ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΑΚΩΝ ΑΝΩΜΑΛΙΩΝ ΣΕ ΕΜΒΡΥΑ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΑΥΤΟΜΑΤΗ ΑΠΟΒΟΛΗ ΠΡΩΤΟΥ ΤΡΙΜΗΝΟΥ. Παπαδοπούλου Θεοπίστη Μαία Α.Μ. :

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΑΣ ΤΜΗΜΑ ΜΑΙΕΥΤΙΚΗΣ Π Ρ Ο Γ Ρ Α Μ Μ Α Μ Ε Τ Α Π Τ Υ Χ Ι Α Κ Ω Ν Σ Π Ο Υ Δ Ω Ν «Ε Ρ Ε Υ Ν Α Σ Τ Η Γ Υ Ν Α Ι Κ Ε Ι Α Α Ν Α Π Α Ρ Α Γ Ω Γ Η» ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΑΚΩΝ ΑΝΩΜΑΛΙΩΝ ΣΕ ΕΜΒΡΥΑ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΑΥΤΟΜΑΤΗ ΑΠΟΒΟΛΗ ΠΡΩΤΟΥ ΤΡΙΜΗΝΟΥ Παπαδοπούλου Θεοπίστη Μαία Α.Μ. : Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: 1. Βραχνής Νικόλαος. Επίκουρος Καθηγητής Μαιευτικής Γυναικολογίας Ιατρικής ΕΚΠΑ (Επιβλέπων) 2. Καλανταρίδου Σοφία: Καθηγήτρια Μαιευτικής-Γυναικολογίας, Ιατρικής ΕΚΠΑ 3. Μαστοράκος Γεώργιος: Καθηγητής Ενδοκρινολογίας, Ιατρικής ΕΚΠΑ Αθήνα 2016

2 Science is an assault on ignorance 1 Matt Ridley

3 Miscarriage, Ronald Ophuis Adapted from:

4 Ευχαριστίες Ας μου επιτραπεί εδώ να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα μου, Επίκουρο Καθηγητή Μαιευτικής-Γυναικολογίας κύριο Νικόλαο Βραχνή, που μου έδωσε την δυνατότητα να εκπονήσω την μεταπτυχιακή μου εργασία, καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές και προτροπές του, η γνωριμία μου μαζί του ήταν πραγματικά μια μοναδική εμπειρία. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια Μαιευτικής Γυναικολογίας της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών κυρία Σοφία Καλανταρίδου, καθώς επίσης και τον διευθυντή του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών Έρευνα στη Γυναικεία Αναπαραγωγή Καθηγητή κύριο Γεώργιο Μαστοράκο που μου έκαναν την τιμή να δεχθούν να είναι μέλη της εξεταστικής μου επιτροπής. Χαίρομαι ιδιαιτέρως όταν στη ζωή μου συναντώ φωτισμένους καθηγητές που εκτός των τυπικών μαθημάτων, με βοηθούν με τις συμβουλές τους, την πορεία της ζωής τους και τις επιλογές τους να διευρύνω τους ορίζοντές μου και να παίρνω πιο εύκολα κάποιες αποφάσεις στα κρίσιμα σταυροδρόμια της ζωής μου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Διευθυντή του Εργαστηρίου Γενετικής Access to Genome Αθήνας κύριο Εμμανουήλ Μανωλάκο για την παραχώρηση των απαραίτητων δειγμάτων για την διεξαγωγή της παρούσας ερευνητικής εργασίας, για την πολύτιμη συνεργασία, καθοδήγηση και βοήθειά του, καθώς και τις διορθώσεις και συστάσεις που μου έκανε. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Μαιευτήρα- Γυναικολόγο, Διδάκτορα της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών κύριο Νικόλαο Βλαχάδη για την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων της μελέτης και για όλη την βοήθεια που μου προσέφερε σε όλα τα στάδια της εργασίας. 3

5 Τμήμα των αποτελεσμάτων της παρούσας εργασίας ανακοινώθηκαν στο 18ο Πανελλήνιο Συνέδριο Περιγεννητικής Ιατρικής (Αθήνα, Οκτωβρίου 2015). Η περίληψη της ανακοίνωσης δημοσιεύθηκε στο περιοδικό Περιγεννητική Ιατρική και Νεογνολογία (Παπαδοπούλου Θ., Βλαχάδης Ν. Μανωλάκος Ε., Καλανταρίδου Σ., Μαστοράκος Γ., Βραχνής Ν. Διερεύνηση Χρωμοσωμιακών Ανωμαλιών σε Έμβρυα μετά από Αυτόματη Αποβολή Πρώτου Τριμήνου. Περιγεννητική Ιατρική και Νεογνολογία 2015;10:40.) Τέλος, θα ήταν παράλειψή μου να μην ευχαριστήσω τους δικούς μου ανθρώπους και τους φίλους μου για την συμπαράσταση, την ανοχή και την κατανόησή τους κατά την διάρκεια και αυτής της διπλωματικής εργασίας. 4

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη Abstract Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α.1. Εισαγωγή Α.2. Αίτια Αυτόματων Αποβολών 14 Α.2.1. Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες 14 Α Αριθμητικές Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες 16 Τρισωμία 21 - Σύνδρομο Down 21 Τρισωμία 18 - Σύνδρομο Edwards 22 Τρισωμία 13 - Σύνδρομο Patau 24 Τρισωμία Τρισωμία Σύνδρομο Turner - Μονοσωμία Χ 28 Σύνδρομο Klinefelter XXY 31 Α Δομικές Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες 32 Α Μη Ισοζυγισμένες δομικές ανακατατάξεις 33 Ελλείμματα 33 Διπλασιασμοί 35 Ισοχρωμοσώματα 36 Δακτυλιοειδή χρωμοσώματα 37 Δικεντρικά χρωμοσώματα 38 Χρωμοσώματα δείκτες 39 Α Ισοζυγισμένες δομικές ανακατατάξεις 40 Μεταθέσεις Αναστροφές

7 Α.2.2. Μητρικά Νοσήματα 44 Α.2.3. Ανατομικές ανωμαλίες 44 Α.2.4. Ενδοκρινικές διαταραχές 45 Α.2.5. Ανοσολογικοί Παράγοντες 46 Α.2.6. Κληρονομική Θρομβοφιλία 47 Α.2.7. Διαιτητικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες 48 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 50 Β.1. Υλικό και Μέθοδοι 51 Β.2. Αποτελέσματα 56 Β.3. Συζήτηση 70 Β.4. Συμπεράσματα 77 Βιβλιογραφία 79 Παράρτημα Ι. Σύμβολα και συντομογραφίες χρωμοσωμικών ανωμαλιών 98 Παράρτημα ΙΙ. Περιγραφή παθολογικών καρυοτύπων σύμφωνα με το ISCN

8 Περίληψη Εισαγωγή: Οι αυτόματες αποβολές αποτελούν την συχνότερη επιπλοκή των κυήσεων και σε περισσότερο από 80% των περιπτώσεων συμβαίνουν πριν την συμπλήρωση 12 εβδομάδων κύησης. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες αποτελούν το συχνότερο αίτιο των σποραδικών αυτόματων αποβολών. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση των χρωμοσωμικών ανωμαλιών στις αυτόματες αποβολές με κυτταρογενετική ανάλυση των προϊόντων αυτόματης αποβολής πρώτου τριμήνου. Υλικό και Μέθοδοι: Μελετήθηκαν συνολικά 198 έμβρυα από αυτόματη αποβολή μονήρους κύησης. Το υλικό συλλέχθηκε από ιδιωτικό εργαστήριο ιατρικής γενετικής στην Ελλάδα κατά το διάστημα 1 Ιανουαρίου 2015 ως 30 Ιουνίου Πραγματοποιήθηκε κλασσική κυτταρογενετική ανάλυση μετά από καλλιέργεια των προϊόντων αποβολής, ενώ στις περιπτώσεις χωρίς αποτέλεσμα χρησιμοποιήθηκε η QF-PCR. Όλα τα δείγματα προϊόντων αποβολής συνοδεύονταν από δείγμα αίματος της μητέρας για αποκλεισμό της επιμειξίας. Αποτελέσματα: Σε 83 έμβρυα διαπιστώθηκαν χρωμοσωμικές ανωμαλίες (41,9%). Η διάρκεια κύησης ήταν 7-12 εβδομάδες κύησης (Μ.Ο.:7,8 ± 1,1) και η ηλικία της μητέρας ήταν έτη (Μ.Ο.:35,0 ± 4,6). Η αναλογία των φύλων (άρρενα/θήλεα) ήταν 1,45. Σε 8 περιπτώσεις διαπιστώθηκαν δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες (9,6%). Η συχνότερη καρυοτυπική ανωμαλία ήταν η αυτοσωματική τρισωμία (45 έμβρυα, 54,2%) με συχνότερες τις τρισωμίες 16 και 22 (από 7 περιπτώσεις). 9 έμβρυα (10,8%) έπασχαν από αριθμητική ανωμαλία των φυλετικών χρωμοσωμάτων (όλα 45,Χ). Σε 7 προϊόντα αποβολής διαπιστώθηκε μωσαϊκό (5 με 45,Χ/46,ΧΧ και 2 με 46,ΧΥ/46,ΧΧ). 12 έμβρυα διαγνώστηκαν με τριπλοειδία (5 άρρενα 69,ΧΧΥ και 7 θήλεα 69,ΧΧΧ). Τέλος διαπιστώθηκε ένα έμβρυο με διπλή τρισωμία (14 και 21) και μία περίπτωση διπλής υπεραριθμίας αυτοσωματικού και φυλετικού χρωμοσώματος (XXY με συνύπαρξη τρισωμίας 18). 7

9 Συμπεράσματα: Η κυτταρογενετική ανάλυση των προϊόντων των αυτόματων αποβολών θα πρέπει να αποτελεί το πρώτο βήμα της διερεύνησης για την παροχή σχετικής συμβουλευτικής ώστε να αποφεύγονται μη αναγκαίες ή πλημμελώς τεκμηριωμένες περαιτέρω εξετάσεις και θεραπείες. Λέξεις κλειδιά: Αυτόματη αποβολή, χρωμοσωμικές ανωμαλίες, κύηση, κυτταρογενετική 8

10 Abstract Objective: Spontaneous abortion is the most common complication of pregnancy and in more than 80% of cases occurs before the completion of 12 weeks of gestation. Chromosomal abnormalities are the most common cause of sporadic spontaneous miscarriages. The aim of this study is to investigate the chromosomal abnormalities in first trimester spontaneous miscarriages detected by cytogenetic analysis. Material and Methods: A total number of 198 fetuses from spontaneous abortion were collected from a single genetic center in Greece between 1 January 2015 and 30 June For the karyotype analysis, all samples were cultured and harvested by standard techniques and conventional karyotype analysis by GTG banding was performed. In chromosomal abnormalities undetectable by conventional karyotype analysis QF-PCR was performed. All samples were accompanied by maternal blood sample to exclude contamination. Results: Abnormal karyotype was found in 83 embryos out of 198 cases (41.9%). The gestational age was 7-12 weeks (mean: 7.8 ± 1.1) and maternal age was years (mean: 35.0 ± 4.6). Sex ratio was In 8 cases structural abnormalities were detected (9.6%). The most frequent chromosomal abnormality was autosomal trisomy (45 embryos, 54.2%), while the most common trisomies were 16 and 22, 7 cases). Nine fetuses (10.8%) suffered from numerical abnormalities of sex chromosomes (all cases were 45,X). Mosaicism was found in 7 samples (5 with 45,X/46,XX and 2 with 46,XY/46,XX). Twelve fetuses were diagnosed with triploidy (5 males 69,XXY and 7 females 69,XXX). Finally we found a fetus with double trisomy (14 and 21) and a case of Klinefelter (XXY) and Edwards (trisomy 18) syndromes coexistence. 9

11 Conclusions: Cytogenetic analysis of the products of conception should be the first step in the investigation of the causes of miscarriages. Results of cytogenetic analysis provide relevant counseling to avoid unnecessary or poorly documented further examination and treatment. Keywords: Spontaneous abortion; miscarriages; chromosomal abnormalities; pregnancy; cytogenetics 10

12 A) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

13 Α.1. Εισαγωγή Κατακόρυφη αύξηση των αυτόματων αποβολών πρώτου τριμήνου διαπιστώνεται τα τελευταία χρόνια στη χώρα μας 2. Ολοένα και περισσότερες καταγραφές αυτόματων αποβολών πρώτου τριμήνου γίνονται πλέον στα σχετικά αρχεία των μαιευτηρίων. Μόνο το εξάμηνο Σεπτεμβρίου-Φεβρουαρίου 2010 το ποσοστό των αυτόματων αποβολών πρώτου τριμήνου επί του συνόλου των τοκετών στην Μαιευτική κλινική του Αρεταίειου νοσοκομείου ήταν 1,5%, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για το διάστημα Σεπτεμβρίου-Φεβρουαρίου 2011 εκτοξεύτηκε στο 4%. Πρόκειται λοιπόν για ένα φαινόμενο που χρήζει άμεσης διερεύνησης προκειμένου να αποσαφηνιστούν οι παράγοντες κινδύνου 3. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (WHO) 4 και το Αμερικανικό Κολλέγιο Μαιευτήρων Γυναικολόγων (ACOG) 5 ως αποβολή (spontaneous abortion/miscarriage) ορίζεται η αυτόματη απώλεια της εγκυμοσύνης πριν από τις 20 εβδομάδες κύησης, (δηλαδή πριν από το στάδιο κατά το οποίο το κύημα μπορεί να θεωρηθεί βιώσιμο) ή η απώλεια ενός εμβρύου βάρους μικρότερου των 400 γραμμαρίων (αν η ηλικία κύησης είναι άγνωστη). Παρ όλα αυτά, οι ορισμοί ποικίλλουν σύμφωνα με την νομοθεσία του κάθε κράτους 6. Το κάθε κράτος ορίζει διαφορετικά την αποβολή. Για παράδειγμα, το όριο των 20 εβδομάδων στην Ελλάδα επεκτείνεται στις 24 εβδομάδες, ενώ σε ορισμένες άλλες ευρωπαϊκές χώρες επεκτείνεται στις 28 εβδομάδες 7,8. Πέραν αυτών των ορίων η απώλεια της εγκυμοσύνης καλείται εμβρυϊκός θάνατος (stillbirth) 4. Η αυτόματη αποβολή είναι η πιο συχνή επιπλοκή της εγκυμοσύνης 9,10. Ωστόσο, δεν υπάρχει πραγματική συμφωνία, σε ολόκληρη τη βιβλιογραφία, σχετικά με τη συχνότητα εμφάνισης των αποβολών. Τα προτεινόμενα ποσοστά είναι 8-20%, 31%, εως 50% και υψηλότερα 11. Οι περισσότεροι όμως ερευνητές, φαίνεται να συγκλίνουν στο 15% περίπου όταν αναφερόμαστε στην απώλεια κλινικά 12

14 επιβεβαιωμένων κυήσεων (κυήσεις που έχουν διαγνωστεί υπερηχογραφικά με την απεικόνιση εμβρυϊκού σάκου ή με αδιαμφισβήτητα κλινικά σημεία εγκυμοσύνης) 4 και περίπου στο 50% όταν σ αυτές συμπεριλαμβάνονται και οι απώλειες των βιοχημικών κυήσεων (κύηση που διαγιγνώσκεται νωρίς μόνο με την ανίχνευση της hcg στα ούρα ή στον ορό και που δεν αναπτύσσεται σε μια κλινική εγκυμοσύνη) 4. Πάνω από το 80% των αυτόματων αποβολών συμβαίνουν στις 12 πρώτες εβδομάδες κύησης και τουλάχιστον οι μισές από αυτές οφείλονται σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες 6 (Εικόνα 1). Chromosomal Anomalies (%) 60% 50% 40% 30% 20% First trimester 55% Second trimester 35% Third trimester 5% 10% 0% First trimester 55% Second trimester 35% Third trimester 5% Εικόνα 1. Συχνότητα χρωμοσωμικών ανωμαλιών (%) σε αποβολές και εμβρυϊκούς θανάτους σε κάθε τρίμηνο. Adapted from: Williams Obstetrics, 23 rd Edition, New York,

15 Α.2. Αίτια Αυτόματων Αποβολών Η αυτόματη αποβολή είναι ένα συχνό και συναισθηματικά καταστρεπτικό γεγονός που συνοδεύει την ανθρώπινη αναπαραγωγή. Τα πράγματα γίνονται ακόμη χειρότερα όταν σε μερικές περιπτώσεις τα αίτια είναι ανεξήγητα και παρ όλες τις επιστημονικές προόδους συχνά δεν μπορούν να προσδιοριστούν 22. Πάντως, είναι κοινά παραδεκτό ότι για τις αποβολές κυρίως του πρώτου τριμήνου, κλινικά αναγνωρισμένων κυήσεων, ευθύνονται σε ποσοστό μεγαλύτερο του 50% οι εμβρυϊκές χρωμοσωμικές ανωμαλίες 6, Από την άλλη πλευρά, αν δούμε τις αποβολές από μια εξελικτική οπτική, αυτό που θεωρούμε μια δυσμενή έκβαση της εγκυμοσύνης αντιπροσωπεύει συχνά μια βιολογική διαλογή ή μια φυσική επιλογή. Οι γυναίκες φαίνεται πως έχουν ένα αποδοτικό σύστημα διαλογής ( quality control ) για να αποβάλλουν τα γενετικά ανώμαλα έμβρυα. Με άλλα λόγια, η αποβολή μπορεί κάλλιστα να αντιπροσωπεύει έναν μηχανισμό επιλογής απογόνων 11,27, Α.2.1. Χρωμοσωμικές ανωμαλίες Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες αποτελούν μια μεγάλη κατηγορία γενετικών νοσημάτων που ευθύνονται σε μεγάλο ποσοστό για τις αποτυχημένες κυήσεις. Υπολογίζεται ότι τουλάχιστον το 50% των αποβολών κλινικά αναγνωρισμένων κυήσεων κυρίως του πρώτου τριμήνου οφείλονται σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες 6, Τα χρωμοσώματα αποτελούνται από γενετικό υλικό (DNA) και πρωτεΐνες και είναι υπεύθυνα για τη μεταφορά της γενετικής πληροφορίας. Οποιαδήποτε αλλαγή στον αριθμό ή τη δομή τους μπορεί να έχει σοβαρές κλινικές συνέπειες 32. Οι ανωμαλίες των χρωμοσωμάτων μπορεί να είναι είτε αριθμητικές, είτε δομικές 14

16 ανωμαλίες και μπορεί να εμπλέκουν ένα ή περισσότερα αυτοσωματικά χρωμοσώματα, φυλετικά χρωμοσώματα ή και τα δύο ταυτόχρονα 33. Τα χρωμοσώματα αποτελούνται από γονίδια. Τα γονίδια αποτελούνται από DNA ή δεοξυριβονουκλεικό οξύ 34. Όλο το DNA του κυττάρου (με μόνη εξαίρεση το μιτοχονδριακό DNA) βρίσκεται στα χρωμοσώματα του πυρήνα 35. Η διπλή έλικα του DNA, όπως την πρωτοπεριέγραψαν το 1953 οι Watson και Crick 36, περιέχει τις γενετικές πληροφορίες και αποτελεί τη βάση για τον αναδιπλασιασμό του DNA. Τα γονίδια αποτελούν διακριτές περιοχές του DNA και το μέγεθός τους ποικίλει από λίγα νουκλεοτίδια έως εκατοντάδες κιλοβάσεις. Υπάρχουν περίπου τρία δισεκατομμύρια (3x10 9 ) ζευγάρια βάσεων στο ανθρώπινο DNA 32. Τα σημαντικότερα συστατικά του DNA είναι οι τέσσερις νουκλεοτιδικές βάσεις που συνήθως αναφέρονται με τα αρχικά τους: A (Adenine/αδενίνη), T (Thymine/θυμίνη), C (Cytosine/κυτοσίνη) και G (Guanine/γουανίνη) 37,38. Στον φυσιολογικό άνθρωπο υπάρχουν 46 (2n=46) χρωμοσώματα 39 σε κάθε κύτταρο που φέρει πυρήνα, τα οποία σχηματίζουν 23 ομόλογα ζεύγη (ανά δύο όμοια/αλληλόμορφα, με την έννοια ότι περιέχουν τα ίδια γονίδια στις ίδιες θέσεις). Τα 22 ζεύγη είναι μορφολογικά όμοια στα αρσενικά και στα θηλυκά άτομα και ονομάζονται αυτοσωμικά. Το 23 ο ζεύγος διαφέρει. Στα αρσενικά υπάρχει ένα Χ και ένα Υ χρωμόσωμα ενώ στα θηλυκά δύο Χ χρωμοσώματα. Τα χρωμοσώματα του 23 ου ζεύγους ονομάζονται φυλετικά γιατί καθορίζουν το φύλο. Κάθε παιδί κληρονομεί το 50% των χρωμοσωμάτων και γονιδίων του από τον πατέρα του και το άλλο 50% από τη μητέρα του. Ο προσδιορισμός λαθών στη δομή ή στον αριθμό των χρωμοσωμάτων είναι δυνατός με τον καρυότυπο (Εικόνα 2). Μερικά από αυτά τα «λάθη» οδηγούν σε θάνατο, ασθένειες ή σε ανωμαλίες ενώ κάποια άλλα λιγότερο σημαντικά περνούν απαρατήρητα για πάντα χωρίς επιπλοκές για τον οργανισμό 32,40. 15

17 Εικόνα 2. Φυσιολογικός καρυότυπος θήλεος ατόμου (46ΧΧ). Adapted from: Α Αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες Οι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες αποτελούν την πιο συχνή αιτία της πρόωρης απώλειας της εγκυμοσύνης 41. Αν για το 50% περίπου των αυτόματων αποβολών του πρώτου τριμήνου ευθύνονται οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες 6, 23-29, το 86% αυτών των ανωμαλιών είναι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες 24. Τα σωματικά κύτταρα, που περιέχουν δύο από κάθε χρωμόσωμα, ονομάζονται διπλοειδή. Οι ανθρώπινοι γαμέτες (ωάριο και σπερματοζωάριο) έχουν απλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων, δηλ. 23. Ο διπλοειδής αριθμός χρωμοσωμάτων διατηρείται σε διαδοχικές γενεές σωματικών κυττάρων με τη διαδικασία της μίτωσης, ενώ ο απλοειδής αριθμός αποκτάται με τη διαδικασία της μείωσης 37. Οι ανωμαλίες που έχουν σχέση με τον αριθμό των χρωμοσωμάτων ταξινομούνται κυρίως σε δύο κατηγορίες, τις πολυπλοειδίες και τις ανευπλοειδίες. 16

18 Ένα ακριβές πολλαπλάσιο του απλοειδικού αριθμού χρωμοσωμάτων (n=23) λέγεται πλοειδία. Στην ευπλοειδία ένα ολόκληρο σύνολο χρωμοσωμάτων αναπαράγεται μία φορά. Όταν η αναπαραγωγή του μονοπλοειδούς συνόλου (n=23) γίνει μία φορά, αυτό είναι χαρακτηριστικό των φυσιολογικών σωματικών κυττάρων (2n=46 διπλοειδές) (Εικόνα 2). Σε περίπτωση όμως που το μονοπλοειδές σύνολο αναπαραχθεί περισσότερες από μία φορές, τότε υπάρχει χρωμοσωμική ανωμαλία και καλείται πολυπλοειδία. Για παράδειγμα, 3n=69 τριπλοειδία (Εικόνα 3) 4n=92 τετραπλοειδία (Εικόνα 4) 8,33. Αλλιώς πολυπλοειδία καλείται η ύπαρξη τριών ή παραπάνω σειρών του μονοπλοειδούς συνόλου (n=23) στον πυρήνα του κυττάρου. Οι πολυπλοειδίες είναι συνήθως ασυμβίβαστες με τη ζωή και απαντώνται εξαιρετικά σπάνια σε ζώντα νεογνά 8,42. Χρειάζεται επίσης να σημειωθεί ότι οι πολυπλοειδίες οδηγούν σε υδατιδώδη πλακουντική εκφύλιση (μερική μύλη κύηση) 7,43. Οι τριπλοειδίες εμφανίζονται σε ποσοστό περίπου 1% του συνόλου των συλλήψεων και σε ποσοστό 17-18% όλων των αποβολών που οφείλονται σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες 44,45. Σε πολύ σπάνιες περιπτώσεις τριπλοειδικά έμβρυα επιβιώνουν ως το τέλος της κύησης 46, ενώ αν γεννηθούν ζωντανά δεν επιβιώνουν για πολύ 33. Η γονική προέλευση του επιπλέον απλοειδικού συνόλου χρωμοσωμάτων σε αυτές τις περιπτώσεις φαίνεται πως είναι πατρική περίπου στα 2/3 των περιπτώσεων και οφείλεται συνήθως στην γονιμοποίηση ενός φυσιολογικού απλοειδούς ωαρίου είτε από δύο σπερματοζωάρια, είτε από ένα διπλοειδές σπερματοζωάριο (αποτέλεσμα αποτυχίας κατά τη μειωτική του διαίρεση) 49. Η μητρικής προέλευσης επιπλέον απλοειδικού συνόλου χρωμοσωμάτων, φαίνεται να είναι αποτέλεσμα αποτυχίας της πρώτης μητρικής μειωτικής διαίρεσης που έχει ως αποτέλεσμα διπλοειδές ωάριο ή λόγω διατήρησης του δεύτερου πολικού σωματίου (καθυστέρηση ενσωμάτωσης του δεύτερου πολικού σωματίου σε ένα στα πρώιμα βλαστομερίδια) 45,50. 17

19 Εικόνα 3. Καρυότυπος τριπλοειδίας (69 XXY). Adapted from: Yilmaz et al. BJMG 2007;10:71-6 Εικόνα 4. Καρυότυπος τετραπλοειδίας (92 XXYY). Adapted from: Chen et al. J Mol Diagn 2000;2:

20 Οι τετραπλοειδίες είναι ακόμη πιο σπάνιες από τις τριπλοειδίες. Οι τετραπλοειδίες ανευρίσκονται σε ποσοστό 6-7% περίπου του συνόλου των αποβαλλόμενων έμβρυων λόγω χρωμοσωμικών ανωμαλιών 44,45. Μια πιθανή προέλευση της τετραπλοειδίας είναι ο διπλασιασμός των χρωμοσωμάτων σε επίπεδο ζυγώτη 42. Ανευπλοειδία καλείται η ανωμαλία στην οποία μεταβάλλεται ο αριθμός ενός συγκεκριμένου χρωμοσώματος. Για παράδειγμα, 2n (φυσιολογικό), 2n+1 (τρισωμία) (Εικόνα 5), 2n-1 (μονοσωμία), 2n+1+1 (διπλή τρισωμία), 2n+2 (τετρασωμία), 2n-2 (νουλισωμία/έχουν χαθεί δύο ομόλογα χρωμοσώματα) 33,51. Εικόνα 5. Καρυότυπος τρισωμίας 21 θήλεος (47,ΧΧ+21). Adapted from: Μολονότι τα αίτια της ανευπλοειδίας δεν είναι απολύτως κατανοητά 32,33, είναι γνωστό ότι οι ανευπλοειδίες συνήθως οφείλονται σε αποτυχία διαχωρισμού (nondisjunction) ενός ζεύγους ομόλογων χρωμοσωμάτων κατά το στάδιο της 19

21 ανάφασης της πρώτης μειωτικής διαίρεσης (τρισωμίες 13, 15, 16 και 21) ή σε αποτυχία διαχωρισμού των αδελφών χρωματίδων στη μείωση ΙΙ (τρισωμία 18) επίσης στο στάδιο της ανάφασης 7 (Εικόνα 6). Η πιθανότητα μη διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων αυξάνει όσο αυξάνει η ηλικία της μητέρας 7,30, Ο μη διαχωρισμός μπορεί να συμβεί και μετά τη γονιμοποίηση δύο φυσιολογικών γαμετών, δηλαδή στη μίτωση μεταζυγωτικών κυττάρων από τα οποία θα προκύψουν ανευπλοειδικές κυτταρικές σειρές. Το φαινόμενο αυτό συναντάται στο 5% των περιπτώσεων τρισωμίας 21 και είναι ανεξάρτητο από την ηλικία της μητέρας. Το αποτέλεσμα του μεταζυγωτικού μη διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων είναι ο μωσαϊκισμός όπου το έμβρυο αποτελείται από ανευπλοειδικά και φυσιολογικά κύτταρα 60. Από τις αυτοσωματικές ανευπλοειδίες, συχνότερες είναι οι τρισωμίες 13, 16, 18, 21 και 22 (σε αναλογία 50% των αυτόματων αποβολών με γενετικές ανωμαλίες). Από τις ανευπλοειδίες των φυλετικών χρωμοσωμάτων συχνότερη (περίπου 25% στο σύνολο των γενετικώς ανώμαλων αυτόματων αποβολών) είναι η μονοσωμία 45,Χ, ενώ λιγότερο συχνή είναι η τρισωμία 47, ΧΧΥ. Η αυτοσωμική μονοσωμία είναι σχεδόν πάντα μη συμβατή με την ζωή 6,7,33,61,62.. Εικόνα 6. Ανευπλοειδία λόγω μη διαχωρισμού. Adapted from: / /bio study-guide-with-diagrams-flash-cards/ 20

22 Τρισωμία 21-Σύνδρομο Down Ο Βρετανός γιατρός John Langdon Down ήταν ο πρώτος που περιέγραψε το σύνδρομο Down το Η χρωμοσωμική βάση όμως της διαταραχής, ότι δηλαδή το σύνδρομο οφείλεται στην τρισωμία 21, βρέθηκε σχεδόν 100 χρόνια αργότερα, το 1959 από τον Jerome Lejeune και συν 64. Η πιθανότητα να γεννηθεί ένα παιδί με σύνδρομο Down είναι περίπου 1 στα 800 στον γενικό πληθυσμό, με την πιθανότητα γέννησης παιδιού με τρισωμία 21 να αυξάνει με την αύξηση της ηλικίας της μητέρας 6,65. Σε ποσοστό περίπου 95% το σύνδρομο Down οφείλεται σε μη διαχωρισμό του χρωμοσώματος 21 κατά τη μητρική μείωση (περίπου στο 75% των περιπτώσεων κατά τη διάρκεια της μείωσης Ι και κατά 25% κατά τη διάρκεια της μείωσης ΙΙ) και το υπόλοιπο 5% των περιπτώσεων οφείλεται είτε σε μωσαϊκισμό, είτε σε μετάθεση 6,66. Μερικά χαρακτηριστικά γνωρίσματα του συνδρόμου σε νεογνά είναι η υποτονία, οι χαλαρές αρθρώσεις, το μαλακό δέρμα, το αυχενικό πτερύγιο με χαλαρό δέρμα, η προέχουσα γλώσσα, η πεπλατυσμένη γέφυρα της μύτης, ο επίκανθος, οι λοξές βλεφαρικές σχισμές, τα μικρά αυτιά, η μονή χειρομαντική γραμμή, η υποπλαστική μεσαία φάλλαγγα του πέμπτου δακτύλου, τα κοντά δάχτυλα, λαιμός, χέρια, και η ύπαρξη μεγάλου διαστήματος ανάμεσα στα δύο πρώτα δάχτυλα των ποδιών ( sandal-toe-gap ) (εικόνα 7). Επιπλέον, πολλά από τα παιδιά αυτά (~40%) 32 παρουσιάζουν συγγενείς καρδιακές ανωμαλίες, ιδιαίτερα δε προβλήματα με τη διαφραγματοποίηση της καρδιάς. Αυτά περιλαμβάνουν κολποκοιλιακή επικοινωνία, ανωμαλίες του μεσοκοιλιακού διαφράγματος, ανοικτό αρτηριακό πόρο και ανωμαλίες της υποκλειδίου αρτηρίας. Συναντώνται επίσης συχνά ανωμαλίες της ανάπτυξης του γαστρεντερικού σωλήνα. Το κυριότερο όμως χαρακτηριστικό του συνδρόμου είναι η νοητική υστέρηση, η οποία κυμαίνεται από μέτρια έως σοβαρή (Intelligence Quotient, IQ~25-50) 6,32,67. Επίσης, υπάρχουν ενδείξεις ότι τα άτομα με σύνδρομο Down αντιμετωπίζουν αυξημένο κίνδυνο για ασθένειες όπως η λευχαιμία, οι θυρεοειδοπάθειες 6, η απώλεια ακοής και η πρόωρη εμφάνιση της νόσου Alzheimer

23 Εικόνα 7. Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά συνδρόμου Down Adapted from: Τρισωμία 18 - Σύνδρομο Edwards Η τρισωμία 18 περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον John Hilton Edwards 69 το 1960 και είναι γνωστή ως σύνδρομο Edwards. Xαρακτηρίζεται από ένα επιπλέον αντίγραφο του χρωμοσώματος 18. Εμφανίζεται με συχνότητα 1 στις γεννήσεις και με αναλογία φύλου 3-4 κορίτσια : 1 αγόρι. H πιθανότητα να γεννηθεί παιδί με τρισωμία 18 αυξάνει με την αύξηση της ηλικίας της μητέρας 6,42. Τα περισσότερα έμβρυα (85%) πεθαίνουν πριν τη γέννα. Το 30% όσων γεννιούνται πεθαίνει στον πρώτο μήνα ζωής, ενώ μόλις το 10% ζει πάνω από το ένα έτος 70. Υπάρχουν ελάχιστες περιπτώσεις ατόμων με τρισωμία 18 που έφτασαν μέχρι την εφηβεία και λίγο πέρα από αυτή 6,33,70-72 στις περισσότερες των περιπτώσεων όμως πρόκειται για 22

24 μωσαϊκά άτομα Οι κύριες αιτίες για τον πρόωρο θάνατο των ατόμων με τρισωμία 18 είναι οι συγγενείς καρδιοπάθειες 33. Στο 80% των περιπτώσεων η τρισωμία 18 είναι αποτέλεσμα ενός de novo μειωτικού μη αποχωρισμού, το 10% είναι μωσαϊκά άτομα με φαινότυπο που ποικίλει, αλλά είναι σαφώς ηπιότερος και το υπόλοιπο 10% είναι άτομα που έχουν κάποια μετάθεση, είτε de novo, είτε κληρονομούμενη από γονέα φορέα μετάθεσης 33. Τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των ατόμων με τρισωμία 18 (εικόνα 8) περιλαμβάνουν νοητική υστέρηση, σοβαρές ανωμαλίες της καρδιάς και των νεφρών, υπερτονία, μικρογναθία, οίδημα της αυχενικής πτυχής, ατρησία του οισοφάγου, βράχυνση των άκρων και απουσία της κερκίδας, χαμηλή πρόσφυση των συχνά δυσμορφικών αυτιών, κοντό στέρνο, σφιγμένες γροθιές με χαρακτηριστικό τρόπο (εφίππευση των δακτύλων του χεριού το δεύτερο και πέμπτο δάκτυλο εφιππεύουν το τρίτο και τέταρτο δάκτυλο) και στρεβλοποδία, τα νύχια είναι συνήθως υποπλαστικά. Επίσης, παρατηρούνται κύστεις των χοριοειδών πλεγμάτων του εγκεφάλου, ενδομήτρια καθυστέρηση της ανάπτυξης και αναπνευστικά προβλήματα 6,33,42. Εικόνα 8. Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά συνδρόμου Edwards. Adapted from: 23

25 Τρισωμία 13 - Σύνδρομο Patau Η τρισωμία 13 ή σύνδρομο Patau πρωτοπεριγράφηκε το 1960 από τον Klaus Patau 79. Xαρακτηρίζεται από ένα επιπλέον αντίγραφο του χρωμοσώματος 13. Εμφανίζεται με συχνότητα περίπου 1 στις γεννήσεις 6, με την πιθανότητα γέννησης παιδιού με τρισωμία 13 να αυξάνει με την αύξηση της ηλικίας της μητέρας 42. Η πιθανότητα γέννησης ενός παιδιού με σύνδρομο Patau είναι χαμηλή, διότι η πλειοψηφία των κυήσεων με αυτή την χρωμοσωμική ανωμαλία καταλήγουν σε αυτόματες αποβολές. Ακόμη και τα παιδιά εκείνα που επιβιώνουν κατά τη γέννηση, έχουν περιορισμένη διάρκεια ζωής 80. Ο μέσος όρος επιβίωσης μετά τη γέννηση των παιδιών αυτών είναι 7 ημέρες. Περίπου 10% του συνόλου των ζώντων γεννηθέντων επιβιώνουν μέχρι τον 1 ο χρόνο ζωής 6. Μεμονωμένες περιπτώσεις ατόμων με τρισωμία 13 επιβιώνουν μετά τον 1 ο χρόνο ζωής Το επιπλέον χρωμόσωμα δημιουργείται συνήθως από μη διαχωρισμό στη μείωση Ι της μητέρας. Το 75% των περιπτώσεων του συνδρόμου οφείλεται σε τρισωμία του χρωμοσώματος 13. Ένα ποσοστό 20% οφείλεται σε Robertsonian μετάθεση με το χρωμόσωμα 14. Η μετατόπιση αυτή είτε δημιουργείται de novo, είτε κληρονομείται σε ποσοστό 5%. Περιπτώσεις μωσαϊκισμού έχουν αναφερθεί και σε άτομα με τρισωμία 13, μόνο που τα άτομα αυτά υπέφεραν από λιγότερες και λιγότερο σοβαρές ανωμαλίες 33,84. Τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της τρισωμίας 13 (εικόνες 9,10) περιλαμβάνουν καρδιακές ανωμαλίες (80-90% των περιπτώσεων) και ολοπροσεγκεφαλία (70% των περιπτώσεων). Η ολοπροσεγκεφαλία μπορεί να συνοδεύεται από μικροκεφαλία, αρκετές ανωμαλίες των οφθαλμών, υπερτελορισμό, ορισμένες φορές μικροφθαλμία, κολοβώματα στην ίριδα, ενίοτε και απουσία των οφθαλμών και κυκλωπία, έντονες ανωμαλίες της μύτης (ίσως παρουσία προβοσκίδας), ανωμαλίες της υπερώας (υπερώια σχιστία, χειλεοσχιστία), έλλειψη δέρματος από το κρανίο. Τα αυτιά εμφανίζουν δυσπλασίες και συχνά τα άτομα αυτά είναι κωφά. Επίσης, εμφανίζουν πολυδακτυλία, τα χέρια κλείνουν σε γροθιά, με το 24

26 δεύτερο και πέμπτο δάκτυλο να εφιππεύουν το τρίτο και το τέταρτο, όπως στην τρισωμία 18, δισχιδή ράχη, ραιβοποδία και μονήρη ομφαλική αρτηρία. Παρατηρείται επίσης καθυστέρηση της ανάπτυξης και σοβαρή διανοητική καθυστέρηση, ανωμαλίες του ουρογεννητικού συστήματος, μεταξύ των οποίων κρυψορχία στα αγόρια, δίκερως μήτρα και υποπλαστικές ωοθήκες στα κορίτσια και πολυκυστικοί νεφροί 6,33,42,84. Τρισωμία 16 Η τρισωμία 16 είναι η πιο συχνή αυτοσωματική ανευπλοειδία που ανευρίσκεται στα προϊόντα αυτόματων αποβολών. Η πλήρης τρισωμία 16 είναι σχεδόν πάντα μη συμβατή με τη ζωή, τα έμβρυα συνήθως αποβάλλονται κατά το πρώτο τρίμηνο της κύησης, αλλά έχει αναφερθεί και περίπτωση εμβρύου που έφτασε μέχρι τις 35 εβδομάδες κύησης 85. Οφείλεται στις περισσότερες των περιπτώσεων σε μη διαχωρισμό του χρωμοσώματος 16 κατά την μητρική μείωση Ι 42,85. Επίσης, έχουν αναφερθεί περιπτώσεις μωσαϊκισμού τρισωμίας Μερικά από τα χαρακτηριστικά που εμφανίζουν τα παιδιά με μωσαϊκισμό τρισωμίας 16 είναι η ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης, οι καρδιακές ανωμαλίες, η μεταγεννητική καθυστέρηση ανάπτυξης, η αναπτυξιακή-λεκτική καθυστέρηση, η κρανιοπροσωπική ασυμμετρία, η επίπεδη βάση της μύτης, τα δυσπλαστικά και χαμηλής πρόσφυσης αυτιά, οι υποπλαστικές θηλές, η εγκάρσια παλαμιαία πτυχή, η σκολίωση κ.α. Περίπου το 50% των ασθενών πεθαίνει μέσα στο πρώτο έτος ζωής, ενώ δεν έχει παρατηρηθεί επιβίωση πάνω από 5 έτη

27 Εικόνα 9: Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά συνδρόμου Patau. Adapted from: /Trisomy+13+(Patau+Syndrome) Εικόνα 11. Κυκλωπία και προβοσκίδα στο σύνδρομο Patau. Adapted from: 26

28 Τρισωμία 22 Η τρισωμία 22 ανακοινώθηκε για πρώτη φορά το και είναι η δεύτερη πιο συχνή αυτοσωματική ανευπλοειδία που ανευρίσκεται στα προϊόντα αυτόματων αποβολών μετά την τρισωμία Η πλήρης τρισωμία 22 είναι σχεδόν πάντα μη συμβατή με τη ζωή, λόγω των σοβαρών οργανικών δυσμορφιών που προκαλεί 95. Στις περισσότερες των περιπτώσεων οφείλεται σε μη διαχωρισμό του χρωμοσώματος 22 κατά την μητρική μείωση ΙΙ 94. Τα χαρακτηριστικά της τρισωμίας αυτής περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης, ολιγάμνιο, μικροκεφαλία, ευρεία και επίπεδη ρινική γέφυρα, υπερτελορισμό, δυσπλαστικά αυτιά, ποικίλου βαθμού υπερώιες σχιστίες, υποσπαδία, ατρησία πρωκτού, συγγενείς καρδιακές ανωμαλίες, νεφρικές ανωμαλίες και άλλα (εικόνα 11) 42, Οι περισσότεροι ασθενείς με πλήρη τρισωμία 22 πεθαίνουν στους πρώτους μήνες της ζωής, ενώ η μεγαλύτερη επιβίωση που έχει καταγραφεί είναι τα τρία έτη 97. Παρατεταμένη επιβίωση πέραν των 20 ετών έχει παρατηρηθεί σε ασθενείς με μωσαϊκισμό 42. Εικόνα 11. Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά τρισωμίας 22 (47,ΧΥ,+22)

29 Σύνδρομο Turner - Μονοσωμία Χ Το σύνδρομο Turner είναι η μόνη μονοσωμία που είναι συμβατή με τη ζωή. Είναι η πιο κοινή φυλετική ανευπλοειδία που ανευρίσκεται στα προϊόντα αποβολής και ευθύνεται για το 20% περίπου των αποβολών πρώτου τριμήνου 6, ενώ εμφανίζεται με συχνότητα περίπου 1 στις γεννήσεις ζώντων κοριτσιών 98. Το σύνδρομο που είναι μια χρωμοσωμική ανωμαλία των κοριτσιών περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1938 από τον Turner 99, ενώ η παρουσία ενός μόνο χρωμοσώματος Χ και η απουσία του σωματίου Barr επιβεβαιώθηκε κυτταρογενετικά το To σωμάτιο Barr το οποίο πήρε το όνομά του από τον Murray Barr 101 που το ανακάλυψε, είναι το αδρανοποιημένο χρωμόσωμα Χ. Η αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ (Χinactivation or lyonization) είναι μια διαδικασία κατά την οποία ένα από τα δύο αντίγραφα του χρωμοσώματος Χ που είναι παρόντα στα θήλεα θηλαστικά αδρανοποιείται. Δεδομένου ότι τα θήλεα θηλαστικά έχουν δύο χρωμοσώματα Χ, η αδρανοποίηση του ενός τα προστατεύει από το να μην υπάρχει ποσοτική διαφορά στη γονιδιακή έκφραση που οφείλεται στην ύπαρξη δύο Χ χρωμοσωμάτων στις γυναίκες έναντι των ανδρών οι οποίοι έχουν μόνο ένα χρωμόσωμα Χ. Το ποιό από τα δύο χρωμοσώματα θα αδρανοποιηθεί στα θήλεα είναι τυχαία επιλογή. Μόλις αδρανοποιηθεί ένα χρωμόσωμα Χ θα παραμείνει ανενεργό σε όλη την διάρκεια της ζωής του κυττάρου. Η πρώτη θεωρία που προσπάθησε να εξηγήσει το μηχανισμό εξισορρόπησης της δόσης των γονιδιακών προϊόντων του χρωμοσώματος Χ προτάθηκε από την Mary Lyon και σήμερα είναι γνωστή ως υπόθεση της Lyon. Σύντομα μετά την γονιμοποίηση, λοιπόν, ένα από τα δύο χρωμοσώματα Χ των θηλυκών κυττάρων υφίσταται φυσικές και μοριακές αλλαγές. Το χρωμόσωμα αυτό φαίνεται διαφορετικό στο μικροσκόπιο μετά από χρώση και εμφανίζει μια σκουρόχρωμη μάζα στην περιφέρεια του πυρήνα του. Αυτή η μάζα είναι το αδρανοποιημένο χρωμόσωμα Χ που λέγεται σωμάτιο Barr (εικόνα 12). Τα αντίστοιχα κύτταρα των φυσιολογικών ανδρών δεν πρέπει να εμφανίζουν σωμάτιο Barr επειδή στους άνδρες υπάρχει μόνο ένα χρωμόσωμα Χ. Ο αριθμός των 28

30 σωματίων Barr είναι πάντα ένα λιγότερο από τον συνολικό αριθμό των Χ χρωμοσωμάτων. Για παράδειγμα, άνδρες με σύνδομο Klinefelter (47,XXY ) έχουν ένα σωμάτιο Barr, ενώ γυναίκες με τριπλοειδία Χ (47,XXX) έχουν δύο σωμάτια Bar 32. Η συχνότερα απαντώμενη χρωμοσωματική σύσταση στο σύνδρομο Turner είναι 45,Χ χωρίς δεύτερο φυλετικό χρωμόσωμα Χ ή Υ. Ωστόσο, γύρω στο 50% περίπου των περιπτώσεων έχουν διαφορετικό καρυότυπο. Το ένα τέταρτο περίπου των περιστατικών με σύνδρομο Turner εμφανίζει μωσαϊκό καρυότυπο, στον οποίο μόνο ένα ποσοστό των κυττάρων είναι 45,Χ 33. Έχει διαπιστωθεί στους ασθενείς με σύνδρομο Turner, ότι στο 75% των περιπτώσεων το χρωμόσωμα Χ έχει μητρική προέλευση 102. Στην πλειονότητα των ασθενών με σύσταση 45,Χ, το χρωμόσωμα Χ που λείπει χάθηκε λόγω μη αποχωρισμού κατά τη σπερματογένεση. Σε ένα μικρό ποσοστό, το σύνδρομο μπορεί να προκληθεί από μιτωτικό μη αποχωρισμό με εκλεκτική απώλεια του χρωμοσώματος Χ που οδηγεί συνήθως σε μωσαϊκισμό. Τέλος, το σύνδρομο μπορεί να προκύψει από δομικές ανακατατάξεις των χρωμοσωμάτων Χ και Υ, που συνήθως είναι πατρικής προέλευσης 33,102. Κατά τη γέννηση τα άτομα αυτά εμφανίζουν, συχνά, λεμφοίδημα της ράχης των κάτω άκρων, το οποίο βοηθά στη διάγνωση του συνδρόμου. Το λεμφοίδημα πολλές φορές υπάρχει και κατά την εμβρυική ζωή και προκαλεί κυστικό ύγρωμα (ορατό στο υπερηχογράφημα), στο οποίο οφείλεται η δημιουργία του πτερυγίου του αυχένα που παρατηρείται μετά τη γέννηση. Η νοημοσύνη είναι συνήθως μέση ή υψηλότερη από το μέσο όρο 32,102. Οι γυναίκες με σύνδρομο Turner έχουν συνήθως μικρό ύψος, το τελικό μέσο ύψος τους φθάνει περίπου τα 143 cm, συνήθως φαρδύ και κοντό λαιμό με πτερύγιο και αλλαγές στη γωνία των αγκώνων που δίνουν στο κατώτερο τμήμα των βραχιόνων γωνιώδη εμφάνιση, μεγάλη απόσταση θηλών, χαμηλή πρόσφυση μαλλιών και υποπλασία νυχιών (εικόνα 13). Επίσης παρατηρείται αυξημένη 29

31 συχνότητα καρδιαγγειακών ανωμαλιών. Τα άτομα αυτά φέρουν ταινιοειδείς γονάδες και είναι χαρακτηριστική η πρωτοπαθής αμηνόρροια και η απουσία ανάπτυξης των δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου. Συνήθως, τα άτομα αυτά είναι στείρα 6,32,102. Εικόνα 12. Αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ και σωμάτιο Barr. Adapted from: Εικόνα 13. Φαινοτυπικά Χαρακτηριστικά Συνδρόμου Turner (45, Χ) Adapted from: 30

32 Σύνδρομο Klinefelter XXY Το σύνδρομο Klinefelter ήταν η πρώτη φυλετική χρωμοσωμική ανευπλοειδία που περιγράφηκε 103 το 1942 από τον Klinefelter και το 1959 βρέθηκε ότι οφείλεται στην παρουσία ενός επιπλέον Χ χρωμοσώματος στους άντρες 104. Είναι η πιο κοινή αιτία υπογοναδισμού και υπογονιμότητας στους άνδρες 105. Ανευρίσκεται σε ποσοστό περίπου 1 στις 600 γεννήσεις ζώντων αρρένων νεογνών 6. Περίπου στο 50% των περιπτώσεων το επιπλέον χρωμόσωμα είναι μητρικής προέλευσης (1/3 οφείλεται σε σφάλμα κατά τη μητρική μείωση Ι και οι υπόλοιπες σε σφάλματα κατά τη μείωση ΙΙ) και περίπου κατά 50% είναι πατρικής προέλευσης (σφάλμα κατά την πατρική μείωση Ι) 106. Επίσης μπορεί να οφείλεται σε μιτωτικό σφάλμα που συνέβη στο μεταζυγωτικό στάδιο και οδηγεί σε μωσαϊκισμό (~15%) 33. Φαίνεται να υπάρχει μια μικρή συσχέτιση με την αυξημένη ηλικία των γονέων 107,108. Ακόμα και αν ο φαινότυπος παρουσιάζεται σχετικά ήπιος, οι μισές από τις συλλήψεις εμβρύων με καρυότυπο 47,ΧΧΥ καταλήγουν σε αποβολές 33. Οι άνδρες ΧΧΥ έχουν ψηλό ανάστημα και μακριά άκρα. Οι όρχεις είναι μικροί και υπάρχει δυσγενεσία των σπερματοφόρων σωληναρίων 32, τα δευτερογενή χαρακτηριστικά του φύλου δεν αναπτύσσονται πλήρως και σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρείται γυναικομαστία (Εικόνα 14). Φαίνονται σωματικά φυσιολογικοί μέχρι την εφηβεία, οπότε γίνεται εμφανής ο υπογοναδισμός τους. Οι ασθενείς με σύνδρομο Klinefelter είναι σχεδόν πάντοτε στείροι 33, εκτός από τις περιπτώσεις μωσαϊκισμού που πιθανόν να είναι γόνιμοι 32. Υπάρχει ελαφρού βαθμού νοητική υστέρηση. Πολλά από τα αγόρια με το σύνδρομο εμφανίζουν περιορισμένη ψυχοκοινωνική προσαρμογή

33 Εικόνα 14. Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά συνδρόμου Klinefelter (47, XXY). Adapted from: Α Δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες Όπως έχει ήδη αναφερθεί παραπάνω, για το 50% περίπου των αυτόματων αποβολών του πρώτου τριμήνου ευθύνονται οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες 6,23-29, το 86% αυτών των ανωμαλιών είναι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες και για ένα μικρότερο ποσοστό περίπου 6% ευθύνονται οι δομικές ανωμαλίες 24,31. Οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες ή ορθότερα δομικές χρωμοσωμικές ανακατατάξεις είναι αλλαγές στη δομή ενός ή περισσότερων χρωμοσωμάτων και μπορεί να αφορούν μερικά γονίδια ή ένα μεγάλο τμήμα του χρωμοσώματος. Οι δομικές χρωμοσωμικές ανακατατάξεις είναι αποτέλεσμα θραύσης των χρωμοσωμάτων, που ακολουθείται από ανασύσταση με ανώμαλο συνδυασμό. Ανακατάταξη μπορεί να συμβεί με πολλούς τρόπους. Ο πιο συνήθης τρόπος, η 32

34 ισοζυγισμένη μετάθεση, απαντά περίπου σε μία στις 375 γεννήσεις. Η ανταλλαγή χρωμοσωματικού υλικού γίνεται αυθόρμητα, σε χαμηλή συχνότητα, αλλά είναι δυνατό να προκληθεί και από παράγοντες θραύσης (μεταλλαξιογόνα), όπως είναι η ιονίζουσα ακτινοβολία, ορισμένες ιογενείς λοιμώξεις και πολλές χημικές ουσίες. Όπως και οι αριθμητικές ανωμαλίες, οι δομικές χρωμοσωματικές ανακατατάξεις είναι δυνατό να υπάρχουν σε όλα τα κύτταρα ενός ατόμου ή σε μορφή μωσαϊκισμού. Υπάρχει περίπτωση τα κομμάτια που έσπασαν να χαθούν (μη ισοζυγισμένες ανακατατάξεις) 6,33. Οι συχνότερες μη ισοζυγισμένες δομικές ανακατατάξεις (ύπαρξη είτε επιπλέον, είτε ελλιπούς χρωμοσωμικού υλικού) στον άνθρωπο είναι οι εξής: Ελλείμματα Διπλασιασμοί Ισοχρωμοσώματα Δακτυλιοειδή χρωμοσώματα Δικεντρικά χρωμοσώματα Χρωμοσώματα δείκτες Οι συχνότερες ισοζυγισμένες δομικές ανακατατάξεις (το σύνολο των χρωμοσωμάτων έχει την φυσιολογική ποσότητα χρωμοσωμικού υλικού) στον άνθρωπο είναι οι εξής: Μεταθέσεις Αναστροφές Α Μη Ισοζυγισμένες Δομικές Ανακατατάξεις Ελλείμματα Έλλειμμα (deletion) είναι η απώλεια ενός τμήματος του χρωμοσώματος, που καταλήγει σε χρωμοσωμική ανισορροπία - απώλεια γενετικού υλικού (οπότε 33

35 προκαλείται μερική μονοσωμία), η οποία αναγνωρίζεται ως αλλαγή στο μήκος του χρωμοσώματος ή ως απώλεια κάποιας ζώνης και αλλαγή στο πρότυπο ζωνών του συγκεκριμένου χρωμοσώματος ή απώλεια αλληλουχιών DNA κάποιας περιοχής του χρωμοσώματος. Μόνο απώλειες μεγάλων ποσοτήτων γενετικού υλικού είναι ορατές στο μικροσκόπιο 32. Οι κλινικές επιπτώσεις εξαρτώνται από το μέγεθος του τμήματος που λείπει, καθώς και από τον αριθμό και τις λειτουργίες των γονιδίων που περιέχει 109. Τα ελλείμματα είναι δύο τύπων: ακραία και ενδιάμεσα 33,109 (εικόνα 15). Μερικά από τα συχνότερα σύνδρομα που προκαλούνται από ελλείμματα είναι το σύνδρομο κλάματος γαλής (cri-du-chat) που οφείλεται στην έλλειψη ενός τμήματος του βραχέως σκέλους του χρωμοσώματος 5. Επίσης, το σύνδρομο DiGeorge που οφείλεται σε ένα μικροέλλειμμα στο μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος 22 6,33. Εικόνα 15. Ελλείμματα ακραία και ενδιάμεσα

36 Διπλασιασμοί Ο διπλασιασμός (duplication) είναι η επανάληψη ενος χρωμοσωμικού τμήματος στο χρωμόσωμα, δηλαδή μία περιοχή του χρωμοσώματος διπλασιάζεται και εμφανίζεται σε δύο αντίγραφα. Ο διπλασιασμός μπορεί να έχει την ίδια (ευθύς διπλασιασμός) ή την αντίθετη (ανεστραμμένος διπλασιασμός) κατεύθυνση με το φυσιολογικό χρωμόσωμα 6,32. Οι περισσότεροι διπλασιασμοί που ανευρίσκονται στον άνθρωπο είναι ευθείς 110 (εικόνα 16). Σε κάθε περίπτωση, παρατηρείται μερική τρισωμία. Παρ όλα αυτά, οι διπλασιασμοί είναι λιγότερο βλαβεροί από τα ελλείμματα, διότι στους διπλασιασμούς δεν απουσιάζει κανένα τμήμα του γενετικού υλικού, απλώς κάποιο βρίσκεται σε περίσσεια. Εν τούτοις, επειδή ο διπλασιασμός ενός γαμέτη καταλήγει σε χρωμοσωμική ανισορροπία και επειδή οι χρωμοσωμικές θραύσεις που τον προκαλούν μπορεί να διασπάσουν γονίδια, ο διπλασιασμός οδηγεί συχνά σε φαινοτυπικές ανωμαλίες 33,109. Εικόνα 16. Διπλασιασμός (ευθύς). Adapted from: illustrations/chromosomalduplication 35

37 Ισοχρωμοσώματα Το ισοχρωμόσωμα (isochromosome) αποτελείται από δύο αντίγραφα του ίδιου χρωμοσωμικού βραχίονα, είναι δηλαδή ένα χρωμόσωμα στο οποίο ο ένας βραχίονας απουσιάζει, ενώ ο άλλος έχει διπλασιασθεί 109. Τα ισοχρωμοσώματα αναγνωρίζονται εύκολα στον καρυότυπο γιατί εμφανίζουν την χαρακτηριστική εικόνα καθρέφτη που αντανακλά την έλλειψη του ενός βραχίονα και το διπλασιασμό του άλλου 32 (εικόνα 17). Συνεπώς ένα άτομο με 46 χρωμοσώματα, το οποίο φέρει ένα ισοχρωμόσωμα, διαθέτει ένα μόνο αντίγραφο του γενετικού υλικού του ενός βραχίονα (μερική μονοσωμία) και τρία αντίγραφα του γενετικού υλικού του άλλου βραχίονα (μερική τρισωμία). Γενικά ισχύει ότι, όσο μικρότερο είναι το ισοχρωμόσωμα, τόσο μικρότερη θα είναι η ανισορροπία και άρα μεγαλύτερη η πιθανότητα επιβίωσης του εμβρύου ή του παιδιού που φέρει το ισοχρωμόσωμα 32,33,109. Εικόνα 17. Ισοχρωμοσώματα. Adapted from: /File:Isochromosomes.jpg 36

38 Δακτυλιοειδή χρωμοσώματα Όταν υπάρχουν ελλείμματα και στα δύο άκρα ενός χρωμοσώματος, τα άκρα αυτά μπορεί να ενωθούν μεταξύ τους και να σχηματίσουν ένα δακτυλιοειδές χρωμόσωμα (ring chromosome) 6 (εικόνα 18). Τα δακτυλιοειδή χρωμοσώματα αποτελούν περίπτωση μερικής μονοσωμίας 109. Οι δακτύλιοι συναντούν δυσκολίες κατά τη μίτωση, όταν οι δύο αδελφές χρωματίδες του δακτυλιοειδούς χρωμοσώματος προσπαθούν να αποχωρισθούν κατά την ανάφαση. Σε τέτοιες περιπτώσεις υπάρχει μεγάλη πιθανότητα να προκληθεί θραύση του δακτυλίου, ακολουθούμενη από συγχώνευση και δημιουργία μεγαλύτερων και μικρότερων δακτυλίων ή ακόμη και να χαθεί ολόκληρο το δακτυλιοειδές χρωμόσωμα. Λόγω αυτής της μιτωτικής αστάθειας, τα δακτυλιοειδή χρωμοσώματα απαντούν συχνά όχι στο σύνολο, αλλά μόνο σε ένα ποσοστό των κυττάρων (μωσαϊκισμός) 111. Το φάσμα της φαινοτυπικής ανωμαλίας της μονοσωμίας, εξαρτάται από το είδος των γονιδίων που χάνονται μαζί με τα ακεντρικά χρωμοσωματικά κομμάτια (αν ο δακτύλιος που σχηματίστηκε δεν περιέχει κεντρομερίδιο χάνεται κατά τη μίτωση) 32. Δακτυλιοειδή χρωμοσώματα έχουν περιγραφεί για όλα τα ανθρώπινα χρωμοσώματα, αν και είναι πολύ σπάνια 32,33. Ένα δακτυλιοειδές χρωμόσωμα μπορεί να δημιουργηθεί de novo ή να κληρονομηθεί από γονέα-φορέα 6. Εικόνα 18. Δακτυλιοειδές χρωμόσωμα. Adapted from: /illustrations/ringchromosome 37

39 Δικεντρικά χρωμοσώματα Τα δικεντρικά χρωμοσώματα (dicentric chromosomes), όπως λέει και το όνομά τους, έχουν δύο κεντρομερίδια. Δεν απαντώνται συχνά και δημιουργούνται από θραύση και επανασύνδεση τμημάτων κεντρομεριδίων προερχόμενα από διαφορετικά χρωμοσώματα ή από τις δύο χρωματίδες του ίδιου χρωμοσώματος (εικόνα 19). Αν και τα δύο κεντρομερίδια είναι λειτουργικά το δικεντρικό χρωμόσωμα θα σπάσει κατά τη ανάφαση. Ορισμένες φορές δημιουργούνται μιτωτικά σταθερές δομές επειδή το ένα από τα δύο κεντρομερίδια έχει αδρανοποιηθεί ή όταν τα κεντρομερίδια είναι τόσο κοντά μεταξύ τους που δρούν ως ένα μεγάλο κεντρομερίδιο 32,33,109,112. Εικόνα 19. Δικεντρικά Χρωμοσώματα. Adapted from: /10/can-changes-in-structure-of-chromosomes.html 38

40 Χρωμοσώματα δείκτες Τα χρωμοσώματα δείκτες [marker chromosomes/small supernumerary marker chromosomes (ssmc)] είναι σπάνια. Είναι συνήθως πολύ μικρά χρωμοσώματαδείκτες, συχνά σε κατάσταση μωσαϊκού, πράγμα που κάνει ιδιαίτερα δύσκολη την ταυτοποίησή τους ακόμη και με τεχνικές FISH και μοριακής χρώσης. Συνήθως, η φυσιολογική σειρά των χρωμοσωμάτων εξακολουθεί να υπάρχει, οπότε αυτά ονομάζονται υπεράριθμα χρωμοσώματα (Εικόνα 20). Αν και δίνουν την εντύπωση αριθμητικής ανωμαλίας, τα χρωμοσώματα δείκτες αποτελούν συγχρόνως μία μορφή δομικής ανακατάταξης. Τα πολύ μικρά χρωμοσώματα δείκτες συχνά αποτελούνται από ελάχιστο υλικό. Τα μεγαλύτερα, περιέχουν υλικό από τον ένα ή και από τους δύο χρωμοσωμικούς βραχίονες και έτσι δημιουργούν ανισορροπία σε όποια γονίδια υπάρχουν εκεί. Όταν εμφανίζονται σε κυτταρικές καλλιέργειες (για παράδειγμα κατά τον προγεννητικό έλεγχο) δημιουργούν δυσκολίες γιατί οι κλινικές συνέπειες συχνά δεν είναι σαφείς. Ένας μικρός αριθμός χρωμοσωμάτων δεικτών περιέχουν λειτουργικά γονίδια και ορισμένα συνδυάζονται με προβλήματα στην ανάπτυξη 32,33. Εικόνα Φυσιολογικά Χρωμοσώματα και ένα επιπλέον χρωμόσωμα δείκτης (mar). Adapted from: basics+for+patients/greek.html 39

41 A Ισοζυγισμένες Δομικές Ανακατατάξεις Μεταθέσεις Μετάθεση είναι η ανταλλαγή χρωμοσωμικών τμημάτων μεταξύ δύο (συνήθως) μη ομόλογων χρωμοσωμάτων. Τα άτομα που φέρουν μία μετάθεση καλούνται φορείς ισοζυγισμένων μεταθέσεων και φαινοτυπικώς είναι φυσιολογικά. Ωστόσο, η μετάθεση μπορεί να έχει επιπτώσεις στους απογόνους τους, να γεννηθούν δηλαδή, παιδιά με ελλείμματα ή περίσσεια γενετικού υλικού. Υπάρχουν δυο κύριοι τύποι μεταθέσεων: οι αμοιβαίες μεταθέσεις (reciprocal translocations) και οι μεταθέσεις τύπου Robertson (Robertsonian translocations) 32,33. Οι αμοιβαίες μεταθέσεις είναι αποτέλεσμα θραύσης τμημάτων μη ομόλογων χρωμοσωμάτων με αμοιβαία ανταλλαγή των σπασμένων αυτών τμημάτων (Εικόνα 21). Συνήθως αφορά μόνο δύο χρωμοσώματα και επειδή η ανταλλαγή είναι αμοιβαία ο συνολικός αριθμός χρωμοσωμάτων παραμένει αμετάβλητος. Οι αμοιβαίες μεταθέσεις είναι σχετικά συχνές (1 στις 600 γεννήσεις) και είναι συνήθως αβλαβείς, τα άτομα που τις φέρουν εμφανίζουν συνήθως φυσιολογικό φαινότυπο, αλλά δημιουργούν αυξημένο κίνδυνο να προκύψουν μη ισοζυγισμένοι γαμέτες (έλλειψη ή περίσσεια υλικού) και παθολογικοί απόγονοι. Επίσης ανευρίσκονται συχνότερα από ότι στον γενικό πληθυσμό σε υπογόνιμους άνδρες και σε ζευγάρια μετά από δύο ή περισσότερες αυτόματες αποβολές 32,33. Οι μεταθέσεις κατά Robertson συμβαίνουν συνήθως μεταξύ χρωμοσωμάτων που έχουν πολύ κοντούς μικρούς βραχίονες, δηλαδή τα ακροκεντρικά χρωμοσώματα (το κεντρομερίδιο είναι στο άκρο του χρωμοσώματος). Είναι αρκετά συχνές μεταθέσεις και συνήθως συμβαίνουν μεταξύ των χρωμοσωμάτων 13 και 14, αλλά και 14 και 21. Πραγματοποιείται θραύση σε δύο ακροκεντρικά χρωμοσώματα που συγχωνεύονται κοντά στην περιοχή του κεντρομεριδίου με απώλεια των βραχέων βραχιόνων τους. Το χρωμόσωμα που προκύπτει, αποτελείται από τους μεγάλους βραχίονες των δύο ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων και το κεντρομέρος του ενός από 40

42 τα δύο χρωμοσώματα, ή και των δύο (δικεντρικό χρωμόσωμα). Από την ίδια μετάθεση σχηματίζεται κι ένα μικρό χρωμόσωμα, από τη συνένωση των μικρών βραχιόνων, το οποίο και εξαφανίζεται (εικόνα 22). Επειδή οι κοντοί βραχίονες και των 5 ζευγών των ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων έχουν πολλαπλά αντίγραφα των γονιδίων για ριβοσωμικό RNA, η απώλεια των βραχέων βραχιόνων δυο ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων δεν είναι επιβλαβής για τον φορέα. Ο φορέας τέτοιας μετάθεσης έχει 45 χρωμοσώματα. Παρά το γεγονός ότι ο φορέας αυτού του είδους της ισοζυγισμένης μετάθεσης δεν εμφανίζει φαινοτυπικές ανωμαλίες, υπάρχει κίνδυνος να παράγει μη ισοζυγισμένους γαμέτες. Η κύρια κλινική σημασία αυτού του τύπου μετάθεσης έγκειται στο ότι οι φορείς μετάθεσης κατά Robertson ως προς το χρωμόσωμα 21, έχουν αυξημένο κίνδυνο να αποκτήσουν παιδί με σύνδρομο Down 32,33. Εικόνα 21. Αμοιβαία μετάθεση (reciprocal translocation) Adapted from: Meiosis 41

43 Εικόνα 22. Μεταθέσεις κατά Robertson Adapted from: /pin/ / Αναστροφές Η αναστροφή (inversion) δημιουργείται από θραύσεις σε δύο διαφορετικά σημεία του ίδιου χρωμοσώματος και επανένωση του τμήματος ύστερα από αναστροφή. Η αναστροφή έχει ως συνέπεια την αλλαγή της διάταξης των γονιδίων στο χρωμόσωμα. Οι αναστροφές διακρίνονται σε παρακεντρικές (paracentric), οι οποίες δεν περιλαμβάνουν το κεντρομέρος, όπου δηλαδή και τα δύο ρήγματα προκαλούνται στον ίδιο βραχίονα και περικεντρικές (pericentric), στις οποίες το κεντρομέρος βρίσκεται στο ανεστραμμένο κομμάτι (εικόνα 23). Μία αναστροφή δεν προκαλεί, συνήθως, φαινοτυπικές ανωμαλίες στους φορείς αφού πρόκειται για ισοζυγισμένη ανακατάταξη, έχει όμως κλινική σημασία για τους απογόνους. Ο φορέας οποιουδήποτε τύπου αναστροφής, διατρέχει τον κίνδυνο να παράγει ανώμαλους γαμέτες, οι οποίοι μπορεί να δημιουργήσουν απογόνους με ισοζυγισμένη χρωμοσωμική σύσταση. Οι συνέπειες των δύο τύπων αναστροφής διαφέρουν. Ο κίνδυνος να αποκτήσει ένας φορέας παρακεντρικής αναστροφής τέκνο με ανώμαλο καρυότυπο είναι πολύ μικρός. Από την άλλη πλευρά, ο κίνδυνος ενός φορέα περικεντρικής αναστροφής να αποκτήσει τέκνο με μη ισοζυγισμένο καρυότυπο είναι 1-10% 32,

44 Εικόνα 23. Αναστροφές (παρακεντρικές και περικεντρικές) Adapted from: Όλες οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες μπορούν να οδηγήσουν σε αυτόματες αποβολές. Συχνότερα μπορούν να οδηγήσουν σε αποβολές οι μετατοπίσεις, επειδή οι φορείς της ανωμαλίας αυτής παράγουν, παρά το φυσιολογικό τους φαινότυπο, γαμέτες με μη ισοζυγισμένη μετάθεση. Τα ελλείμματα καταλήγουν σε αποβολές, επειδή τα μεγαλύτερα τουλάχιστον από αυτά δεν είναι συμβατά με τη ζωή. Αποβολή μπορούν να προκαλέσουν επίσης, αλλά σε μικρότερη συχνότητα, και η αναστροφή, καθώς και το δακτυλιοειδές χρωμόσωμα 7. 43

45 Α.2.2. Μητρικά Νοσήματα Σοβαρά νοσήματα από το καρδιοαγγειακό και το ουροποιητικό σύστημα ή παθήσεις του ήπατος, καθώς και ειδικές λοιμώξεις, όπως η σύφιλη, έχουν συσχετιστεί με αποβολές 6,7. Η κοιλιοκάκη προκαλεί τόσο στους άνδρες, όσο και στις γυναίκες υπογονιμότητα και επαναλαμβανόμενες αποβολές 113. Επίσης, υπάρχουν πολλές βιβλιογραφικές αναφορές ότι οι λοιμώξεις προκαλούν αποβολές 114. Μητρικές λοιμώξεις, όπως η ερυθρά, η ελονοσία, η λιστερίωση και η τοξοπλάσμωση φαίνεται ότι προδιαθέτουν για αποβολές, ενώ συχνά ενοχοποιούνται ο κυτταρομεγαλοϊός (CMV), τα μυκοπλάσματα, κυρίως το Ureoplasma urealyticum και λιγότερο το Mycoplasma hominis, αλλά και τα χλαμύδια 7. Α.2.3. Ανατομικές ανωμαλίες Ορισμένες εκ γενετής ανωμαλίες της μήτρας που είναι αποτέλεσμα της ατελούς σύντηξης των πόρων του Müller (δίκερως, δίδελφυς, διθάλαμη κλπ), αλλά και επίκτητες, όπως ινομυώματα της μήτρας, ενδομητρικοί πολύποδες, ενδομήτριες συμφύσεις, μπορούν να προκαλέσουν αποβολές, διότι παρεμβάλλονται αρνητικά στην εμφύτευση, λόγω της διαταραχής του όγκου ή και της αιμάτωσης της κοιλότητας της μήτρας 6-7,115. Επίσης, η ανεπάρκεια του τραχήλου που μπορεί να είναι συγγενής (σπανιότερα) ή συχνότερα αποτέλεσμα χειρουργικών επεμβάσεων (κωνοειδής εκτομή τραχήλου, βίαιη διαστολή του τραχήλου για απόξεση της μήτρας), σχετίζεται συχνότερα με πρόωρη ρήξη των εμβρυϊκών υμένων και αυτόματες αποβολές στο 2ο τρίμηνο της κύησης ή με πρόωρους τοκετούς 6,7. 44

46 Α.2.4. Ενδοκρινικές διαταραχές Αυξημένη συχνότητα αποβολών καθώς και μειωμένα ποσοστά συλλήψεων βρίσκονται σε γυναίκες με υπερθυρεοειδισμό, σε γυναίκες με υποθυρεοειδισμό 116 και σε γυναίκες με αρρύθμιστο σακχαρώδη διαβήτη 7. Στον υποθυρεοειδισμό η σοβαρή ανεπάρκεια ιωδίου φαίνεται να σχετίζεται με αποβολές 117. Ο υποθυρεοειδισμός είναι κοινός στις γυναίκες και συνήθως προκαλείται από μια αυτοάνοση διαταραχή. Ο υποκλινικός υποθυρεοειδισμός και οι επιπτώσεις του στις αποβολές δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς αλλά φαίνεται να σχετίζεται με τις πρόωρες αποβολές 116. Τα ποσοστά των αυτόματων αποβολών, καθώς και των σοβαρών συγγενών δυσπλασιών αυξάνονται σε γυναίκες με ινσουλινοεξαρτώμενο διαβήτη. Ο κίνδυνος φαίνεται να είναι ανάλογος με το βαθμό του μεταβολικού ελέγχου στα πρώιμα στάδια της κύησης. Για παράδειγμα, αν γίνει σωστή ρύθμιση της γλυκόζης τις πρώτες 21 μέρες μετά την σύλληψη τα ποσοστά αποβολών είναι ίδια με αυτά των μη διαβητικών γυναικών 118. Ο ανεπαρκής έλεγχος της γλυκόζης όμως, έχει ως αποτέλεσμα αυξημένα ποσοστά αποβολών 6. Επιπλέον, η ανεπάρκεια έκκρισης προγεστερόνης από το ωχρό σωμάτιο ή τον πλακούντα είναι δυνατόν να προκαλέσει αυτόματη αποβολή 6. Τέλος, το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών, εκτός του ότι καθιστά τις γυναίκες υπογόνιμες λόγω της ανωοθυλακιορρηξίας, μπορεί να προκαλέσει και αποβολές όταν αυτές οι γυναίκες μείνουν έγκυες 119. Δύο είναι οι πιθανοί μηχανισμοί που ενοχοποιούνται, τα αυξημένα επίπεδα της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) και οι άμεσες επιδράσεις της υπερινσουλιναιμίας σχετικά με την λειτουργία των ωοθηκών (οι γυναίκες αυτές εμφανίζουν αντίσταση στην ινσουλίνη) 6. 45

47 Α.2.5. Ανοσολογικοί παράγοντες Υπάρχουν δυο βασικοί ανοσολογικοί μηχανισμοί που συνδέονται με τις αποβολές: οι αυτοάνοσοι και οι αλλοάνοσοι 6,7. Στα αυτοάνοσα νοσήματα αναπτύσσονται μηχανισμοί, με τους οποίους η κυτταρική αντίδραση κατευθύνεται σε ειδικές περιοχές του μητρικού οργανισμού, στους ίδιους δηλαδή τους ιστούς της μητέρας, όπως για παράδειγμα στον φθαρτό και στον πλακούντα, όπου προκαλούν αγγειακές βλάβες και μπορούν κατά συνέπεια να επηρεάσουν σε σημαντικό βαθμό τη μητρική ή την εμβρυϊκή έκβαση στην εγκυμοσύνη. Στα αυτοάνοσα νοσήματα περιλαμβάνονται κυρίως ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος και το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο 7. Στον συστηματικό ερυθηματώδη λύκο δεν επηρεάζεται η γονιμότητα, παρατηρείται ωστόσο αυξημένη συχνότητα αποβολών 120, λόγω της αγγειακής βλάβης (φλεγμονής) των αρτηριδίων του φθαρτού που επηρεάζει και τα αγγεία της μήτρας και οφείλεται στα αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα (αντιπηκτικό του λύκου και αντικαρδιολιπινικά αντισώματα) 7,121,122. Όσον αφορά το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο, το οποίο χαρακτηρίζεται κλινικώς κυρίως από φλεβικές ή αρτηριακές θρομβώσεις, προκαλεί μαιευτικές επιπλοκές, αυτόματες αποβολές ή σοβαρή προεκλαμψία ή σοβαρή πλακουντιακή ανεπάρκεια πριν από την 34 η εβδομάδα της κύησης. Η πλακουντιακή ανεπάρκεια μπορεί να οδηγήσει σε επιβράδυνση της ενδομήτριας ανάπτυξης ή και σε θάνατο του εμβρύου 7. Η παθοφυσιολογία των αλλοάνοσων διαταραχών που ευθύνονται για τις αυτόματες αποβολές δεν είναι επαρκώς κατανοητή. Κατ αρχήν, όλοι οι άνθρωποι είναι γενετικά ανόμοιοι και με την έννοια αυτή το έμβρυο αναφέρεται ως ημιαλλομόσχευμα, είναι δηλαδή κατά το ήμισυ ξένο προς την μητέρα 7 εφόσον περιέχει και υλικό (αντιγόνα) τα οποία προέρχονται από τον πατέρα. 46

48 Βασική και αναγκαία συνθήκη για την επιτυχή έκβαση μιας κύησης είναι η αναγνώριση του εμβρύου από τους ανοσολογικούς μηχανισμούς της μητέρας κατά τρόπο τέτοιο ώστε να μην πυροδοτηθούν αντιδράσεις εναντίον του, να κατασταλεί δηλαδή η κυτταρική ανοσία της μητέρας (καταστολή των κυτταροτοξικών ΝΚ και Τ λεμφοκυττάρων) και να μην απορριφθεί το έμβρυο ως ξένο σώμα 6,7. Φυσιολογικά ο οργανισμός της μητέρας κατά την κύηση αναπτύσσει ένα μηχανισμό που λέγεται ανοσολογική ανοχή (immune tolerance) με σκοπό να καταστείλει την κυτταρική ανοσία και να μην απορρίψει την εμφύτευση του εμβρύου που ο οργανισμός της θα αναγνώριζε ως ξένο. Αν η μητέρα αποτύχει να αναπτύξει αυτόν τον μηχανισμό ανοσολογικής ανοχής τότε το έμβρυο θα αποβληθεί. Τα αντισώματα που αναπτύσσονται στην μητέρα κατά την ανοσολογική ανοχή προστατεύουν τα εμβρυϊκά κύτταρα από την επίθεση που θα δεχόταν από τα κύτταρα φυσικούς φονιάδες της μητέρας (NK-Natural Killers) που θα το αναγνώριζαν ώς ξένο σώμα 6,7. Α.2.6. Κληρονομική Θρομβοφιλία Ορισμένες γενετικές διαταραχές της πήξης του αίματος μπορεί να αυξήσουν τον κίνδυνο τόσο για αρτηριακές, όσο και για φλεβικές θρομβώσεις. Οι συχνότερες κληρονομικές θρομβοφιλίες οφείλονται σε μεταλλάξεις των γονιδίων του παράγοντα V Leiden, της προθρομβίνης, της αντιθρομβίνης, των πρωτεϊνών C και S και του ενζύμου MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase, αναγωγάση του μεθυλενοτετραϋδροφυλλικού). Οι κληρονομικές αυτές θρομβοφιλίες σχετίζονται με επαναλαμβανόμενες αποβολές 6,

49 Α.2.7. Διαιτητικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες Η διαιτητική ανεπάρκεια μιας οποιασδήποτε θρεπτικής ουσίας ή η μέτρια ανεπάρκεια όλων των θρεπτικών συστατικών δεν φαίνεται να αποτελεί σημαντική αιτία αποβολής. Ακόμη και σε ακραίες περιπτώσεις υπερέμεσης της κύησης και σημαντικής απώλειας βάρους σπάνια ακολουθεί αποβολή 6. Η καθημερινή κατανάλωση ωστόσο φρέσκων φρούτων και λαχανικών φαίνεται να μειώνει τον κίνδυνο αποβολών 126. Η αυξημένη κατανάλωση καφεϊνης (τουλάχιστον πέντε φλιτζάνια καφέ ημερησίως) σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο αποβολής και πάνω από το όριο αυτό ο κίνδυνος αυξάνεται γραμμικά 130. Το κάπνισμα σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο αποβολών 131. Όσο περισσότερα τσιγάρα καπνίζει μια γυναίκα κατά την κύηση, τόσο αυξάνεται ο κίνδυνος αποβολής 130,132. Η αυξημένη χρήση αλκοόλ φαίνεται να σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο τόσο για αυτόματες αποβολές, όσο και για συγγενείς ανωμαλίες του εμβρύου κυρίως κατά την διάρκεια των πρώτων 8 εβδομάδων της κύησης 133. Ο κίνδυνος φαίνεται να σχετίζεται με την συχνότητα χρήσης αλλά και με την δοσολογία 130. Η χαμηλή κατανάλωση αλκοόλ κατά την κύηση δεν σχετίζεται με σημαντικό κίνδυνο για αποβολή 126,134. Η ακτινοβολία σε υψηλές δόσεις (για παράδειγμα οι θεραπευτικές δόσεις για την καταπολέμηση κάποιας κακοήθειας) προκαλεί αποβολές 6. Οι χαμηλότερες δόσεις είναι λιγότερο τοξικές. Βέβαια η ακριβής δόση που προκαλεί αποβολή δεν είναι γνωστή, αλλά έκθεση του εμβρύου σε ακτινοβολία χαμηλότερη από 5 rads δεν αυξάνει τον κίνδυνο για αποβολή 135. Όσον αφορά τον κίνδυνο από την έκθεση σε περιβαλλοντικούς τοξικούς παράγοντες και τη συσχέτισή του με τις αποβολές υπάρχουν κάποιες δυσκολίες. Οι δυσκολίες αυτές αφορούν στη μέτρηση της έντασης και τη διάρκεια της έκθεσης. 48

50 Συνεπώς υπάρχουν λίγες πληροφορίες για να μπορέσει να κατηγορηθεί μια ουσία ως επιβλαβής για το έμβρυο ή από την άλλη πλευρά να θεωρηθεί ως ασφαλής. Υπάρχουν ωστόσο ορισμένες μελέτες στις οποίες έχει διαπιστωθεί ότι έκθεση σε διάφορους τοξικούς παράγοντες όπως το αρσενικό, ο μόλυβδος, η φορμαλδεϋδη, το βενζόλιο, το οξείδιο του αιθυλενίου και τα αναισθητικά αέρια μπορεί να αυξήσουν τον κίνδυνο αποβολής 136. Τα μεγάλα κοιλιακά τραύματα μπορούν να προκαλέσουν αποβολή. Ωστόσο, οι τραυματισμοί είναι σπάνιο αίτιο αποβολών και η επίπτωση τους εξαρτάται από τη βαρύτητα του τραυματισμού. Όσο αφορά τα αποτελέσματα των μικροτραυματισμών αυτά είναι δύσκολο να εξακριβωθούν 6. 49

51 B) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

52 Β.1. Υλικό και Μέθοδοι Μελετήθηκαν συνολικά 198 έμβρυα από αυτόματες αποβολές μονήρων κυήσεων. Το υλικό της έρευνας προήλθε από το εργαστήριο κλινικής γενετικής Access to Genome Αθήνας, όπου έγιναν και οι γενετικές αναλύσεις, κατά το χρονικό διάστημα από 1/1/2015 έως 30/6/2015. Η ανάλυση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με κλασική κυτταρογενετική ανάλυση. Στις περιπτώσεις όπου δεν υπήρχε αποτέλεσμα με την κλασική κυτταρογενετική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος QF-PCR. Όλα τα προϊόντα αποβολών έφθαναν στο εργαστήριο σε falcon των 50 ml που περιείχε μέσα 20 ml Hanks στείρο με προσθήκη αντιβιοτικών και ηπαρίνης και συνοδεύονταν από δείγμα αίματος της μητέρας για αποκλεισμό της επιμειξίας. Η κλασσική κυτταρογενετική ανάλυση πραγματοποιήθηκε μετά από καλλιέργεια των προϊόντων αποβολής. Για κάθε δείγμα έγιναν δύο καλλιέργειες σύμφωνα με το πρωτόκολλο. Η ζώνωση των χρωμοσωμάτων επετεύχθη με τη μέθοδο G- ζωνοποίησης GTG (Trypsin Leishman). Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για τα δείγματα των ιστών αποβολής ήταν τα εξής: Καλλιεργητικό υλικό: Amnio-max, κολχικίνη (2,5 mg/ml), υπότονο διάλυμα KCl: 2,8gr KCl/500ml W. for injection, μονιμοποιητικό διάλυμα μεθανόλης/οξικού (3:1), θρυψίνη-edta 1X/1N (w/o Ca, Mg). Τα στάδια που ακολουθήθηκαν για την καλλιέργεια των προϊόντων αποβολής ήταν τα παρακάτω: Κόψιμο των ιστών αποβολής σε πολύ μικρά τεμάχια. Σε κάθε καλλιέργεια τοποθετήθηκε 1,5 mg ιστού και 3 ml καλλιεργητικού υλικού, και ακολούθησε επώαση σε κλίβανο στους 37 ο C. Αλλαγή καλλιεργητικού υλικού την 7 η ημέρα. Προσθήκη θρυψίνης για 2, και προσθήκη 2 ml νέου καλλιεργητικού υλικού την 9 η -11 η ημέρα ώρες αργότερα προστίθεται 0,1 ml κολχικίνης. Προσθήκη θρυψίνης για 2, και συλλογή των κυττάρων σε σωληνάρια, και προσθήκη 2 ml Hanks στα σωληνάρια. Φυγοκέντρηση στις 1700 rpm για 7, απόρριψη του υπερκειμένου και επαναδιάλυση του ιζήματος σε 5 ml υπότονου διαλύματος KCl 51

53 θερμοκρασίας 37 ο C. Επώαση στους 37 ο C για 30, φυγοκέντρηση στις 1700 rpm για 7, απόρριψη του υπερκειμένου και επαναδιάλυση του ιζήματος σε 5ml μονιμοποιητικού διαλύματος και τοποθέτηση στους 8 ο C για 45. Τέλος, επανάληψη των πλύσεων με το μονιμοποιητικό διάλυμα. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για τα δείγματα περιφερικού αίματος μητέρας ήταν τα παρακάτω: Καλλιεργητικό υλικό: 100 ml RPMI-1640, 20 ml fetal calf serum, 1 ml Penicilline streptomycin, 1 ml L-Glutamine, 4% bicarbonate, κολχικίνη (2,5 mg/ml), υπότονο διάλυμα KCl: 2,8 gr KCl/500ml W. for injection, μονιμοποιητικό διάλυμα μεθανόλης/οξικού (3:1), θρυψίνη-edta 1X/1N (w/o Ca, Mg). Τα στάδια που ακολουθήθηκαν για την καλλιέργεια των δειγμάτων περιφερικού αίματος των μητέρων ήταν τα παρακάτω: Σε κάθε σωληνάριο προστέθηκε 0,8 ml αίματος και καλλιεργητικού υλικού, ώστε ο τελικός όγκος της κάθε καλλιέργειας να είναι 5 ml και ακολούθησε επώαση για 72 ώρες σε κλίβανο στους 37 ο C. Στις 48 ώρες έγινε προσθήκη θυμιδίνης και στις 71 ώρες προσθήκη 0,1 ml κολχικίνης. Μετά από 72 ώρες έγινε φυγοκέντρηση στις 1700 rpm για 7, απόρριψη του υπερκειμένου και επαναδιάλυση του ιζήματος σε 5 ml υπότονου διαλύματος KCl θερμοκρασίας 37 ο C. Επώαση στους 37 ο C για 10-15, φυγοκέντρηση στις 1700 rpm για 7, απόρριψη του υπερκειμένου και επαναδιάλυση του ιζήματος σε 5 ml μονιμοποιητικού διαλύματος. Στη συνέχεια, επανάληψη των πλύσεων με το μονιμοποιητικό διάλυμα μέχρι να παραμείνει καθαρό το ίζημα. Η προετοιμασία των χρωμοσωματικών παρασκευασμάτων για κυτταρογενετική ανάλυση έγινε ως εξής: Μέρος του υλικού επιστρώθηκε σε αντικειμενοφόρες πλάκες. Η επίστρωση του χρωμοσωματικού υλικού γίνεται με 1-2 σταγόνες εναιωρήματος κυττάρων πάνω σε καθαρή και υγρή αντικειμενοφόρο πλάκα. Η ποιότητα των πλακιδίων ελέγχεται με παρατήρηση σε οπτικό μικροσκόπιο αντίθετης φάσης και οι πλάκες αφήνονται να στεγνώσουν σε θερμοκρασία δωματίου. Για κάθε δείγμα που προορίζεται για κυτταρογενετική ανάλυση επιστρώνονται τουλάχιστον δύο αντικειμενοφόρες πλάκες από κάθε καλλιέργεια. Για λόγους τήρησης του απορρήτου, 52

54 τα δείγματα είναι κωδικοποιημένα και σε όλη την διάρκεια της διαδικασίας παραμένουν αυστηρώς ανώνυμα. Σε κάθε πλακάκι αναγράφεται μόνο ο εργαστηριακός κωδικός, η ημερομηνία παραλαβής του δείγματος και ο αύξων αριθμός του πλακιδίου. Τέλος, τα πλακίδια επωάζονται στους 90 ο C για 1h, προκειμένου να επιτευχθεί η παλαίωση των χρωμοσωματικών παρασκευασμάτων. Για τον προσδιορισμό των χρωμοσωμάτων και την ανάλυση της δομής τους χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ζωνοποίησης χρωμοσωμάτων GTG. Η ζώνωση G αποτελεί την πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδο ζωνοποίησης και χρώσης. Περιλαμβάνει κατεργασία των χρωμοσωμάτων με θρυψίνη για να μετουσιωθούν οι χρωμοσωματικές πρωτείνες, και χρώση με Leishman. Τα στάδια της μεθόδου είναι τα εξής: Τα χρωμοσωματικά παρασκευάσματα επωάζονται σε ισότονο διάλυμα θρυψίνης 0,05% για 30 sec περίπου και κατόπιν το ένζυμο απομακρύνεται με απόπλυση σε φυσιολογικό ορό. Ακολουθεί χρώση των παρασκευασμάτων σε διάλυμα Leishman για 1 min. Στη συνέχεια πραγματοποιείται έκπλυση με νερό βρύσης. Τα πλακίδια αφήνονται να στεγνώσουν, προστίθενται 2 σταγόνες Entellan ανά αντικειμενοφόρο πλάκα και τοποθετείται υάλινη καλυπτρίδα (24χ50). Η μικροσκοπική παρατήρηση-μελέτη και καρυοτυπική ανάλυση των ζωνοποιημένων και χρωσμένων χρωμοσωματικών παρασκευασμάτων έγινε σε οπτικό μικροσκόπιο (Zeis-Axioscop 40) εφοδιασμένο με ψηφιακή κάμερα μικροσκοπίου και με λογισμικό σύστημα ψηφιακής εικόνας IKAROS, της εταιρίας Metasystems (Metasystems, Germany). Με αντικειμενικό φακό 10χ, σαρώνεται η αντικειμενοφόρος πλάκα και ανιχνεύονται οι περιοχές που φέρουν μεταφάσεις με σχετικά καλή μορφολογία και διάταξη χρωμοσωμάτων, καθώς και με ικανοποιητικό για την ανάλυση αριθμό αλληλεπικαλυπτόμενων χρωμοσωμάτων. Με τη χρήση του καταδυτικού φακού 100χ μεγεθύνεται η εικόνα της μετάφασης, η οποία και αποθηκεύεται σε ηλεκτρονική μορφή. 53

55 Για κάθε δείγμα έγινε πλήρης καρυοτυπικός έλεγχος (ανάλυση 16 μεταφάσεων). Ο καρυότυπος περιγράφεται σύμφωνα με το ισχύον σύστημα κυτταρογενετικής ονοματολογίας ανθρώπου-international system for human cytogenetic nomenclature (ISCN) (Παράρτημα Ι και ΙΙ). Στις περιπτώσεις όπου δεν είχαμε αποτέλεσμα με την κλασική κυτταρογενετική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε η ταχεία μέθοδος ανίχνευσης χρωμοσωμικών ανευπλοειδιών QF-PCR (quantitative fluorescent polymerase chain reactionποσοτική φθορίζουσα αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) για τις πιο συχνές αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Οι πιο συχνές αυτές ανωμαλίες ανευρίσκονται στα χρωμοσώματα 21, 18, 13, Χ και Y. Η QF-PCR αποτελεί μια αξιόπιστη μέθοδο ανίχνευσης των ανευπλοειδιών αυτών των χρωμοσωμάτων με ελάχιστα ψευδώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα Το γενωμικό DNA εξήχθη με τη χρήση του εμπορικού σκευάσματος (kit) Maxwell 16 Cell LEV DNA Purification (Promega, USA). Για την εκτέλεση της QF- PCR χρησιμοποιήθηκε ένα σύνολο δεικτών STRs (short tandem repeats-μικρού μήκους διαδοχικές επαναλήψεις ή μικροδορυφόροι) για τα χρωμοσώματα 21, 18, 13, Χ και Y. Πιο συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν 4 STRs για τα Χ και Y χρωμοσώματα, 6 για το χρωμόσωμα 21, 4 για το χρωμόσωμα 18 και 4 για το χρωμόσωμα 13. Επιπλέον τα δείγματα αναλύθηκαν και για τα γονίδια της αμελογενίνης (amelogenin- AMXY) και του SRY για τον προσδιορισμό του εμβρυϊκού φύλου. Οι αντιδράσεις τέθηκαν σε τρεις διαφορετικές πολλαπλές PCR δοκιμασίες χρησιμοποιώντας γενωμικό DNA. Σε κάθε δοκιμασία προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα PCR (Invitrogen, USA), 1,5mM MgCl 2, 5-10 pmol του κάθε εκκινητή, 0,06 u/l Taq πολυμεράσης (Invitrogen, USA). Τα προϊόντα της QF-PCR υποβλήθηκαν σε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση σε αυτοματοποιημένο αναλυτή DNA (DNA sequencer) (ABI3100, Applied Biosystems). Στην ανάλυσή μας περιλήφθηκαν συνολικά 198 δείγματα (προϊόντα αποβολής) για τα οποία είχαμε αποτέλεσμα κυτταρογενετικής ανάλυσης. Εξ αυτών, σε 83 54

56 έμβρυα διαπιστώθηκαν χρωμοσωμικές ανωμαλίες (ποσοστό 41,9%). Για τα 83 αυτά έμβρυα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν τα εξής δεδομένα: καρυότυπος, ηλικία κύησης στην οποία έλαβε χώρα η αυτόματη αποβολή (σε συμπληρωμένες εβδομάδες), ηλικία της μητέρας (σε συμπληρωμένα έτη) και ο τρόπος σύλληψης (αυτόματη ή εξωσωματική γονιμοποίηση-in vitro fertilization, IVF). Οι σχετικές συχνότητες εκφράστηκαν ως ποσοστά (%). Οι ποσοτικές παράμετροι εκφράστηκαν ως μέση τιμή (mean) ± τυπική απόκλιση (standard deviation, SD) και ως διάμεση τιμή (median) και ενδοτεταρτημοριακό εύρος (interquartile range, IQR). Για τη στατιστική ανάλυση των ποσοτικών δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν οι δοκιμασίες t-test και η μη παραμετρική δοκιμασία κατά Wilcoxon για ανεξάρτητα δείγματα. Για τη σύγκριση των ποσοστών χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία χ² και η ακριβής δοκιμασία κατά Fisher. Ως στατιστικά σημαντικά θεωρήθηκαν τα αποτελέσματα όταν p-value < 0,05 σε δίπλευρο έλεγχο. Η στατιστική ανάλυση έγινε με την χρήση του στατιστικού προγράμματος MedCalc statistical software version (2013). 55

57 Β.2. Αποτελέσματα Στην ανάλυσή μας περιλήφθηκαν συνολικά 198 δείγματα (προϊόντα αποβολής) για τα οποία είχαμε αποτέλεσμα κυτταρογενετικής ανάλυσης. Εξ αυτών, σε 83 έμβρυα διαπιστώθηκαν χρωμοσωμικές ανωμαλίες (ποσοστό 41,9%) (Διάγραμμα 1). Η πλειοψηφία των εμβρύων έπασχε από αριθμητικές ανωμαλίες των χρωμοσωμάτων (75 έμβρυα, 90,4%). Δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες διαπιστώθηκαν σε 8 έμβρυα (9,6%) (Διάγραμμα 2). Η συνοπτική καταγραφή των αποτελεσμάτων της κυτταρογενετικής ανάλυσης των εμβρύων με χρωμοσωμικές ανωμαλίες στο δείγμα μας φαίνονται στον Πίνακα 1. Η συνοπτική κατανομή των χρωμοσωμικών ανωμαλιών που ανιχνεύτηκαν στα προϊόντα αποβολής του δείγματός μας απεικονίζονται στο Διάγραμμα 3. Μεταξύ των 8 εμβρύων με δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες, Σε 4 διαγνώστηκε παράγωγο χρωμόσωμα (derivative chromosome), σε 3 διαγνώστηκε μετάθεση κατά Robertson (Robertson translocation), και σε μία περίπτωση εντοπίστηκε δακτυλιοειδές χρωμόσωμα (ring chromosome) (Πίνακας 1). Συνολικά, η συχνότερη χρωμοσωμική ανωμαλία ήταν η αυτοσωματική τρισωμία (45 έμβρυα: 54,2%). Οι συχνότερες αυτοσωματικές τρισωμίες ήταν στα χρωμοσώματα 16 και 22 (από 7 περιπτώσεις, συχνότητα 15,6%). Ανευρέθηκαν επίσης 5 έμβρυα με τρισωμία 18 (σύνδρομο Edwards) (11,1%) και 5 έμβρυα με τρισωμία 13 (σύνδρομο Patau) (11,1%), ενώ ακολούθησαν σε συχνότητα οι τρισωμίες 7, 14, 15, 20 και 21 (σύνδρομο Down) με 3 περιπτώσεις η καθεμιά (6,7%) και η τρισωμία 3 με 2 περιπτώσεις (4,4%). Τέλος ανιχνεύτηκαν 4 έμβρυα με τρισωμία 4, 5, 8 και 12, αντίστοιχα (Διάγραμμα 4). Η κατανομή των εμβρύων κατά φύλο ήταν: 48 άρρενα (59,3%) και 33 θήλεα (40,7%) (Διάγραμμα 5), με αποτέλεσμα το πηλίκο των φύλων των εμβρύων που 56

58 αποβλήθηκαν (sex ratio) (άρρενα/θήλεα) να είναι 1,45. 2 έμβρυα ήταν μωσαϊκά 46,XY/46,XX (2,4%). Το πηλίκο των φύλων (άρρενα/θήλεα) ήταν 1 στα προϊόντα αποβολής με δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες και 2,32 στα έμβρυα με αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Συνολικά, το (%) ποσοστό των θηλέων εμβρύων ήταν 1,7 φορές μικρότερη μεταξύ των εμβρύων με αριθμητική, σε σύγκριση με αυτά με δομική χρωμοσωμική ανωμαλία (30,1% έναντι 50%) αλλά η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p=0,26) (Διάγραμμα 6). Μεταξύ των 8 εμβρύων με δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες, τα 4 ήταν άρρενα (50%) και τα 4 θήλεα (50%). Στις περιπτώσεις των 45 εμβρύων με αυτοσωματική τρισωμία, τα άρρενα έμβρυα ήταν 37 (82,2%) και τα θήλεα 7 (17,8%). Το πηλίκο του φύλου (άρρενα/θήλεα) ήταν 5,43. Όλα τα έμβρυα με αυτοσωματική τρισωμία 5, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 20, 21 και 22 ήταν άρρενα. Αντίθετα όλα τα έμβρυα με τρισωμία 3, 4 και 18 ήταν θήλεα. Η αναλογία των αρρένων εμβρύων ήταν 2,7 φορές μεγαλύτερη (82,3% έναντι 30,6%, 95%CI: 1,7-4,3, p<0,001) μεταξύ των αποβληθέντων εμβρύων με αυτοσωματική τρισωμία, σε σύγκριση με τους άλλους τύπους χρωμοσωμικών ανωμαλιών. 9 έμβρυα (10,8%) έπασχαν από ανευπλοειδία των φυλετικών χρωμοσωμάτων. Όλες αυτές οι περιπτώσεις ήταν θήλεα έμβρυα με σύνδρομο Turner (45,X). Σε 7 προϊόντα αποβολής διαπιστώθηκε μωσαϊκό (8,4%). Συγκεκριμένα, 5 έμβρυα διαγνώστηκαν με καρυότυπο 45,Χ/46,ΧΧ και 2 έμβρυα με καρυότυπο 46,ΧΥ/46,ΧΧ 12 έμβρυα διαγνώστηκαν με τριπλοειδία (14,5%). Συγκεκριμένα, εντοπίστηκαν 5 άρρενα έμβρυα με καρυότυπο 69,ΧΧΥ και 7 θήλεα με καρυότυπο 69,ΧΧΧ (πηλίκο φύλων: 0,71). Τα έμβρυα με τριπλοειδία ήταν η μόνη κατηγορία στην οποία βρέθηκαν να υπερτερούν τα θήλεα. 57

59 Τέλος, διαπιστώθηκε ένα άρρεν έμβρυο με διπλή τρισωμία (ταυτόχρονη ύπαρξη τρισωμίας 14 και τρισωμίας 21, καρυότυπος: 48,XY,+14+21) και μία περίπτωση διπλής υπεραριθμίας αυτοσωματικού και φυλετικού χρωμοσώματος (άρρεν έμβρυο με σύνδρομο Klinefelter XXY με συνύπαρξη τρισωμίας 18, καρυότυπος: 48,XXY,+18). Τα έμβρυα στο δείγμα μας αποβλήθηκαν μετά από διάρκεια κύησης (σε συμπληρωμένες εβδομάδες) από 7 ως 12, με μέση τιμή 7,8 και τυπική απόκλιση 1,1 εβδομάδες (7,8 ± 1,1 εβδομάδες). Η διάμεση ηλικία κύησης κατά την αποβολή ήταν 8 εβδομάδες με ενδοτεταρτημοριακό εύρος 7-8 εβδομάδες κύησης. Σχεδόν οι μισές αυτόματες αποβολές έλαβαν χώρα στις 7 εβδομάδες κύησης (49,4%) (Διάγραμμα 7). Περισσότερο από το 90% των αποβολών συνέβησαν μεταξύ 7-9 εβδομάδων (91,6%) ενώ λιγότερο από το 5% συνέβησαν στις εβδομάδες (Διάγραμμα 8). Η διάρκεια κύησης δεν διέφερε μεταξύ των αποβολών με δομικές και αυτών με αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες (8,0 έναντι 7,8, p=0,605) (Διάγραμμα 9). Η ηλικία της μητέρας που κυοφορούσε τα έμβρυα κυμάνθηκε από έτη με μέση τιμή 35,0 και τυπική απόκλιση 4,6 έτη (35,0 ± 4,6 έτη). Η διάμεση ηλικία της μητέρας ήταν τα 36 έτη με ενδοτεταρτημοριακό εύρος έτη. Το μεγαλύτερο ποσοστό των μητέρων ήταν ηλικία ετών (37,3%). 53,0% των μητέρων ήταν ηλικίας >35 ετών και 21,7% ήταν 40 ετών (Διάγραμμα 10). Η μέση ηλικία των γυναικών που απέβαλαν έμβρυο με αριθμητικές ανωμαλίες ήταν μεγαλύτερη από αυτές με αποβολή εμβρύου με δομικές ανωμαλίες (μέση ηλικία: 35,3 έτη έναντι 32,6 έτη, αντίστοιχα) αλλά η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p=0,116) (Διάγραμμα 11). Η συχνότητα των δομικών ανωμαλιών είναι 4,3 φορές μεγαλύτερη στα έμβρυα που αποβλήθηκαν από τις νεότερες γυναίκες (<35 ετών), σε σύγκριση με τα έμβρυα των μεγαλύτερης ηλικίας μητέρων ( 35 ετών) (17,6% έναντι 4,1%, αντίστοιχα), με την διαφορά να είναι στα όρια της στατιστικής σημαντικότητας (p=0,059) (Διάγραμμα 12). 58

60 Από τις 83 κυήσεις που κατέληξαν σε αυτόματη αποβολή, οι 11 ήταν μετά από IVF (13,3%) και οι 72 ήταν μετά από αυτόματη σύλληψη (86,7%) (Διάγραμμα 13). Η μέση ηλικία των γυναικών που συνέλαβαν με IVF ήταν μεγαλύτερη από αυτές που συνέλαβαν φυσιολογικά αν και η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (37,1 έναντι 34,7 έτη, αντίστοιχα, p=0,109) (Διάγραμμα 14). Το ποσοστό των μητέρων ηλικίας 35 ετών ήταν μεγαλύτερο μεταξύ αυτών που συνέλαβαν με IVF, σε σύγκριση με αυτές που συνέλαβαν φυσιολογικά αλλά η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (81,8% έναντι 55,6%, p=0,186) (Διάγραμμα 15). Στις αποβολές μετά από IVF, δε διαπιστώθηκε κανένα έμβρυο με δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες και το σύνολο των περιπτώσεων αφορούσαν αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Στις αποβολές μετά από φυσιολογική σύλληψη, διαγνώστηκαν 8 περιπτώσεις δομικών (11,1%) και 64 περιπτώσεις αριθμητικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών (88,8%). Η διαφορά στη συχνότητα των δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών δε διέφερε μεταξύ των κυήσεων που προήλθαν από IVF, σε σύγκριση με αυτές που προήλθαν από φυσιολογική σύλληψη (0% έναντι 11,1%, αντίστοιχα, p=0,589) (Διάγραμμα 16). Επίσης, δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των εμβρύων που αποβλήθηκαν μετά από IVF, σε σύγκριση με αυτά που αποβλήθηκαν μετά από φυσιολογική σύλληψη, στη συχνότητα ανευπλοειδίας συνολικά (81,8% έναντι 62,5%, αντίστοιχα, p=0,314), αυτοσωματικής ανευπλοειδίας (63,6% έναντι 52,8%, αντίστοιχα, p=0,538), ανευπλοειδίας των φυλετικών χρωμοσωμάτων (18,2% έναντι 9,7%, αντίστοιχα, p=0,341), μωσαϊκού (8,3% έναντι 8,3%, αντίστοιχα, p=1) και τριπλοειδίας (8,3% έναντι 15,3%, αντίστοιχα, p=1) (Διάγραμμα 17). 59

61 ,1 (%) , Έμβρυα με χρωμοσωμικές ανωμαλίες Έμβρυα με φυσιολογικό καρυότυπο Διάγραμμα 1. (%) ποσοστό των αποβληθέντων εμβρύων με χρωμοσωμικές ανωμαλίες και φυσιολογικό καρυότυπο στο δείγμα μας , (%) ,6 0 Αριθμητικές Χρωμοσωμικές ανωμαλίες Δομικές Διάγραμμα 2. (%) ποσοστό των αποβληθέντων εμβρύων με αριθμητικές και δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες στο δείγμα μας. 60

62 Πίνακας 1. Αποτελέσματα της κυτταρογενετικής ανάλυσης των προϊόντων αποβολής του δείγματός μας ΚΑΡΥΟΤΥΠΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ (%) ΔΟΜΙΚΕΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ 8 9,6 ΠΑΡΑΓΩΓΟ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ 4 4,8 46,XX,der(2)t(2;3)(p21.3;q35) 1 1,2 46,XX,der(8)t(2;8)(p21.3;q23) 1 1,2 46,XX,der(12)t(12;13)(p22.3;q14) 1 1,2 46,XY,der(13)t(8;13)(p21;q32) 1 1,2 ΔΑΚΤΥΛΙΟΕΙΔΕΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ 1 1,2 46,XY,ring(15) 1 1,2 ΜΕΤΑΘΕΣΗ ROBERTSON 3 3,6 46,XX,rob(22;22)(q10;q10) 1 1,2 46,XY,rob(21;21)(q10;q10) 1 1,2 46,XY,rob(13;13)(q10;q10) 1 1,2 ΑΡΙΘΜΗΤΙΚΕΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ 75 90,4 ΑΥΤΟΣΩΜΑΤΙΚΗ ΤΡΙΣΩΜΙΑ 45 54,2 47,XX,+3 2 2,4 47,XX,+4 1 1,2 47,XY,+5 1 1,2 47,XY,+7 3 3,6 47,XY,+8 1 1,2 47,XY, ,2 47,XY, ,0 47,XY, ,6 47,XY, ,6 47,XY, ,4 47,XX, ,0 47,XY, ,6 47,XY, ,6 47,XY, ,4 61

63 Πίνακας 1 (συνέχεια). Αποτελέσματα της κυτταρογενετικής ανάλυσης των προϊόντων αποβολής του δείγματός μας ΚΑΡΥΟΤΥΠΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ (%) ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΑ ΦΥΛΕΤΙΚΩΝ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΩΝ 9 10,8 45,X 9 10,8 ΔΙΠΛΗ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΑ 2 2,4 48,XY, ,2 48,ΧΧΥ, ,2 ΜΩΣΑΪΚΟ 7 8,4 45,X / 46,XX 5 6,0 46,XY / 46,XX 2 2,4 ΤΡΙΠΛΟΕΙΔΙΑ 12 14,5 69,XXY 5 6,0 69,XXX 7 8,4 ΣΥΝΟΛΟ (%) 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 Διπλή τρισωμία 2,4 Μωσαϊκό 8,4 Δομική χρωμοσωμική ανωμαλία Ανευπλοειδία φυλετικών χρωμοσωμάτων Τριπλοειδία 9,6 10,8 14,5 Αυτοσωματική τρισωμία 54,2 Διάγραμμα 3. Η κατανομή των χρωμοσωμικών ανωμαλιών στα προϊόντα αποβολής που εξετάστηκαν. 62

64 Καρυότυπος εμβρύου 47,XX,+3 47,XX,+4 47,XY,+5 47,XY,+7 47,XY,+8 47,XY,+12 47,XY,+13 47,XY,+14 47,XY,+15 47,XY,+16 47,XX,+18 47,XY,+20 47,XY,+21 47,XY,+22 (%) 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 2,2 2,2 2,2 2,2 4,4 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 11,1 11,1 15,6 15,6 Διάγραμμα 4. Κατανομή των καρυότυπων των εμβρύων με αυτοσωματική τρισωμία ,3 (%) , Άρρεν Φύλο εμβρύου Θήλυ Διάγραμμα 5. Κατανομή συχνοτήτων των αποβληθέντων εμβρύων του δείγματος κατά φύλο. 63

65 2,5 2,32 Πηλίκο φύλων (Άρρενα/Θήλεα) 2 1,5 1 0,5 1 0 Αριθμητικές Χρωμοσωμικές ανωμαλίες Δομικές Διάγραμμα 6. Το πηλίκο των φύλων (sex ratio) (άρρενα/θήλεα) των αποβληθέντων εμβρύων κατά χρωμοσωμική ανωμαλία. 60,0 50,0 49,4 40,0 34,9 (%) 30,0 20,0 10,0 0,0 7,2 3,6 3,6 1, Ηλικία κύησης (εβδομάδες) Διάγραμμα 7. Κατανομή συχνοτήτων των αποβληθέντων εμβρύων του δείγματος κατά εβδομάδα κύησης που έλαβε χώρα η αυτόματη αποβολή. 64

66 ,3 91,6 95,2 98, (%) 60 49, Ηλικία κύησης (εβδομάδες) Διάγραμμα 8. Αθροιστικό διάγραμμα της κατανομής συχνοτήτων των αποβληθέντων εμβρύων του δείγματος κατά εβδομάδα κύησης που έλαβε χώρα η αυτόματη αποβολή ,0 7,8 Διάρκεια κύησης (εβδομάδες) Δομικές Χρωμοσωμικές ανωμαλίες Αριθμητικές Διάγραμμα 9. Σύγκριση μέσης διάρκειας κύησης μεταξύ των αποβολών με δομικές και αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες. 65

67 40 37, , ,7 (%) , Ηλικία μητέρας (έτη) Διάγραμμα 10. Κατανομή συχνοτήτων των αποβληθέντων εμβρύων του δείγματος κατά ηλικία της μητέρας. Μέση ηλικία της μητέρας (έτη) ,6 35,3 0 Δομικές Χρωμοσωμικές ανωμαλίες Αριθμητικές Διάγραμμα 11. Η μέση ηλικία της μητέρας σε έμβρυα με δομικές και αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες. 66

68 ΔΟΜΙΚΕΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΑΡΙΘΜΗΤΙΚΕΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ,4 95,9 (%) ,6 4,1 <35 35 Ηλικία μητέρας (έτη) Διάγραμμα 12. (%) ποσοστό εμβρύων με δομικές και αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες σε νεότερες (<35 ετών) και μεγαλύτερης ηλικίας μητέρες ( 35 ετών) ,7 60 (%) ,3 0 Αυτόματη σύλληψη IVF Διάγραμμα 13. Κατανομή των αποβληθέντων εμβρύων κατά τρόπο σύλληψης. 67

69 ,1 34,7 30 Ηλικία μητέρας (έτη) IVF Φυσιολογική σύλληψη Διάγραμμα 14. Μέση ηλικία της μητέρας κατά τρόπο σύλληψης , ,6 (%) Αυτόματη σύλληψη IVF Διάγραμμα 15. (%) ποσοστό μητέρων ηλικίας 35 ετών σε έμβρυα που συνελήφθησαν φυσιολογικά και με IVF. 68

70 Δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες 120 Αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες ,8 100 (%) ,1 Φυσιολογική σύλληψη 0 IVF Διάγραμμα 16. Συχνότητα δομικών και αριθμητικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών κατά τρόπο σύλληψης. IVF Φυσιολογική σύλληψη ,8 (%) ,5 63,6 52, ,2 15,3 9,7 8,3 8,3 8,3 0 Ανευπλοειδία Αυτοσωματική ανευπλοειδία Ανευπλοειδία φυλετικών χρωμοσωμάτων Μωσαϊκό Τριπλοειδία Διάγραμμα 17. Κατανομή των τύπων χρωμοσωμικών ανωμαλιών κατά τρόπο σύλληψης. 69

71 Β.3. Συζήτηση Η αυτόματη αποβολή είναι ένα συχνό και συναισθηματικά καταστρεπτικό γεγονός που συνοδεύει την ανθρώπινη αναπαραγωγή. Τα πράγματα γίνονται ακόμη χειρότερα όταν σε μερικές περιπτώσεις τα αίτια είναι ανεξήγητα και παρ όλες τις επιστημονικές προόδους συχνά δεν μπορούν να προσδιοριστούν 22. Παρά ταύτα, είναι κοινά παραδεκτό ότι για τις αποβολές κυρίως του πρώτου τριμήνου, κλινικά αναγνωρισμένων κυήσεων, ευθύνονται σε ποσοστό μεγαλύτερο του 50% οι εμβρυϊκές χρωμοσωμικές ανωμαλίες 6, Από την άλλη πλευρά, αν δούμε τις αποβολές από μια εξελικτική οπτική, αυτό που θεωρούμε μια δυσμενή έκβαση της εγκυμοσύνης αντιπροσωπεύει συχνά μια βιολογική διαλογή ή μια φυσική επιλογή. Οι γυναίκες φαίνεται πως έχουν ένα αποδοτικό σύστημα διαλογής ( quality control system ) για να αποβάλουν τα γενετικά ανώμαλα έμβρυα. Με άλλα λόγια, η αποβολή μπορεί κάλλιστα να αντιπροσωπεύει έναν μηχανισμό επιλογής απογόνων 11,27, Περίπου το ένα τέταρτο του συνόλου των γυναικών είχαν τουλάχιστον μία αποβολή κατά τη διάρκεια της ζωής τους 138. Η σημασία των χρωμοσωμικών ανωμαλιών ως πιθανές αιτίες των αυτόματων αποβολών αποδείχθηκε μέσω συστηματικών κυτταρογενετικών ερευνών σε προϊόντα αποβολής εδώ και πολλά χρόνια 26,29. Το 86% αυτών των ανωμαλιών είναι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες ενώ για ένα μικρότερο ποσοστό περίπου 6% ευθύνονται οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες 24,31,137,138. Ο χρωμοσωμικός έλεγχος γίνεται με καρυοτύπηση. Ο κλασικός/ συμβατικός καρυότυπος, ο οποίος ορίζεται ως ο μορφολογικός χαρακτηρισμός των χρωμοσωμάτων ενός ατόμου συμπεριλαμβανομένων του αριθμού, της μορφής και του μεγέθους των χρωμοσωμάτων, μπορεί να ανιχνεύσει ανωμαλίες ολόκληρου του γονιδιώματος και ως εκ τούτου χρησιμοποιείται ως πρότυπο ( gold standard ) για ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε δείγματα προϊόντων αποβολής. Όμως, η 70

72 διακριτική ικανότητα του είναι μικρή με αποτέλεσμα ελλείμματα και διπλασιασμοί μικρότεροι των 5Mb να μην ανιχνεύονται. Για τον λόγο αυτό σήμερα, εκτός των κλασικών κυτταρογενετικών τεχνικών χρησιμοποιούνται και μοριακές τεχνικές 138. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν συνολικά 198 δείγματα (προϊόντα αποβολής). Παθολογικός καρυότυπος βρέθηκε σε 83 έμβρυα, ποσοστό 41,9%. Σχεδόν οι μισές αυτόματες αποβολές έλαβαν χώρα στις 7 εβδομάδες κύησης (49,4%). Περισσότερο από το 90% των αποβολών συνέβησαν μεταξύ 7-9 εβδομάδων κύησης (91,6%), ενώ λιγότερο από το 5% συνέβησαν στις εβδομάδες κύησης. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία πάνω από το 80% των αυτόματων αποβολών συμβαίνουν πριν τις 12 εβδομάδες κύησης και τουλάχιστον οι μισές από αυτές οφείλονται σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες 6, Οι πιο συχνές χρωμοσωμικές ανωμαλίες που ανιχνεύθηκαν στα προϊόντα αποβολής στο δείγμα μας ήταν κυρίως αριθμητικές (90,4%) και ως επί το πλείστον αυτοσωμικές τρισωμίες (54,2%). Οι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες αποτελούν την πιο συχνή αιτία της πρόωρης απώλειας της εγκυμοσύνης 41. Αν για το 50% περίπου των αυτόματων αποβολών του πρώτου τριμήνου ευθύνονται οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες 6,23-29, το 86% αυτών των ανωμαλιών είναι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες 24. Οι ανωμαλίες που έχουν σχέση με τον αριθμό των χρωμοσωμάτων ταξινομούνται κυρίως σε δύο κατηγορίες, τις πoλυπλοειδίες και τις ανευπλοειδίες 8,33,51. Μολονότι τα αίτια της ανευπλοειδίας δεν είναι απολύτως κατανοητά 32,33, είναι γνωστό ότι οι ανευπλοειδίες συνήθως οφείλονται σε αποτυχία διαχωρισμού (nondisjunction) ενός ζεύγους ομόλογων χρωμοσωμάτων κατά το στάδιο της ανάφασης της πρώτης μειωτικής διαίρεσης ή σε αποτυχία διαχωρισμού των αδελφών χρωματίδων στη μείωση ΙΙ επίσης στο στάδιο της ανάφασης 7. Η πιθανότητα μη διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων αυξάνει όσο αυξάνει η ηλικία της μητέρας 7,30, Ο μη διαχωρισμός μπορεί να συμβεί και μετά τη γονιμοποίηση δύο φυσιολογικών γαμετών, δηλαδή στη μίτωση μεταζυγωτικών κυττάρων από τα οποία 71

73 θα προκύψουν ανευπλοειδικές κυτταρικές σειρές. Το αποτέλεσμα του μεταζυγωτικού μη διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων είναι ο μωσαϊκισμός όπου το έμβρυο αποτελείται από ανευπλοειδικά και φυσιολογικά κύτταρα 60. Το φαινόμενο αυτό του μωσαϊκισμού συναντάται περίπου στο 8% των περιπτώσεων στις κυτταρογενετικές αναλύσεις των προϊόντων αποβολής 24, 138. Από τις αυτοσωματικές ανευπλοειδίες, συχνότερες είναι οι τρισωμίες 13, 16, 18, 21 και 22 (σε αναλογία 50% των αυτόματων αποβολών με γενετικές ανωμαλίες). Από τις ανευπλοειδίες των φυλετικών χρωμοσωμάτων συχνότερη (περίπου 25% στο σύνολο των γενετικώς ανώμαλων αυτόματων αποβολών) είναι η μονοσωμία 45,Χ, ενώ λιγότερο συχνή είναι η τρισωμία 47,ΧΧΥ. Η αυτοσωμική μονοσωμία είναι σχεδόν πάντα μη συμβατή με την ζωή 6,7,33,61,62. Οι συχνότερες αυτοσωμικές τρισωμίες που ανιχνεύθηκαν στο δείγμα μας ήταν η τρισωμία 16 (15,6%) (η τρισωμία 16 είναι μακράν η πιο συχνή τρισωμία που ανευρίσκεται στα προϊόντα αποβολής και ποτέ δεν επιβιώνει έως την γέννηση 145 ) και η τρισωμία 22 (15,6%) και ακολουθούν οι τρισωμίες 18 και 13 με ποσοστό 11,1% εκάστη. Ακολούθησαν σε συχνότητα οι τρισωμίες 7, 14, 15, 20 και 21 (σύνδρομο Down) με 3 περιπτώσεις η καθεμιά (6,7%) και η τρισωμία 3 με 2 περιπτώσεις (4,4%). Τέλος ανιχνεύτηκαν 4 έμβρυα με τρισωμία 4, 5, 8 και 12, αντίστοιχα. Επίσης, η συχνότερη φυλετική ανευπλοειδία που ανιχνεύθηκε ήταν η μονοσωμία 45Χ (10,8%). Η μονοσωμία 45Χ (σύνδρομο Turner) είναι η μόνη μονοσωμία που είναι συμβατή με τη ζωή. Είναι η πιο κοινή φυλετική ανευπλοειδία που ανευρίσκεται στα προϊόντα αποβολής και ευθύνεται περίπου για το 20% περίπου των αποβολών πρώτου τριμήνου 6, ενώ εμφανίζεται με συχνότητα περίπου 1 στις γεννήσεις ζώντων κοριτσιών 98. Επιπλέον, σε 7 προϊόντα αποβολής διαπιστώθηκε μωσαϊκό (8,4%). Συγκεκριμένα, 5 έμβρυα διαγνώστηκαν με καρυότυπο 45,Χ/46,ΧΧ και 2 έμβρυα με καρυότυπο 46,ΧΥ/46,ΧΧ. Επίσης, 12 έμβρυα διαγνώστηκαν με τριπλοειδία (14,5%). Συγκεκριμένα, εντοπίστηκαν 5 άρρενα έμβρυα με καρυότυπο 69,ΧΧΥ και 7 θήλεα με καρυότυπο 69,ΧΧΧ. Οι τριπλοειδίες εμφανίζονται σε ποσοστό περίπου 1% του 72

74 συνόλου των συλλήψεων και σε ποσοστό περίπου 15% όλων των αποβολών που οφείλονται σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες 44,45,49,146. Σε πολύ σπάνιες περιπτώσεις τριπλοειδικά έμβρυα επιβιώνουν ως το τέλος της κύησης 46, ενώ αν γεννηθούν ζωντανά δεν επιβιώνουν για πολύ 33. Η γονική προέλευση του επιπλέον απλοειδικού συνόλου χρωμοσωμάτων σε αυτές τις περιπτώσεις φαίνεται πως είναι πατρική περίπου στα 2/3 των περιπτώσεων και οφείλεται συνήθως στην γονιμοποίηση ενός φυσιολογικού απλοειδούς αωρίου είτε από δύο σπερματοζωάρια, είτε από ένα διπλοειδές σπερματοζωάριο (αποτέλεσμα αποτυχίας κατά τη μειωτική του διαίρεση) 49. Η μητρικής προέλευσης επιπλέον απλοειδικού συνόλου χρωμοσωμάτων, φαίνεται να είναι αποτέλεσμα αποτυχίας της πρώτης μητρικής μειωτικής διαίρεσης που έχει ως αποτέλεσμα διπλοειδές ωάριο ή λόγω διατήρησης του δεύτερου πολικού σωματίου (καθυστέρηση ενσωμάτωσης του δεύτερου πολικού σωματίου σε ένα στα πρώιμα βλαστομερίδια) 45,50. Τέλος, στο δείγμα μας διαπιστώθηκαν δύο έμβρυα με διπλή τρισωμία (ποσοστό 2,4%) εκ των οποίων ένα άρρεν έμβρυο με διπλή τρισωμία (ταυτόχρονη ύπαρξη τρισωμίας 14 και τρισωμίας 21, καρυότυπος: 48,XY,+14+21) και μία περίπτωση διπλής υπεραριθμίας αυτοσωματικού και φυλετικού χρωμοσώματος (άρρεν έμβρυο με σύνδρομο Kleinefelter XXY με συνύπαρξη τρισωμίας 18, καρυότυπος: 48,XXY,+18). Η ταυτόχρονη εμφάνιση διπλής ανευπλοειδίας συνδρόμου Edwards (τρισωμία 18) και συνδρόμου Klinefelter (47, ΧΧΥ) είναι σπάνια, μόνο 14 περιπτώσεις έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία Η ύπαρξη διπλής ανευπλοειδίας στο ίδιο άτομο είναι ένα σχετικά σπάνιο φαινόμενο 161. Αν και οι απλές τρισωμίες είναι οι συνηθέστερες χρωμοσωμικές ανωμαλίες που παρατηρούνται σε αποβολές πρώτου τριμήνου (>50%), οι διπλές τρισωμίες κυμαίνονται από 0,21 έως 2,8% στη βιβλιογραφία 162. Ο Alvarez και συν αναφέρουν ότι το ποσοστό των διπλών ανευπλοειδιών στις αποβολές είναι 2,18% 147. Δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες διαπιστώθηκαν σε 8 έμβρυα (9,6%). Σε 4 έμβρυα διαγνώστηκε παράγωγο χρωμόσωμα (derivative chromosome), σε 3 έμβρυα 73

75 διαγνώστηκε μετάθεση κατά Robertson (Robertson translocation), και σε μία περίπτωση εντοπίστηκε δακτυλιοειδές χρωμόσωμα (ring chromosome). Σύμφωνα με τους Goddijn και συν 24, Pflueger 31 και Van den Berg και συν 138 οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες ευθύνονται για ένα ποσοστό περίπου 6% των αυτόματων αποβολών του πρώτου τριμήνου. Οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες ή ορθότερα δομικές χρωμοσωμικές ανακατατάξεις είναι αλλαγές στη δομή ενός ή περισσότερων χρωμοσωμάτων και μπορεί να αφορούν μερικά γονίδια ή ένα μεγάλο τμήμα του χρωμοσώματος. Οι δομικές χρωμοσωμικές ανακατατάξεις είναι αποτέλεσμα θραύσης των χρωμοσωμάτων, που ακολουθείται από ανασύσταση με ανώμαλο συνδυασμό. Ανακατάταξη μπορεί να συμβεί με πολλούς τρόπους. Ο πιο συνήθης τρόπος, η ισοζυγισμένη μετάθεση, απαντά περίπου σε μία στις 375 γεννήσεις. Η ανταλλαγή χρωμοσωμικού υλικού γίνεται αυθόρμητα, σε χαμηλή συχνότητα, αλλά είναι δυνατό να προκληθεί και από παράγοντες θραύσης (μεταλλαξογόνα), όπως είναι η ιονίζουσα ακτινοβολία, ιογενείς λοιμώξεις και πολλές χημικές ουσίες. Όπως και οι αριθμητικές ανωμαλίες, οι δομικές χρωμοσωματικές ανακατατάξεις είναι δυνατό να υπάρχουν σε όλα τα κύτταρα ενός ατόμου ή σε μορφή μωσαϊκισμού. Υπάρχει περίπτωση τα κομμάτια που έσπασαν να χαθούν (μη ισοζυγισμένες ανακατατάξεις) 6,33. Όλες οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες μπορούν να οδηγήσουν σε αυτόματες αποβολές. Συχνότερα μπορούν να οδηγήσουν σε αποβολές οι μετατοπίσεις, επειδή οι φορείς της ανωμαλίας αυτής παράγουν, παρά το φυσιολογικό τους φαινότυπο, γαμέτες με μη ισοζυγισμένη μετάθεση. Τα ελλείμματα καταλήγουν σε αποβολές, επειδή τα μεγαλύτερα τουλάχιστον από αυτά δεν είναι συμβατά με τη ζωή. Αποβολή μπορούν να προκαλέσουν επίσης, αλλά σε μικρότερη συχνότητα, και η αναστροφή, καθώς και το δακτυλιοειδές χρωμόσωμα 7. Στο δείγμα μας, δεν διαπιστώθηκε διαφορά στην διάρκεια της κύησης μεταξύ των αποβολών με δομικές και αυτών με αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες. 74

76 Οι μεταθέσεις είναι η πιο κοινή, κλινικά σημαντική δομική ανωμαλία. Στην ισοζυγισμένη μορφή τους δεν έχουν καμία φαινοτυπική επίδραση. Ωστόσο οι μη ισοζυγισμένες μεταθέσεις είναι πιθανό να έχουν επιπτώσεις στο φαινότυπο του απογόνου και τη βιωσιμότητα της κύησης 145. Όταν στα προϊόντα αποβολής διαπιστώνεται μια μη ισοζυγισμένη δομική ανακατάταξη είναι σύνηθες να εξετάζεται ο καρυότυπος των γονέων για να καθοριστεί αν κάποιος από τους δύο γονείς είναι φορέας μια ισοζυγισμένης ανακατάταξης κάτι που αυξάνει τον κίνδυνο για μελλοντικό απόγονο με επιπλέον ή ελλιπές χρωμοσωμικό υλικό 163. Ένα ζευγάρι έχει κίνδυνο μη ισοζυγισμένης μετάθεσης σε μια εγκυμοσύνη που κυμαίνεται από 1% έως 5%, υποδεικνύοντας την ανάγκη για προγεννητική διάγνωση 164. Παρόλο που στους γονείς-φορείς μεταθέσεων ίσως η επιλογή του προεμφυτευτικού γενετικού ελέγχου (PGS), και ως εκ τούτου η υποβολή του ζεύγους σε εξωσωματική γονιμοποίηση, θα ήταν μια λύση, τα ερευνητικά δεδομένα δεν είναι ακόμη πειστικά Η ηλικία των μητέρων στο δείγμα μας κυμάνθηκε μεταξύ ετών, με μέση τιμή 35. Το 53% των μητέρων που απέβαλαν είχαν ηλικία πάνω από 35 έτη και το 21,7% πάνω από 40 έτη. Η αυξημένη ηλικία της μητέρας αποτελεί παράγοντα υψηλού κινδύνου για τις αυτόματες αποβολές και αυτό έχει παρατηρηθεί από πολλούς ερευνητές Στην ηλικία των 20 ετών ο κίνδυνος αποβολής είναι περίπου 10% και αυξάνεται πάνω από 90% μεταξύ των γυναικών 45 ετών και άνω 176. Επίσης, βρέθηκε ότι η συχνότητα των δομικών ανωμαλιών είναι 4,3 φορές μεγαλύτερη στα έμβρυα που αποβλήθηκαν από τις νεότερες γυναίκες (<35 ετών), σε σύγκριση με τα έμβρυα των μεγαλύτερης ηλικίας μητέρων ( 35 ετών) (17,6% έναντι 4,1%, αντίστοιχα) αλλά τα αποτελέσματα ήταν ενδεικτικά (p=0,059). Από τις 83 κυήσεις που κατέληξαν σε αυτόματη αποβολή, οι 11 ήταν μετά από IVF (13,3%) και οι 72 ήταν μετά από αυτόματη σύλληψη (86,7%). Σύμφωνα όμως με την βιβλιογραφία, φαίνεται πως οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες είναι κοινή 75

77 αιτία αυτόματων αποβολών πρώτου τριμήνου τόσο για τις αυτόματες συλλήψεις, όσο και για τις συλλήψεις μετά από τεχνικές υποβοηθούμενης αναπαραγωγής και δεν παρατηρούνται στατιστικά σημαντικές διαφορές 177,178. Επίσης, στις αποβολές μετά από IVF, δε διαπιστώθηκε κανένα έμβρυο με δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες και το σύνολο των περιπτώσεων αφορούσαν αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Η ανάλυση των δειγμάτων μας πραγματοποιήθηκε με κλασική κυτταρογενετική ανάλυση. Στις περιπτώσεις όπου δεν υπήρχε αποτέλεσμα με την κλασική κυτταρογενετική ανάλυση χρησιμοποίηθηκε η μέθοδος QF-PCR. Ο κλασικός καρυότυπος μπορεί να ανιχνεύσει αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες καθώς και δομικές ανακατατάξεις όταν όμως η απώλεια ή το επιπλέον γενετικό υλικό είναι αρκετά μεγάλο (πάνω από 5 Μb) 138. H QF-PCR, από την άλλη πλευρά, αποτελεί μεν μια αξιόπιστη μοριακή μέθοδο για την ανίχνευση των κοινών τρισωμιών (13, 18, 21, Χ και Υ) καθώς και του φύλου του εμβρύου αλλά δεν μπορεί να ανιχνεύσει δομικές αλλαγές 179. Δεδομένου ότι ο αριθμός των χρωμοσωμάτων που ελέγχονται με αυτή την τεχνική είναι περιορισμένος, το ζήτημα για το αν η QF-PCR είναι μια αξιόπιστη τεχνική από μόνη της, είναι αμφιλεγόμενο. Το μεγάλο μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι λειτουργεί με δείκτες για συγκεκριμένα χρωμοσώματα και δεν ελέγχει ολόκληρο το γονιδίωμα 138. Αν υπήρχε δυνατότητα αντί του συμβατικού καρυότυπου να γίνει μοριακός καρυότυπος (με μοριακές τεχνικές που ελέγχουν ολόκληρο το γονιδίωμα όπως για παράδειγμα την τεχνική array-cgh) θα υπήρχε η δυνατότητα να ανιχνευθούν μεταλλάξεις πολύ μικρότερες από αυτές που μπορεί να ανιχνευθούν με το συμβατικό καρυότυπο. Όπως για παράδειγμα, μικρά ελλείμματα ή μικροδιπλασιασμοί που μπορεί να συνδέονται με γνωστά σύνδρομα όπως τα σύνδρομα Prader Willi, Angelman, DiGeorge και άλλων, όπου δεν δύναται να ανιχνευτούν με το συμβατικό καρυότυπο 179. Παρ όλα αυτά η κάθε μέθοδος έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά της και για την ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε δείγματα προϊόντων αποβολής ο κλασικός καρυότυπος χρησιμοποιείται ακόμη ως πρότυπο ( gold standard ) 138,

78 Β.4. Συμπεράσματα Στην παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία παρουσιάστηκαν τα αποτελέσματα της κυτταρογενετικής ανάλυσης προϊόντων αποβολής πρώτου τριμήνου για πρώτη φορά σε Ελληνικό πληθυσμό. Από τα αποτελέσματά μας, προέκυψε συχνότητα χρωμοσωμικών ανωμαλιών 41,9%, με κυριαρχία των αριθμητικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε >90% των περιπτώσεων, με συχνότερες τις αυτοσωματικές τρισωμίες. Το 10,8% των αποβληθέντων εμβρύων έπασχαν από ανευπλοειδία φυλετικών χρωμοσωμάτων (σε όλες τις περιπτώσεις διαγνώστηκε σύνδρομο Turner), ενώ 8,4% των εμβρύων ήταν μωσαϊκά. Στο δείγμα μας επιβεβαιώθηκε το υψηλότερο ποσοστό αρρένων μεταξύ των εμβρύων με αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες (ιδίως των αυτοσωματικών χρωμοσωμάτων), ενώ τα έμβρυα με δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες δεν διέφεραν κατά φύλο, όπως και η τάση αύξησης της συχνότητας αριθμητικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών με την αύξησης της ηλικίας της μητέρας. Σημαντικά ευρήματα αποτελούν δύο περιπτώσεις με διπλή τρισωμία (ένα έμβρυο με ταυτόχρονη παρουσία τρισωμίας 14 και συνδρόμου Down και ένα έμβρυο με συνδυασμό συνδρόμων Klinefelter και Edwards). Η κυτταρογενετική ανάλυση των προϊόντων των αυτόματων αποβολών αποτελεί σημαντικό τμήμα στην αιτιολογική διερεύνηση της απώλειας του κυήματος ώστε να αποφεύγονται μη αναγκαίες ή πλημμελώς τεκμηριωμένες εξετάσεις και θεραπείες. Οι φορείς μεταθέσεων είναι υψηλού ρίσκου για αυτόματες αποβολές και επίσης έχουν αυξημένο κίνδυνο για απογόνους με χρωμοσωμική μη ισοζυγισμένη δομική ανωμαλία. Η ανίχνευση δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών στο έμβρυο, στις περιπτώσεις που και οι γονείς είναι φορείς, μπορούν να οδηγήσουν στην κατάλληλη γενετική συμβουλευτική και καθοδήγηση του ζευγαριού ή και στην 77

79 εφαρμογή προεμφυτευτικού γενετικού screening για την πρόληψη απώλειας σε επόμενη εγκυμοσύνη. 78

80 Βιβλιογραφία 1. Ridley, M. A survey of science: The edge of ignorance. The economist 1991;7644: Κρεατσάς, Γ. Μπότσης, Δ. Υφαντόπουλος, Ι. Νικολοπούλου-Σταμάτη, Π. Δεληγεώρογλου, Ε. Σαλάκος, Ν. Βραχνής, Ν. Κυήσεις, Αποβολές, δημογραφικό και οικονομική κρίση. Τα Νέα. Available from: [Accessed 15 th May 2015]. 3. Κρεατσάς, Γ. Μπότσης, Δ. Υφαντόπουλος, Ι. Νικολοπούλου-Σταμάτη, Π. Δεληγεώρογλου, Ε. Σαλάκος, Ν. Βραχνής, Ν. Υγεία: Διπλασιάστηκαν οι αποβολές τα τελευταία δυο χρόνια. Available from: oi_apovoles_ta_teleftaia_dyo_chronia [Accessed 5 th September 2015]. 4. Zegers-Hochschild F, Adamson GD, de Mouzon J, Ishihara O, Mansour R, Nygren K, Sullivan E, Vanderpoel S; International Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology; World Health Organization. International Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology (ICMART) and the World Health Organization (WHO) revised glossary of ART terminology, Fertil Steril 2009;92: Committee on Practice Bulletins Gynecology. The American College of Obstetricians and Gynecologists Practice Bulletin no Early pregnancy loss. Obstet Gynecol 2015;125: Cunningham G, Leveno K, Bloom S, Hauth J, Rouse D, Spong C. Williams Obstetrics, 23 rd Edition, New York, 2010, pp Καλογερόπουλος Α. Γυναικολογία, 2 η έκδοση. University Studio Press, Θεσσαλονίκη, 2004, σελ

81 8. Μανταλενάκης Σ. Σύνοψη Μαιευτικής και Γυναικολογίας, 2 η έκδοση. Ιατρικές Εκδόσεις Λίτσας, Αθήνα, 1990, σελ. 134, Simmons RK, Singh G, Maconochie N, Doyle P, Green J. Experience of miscarriage in the UK: qualitative findings from the National Women's Health Study. Soc Sci Med 2006;63: El-Sayed MM, Mohamed SA, Jones MH. Expectant management of firsttrimester miscarriage. J Obstet Gynaecol 2009;29: Hure AJ, Powers JR, Mishra GD, Herbert DL, Byles JE, Loxton D. Miscarriage, preterm delivery, and stillbirth: large variations in rates within a cohort of Australian women. PLoS One 2012;7:e Hogge WA, Byrnes AL, Lanasa MC, Surti U. The clinical use of karyotyping spontaneous abortions. Am J Obstet Gynecol 2003;189: Pierson R. Very early pregnancy. J Obstet Gynaecol Can 2006;28: Alijotas-Reig J, Garrido-Gimenez C. Current concepts and new trends in the diagnosis and management of recurrent miscarriage. Obstet Gynecol Surv 2013;68: Rai R, Regan L. Recurrent miscarriage. Lancet 2006;368: Jauniaux E, Farquharson RG, Christiansen OB, Exalto N. Evidence-based guidelines for the investigation and medical treatment of recurrent miscarriage. Hum Reprod 2006;21: Dória S, Carvalho F, Ramalho C, Lima V, Francisco T, Machado AP, Brandão O, Sousa M, Matias A, Barros A. An efficient protocol for the detection of chromosomal abnormalities in spontaneous miscarriages or foetal deaths. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2009;147: Yakut S, Toru HS, Çetin Z, Özel D, Şimşek M, Mendilcioğlu İ, Lüleci G. Chromosome abnormalities identified in 457 spontaneous abortions and their histopathological findings. Turk Patoloji Derg 2015;31:

82 19. Celep F, Karagüzel A, Ozeren M, Bozkaya H. The frequency of chromosomal abnormalities in patients with reproductive failure. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2006;127: Wilcox AJ, Weinberg CR, O'Connor JF, Baird DD, Schlatterer JP, Canfield RE, Armstrong EG, Nisula BC. Incidence of early loss of pregnancy. N Engl J Med 1988;319: Jurkovic D, Overton C, Bender-Atik R. Diagnosis and management of first trimester miscarriage. BMJ 2013;346:f Wolf GC, Horger EO 3rd. Indications for examination of spontaneous abortion specimens: a reassessment. Am J Obstet Gynecol 1995;173: Καλογερόπουλος Α. Μαιευτική. University Studio Press, Θεσσαλονίκη, Goddijn M, Leschot NJ. Genetic aspects of miscarriage. Baillieres Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2000;14: Guerneri S, Bettio D, Simoni G, Brambati B, Lanzani A, Fraccaro M. Prevalence and distribution of chromosome abnormalities in a sample of first trimester internal abortions. Hum Reprod 1987;2: Boué J, Bou A, Lazar P. Retrospective and prospective epidemiological studies of 1500 karyotyped spontaneous human abortions. Teratology 1975;12: Forbes LS. The evolutionary biology of spontaneous abortion in humans. Trends Ecol Evol 1997;12: Kajii T, Ferrier A, Niikawa N, Takahara H, Ohama K, Avirachan S. Anatomic and chromosomal anomalies in 639 spontaneous abortuses. Hum Genet 1980;55:

83 29. Turleau C, Chavin-Colin F, de Grouchy J. Cytogenetic investigation in 413 couples with spontaneous abortions. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1979;9: Stein Z, Stein W, Susser M. Attrition of trisomies as a maternal screening device. An explanation of the association of trisomy 21 with maternal age. Lancet 1986;1: Pflueger S. Cytogenetics of Spontaneous Abortion, In: Gersen S, Keagle M. (Εd) The principles of clinical cytogenetics, 2 nd Edition. Humana Press Inc, New Jersey, 2005, pp Sack G. Medical Genetics. Επιστημονικές Εκδόσεις Παρισιάνου, Αθήνα, 2002, σελ Nussbaum RL, McInnes RR, Willard HF. Thomson & Thompson: Genetics in Medicine, 7 th Edition. Saunders Elsevier, Philadelphia, 2007, pp Morin SJ, Eccles J, Iturriaga A, Zimmerman RS. Translocations, inversions and other chromosome rearrangements. Fertil Steril 2016 [Epub ahead of print] 35. Ushiki T, Hoshi O, Iwai K, Kimura E, Shigeno M. The structure of human metaphase chromosomes: its histological perspective and new horizons by atomic force microscopy. Arch Histol Cytol 2002;65: Watson JD. Crick FH. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 1953;171: Fraser RD. The structure of deoxyribose nucleic acid. J Struct Biol 2004;145: Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid. Clin Orthop Relat Res 2007;462: Tjio JH, Levan A. The chromosome number of man. Hereditas 1956;42:

84 40. Rebuzzini P, Zuccotti M, Redi CA, Garagna S. Chromosomal abnormalities in embryonic and somatic stem cells. Cytogenet Genome Res 2015;147: Ward KJ. Genetic factors in recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med 2000;18: Wang JC. Autosomal aneuploidy. In: Gersen S, Keagle M (Eds). The principles of clinical cytogenetics, 2 nd Edition. Humana Press Inc, New Jersey, 2005, pp Niemann I, Petersen LK, Hansen ES, Sunde L. Predictors of low risk of persistent trophoblastic disease in molar pregnancies. Obstet Gynecol 2006;107: Noor PJ, Hassan K. Cytogenetics of aborters and abortuses: a review. Singapore Med J 1984;25: Neuber M, Rehder H, Zuther C, Lettau R, Schwinger E. Polyploidies in abortion material decrease with maternal age. Hum Genet 1993;91: McFadden DE, Kalousek DK. Two different phenotypes of fetuses with chromosomal triploidy: correlation with parental origin of the extra haploid set. Am J Med Genet 1991;38: Jacobs PA, Szulman AE, Funkhouser J, Matsuura JS, Wilson CC. Human triploidy: relationship between parental origin of the additional haploid complement and development of partial hydatidiform mole. Ann Hum Genet 1982;46: Uchida IA, Freeman VC. Triploidy and chromosomes. Am J Obstet Gynecol 1985;151: Zaragoza MV, Surti U, Redline RW, Millie E, Chakravarti A, Hassold TJ. Parental origin and phenotype of triploidy in spontaneous abortions: predominance of diandry and association with the partial hydatidiform mole. Am J Hum Genet 2000;66:

85 50. Daniel A, Wu Z, Bennetts B, Slater H, Osborn R, Jackson J, Pupko V, Nelson J, Watson G, Cooke-Yarborough C, Loo C. Karyotype, phenotype and parental origin in 19 cases of triploidy. Prenat Diagn 2001;21: Mosby's medical dictionary, 8th edition. Elsevier, Penrose LS. The relative effects of paternal and maternal age in mongolism. J Genet 1933;27: Angell RR, Xian J, Keith J. Chromosome anomalies in human oocytes in relation to age. Hum Reprod 1993;8: Kumar RM, Khuranna A. The chromosome complement of human uncleaved oocytes. J Obstet Gynaecol 1995;21: Lim AS, Ho AT, Tsakok MF. Chromosomes of oocytes failing in-vitro fertilization. Hum Reprod 1995;10: Roberts CG, O'Neill C. Increase in the rate of diploidy with maternal age in unfertilized in-vitro fertilization oocytes. Hum Reprod 1995;10: Dailey T, Dale B, Cohen J, Munné S. Association between nondisjunction and maternal age in meiosis-ii human oocytes. Am J Hum Genet 1996;59: Sandalinas M, Márquez C, Munné S. Spectral karyotyping of fresh, noninseminated oocytes. Mol Hum Reprod 2002;8: Hook EB. Down syndrome rates and relaxed selection at older maternal ages. Am J Hum Genet 1983;35: Antonarakis SE, Avramopoulos D, Blouin JL, Talbot CC Jr, Schinzel AA. Mitotic errors in somatic cells cause trisomy 21 in about 4.5% of cases and are not associated with advanced maternal age. Nat Genet 1993;3: Adinolfi M, Pertl B, Sherlock J. Rapid detection of aneuploidies by microsatellite and the quantitative fluorescent polymerase chain reaction. Prenat Diagn 1997;17:

86 62. Lim HJ, Kim YJ, Yang JH, Kim EJ, Choi JS, Jung SH, Ahn HK, Han JY, Kim MY, Choi KH, Kim JM, Kim YM, Park SY, Ryu HM. Amniotic fluid interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of aneuploidy; experiences in 130 prenatal cases. J Korean Med Sci 2002;17: Down JLH. Observations on an ethnic classification of idiots. London Hospital Reports 1866;3: Lejeune J, Turpin R, Gautier M. Chromosomic diagnosis of mongolism. Arch Fr Pediatr 1959;16: Patterson D, Costa AC. Down syndrome and genetics - a case of linked histories. Nat Rev Genet 2005;6: Magenis RE. On the origin of chromosome anomaly. Am J Hum Genet 1988;42: Hall B. Mongolism in newborn infants. An examination of the criteria for recognition and some speculations on the pathogenic activity of the chromosomal abnormality. Clin Pediatr 1966;5: Hu Y, Zheng M, Xu Z, Wang X, Cui H. Quantitative real-time PCR technique for rapid prenatal diagnosis of Down syndrome. Prenat Diagn 2004;24: Edwards JH, Harnden DG, Cameron AH, Crosse VM, Wolff OH. A new trisomic syndrome. Lancet 1960;1: Kelly M, Robinson BW, Moore JW. Trisomy 18 in a 20-year-old woman. Am J Med Genet 2002;112: Van Dyke DC, Allen M. Clinical management considerations in long-term survivors with trisomy 18. Pediatrics 1990;85: Mehta L, Shannon RS, Duckett DP, Young ID. Trisomy 18 in a 13 year old girl. J Med Genet 1986;23:

87 73. Beratis NG, Kardon NB, Hsu LY, Grossman D, Hirschhorn K. Parental mosaicism in trisomy 18. Pediatrics 1972;50: Kohn G, Shohat M. Trisomy 18 mosaicism in an adult with normal intelligence. Am J Med Genet 1987;26: Gersdorf E, Utermann B, Utermann G. Trisomy 18 mosaicism in an adult woman with normal intelligence and history of miscarriage. Hum Genet 1990;84: Sarigol SS, Rogers DG. Trisomy 18 mosaicism in a thirteen-year-old girl with normal intelligence, delayed pubertal development, and growth failure. Am J Med Genet 1994;50: Butler MG. Trisomy 18 mosaicism in a 24-year-old white woman with normal intelligence and skeletal abnormalities. Am J Med Genet 1994;53: Collins AL, Fisher J, Crolla JA, Cockwell AE. Further case of trisomy 18 mosaicism with a mild phenotype. Am J Med Genet 1995;56: Patau K, Smith DW, Therman E, Inhorn SL, Wagner HP. Multiple congenital anomaly caused by an extra autosome. Lancet 1960;1: Morris JK, Savva GM. The risk of fetal loss following a prenatal diagnosis of trisomy 13 or trisomy 18. Am J Med Genet A 2008;146: Duarte AC, Menezes AI, Devens ES, Roth JM, Garcias GL, Martino-Roth MG. Patau syndrome with a long survival. A case report. Genet Mol Res 2004;3: Singh KS. Trisomy 13 (Patau's syndrome): a rare case of survival into adulthood. J Ment Defic Res 1990;34: Tunca Y, Kadandale JS, Pivnick EK. Long-term survival in Patau syndrome. Clin Dysmorphol 2001;10: Petry P, Polli JB, Mattos VF, Rosa RC, Zen PR, Graziadio C, Paskulin GA, Rosa RF. Clinical features and prognosis of a sample of patients with 86

88 trisomy 13 (Patau syndrome) from Brazil. Am J Med Genet A 2013;161: Yancey MK, Hardin EL, Pacheco C, Kuslich CD, Donlon TA. Non-mosaic trisomy 16 in a third-trimester fetus. Obstet Gynecol 1996;87: Gilbertson NJ, Taylor JW, Kovar IZ. Mosaic trisomy 16 in a live newborn infant. Arch Dis Child 1990;65: Devi AS, Velinov M, Kamath MV, Eisenfeld L, Neu R, Ciarleglio L, Greenstein R, Benn P. Variable clinical expression of mosaic trisomy 16 in the newborn infant. Am J Med Genet 1993;47: Lindor NM, Jalal SM, Thibodeau SN, Bonde D, Sauser KL, Karnes PS. Mosaic trisomy 16 in a thriving infant: maternal heterodisomy for chromosome 16. Clin Genet 1993;44: Garber A, Carlson D, Schreck R, Fischel-Ghodsian N, Hsu WT, Oeztas S, Pepkowitz S, Graham JM Jr. Prenatal diagnosis and dysmorphic findings in mosaic trisomy 16. Prenat Diagn 1994;14: Pletcher BA, Sanz MM, Schlessel JS, Kunaporn S, McKenna C, Bialer MG, Alonso ML, Zaslav AL, Brown WT, Ray JH. Postnatal confirmation of prenatally diagnosed trisomy 16 mosaicism in two phenotypically abnormal liveborns. Prenat Diagn 1994;14: Hajianpour MJ. Postnatally confirmed trisomy 16 mosaicism: follow-up on a previously reported patient. Prenat Diagn 1995;15: Hsu WT, Shchepin DA, Mao R, Berry-Kravis E, Garber AP, Fischel- Ghodsian N, Falk RE, Carlson DE, Roeder ER, Leeth EA, Hajianpour MJ, Wang JC, Rosenblum-Vos LS, Bhatt SD, Karson EM, Hux CH, Trunca C, Bialer MG, Linn SK, Schreck RR. Mosaic trisomy 16 ascertained through amniocentesis: evaluation of 11 new cases. Am J Med Genet 1998;80:

89 93. Hsu LY, Shapiro LR, Gertner M, Lieber E, Hirschhorn K. Trisomy 22: a clinical entity. J Pediatr 1971;79: Bacino CA, Schreck R, Fischel-Ghodsian N, Pepkowitz S, Prezant TR, Graham JM Jr. Clinical and molecular studies in full trisomy 22: further delineation of the phenotype and review of the literature. Am J Med Genet 1995;56: Heinrich T, Nanda I, Rehn M, Zollner U, Frieauff E, Wirbelauer J, Grimm T, Schmid M. Live-born trisomy 22: patient report and review. Mol Syndromol 2013;3: Stressig R, Körtge-Jung S, Hickmann G, Kozlowski P. Prenatal sonographic findings in trisomy 22: five case reports and review of the literature. J Ultrasound Med 2005;24: Kukolich MK, Kulharya A, Jalal SM, Drummond-Borg M. Trisomy 22: no longer an enigma. Am J Med Genet 1989;34: Sybert VP, McCauley E. Turner's syndrome. N Engl J Med 2004;351: Turner HH. A syndrome of infantilism, congenital webbed neck and cubitus valgus. Endocrinology 1938;23: Ford CE, Jones KW, Polani PE, De Almeida JC, Briggs JH. A sexchromosome anomaly in a case of gonadal dysgenesis (Turner's syndrome). Lancet 1959;1: Barr ML, Bertram EG. A morphological distinction between neurones of the male and female, and the behaviour of the nucleolar satellite during accelerated nucleoprotein synthesis. Nature 1949;163: Li X. Sex chromosomes and sex chromosome abnormalities. Clin Lab Med 2011;31: Klinefelter HF, Reifenstein EC, Albright F. Syndrome characterized by gynecomastia, aspermatogenesis without a-leydigism, and increased 88

90 excretion of follicle-stimulating hormone. J Clin Endocrinol Metab 1942;2: Jacobs, P.A. Strong, J.A. A case of human intersexuality having a possible XXY sex-determining mechanism. Nature, 1959, 183, pp Harton GL, Tempest HG. Chromosomal disorders and male infertility. Asian J Androl 2012;14: Milunsky A, Milunsky JM. Genetic counseling: Preconception, prenatal, and perinatal. In Milunsky A (Ed), Genetic disorders of the fetus: Diagnosis, prevention, and treatment, 5th ed. Baltimore and London, Johns Hopkins University Press, Jacobs PA, Hassold TJ. The origin of numerical chromosome abnormalities. Adv Genet 1995;33: Lowe X, Eskenazi B, Nelson DO, Kidd S, Alme A, Wyrobek AJ. Frequency of XY sperm increases with age in fathers of boys with Klinefelter syndrome. Am J Hum Genet 2001;69: Kaiser-Rogers K. Rao K. Structural Chromosome Rearrangements, In: Gersen S, Keagle M (Eds) The Principles of Clinical Cytogenetics, 2 nd Edition. Humana Press Inc., New Jersey, 2005, pp Van Dyke DL. Isochromosomes and interstitial tandem direct and inverted duplications. In: Daniel, A. (Ed) The cytogenetics of mammalian autosomal rearrangements. Liss AR, New York, 1988 pp Wyandt HE. Ring autosomes: identification, familial transmission, causes of phenotypic effects and in vitro mosaicism, In: Daniel, A. (Ed) The cytogenetics of mammalian autosomal rearrangements, Liss AR, New York, 1988, pp Wolff DJ, Miller AP, Van Dyke DL, Schwartz S, Willard HF. Molecular definition of breakpoints associated with human Xq isochromosomes: 89

91 implications for mechanisms of formation. Am J Hum Genet 1996;58: Sher KS, Jayanthi V, Probert CS, Stewart CR, Mayberry JF. Infertility, obstetric and gynaecological problems in coeliac sprue. Dig Dis 1994;12: Simpson JL, Mills JL, Kim H, Holmes LB, Lee J, Metzger B, Knopp R, Jovanovic-Peterson L, Aarons J, Conley M. Infectious processes: an infrequent cause of first trimester spontaneous abortions. Hum Reprod 1996;11: Devi Wold AS, Pham N, Arici A. Anatomic factors in recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med 2006;24: De Vivo A, Mancuso A, Giacobbe A, Moleti M, Maggio Savasta L, De Dominici R, Priolo AM, Vermiglio F. Thyroid function in women found to have early pregnancy loss. Thyroid 2010;20: Castañeda R, Lechuga D, Ramos RI, Magos C, Orozco M, Martínez H. Endemic goiter in pregnant women: utility of the simplified classification of thyroid size by palpation and urinary iodine as screening tests. BJOG 2002;109: Mills JL, Simpson JL, Driscoll SG, Jovanovic-Peterson L, Van Allen M, Aarons JH, Metzger B, Bieber FR, Knopp RH, Holmes LB. Incidence of spontaneous abortion among normal women and insulin-dependent diabetic women whose pregnancies were identified within 21 days of conception. N Engl J Med 1988;319: Cocksedge KA, Li TC, Saravelos SH, Metwally M. A reappraisal of the role of polycystic ovary syndrome in recurrent miscarriage. Reprod Biomed Online 2008;17:

92 120. Warren JB, Silver RM. Autoimmune disease in pregnancy: systemic lupus erythematosus and antiphospholipid syndrome. Obstet Gynecol Clin North Am 2004;31: Di Prima FA, Valenti O, Hyseni E, Giorgio E, Faraci M, Renda E, De Domenico R, Monte S. Antiphospholipid Syndrome during pregnancy: the state of the art. J Prenat Med 2011;5: Yasuda M, Takakuwa K, Tokunaga A, Tanaka K. Prospective studies of the association between anticardiolipin antibody and outcome of pregnancy. Obstet Gynecol 1995;86: Kutteh WH, Triplett DA. Thrombophilias and recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med 2006;24: Paidas MJ, Ku DH, Langhoff-Roos J, Arkel YS. Inherited thrombophilias and adverse pregnancy outcome: screening and management. Semin Perinatol 2005;29: Rey E, Kahn SR, David M, Shrier I. Thrombophilic disorders and fetal loss: a meta-analysis. Lancet 2003;361: Maconochie N, Doyle P, Prior S, Simmons R. Risk factors for first trimester miscarriage--results from a UK-population-based case-control study. BJOG 2007;114: Cnattingius S, Signorello LB, Annerén G, Clausson B, Ekbom A, Ljunger E, Blot WJ, McLaughlin JK, Petersson G, Rane A, Granath F. Caffeine intake and the risk of first-trimester spontaneous abortion. N Engl J Med 2000;343: Klebanoff MA, Levine RJ, DerSimonian R, Clemens JD, Wilkins DG. Maternal serum paraxanthine, a caffeine metabolite, and the risk of spontaneous abortion. N Engl J Med 1999;341: Domínguez-Rojas V, de Juanes-Pardo JR, Astasio-Arbiza P, Ortega- Molina P, Gordillo-Florencio E. Spontaneous abortion in a hospital 91

93 population: are tobacco and coffee intake risk factors? Eur J Epidemiol 1994;10: Armstrong BG, McDonald AD, Sloan M. Cigarette, alcohol, and coffee consumption and spontaneous abortion. Am J Public Health 1992;82: Kline J, Shrout P, Stein Z, Susser M, Warburton D. Drinking during pregnancy and spontaneous abortion. Lancet 1980;2: Chatenoud L, Parazzini F, di Cintio E, Zanconato G, Benzi G, Bortolus R, La Vecchia C. Paternal and maternal smoking habits before conception and during the first trimester: relation to spontaneous abortion. Ann Epidemiol 1998;8: Floyd RL, Decouflé P, Hungerford DW. Alcohol use prior to pregnancy recognition. Am J Prev Med 1999;17: Kesmodel U, Wisborg K, Olsen SF, Henriksen TB, Secher NJ. Moderate alcohol intake in pregnancy and the risk of spontaneous abortion. Alcohol Alcohol 2002;37: Brent RL. Utilization of developmental basic science principles in the evaluation of reproductive risks from pre- and postconception environmental radiation exposures. Teratology 1999;59: Johnson EM. Perspectives on reproductive and developmental toxicity. Toxicol Ind Health 1986;2: Azmanov DN, Milachich TV, Zaharieva BM, Michailova GI, Dimitrova VG, Karagiozova ZH, Maznejkova VT, Chernev TA, Toncheva DI. Profile of chromosomal aberrations in different gestational age spontaneous abortions detected by comparative genomic hybridization. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2007;131: Van den Berg MM, van Maarle MC, van Wely M, Goddijn M. Genetics of early miscarriage. Biochim Biophys Acta 2012;1822:

94 139. Cirigliano V, Voglino G, Cañadas MP, Marongiu A, Ejarque M, Ordoñez E, Plaja A, Massobrio M, Todros T, Fuster C, Campogrande M, Egozcue J, Adinolfi M. Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR. Assessment on 18,000 consecutive clinical samples. Mol Hum Reprod 2004;10: Nicolini U, Lalatta F, Natacci F, Curcio C, Bui TH. The introduction of QF- PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Hum Reprod Update 2004;10: Ogilvie CM, Donaghue C, Fox SP, Docherty Z, Mann K. Rapid prenatal diagnosis of aneuploidy using quantitative fluorescence-pcr (QF-PCR). J Histochem Cytochem 2005;53: Pertl B, Kopp S, Kroisel PM, Tului L, Brambati B, Adinolfi M. Rapid detection of chromosome aneuploidies by quantitative fluorescence PCR: first application on 247 chorionic villus samples. J Med Genet 1999;36: Atef SH, Hafez SS, Mahmoud NH, Helmy SM. Prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using QF-PCR: the egyptian study. J Prenat Med 2011;5: Papoulidis I, Siomou E, Sotiriadis A, Efstathiou G, Psara A, Sevastopoulou E, Anastasakis E, Sifakis S, Tsiligianni T, Kontodiou M, Malamaki C, Tzimina M, Petersen MB, Manolakos E, Athanasiadis A. Dual testing with QF-PCR and karyotype analysis for prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities. Evaluation of 13,500 cases with consideration of using QF- PCR as a stand-alone test according to referral indications. Prenat Diagn 2012;32: ESHRE Capri Workshop Group. Genetic aspects of female reproduction. Hum Reprod Update 2008;14:

95 146. Hassold T, Chen N, Funkhouser J, Jooss T, Manuel B, Matsuura J, Matsuyama A, Wilson C, Yamane JA, Jacobs PA. A cytogenetic study of 1000 spontaneous abortions. Ann Hum Genet 1980;44: Chen CP, Chern SR, Chen CY, Wu PC, Chen LF, Pan CW, Wang W. Double aneuploidy with Edwards-Klinefelter syndromes (48,XXY,+18) of maternal origin: prenatal diagnosis and molecular cytogenetic characterization in a fetus with arthrogryposis of the left wrist and aplasia of the left thumb. Taiwan J Obstet Gynecol 2011;50: Haylock J. Fitzgerald M. Danks D, Dennet X. Two cases of the 18-trisomy syndrome, one in combination with an XXY karyotype. Human Chromos Lett 1963;9: Cohen MM, Bumbalo TS. Double aneuploidy: trisomy-18 and Klinefelter s syndrome. Am J Dis Child 1967;113: Zellweger H, Abbo G. Double trisomy and double trisomic mosaicism. Am J Dis Child 1967;113: Henchman DC, Grey J, Campbell JB, Nance S. Klinefelter's Syndrome with mosaicism trisomy-18. Aust Paediatr J 1970;6: Bach C, Toublanc JE, Gautier M. Case of double aneuploidy: trisomy 18 and XXY. Ann Genet 1973;16: Nielsen J, Vetner M, Holm V, Askjaer AS, Reske-Nielsen E, Zizka J. Klinefelter's syndrome and trisomy 18 in a newborn boy. Clin Genet 1978;13: Rogers RC, Phelan MC, Pulliam L, Albies K. Double aneuploidy. Proc Greenwood Genet Ctr 1986;5: Hanna JS, Neu RL, Lockwood DH. Prenatal cytogenetic results from cases referred for 44 different types of abnormal ultrasound findings. Prenat Diagn 1996;16:

96 156. Van Ravenswaaij-Arts CM, Tuerlings JH, Van Heyst AF, Nijhuis JG, Niehof J, Smeets DF. Misinterpretation of trisomy 18 as a pseudomosaicism at third-trimester amniocentesis of a child with a mosaic 46,XY/47,XY, +3/48,XXY, +18 karyotype. Prenat Diagn 1997;17: Komwilaisak R, Ratanasiri T, Komwilaisak P, Luengwattanawanit S. Threedimensional ultrasonographic findings of the rare chromosomal abnormality 48, XXY/+18: a case report. J Med Assoc Thai 2004;87: Li QY, Tsukishiro S, Nakagawa C, Tanemura M, Sugiura-Ogasawara M, Suzumori K, Sonta S. Parental origin and cell stage of non-disjunction of double trisomy in spontaneous abortion. Congenit Anom 2005;45: Hou JW. Double aneuploidy: trisomy 18 and XXY in a boy. Chang Gung Med J 2006;29(4 Suppl): Begam M, Bekdache GN, Murthy SK, Mirghani HM. Double aneuploidy of trisomy 18 and Klinefelter syndrome: prenatal diagnosis and perinatal outcome. J Perinat Med 2010;38: Iliopoulos D, Poultsides G, Peristeri V, Kouri G, Andreou A, Voyiatzis N. Double trisomy (48,XXY,+21) in monozygotic twins: case report and review of the literature. Ann Genet 2004;47: Diego-Alvarez D, Ramos-Corrales C, Garcia-Hoyos M, Bustamante- Aragones A, Cantalapiedra D, Diaz-Recasens J, Vallespin-Garcia E, Ayuso C, Lorda-Sanchez I. Double trisomy in spontaneous miscarriages: cytogenetic and molecular approach. Hum Reprod 2006;21: Jacobs PA, Frackiewicz A, Law P, Hilditch CJ, Morton NE. The effect of structural aberrations of the chromosomes on reproductive fitness in man. II. Results. Clin Genet 1975;8: Franssen MT, Korevaar JC, van der Veen F, Leschot NJ, Bossuyt PM, Goddijn M. Reproductive outcome after chromosome analysis in couples 95

97 with two or more miscarriages: index [corrected]-control study. BMJ 2006;332: Carp H, Feldman B, Oelsner G, Schiff E. Parental karyotype and subsequent live births in recurrent miscarriage. Fertil Steril 2004;81: Sermon KD, Michiels A, Harton G, Moutou C, Repping S, Scriven PN, SenGupta S, Traeger-Synodinos J, Vesela K, Viville S, Wilton L, Harper JC. ESHRE PGD Consortium data collection VI: cycles from January to December 2003 with pregnancy follow-up to October Hum Reprod 2007;22: Verlinsky Y, Cohen J, Munne S, Gianaroli L, Simpson JL, Ferraretti AP, Kuliev A. Over a decade of experience with preimplantation genetic diagnosis: a multicenter report. Fertil Steril 2004;82: Nybo Andersen AM, Wohlfahrt J, Christens P, Olsen J, Melbye M. Maternal age and fetal loss: population based register linkage study. BMJ 2000;320: Fretts RC, Schmittdiel J, McLean FH, Usher RH, Goldman MB. Increased maternal age and the risk of fetal death. N Engl J Med 1995;333: Petitti DB. The epidemiology of fetal death. Clin Obstet Gynecol 1987;30: Berkowitz GS, Skovron ML, Lapinski RH, Berkowitz RL. Delayed childbearing and the outcome of pregnancy. N Engl J Med 1990;322: Harlap S, Shiono PH. Ramcharan S. A life table of spontaneous abortions and the effect of age, parity and other variables. In: Porter IH, Hook EB (Eds). Human embryonic and foetal death. Academic Press, New York,

98 173. Risch HA, Weiss NS, Clarke EA, Miller AB. Risk factors for spontaneous abortion and its recurrence. Am J Epidemiol 1988;128: Coste J, Job-Spira N, Fernandez H. Risk factors for spontaneous abortion: a case-control study in France. Hum Reprod 1991;6: Kline J. Stein Z. Spontaneous abortion. In: Bracken M (Ed) Perinatal epidemiology. Oxford University Press, New York, Heffner LJ. Advanced maternal age--how old is too old? N Engl J Med 2004;351: Pendina AA, Efimova OA, Chiryaeva OG, Tikhonov AV, Petrova LI, Dudkina VS, Sadik NA, Fedorova ID, Galembo IA, Kuznetzova TV, Gzgzyan AM, Baranov VS. A comparative cytogenetic study of miscarriages after IVF and natural conception in women aged under and over 35 years. J Assist Reprod Genet 2014;31: Ma S, Philipp T, Zhao Y, Stetten G, Robinson WP, Kalousek D. Frequency of chromosomal abnormalities in spontaneous abortions derived from intracytoplasmic sperm injection compared with those from in vitro fertilization. Fertil Steril 2006;85: Saldarriaga W, García-Perdomo HA, Arango-Pineda J, Fonseca J. Karyotype versus genomic hybridization for the prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities: a metaanalysis. Am J Obstet Gynecol 2015;212:330.e Lin SB, Xie YJ, Chen Z, Zhou Y, Wu JZ, Zhang ZQ, Shi SS, Chen BJ, Fang Q. Improved assay performance of single nucleotide polymorphism array over conventional karyotyping in analyzing products of conception. J Chin Med Assoc 2015;78:

99 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) (Μερικά από τα σύμβολα για την περιγραφή των χρωμοσωμικών ανωμαλιών σύμφωνα με το διεθνές σύστημα κυτταρογενετικής ονοματολογίας του ανθρώπου). Σύμβολα p q pter qter cen del der dic dup Ερμηνεία Μικρός βραχίονας Μεγάλος βραχίονας Κορυφή μικρού βραχίονα Κορυφή μεγάλου βραχίονα Κεντρομέρος Έλλειμμα Παράγωγο χρωμοσωμικής ανακατάταξης Δικεντρικό χρωμόσωμα Διπλασιασμός i, iso Ισοχρωμόσωμα ins inv mat pat r t rob mar Προσθήκη Αναστροφή Μητρικής προέλευσης Πατρικής προέλευσης Δακτυλιοειδές χρωμόσωμα Μετάθεση Robertsonian μετάθεση Χρωμόσωμα δείκτης + / - Προσθήκη/έλλειψη χρωμοσώματος / Μωσαϊκισμός 98

100 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ 99