσηεΐλε πξνζαξκνγέαο, ε νπνία ελεξγνπνηεί ηελ JAK2 (30), θαη 5) ε SIRP, ε νπνία πξνζδέλεηαη ζηελ integrin associated-protein θαη ηελ JAK2 κέζσ ελφο κεραληζκνχ ν νπνίνο δελ απαηηεί φκσο θσζθνξπιίσζε ηεο ηπξνζίλεο, αλ θαη ε ίδηα ε SIRP θσζθνξπιηψλεηαη σο απάληεζε ζηελ GH. H θσζθνξπιησκέλε SIRΡ ζηξαηνινγεί κφξηα ηεο SHP-2 ηπξνζηληθήο θσζθαηάζεο, ε νπνία απνθσζθνξπιηψvεη ηελ SIRP θαη πνιχ πηζαλφλ ηελ JAK2 θαη ξπζκίδεη έηζη αξλεηηθά ηνλ άμνλα GH/IGF-I (80). Ζ ελεξγνπνίεζε ηνπ ππνδνρέα ηεο απμεηηθήο νξκφλεο (GHR) επάγεη επίζεο κε αξλεηηθφ ηξφπν, ην κεηαγσγηθφ κνλνπάηη ηεο, πξάγκα πνιχ ζεκαληηθφ γηα ηνλ ηεξκαηηζκφ ηεο δξάζεο ηεο. 1) Αξρηθά, έλαο πξψηνο κεραληζκφο αξλεηηθήο ξχζκηζεο πξαγκαηνπνηείηαη απφ εηδηθέο θσζθαηάζεο, φπσο νη θσζθαηάζεο ηπξνζίλεο SHP-1 θαη SHP-2 νη νπνίεο πξνζδέλνληαη ζε θσζθνξπιησκέλα θαηάινηπα ηπξνζίλεο ησλ GHR, JAK2-θηλάζεο θαη STAT5b κέζσ ησλ SH2 πεξηνρψλ ηνπο. Απηφ νδεγεί ζε απνθσζθνξπιίσζε θαη απελεξγνπνίεζε ησλ ηειεπηαίσλ κνξίσλ (81). Έλαο δεχηεξνο 128

130 κεραληζκφο αξλεηηθήο ξχζκηζεο ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο GH, αθνξά ηηο SOCS θαη CIS πξσηεΐλεο. Απηέο νη πξσηεΐλεο ελεξγνπνηνχληαη απφ δηαθνξεηηθέο θπηνθίλεο κέζσ ηνπ STAT κνλνπαηηνχ. Οη SOCS πεξηέρνπλ κηα SH2 πεξηνρή κέζσ ηεο νπνίαο πξνζδέλνληαη θαη αλαζηέιινπλ ηελ JH1 πεξηνρή ηεο ελεξγνπνηεκέλεο JAK2-θηλάζεο, πνπ είλαη θσζθνξπιησκέλε ζε θαηάινηπα ηπξνζίλεο. Δλ αληηζέζεη κε ηηο SOCS,νη CIS πξσηεΐλεο είλαη ξπζκηζηέο ηεο αξλεηηθήο αλάδξνκεο ηξνθνδφηεζεο, πνπ ελεξγνπνηνχληαη απφ ηνλ STAT5. Οη CIS πξνζδέλνληαη ζηνλ ππνδνρέα ηεο GH θαη αλαζηέιιεη ηε θσζθνξπιίσζε ηνπ STAT5 θαη ζπλεπψο ηελ ζχζηνηρε κεηαγξαθηθή ηνπ απάληεζε (82,83). Έλαο ηξίηνο κεραληζκφο αθνξά κφξηα (θηλάζεο) ηνπ MAPK κνλνπαηηνχ, ηα νπνία είλαη ηθαλά λα ξπζκίζνπλ αξλεηηθά ηελ ελεξγφηεηα ηεο JΑΚ2-θηλάζεο. Κάπνηα απφ απηά, φπσο νη ERK2 θαη JNK1 θηλάζεο κπνξνχλ λα θσζθνξπιηψζνπλ ηνλ STAT3 ζε εηδηθφ θαηάινηπν ζεξίλεο. Δίλαη πηζαλφλ φκσο ε θσζθνξπιίσζε ηνπ STAT3 λα ξπζκίδεη αξλεηηθά ηελ πξφζδεζε ζην DNA θαη ηελ κεηαγξαθηθή ηνπ ελεξγφηεηα. Αθφκα, νη ελεξγνπνηεκέλεο ERKs θαη JNKs κπνξνχλ λα αιιειεπηδξνχλ κε ζπγθεθξηκέλνπο αλαζηνιείο ηνπ JAK/STAT κεηαγσγηθνχ άμνλα (SOCS θαη CIS). Ζ ελεξγφηεηα ησλ STAT κπνξεί επίζεο λα ηξνπνπνηείηαη κέζσ ηεο πξφζδεζήο ηνπο ζηελ ελεξγνπνηεκέλε κνξθή ηεο ERK2 ή ζηελ πξσηετληθή θηλάζε C-δ (10). 4) Σέινο, έλαο ηέηαξηνο κεραληζκφο αθνξά ηελ αιιειεπίδξαζε κεηαμχ ηνπ Stat3 θαη ηνπ εμαξηψκελνπ απφ ηηο θπθιίλεο αλαζηνιέα θηλαζψλ p21, ν νπνίνο πξνζδέλεηαη ζην Stat3 θαη αλαζηέιιεη ηελ ηθαλφηεηά ηνπ λα ελεξγνπνηεί ηε κεηαγξαθή. Ο αθξηβήο κεραληζκφο απηήο ηεο αξλεηηθήο ξχζκηζεο είλαη κέρξη ζηηγκήο ππφ κειέηε (84). Σν mrna ηνπ GHR, βξίζθεηαη ζηνπο πεξηζζφηεξνπο κεηεκβξπτθνχο ηζηνχο (85). Δπίζεο ν ππνδνρέαο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο έρεη αληρλεπζεί κε κειέηεο αλνζναληίδξαζεο ζε θαιιηεξγεκέλνπο ηλνβιάζηεο, νη νπνίνη είραλ ιεθζεί λσξίο θαηά ηελ εκβξπτθή δσή (8.5 εβδνκάδεο). Οη κειέηεο αλνζντζηνρεκείαο θαη in situ πβξηδνπνίεζεο έρνπλ δείμεη φηη ηφζν ν IGF-I φζν θαη ν ππνδνρέαο ηνπ εθθξάδνληαη ζε θαιιηεξγεκέλνπο ηλνβιάζηεο. Δλψ νη θαιιηεξγεκέλνη ηλνβιάζηεο παξάγνπλ IGF- I, ζηα επηδεξκηθά βαζηθά θεξαηηλνθχηηαξα δελ αληρλεχεηαη IGF-I, ελψ είλαη παξψλ ν ππνδνρέαο ηνπ (86). Όπσο είλαη ήδε γλσζηφ, ε ηδηνπαζήο δηαηαξαρή ζηελ αλάπηπμε (idiopathic growth failure, GF) αθνξά παηδηά πνπ ην χςνο ηνπο βξίζθεηαη θάησ απφ ηελ 3 ε εθαηνζηηαία ζέζε ζηελ δηεζλή θιίκαθα αλάπηπμεο. Σα παηδηά απηά εκθαλίδνπλ επίζεο θαζπζηέξεζε ζηελ νζηηθή ηνπο ειηθία θαη ειαηησκέλν εηήζην ξπζκφ αχμεζεο 129

131 αγλψζηνπ αηηηνινγίαο. Ζ θπζηθή φκσο εμέηαζε ησλ παηδηψλ κε ηδηνπαζή δηαηαξαρή ζηελ αλάπηπμε είλαη θπζηνινγηθή (εθηφο απφ ην ρακειφ χςνο θαη ηελ παζνινγηθή ηαρχηεηα αλάπηπμεο), φπσο θπζηνινγηθφο είλαη θαη ν αηκαηνινγηθφο θαη ν βηνρεκηθφο ηνπο έιεγρνο. Αθφκα, θπζηνινγηθή είλαη θαη ε ζπξενεηδηθή ηνπο ιεηηνπξγία. ηνλ έιεγρν ησλ ζσκαηνηξφπσλ νξκνλψλ, ζηα παηδηά κε ηδηνπαζή δηαηαξαρή ζηελ αλάπηπμε παξαηεξνχληαη ηα εμήο: Πξψηνλ, ε απάληεζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο κεηά απφ θαξκαθνινγηθή δηέγεξζε είλαη θπζηνινγηθή. Γεχηεξνλ, ε ελδνγελήο 24-σξε έθθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο είλαη επίζεο θπζηνινγηθή, θαη ηξίηνλ ε παξνπζηάδνπλ ζπγθέληξσζε ηνπ IGF-Η (insulin-like growth factor-η) είλαη ρακειή αιιά βειηηψλεηαη θαη αγγίδεη ηηο θπζηνινγηθέο ηηκέο χζηεξα απφ δηέγεξζε κε απμεηηθή νξκφλε (IGF-Η generation test). Ζ ππνθείκελε βιάβε πνπ πξνθαιεί ηελ ηδηνπαζήο δηαηαξαρή ζηελ αλάπηπμε, θαη θαη επέθηαζε θαη ην ζνβαξφ θνληφ αλάζηεκα, είλαη κέρξη ζήκεξα άγλσζηε (87). Οη πξψηεο κειέηεο ηεο εξεπλεηηθήο νκάδαο ηνπ εξγαζηεξίνπ, έδεημαλ φηη κηα νκάδα παηδηψλ πνπ έρνπλ θπζηνινγηθέο ηηκέο ζε φιεο ηηο δνθηκαζίεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, πάζρνπλ απφ δηαηαξαρή ζηελ αλάπηπμε θαη έρνπλ βιάβε ζηε κεηάδνζε ηνπ ζήκαηνο ηεο GH κεηά ηελ πξφζδεζε ζηνλ ππνδνρέα ηεο (Post-Receptor defect). Ζ δηαηαξαρή απηή νλνκάζηεθε «Growth Hormone Transduction Defect (GHTD)»(82,83). Δπίζεο ην θαηλφκελν απηφ δελ ζρεηηδφηαλ κε θάπνηνπ είδνπο θιεξνλνκηθφηεηα. Απηή ε βιάβε δελ έρεη πεξηγξαθεί πνηέ ζηελ δηεζλή βηβιηνγξαθία. Πξνεγνχκελεο κειέηεο ηνπ εξγαζηεξίνπ είραλ ζαλ ζηφρν ηελ ηαπηνπνίεζε ζε κνξηαθφ επίπεδν θάπνηαο πηζαλήο βιάβεο πνπ κπνξεί λα ελέρεηαη ζηελ παζνγέλεζε απηήο ηεο δηαηαξαρήο. Γηα ην ζθνπφ απηφ κειεηήζεθε ε δηαδηθαζία κεηαγσγήο ηνπ ζήκαηνο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο (growth hormone (GH) - triggered signal transduction) ζε θαιιηεξγεκέλνπο ηλνβιάζηεο δεθαηεζζάξσλ αζζελψλ κε ηδηνπαζή δηαηαξαρή ζηελ αλάπηπμε. Οη θαιιηέξγεηεο ησλ ηλνβιαζηψλ πξνήιζαλ απφ βηνςίεο νχισλ ησλ παηδηψλ απηψλ. ε φινπο ηνπο αζζελείο ε έθθξαζε ηνπ ππνδνρέα ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ήηαλ θπζηνινγηθή. ε ηέζζεξηο φκσο απφ απηνχο, παξαηεξήζεθε, κεησκέλε ελεξγνπνίεζε, ιφγσ κεησκέλεο θσζθνξπιίσζεο, ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα STAT3 (signal transducer and activator of transcription -3) (87) Ζ κεησκέλε απηή ελεξγνπνίεζε ηνπ STAT3 ζπλνδεπφηαλ θαη απφ θαηαζηνιή ηνπ θπηηαξηθνχ θχθινπ ζηελ θάζε G 0 -G 1, φπσο απηφ απνδείρζεθε κε αλάιπζε θπηηαξνκεηξίαο θζνξηζκνχ (fluorescence activated cell sorter, FACS), θαη αλάιπζε ελζσκάησζεο βξσκν-δενμπνπξηδίλεο (BrdU). Παξάιιεια, βξέζεθαλ απμεκέλα 130

132 επίπεδα ηνπ αλαζηνιέα ηεο θπηηαξηθήο δηαίξεζεο p21, θαζψο θαη κεησκέλα επίπεδα ησλ πξσηετλψλ cyclin A, cyclin D, θαη CDT1, πνπ φιεο ηνπο παίδνπλ κείδνλα ξφιν ζηελ ξχζκηζε ηνπ θπηηαξηθνχ θχθινπ. Όιεο απηέο νη παξαηεξνχκελεο κεηαβνιέο επαλήιζαλ ζε θπζηνινγηθά επίπεδα, φηαλ ζηηο θαιιηέξγεηεο ηλνβιαζηψλ πξνζηέζεθε αλζξψπηλε απμεηηθή νξκφλε (hgh, human GH) ζε πςειέο ζπγθεληξψζεηο. Δπηπιένλ, ζηα παηδηά απηά κε θνληφ αλάζηεκα θαη κεησκέλε ελεξγνπνίεζε ηνπ STAT3, παξαηεξήζεθε ζεκαληηθή αχμεζε ηεο ηαρχηεηαο ηεο αλάπηπμεο ηνπ (catch-up growth) θαηά ηε δηάξθεηα ηεζζάξσλ εηψλ πνπ έιαβαλ ζεξαπεία κε απμεηηθή νξκφλε (hgh). Με ηηο κειέηεο απηέο αλαδείρζεθε, γηα πξψηε θνξά, ε χπαξμε κηαο δηαηαξαρήο ζηελ κεηαγσγή ζήκαηνο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, ζε θαιιηεξγεκέλνπο ηλνβιάζηεο ηεζζάξσλ παηδηψλ κε GF (Growth failure), ε νπνία κπνξεί λα αληηκεησπηζηεί απνηειεζκαηηθά κε εμσγελή ρνξήγεζε hgh (2,3). Ζ θαηλνχξηα απηή θιηληθή νληφηεηα νλνκάζηεθε «Growth Hormone Transduction Defect» (GHTD) θαη πεξηιακβάλεη παηδηά κε δηαηαξαρή ζηελ αλάπηπμε ρσξίο δηαηαξαρή ζηελ έθθξηζε ηεο απμεηηθήο νξκφλεο. (78) Πξφζθαηα έρεη απνδεηρζεί φηη ζε κπνβιάζηεο C2C12, ν κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο STAT3 παίδεη ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ έθθξαζε ηνπ mrna ηνπ παξάγνληα IGF-I κεηά απφ επαγσγή κε απμεηηθή νξκφλε (4). Δίλαη ινηπφλ πηζαλφ φηη ε δηαηαξαρή ζηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ STAT3 πνπ παξαηεξήζεθε ζηα ηέζζεξα παηδηά κε ηδηνπαζή δηαηαξαρή ζηελ αλάπηπμε, κπνξεί λα απνηειεί ηνλ πεξηνξηζηηθφ παξάγνληα γηα ηελ κεησκέλε παξαγσγή ηνπ IGF-I πνπ παξαηεξείηαη ζηα παηδηά απηά. Σν παξφλ εξεπλεηηθφ πξσηφθνιιν, δηαηξέζεθε ζε ηξία κέξε γηα ηελ θαιχηεξε κειέηε θαη ζπζρέηηζε ησλ απνηειεζκάησλ ηνπ. Ο ζθνπφο βέβαηα ηεο παξνχζαο εξγαζίαο ήηαλ ε κνξηαθή κειέηε ηεο δηαηαξαρήο ηνπ κεηαγσγηθνχ άμνλα GH/IGFI ζε παηδία κε «GHTD». Σν πξψην κέξνο είρε σο ζηφρν, ηε κειέηε ησλ αλαζηνιέσλ ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, ην δεχηεξν κέξνο ηελ χπαξμε πηζαλήο δηαζπλνκηιίαο θαη ην ηξίην κέξνο, ηελ πηζαλή ζπζρέηηζε ησλ ζηεξνεηδψλ ηνπ θχινπ ζην κνλνπάηη ηεο κεηαγσγήο ηνπ ζήκαηνο ηεο GH, ζε έλα αζζελή. Σα κέξε απηά αλαιχνληαη εθηελέζηεξα παξαθάησ. 131

133 7 ΤΜΠΔΡΑΜΑΣΑ πλνςίδνληαο ηα απνηειέζκαηα ηεο παξνχζαο κειέηεο, ζπκπεξαίλνπκε φηη θαη ηα ηέζζεξα παηδηά κε GHTD παξνπζίαδαλ πςειή έθθξαζε ηνπ αλαζηνιέα ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο GH, ηνλ CIS, ελψ ην PIAS ζηελ ζπγθεθξηκέλε νκάδα παηδηψλ δελ θαίλεηαη λα παίδεη θάπνην ζεκαληηθφ ξφιν. Ζ αξλεηηθή ξχζκηζε ηεο κεηάδνζεο ηνπ ζήκαηνο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο ζρεηίδεηαη κε πνιιαπινχο ζπλδπαζηηθνχο κεραληζκνχο πνπ θπξίσο πεξηιακβάλνπλ ηελ εζσηεξηθνπνίεζε ηνπ ππνδνρέα ηεο, ηνλ GHR θαη ηε δξάζε ησλ αξλεηηθψλ ξπζκηζηψλ ηνπ κνλνπαηηνχ φπσο νη SOCS. Όπσο ήδε έρεη αλαθεξζεί νη SOCS πξσηεΐλεο έρνπλ πξφζθαηα θεξδίζεη ην ελδηαθέξνλ φηη είλαη ζεκαληηθνί ξπζκηζηέο ηνπ JAK/STAT κνλνπαηηνχ. To CIS είλαη έλα κέινο ηεο νηθνγέλεηαο ησλ SOCS πξσηετλψλ. Μία ππφζεζε είλαη φηη ε εζσηεξηθνπνίεζε ηνπ ππνδνρέα ηεο απμεηηθήο νξκφλεο GHR είλαη ζεκαληηθή θαη φηη νη SOCS πξσηεΐλεο παίξλνπλ κέξνο ζηελ δηαδηθαζία απηή, κε ην λα ξπζκίδνπλ ηελ δηάζπαζε εκπιεθνκέλσλ πξσηετλψλ κέζσ ηεο νπβπθνπτηηλπιίσζήο ηνπο. Ζ πην ζεκαληηθή ηπξνζηληθή θηλάζε ε νπνία ελεξγνπνηεί ηεο δξάζεο ηεο απμεηηθήο νξκφλεο είλαη ε JAK2 (127, 128). H JAK2 ζπλδέεηαη ζηνλ GHR κέζσ ηεο πεξηνρήο ΒΟΥ1 ε νπνία βξίζθεηαη θνληά ζηελ δηακεκβξαληθή πιεπξά ηνπ ππνδνρέα. Χζηφζν, ππάξρνπλ ζηνηρεία πνπ δείρλνπλ φηη ην JAK2, είλαη δεζκεπκέλν επάλσ ζηνλ GHR θαη είλαη πνιχ πηζαλφλ ε ζχλδεζε κε ην ππφζηξσκα λα κνληκνπνηεί ην ζχκπινθν GHR-JAK2. Kαζψο ην JAK2 ελεξγνπνηείηαη, θσζθνξπιηψλεη ηνλ GHR ζε πνιιαπιά θαηάινηπα ηπξνζίλεο. Σν θσζθνξπιησκέλν ζχκπινθν GHR-JAK2 εμαζθαιίδεη πνιιαπιέο ζέζεηο ζχλδεζεο γηα ζεκαηνδνηηθά κφξηα πνπ πεξηέρνπλ ηελ SH2 πεξηνρή ή ΡTBs (phosphotyrosine binding motifs). Οη STAT πξσηεΐλεο ζπλδένληαη κέζσ ηεο SH2 πεξηνρήο ηνπο ζηνλ ππνδνρέα. Ζ πεξηνρή SH2 θαζψο θαη ην N-ηειηθφ άθξν είλαη ζεκαληηθέο γηα ηελ ζηαζεξφηεηα ηεο αιιειεπίδξαζεο ησλ STATs κε ην DNA. (89,90) Δίλαη γλσζηφ απφ ηελ βηβιηνγξαθία φηη ε πςειφηεξε ελεξγνπνίεζε ηεο ηπξνζηληθήο θσζθνξπιίσζεο ηνπ JAK2, επηηπγράλεηαη ζε πνιχ ιίγα ιεπηά κεηά ηελ ελεξγνπνίεζε ηεο απφ ην κφξην ηεο απμεηηθήο νξκφλεο, γεγνλφο πνπ δηαπηζηψζεθε ζηα θπζηνινγηθά άηνκα ζηα πεηξάκαηα καο. Ζ πεξίνδνο απηή ηεο ελεξγνπνίεζεο ηνπ JAK2, in vitro, αθνινπζείηαη απφ κία πεξίνδν απεπαηζζεηνπνίεζεο, φηαλ δελ κπνξεί λα πξαγκαηνπνηεζεί ε πςειφηεξε ελεξγνπνίεζε απφ ηε ζεκαηνδφηεζε ηεο GH, 132

134 ζηνηρείν πνπ δηαπηζηψλεηαη ζηνπο αζζελείο. Τπάξρνπλ πνιιά ζηάδηα, ζηα νπνία ε αξλεηηθή ξχζκηζε ηεο ζεκαηνδφηεζεο κεηά ηνλ ππνδνρέα κπνξεί λα πξαγκαηνπνηεζεί. Απηά είλαη ε εζσηεξηθνπνίεζε ηνπ ππνδνρέα, ε απεπαηζζεηνπνηήζε ησλ ελεξγνπνηεηψλ ηνπ κνλνπαηηνχ κέζσ απνθσζθνξπιίσζεο ηνπο, απνδφκεζε ησλ ζεκαηνδνηηθψλ δηάκεζσλ κνξίσλ θαη ηέινο ε δξάζε ησλ αξλεηηθψλ ξπζκηζηψλ ηνπ κεηαγσγηθνχ άμνλα ηεο GH. Οη πξσηεΐλεο πνπ πεξηέρνπλ SOCS box φπσο ην CIS, κπνξνχλ λα δξάζνπλ ζαλ παξάγνληεο πνπ νδεγνχλ ελεξγνπνηεκέλεο ζεκαηνδνηηθέο πξσηεΐλεο ζην πξσηεφζσκα γηα απνηθνδφκεζε. Μέζσ ηνπ SOCS box, νη πξσηεΐλεο πνπ ην πεξηέρνπλ, ζπλδένληαη κε elongins B θαη C (elongin BC complex) θαη cullin-2 θαη έηζη ζρεκαηίδνπλ έλα Δ3 ζχκπιεγκα (ubiquitin-protein isopeptide ligase) κέζσ ηνπ νπνίνπ νδεγνχληαη ζε απνηθνδφκεζε ζην πξσηεφζσκα. Δλδερνκέλσο, κέζσ απηνχ ηνπ κεραληζκνχ θαίλεηαη φηη ε CIS νπβπθνπηηηλπιηψλεηαη. ην πξψην κέξνο ηνπ εξεπλεηηθνχ πξσηνθφιινπ εξεπλήζακε ηελ πηζαλή δξάζε ησλ αλαζηνιέσλ ηνπ ζεκαηνδνηηθνχ κνλνπαηηνχ ηεο GH. Σα απνηειέζκαηα πνπ πήξακε έδεημαλ φηη ηα παηδηά απηά δελ θσζθνξπιίσλαλ ην STAT3, κεηά απφ επαγσγή ησλ θπηηάξσλ ηνπο κε hgh, θαη έρνπλ ππεξεθθξαζκέλε ηελ CΗS πξσηεΐλε, ζε ζχγθξηζε κε ηνπο κάξηπξεο. Ζ νπβηθνπηηλπιησκέλε (ubiquitinated 37kD) κνξθή ηεο CIS πξσηεΐλεο παξαηεξήζεθε κφλν ζηα θχηηαξα ησλ αζζελψλ. Με βάζε ηα απνηειέζκαηα απηά έγηλε θηλεηηθή κειέηε ηεο έθθξαζεο κνξίσλ πνπ είλαη ζεκαληηθά γηα ηελ κεηάδνζε ηνπ ζήκαηνο γηα λα ειέγμνπκε ηελ δξάζε ηνπ CIS ζε έλαλ απφ ηνπο αζζελείο. Απφ ηα πεηξάκαηα βξέζεθε φηη ζηνλ αζζελή απηφ ππάξρεη αξθεηή θαζπζηέξεζε ζηελ θσθσξπιίσζε ηνπ JAK2. Ζ πξψηκε παξνπζία ηνπ ubghr/cis ζπκπιέγκαηνο ζηα παηδηά πνπ πάζρνπλ απφ GHTD θαίλεηαη φηη πξνθαιεί ηελ θαζπζηεξεκέλε ελεξγνπνίεζε ηεο JAK2 θαη κηα εμαζζελεκέλε ελεξγνπνίεζε ηνπ παξάγνληα STAT3 φηαλ ρνξεγνχληαη ζηα θχηηαξα 200 ng/ml hgh (δφζε ε νπνία ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ GH κνλνπαηηνχ κεηαγσγήο ζήκαηνο ζε θπζηνινγηθνχο ηλνβιάζηεο). Τςειέο δφζεηο, φκσο, hgh (1000 ng/ml) ελεξγνπνηνχλ ηελ θσζθνξπιίσζε ησλ JAK2 θαη STAT3 ζηνπο ηλνβιάζηεο ησλ GHTD αζζελψλ. Ζ αδπλακία θσζθνξπιίσζεο ηνπ STAT3 ζηα παηδηά απηά ίζσο είλαη ηφζν έθδειε, δηφηη ην STAT3 βξίζθεηαη ζην θχηηαξν ζε κηθξφηεξα πνζνζηά απφ ηα ππφινηπα STATs. Σν εξψηεκα πνπ δεκηνπξγείηαη είλαη κε πνηνπο απφ ηνπο ηξεηο παξαθάησ 133

135 ηξφπνπο, αλαζηέιιεηαη ε ζεκαηνδφηεζε ηνπ GHR/JAK2; Δικόνα 70: Δηθόλα 70: Σρεκαηηθή απεηθόληζε ηνπ ζπζηήκαηνο νπβνπηθνπηηίλεο θαη ηεο εζσηεξηθνπνηήζεο ηνπ ππνδνρέα ηεο GH θαη ε απνδόκεζε ηνπ κέζσ απηνύ. 1) Ζ πξσηεΐλε CIS αληαγσλίδεηαη ηηο STAT γηα θνηλφ ζεκείν πξφζδεζεο ζηνλ ππνδνρέα GHR. Ζ CIS θαίλεηαη φηη αλαζηέιιεη ηελ GHR-JAK2 ζεκαηνδφηεζε, κέζσ παξνδηθνχ κεραληζκνχ αλαζηνιήο, πνπ εκπεξηέρεη αληαγσληζκφ αλάκεζα ζηελ CIS ( SH2 πεξηνρή ) θαη ηνλ STAT3 γηα θνηλφ ζεκείν πξφζδεζεο κε ηελ εζσηεξηθή θπηηαξνπιαζκαηηθή πεξηνρή ηνπ ππνδνρέα GHR. Απηή ε πεξηνρή πξφζδεζεο, είλαη πινχζηα ζε θσζθνηπξνζίλεο. Ο κεραληζκφο αλαζηνιήο κεηψλεηαη ζε απμαλφκελα επίπεδα ηνπ STAT3. 2) Ζ πξσηείλε CIS δξα κέζσ ηνπ κεραληζκνχ απνδφκεζεο πξσηετλψλ, φπνπ ν ππνδνρέαο GHR νδεγείηαη κέζσ ηεο CIS, γηα απνδφκεζε ζην πξσηεάζσκα. πγθεθξηκέλα, ε ζπλδεδεκέλε CIS (κε ηνλ ηπξφζηλν- θσζθνξπιησκέλν ππνδνρέα GHR) δξα σο παξάγσλ κεηαθνξάο ηνπ GHR ζην πξσηεάζσκα γηα απνηθνδφκεζε. Ζ εμαξηψκελε απφ ην πξσηεάζσκα απνηθνδφκεζε ηνπ νπβηθνπτηηλπιησκέλνπ παξάγνληα CIS, ε νπνία είλαη πεξηζζφηεξν πηζαλή ζηε κνξθή ηνπ (GHR-JAK2)-CIS ζπκπιέγκαηνο, θαίλεηαη φηη απνηειεί έλα ζεκαληηθφ βήκα ζηνλ ρξνλνεμαξηψκελν κεραληζκφ αλαζηνιήο απφ ηνλ CIS. 134