ΒΑΣΙΛΙΚΗ XONΔΡΟΥ. Βιολόγος, MSc

Transcript

1 ΒΑΣΙΛΙΚΗ XONΔΡΟΥ Βιολόγος, MSc «ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΦΟΡΙΚΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΥΠΟΓΡΑΦΗΣ ΤΡΙΩΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΙΣΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΟΝΤΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΤΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ β-τυπου» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΠΑΤΡΑ 2017

2 ΒΑΣΙΛΙΚΗ XONΔΡΟΥ Βιολόγος, MSc «ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΦΟΡΙΚΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΥΠΟΓΡΑΦΗΣ ΤΡΙΩΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΙΣΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΟΝΤΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΤΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ β-τυπου» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΓΕΩΡΓΙΟΣ Π. ΠΑΤΡΙΝΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ/ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΚΩΝ/ΝΟΣ ΠΟΥΛΑΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΑΔΑΜΑΝΤΙΑ ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ, ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΑΝΑΡΓΥΡΟΣ ΣΥΜΕΩΝΙΔΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΣΠΥΡΟΥΛΙΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ-ΠΡΟΕΔΡΟΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΠΑΪΡΑΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΓΡΗΓΟΡΙΟΣ ΣΙΒΟΛΑΠΕΝΚΟ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ

3 Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσοβιολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών κατά τα ακαδημαϊκά έτη υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Πατρινού Γεώργιου. Μέρος αυτής χρηματοδοτήθηκε από το Ευρωπαϊκό πρόγραμμα RD-Connect D643. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα Kαθηγητή κ. Πατρινό Γεώργιο, για τη συνεχή καθοδήγηση, τις εποικοδομητικές συζητήσεις και τις πολύτιμες και πάντοτε εύστοχες υποδείξεις του καθ όλη τη διάρκεια του πειραματικού μέρους της παρούσας διατριβής αλλά και κατά τη συγγραφή της. Επίσης, νιώθω την ανάγκη να τον ευχαριστήσω για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε δίνοντας μου την ευκαιρία να πραγματοποιήσω τη διατριβή μου στο ΕΜΒΙΑ, για τα εφόδια τα οποία μου έδωσε αλλά και τους νέους ορίζοντες ερευνητικούς κι επαγγελματικούς που μου άνοιξε. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω, επίσης, στον κ. Πουλά Κων/νο, Aναπληρωτή Kαθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής, στην κα Παπαχατζοπούλου Αδαμαντία, Aναπληρώτρια Kαθηγήτρια του τμήματος Ιατρικής, στον κ. Συμεωνίδη Ανάργυρο, Καθηγητή του τμήματος Ιατρικής, στον κ. Σπυρούλια Γεώργιο, Καθηγητή-Πρόεδρο του τμήματος Φαρμακευτικής, στον κ. Πάϊρα Γεώργιο, Αναπληρωτή Καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής και στον κ. Σιβολαπένκο Γρηγόριο, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής για τη συμμετοχή τους στην εξεταστική επιτροπή καθώς και την εποικοδομητική κριτική του κειμένου μου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Πέτρο Κολοβό μεταδιδακτιρκό ερευνητή στο Ινστιτούτο BRIC του Πανεπιστημίου της Κοπεγχάγης για την βοήθειά του στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής. Ένα ακόμα μεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να εκφράσω στην κα Παπαχατζοπούλου Αδαμαντία, στην κα Κουράκλη Αλεξάνδρα, στην κα Χαλκιά Παναγιώτα και στην κα Θεοδωρίδου Μάτα για τη συλλογή των πολύτιμων δειγμάτων των ασθενών, η οποία πραγματοποιήθηκε στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών, στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης Α.ΧΕ.ΠΑ και στο Γ.Ν.Θ. Ιπποκράτειο.

4 Ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στη μεταδιδακτορική ερευνήτρια του εργαστηρίου κα Κατσίλα Θεοδώρα, η οποία ήταν η συνοδοιπόρος μου σε όλο αυτό το ταξίδι, για τις συμβούλες της, καθώς και για το γεγονός ότι μοιράστηκε μαζί μου τις γνώσεις και την εμπειρία της. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στην Επίκουρη Καθηγήτρια της ΣΘΕΤ του Ελληνικού Ανοικτού Πανεπιστημίου κα Σγουρού Αργυρώ για τις γνώσεις που με μετέδωσε, για τη στήριξη και την κατανόησή της κατά το διάστημα συγγραφής της παρούσας διατριβής και την ευκαιρία που μου έδωσε να συνεχίσω κοντά της. Στο σημείο αυτό θα ήθελα, επίσης, να ευχαριστήσω τους υποψήφιους διδάκτορες του ΕΜΒΙΑ, όλους μαζί, αλλά και τον κάθε ένα προσωπικά για την άριστη συνεργασία μας κι όλες τις ευχάριστες στιγμές που μοιραστήκαμε, όπως επίσης και τα υπόλοιπα μέλη αυτού για το φιλικό κλίμα που επικρατούσε στο εργαστήριο. Ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ θέλω να εκφράσω στην πολύτιμη φίλη μου και συνεργάτιδά μου Γραβιά Κατερίνα με την οποία μοιράστηκα όλες τις χαρές, αλλά κι όλες τις δυσκολίες των τριών αυτών χρόνων σε επαγγελματικό και προσωπικό επίπεδο. Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ το οφείλω στους γονείς μου, τον αδερφό μου και το Σπύρο, των οποίων η αγάπη κι η στήριξη βρίσκεται πίσω από κάθε μου βήμα. Χονδρού Βασιλική Ιούλιος 2017

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ερυθροποίηση Γενικά Η ερυθροποίηση κατά τη διάρκεια της οντογένεσης του ανθρώπου Αιμοσφαιρίνη Δομή και λειτουργία της ανθρώπινης αιμοσφαιρίνης Τύποι αιμοσφαιρίνης κατά τη διάρκεια της οντογένεσης Δομή κι οργάνωση των γονιδίων των σφαιρινών Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος των β σφαιρινών κατά την οντογένεση Διαμόρφωση της χρωματίνης Cis ρυθμιστικά στοιχεία Trans μεταγραφικοί παράγοντες Επιγενετικοί μηχανισμοί ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών Αιμοσφαιρινοπάθειες Δρεπανοκυτταρική Αναιμία Παθοφυσιολογία της νόσου Κλινικά συμπτώματα β Θαλασσαιμία Μεταλλάξεις στο γονίδιο της β σφαιρίνης Παθοφυσιολογία της νόσου Κλινικοί Φαινότυποι Αντιμετώπιση των αιμοσφαιρινοπαθειών β τύπου Αλλογενής μεταμόσχευση αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων Γονιδιακή Θεραπεία i

6 3.3.3 Επανενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου της γ σφαιρίνης Η υδροξυουρία στη θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών β τύπου Εξατομικευμενη Ιατρική Φαρμακογονιδιωματικοί Βιοδείκτες Το γονίδιο VEGFA ΣΚΟΠΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Μελέτη του διαφορικού μεταγραφικού προφίλ τριών αιμοποιητικών ιστών κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης οντογένεσης Μέθοδος των DNA μικροσυστοιχιών Ιστοί των οποίων το μεταγραφικό προφίλ αναλύθηκε με τη μέθοδο των DNA μικροσυστοιχιών Eπιλογή του γονιδίου VEGFA για περαιτέρω μελέτη Μελέτη του μεταγραφικού προφίλ των ερυθροειδικών κυττάρων κατά τη διαφοροποίησή τους προς την ερυθρά σειρά Μέθοδος Αλληλούχισης RNA Ιστοί των οποίων το μεταγραφικό προφίλ αναλύθηκε με τη μέθοδο RNA Seq Μελέτη μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών του γονιδίου VEGFA ως φαρμακογονιδιωματικούς δείκτες Δείγματα που αναλύθηκαν Απόμονωση γονιδιωματικού DNA από περιφερικό αίμα Ποσοτική και ποιοτική ανάλυση του DNA Εύρεση tagsnps Πολυμορφισμοί στόχοι Σχεδιασμός εκκινητών Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Μελέτη του πολυμορφισμού rs Touchdown PCR ii

7 4.7.1 Μελέτη του πολυμορφισμού rs Αllele Specific PCR Μελέτη του πολυμορφισμού rs Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Καθαρισμός PCR προϊόντων Αλληλούχιση κατά Sanger Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων γονοτύπησης Ισορροπία Hardy Weinberg Ακριβής έλεγχος του Fisher In silico πρόβλεψη της επίπτωσης των υπό μελέτη πολυμορφισμών στην παραγόμενη πρωτεΐνη ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μελέτη της διαφορικής μοριακής υπογραφής τριών αιμοποιητικών ιστών κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης οντογένεσης Επιλογή του γονιδίου VEGFA Μελέτη του μεταγραφικού προφίλ των ερυθροειδικών κυττάρων κατά τη διαφοροποίησή τους προς την ερυθρά σειρά Μελέτη μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών του γονιδίου VEGFA ως τροποποιητών της κλινικής εικόνας ασθενών με β θαλασσαιμία αλλά κι ως φαρμακογονιδιωματικών δείκτες Μελέτη του πολυμορφισμού rs Συσχέτιση με την κλινική εικόνα της νόσου Συσχέτιση με την απόκριση διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία ασθενών στη χορήγηση HU Μελέτη του πολυμορφισμού rs Συσχέτιση με την κλινική εικόνα της νόσου Συσχέτιση με την ανταπόκριση ασθενών διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία στη χορήγηση HU Μελέτη του πολυμορφισμού rs iii

8 Συσχέτιση με την κλινική εικόνα της νόσου Συσχέτιση με την απόκριση ασθενών διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία στη χορήγηση HU In silico πρόβλεψη της επίπτωσης των υπό μελέτη πολυμορφισμών στην παραγόμενη πρωτεΐνη ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Περίληψη Summary ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ iv

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1: Κλινική εικόνα, γονότυπος, αιματολογικά δεδομένα και συμπτώματα ασθενών με διαφορετικούς τύπους β θαλασσαιμίας Πίνακας 2: Διαφορετικές ισομορφές του γονιδίου VEGFA κι η λειτουργία τους Πίνακας 3: Ιστοί των οποίων το μεταγραφικό προφίλ μελετήθηκε με τη μέθοδο των DNA μικροσυστοιχιών Πίνακας 4: Ιστοί των οποίων το μεταγραφικό προφίλ μελετήθηκε με τη μέθοδο RNA Seq. 60 Πίνακας 5: Αριθμός δειγμάτων για κάθε υπό μελέτη πληθυσμιακή ομάδα Πίνακας 6: Χαρακτηριστικά των πολυμορφισμών στόχων της παρούσας μελέτης Πίνακας 7: Ποσοστιαία μεταβολή της έκφρασης του γονιδίου VEGFA κατά την ανθρώπινη οντογένεση Πίνακας 8: Ποσοστιαία μεταβολή της έκφρασης του γονιδίου VEGFA κατά τη διαφοροποίηση των ερυθροειδικών κυττάρων ανθρώπου Πίνακας 9: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία Πίνακας 10: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία 84 Πίνακας 11: Στατιστική ανάλυση της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον rs μεταξύ υγιών ατόμων, ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία κι ασθενών με μείζονα β θαλασσαιμία Πίνακας 12: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία ασθενών Πίνακας 13: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία ασθενών Πίνακας 14: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs10434 σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία κι ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία Πίνακας 15: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs10434 σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία Πίνακας 16: Στατιστική ανάλυση της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον rs10434 μεταξύ υγιών ατόμων, ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία και ασθενών με μείζονα β θαλασσαιμία v

10 Πίνακας 17: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs10434 μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία ασθενών Πίνακας 18: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs10434 μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία ασθενών Πίνακας 19: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία Πίνακας 20: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία 95 Πίνακας 21: Στατιστική ανάλυση της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον rs μεταξύ υγιών ατόμων, ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία κι ασθενών με μείζονα β θαλασσαιμία Πίνακας 22: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία ασθενών Πίνακας 23: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία ασθενών Πίνακας 24: Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη των πολυμορφισμών rs , rs10434 και rs Πίνακας 25: Πρωτόκολλο της αντίδρασης PCR για τους πολυμορφισμούς rs , rs10434 και rs Πίνακας 26: Συνθήκες PCR για τον πολυμορφισμό rs Πίνακας 27: Συνθήκες Touchdown PCR για τον πολυμορφισμό rs Πίνακας 28: Συνθήκες AS PCR για τον πολυμορφισμό rs Πίνακας 29: Γονότυπος ασθενών με μείζονα β θαλασσαιμία Πίνακας 30: Αιματολογικά και μοριακά δεδομένα ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία Πίνακας 31: Αιματολογικά και μοριακά δεδομένα ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία Πίνακας 32: Κλινικά δεδομένα ασθενών διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία ασθενών οι οποίοι λαμβάνουν HU ως θεραπευτική αγωγή vi

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1: Η ερυθροποίηση κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης οντογένεσης Εικόνα 2: Διαφοροποίηση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων... 6 Εικόνα 3: Δομή του μορίου της αιμοσφαιρίνης... 7 Εικόνα 4: Έκφραση των διαφορετικών σφαιρινικών γονιδίων κατά την οντογένεση του ανθρώπου... 9 Εικόνα 5: Δομή και οργάνωση των σφαιρινικών γονιδίων του ανθρώπου Εικόνα 6: Αναπαράσταση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της LCR και των γονιδίων του συμπλέγματος των β σφαιρινών στα ερυθροειδικά κύτταρα Εικόνα 7: Μεταγραφικοί παράγοντες που εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος των β σφαιρινών Εικόνα 8: mirnas που εμπλέκονται στην έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών Εικόνα 9: Δρεπανοκύτταρο και φυσιολογικό ερυθροκύτταρο Εικόνα 10: Σημειακές μεταλλάξεις κι έκταση των ελλείψεων στις θαλασσαιμίες και στο σύνδρομο HPFH Εικόνα 11: Είδη και θέσεις μεταλλάξεων στο γονίδιο της β σφαρίνης Εικόνα 12: Κατανομή των μεταλλάξεων της β θαλασσαιμίας Εικόνα 13: Παθοφυσιολογία της β θαλασσαιμίας Εικόνα 14: Κλινικά συμπτώματα με τη μεγαλύτερη συχνότητα μεταξύ ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων και μείζονα β θαλασσαιμία Εικόνα 15: Πιθανή θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών β τύπου μέσω γονιδιακής θεραπείας Εικόνα 16: Σηματοδοτικά μονοπάτια που οδηγούν σε επαγωγή της γ σφαιρίνης και τα οποία ενεργοποιούνται από την HU Εικόνα 17: Δομή του ανθρώπινου γονιδίου VEGFA και οι διαφορετικές ισομορφές που προκύπτουν από εναλλακτική συναρμογή Εικόνα 18: Τα μέλη της οικογένειας VEGF και οι υποδοχείς τους VEGFRs Εικόνα 19: Αρχή της μεθόδου των DNA μικροσυστοιχιών Εικόνα 20: Βασικά βήματα ενός πειράματος RNA seq Εικόνα 21: Αρχή της Allele Specific PCR Εικόνα 22: Χρωματογράφημα αλληλούχισης κατά Sanger Εικόνα 23: Χρωμοδιάγραμμα διαφορικής έκφρασης γονιδίων μεταξύ HEPs περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου και HEPs ομφαλοπλακουντικού αίματος vii

12 Εικόνα 24: Χρωμοδιάγραμμα διαφορικής έκφρασης γονιδίων μεταξύ HEPs περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου και HEPs εμβρυϊκού ήπατος Εικόνα 25: Χρωμοδιάγραμμα διαφορικής έκφρασης γονιδίων μεταξύ ΗΕPs ιστών που εκφράζουν υψηλά και ιστών που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα HbF Εικόνα 26: Χρωμοδιάγραμμα διαφορικής έκφρασης γονιδίων κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων της ερυθράς σειράς Εικόνα 27: Ενδεικτική ανάλυση PCR προϊόντων μεγέθους 341bp που εμπεριέχουν τον SNP rs σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% w/v Εικόνα 28: Ενδεικτικό χρωματογράφημα ατόμων με διαφορετικό γονότυπο ως προς τον SNP rs (C>A) Εικόνα 29: Ιστόγραμμα της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία Εικόνα 30: Ιστόγραμμα της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs μεταξύ ανταποκρινόμενων και μη στην HU ασθενών Εικόνα 31: Ενδεικτική ανάλυση PCR προϊόντων μεγέθους 325bp που εμπεριέχουν τον SNP rs10434 σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% w/v Εικόνα 32: Ενδεικτικό χρωματογράφημα ατόμων με διαφορετικό γονότυπο ως προς τον SNP rs10434 (G>A) Εικόνα 33: Ιστόγραμμα της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs10434 σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία Εικόνα 34: Ιστόγραμμα % συχνότητας εμφάνισης γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs10434 μεταξύ ανταποκρινόμενων και μη στην HU ασθενών Εικόνα 35: Ενδεικτική ανάλυση AS PCR προϊόντων μεγέθους 248bp σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% w/v Εικόνα 36: Ιστόγραμμα % συχνότητας εμφάνισης γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία Εικόνα 37: Ιστόγραμμα % συχνότητας εμφάνισης γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs μεταξύ ανταποκρινόμενων και μη στην HU ασθενών Εικόνα 38: Ανισορροπία σύνδεσης (LD) μεταξύ των υπό μελέτη πολυμορφισμών Εικόνα 39: Σχέση μεταξύ των αλληλομόρφων των πολυμορφισμών rs και rs viii

13 Εικόνα 40: Αποτελέσματα από Human Splicing Finder ix

14 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΟΙ ΟΡΟΙ Active Chromatin Hub (ACH): Ενεργό κέντρο χρωματίνης AS-PCR: Allele Specific PCR BFU-E: Burst Forming Unit-Erythroid CFU-E: Colony Forming Unit-Erythroid Common Lymphoid Progenitor (CLP): Κοινός πρόγονος της λεμφοειδούς σειράς Common Myeloid Progenitor (CMP): Κοινός πρόγονος της μυελοειδούς σειράς Definitive Erythropoiesis: Οριστική Ερυθροποίηση Food and Drug Administration (FDA): Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων των Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής Genome Wide Association Studies (GWAS): Mελέτες συσχέτισης γονιδιωματικής κλίμακας Granulocytes/Macrophages Progenitors (GMP): Προγονικά κύτταρα των κοκκιοκυττάρων και των μακροφάγων Human Erythroid Progenitors (HEPs): Προγονικά ερυθροειδικά κύτταρα ανθρώπου Hematopoietic Stem Cell (HSC): Αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα Hematopoietic Stem Cell Transplantation (HSCΤ): Μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων Hemoglobin (Hb): Αιμοσφαιρίνη Hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH): Κληρονομική παραμονή της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HU: Υδροξυουρία Hypersensitive site (HS): Υπερευαίσθητη θέση Intervening Sequences (IVS): παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες x

15 Linkage Disequilibrium (LD): Ανισορροπία σύνδεσης Locus Control Region (LCR): Περιοχή ελέγχου του γενετικού τόπου Mean Cellular Hemoglobin (MCH): Mέση περιεκτικότητας αιμοσφαιρίνης Mean Cellular Volyme (MCV): Mέσος όγκος ερυθρών αιμοσφαιρίων Megakaryocyte/Erythrocyte Progenitors (MEP): Προγονικά κύτταρα των μεγακαρυοκυττάρων και των ερυθροκυττάρων Natular Killer Cells (NK): Φυσικά φονικά κύτταρα Non-Transfusion Depedent Thalassemia (NTDT): Μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων θαλασσαιμία Pluripotent stem cell: Πολυδύναμο αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο Primitive erythropoiesis: Αρχέγονη Ερυθροποίηση Short Chain Fatty Acids (SCFAs): Βραχείας αλυσίδας λιπαρά οξέα Sickle-cell Disease (SCD): Δρεπανοκυτταρική αναιμία Single Nucleotide Polymorphism (SNP): Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός Vascular endothelial Growth Factor (VEGFA): Ενδοθηλιακός Αυξητικός Παράγοντας-Α Vascular Endothelial Growth Factor Receptors (VEGFRs): Υποδοχείς των Ενδοθηλιακών Αυξητικών Παραγόντων xi

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1

17 1. Ερυθροποίηση 1.1 Γενικά Το αίμα των θηλαστικών περιέχει διαφορετικούς τύπους κυττάρων με συγκεκριμένη λειτουργία. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια ή αλλιώς ερυθροκύτταρα αποτελούν τον πιο κοινό τύπο κυττάρων του αίματος. Πρόκειται για απύρηνα κύτταρα χωρίς οργανίδια σε σχήμα αμφίκοιλου δίσκου με κύρια λειτουργία τη μεταφορά O 2 στους ιστούς. Στον άνθρωπο τα ερυθροκύτταρα έχουν μέση διάρκεια ζωής περίπου 120 ημέρες κι ανανεώνονται καθ όλη τη διάρκεια ζωής ενός ατόμου. Η διαδικασία παραγωγής των ερυθροκυττάρων από ένα αρχέγονο πολυδύναμο κύτταρο ονομάζεται ερυθροποίηση [1]. Η ερυθροποίηση ξεκινά πολύ νωρίς κατά την εμβρυογένεση. Αποτελεί μια από τις πρώτες διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα αμέσως μετά την εμφύτευση της βλαστοκύστης στα τοιχώματα της μήτρας κι είναι απαραίτητη για την επιβίωση του εμβρύου. Κατά την οντογένεση των θηλαστικών η ερυθροποίηση πραγματοποιείται σε παροδικές δομές, όπως ο λεκιθικός σάκος κι ο πλακούντας καθώς και σε διαφορετικά όργανα, που εναλλάσσονται κατά την διάρκεια της εμβρυογένεσης, γεγονός που πιθανά εξυπηρετεί τις ανάγκες του εμβρύου. Τα πρώτα ερυθροειδικά κύτταρα εμφανίζονται στο λεκιθικό σάκο πριν ακόμα ξεκινήσει η κυκλοφορία του αίματος. Καθώς η οργανογένεση ξεκινά, ερυθροειδικά κύτταρα ανιχνεύονται στο μεσόνεφρο, στον πλακούντα και στις ομφαλοπλακουντικές αρτηρίες. Αργότερα, κατά τη διάρκεια της κύησης το εμβρυϊκό ήπαρ γίνεται το κύριο κέντρο ερυθροποίησης ενώ λίγο πριν τη γέννηση μεταφέρεται στο μυελό των οστών που αποτελεί πια το κέντρο ερυθροποίησης σε όλη τη διάρκεια ζωής του ατόμου [2-6]. Εξελικτικά η ερυθροποίηση διακρίνεται σε: Αρχέγονη ερυθροποίηση (primitive erythropoiesis) η οποία πραγματοποιείται στις νησίδες αίματος στο λεκιθικό σάκο και χαρακτηρίζεται από την παροδική κυκλοφορία μεγάλων εμπύρηνων ερυθροβλαστών οι οποίοι στο τέλος χάνουν τον πυρήνα τους κι εκφράζουν τις εμβρυονικές αιμοσφαιρίνες και σε 2

18 Οριστική ερυθροποίηση (definitive erythropoiesis) η οποία χαρακτηρίζεται από τη συνεχή κυκλοφορία μικρότερων σε μέγεθος απύρηνων ερυθροκυττάρων. Η οριστική ερυθροποίηση θα μπορούσε περαιτέρω να διακριθεί σε αυτή του εμβρυϊκού σταδίου, η οποία πραγματοποιείται στο εμβρυϊκό ήπαρ με τα ερυθροκύτταρα να εκφράζουν την εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη HbF και σε αυτή του ενήλικου σταδίου, η οποία πραγματοποιείται στο μυελό των οστών με τα ερυθροκύτταρα να παράγουν την ενήλικη αιμοσφαιρίνη HbA [7, 8]. 1.2 Η ερυθροποίηση κατά τη διάρκεια της οντογένεσης του ανθρώπου Στον άνθρωπο, το πρώτο κύμα ερυθροποίησης πραγματοποιείται μεταξύ της 3 ης και της 4 ης εβδομάδας κυήσεως. Αρχέγονα προγονικά κύτταρα των ερυθρών αιμοσφαιρίων (EryP-CFC) που προέρχονται από το μεσόδερμα με καθορισμένες αιμοποιητικές ιδιότητες (αιμαγγειοβλάστης) σχηματίζουν συμπαγείς αποικίες μεταξύ των μεσοδερμικών κυττάρων του λεκιθικού σάκου στο τέλος της γαστριδίωσης [9]. Με την έναρξη του καρδιακού παλμού εμπύρηνα πρόδρομα ερυθροκύτταρα στο στάδιο του προερυθροβλάστη αρχίζουν να κυκλοφορούν και να ωριμάζουν σταδιακά. Κατά τη διαδικασία της ωρίμανσης τους παρατηρείται αύξηση του αριθμού τους μέσω περιορισμένου αριθμού συμμετρικών διαιρέσεων, μείωση του μεγέθους τους, συμπύκνωση του πυρήνα με απώλεια της ευχρωματίνης, συσσώρευση αιμοσφαιρίνης και μείωση του ποσού του RNA. Οι ερυθροβλάστες αυτοί τελικά χάνουν τον πυρήνα τους αρκετές μέρες μετά την είσοδό τους στην κυκλοφορία του αίματος [10]. Το δεύτερο κύμα ερυθροποίησης ξεκινά επίσης από το λεκιθικό σάκο. Στο έμβρυο του ανθρώπου οριστικά προγονικά κύτταρα της ερυθράς σειράς, BFU-Es (Burst- Forming Unit-Erythroid), εντοπίζονται στο λεκιθικό σάκο περίπου την 4 η εβδομάδα κυήσεως, μεταναστεύουν στο εμβρυϊκό ήπαρ αμέσως μετά το σχηματισμό του (5 η -6 η εβδομάδα κυήσεως), διαφοροποιούνται σε ερυθρά αιμοσφαίρια χάνοντας τον πυρήνα τους κι απελευθερώνονται στην κυκλοφορία του αίματος αποτελώντας τα πρώτα οριστικά ερυθροκύτταρα του εμβρύου [11]. Το τρίτο κύμα ερυθροποίησης είναι πιο πολύπλοκο και ξεκινάει από τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα ((Ηematopoietic Stem Cells, HSCs) τα οποία 3

19 παράγονται σε ενδο-εμβρυονικές δομές όπως η περιοχή αορτής-γονάδων-μεσόνεφρου (aorta-gonad-mesonephros region, AGM), τα αγγεία κι o πλακούντας. Στο έμβρυο του ανθρώπου εντοπίζονται στην AGM περιοχή την 5 η εβδομάδα κυήσεως. Τα παραπάνω HSCs δεν διαφοροποιούνται στους ιστούς που παράγονται αλλά εποικίζουν το εμβρυϊκό ήπαρ, το θύμο αδένα και το μυελό των οστών και διαφοροποιούνται σε κύτταρα της λεμφοειδούς και της μυελοειδούς σειράς (εικόνα 1) [12, 13]. Στην οριστική ερυθροποίηση σε αντίθεση με την αρχέγονη οι πρόδρομες μορφές των ερυθροκυττάρων ωριμάζουν έξω από τα αγγεία στις ερυθροβλαστικές νησίδες. Οι νησίδες αυτές αποτελούνται από ερυθροβλάστες οι οποίοι περιβάλλουν ένα κεντρικό μακροφάγο που διευκολύνει την φαγοκυττάρωση των πυρήνων που προέρχονται από τους νορμοβλάστες και παρέχει το σίδηρο που απαιτείται για την ερυθροποίηση [7, 14, 15]. 4

20 Εικόνα 1: Η ερυθροποίηση κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης οντογένεσης. HB: αιμαγγειοβλάστης, ΗSC: αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα, BFU-E: Burst Forming Unit- Erythroid, CFU-E: Colony Forming Unit- Eryhtroid, ProE: προερυθροβλάστης, BasoE: βασεόφιλος ερυθροβλάστης, PolyE: πολυχρωματόφιλος ερυθροβλάστης, OrthoE: ορθοχρωματικός ερυθροβλάστης ή νορμοβλάστης, Retic: δικτυοερυθροκύτταρο, RBC: ερυθροκύτταρο (προσαρμογή από Palis, 2014; Palis 2008 [11, 16]) Η διαφοροποίηση των HSCs έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή δύο ειδών προγoνικών κυττάρων: τα κοινά μυελοειδή προγονικά κύτταρα (Common Myeloid Progenitors, CMPs) και τα κοινά λεμφοειδή προγονικά κύτταρα (Common Lymphoid Progenitors, CLPs). Τα CLPs διαφοροποιούνται σε Β-λεμφοκύτταρα, Τ- λεμφοκύτταρα, σε ΝΚ κύτταρα (Natural Killer cells) και λεμφοειδή δενδριτικά κύτταρα. Τα CMPs 5

21 διαφοροποιούνται σε δύο ειδών προγονικά κύτταρα: τα προγονικά κύτταρα των κοκκιοκυττάρων/μακροφάγων (Granulocytes/Macrophages Progenitors, GMPs), τα οποία διαφοροποιούνται περαιτέρω σε κοκκιοκύτταρα, μονοκύτταρα/μακροφάγα και μυελοειδή δενδριτικά κύτταρα και τα προγονονικά κύτταρα των μεγακαρυοκυττάρων/ερυθροκυττάρων (Megakaryocyte/Erythrocyte Progenitors, MEPs), τα οποία διαφοροποιούνται σε μεγακαρυοκύτταρα που καταλήγουν σε αιμοπετάλια και σε ερυθροκύτταρα (εικόνα 2) [7, 17-19]. Εικόνα 2: Διαφοροποίηση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (προσαρμογή από 6

22 2. Αιμοσφαιρίνη 2.1 Δομή και λειτουργία της ανθρώπινης αιμοσφαιρίνης Η αιμοσφαιρίνη αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη των ερυθροκυττάρων του αίματος των σπονδυλωτών. Κύρια λειτουργία της είναι η μεταφορά Ο 2 από τους πνεύμονες στους ιστούς. Επιπλέον, σε μικρότερο βαθμό, αλληλεπιδρά με τρία ακόμα αέρια, το CO 2, το CO και το NO τα οποία έχουν σημαντικές βιολογικές δράσεις. Η αιμοσφαιρίνη του ανθρώπου είναι ένα τετραμερές μόριο το οποίο αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες ανά δύο όμοιες μεταξύ τους. Πιο συγκεκριμένα, αποτελείται από δύο αλυσίδες σφαιρίνης τύπου-α (αλυσίδες ζ και α) και δύο αλυσίδες σφαρίνης τύπου-β (αλυσίδες ε, γ, δ και β). Κάθε μία από αυτές είναι ενωμένη με μια προσθετική ομάδα, την αίμη. Το μόριο της αίμης αποτελείται από ένα δακτύλιο πρωτοπορφυρίνης IX στο κέντρο του οποίου βρίσκεται ένα άτομο σιδήρου που είναι υπεύθυνο για την δέσμευση του Ο 2. Η πρωτοπορφυρίνη αποτελείται από 4 πυρρολικούς δακτυλίους κι είναι υπεύθυνη για το χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα της αιμοσφαιρίνης και κατά συνέπεια του αίματος (εικόνα 3) [20, 21]. Εικόνα 3: Δομή του μορίου της αιμοσφαιρίνης (προσαρμογή από 7

23 2.3 Τύποι αιμοσφαιρίνης κατά τη διάρκεια της οντογένεσης Κατά τη διάρκεια της οντογένεσης του ανθρώπου συναντάμε διαφορετικούς τύπους αιμοσφαιρίνης γεγονός που οφείλεται στην έκφραση διαφορετικών γονιδίων σφαιρίνης τύπου-α και σφαιρίνης τύπου-β από τα ερυθροειδικά κύτταρα (εικόνα 4). Η έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων μετατοπίζεται από το ένα όργανο στο άλλο καθώς η ερυθροποίηση πραγματοποιείται από το λεκιθικό σάκο, στο εμβρυϊκό ήπαρ κι από εκεί στο μυελό των οστών. Τις πρώτες εβδομάδες της κύησης, οι σφαιρίνες α-, ε- και ζ- παράγονται στο λεκιθικό σάκο που αποτελεί το πρώτο αιμοποιητικό όργανο. Μετά την 5 η εβδομάδα έως και την 20 η, η ερυθροποίηση πραγματοποιείται στο εμβρυϊκό ήπαρ όπου συντίθενται οι σφαιρίνες α και γ. Στη συνέχεια συμμετέχει ο σπλήνας και λίγο πριν την γέννηση ενεργοποιείται ο μυελός των οστών ο οποίος παραμένει το κύριο αιμοποιητικό όργανο σε όλη την υπόλοιπη ενήλικη ζωή, όπου παράγονται οι σφαιρίνες α, β και δ [21]. Στα πρώτα στάδια ανάπτυξης του εμβρύου παράγονται οι εμβρυονικές αιμοσφαιρίνες Hb Gower-1 (ζ 2 ε 2 ), Hb Gower-2 (α 2 ε 2 ) και Hb Portland (ζ 2 γ 2 ). Συγκεκριμένα, οι αιμοσφαιρίνες Hb Gower-1 και Hb Gower-2 κυριαρχούν τις πρώτες εβδομάδες της κύησης κι εξαφανίζονται μεταξύ της 6ης και της 8ης εβδομάδας όταν ξεκινά η σύνθεση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης HbF (α 2 γ 2 ) στο εμβρυϊκό ήπαρ. Από την 10 η εβδομάδα η HbF αποτελεί την κύρια αιμοσφαιρίνη με τα επίπεδα της να παραμένουν υψηλά σε όλη τη διάρκεια της κύησης και να παρουσιάζουν μια μικρή μείωση τις τελευταίες εβδομάδες. Αμέσως μετά τη γέννηση η ΗbF μειώνεται δραματικά για να φτάσει στο 1% της συνολικής αιμοσφαιρίνης 10 μήνες μετά. Από το στάδιο αυτό κι έπειτα παράγεται από συγκεκριμένο πληθυσμό κυττάρων, γνωστών ως F-κύτταρα, ο αριθμός των οποίων ποικίλει στα φυσιολογικά ενήλικα άτομα διαφορετικών πληθυσμών. Από την 6 η εβδομάδα της κύησης αρχίζει να ανιχνεύεται κι η αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων HbA (α 2 β 2 ) σε ποσοστό 5-10% της συνολικής αιμοσφαιρίνης. Μετά την 12 η εβδομάδα μετά τη γέννηση η HbA γίνεται η κύρια αιμοσφαιρίνη. Επίσης, στα ενήλικα άτομα απαντάται κι η αιμοσφαιρίνη HbA 2 (α 2 δ 2 ) σε ένα ποσοστό 2-3%, η οποία αρχίζει να συντίθεται λίγο πριν τη γέννηση [13, 20, 22]. 8

24 Οι διαφορετικοί τύποι αιμοσφαιρίνης ενός φυσιολογικού ατόμου διαφέρουν μεταξύ τους ως προς ορισμένες ιδιότητες οι οποίες τους παρέχουν συγκεκριμένα πλεονεκτήματα κατά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης. Για παράδειγμα, οι εμβρυονικές αιμοσφαιρίνες και η HbF διευκολύνουν τη μεταφορά Ο 2 μέσω του πλακούντα κατά τη διάρκεια της ενδομήτριας ζωής καθώς έχουν μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης του Ο 2 σε σχέση με την αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων HbA παρότι όλες έχουν παρόμοια δομή [23]. Εικόνα 4: Έκφραση των διαφορετικών σφαιρινικών γονιδίων κατά την οντογένεση του ανθρώπου (προσαρμογή από Martyn, 2017 [24]) 2.4 Δομή κι οργάνωση των γονιδίων των σφαιρινών Ο αριθμός και η σύνθεση των υπομονάδων των διαφορετικών αιμοσφαιρινών του ανθρώπου υποδηλώνει ότι υπάρχει τουλάχιστον ένα γονίδιο που κωδικοποιεί καθεμία από τις διαφορετικές σφαιρινικές αλυσίδες: α, β, γ, δ, ε, και ζ. Έτσι, η αλληλουχία των αμινοξέων καθεμίας από τις σφαιρινικές αλυσίδες κωδικοποιείται από το αντίστοιχο γονίδιο. Τα γονίδια όλων των σφαιρινών του ανθρώπου έχουν παρόμοια δομή. Αποτελούνται από 3 εξώνια και 2 ιντρόνια (ή αλλιώς παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες, Ιntervening Sequences, IVSs) με τις θέσεις δέσμευσης της αίμης αλλά και σύνδεσης των αλυσίδων α/β μεταξύ τους να κωδικοποιούνται στο εξώνιο 2. Στα γονίδια των 9

25 σφαιρινών τύπου-α τα ιντρόνια παρεμβάλλονται μεταξύ των κωδικονίων και ενώ στα γονίδια των σφαιρινών τύπου-β παρεμβάλλονται μεταξύ των κωδικονίων και Το πρώτο ιντρόνιο (IVS-I) είναι μικρότερο σε μέγεθος από το δεύτερο ιντρόνιο (IVS-II) τόσο στις σφαιρίνες τύπου-α όσο και στις σφαιρίνες τύπου-β. Εξαίρεση αποτελεί η ζ- σφαιρίνη η οποία παρεκλίνει από το πρώτυπο του μεγέθους των ιντρονίων της οικογένειας των σφαιρινών τύπου-α στην οποία ανήκει. Συγκεκριμένα, ενώ τα ιντρόνια των γονιδίων της α-σφαιρίνης και των ψευδογονιδίων ψα έχουν μικρό μέγεθος (<150bp) αυτά της ζ-σφαιρίνης και του ψευδογονιδίου ψζ είναι μεγαλύτερα. Επίσης το πρώτο ιντρόνιο των ζ και ψζ γονιδίων είναι πολύ μεγαλύτερο από το δεύτερο. Οι σφαιρινικές αλυσίδες τύπου-α έχουν μήκος 141 αμινοξέα ενώ οι σφαιρινικές αλυσίδες τύπου-β έχουν μήκος 146 αμινοξέα [25]. Στην περιοχή του υποκινητή κάθε γονιδίου υπάρχουν τρεις συντηρημένες αλληλουχίες στις οποίες προσδένονται μεταγραφικοί παράγοντες. Οι αλληλουχίες αυτές είναι οι εξής: «ΤΑΤΑ box», «CCAAT box» και «CACCC box» που βρίσκονται -30, -90 και -103 bp ανοδικά του cap site των γονιδίων αντίστοιχα. Τα γονίδια των σφαιρινών τύπου-α όπως και των σφαιρινών τύπου-β είναι οργανωμένα σε πολυγονιδιακά συμπλέγματα. Στον άνθρωπο, η διάταξη των γονιδίων στα συμπλέγματα αυτά είναι ανάλογη της σειράς έκφρασής τους, με τα γονίδια τα οποία εκφράζονται νωρίτερα κατά την οντογένεση να εντοπίζονται στο 5 άκρο του συμπλέγματος ενώ τα γονίδια που εκφράζονται τελευταία να εντοπίζονται στο 3 άκρο αυτού. Επιπλέον, εκτός από λειτουργικά γονίδια περιλαμβάνουν και ψευδογονίδια [26]. Στον άνθρωπο, το σύμπλεγμα των α-σφαιρινών εδράζεται στο χρωμόσωμα 16 στη θέση 16p13.3. Από το 5 προς το 3 άκρο αυτού συναντάμε με τη σειρά το γονίδιο HBZ (ζ) το οποίο κωδικοποιεί την εμβρυονική ζ-σφαιρίνη, τα ψευδογονίδια ΗΒΖΡ (ψζ), ΗΒΑΡ1 (ψα1) και ΗΒΑΡ2 (ψα2), τα γονίδια ΗΒΑ1 (α1) και ΗΒΑ2 (α2) τα οποία κωδικοποιούν την ίδια πρωτεΐνη, την α-σφαιρίνη, και το γονίδιο HBQ1 (θ) που κωδικοποιεί τη θ-αλυσίδα η λειτουργία της οποίας δεν είναι γνωστή. Παρότι τα γονίδια ΗΒΑ1 και ΗΒΑ2 έχουν 98,5% ομολογία μεταξύ τους, στο ενήλικο άτομο το γονίδιο ΗΒΑ2 μεταγράφεται εντονότερα σε σχέση με το ΗΒΑ1 έτσι που η αναλογία 10

26 του mrna στους τελικά διαφοροποιημένους ερυθροβλάστες να είναι α1:α2=1:2,6 [27-29]. Το σύμπλεγμα των β-σφαιρινών εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 11 και πιο συγκεκριμένα στη θέση 11p15.5. Από το 5 προς το 3 άκρο αυτού συναντάμε με τη σειρά το γονίδιο της ε-σφαιρίνης ΗΒΕ (ε), τα γονίδια της γ-σφαιρίνης HBG2 και ΗΒG1( G γ και Α γ αντίστοιχα), το ψευδογονίδιο της β-σφαιρίνης ΗΒΒΡ (ψβ), το γονίδιο της δ-σφαιρίνης ΗΒD (δ) και το γονίδιο της β-σφαιρίνης HBB (β). Τα γονίδια HBG1 και ΗΒG2 κωδικοποιούν την ίδια πρωτεΐνη με μόνη διαφορά την ύπαρξη γλυκίνης ή αλανίνης στη θέση 136 της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Επιπλέον, στο 5 άκρο κάθε συμπλέγματος υπάρχουν cis-ρυθμιστικές περιοχές και συγκεκριμένα η υπερευαίσθητη περιοχή HS40 στο σύμπλεγμα των α-σφαιρινών και η περιοχή ελέγχου του γενετικού τόπου (Locus Control Region, LCR) στο σύμπλεγμα των β-σφαιρινών [26]. Εικόνα 5: Δομή και οργάνωση των σφαιρινικών γονιδίων του ανθρώπου (προσαρμογή από και 11

27 2.5 Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος των β σφαιρινών κατά την οντογένεση Η έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών ρυθμίζεται αυστηρά στο χώρο και στο χρόνο, καθώς εκφράζονται μόνο στους ερυθροποιητικούς ιστούς (ιστοειδική έκφραση) και διαφορετικά γονίδια εκφράζονται σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης (αναπτυξιακά ειδική έκφραση). Στον άνθρωπο συμβαίνουν δύο γεγονότα μεταστροφής όσον αφορά το είδος της συντιθέμενης αιμοσφαιρίνης. Η πρώτη μεταστροφή συμβαίνει νωρίς κατά την ενδομήτριο ζωή καθώς η έκφραση της ζ- και ε-σφαιρίνης παύει και ξεκινά η σύνθεση της α- και της γ-σφαιρίνης οδηγώντας στην παραγωγή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης HbF. Η δεύτερη μεταστροφή περιλαμβάνει τη μετάβαση από την γ- στη β-σφαιρίνη, ξεκινά λίγες εβδομάδες πριν κι ολοκληρώνεται μετά τη γέννηση. Οδηγεί στη μείωση της έκφρασης της εμβρυϊκής HbF κι αύξηση της έκφρασης της ενήλικης αιμοσφαιρίνης HbA [30, 31]. Οι παραπάνω μεταστροφές συμπίπτουν με τις αλλαγές στις θέσεις και στο είδος ερυθροποίησης (κεφ 1.2 και 2.3). Όσον αφορά το σύμπλεγμα των β-σφαιρινών η μετάβαση από την έκφραση του γονιδίου ε στο γ και από το γ στο β βασίζεται αφενός μεν στον ανταγωνισμό μεταξύ των υποκινητών των γονιδίων του συμπλέγματος για την πρόσδεσή τους στην περιοχή LCR κι αφετέρου στην αυτόνομη αποσιώπηση των γονιδίων που εκφράζονται στο προηγούμενο αναπτυξιακό στάδιο. Στους παραπάνω μηχανισμούς σημαντικό ρόλο παίζει η διαμόρφωση της χρωματίνης καθώς και μια σειρά cis και trans ρυθμιστικά στοιχεία [32] Διαμόρφωση της χρωματίνης Η δομή της χρωματίνης παίζει σημαντικό ρόλο στην έκφραση των γονιδίων μέσω εναλλαγής μεταξύ της «μεταγραφικά ενεργής» και της «μεταγραφικά ανενεργής» διαμόρφωσης. Η μεταγραφικά ενεργή διαμόρφωση είναι ευαίσθητη στη δράση της DNase I και είναι υπερακετυλιωμένη ενώ η μεταγραφικά ανενεργή διαμόρφωση είναι ανθεκτική στη δράση της DNase I κι είναι υποακετυλιωμένη. Στα ερυθροειδικά κύτταρα, το σύμπλεγμα των β-σφαιρινών έχει υψηλή ευαισθησία στη DNase I γεγονός που υποδηλώνει ότι βρίσκεται σε μια μεταγραφικά πιο ενεργή κι επομένως προσβάσιμη διαμόρφωση της χρωματίνης. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο η 12

28 δομή της χρωματίνης ελέγχει την ενεργοποίηση και την καταστολή της μεταγραφής δεν είναι πλήρως κατανοητός. Πρωτεΐνες, οι οποίες προσδένονται κι ενεργοποιούν τη μεταγραφή, ίσως έχουν πρόσβαση στο DNA χωρίς να επηρεάζεται η δομή των νουκλεοσωμάτων ή ίσως χρειάζονται κι άλλες πρωτεΐνες, οι οποίες δρουν ως συμπαράγοντες, τροποποιώντας τη δομή του νουκλεοσώματος, καθιστώντας έτσι το DNA πιο εύκολα προσβάσιμο. Υπάρχουν αντικρουόμενα δεδομένα σχετικά με τη συμμετοχή της LCR στη δημιουργία της μεταγραφικά ενεργής διαμόρφωσης. Αυτό που είναι ευρέως αποδεκτό είναι ότι η LCR διατηρεί μια κατάσταση της χρωματίνης που είναι ευνοϊκή για την πρόσδεση επιπλέον παραγόντων που ενδεχομένως εμπλέκονται σε περαιτέρω άνοιγμα της χρωματίνης ή ενεργοποίηση της μεταγραφής [33, 34] Cis ρυθμιστικά στοιχεία Στα cis ρυθμιστικά στοιχεία τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην έκφραση των γονιδίων του συμπλέγματος των β-σφαιρινών περιλαμβάνονται: Οι υποκινητές των σφαιρινικών γονιδίων οι οποίοι φέρουν μοτίβα «TATA box», «CCAAT box» και «CACCC box» [35] που εντοπίζονται -30, -90 και -103 bp ανοδικά του cap site των γονιδίων αντίστοιχα. Οι ενισχυτές οι οποίοι ρυθμίζουν θετικά τη μεταγραφή ενός γονιδίου καθώς είναι αλληλουχίες DNA που αυξάνουν τη δράση των υποκινητών. Εντοπίζονται είτε στα άκρα του γονιδίου είτε εσωτερικά σε αυτό και δρουν ακόμα και σε μεγάλες αποστάσεις από τα γονίδια. Στο γονίδιο της β- σφαιρίνης έχουν περιγραφεί δύο ενισχυτές οι οποίοι εμπλέκονται στην ιστοειδική κι αναπτυξιακά ειδική έκφραση του γονιδίου. Επιπλέον, δράση ενισχυτή φαίνεται ότι έχουν κι οι υπερευαίσθητες θέσεις της LCR [36]. Οι αποσιωπητές στους οποίους προσδέονται πρωτεΐνες που αναστέλλουν τη δράση του υποκινητή κι επομένως εμποδίζουν την έκφραση των γονιδίων. Ένας αποσιωπητής έχει περιγραφεί στον υποκινητή του ε- γονιδίου κι ο οποίος ελέγχει την αυτόνομη καταστολή της έκφρασής του κατά το εμβρυϊκό και το ενήλικο στάδιο ανάπτυξης. Οι μονωτές οι οποίοι προστατεύουν από τις αρνητικές επιπτώσεις της γειτονικής ετεροχρωματίνης κι ίσως οριοθετούν μια μεταγραφικά ενεργή περιοχή της χρωματίνης [37]. 13

29 Τα στοιχεία MARs (Matrix Attachment Regions)/SARs (Scaffold Attachment Regions) τα οποία προωθούν την πρόσδεση στον πυρηνικό σκελετό με αποτέλεσμα το σχηματισμό βρόχων. Τα στοιχεία αυτά ενδεχομένως απομονώνουν το βρόχο από την γύρω χρωματίνη και τον προστατεύουν από την αναδιοργάνωση αυτής με αποτέλεσμα ο βρόχος να δύναται να αποτελέσει μια θέση έναρξης της μεταγραφής [38]. Η Περιοχή Ελέγχου του Γενετικού Τόπου η οποία αποτελεί μια σημαντική ρυθμιστική περιοχή μεταξύ 6 και 20kb ανοδικά του ε-γονιδίου στο σύμπλεγμα των β-σφαιρινών. Αποτελείται από 5 θέσεις που παρουσιάζουν υψηλή ευαισθησία στη DNase I κι ονομάζονται υπερευαίσθητες θέσεις (hypersensitive sites, HS) HS1 έως HS5 [34]. Οι ΗS θέσεις της LCR περιέχουν έναν εξελικτικά συντηρημένο πυρήνα μήκους bp που είναι υπεύθυνος για την ευαισθησία στην DNAase I κι ο οποίος πλαισιώνεται από αλληλουχίες που είναι παρόμοιες αλλά όχι ίδιες μεταξύ των ειδών. Ο πυρήνας φέρει θέσεις δέσμευσης ερυθροειδικών αλλά και γενικών μεταγραφικών παραγόντων. Οι θέσεις HS2 έως HS4 εμφανίζουν δράση ενισχυτή της γονιδιακής έκφρασης ενώ η θέση HS5 φαίνεται να έχει έναν πιο δομικό ρόλο δρώντας ως μονωτής που απομονώνει τμήματα του γονιδιώματος από την δομή της χρωματίνης γύρω από αυτά. Η δράση της HS1 θέσης δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί. Επίσης, υπάρχουν κι άλλες υπερευαίσθητες θέσεις ανοδικά (5 HS-111) και καθοδικά (3 HS1) των σφαιρινικών γονιδίων, εκτός της LCR, που κι αυτές φαίνεται να έχουν δομικό ρόλο ανάλογο αυτού της HS5 [34, 39, 40]. Στον άνθρωπο, η LCR ρυθμίζει θετικά την έκφραση ενός μόνο γονιδίου κάθε φορά, με τα γονίδια να ανταγωνίζονται μεταξύ τους για την ενεργοποίησή τους μέσω αυτής [40]. Τα τελευταία χρόνια έχουν περιγραφεί πολλά μοντέλα δράσης της LCR με το μοντέλο του βρόχου (looping model) να είναι το πιο αποδεκτό. Σύμφωνα με το μοντέλο του βρόχου μεταγραφικοί παράγοντες προσδένονται στις υπερευαίσθητες θέσεις της LCR και του υποκινητή του γονιδίου που ενεργοποιείται κάθε φορά. Η ενδιάμεση περιοχή του DNA αναδιπλώνεται με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός βρόχου ο οποίος επιτρέπει την άμεση επαφή μεταξύ των παραγόντων που είναι προσδεδεμένων στην LCR κι αυτών που είναι προσδεδεμένοι 14

30 στον υποκινητή σχηματίζοντας ένα ενεργό σύμπλοκο μεταγραφής στον υποκινητή του γονιδίου. Η LCR αρχικά αλληλεπιδρά με τα γονίδια που βρίσκονται πιο κοντά της αλλά καθώς η ανάπτυξη προχωρά αλληλεπιδρά και με τα πιο απομακρυσμένα γονίδια κάτι που σε μεγάλο βαθμό εξαρτάται από τους μεταγραφικούς παράγοντες που είναι διαθέσιμοι (εικόνα 6) [33, 39]. Εικόνα 6: Αναπαράσταση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της LCR και των γονιδίων του συμπλέγματος των β-σφαιρινών στα ερυθροειδικά κύτταρα. Η LCR μαζί με δύο ακόμα υπερευαίσθητες θέσεις ανοδικά και καθοδικά των γονιδίων σχηματίζουν το ενεργό κέντρο χρωματίνης ACH (κίτρινη σφαίρα στην εικόνα) με το οποίο αλληλεπιδρούν τα σφαιρινικά γονίδια (πηγή Patrinos et al, 2004 [41]) Trans μεταγραφικοί παράγοντες Υπάρχουν πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες που εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος των β-σφαιρινών. Οι παράγοντες αυτοί σχηματίζουν ένα περίπλοκο δίκτυο αλληλεπιδράσεων με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες, με τους υποκινητές των σφαιρινικών γονιδίων, τις θέσεις HS της LCR και cis διαγονιδιακά ρυθμιστικά στοιχεία (εικόνα 7). Υπάρχουν ειδικοί αλλά και γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες. Ορισμένοι ερυθροειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες είναι στόχοι των ακετυλοτρανσφερασών των ιστονών κι ορισμένοι υπάρχουν ως φωσφοπρωτεΐνες γεγονός που υποδηλώνει ότι η δράση τους ρυθμίζεται από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις κι ότι ενδεχομένως εμπλέκονται στην 15

31 αναδιοργάνωση της χρωματίνης του β-συμπλέγματος. Μεταξύ αυτών των παραγόντων περιλαμβάνονται οι εξής: NF-E2 (Nuclear Factor Erythroid 2) Ο παράγοντας αυτός απαντάται σε ρυθμιστικές περιοχές των γονιδίων των σφαιρινών. Αποτελεί βασικό παράγοντα για την ανάπτυξη των μεγακαρυοκυττάρων και την παραγωγή των αιμοπεταλίων. In vitro αναλύσεις έχουν δείξει ότι οι θέσεις δέσμευσης του NF-E2 είναι σημαντικές για την αναδιαμόρφωση της δομής της χρωματίνης κι απαραίτητες για την έκφραση της ε-σφαιρίνης καθώς επίσης και για το σχηματισμό της 5' HS2 της LCR. Ωστόσο πρόκειται για ένα γενικό παράγοντα η δράση του οποίου ελέγχεται από ποικίλα σηματοδοτικά μονοπάτια [42, 43]. GATA-1 Ο GATA-1 είναι ένας ερυθροειδικός μεταγραφικός παράγοντας απαραίτητος για τη μεταστροφή της έκφρασης των σφαιρινικών γονιδίων και την ωρίμανση των ερυθρoκυττάρων. Ανήκει στην οικογένεια των GATA μεταγραφικών παραγόντων τα μέλη της οποίας φέρουν ένα δαχτύλιο ψευδαργύρου και προσδένονται στην νουκλεοτιδική αλληλουχία WGATAR. Θέσεις πρόσδεσης του GATA-1 εντοπίζονται στους υποκινητές των γονιδίων των σφαιρινών και στις θέσεις HS1-HS5 της LCR. Μπορεί να ενεργοποιήσει αλλά και να καταστείλει τη γονιδιακή έκφραση ανάλογα με τη θέση πρόσδεσής του και τις πρωτεΐνες με τις οποίες αλληλεπιδρά. Όταν προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου της ε-σφαιρίνης επάγει την έκφρασή του αλλά όταν προσδένεται στον αποσιωπητή του παρουσία του γενικού μεταγραφικού παράγοντα ΥΥ1 την καταστέλλει. Επίσης, ο GATA-1 προσδένεται ανοδικά του υποκινητή των γονιδίων HBG1 και HBG2 και μέσω του FOG-1 ενεργοποιεί το κατασταλτικό σύμπλοκο NuRD. Επιπλέον, εμπλέκεται σε ένα πολύπλοκο δίκτυο αλληλεπιδράσεων με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες όπως ο SP-1 και o EKLF (KLF1). Τέλος, έχει βρεθεί ότι αυξάνει την ακετυλίωση των ιστονών στην LCR και στους υποκινητές των γονιδίων, συμμετέχει στην στρατολόγηση της RNA πολυμεράσης II προς την LCR και τους υποκινητές και μαζί με τον παράγοντα FOG (Friend Of GATA) μεσολαβεί στην αλληλεπίδραση μεταξύ της LCR και του γονιδίου της β-σφαιρίνης. Χωρίς τους παράγοντες GATA1 και EKLF δεν υπάρχει αιμοποίηση [44, 45]. 16

32 EKLF (Krüppel like Factor) Ο παράγοντας EKLF ή αλλιώς KLF1 ρυθμίζει τη μεταστροφή από την γ- στη β- σφαιρίνη μέσω πολλών μηχανισμών. O παράγοντας αυτός έχει βρεθεί ότι διευκολύνει το σχηματισμό ενός ενεργού κέντρου χρωματίνης (Active Chromatin Hub, ACH) στο συμπλέγμα των β-σφαιρινών. Πιο συγκεκριμένα, o KLF1 συμβάλλει ώστε το γονίδιο της β-σφαιρίνης να αντικαταστήσει το γονίδιο της γ-σφαιρίνης στο ACH με ένα τρόπο εξαρτώμενο από το αναπτυξιακό στάδιο. Δεύτερον, επάγει άμεσα γονίδια τα οποία καταστέλλουν την έκφραση του γονιδίου της γ-σφαιρίνης όπως το γονίδιο BCL11A. Τέλος, παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων του κυτταρικού κύκλου. Οποιαδήποτε αλλαγή μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχές του κυτταρικού κύκλου κι «ερυθροποιητικό στρες» μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την έμμεση αύξηση της έκφρασης της HbF [46]. Έχουν βρεθεί κι άλλα μέλη της οικογένειας των krüppel like factors, όπως τα KLF3 και KLF8, τα οποία ενεργοποιούνται από τον KLF1 και συμμετέχουν στην αποσιώπηση του εμβρυϊκού σφαιρινικού γονιδίου [47]. FKLF και FKLF2 (Fetal Krüppel like factors) O παράγοντας FKLF ενεργοποιεί τη μεταγραφή του γ-γονιδίου μέσω του στοιχείου «CAACCC» στον υποκινητή αυτού. Επίσης, ενεργοποιεί τη μεταγραφή του β-γονιδίου αλλά σε μικρότερο βαθμό σε σχέση με το EKLF. Το FKLF2 εκτός από το γ-γονίδιο επάγει την έκφραση κι άλλων γονιδίων των ερυθροειδικών κυττάρων γεγονός που υποδηλώνει ότι ενδεχομένως παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση αυτών [48]. DRED, COUP-TFII, SSP και γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες Το σύμπλοκο DRED (direct repeat erythroid-definitive) καταστέλλει την έκφραση του ε-γονιδίου. Εμποδίζει την πρόσδεση του EKLF στον υποκινητή του ε- σφαιρινικού γονιδίου και έτσι αποσιωπείται η έκφραση αυτού κατά την οριστική ερυθροποίηση. O παράγοντας COUP-TFII ή NF-E3 είναι ένας υποδοχέας ο οποίος έχει ιδιότητες τόσο επαγωγέα όσο και καταστολέα κι εμπλέκεται στη μεταστροφή των γονιδίων του β-συμπλέγματος, καταστέλλοντας την έκφραση του ε-γονιδίου στα εμβρυϊκά ερυθροκύτταρα. H πρωτεΐνη SSP (stage selector protein) ενισχύει την αλληλεπίδραση 17

33 των υποκινητών των σφαιρινικών γονιδίων με την LCR. Θέσεις πρόσδεσης της SSP έχουν βρεθεί στον υποκινητή και την 5 UTR του γ-γονιδίου [49]. Επιπλέον, γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες όπως οι Sp1, YY1 και USF δρουν σε συνεργασία με ερυθροειδικούς μεταγραφικούς παράγοντες προκειμένου να ενεργοποιήσουν ή να καταστείλουν την έκφραση των γονιδίων του β-συμπλέγματος. Σύμφωνα με ένα πρόσφατο μοντέλο που έχει προταθεί για την αποσιώπηση του εμβρυονικού και του εμβρυϊκού σφαιρινικού γονιδίου, τα γονίδια ε και γ καταστέλλονται αυτόνομα στα ερυθροκύτταρα του ενήλικου σταδίου ανάπτυξης. Οι υποδοχείς ΤR2/TR4 καταστέλλουν την έκφραση των γονιδίων αυτών άμεσα μέσω πρόσδεσης στα στοιχεία DR. O παράγοντας ΜΥΒ καταστέλλει έμμεσα την έκφρασή τους μέσω ενεργοποίησης των ΤR2/TR4 και του EKLF/KLF1. To γονίδιο KLF1 ενεργοποιεί την έκφραση του BCL11A, το οποίο με τη σειρά του καταστέλλει την έκφραση της εμβρυονικής ε- και της εμβρυϊκής γ- σφαιρίνης, σε συνεργασία με τους παράγοντες SOX6 και KLF3/8. O GATA-1 καταστέλλει άμεσα την έκφρασης της γ- σφαιρίνης κι επίσης συμμετέχει στην μεσολαβούμενη από το BCL11A καταστολή [47]. Εικόνα 7: Μεταγραφικοί παράγοντες που εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος των β-σφαιρινών (προσαρμογή από [47, 50]) 18

34 2.5.4 Επιγενετικοί μηχανισμοί ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών Εκτός από όλα τα παραπάνω στοιχεία, όλο και περισσότερη βάση δίνεται στο ρόλο των επιγενετικών μηχανισμών στη ρύθμιση των γονιδίων του συμπλέγματος των β- σφαιρινών. Η μεθυλίωση του DNA κι οι τροποποιήσεις των ιστονών (ακετυλίωση, μεθυλίωση, φωσφορυλίωση) φαίνεται να αποτελούν σημαντικούς «βοηθητικούς» μηχανισμούς. Συνήθως, οι επιγενετικές τροποποιήσεις αποτελούν σήμα αναγνώρισης για άλλες πρωτεΐνες ή πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Τα ένζυμα DNMTs (DNA methyltransferases), HDACs (Histone deacetylases) και LSD1 (lysine-specific histone demethylase 1) έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται στην αποσιώπηση των εμβρυονικών και των εμβρυϊκών σφαιρινικών γονιδίων μέσω του BCL11A και των υποδοχέων TR2/TR4. Τέλος, μια νέα ομάδα ρυθμιστικών μορίων αποτελούν τα micrornas. Πρόκειται για μια ομάδα μη κωδικών μορίων RNA με μήκος περίπου 22 νουκλεοτίδια τα οποία ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων τους μετα-μεταγραφικά. Επίσης, παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναδιοργάνωση της χρωματίνης, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση. Αυτά τα μονόκλωνα μόρια RNA σχηματίζουν ένα σύμπλοκο αποσιώπησης (mirisc) με άλλες πρωτεΐνες, το οποίο προσδένεται στην 3 αμετάφραστη περιοχή (3 UTR) του mrna-στόχου εμποδίζοντας έτσι την μετάφρασή του στο κυτταρόπλασμα (εικόνα 8) [51]. Εικόνα 8: mirnas που εμπλέκονται στην έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών (πηγή Saki et al, 2016 [51]) 19

35 3. Αιμοσφαιρινοπάθειες Οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι μια ετερογενής ομάδα κληρονομικών διαταραχών που προκύπτουν από μεταλλάξεις στα γονίδια των σφαιρινών. Στην πλειοψηφία τους, οι διαταραχές αυτές κληρονομούνται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο και διακρίνονται σε δύο ομάδες: α) τις διαταραχές που οδηγούν σε μειωμένη σύνθεση των τύπου-α ή τύπου-β σφαιρινικών αλυσίδων που συνιστούν το τετραμερές μόριο της αιμοσφαιρίνης (ποσοτικές διαταραχές) και β) τις διαταραχές που προκαλούν αλλαγές στη δομή της παραγόμενης πρωτεΐνης αλλάζοντας και τη λειτουργία της (ποιοτικές διαταραχές). Με το 7% του παγκόσμιου πληθυσμού να είναι φορείς, οι αιμοσφαιρινοπάθειες συγκαταλέγονται μεταξύ των πιο κοινών μονογονιδιακών ασθενειών κι αποτελούν ένα από τα πιο σημαντικά προβλήματα υγείας παγκοσμίως. Αρχικά, εντοπίζονταν στην περιοχή της Μεσογείου, στην Ασία και στην Αφρική [52]. Ωστόσο, τα κύματα μετανάστευσης είχαν σαν αποτέλεσμα την εξάπλωσή τους σε ολόκληρο τον κόσμο με τη συχνότητα τους να ποικίλει από περιοχή σε περιοχή [53, 54]. Από κλινικής άποψης, οι πιο σημαντικές είναι η δρεπανοκυτταρική αναιμία και η β-θαλασσαιμία. Περίπου το 1-2% του παγκόσμιου πληθυσμού είναι ετερόζυγοι για τη δρεπανοκυτταρική αναιμία και το 3% ετερόζυγοι για τη β-θαλασσαιμία [55]. Οι φορείς τόσο της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας όσο και της β-θαλασσαμίας και γενικότερα των αιμοσφαιρινοπαθειών είναι σχετικά προστατευμένοι έναντι της ελονοσίας ή αλλιώς μαλάριας που οφείλεται σε μόλυνση από το πρωτόζωο Plasmodium falciparum. Έτσι, λόγω της εξελικτικής πίεσης, σε περιοχές που η ελονοσία είναι ενδημική, τα γονίδια των αιμοσφαιρινοπαθειών απαντώνται σε εξαιρετικά υψηλές συχνότητες. Ωστόσο, τα κύματα μετανάστευσης αλλά κι οι γάμοι μεταξύ των διαφορετικών πληθυσμών οδήγησαν στη μεταφορά των γονιδίων αυτών και σε άλλες περιοχές αλλά και πληθυσμούς όπως οι πληθυσμοί των χωρών της Αμερικής αλλά και της Ευρώπης [56-58]. 3.1 Δρεπανοκυτταρική Αναιμία Οι ποιοτικές αιμοσφαιρινοπάθειες γενικά προκαλούνται από απλές αντικαταστάσεις και μικρές ελλείψεις ή ενθέσεις βάσεων που επηρεάζουν τις κωδικές περιοχές των γονιδίων, με αποτέλεσμα το σχηματισμό παραλλαγών του μορίου της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης. Οι παραλλαγές αυτές διαφέρουν από το φυσιολογικό 20

36 μόριο ως προς την αμινοξική αλληλουχία των α- ή των β- αλυσίδων τους. Οι πιο συχνές παραλλαγές της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης που οδηγούν σε παθολογικές καταστάσεις είναι η αιμοσφαιρίνη S (HbS), η αιμοσφαιρίνη C (HbC) και η αιμοσφαιρίνη E (HbE) [59]. Η δρεπανοκυτταρική αναιμία (Sickle Cell Disease, SCD) είναι μια ποιοτική αιμοσφαιρινοπάθεια η οποία προκύπτει από μια δομική αλλαγή της αλληλουχίας των αμινοξέων της β-σφαιρνικής αλυσίδας εξαιτίας μιας σημειακής μετάλλαξης. Η μετάλλαξη αυτή προκαλεί την αλλαγή μιας βάσης από αδενίνη σε θυμίνη στο 17 ο νουκλεοτίδιο της β-σφαιρινικής αλυσίδας (GAG GTG) και μεταφράζεται σε αντικατάσταση του γλουταμινικού οξέος από βαλίνη στο 6 ο αμινοξύ αυτής. Η τροποποιημένη αλυσίδα που συντίθεται ονομάζεται β s και η αιμοσφαιρίνη που προκύπτει HbS [60]. Η αιμοσφαιρίνη HbS περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1949 από τον Linus Pauling και τους συνεργάτες του ως ο τύπος της αιμοσφαιρίνης που εντοπίζεται στα ερυθροκύτταρα των ατόμων που πάσχουν από δρεπανοκυτταρική αναιμία. Όπως παρατήρησαν η HbS έχει διαφορετική κινητικότητα κατά την ηλεκτροφόρηση σε σχέση με αυτή των φυσιολογικών ατόμων. Η δρεπανοκυτταρική αναιμία απαντάται σε υψηλή συχνότητα στην Κεντρική Αφρική, κατά μήκος της νότιας ακτής της Αραβικής χερσονήσου, στην Kεντρική και στις παράκτιες περιοχές της Ινδίας, στη Nοτιοανατολική Ασία καθώς και σε πληθυσμούς με καταγωγή από τη Μεσόγειο. Όσο αφορά τη συχνότητα με την οποία εμφανίζεται μεταξύ των διαφορετικών περιοχών της Ελλάδας παρουσιάζει μεγάλη ετερογένεια. Υψηλή συχνότητα ετεροζυγωτών απαντάται στη Βοιωτία, στη Χαλκιδική (15%-20%) αλλά και στην Άρτα, την Καρδίτσα και τη Δυτική Πελοπόννησο [61] Παθοφυσιολογία της νόσου Στην αιμοσφαιρίνη HbS το πολικό, υδρόφιλο κι αρνητικά φορτισμένο γλουταμινικό οξύ αντικαθίσταται από τη λιγότερο πολική, υδρόφοβη και με ουδέτερο φορτίο βαλίνη γεγονός που καθιστά το μόριο της αιμοσφαιρίνης αδιάλυτο σε συνθήκες έλλειψης οξυγόνου. Τα μόρια της HbS αναπτύσσουν μεταξύ τους υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με αποτέλεσμα την καθίζησή τους και το σχηματισμό 21

37 πολυμερών στο εσωτερικό των ερυθροκυττάρων. Τα πολυμερή αυτά δίνουν στα ερυθροκύτταρα το χαρακτηριστικό δρεπανοειδές σχήμα τους. Τα ερυθροκύτταρα τα οποία περιέχουν τη φυσιολογική αιμοσφαιρίνη HbA έχουν σχήμα αμφίκοιλου δίσκου που τους επιτρέπει να είναι ευέλικτα και να κινούνται μέσω μεγάλων αλλά και μικρότερων αιμοφόρων αγγείων μεταφέροντας οξυγόνο στους ιστούς. Αντίθετα, τα δρεπανοκύτταρα είναι άκαμπτα και «κολλούν» στα τοιχώματα των αιμοφόρων αγγείων προκαλώντας απόφραξη που επιβραδύνει ή μειώνει τη ροή του αίματος με αποτέλεσμα το οξυγόνο να μη μπορεί να φτάσει στους παρακείμενους ιστούς (εικόνα 9) [62, 63]. Εικόνα 9: Δρεπανοκύτταρο και φυσιολογικό ερυθροκύτταρο (προσαρμογή από Σε συνθήκες παροχής οξυγόνου τα ερυθροκύτταρα επανέρχονται στην κανονική της μορφή αν και χάνουν την πλαστικότητά τους όταν το φαινόμενο επαναληφθεί αρκετές φορές. Ο φαινότυπος της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας προκύπτει είτε από ομοζυγωτία για την παραπάνω μετάλλαξη είτε από σύνθετη ή διπλή ετεροζυγωτία δηλαδή περιπτώσεις όπου μεταλλάξεις εντοπίζονται και στα δύο αλληλόμορφα αλλά είναι διαφορετικές (συνδυασμός του γονιδίου της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας με γονίδια άλλων αιμοσφαιρινοπαθειών π.χ. HbS/HbC, HbS/HbE, HbS/HbD, HbS/βthal). Όλες οι παραπάνω καταστάσεις ονομάζονται δρεπανοκυτταρικά σύνδρομα. Η δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι η πιο επικίνδυνη από όλες τις αιμοσφαιρινοπάθειες. Οι συνέπειες της δρεπάνωσης είναι οι εξής: αλλαγές στη 22

38 μεμβράνη των κυττάρων που οδηγούν σε απώλεια καλίου κι αφυδάτωση των κυττάρων, αλληλεπίδραση της αιμοσφαιρίνης με το ενδοθήλιο των αγγείων, τα ουδετερόφιλα και τα μονοκύτταρα, αιμόλυση, εξάντληση του NO, απελευθέρωση φλεγμονωδών πρωτεϊνών κι ενεργοποίηση της διαδικασίας πήξης. Όλες αυτές οι διεργασίες οδηγούν σε αιμολυτική αναιμία, μια φλεγμονώδη κατάσταση, επίπονες κρίσεις απόφραξης των αγγείων και βλάβη πολλών οργάνων με αποτέλεσμα να μειώνεται το προσδόκιμο ζωής των ασθενών [63] Κλινικά συμπτώματα Τα πρώτα συμπτώματα εμφανίζονται πριν την ηλικία του ενός έτους με χρόνια αιμολυτική αναιμία κι αναπτυξιακές διαταραχές. Το κύριο πρόβλημα των ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι οι αγγειοαποφρακτικές κρίσεις. Πρόκειται για επώδυνες κρίσεις οι οποίες μπορεί να συμβούν χωρίς προειδοποίηση όταν τα δρεπανοκύτταρα εμποδίζουν τη ροή του αίματος και μειώνουν τη μεταφορά οξυγόνου. Ορισμένες κρίσεις μπορεί να είναι πιο επώδυνες κι από τον τοκετό. Ο πόνος μπορεί να εμφανιστεί σε οποιοδήποτε σημείο του σώματος ανάλογα με το σημείο της απόφραξης αλλά και σε περισσότερα από ένα σημεία τη φορά. Πιο συχνά εμφανίζεται στο κάτω μέρος της πλάτης, στα άκρα, στην κοιλιακή χώρα, στο στήθος και στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Μια αγγειοαποφρακτική κρίση μπορεί να προέλθει λόγω μιας ασθένειας, λόγω απότομης μεταβολής της θερμοκρασίας, σε καταστάσεις άγχους, αφυδάτωσης, μεγάλου υψομέτρου. Συχνά, το άτομο δε γνωρίζει τι προκαλεί την κρίση η οποία μπορεί να διαρκέσει από λίγες ώρες μέχρι αρκετές μέρες. Οι αγγειοαποφρακτικές κρίσεις ευθύνονται για το Οξύ Θωρακικό Σύνδρομο (Acute Chest Syndrome) καθώς και για τα αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια που πλήττουν τους πάσχοντες. Το Οξύ Θωρακικό Σύνδρομο συνήθως εμφανίζεται λίγες μέρες μετά από μια αγγειοαποφρακτική κρίση και ενδεχομένως να συνοδεύεται από μια λοίμωξη [64]. Οι ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι ευαίσθητοι σε βακτηριακές λοιμώξεις, από λοιμογόνους παράγοντες όπως οι Pneumococcus, Hemophilus influenza type B, Meningococcus, Salmonella, Staphylococcus, Chlamydia, Mycoplasma pneumoniae, οι οποίες μπορεί να οδηγήσουν σε σηψαιμία, πνευμονία, μηνιγγήτιδα, οστεομυελίτιδα και τελικά σε θάνατο του ασθενούς. Τέλος, οι επανειλημμένες αποφράξεις της κυκλοφορίας λόγω της δρεπάνωσης έχουν ως 23

39 αποτέλεσμα χρόνιες επιπλοκές που σχετίζονται με τον αμφιβληστροειδή, την καρδιά, το σπλήνα και τους νεφρούς. Για τους άντρες ο πριαπισμός είναι μια ακόμα σημαντική επιπλοκή η οποία τις περισσότερες φορές αντιμετωπίζεται με χειρουργική επέμβαση [60]. Τα μόνιμα μετασχηματισμένα δρεπανοκύτταρα απομακρύνονται από την κυκλοφορία του αίματος πολύ πριν τις 120 μέρες που αποτελούν τη διάρκεια ζωής των φυσιολογικών ερυθροκυττάρων οδηγώντας σε χρόνια αιμολυτική αναιμία. Τα κλινικά συμπτώματα εμφανίζονται σε ασθενείς ομόζυγους για τη μετάλλαξη ενώ οι ετεροζυγώτες είναι ασυμπτωματικοί [64]. 3.2 β Θαλασσαιμία Οι ποσοτικές διαταραχές της σύνθεσης των σφαιρινικών αλυσίδων ονομάζονται «θαλασσαιμίες». Ανάλογα με τη σφαιρινική αλυσίδα της οποίας η σύνθεση επηρεάζεται διακρίνονται σε διαφορετικούς τύπους: α-θαλασσαιμία, β-θαλασσαιμία, δ-θαλασσαιμία, δβ-θαλασσαιμία κ.α. Οι πιο συχνές είναι η α- κι η β-θαλασσαιμία. Η ονομασία θαλασσαιμία οφείλεται στο ότι η πρώτη ολοκληρωμένη περιγραφή της νόσου αφορούσε την περιοχή της Μεσογείου [65] Μεταλλάξεις στο γονίδιο της β σφαιρίνης Η β-θαλασσαιμία παρουσιάζει μεγάλη ετερογένεια σε μοριακό επίπεδο. Πάνω από 300 μεταλλάξεις έχουν περιγραφεί στο γονίδιο της β-σφαιρίνης που οδηγούν είτε σε μειωμένη είτε σε πλήρη έλλειψη σύνθεσης της β-σφαιρινικής αλυσίδας. Οι μεταλλάξεις οι οποίες προκαλούν μείωση της σύνθεσης της β-αλυσίδας είναι γνωστές ως β + ενώ αυτές που καταργούν ολοκληρωτικά τη σύνθεση της β-αλυσίδας είναι γνωστές ως β 0 [66, 67]. Οι σημειακές μεταλλάξεις διακρίνονται σε 3 κατηγορίες: α) μεταλλάξεις οι οποίες επηρεάζουν τη μεταγραφή του γονιδίου της β-σφαιρίνης (μεταλλάξεις στον υποκινητή και στην 5 UTR του γονιδίου), β) μεταλλάξεις οι οποίες επηρεάζεουν την ωρίμανση του mrna (μεταλλάξεις που εντοπίζονται στο σημείο συραφής ιντρονίουεξωνίου, στην πολύ-α ουρά και στην 3 UTR) και γ) μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη μετάφραση του mrna σε πρωτεΐνη (μεταλλάξεις μη νοηματικές, μεταλλάξεις μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης, μεταλλάξεις που επηρεάζουν το κωδικόνια 24

40 έναρξης της μετάφρασης). Επιπλέον, υπάρχουν και σιωπηλές μεταλλάξεις δηλαδή πολύ ήπιες μεταλλάξεις που δεν επηρεάζουν την κλινική εικόνα του ατόμου (φυσιολογικοί RBC δείκτες και φυσιολογική τιμή HbA 2 ) [68-71] Λιγότερο συχνές είναι οι περιπτώσεις β-θαλασσαιμίας που οφείλονται σε ελλείψεις στο γονίδιο της β-σφαιρίνης. Ωστόσο, εκτός από το γονίδιο της β- σφαιρίνης, οι μεγάλου μήκους ελλείψεις μπορούν συγχρόνως να επηρεάσουν την έκφραση κι άλλων γονιδίων του β-συμπλέγματος ή της LCR προκαλώντας πιο σύνθετες μορφές θαλασσαιμίας (δβ 0 -, Α γδβ 0 -, εγδβ 0 -θαλασσαιμία) [72]. Σε σπάνιες περιπτώσεις, υπάρχουν άτομα που φέρουν μεταλλάξεις σε ρυθμιστικές περιοχές του συμπλέγματος των β-σφαιρινών οι οποίες αναστέλλουν τη μεταστροφή από τη γ- στη β-σφαιρίνη καταλήγοντας σε αυξημένα επίπεδα HbF (>1%) καθ όλη τη διάρκεια ζωής τους χωρίς να έχουν αρνητικές επιπτώσεις. Πρόκειται για το σύνδρομο κληρονομικής παραμονής της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης HbF (Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin, HPFH). Το σύνδρομο HPFH προέρχεται κυρίως από μεγάλες ελλείψεις του β-γονιδιακού τόπου στην 3 περιοχή των γονιδίων HBG1/HBG2 (deletional HPFH) και δευτερευόντως από σημειακές μεταλλάξεις και μικρές ελλείψεις/ενθέσεις εντός της περιοχής του υποκινητή του γονιδίου της γ-σφαιρίνης (non deletional HPFH) (εικόνα 10). Οι σημειακές μεταλλάξεις εντοπίζονται σε 3 διαφορετικές θέσεις εντός του υποκινητή (-200, -175 και -115). Επίσης, άτομα με HPFH παρουσιάζουν μια έλλειψη 13bp στη θέση -114 με Οι παραπάνω ελλείψεις και σημειακές μεταλλάξεις σχετίζονται με διαφορετικά επίπεδα αύξησης της HbF και πιστεύεται ότι διαταράσσουν τη δέσμευση ενός καταστολέα της μεταγραφής κοντά στη στιγμή της γέννησης. Είναι ενδιαφέρον ότι ο υποκινητής του γονιδίου της γ-σφαιρίνης φέρει δύο «CCAAT box» με τις μεταλλάξεις του συνδρόμου να εντοπίζονται εντός του άπω «CCAAT box» [24, 71]. 25

41 Εικόνα 10: Σημειακές μεταλλάξεις κι έκταση των ελλείψεων στις θαλασσαιμίες και στο σύνδρομο HPFH. Το x αναπαριστά τις σημειακές μεταλλάξεις κι η διακεκομμένη γραμμή την έλλειψη (προσαρμογή από Επιπλέον, ορισμένες σπάνιες μεταλλάξεις οδηγούν σε εξαιρετικά ασταθείς παραλλαγές της β-σφαιρίνης οι οποίες καθιζάνουν στα πρόδρομα ερυθροειδικά κύτταρα προκαλώντας μη αποδοτική ερυθροποίηση. Ετεροζυγώτες γι αυτές τις μεταλάξεις εμφανίζουν τον κλινικό φαινότυτο της β-θαλασσαιμίας και γι αυτό οι καταστάσεις αυτές είναι γνωστές ως επικρατής β-θαλασσαμία. Τέλος, υπάρχουν και μεταλλάξεις εκτός του χρωμοσώματος 11 που σχετίζονται με μεταγραφικούς παράγοντες (π.χ.gata-1) οι οποίοι εμπλέκονται στην έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων. Η θέση των μεταλλάξεων εντός των διαφορετικών περιοχών του γονιδίου είναι ο πρωταρχικός παράγοντας που καθορίζει τη βαρύτητα του φαινοτύπου των ασθενών (β ++, β +, β 0 ) (εικόνα 11) [73]. 26

42 Εικόνα 11: Είδη και θέσεις μεταλλάξεων στο γονίδιο της β-σφαρίνης (προσαρμογή από Origa, 2017 [73]. Στην Ελλάδα η πιο συχνή μετάλλαξη είναι η IVS-I-110 κι ακολουθούν οι Cd-39, IVS-I-1, IVS-I-6, IVS-II-745, Cd-6, IVS-ΙΙ-1, Cd-5, IVS-1-6 και 44 bp del (εικόνα 12) [74]. Εικόνα 12: Κατανομή των μεταλλάξεων της β-θαλασσαιμίας (πηγή Cao and Kan, 2013 [75]) 27

43 3.2.2 Παθοφυσιολογία της νόσου Στη β-θαλασσαιμία η πλήρης έλλειψη ή η μειωμένη σύνθεση της β-αλυσίδας κατά την ερυθροποίηση έχει ως αποτέλεσμα τη μειωμένη σύνθεση λειτουργικής αιμοσφαιρίνης η οποία οδηγεί σε υποχρωμία (μείωση της αιμοσφαιρίνης που περιέχεται στα ερυθροκύτταρα) και μικροκυττάρωση (μείωση του όγκου των ερυθροκυττάρων). Επίσης, οι ελεύθερες α-αλυσίδες, οι οποίες δε βρίσκουν β- αλυσίδες προκειμένου να σχηματίσουν τετραμερή συσσωρεύονται εντός των ερυθροειδικών κυττάρων. Στην ετερόζυγη κατάσταση η περίσσεια των α-αλυσίδων είναι μικρή κι απομακρύνονται με πρωτεόλυση. Όταν όμως και τα δύο αλληλόμορφα του γονίδιου της β-σφαιρίνης φέρουν μια μετάλλαξη (είτε ομόζυγη κατάσταση είτε διπλή ετεροζυγωτία) τότε η περίσσεια των α-αλυσίδων είναι τεράστια και δε μπορούν να απομακρυνθούν με πρωτεόλυση. Συσσωμάτωση, μετουσίωση κι αποικοδόμηση αυτών οδηγεί στο σχηματισμό αδιάλυτων ιζημάτων καθώς και αιμοχρωμάτων (οξειδωμένη μορφή της αιμοσφαιρίνης) που καταστρέφουν τη μεμβράνη των κυττάρων. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα το θάνατο των πρόδρομων ερυθροειδικών κυττάρων στο μυελό των οστών (μη αποδοτική ερυθροποίηση), το θάνατο των ώριμων ερυθροκυττάρων στην κυκλοφορία του αίματος (αιμόλυση) και τη δέσμευση ανοσοσφαιρινών και συστατικών του συμπληρώματος στη μεμβράνη των ερυθροκυττάρων ενεργοποιώντας την καταστροφή αυτών στο σπλήνα. Η προκύπτουσα αναιμία οδηγεί σε μειωμένη οξυγόνωση των ιστών, αύξηση των επιπέδων της ερυθροποιητίνης και περαιτέρω διέργεση του μυελού των οστών. Η υπερπλασία του ερυθρού μυελού (25 με 30 φορές περισσότερο από το κανονικό) σε μια προσπάθεια αποκατάστασης της μη αποδοτικής ερυθροποίησης, αναστέλλει την ανάπτυξη, προκαλεί παραμορφώσεις των οστών, οστεοπόρωση και οδηγεί στη δημιουργία εξωμυελικών μαζών. Η εξωμυελική ερυθροποίηση οδηγεί σε διόγκωση του ήπατος και του σπλήνα (ηπατομεγαλία/σπληνομεγαλία) καθώς και σε αύξηση της απορρόφησης του σιδήρου με αποτέλεσμα την υπερφόρτωση του οργανισμού με σίδηρο η οποία μπορεί να οδηγήσει σε καρδιακή ανεπάρκεια, ηπατική ανεπάρκεια κι ενδοκρινική ανεπάρκεια (εικόνα 13) [66, 76-79]. 28

44 Εικόνα 13: Παθοφυσιολογία της β-θαλασσαιμίας (προσαρμογή από Nienhuis and Nathan, 2012 [81]) Κλινικοί Φαινότυποι Η κλινική εικόνα των ασθενών με β-θαλασσαιμία ποικίλει. Υπάρχουν τρεις κύριοι φαινότυποι: η ελάσσων ή αλλιώς ετερόζυγη β-θαλασσαιμία,, η ενδιάμεση ή αλλιώς μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και η μείζων β-θαλασσαιμία ή μεσογειακή αναιμία ή αναιμία του Cooley που πρόκειται για καταστάσεις ομοζυγωτίας ή διπλής ετεροζυγωτίας. Η σοβαρότητα της νόσου σχετίζεται με το βαθμό ανισορροπίας μεταξύ των α- και β-αλυσίδων σφαιρίνης αλλά και με το βαθμό περίσσειας των α-αλυσίδων. Επομένως, παράγοντες που μειώνουν την ανισορροπία μεταξύ των δύο τύπων αλυσίδων του τετραμερούς της αιμοσφαιρίνης αλλά και την περίσσεια των α-αλυσίδων στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα έχουν αντίκτυπο στο φαινότυπο [76, 80] Ελάσσων β θαλασσαιμία Με τον όρο ελάσσων β-θαλασσαιμία αναφερόμαστε στην ετερόζυγη κατάσταση της β-θαλασσαιμίας όπου τα άτομα φέρουν ένα φυσιολογικό β αλληλόμορφο κι ένα 29

45 μεταλλαγμένο (είτε β 0 είτε β + ). Συνήθως, οι φορείς της β-θαλασσαιμίας είναι κλινικά ασυμπτωματικοί, σε ορισμένες όμως περιπτώσεις μπορεί να εμφανίσουν μια ήπιας μορφής αναιμία (παιδική ηλικία, εγκυμοσύνη, καταστάσεις στρες). Ωστόσο, η βαρύτητα της κλινικής εικόνας των φορέων μπορεί να γίνει πιο έντονη σε περίπτωση συγκληρονόμησης μεταλλάξεων που οδηγούν σε αύξηση παραγωγής της α-αλυσίδας ή σε περίπτωση που η μετάλλαξη στο β-γονίδιο έχει ως αποτέλεσματα την παραγωγή ασταθούς β-σφαιρίνης [68, 81] Μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία Οι ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία (Non-Transfusion Dependent Thalassemia, NTDT) εμφανίζουν πιο ήπια αναιμία από τους ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία κι εξ ορισμού δεν χρήζουν μεταγγίσεων ή χρήζουν μεταγγίσεων μόνο περιστασιακά. Στις πιο σοβαρές περιπτώσεις, οι ασθενείς αρχίζουν να εμφανίζουν συμπτώματα μεταξύ της ηλικίας των 2 και 6 ετών και παρότι μπορούν να επιβιώσουν χωρίς συστηματικές μεταγγίσεις παρουσιάζουν καθυστέρηση στην ανάπτυξή τους. Στο αντίθετο άκρο, βρίσκονται οι ασθενείς με τις πιο ήπιες μορφές, οι οποίοι είναι εντελώς ασυμπτωματικοί έως την ενήλικη ζωή με ήπια μόνο αναιμία. Πρόκειται για μια εξαιρετικά ετερογενή ομάδα ασθενών [66]. Ο πρωταρχικός τροποποιητής του φαινοτύπου είναι οι πολλές και διαφορετικές μεταλλάξεις που επηρεάζουν το γονίδιο της β-σφαιρίνης σε ομόζυγη ή ετερόζυγη κατάσταση. Αυτές κυμαίνονται από ήπιες μεταλλάξεις στον υποκινητή του γονιδίου οι οποίες προκαλούν ελαφριά μείωση στη σύνθεση της β-αλυσίδας έως τις μεταλλάξεις που οδηγούν σε πλήρη απουσία αυτής (β 0 ) [82]. Οι δευτερογενείς παράγοντες είναι εκείνοι που εμπλέκονται άμεσα στην τροποποίηση του βαθμού ανισορροπίας των α/β-αλυσίδων μεταξύ των οποίων η συνύπαρξη διαφορετικών μορφών α-θαλασσαιμίας και η αποτελεσματική σύνθεση γ- αλυσίδων στην ενήλικη ζωή [83-85]. Έχουν βρεθεί αρκετά γονίδια τα οποία θα μπορούσαν να τροποποιήσουν την έκφραση του γονιδίου της γ-σφαιρίνης και να βελτιώσουν το φαινότυπο. Πολλά από αυτά εντοπίζονται στο σύμπλεγμα των β- σφαιρινών (δβ0-θαλασσαιμία, σημειακές μεταλλάξεις στους υποκινητές των Α-γ ή G- γ) ενώ άλλα εντοπίζονται σε άλλα χρωμοσώματα (BCL11A, KLF1, HBS1L-MYB) [86-88]. 30

46 Στους τριτογενείς παράγοντες ανήκουν πολυμορφισμοί οι οποίοι δε σχετίζονται με τη σύνθεση των σφαιρινικών αλυσίδων αλλά μπορεί να έχουν θετική επίδραση σε επιπλοκές της νόσου όπως η απορρόφηση του σιδήρου [66, 86, 87, 89, 90] Ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία Οι ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία χρήζουν συστηματικών μεταγγίσσεων εφ όρου ζωής προκειμένου να επιβιώσουν. Τα πρώτα κλινικά συμπτώματα εμφανίζονται στην ηλικία των 6 με 24 μηνών κι αν δεν αντιμετωπιστούν οι ασθενείς πεθαίνουν κατά τα 2 πρώτα έτη της ζωής τους. Η απαιτούμενη θεραπεία για τους συγκεκριμένους ασθενείς περιλαμβάνει συστηματικές μεταγγίσεις καθ όλη τη διάρκεια της ζωής τους, κάθε 2 με 5 εβδομάδες ανάλογα με τις ανάγκες κάθε ατόμου, ώστε τα επίπεδα της αιμοσφαιρίνης πριν τη μετάγγιση να διατηρηθούν στο 9.5 με 10.5g/dL. Αυτό το σχήμα μετάγγισης προάγει τη σωστή ανάπτυξη, αναστέλλει επαρκώς την υπερδραστηριότητα του μυελού των οστών στους περισσότερους ασθενείς κι ελαχιστοποιεί τη συσσώρευση σιδήρου. Τα επίπεδα της αιμοσφαιρίνης μετά τη μετάγγιση πρέπει να διατηρούνται το μέγιστο μεταξύ 14 με 15g/dL. Η απόφαση για την έναρξη αυτού του είδους της θεραπείας βασίζεται στην παρουσία σοβαρής αναιμίας (Hb<7g/dL για περισσότερο από δύο εβδομάδες αποκλείοντας άλλες αιτίες όπως μολύνσεις, ανεπάρκεια φολικού οξέος κ.α.). Σε ασθενείς με Hb>7g/dL υπάρχουν άλλοι παράγοντες που πρέπει να ληφθούν υπόψη όπως το σχήμα του προσώπου, η καθυστέρηση στην ανάπτυξη, η αυξημένη σπληνομεγαλία, η εξωμυελική ερυθροποίηση κ.α. Χρόνια θεραπεία με μεταγγίσεις καταλήγει σε υπερβολική συγκέντρωση σιδήρου σε ζωτικούς ιστούς, με καρδιακές, ηπατικές κι ενδοκρινικές επιπλοκές όπως ο διαβήτης, ο υποθυροειδισμός, ο υπογοναδισμός, καρδιακές αρρυθμίες κ.α. που τελικά μπορεί να οδηγήσουν σε θάνατο του ασθενούς. Τα επίπεδα σιδήρου θα πρέπει να προσδιορίζονται με ακρίβεια προκειμένου να αξιολογηθεί η ανάγκη για θεραπεία αποσιδήρωσης (chelation therapy). Ασθενείς οι οποίοι δεν υποβάλλονται συστηματικά σε μεταγγίσεις παρουσιάζουν αυξημένη εξωμυελική ερυθροποίηση κυρίως στο σπλήνα με αποτέλεσμα την αύξηση του μεγέθους του κάτι που οδηγεί με τη σειρά του σε πρόωρη καταστροφή των μεταγγιζόμενων φυσιολογικών ερυθροκυττάρων καθώς επίσης των λευκοκυττάρων και των αιμοπεταλίων. Επομένως, αυξάνεται η ανάγκη των ασθενών σε αίμα και η υπερφόρτωση με σίδηρο. Σε προσεκτικά επιλεγμένες περιπτώσεις πραγματοποιείται σπληνεκτομή [60, 66, 76, 91]. 31

47 Εικόνα 14: Κλινικά συμπτώματα με τη μεγαλύτερη συχνότητα μεταξύ ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων και μείζονα β-θαλασσαιμία.(προσαρμογή από Musallam et al, 2013 [87]) 32

48 Πίνακας 1: Κλινική εικόνα, γονότυπος, αιματολογικά δεδομένα και συμπτώματα ασθενών με διαφορετικούς τύπους β-θαλασσαιμίας (προσαρμογή από Kohne et al, 2011;Musallam et al, 2013 [53, 87]) Φαινότυπος (βθαλασσαμία) Γονότυπος Αιματολογικά δεδομένα Αιμοσφαιρινική σύσταση Συμπτωματολογία Σιωπηλή Ελάσσων Μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων σιωπηλή β/β β 0 /β, β + /β, ή ήπια β + /β Φυσιολογικοί δείκτες HbA 2 <3% HbF < 2% Hb 9 μέχρι 15 g/dl Hb 9 μέχρι 13 g/dl MCV 55 μέχρι 75 fl MCH 19 μέχρι 25 pg β 0 /ήπια β +, β + /ήπια β +, ή ήπια β + /ήπια β + β 0 /σιωπηλή β, β + /σιωπηλή β, σιωπηλή β + /σιωπηλή β, ή σιωπηλή β/σιωπηλή β Hb 6 μέχρι 10 g/dl β 0 /β 0, β + / β +, ή β 0 / β + και α θαλασσαιμία MCV 55 μέχρι 70 fl που οφείλεται σε έλλειψη ή μη MCH 15 μέχρι 23 pg β 0 /β 0, β + / β +, ή β 0 / β + και αυξημένη ικανότητα σύνθεσης γ σφαιρίνης Μορφές της δβ θαλασσαιμίας που προκύπτουν από ελλείψεις και HPFH β 0 /β ή β + /β και ααα ή αααα διπλασιασμούς Επικρατής β θαλασσαιμία (inclusion bodies) Μείζων Hb <7 g/dl β 0 /β 0, β + / β +, ή β 0 / β + MCV 50 μέχρι 60 fl MCH 14 μέχρι 20 pg HbA 2 >3.2% HbF 0.5 6% HbA 2 μεταβλητή HbF μέχρι 100% HbA 2 μεταβλητή HbF 70 90% Ασυμπτωματική Χωρίς αιματολογικές ανωμαλίες Οριακώς ασυμπτωματική αναιμία Μικροκύτωση και υποχρωμία Καθυστερημένη εμφάνιση Μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων Η κλινική βαρύτητα είναι μεταβλητή και κυμαίνεται από ελάσσων σε μείζων Πρώιμη εμφάνιση Βαριά αναιμία Εξαρτώμενη μεταγγίσεων 33

49 3.3 Αντιμετώπιση των αιμοσφαιρινοπαθειών β τύπου Η θεραπεία των ασθενών με αιμοσφαιρινοπάθειες β-τύπου είναι συμπτωματική, στοχεύει δηλαδή στην όσο το δυνατόν μεγαλύτερη ανακούφιση των συμπτωμάτων τους βελτιώνοντας σε μεγάλο βαθμό την ποιότητα ζωής τους. Οι συστηματικές μεταγγίσεις, οι θεραπείες που στοχεύουν στην απομάκρυνση της περίσσειας σιδήρου από ζωτικά όργανα όπως η καρδιά και το ήπαρ, η σπληνεκτομή καθώς και η έγκαιρη αντιμετώπιση των όποιων παρενεργειών των παραπάνω έχουν συμβάλλει κατά πολύ στη διαχείριση της νόσου μετατρέποντας την από ένα θανατηφόρο σε ένα χρόνιο νόσημα. Όσον αφορά τη θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών β-τύπου υπάρχουν τρεις θεραπευτικές προσεγγίσεις: α) αλλογενής μεταμόσχευση αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων, β) γονιδιακή θεραπεία και γ) επανενεργοποίηση του γονιδίου της γ- σφαιρίνης με τη χρήση φαρμακευτικών παραγόντων [92] Αλλογενής μεταμόσχευση αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων Οι συμβατικές θεραπείες βελτιώνουν την ποιότητα ζωής και την επιβίωση των ασθενών αλλά η μεταμόσχευση αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (hematopoietic stem cell transplantation, HSCT) προσφέρει ελπίδα για οριστική θεραπεία ασθενών με β-θαλασσαιμία αφού το υγιές μόσχευμα ενός ιστοσυμβατού δότη αντικαθιστά την μη αποδοτική ερυθροποίηση του λήπτη. Η πρώτη επιτυχημένη μεταμόσχευση πραγματοποιήθηκε περισσότερo από 30 χρόνια πριν. Από τότε, πολλά κέντρα μεταμόσχευσης έχουν προσπαθήσει να κατηγοριοποιήσουν τους παράγοντες κινδύνου και να διαφοροποιήσουν τη διαδικασία με σκοπό τη θεραπεία περισσότερων ασθενών, μειώνοντας τον κίνδυνο νοσηρότητας και θνησιμότητας, βελτιώνοντας ταυτόχρονα την επιβίωση χωρίς θαλασσαιμία. Οι παράγοντες που έχει βρεθεί ότι επηρεάζουν την έκβαση μιας τέτοιας μεταμόσχευσης είναι το ιστορικό του ασθενούς πριν από αυτή (ηπατομεγαλία, πυλαία ίνωση, ακανόνιστες θεραπείες αποσιδήρωσης), η ηλικία στην οποία πραγματοποιείται (προτιμάται η μικρή ηλικία, πριν τα ζωτικά όργανα του ασθενούς υποστούν βλάβη λόγω της υπερφόρτωσης με σίδηρο), η πηγή των προγονικών κυττάρων (περιφερικό αίμα, μυελός των οστών, αίμα ομφάλιου λώρου), η ιστοσυμβατότητα, η θεραπευτική αγωγή που ακολουθείται για την προετοιμασία του ασθενούς και η αντιμετώπιση οποιασδήποτε υπερπλασίας του μυελού των οστών πριν τη μεταμόσχευση. Το 85% των ασθενών που υφίστανται μεταμόσχευση επιβιώνει χωρίς τη νόσο, το 5-10% απορρίπτει το μόσχευμα ενώ το 34

50 ποσοστό θνησιμότητας κυμαίνεται μεταξύ 5-15%. Στο σημείο αυτό, να αναφέρουμε ότι η θεραπεία αποσιδήρωσης είναι απαραίτητη στα μη θαλασσαμικά, μετά τη μεταμόσχευση, άτομα [92-94] Γονιδιακή Θεραπεία Μια ιδιαίτερα ελκυστική θεραπευτική προσέγγιση είναι το να διορθώσουμε το γονίδιο που έχει πρόβλημα στα κύτταρα των ασθενών μέσω της δράσης των πολυδύναμων προγονικών κυττάρων (ips cells). Τα τελευταία 25 χρόνια έχουν ξεπεραστεί τρομερά εμπόδια προκειμένου να κάνουν τη γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών και κυρίως της β-θαλασσαιμίας μια ρεαλιστική επιλογή. Οι σφαιρίνες πρέπει να εκφράζονται σε πολύ υψηλά επίπεδα στα ερυθροειδικά κύτταρα κι αυτό απαιτεί την προσθήκη πολύ προσεκτικά επιλεγμένων στοιχείων της LCR στους φορείς γονιδιακής θεραπείας. Γενικά, το γονίδιο της β-σφαιρίνης ήταν από μόνο του μια λεπτή γραμμή σε αυτή την προσπάθεια. Επιπλέον, έγινε ξεκάθαρο ότι οι λεντι-ϊοί ήταν πολύ καλύτεροι από τους γ-ρετροϊούς ως φορείς των «θεραπευτικών» γονιδίων. Το πρώτο ενθαρρυντικό αποτέλεσμα ήταν η μεταφορά μέσω λεντιϊκών φορέων, η ενσωμάτωση και η έκφραση του θεραπευτικού διαγονιδίου της β- ή της γ- σφαιρίνης του ανθρώπου σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα θαλασσαιμικού μοντέλου ποντικού που οδήγησε σε βελτίωση του φαινοτύπου της νόσου in vivo. Αποκατάσταση της ερυθροποίησης επιτεύχθη και σε ανθρώπινα αρχέγονα αιμοποιητικά CD34+ κύτταρα από μυελό των οστών ή περιφερικό αίμα ασθενών με β-θαλασσαιμία in vitro. Η πρώτη επιτυχημένη κλινική δοκιμή έγινε το 2007 από την ομάδα του Leboulch σε έναν 18-χρονο ασθενή β Ε /β 0, με κλινικό φαινότυπο μείζονος β-θαλασσαιμίας ο οποίος ήταν εξαρτώμενος μεταγγίσεων, ακολουθούσε θεραπεία παρεντερικής αποσιδήρωσης από πολύ νωρίς κατά την παιδική του ηλικία και είχε υποβληθεί σε σπληεκτομή στην ηλικία των 6 ετών. Ο ασθενής αυτός υποβλήθηκε σε μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων τα οποία είχαν υποστεί μεταγωγή με τον λεντιϊκό φορέα της β-σφαιρίνης. Ο εν λόγω ασθενής κατέστη ανεξάρτητος μεταγγίσεων ένα χρόνο μετά και παραμένει έως σήμερα. Παρά την επιτυχία αυτής της προσπάθειας υπάρχουν αρκετά ζητήματα ακόμα που πρέπει να λυθούν. Αρχικά, το να επιτύχουμε έκφραση της σφαιρίνης σε θεραπευτικά επίπεδα εξακολουθεί να είναι μια πρόκληση γι αυτό και γίνονται προσπάθειες για περαιτέρω βελτιστοποίηση των φορέων γονιδιακής θεραπείας. Μια άμεση ανησυχία είναι η θέση ενσωμάτωσης του φορέα στο γονιδίωμα των κυττάρων του ασθενούς η οποία ενδέχεται να επηράσει 35

51 την έκφραση των γειτονικών γονιδίων. Στον παραπάνω ασθενή αναπτύχθηκε ένας κλώνος αιμοποιητικών κυττάρων στα οποία ο λεντιϊκός φορέας είχε ενσωματωθεί κοντά στο γονίδιο HMAG2 απορρυθμίζοντας την έκφρασή του (σχηματισμός όγκου). Αν και μέχρι σήμερα δεν έχουν αναφερθεί ανεπιθύμητες ενέργειες το γεγονός αυτό φέρνει στην επιφάνεια ορισμένα ζητήματα μακροπρόθεσμης ασφάλειας. Ήδη έχει αναφερθεί μια στοχευμένη θέση ενσωμάτωσης του διαγονιδίου της σφαιρίνης με τη βοήθεια νουκλεασών δακτυλίου ψευδαργύρου (zinc finger nucleases) οι οποίες δημιουργούν δίκλωνα ρήγματα στο DNA. Όλα τα παραπάνω σε συνδυασμό με τη βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας των CD34+ κυττάρων in vitro, καθώς και η εύρεση εναλλακτικών πηγών προγονικών κυττάρων-στόχων, όπως τα πολυδύναμα επαγόμενα κύτταρα ips, ανοίγουν το δρόμο για πιο επιτυχημένες κι ασφαλείς κλινικές μελέτες στο μέλλον [92, 95, 96]. Επίσης, το σύστημα CRISPR-Cas9 έχει χρησιμοποιηθεί για την τροποποίηση μιας αλληλουχίας μήκους 13 νουκλεοτιδίων στον υποκινητή των γονιδίων HBG1 και HBG2 αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων ανθρώπου, «προξενώντας» μια μετάλλαξη που σχετίζεται με το σύνδρομο HPFH. Τα τροποιημένα αυτά κύτταρα παρήγαγαν ερυθροκύτταρα με αυξημένα επίπεδα HbF τα οποία ήταν επαρκή για να αναστείλουν το σχηματισμό των δρεπανοκυττάρων σε κατάσταση υποξίας στα άτομα με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Η τεχνολογία CRISPR-Cas επιτρέπει τη διόρθωση των αιμοσφαιρινοπαθειών β-τύπου in situ στα HSCs χωρίς την ανάγκη εισαγωγής γονιδίου [97, 98]. 36

52 Εικόνα 15: Πιθανή θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών β- τύπου μέσω γονιδιακής θεραπείας (προσαρμογή από Sankaran, 2015 [95]) Παρότι η μεταμόσχευση αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων και η γονιδιακή θεραπεία αποτελούν δύο πολλά υποσχόμενες προσεγγίσεις, εγείρουν πλήθος ηθικών και δεοντολογικών διλλημάτων και προβληματισμών τα οποία είναι δύσκολο να απαντηθούν Επανενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου της γ σφαιρίνης Η εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη HbF είναι η κύρια αιμοσφαιρίνη που εκφράζεται κατά τη διάρκεια της κύησης και υποστηρίζει τη μεταφορά οξυγόνου στο έμβρυο. Όσο πλησιάζουμε στη γέννηση η παραγωγή της γ-αλυσίδας μειώνεται ενώ η μεταγραφή του γονιδίου της β-σφαιρίνης σταδιακά αυξάνεται. Αυτή η μεταστροφή τυπικά ολοκληρώνεται στην ηλικία των 6 μηνών περίπου γεγονός που εξηγεί γιατί τα άτομα που πάσχουν από δρεπανοκυτταρική αναιμία ή β-θαλασσαιμία αρχίζουν να εκδηλώνουν συμπτώματα κατά την προχωρημένη βρεφική ηλικία. Άτομα που πάσχουν από β-θαλασσαιμία ή δρεπανοκυτταρική αναιμία και ταυτόχρονα εμφανίζουν το σύνδρομο HPFH παρουσιάζουν μειωμένη βαρύτητα της νόσου και σε ορισμένες περιπτώσεις είναι τελείως ασυμπτωματικά. Στην περίπτωση της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας η παθοφυσιολογία της νόσου εξαρτάται από τον 37

53 πολυμερισμό της HbS. Η HbF μειώνει τη συγκέντρωση HbS, αλλά το πιο σημαντικό είναι ότι τόσο η HbF όσο και τα υβριδικά τετραμερή α 2 β s γ δεν μπορούν να εισέλθουν στη φάση πολυμερισμού. Αντίθετα, τα υβριδικά τετραμερή που περιέχουν τις αλυσίδες β s και β Α έχουν 50% πιθανότητα πολυμερισμού. Το φαινόμενο παρεμπόδισης του πολυμερισμού από την HbF οφείλεται κυρίως στα κατάλοιπα γλυκίνης γ 87 και ασπαρτικού οξέος γ 80 και στα δύο γονίδια της γ-σφαιρίνης [99-101]. Στους θαλασσαιμικούς ασθενείς ο ρόλος της επανενεργοποίησης της γ-σφαιρίνης είναι περισσότερο ποσοτικός αφού αντισταθμίζει την απουσία/ή τη μειωμένη παραγωγή των β-αλυσίδων βελτιώνοντας τη μη αποδοτική ερυθροποίηση, μειώνοντας την αιμόλυση κι αυξάνοντας τα συνολικά επίπεδα αιμοσφαιρίνης από τη μεγαλύτερη επιβίωση των ερυθροκυττάρων [95]. Το γεγονός αυτό παρέχει ισχυρές ενδείξεις ότι η επανενεργοποίηση του γονιδίου της εμβρυϊκής γ-σφαιρίνης θα ήταν μια αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση για την θεραπεία της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας και της β-θαλασσαιμίας. Αρκετές ερευνητικές μελέτες έχουν εστιάσει την προσοχή τους στην ανάπτυξη φαρμακευτικών παραγόντων που επανενεργοποιούν την έκφραση της γ-σφαιρίνης. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονται οι εξής: Κυτταροτοξικοί παράγοντες Οι παράγοντες αυτοί προκαλούν «αναγέννηση» της ερυθράς σειράς μέσω της κυτταροτοξικής δράσης τους κι απελευθερώνουν μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) μέσω μεταβολικών επιδράσεων. Το NO επάγει την HbF μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού της p38 ΜΑΡΚ κινάσης. Κυτταροτοξικοί παράγοντες όπως η βινβλαστίνη και η υδροξυουρία έχει βρεθεί ότι επάγουν την έκφραση της HbF στα πρωτεύονται και στον άνθρωπο [102, 103]. Αναστολείς των DNA μεθυλτρανσφερασών Στα ενήλικα ερυθροειδικά κύτταρα, το γονίδιο της γ-σφαιρίνης αποσιωπείται εν μέρει λόγω της μεθυλίωσης της κυτοσίνης των CG δινουκλεοτιδίων (CpG) του υποκινητή. Τα ανάλογα κυτοσίνης, 5-αζακυτιδίνη και 5-αζα-2 -δεσοξυκυτιδίνη (decitabine) αναστάλλεουν τη δράση των μεθυλτρανσφερασών ώστε να επανενεργοποιήσουν την έκφραση του γ-γονιδίου. Η 5-αζακυτιδίνη έχει βρεθεί ότι επάγει τη σύνθεση της HbF σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία αλλά και 38

54 δρεπανοκυτταρική αναιμία. Ωστόσο, εξαιτίας της ανησυχίας αλλά και των αντικρουόμενων απόψεων σχετικά με τους κινδύνους που ενέχει ο παράγοντας αυτός (κυτταροτοξικότητα, μεταλλαξιγένεση, ανοσο- και μυελοκαταστολή, ενεργοποίηση ιών που βρίσκονται σε λανθάνουσα φάση) η χρήση του περιορίστηκε σε περιπτώσεις που η συμβατική θεραπεία είναι ανέφικτη. Η decitabine σε χαμηλές συγκεντώσεις είναι πιο ασφαλής χωρίς να προκαλεί βλάβες στο DNA ή να είναι κυτταροτοξική [104, 105]. Αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών Η γονιδιακή έκφραση ελέγχεται από αλλαγές στη δομή της χρωματίνης μέσω της ακετυλίωσης και της αποακετυλίωσης των ιστονών που οδηγούν σε ενεργοποίηση και καταστολή αυτής αντίστοιχα. Αρκετοί αναστολείς των αποακετυλασών όπως το βουτυρικό νάτριο επάγουν τη σύνθεση της HbF in vitro και in vivo σε διαγονιδιακά μοντέλα ποντικού. Αναστέλλοντας τη δράση των αποακετυλασών, μια μεταγραφικά ενεργή δομή χρωματίνης δημιουργείται μέσω της υπερακετυλίωσης των ιστονών κάνοντας το DNA προσβάσιμο σε διάφορα ρυθμιστικά μόρια. Βρέφοι των οποίων η μητέρα έχει διαβήτη παρουσιάζουν καθυστέρηση στη μεταστροφή από τη γ- στη β- σφαιρίνη μετά τη γέννηση που οφείλεται στα αυξημένα επίπεδα α-αμινο βουτυρικού οξέος. Κλινικές δοκιμές με ενοφλέβια χορήγηση βουτιρικής αργινίνης σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία επιβεβαίωσαν τη δράση της ως επαγωγέα της HbF. Ωστόσο, περαιτέρω ανάπτυξη αυτής παρεμποδίστηκε λόγω της ανάγκης χορήγησής της ενδοφλεβίως καθώς όταν χορηγείται από το στόμα μεταβολίζεται πολύ γρήγορα [102, 103, 106]. Βραχείας αλυσίδας λιπαρά οξέα (Short-Chain Fatty Acids, SCFAs) Αρκετά SCFAs και τα παράγωγά τους επάγουν τη σύνθεση HbF σε ανθρώπους και μπαμπουίνους. Το βαλπροϊκό οξύ και το φαινυλοβουτυρικό οξύ επάγουν την HbF όταν χορηγούνται στον άνθρωπο. Κλινικές δοκιμές για την από του στόματος χορήγηση του παραγώγου 2,2-διμεθυλοβουτυρικό άλας νατρίου έδειξαν ότι αυξάνει σημαντικά την HbF στους β-θαλασσαιμικούς ασθενείς αλλά ήταν λιγότερο αποτελεσματική σε δρεπανοκυτταρικούς ασθενείς γι αυτό και διακόπηκε σε αυτούς. Αυτό που μένει να προσδιοριστεί είναι αν ο βαθμός αύξησης της HbF είναι επαρκής για να μειώσει τις μακροπρόθεσμες επιπλοκές της μη αποδοτικής ερυθροποίησης, την αναιμία και την ανάγκη για μεταγγίσεις [103, 106]. 39

55 4. Η υδροξυουρία στη θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών β τύπου Η υδροξυουρία ή αλλιώς υδροξυκαρβαμίδιο (ΗU) είναι ένας αντιμεταβολίτης με κυτταροτοξική κι αντινεοπλασματική δράση. Χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ασθενών με μυελοδυσπλαστικές διαταραχές όπως η χρόνια μυελογενής λευχαιμία, σε ορισμένες περιπτώσεις για τη θεραπεία της ψωρίασης αλλά και ως αγωγή έναντι του HIV. Δρα ως ισχυρός αναστολέας της ριβονουκλεοτιδικής ρεδουκτάσης, ενός ενζύμου απαραίτητου για τη σύνθεση και την επιδιόρθωση του DNA. Πρόκειται για το μόνο εγκεκριμένο από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής (FDA) το 1998 και τον Ευρωπαϊκό Οργανισμό Φαρμάκων το 2007, φαρμακευτικό παράγοντα που επάγει την HbF σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Επίσης, προσφέρει κλινικά οφέλη σε ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και μειώνει την ανάγκη για μεταγγίσεις των ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία [107]. Έχουν προταθεί δύο μηχανισμοί μέσω των οποίων η HU επάγει την έκφραση της HbF αν κι ο ακριβής μηχανισμός δεν είναι πλήρως γνωστός. Στον πρώτο μηχανισμό, ο οποίος είναι γνωστός ως «ερυθροποίηση λόγω στρες», η HU αναστέλλει τη σύνθεση του DNA (S φάση) στα ταχέως διαιρούμενα πρόδρομα ερυθροειδικά κύτταρα τα οποία παράγουν HbA προωθώντας έτσι τον πολλαπλασιασμό των λιγότερο ώριμων F κυττάρων τα οποία παράγουν HbF. Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις ότι μπορεί να επηρεάσει την κινητική της ερυθροποίησης και μέσω αναστολής της πρωτεϊνοσύνθεσης (GATA-1). Ο δεύτερος μηχανισμός σχετίζεται με την ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών που οδηγούν σε υπερέκφραση της γ- σφαρίνης. Η HU μπορεί να επάγει την έκφραση της γ-σφαιρίνης είτε αυξάνοντας τα επίπεδα του NO και του camp είτε μέσω της φωσφορυλίωσης της p38 MAPK και του CREB1 κ.α. Επιπλέον, σε πρόσφατες μελέτες έχει βρεθεί ότι η HU επάγει την έκφραση ορισμένων mirnas (mir-26b, mir-151) τα οποία σχετίστηκαν με αυξημένα επίπεδα της HbF σε δρεπανοκυτταρικούς ασθενείς. Ωστόσο, ο ρόλος των mirnas στην επαγωγή της HbF από την HU πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω (εικόνα 16) [108, 109]. 40

56 Εικόνα 16: Σηματοδοτικά μονοπάτια που οδηγούν σε επαγωγή της γ-σφαιρίνης και τα οποία ενεργοποιούνται από την HU (πηγή Banan, 2013 [109]) Στους ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία πέρα από την αύξηση των επιπέδων της HbF έχει παρατηρηθεί και βελτιωμένη μορφολογία των ερυθροκυττάρων, μείωση του αριθμού των λευκοκυττάρων και των δικτυοερυθροκυττάρων και μειωμένη αιμόλυση. Η HU σχετίστηκε με: α) τη μείωση της συχνότητας των επώδυνων κρίσεων, του Οξέος Θωρακικού Συνδρόμου, της νοσηλείας και των μεταγγίσεων, β)την προστασία από εγκεφαλικές παθήσεις και βλάβες ζωτικών οργάνων, και γ) την αύξηση του προσδόκιμου ζωής και του ποσοστού επιβίωσης. Ωστόσο, στην περίπτωση των β-θαλασσαιμικών ασθενών δε σχετίζεται με σταθερή ή σημαντική αλλαγή στη μορφολογία των ερυθροκυττάρων γεγονός που ενδεχομένως σχετίζεται με τη μειωμένη απόκριση ορισμένων ασθενών [104]. Παρότι, η HU έχει πολλά οφέλη (χορηγείται από το στόμα, είναι οικονομικά προσιτή) μακροπρόθεσμα η χρήση της ενδέχεται να κρύβει κινδύνους. Υπάρχουν αναφορές ότι η λήψη HU από ασθενείς που πάσχουν από δρεπανοκυτταρική αναιμία μπορεί να οδηγήσει σε λευχαιμία, σε μειωμένη σπερματογένεση κι έλκη των άκρων καθώς και σε σωματικές μεταλλάξεις (κυρίως σε παιδιά). Επίσης, παρενέργειες μπορεί να προκαλέσει και σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία όπως πονοκέφαλο, ναυτία και ζαλάδα. Για το λόγο αυτό, σε συνδυασμό με τη διαφορική απόκριση των 41

57 ασθενών, κρίνεται απαραίτητη η στοχευμένη χορήγηση της HU κάτι όμως που προϋποθέτει την κατανόηση των λόγων που η αντίδραση των ασθενών στο φάρμακο διαφοροποιείται [109]. Η απόκριση στη λήψη HU ποικίλλει με τα ποσοστά της HbF μετά τη χορήγηση αυτής να κυμαίνονται μεταξύ 10% έως και πάνω από 30%. Αποτελέσματα ερευνών έχουν δείξει ότι ένα γενετικό στοιχείο θα μπορούσε να επηρεάσει αυτή την ποικιλία στην απόκριση των ασθενών. Πρόσφατες Μελέτες Συσχέτισης Γονιδιακής Κλίμακας (Genome Wide Associations Studies, GWAS) έχουν αποκαλύψει ότι αλλαγές στην αλληλουχία του γονιδιώματος θα μπορούσαν να επηρεάσουν την απόκριση. Πιο συγκεκριμένα, ισχυρή συσχέτιση έχει βρεθεί μεταξύ των επιπέδων της HbF και μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs) γονιδίων είτε εντός είτε εκτός του β- γονιδιακού τόπου (Xmn1-HBG2, HBS1L-MYB, BCL11A) [110]. 5. Εξατομικευμενη Ιατρική Η εξατομικευμένη ιατρική αποτελεί έναν από τους στόχους πολλών φαρμακευτικών εταιρειών, ακαδημαϊκών ιατρικών κέντρων και των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (National Institutes of Health) για τις επόμενες δεκαετίες. Ο πρωταρχικός στόχος της εξατομικευμένης ιατρικής είναι η χορήγηση σε κάθε ασθενή συγκεκριμένου φαρμάκου σε συγκεκριμένη δόση, η οποία είναι πιο πιθανό να είναι αποτελεσματική κι ασφαλής γι αυτόν, με βάση το γονιδιωματικό του προφίλ. Όπως έχει πει κι ο Ιπποκράτης «είναι πολύ πιο σημαντικό να γνωρίζουμε ποιο άτομο έχει την ασθένεια παρά τι ασθένεια έχει ένα άτομο». Η φαρμακογενετική και η φαρμακογονιδιωματική έρχονται να κάνουν την εξατομικευμένη ιατρική πραγματικότητα [111]. Ως φαρμακογενετική ορίζεται η επιστήμη η οποία μελετά πώς ο φαινότυπος απόκρισης σε ένα φάρμακο είτε αυτός αφορά την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου (ανταποκρινόμενοι και μη ασθενείς) είτε την τοξικότητα αυτού (σοβαρές ανεπιθύμητες παρενέργειες) ποικίλει εξαιτίας της κληρονομικότητας. Η ιστορία της φαρμακογενετικής ξεκινά το 510 π.χ. όταν ο Πυθαγόρας διαπίστωσε ότι η κατάποση της φάβας οδηγούσε σε μια δυνητικά θανατηφόρο αντίδραση για ορισμένα άτομα αλλά όχι για όλα. Ωστόσο, ο όρος φαρμακογενετική χρησιμοποιήθηκε για πρώτη 42

58 φορά τη δεκαετία του 1950 [112]. Η έλλειψη των ενζύμων αφυδρογονάση της 6- φωσφορικής γλυκόζης και Ν-ακετυλοτρανσφεράση της αρυλαμίνης τύπου 2 αποτελούν τις πρώτες αναφορές ότι κληρονομικές αλλαγές σε ένζυμα που σχετίζονται με το μεταβολισμό των φαρμάκων θα μπορούσαν να ευθύνονται για τις παρενέργειες ενός φαρμάκου και τις διακυμάνσεις όσον αφορά την απόκριση των ασθενών. Από τότε μέχρι σήμερα έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στον τομέα της φαρμακογενετικής [113]. Με την πάροδο των ετών, η ανάπτυξη μοριακών τεχνικών ανάλυσης ολόκληρου του γονιδιώματος και η εμφάνιση Μελετών Συσχέτισης Γονιδιωματικής Κλίμακας είχε ως αποτέλεσμα τη μετάβαση από τη φαρμακογενετική στη φαρμακογονιδιωματική. Ο όρος φαρμακογονιδιωματική εισήχθη το 1998 για να περιγράψει τη μελέτη ολόκληρου του φάσματος των γονιδίων που καθορίζουν την απόκριση σε ένα φάρμακο λαμβάνοντας υπόψη την ποικιλομορφία της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος και τις κλινικές συνέπειες αυτής. Πιο συγκεκριμένα, η φαρμακογονιδιωματική δεν εστιάζει μόνο στα ένζυμα τα οποία συμμετέχουν στο μεταβολισμό των φαρμάκων αλλά στρέφει το ενδιαφέρον της και σε γονίδια τα οποία κωδικοποιούν μόρια που σχετίζονται με τη νόσο, με την κατανομή, την απορρόφηση, την έκκριση, τη μεταφορά και το μόριο-στόχο ενός φαρμάκου [113]. 5.1 Φαρμακογονιδιωματικοί Βιοδείκτες Η επιλογή της κατάλληλης φαρμακευτικής αγωγής καθώς και η χορήγηση της κατάλληλης δόσης βασίζεται στο ιατρικό ιστορικό του ασθενούς και σε παράγοντες όπως το φύλο, η ηλικία, το βάρος, η λειτουργία των οργάνων, η δίατα, κ.α. Ωστόσο, παρότι αυτοί οι παράγοντες λαμβάνονται υπόψη, η απόκριση ποικίλει μεταξύ των ασθενών και κυμαίνεται από θετικά αποτελέσματα μέχρι σοβαρές παρενέργειες. Στόχος των φαρμακογονιδιωματικών μελετών είναι η συσχέτιση γενετικών διαφορών μεταξύ των ατόμων με τη φαρμακοκινητική, τη φαρμακοδυναμική, την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια ενός φαρμάκου με απώτερο σκοπό εκτός από τους παραπάνω παράγοντες να λαμβάνονται υπόψη και γενετικοί παράγοντες οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για το 20-40% της διαφορικής απόκρισης μεταξύ των ασθενών [ ]. 43

59 Επομένως για πιο εξατομικευμένες πρακτικές συνταγογράφησης είναι ουσιώδης η ύπαρξη φαρμακογονιδωματικών βιοδεικτών με τη βοήθεια των οποίων οι ασθενείς ομαδοποιούνται με βάση την πιθανή απόκρισή τους σε ένα συγκεκριμένο φάρμακο τόσο ως προς την αποτελεσματικότητα όσο και ως προς τις παρενέργειες αυτού. Ως βιοδείκτης ορίζεται ένα χαρακτηριστικό του DNA ή του RNA, το οποίο αποτελεί δείκτη φυσιολογικών και παθολογικών καταστάσεων και/ή της απόκρισης ενός ασθενούς στη θεραπευτική αγωγή [117]. Μεταξύ των χαρακτηριστικών του DNA που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φαρμακογονιδιωαμτικοί βιοδείκτες περιλαμβάνονται μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί, απλότυποι, τροποποιήσεις του DNA (π.χ. μεθυλίωση), επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες κ.α. Κάθε βάσεις εντοπίζονται πολυμορφικές θέσεις στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Ο πιο κοινός τύπος πολυμορφικής θέσης του ανθρώπινου γονιδιώματος είναι οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί ή αλλιώς SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). Πρόκειται για διαφορές ενός μόνο νουκλεοτιδίου από άτομο σε άτομο και προκύπτουν από αντικατάσταση μιας βάσης από μια άλλη, καθώς κι από την προσθήκη ή την έλλειψη ενός νουκλεοτιδίου. Ένας SNP εντοπίζεται περίπου κάθε bp με αποτέλεσμα 2 άτομα να διαφέρουν σε περίπου 3-10 εκατομμύρια bp αντιπροσωπεύοντας ποσοστό <1% των 3,2 δισεκατομμυρίων βάσεων του απλοειδούς γονιδιώματος. Η θέση ενός SNP σε ένα συγκεκριμένο γονίδιο καθορίζει αν θα επηρεαστεί η όχι η λειτουργία αυτού. Επίσης, το αποτέλεσμα ενός SNP εξαρτάται από το αν εντοπίζεται στο ένα ή και στα δύο αλληλόμορφα ενός γονιδίου [111, 118]. Οι περισσότεροι SNPs δεν επηρεάζουν την υγεία ή την εξέλιξη της νόσου. Ωστόσο, κάποιες από αυτές τις γενετικές αλλαγές είναι πολύ σημαντικές, καθώς έχει βρεθεί ότι μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες στην πρόβλεψη της απόκρισης ενός «μεμονωμένου» ατόμου σε συγκεκριμένο φάρμακο, της ευαισθησίας σε περιβαλλοντικούς παράγοντες και του κινδύνου εμφάνισης μιας συγκεκριμένης ασθένειας. Εκτός βέβαια από τους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς υπάρχουν κι άλλους είδους γενετικές παραλλαγές, όπως μικρού μήκους ελλείψεις ή ενθέσεις (<10 44

60 bp), επαναλήψεις κι αναστροφές, οι οποίες είναι γνωστές ως δομικές αλλαγές (structural variations). Αυτού του είδους οι αλλαγές είναι λιγότερο συχνές αλλά έχουν μεγαλύτερες επιπτώσεις καθώς περιλαμβάνουν μεγαλύτερο μέρος του γονιδιώματος. Για παράδειγμα, μια τέτοιου είδους έλλειψη στην κωδική περιοχή ενός γονιδίου μπορεί να οδηγήσει σε μια εντελώς διαφορετική μη λειτουργική πρωτεΐνη [ ]. Οι φαρμακογονιδιωματικοί βιοδείκτες οι οποίοι σχετίζονται με τη δράση ενός φαρμάκου θα μπορούσαν να διακριθούν σε 3 κατηγορίες: 1) Βιοδείκτες οι οποίοι «προβλέπουν» το μεταβολισμό ενός φαρμάκου Σε αυτή την κατηγορία περιλαμβάνονται πολυμορφισμοί οι οποίοι εντοπίζονται σε ένζυμα τα οποία συμμετέχουν στο μεταβολισμό φαρμάκων μεταξύ των οποίων ένζυμα του κυττοχρώματος P450 όπως τα CYP2D6, CYP3A1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2A6, CYP2E1. Οι πολυμορφισμοί αυτοί θα μπορούσαν να φανούν χρήσιμοι για τον προσδιορισμό του κατάλληλου δοσολογικού σχήματος ενός φαρμάκου. 2) Βιοδείκτες οι οποίοι «προβλέπουν» την απόκριση σε ένα φάρμακο Σε αυτή την κατηγορία ανήκουν πολυμορφισμοί οι οποίοι εντοπίζονται σε κωδικές ή ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων που εμπλέκονται στο θεραπευτικό μονοπάτι και θα μπορούσαν να σχετίζονται με την αποτελεσματικότητα ενός φαρμάκου. 3) Βιοδείκτες οι οποίοι «προβλέπουν» τις ανεπιθύμητες ενέργειες ενός φαρμάκου Στην προκειμένη περίπτωση για να έχει ένας βιοδείκτης κλινική χρησιμότητα θα πρέπει να πληρούνται τουλάχιστον τα ακόλουθα τέσσερα κριτήρια ως προς τις ανεπιθύμητες ενέργειες του φαρμάκου: α) θα πρέπει να είναι αρκετά συχνές, β) μη απειλητικές για τη ζωή, γ) η σοβαρότητά τους θα πρέπει να είναι μικρότερη ή ίση με την κλινική κατάσταση του ασθενούς που απαιτεί τη χορήγηση του φαρμάκου και δ) να υπάρχουν ελάχιστες εναλλακτικές λύσεις θεραπευτικής αγωγής ή ένας καθοριστικός παράγοντας που απαιτεί τη χορήγηση της συγκεκριμένης φαρμακευτικής αγωγής. Εφόσον ισχύουν τα παραπάνω κριτήρια θα μπορούσε στην ετικέτα του φαρμάκου να αναγράφεται και ο βιοδείκτης για ανεπιθύμητες ενέργειες. 45

61 Η ύπαρξη φαρμακογονιδιωματικών βιοδεικτών θα μπορούσε να βελτιώσει κατά πολύ τα αποτελέσματα μιας θεραπευτικής αγωγής. Ωστόσο, πριν την κλινική χρήση τους στο γενικό πληθυσμό είναι απαραίτητο να προηγηθούν επιστημονικές μελέτες και κλινικές δοκιμές οι οποίες θα λάβουν υπόψη τους τις διαφορές που μπορεί να υπάρχουν μεταξύ των πληθυσμών. Επίσης, θα πρέπει να ληφθούν υπ όψιν ζητήματα τα οποία μπορεί να προκύψουν από την προστασία των γενετικών δεδομένων του κάθε ασθενούς [119]. 6. Το γονίδιο VEGFA Το γονίδιο VEGF-A ανήκει στην οικογένεια των Αγγειακών Ενδοθηλιακών Αυξητικών Παραγόντων (Vascular Endothelial Growth Factors, VEGFs). Στον άνθρωπο, η οικογένεια VEGF αποτελείται από 5 μέλη: VEGF-A, -B, -C, -D και PLGF (Placenta Growth Factor). Δομικά τα μόρια VEGFs ανήκουν στην υπεροικογένεια VEGF-PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) η οποία χαρακτηρίζεται από την παρουσία οκτώ συντηρημένων κυστεϊνών που σχηματίζουν μια τυπική δομή κόμπου-κυστίνης (cystine-knot). Συγκεκριμένα, από τις οκτώ συντηρημένες κυστεΐνες οι δύο δημιουργούν διαμοριακούς χιαστί δισουλφιδικούς δεσμούς και σχηματίζουν ένα διμερές (δομή της κυστίνης) ενώ οι υπόλοιπες έξι δημιουργούν τρεις ενδομοριακούς δισουλφιδικούς δεσμούς σχηματίζοντας τρεις βρόχους (loop) (Shibuya, 2001). Τα μόρια VEGF σχηματίζουν κυρίως ομοδιμερή αν κι έχουν αναγνωριστεί VEGF-A και PLGF ετεροδιμερή (Olsson et al, 2006). Η απουσία των πρωτεϊνών αυτών στους μονοκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς όπως η ζύμη υποδηλώνει ότι η δομή cystine-knot εξελίχθηκε για να καλύψει τη λειτουργία των ορμονών και των εξωκυττάριων σηματοδοτικών μορίων στους πολυκύτταρους οργανισμούς με οργάνωση σε επίπεδο ιστού [120]. Τα μέλη της οικογένειας VEGF συμμετέχουν σε μια πληθώρα βιολογικών διεργασιών των ενδοθηλιακών κυττάρων όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση, η επιβίωση, η επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων και η διαφοροποίηση. Επιπλέον, κάποια από αυτά ρυθμίζουν τη διαπερατότητα των αιμοφόρων αγγείων. Σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία ενεργοποιούνται από τα μόρια VEGF παίζουν σημαντικό ρόλο στη de novo δημιουργία των αγγείων από 46

62 πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα (vasculogenesis) αλλά και στη δημιουργία αιμοφόρων αγγείων από ήδη υπάρχοντα (αγγειογένεση) [121]. Το μόριο VEGF-A ανακαλύφθηκε τη δεκαετία του 1980 ανεξάρτητα ως ένα μόριο το οποίο επάγει άμεσα κι αποτελεσματικά τη διαπερατότητα των αγγείων (VPF, Vascular Permeability Factor) αλλά κι ως αυξητικός παράγοντας ειδικός των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων (VEGF). Ωστόσο, η κλωνοποίηση των γονιδίων που κωδικοποιούσαν τις «δύο» αυτές πρωτεΐνες το 1989 διευκρίνισε ότι πρόκειται για την ίδια πρωτεΐνη η οποία κωδικοποιείται από ένα μόνο γονίδιο [122]. Από την ανακάλυψή της το 1983 η πρωτεΐνη VEGF-A έχει αναδειχθεί σε σημαντικό ρυθμιστή της αγγειογένεσης τόσο κατά την ανάπτυξη του εμβρύου όσο και κατά την ενήλικη ζωή σε φυσιολογικές αλλά και παθολογικές καταστάσεις. Σε φυσιολογικές συνθήκες αγγείωσης των ενήλικων οργάνων βασικά επίπεδα του VEGF-A προστατεύουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα από την απόπτωση. Ωστόσο, τα επίπεδα αυτού αυξάνονται σε πολλές φυσιολογικές καταστάσεις όπως η εγκυμοσύνη, η εμμηνόρροια, η επούλωση πληγών αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, τα καρδιαγγειακά νοσήματα, η ψωρίαση κι ο καρκίνος [123, 124]. Στον άνθρωπο το γονίδιο VEGF-A εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6 στη θέση 6p21.1. Αποτελείται από 8 εξώνια και 7 ιντρόνια κι έχει μήκος περίπου 14kb. Ο υποκινητής του γονιδίου δεν έχει το τυπικό «TATA box» αλλά έχει αρκετές θέσεις δέσμευσης ρυθμιστικών παραγόντων όπως AP1, AP2, Sp1. Το 1998, ο Akiri G. κι οι συνεργάτες του περιέγραψαν έναν εναλλακτικό υποκινητή στην 5 UTR του γονιδίου. Αυτή η θέση έναρξης της μεταγραφής εντοπίζεται 633 νουκλεοτίδια καθοδικά της κύριας θέσης έναρξης της μεταγραφής. Τα δύο διαφορετικά μετάγραφα που προκύπτουν φαίνεται να έχουν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης στο χώρο και στο χρόνο [124]. Η έκφραση του γονιδίου VEGF-A επάγεται από ποικίλους παράγοντες μεταξύ των οποίων η υποξία, αυξητικοί παράγοντες, μεταλλάξεις του γονιδίου p53, οιστρογόνα κ.α. Από όλους αυτούς τους παράγοντες πιο σημαντικός ρυθμιστής της έκφρασης του VEGF-A σε μεταγραφικό επίπεδο θεωρείται η υποξία [122]. Η εναλλακτική συναρμογή του γονιδίου VEGF-A στα εξώνια 6 και 7 έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ισομορφών με διαφορετική διαθεσιμότητα και 47

63 διαφορετική λειτουργία. Όλα τα μετάγραφα φέρουν τα εξώνια 1-5 και το εξώνιο 8. Η υδρόφοβη σηματοδοτική αλληλουχία μήκους 26 αμινοξέων στο Ν-τελικό άκρο κάθε ισομορφής που είναι απαραίτητη για την έκκριση του VEGF-A κωδικοποιείται από το εξώνιο 1 κι ένα μικρό μέρος του εξωνίου 2. Οι ομόλογες περιοχές μεταξύ των μορίων VEGF και PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) κωδικοποιούνται από τα εξώνια 3 και 4. Τα εξώνια 6 και 7 κωδικοποιούν περιοχές δέσμευσης ηπαρίνης οι οποίες ευθύνονται για την ικανότητα διάχυσης και τη συγγένεια των ισομορφών με την εξωκυττάρια ύλη. Η επιλογή μιας εκ των δύο θέσεων συναρμογής στο εξώνιο 8 οδηγεί σε δύο διαφορετικές οικογένειες ισομορφών, την προ-αγγειογενετική (VEGF- A xxx ) και την αντι-αγγειογενετική (VEGF-A xxx b) οικογένεια, τα μέλη των οποίων έχουν ίδιο μήκος αλλά διαφέρουν σε έξι αμινοξέα στο C-τελικό άκρο τους. Η ισορροπία μεταξύ των αντι-αγγειογενετικών και των προ-αγγειογενετικών πρωτεϊνών είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της αγγειακής ομοιόστασης [120, ]. Η εκάστοτε ισομορφή παίρνει το όνομά της από το συνολικό αριθμό των αμινοξέων της ώριμης πρωτεΐνης που κωδικοποιεί (εικόνα 17). Παρά το όνομά τους, ισομορφές του VEGF-A έχουν ταυτοποιηθεί να παίζουν σημαντικό ρόλο και σε άλλους κυτταρικούς τύπους πλην των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η ισομορφή VEGF- A165 που αποτελεί και την κύρια ισομορφή του VEGF-A δρα και ως παράγοντας επιβίωσης των αιμοποιητικών κυττάρων. Οι κύριες ισομορφές που απαντώνται στον άνθρωπο καθώς και η λειτουργία τους φαίνονται στον πίνακα που ακολουθεί. 48

64 Πίνακας 2: Διαφορετικές ισομορφές του γονιδίου VEGFA κι η λειτουργία τους Ισομορφή Λειτουργία VEGF-A 121 Αγγειογένεση Πολλαπλασιασμός ενδοθηλιακών κυττάρων VEGF-A 165 Ρύθμιση αγγειογένεσης τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις σε ενήλικα άτομα αλλά και κατά την εμβρυογένεση Διαπερατότητα των αγγείων Πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, επιβίωση ενδοθηλιακών κυττάρων Λειτουργία ενδοθηλιακών κυττάρων και μη π.χ. τα λεμφοκύτταρα Επιβίωση αιμοποιητικών κυττάρων, ποδοκυττάρων και καρκινικών κυττάρων VEGF-A 189 Πολλαπλασιασμός, μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro σε παρόμοια έκταση με το VEGF-A 165 Προσκόλληση κι επιβίωση των κυττάρων μέσω αλληλεπίδρασης με ιντεγκρίνες VEGF-A 110 διέγερση σε μικρότερο βαθμό του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών Μικρότερη μιτογόνο δράση σε σχέση με το VEGF-A 165 και κατά συνέπεια κυττάρων VEGF-A 111 Η συγκεκριμένη ισομορφή δεν εντοπίζεται σε υγιή ανθρώπινα κύτταρα Επάγεται από την υπεριώδη ακτινοβολία UV-B κι από γονιδιοτοξικούς παράγοντες VEGF-A 145 Υψηλά ποσοστά στον ανθρώπινο πλακούντα Πολλαπλασιασμός ενδοθηλιακών κυττάρων, αγγειογενετική απόκριση in vivo VEGF-A 148 Λείπει το εξώνιο 8 Ενδεχομένως δεν έχει κάποια βιολογική δράση VEGF-A 162 Πολλαπλασιασμός ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro Αγγειογένεση in vivo Ο πιο ειδικός βιολογικός ρόλος της δεν έχει ακόμα βρεθεί VEGF-A 183 Όχι μιτογόνες ιδιότητες Αύξηση διαπερατότητας αγγείων ποντικού VEGF-A 206 Αρχικά πίστευαν ότι περιοριζόταν σε κύτταρα που προέρχονται από τον πλακούντα επηρεάζοντας τη διαπερατότητα των αγγείων Έχει βρεθεί στα εκκριτικά κοκκία μαστικών κυττάρων του δέρματος σε φυσιολογικό και καρκινικό ιστό και σε κύτταρα από καρκίνο του πνεύμονα αν και δε φαίνεται να σχετίζεται με τη δημιουργία του όγκου 49

65 Όσον αφορά τις ισομορφές VEGF-A xxx b φαίνεται να βρίσκονται σε υψηλά ποσοστά σε σχέση με το συνολικό VEGF-A και πολλές φορές ξεπερνούν το ποσοστό των VEGF-A xxx. Έχουν βρεθεί σε μια σειρά ιστών, όπως ο πνεύμονας, η ουροδόχος κύστη, ο νεφρός, το παχύ έντερο, οι λείοι μύες καθώς και να κυκλοφορούν ελεύθερα στο πλάσμα, στον πλακούντα και στα ούρα. Επομένως, είναι ξεκάθαρο ότι αποτελούν μέρος της κανονικής φυσιολογίας. Η έκφρασή τους εξαρτάται από την «αγγειογενετικότητα» των ιστών και πιο συγκεκριμένα, καταστέλλεται στους αγγειογενετικούς ή δυνητικά αγγειογενετικούς ιστούς, όπως ο πλακούντας [123]. Εικόνα 17: Δομή του ανθρώπινου γονιδίου VEGFA και οι διαφορετικές ισομορφές που προκύπτουν από εναλλακτική συναρμογή (πηγή Acorndegyu et al, 2013[124]) 50

66 Τα μόρια VEGF προσδένονται σε τρεις υποδοχείς τύπου κινάσης της τυροσίνης (RTKs, Receptor Tyrosine Kinases), οι οποίοι ονομάζονται υποδοχείς των αγγειακών ενδοθηλιακών αυξητικών παραγόντων VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 (Vascular Endothelial Growth Factors Receptors), καθώς επίσης και σε συνυποδοχείς, όπως οι πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαρίνης (HSPGs, Heparan Sulphate Proteoglycans) και οι νευροπιλίνες (neuropillins) [126]. Οι υποδοχείς VEGFRs αποτελούνται από 3 τμήματα: το εξωκυττάριο τμήμα στο οποίο προσδένονται τα μόρια VEGF κι αποτελείται από 7 περιοχές τύπου ανοσοσφαιρίνης, ένα μικρό διαμεμβρανικό τμήμα κι ένα κυτταροπλασματικό τμήμα το οποίο αποτελείται από 2 καταλυτικές περιοχές κινάσης της τυροσίνης. Τα βασικά βήματα μεταγωγής σήματος μέσω των παραπάνω υποδοχέων είναι τα εξής: Πρόσδεση του μορίου στον υποδοχέα, διμερισμός αυτού, ενεργοποίηση της κινάσης, αυτοφωσφορυλίωση του υποδοχέα, πρόσδεση κι ενεργοποίηση επιπλέον σηματοδοτικών μορίων στις θέσεις αυτοφωσφορυλίωσης με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών (εικόνα 18) [122, 123]. Η πρωτεΐνη VEGF-A ασκεί τις βιολογικές της δράσεις μέσω της πρόσδεσής της στους υποδοχείς VEGFR1 (ή αλλιώς Flt-1) και VEGFR2 (ή αλλιώς KDR). Ο VEGFR1 συμμετέχει σε μονοπάτια σχετικά με την διαπερατότητα των αγγείων, τη μετανάστευση των μακροφάγων και των μονοκυττάρων, την αιμοποίηση, τη στρατολόγηση πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων από το μυελό των οστών και τη ρύθμιση των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την ανάπτυξη. Επίσης, μπορεί να ρυθμίσει θετικά ή αρνητικά τη δράση του VEGFR2. Ο VEGFR2 εμπλέκεται σε μονοπάτια που σχετίζονται με την υγιή και μη φυσιολογία των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η νευροπιλίνη Np-1 λειτουργεί ως συνυποδοχέας ειδικός για κάποιες ισομορφές του VEGF-A [123, 126]. 51

67 Εικόνα 18: Τα μέλη της οικογένειας VEGF και οι υποδοχείς τους VEGFRs. (Α) VEGF μόρια και οι ομοδιμερείς υποδοχείς τους (Β) Ετεροδιμερείς υποδοχείς (Γ) Νευροπιλίνες (NRP1 KAI NRP2) ως συνυποδοχείς (προσαρμογή από de Almodovar et al, 2009 [127]) Μελέτες σε knockout μύες υποδηλώνουν το ρόλο του VEGF-A γονιδίου και των υποδοχέων του στην ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος αλλά και των αιμοποιητικών ιστών. Η Casella I. και οι συνεργάτες της το 2003 διαπίστωσαν ότι η παραγωγή του VEGF-A είναι καίριας σημασίας για την επιβίωση και τη διαφοροποίηση των ενήλικων προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων (HSCs). Επίσης δρα τόσο μέσω του VEGFR1 όσο και του VEGFR2 υποδοχέα [128]. Τέλος να αναφέρουμε ότι η λειτουργία του VEGF-A τόσο κατά την εμβρυογένεση όσο και κατά την ενήλικη ζωή οφείλεται στον αυστηρό έλεγχο της έκφρασής του. Η ύπαρξη δύο υποκινητών, δύο σημάτων πολυαδενυλίωσης και πολλών εναλλακτικών γεγονότων συναρμογής μαρτυρούν την πολυπλοκότητα των μηχανισμών που διέπουν τη ρύθμιση της έκφρασής του. Η ρύθμιση γίνεται κυρίως σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο με το mrna να περιέχει μια ποικιλία ρυθμιστικών στοιχείων (HSR, ARE αλληλουχίες, IRES, hnrnpl ή GAIT θέσεις δέσμευσης). 52

68 ΣΚΟΠΟΣ Το γονίδια των σφαιρινών στον άνθρωπο εκφράζονται μόνο στους ερυθροποιητικούς ιστούς και διαφορετικές αιμοσφαιρίνες παράγονται στα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια. Η μεταστροφή από την εμβρυϊκή στην αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων κατά την οντογένεση του ανθρώπου ελέγχεται από πολλούς ρυθμιστικούς παράγοντες μέσα από πολύπλοκα μονοπάτια. Η επανενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου της γ-σφαιρίνης υπόσχεται πολλά για τη θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών β-τύπου καθώς κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι υψηλά επίπεδα εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης HbF βελτιώνουν τα κλινικά συμπτώματα ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία και β-θαλασσαιμία. Η υδροξυουρία (HU) αποτελεί το μόνο εγκεκριμένο φαρμακευτικό παράγοντα ο οποίος επάγει την έκφραση της HbF και ο οποίος χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των δύο προαναφερθέντων ασθενειών. Ωστόσο, η απόκριση των ασθενών στην HU ποικίλλει. Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών καθώς και η μελέτη γενετικών παραλλαγών γονιδίων που μπορεί σχετίζονται με τα επίπεδα της HbF είναι μεγάλης σημασίας για τη θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών β-τύπου. Ο στόχος της παρούσας ερευνητικής εργασίας είναι διττός: Αφενός μεν η μελέτη της διαφορικής μοριακής υπογραφής τριών αιμοποιητικών ιστών του ανθρώπου κατά τη διάρκεια της οντογενέσης προκειμένου να εντοπιστούν γονίδια τα οποία ενδεχομένως σχετίζονται με τη διαβάθμιση της έκφρασης της HbF και Αφετέρου η περαιτέρω μελέτη του γονιδίου VEGFA, του οποίου η έκφραση βρέθηκε ότι διαφοροποιείται κατά την οντογένεση τόσο ως προς το προφίλ έκφρασής του κατά τη διαφορoποίηση των πρώιμων ερυθροειδικών κυττάρων, δύο ιστών με υψηλά επίπεδα HbF, σε ερυθροβλάστες όσο κι ως προς τον πιθανό του ρόλο ως φαρμακογονιδιωματικό δείκτη της απόκρισης ασθενών με αιμοσφαιρινοπάθειες β-τύπου στην HU αλλά κι ως τροποποιητή της βαρύτητας των κλινικών συμπτωμάτων της β-θαλασσαιμίας. 53

69 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 54

70 1. Μελέτη του διαφορικού μεταγραφικού προφίλ τριών αιμοποιητικών ιστών κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης οντογένεσης 1.1 Μέθοδος των DNA μικροσυστοιχιών Η ανάλυση του μεταγραφικού προφίλ ή αλλιώς του μεταγραφώματος (whole transcriptome analysis) στοχεύει στην ταυτοποίηση και την ποσοτικοποίηση του RNA που υπάρχει σε ένα κύτταρο, σε έναν ιστό ή σε έναν οργανισμό. Από την ανακάλυψή της τη δεκαετία του 1990 έως σήμερα η τεχνολογία των DNA μικροσυστοιχιών (DNA microarrays) χρησιμοποιείται ευρέως σε μελέτες γονιδιακής έκφρασης. Η παραπάνω μέθοδος μας δίνει τη δυνατότητα να ανιχνεύσουμε ταυτόχρονα δεκάδες χιλιάδες μετάγραφα ανιχνεύοντας συγκεκριμένα τμήματα του mrna. Η χρήση των DNA μικροσυστοιχιών έχει οδηγήσει σε σημαντική πρόοδο όσον αφορά την ταυτοποίηση γονιδίων των οποίων η έκφραση διαφοροποιείται ανάμεσα σε έναν υγιή κι έναν ασθενή ιστό, κατά τη διάρκεια της οντογένεσης, ως απόκριση σε ένα φάρμακο ή κατά την εξέλιξη της γονιδιακής ρύθμισης μεταξύ διαφορετικών ειδών [129]. Με τον όρο DNA μικροσυστοιχία εννοούμε μια στερεή γυάλινη επιφάνεια πάνω στην οποία βρίσκονται ακινητοποιημένες αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων, ειδικές για συγκεκριμένα μετάγραφα του γονιδιώματος. Οι αλληλουχίες αυτές ονομάζονται ανιχνευτές (probes). Προκειμένου να καταστεί δυνατή η ανίχνευση καθώς και η ποσοτικοποίηση της έκφρασης κάθε γονιδίου, το mrna ενός δείγματος σημαίνεται με μια φθορίζουσα χρωστική και στη συνέχεια υβριδοποιείται στη μικροσυστοιχία. Ακουλουθεί διέργεση στο μήκος κύματος που απορροφά η συγκεκριμένη χρωστική μέσω ενός laser. Έπεται σάρωση της μικροσυστοιχίας με ειδικό σαρωτή και μέτρηση του φθορισμού κάθε ανιχνευτή. Τέλος, χρησιμοποιούνται τα κατάλληλα λογισμικά εργαλεία για την οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων (εικόνα 19). Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ολιγονουκλεοτιδικές μικροσυστοιχίες τύπου Affymetrix. Πρόκειται για 25μερή τα οποία συντίθενται in situ στη στερεή επιφάνεια της μικροσυστοιχίας με τη μέθοδο της φωτολιθογραφίας. Για το ίδιο mrna χρησιμοποιείται περίσσεια ανιχνευτών οι οποίοι αναγνωρίζουν διαφορετικές περιοχές κοντά στο 3 άκρο των μεταγράφων ενός γονιδίου. 55

71 Ο σχεδιασμός των ανιχνευτών γίνεται in silico με τη χρήση βάσεων δεδομένων οι οποίες περιέχουν τις απαραίτητες πληροφορίες για την αλληλουχία του mrna και στηρίζεται στη μοναδικότητά τους ως προς μια αλληλουχία αναφοράς. Εικόνα 19: Αρχή της μεθόδου των DNA μικροσυστοιχιών (προσαρμογή από και Ιστοί των οποίων το μεταγραφικό προφίλ αναλύθηκε με τη μέθοδο των DNA μικροσυστοιχιών Στην παρούσα μελέτη αναλύθηκε το διαφορικό μεταγραφικό προφίλ πρoγονικών ερυθροειδικών κυττάρων (Human Eythroid Progenitors, HEPs) τριών αιμοποιητικών ιστών κατά τη διάρκεια της οντογένεσης του ανθρώπου. Οι ιστοί οι οποίοι μελετήθηκαν κaι ο αριθμός των δειγμάτων για κάθε έναν από αυτούς φαίνεται στον πίνακα που ακολουθεί (πίνακας 3). 56

72 Πίνακας 3: Ιστοί των οποίων το μεταγραφικό προφίλ μελετήθηκε με τη μέθοδο των DNA μικροσυστοιχιών Ιστός Αριθμός Δειγμάτων Εμβρυϊκό ήπαρ 4 Ομφαλοπλακουντικό αίμα 5 Περιφερικό αίμα ενήλικου ατόμου 4 Τη συλλογή εμβρυϊκού ήπατος, ομφαλοπλακουντικού αίματος και περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου ακολούθησαν πρωτογενείς καλλιέργειες πρoγονικών ερυθροειδικών κυττάρων. Ολικό RNA απομονώθηκε από τα παραπάνω κύτταρα κι υβριδοποιήθηκε σε μικροσυστοιχία τύπου Affymetrix Human Genome U133 array v2.0 [130]. Η παραπάνω μικροσυστοιχία αποτελείται από διαφορετικούς ανιχνευτές για γονίδια. Η διάκριση της διαφορικής έκφρασης κάθε γονιδίου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού εργαλείου Altanalyze. Η ομαδοποίηση των διαφορετικών ομάδων ανιχνευτών πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό Cluster 3.0 [131] και τέλος η οπτικοποίηση των δεδομένων (heatmaps) με τη χρήση του λογισμικού JavaTreeView Version 1.1.6r2 [132]. Ποσοστιαία μεταβολή (fold change) >2 αντιστοιχεί σε υπερέκφραση ενός γονιδίου ενώ < 2 αντιστοιχεί σε υποέκφραση [130]. Η μελέτη της μοριακής υπογραφής των πρoγονικών ερυθροειδικών κυττάρων των τριών ιστών περιλαμβάνει τρεις διαφορετικές ομάδες σύγκρισης: α) περιφερικό αίμα ενήλικου ατόμου έναντι ομφαλοπλακουντικού αίματος, β) περιφερικό αίμα ενήλικου ατόμου έναντι εμβρυϊκού ήπατος και γ) ιστοί που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα HbF (περιφερικό αίμα ενήλικου ατόμου) έναντι ιστών που εκφράζουν υψηλά επίπεδα HbF (ομφαλοπλακουντικό αίμα και εμβρυϊκό ήπαρ). Η συλλογή όλων των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε κατόπιν γραπτής συναίνεσης των συμμετεχόντων στην περίπτωση του περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου και των γονιών στην περίπτωση του ομφαλοπλακουντικού αίματος και του εμβρυϊκού ήπατος σύμφωνα πάντα με τους κανόνες Βιοηθηκής των εκάστοτε Ιδρυμάτων. Τα 57

73 δείγματα του εμβρυϊκού ήπατος προέρχονται από αυτόματες αποβολές. Όλα τα δείγματα ανήκουν στον Καυκάσιο πληθυσμό. 2. Eπιλογή του γονιδίου VEGFA για περαιτέρω μελέτη Η ανάλυση του μεταγραφικού προφίλ των τριών διαφορετικών ιστών οδήγησε σε χιλιάδες γονίδια τα οποία εκφράζονται διαφορετικά μεταξύ αυτών. Μέσω της βάσης δεδομένων STRING (Search Tool for the Retrieval of International Genes/Proteins) [133] και του εργαλείου GeneΜΑΝΙΑ [134] διερευνήθηκε πώς αυτά τα γονίδια μπορεί να συνδέονται μεταξύ τους καθώς κι αν σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα (μέσω της συνδεσής τους με άλλα γονίδια) είτε με την ερυθροποίηση είτε με τις αιμοσφαιρινοπάθειες και την έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων γενικότερα. Το αποτέλεσμα της αναζήτησης αυτής οδήγησε σε μια λίστα 95 γονιδίων. Κατόπιν πιο εκτενούς αναζήτησης βιβλιογραφικών δεδομένων σχετικά με τη σύνδεση των γονιδίων αυτών με την ερυθροποίηση και τις αιμοσφαιρινοπάθειες επιλέγη το γονίδιο VEGFA για περαιτέρω μελέτη. 3. Μελέτη του μεταγραφικού προφίλ των ερυθροειδικών κυττάρων κατά τη διαφοροποίησή τους προς την ερυθρά σειρά 3.1 Μέθοδος αλληλούχισης RNA Η ανάπτυξη υψηλής απόδοσης μεθόδων αλληλούχισης του DNA οδήγησε σε μια νέα μέθοδο χαρτογράφησης και ποσοτικοποίησης του μεταγραφώματος ενός κυττάρου σε ένα συγκεκριμένο αναπτυξιακό στάδιο ή μια κατάσταση. Η μέθοδος αυτή ονομάζεται αλληλούχιση RNA (RNA sequencing) ή αλλιώς whole transcriptome shotgun sequencing (WTSS). Τα μεγάλου μήκους μόρια RNA μετατρέπονται σε μια cdna βιβλιοθήκη μικρότερων μορίων είτε μέσω κατάτμησης του RNA είτε μέσω κατάτμησης του cdna. Στο ένα ή και στα δύο άκρα των μορίων cdna προσδένονται μόριαπροσαρμογείς (adaptors) κι ακολουθεί αλληλούχιση αυτών είτε από το ένα είτε κι από 58

74 τα δύο άκρα με υψηλής απόδοσης τεχνικές. Οι αλληλουχίες που προκύπτουν ονομάζονται reads και το μέγεθός τους κυμαίνεται από bp ανάλογα με τη μέθοδο αλληλούχισης που χρησιμοποιείται. Ακολουθεί αντιστοίχιση αυτών των πολλών μικρών αλληλουχιών με μια μεγάλου μήκους αλληλουχία (γονιδίωμα αναφοράς ή μεταγράφωμα αναφοράς) και διάκρισή τους σε 3 τύπους: αλληλουχίες εξωνίων (exonic reads), αλληλουχίες του Poly-A άκρου (poly-a end reads) και αλληλουχίες συρραφής (junction reads) με τη βοήθεια ειδικών προγραμμάτων. Αυτοί οι τρεις τύποι αλληλουχιών χρησιμοποιούνται για την ανάλυση του προφίλ έκφρασης ενός γονιδίου (εικόνα 20) [135]. Εικόνα 20: Βασικά βήματα ενός πειράματος RNA-seq (προσαρμογή από Martin and Wang, 2011[136]) 59

75 3.2. Ιστοί των οποίων το μεταγραφικό προφίλ αναλύθηκε με τη μέθοδο RNA Seq Το προφίλ έκφρασης του γονιδίου VEGFA αλλά και γονιδίων που έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται σε μονοπάτια τα οποία σχετίζονται με τα επίπεδα της HbF, το μεταβολισμό της HU και τον πολλαπλασιασμό των ερυθροειδικών κυττάρων μελετήθηκε περαιτέρω κατά τη διαφοροποίηση των πρώιμων ερυθροειδικών κυττάρων δύο ιστών που εκφράζουν υψηλά επίπεδα HbF (πίνακας 4). Συγκεκριμένα, εμβρυϊκό ήπαρ και αίμα από ομφάλιο λώρο ανθρώπου συλλέχθησαν και προγονικά ερυθροειδικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν ex vivo. Κύτταρα BFU-Es (Burst-Formind Unit-Erythroid), CFU-Es (Colony-Forming Unit-Erythroid) κι ερυθροβλάστες απομονώθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS) με βάση την έκφραση των επιφανειακών κυτταρικών δεικτών CD71 και CD235A + (BFU-E CD71 low /CD235A -, CFU-E CD71 medium /CD235A - κι ερυθροβλάστες CD71 high /CD235A + ). Ακολούθησε απομόνωση RNA από τα παραπάνω κύτταρα κι αλληλούχιση αυτού με τη μέθοδο RNA-Seq (HiSeq2000, Illumina) [137]. Η αντιστοίχιση των αλληλουχιών (reads) με το γονιδίωμα αναφοράς έγινε με τη βοήθεια του αλγορίθμου TopHat και η οπτικοποίηση των δεδομένων με τη χρήση του λογισμικού custom R script [138]. Πίνακας 4: Ιστοί των οποίων το μεταγραφικό προφίλ μελετήθηκε με τη μέθοδο RNA-Seq Ιστός Αριθμός Δειγμάτων Εμβρυϊκό ήπαρ 1 Ομφαλοπλακουντικό αίμα 2 4. Μελέτη μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών του γονιδίου VEGFA ως φαρμακογονιδιωματικοί δείκτες 4.1. Δείγματα που αναλύθηκαν Η παρούσα μελέτη περιλαμβάνει τέσσερις διαφορετικές ομάδες ατόμων: Υγιή άτομα 60

76 Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία Ασθενείς διπλά ετερόζυγους για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία στους οποίους χορηγείται υδροξυουρία ως θεραπευτική αγωγή Οι διπλά ετερόζυγοι ασθενείς για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία διακρίνονται σε «ανταποκρινόμενους» και «μη ανταποκρινόμενους» με βάση τα επίπεδα της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης HbF μετά τη χορήγηση HU. Στην παρούσα μελέτη η διάκριση αυτή έγινε με βάση την τιμή plateau του % ποσοστού της HbF σε σχέση με τη συνολική αιμοσφαιρίνη στο αίμα τους μετά τη χορήγηση HU, με τους ανταποκρινόμενους να έχουν τιμή plateau πάνω από 20% ενώ οι «μη ανταποκρινόμενοι» κάτω από 20% [130]. Ο αριθμός των δειγμάτων για κάθε ομάδα φαίνεται στον πίνακα 5. Πίνακας 5: Αριθμός δειγμάτων για κάθε υπό μελέτη πληθυσμιακή ομάδα Ομάδα ατόμων Αριθμός Δειγμάτων Υγιή άτομα 115 Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία 19 Ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία 115 Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ανταποκρινόμενοι στην HU Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία μη ανταποκρινόμενοι στην HU Τα κλινικά και μοριακά δεδομένα όλων των παραπάνω ασθενών παρουσιάζονται αναλυτικά στους πίνακες 30, 31 και 32 του παραρτήματος [ ]. Όλα τα δείγματα προέρχονται από άτομα ελληνικής καταγωγής και συλλέχθησαν στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών (ΠΓΝΠ) και στο Πανεπιστημιακό 61

77 Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης (Α.ΧΕ.ΠΑ.). Στο σημείο αυτό να αναφέρουμε ότι η δειγματοληψία έγινε κατόπιν γραπτής συναίνεσης όλων των ατόμων που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη σύμφωνα με τις επιτροπές δεοντολογίας των αντίστοιχων ιδρυμάτων. 4.2 Απόμονωση γονιδιωματικού DNA από περιφερικό αίμα Για την απομόνωση γονιδιωματικού DNA από περιφερικό αίμα χρησιμοποιήθηκε το προτυποποιημένο σύστημα QIAamp Blood Midi Kit της εταιρείας Qiagen κι ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο Purification of DNA from Whole Blood using the Qiamp DNA Midi Kit (Spin Protocol) [143]. Σε περιβάλλον υψηλής ιοντικής ισχύος και χαμηλού ph το DNA προσδένεται σε στήλη πυριτίου. Σε αυτές τις συνθήκες, πρωτεΐνες καθώς και προσμίξεις που μπορούν να αναστείλουν την PCR κι άλλες ενζυμικές αντιδράσεις δεν προσκολλώνται στη μεμβράνη κι απομακρύνονται με το κατάλληλο διάλυμα έκπλυσης. Για την έκλουση του DNA από τη στήλη απαιτούνται οι αντίθετες συνθήκες (χαμηλή ιοντική ισχύς και υψηλό ph). 4.3 Ποσοτική και ποιοτική ανάλυση του DNA Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των δειγμάτων DNA έγινε με τη χρήση του Nanodrop, ενός φασματοφωτομέτρου πλήρους φάσματος ( nm). Το Nanodrop μας δίνει τη δυνατότητα να μετρήσουμε τη συγκέντρωση των νουκλεϊκών οξέων και όχι μόνο, με μεγάλη ακρίβεια κι επαναληψιμότητα χρησιμοποιώντας μικρή ποσότητα δείγματος (1μl). Η συσκευή αυτή αποτελείται από ένα βραχίονα ο οποίος φέρει μια ακίδα μέτρησης σε κάθε άκρο του. Η φωτομέτρηση για τα νουκλεϊκά οξέα πραγματοποιείται σε μήκος κύματος 260 nm. Από την τιμή της οπτικής απορρόφησης (O.D) το λογισμικό του συστήματος Nanodrop υπολογίζει αυτόματα τη συγκέντρωση του DNA. Ταυτόχρονα με τη συγκέντρωση όμως, δίνει κι άλλες μετρήσεις. Από αυτές πολύ σημαντικές είναι ο λόγος της απορρόφησης στα 260 nm προς την απορρόφηση στα 280 nm όπως και ο λόγος της απορρόφησης στα 260 nm προς την απορρόφηση στα 230 nm. Ο λόγος O.D 260nm /O.D 280nm αποτελεί ένδειξη της καθαρότητας του υπό εξέταση δείγματος όσον αφορά την ύπαρξη πρωτεϊνών σε αυτό καθώς οι πρωτεΐνες έχουν μέγιστο απορρόφησης στα 280 nm. Mια τιμή ~1,8 είναι ευρέως αποδεκτή για το καθαρό DNA. Ο λόγος O.D 260nm /O.D 230nm υποδηλώνει κι αυτός την καθαρότητα των 62

78 δειγμάτων και κυμαίνεται μεταξύ 2,0 και 2,2 για τα καθαρά νουκλεϊκά οξέα. Οποιαδήποτε τιμή αυτού αισθητά μικρότερη από την αναμενόμενη υποδηλώνει την παρουσία προσμίξεων που έχουν μέγιστο απορρόφησης στα 230 nm (π.χ EDTA, phenol). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ποιοτική ανάλυση των δειγμάτων DNA με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 0,8% w/v (κεφ.4.9). Από την εικόνα της ηλεκτροφόρησης μπορούμε να διακρίνουμε το μέγεθος (bp) του DNA καθώς κι αν είναι άθικτο ή αν έχει αποικοδομηθεί αφού το άθικτο DNA εμφανίζεται σαν μια συμπαγής ζώνη ενώ το αποικοδομημένο παρουσιάζει μια διάχυτη εικόνα (smear) Εύρεση tagsnps Σε μελέτες των οποίων στόχος είναι να συσχετίσουν SNPs ενός γονιδίου με μια ασθένεια ή με την απόκριση στη χορήγηση ενός φαρμάκου είναι πολύ σημαντικό να γνωρίζουμε την έκταση της ανισορροπίας σύνδεσης (linkage disequilibrium, LD) κατά μήκος του γονιδίου προκειμένου να ανιχνεύσουμε τα κρίσιμα SNPs, που πιθανά σχετίζονται με την ασθένεια. Όταν δύο γενετικοί τόποι δεν κληρονομούνται ο ένας ανεξάρτητα από τον άλλο τότε λέμε ότι βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης. Σε περιοχές με υψηλή ανισορροπία σύνδεσης περιορισμένος αριθμός SNPs χρειάζεται να γονοτυπηθεί καθώς η σύνδεσή τους με άλλους SNPs της περιοχής «προβλέπει» τους μη-γονοτυπημένους. Αυτή η μικρή ομάδα των SNPs που μελετώνται σε ευρείας κλίμακας μελέτες γονοτύπησης ονομάζονται tagsnps και συμπεριφέρονται ως αντιπρόσωποι πολλαπλών άλλων SNPs με τους οποίους βρίσκονται σε ισχυρή ανισορροπία σύνδεσης, με τους οποίους δηλαδή έχουν την τάση να συγκληρονομούνται. Αντίθετα οι περιοχές με μικρή ανισορροπία σύνδεσης πρέπει να μελετηθούν εκτενέστερα [144]. Για την εύρεση των tagsnps στο γονίδιο VEGFA χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο επιλογής tagsnp του Ιnternational HapMap Project (HapMap Genome Broswer release #27 (Phase 1, 2 & 3 merged genotypes & frequencies) ( [145, 146] καθώς και το εργαλείο SNAP (SNP Annotation and Proxy search) που φιλοξενείται στην ιστοσελίδα του «Broad Institute» ( [147]. 63

79 Η εύρεση των tagsnps αφορούσε τον Καυκάσιο πληθυσμό (CEU) στον οποίο ανήκει κι ο ελληνικός και πραγματοποιήθηκε με μια μέθοδο πολλαπλών δεικτών όπου ο έλεγχος της σύνδεσης μεταξύ των SNPs βασίζεται στο στατιστικό κριτήριο r 2. Στη συγκεκριμένη εργασία το r 2 ορίστηκε στο 0,8 (cut-off value) και η ελάσσων συχνότητα εμφάνισης αλληλομόρφου (Minor Allele Frequency, MAF) στο 0,2 (cutoff value). Η ανισορροπία σύνδεσης μεταξύ των τριών υπό μελέτη πολυμορφισμών του γονιδίου VEGFA οπτικοποιήθηκε με τη βοήθεια του εργαλείου LDmatrix της πλατφόρμας LDlink [148, 149] Πολυμορφισμοί στόχοι Από τους 4 tagsnps κατά μήκος του γονιδίου VEGFA, που προέκυψαν με βάση τις προαναφερθείσες τιμές r 2 και ΜΑF, μελετήθηκαν περαιτέρω οι πολυμορφισμοί rs , rs και rs10434 προκειμένου να διερευνηθεί η συσχέτισή τους με την κλινική εικόνα των ασθενών με β-θαλασσαιμία αλλά και με την απόκριση των διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών στη χορήγηση HU. Τα «χαρακτηριστικά» των προαναφερθέντων SNPs παρουσιάζονται στον πίνακα 6. Ο 4 ος tagsnp βρίσκεται σε LD με τους rs και rs και με κανέναν άλλο SNP, γι αυτό και δεν αναλύθηκε περαιτέρω. Πίνακας 6: Χαρακτηριστικά των πολυμορφισμών στόχων της παρούσας μελέτης SNP Χρωμοσωματική Θέση Αλλαγή Προγονικό αλληλόμορφο (wild type) Είδος Πολυμορφισμού (Consequence Type) rs : C>A C Ιντρονικός rs : G>A G Ιντρονικός rs : Α>G G Πολυμορφισμός που εντοπίζεται στην 3 UTR περιοχή/3 downstream περιοχή του γονιδίου 64

80 4.5 Σχεδιασμός εκκινητών Αφού επιλέχθησαν οι tagsnps που θα μελετηθούν, ακολούθησε ο σχεδιασμός των κατάλληλων εκκινητών με σκοπό την ενίσχυση/τον πολλαπλασιασμό, μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, ενός μέρους της αλληλουχίας του γονιδιώματος το οποίο περιέχει τον υπό ανάλυση πολυμορφισμό κάθε φορά. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: Εύρεση της ακριβούς θέσης του εκάστοτε πολυμορφισμού στο ανθρώπινο γονιδίωμα καθώς κι ενός μέρους της αλληλουχίας εκατέρωθεν αυτού μέσω της βάσης δεδομένων ensembl ( [150] Μεταφορά της παραπάνω αλληλουχίας στο πρόγραμμα Primer3 και καθορισμός συγκεκριμένων παραμέτρων των εκκινητών (μήκος, Tm, % σύσταση σε GC κλπ) ( [151] Οι εκκινητές πρέπει να έχουν μήκος νουκλεοτίδια και η διαφορά στο μήκος μεταξύ των δύο εκκινητών ενός ζεύγους δεν πρέπει να ξεπερνά τα 3 νουκλεοτίδια. Η θερμοκρασία υβριδοποίησής τους με την αλληλουχία-στόχο πρέπει να είναι παραπλήσια και να κυμαίνεται ιδανικά μεταξύ ο C. Η % σύσταση σε γουανίνη-κυτοσίνη (% GC content), η οποία καθορίζει και τη θερμοκρασία υβριδοποίησης αυτών, πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 40-60%. Λήψη 5 προτεινόμενων ζευγών εκκινητών από το πρόγραμμα Primer3 Έλεγχος κάθε εκκινητή ξεχωριστά για την ειδικότητά του ως προς την αλληλουχία-στόχο στο DNA μέσω του εργαλείου BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) του ensembl ( [152] Ιδανικοί θεωρούνται οι εκκινητές οι οποίοι είναι ειδικοί μόνο ως προς την αλληλουχία-στόχο. Έλεγχος της συμπληρωματικότητας μεταξύ των δύο εκκινητών κάθε ζεύγους αλλά και με τον εαυτό τους (αυτοσυμπληρωματικότητα) με τη βοήθεια του προγράμματος DNAMAN Στόχος είναι η αποφυγή δημιουργίας διμερών (primer-dimers) τα οποία είναι πιο εύκολο να πολυμεριστούν σε σχέση με το επιθυμητό προϊόν καταναλώνοντας αντιδραστήρια και μειώνοντας με αυτό τον τρόπο την απόδοση της αντίδρασης. 65

81 Έλεγχος της δημιουργίας δευτεροταγών δομών (λούπες) στο PCR προϊόν που προκύπτει από κάθε ζεύγος εκκινητών μέσω του προγράμματος DINAMelt ( ) [153] Κυρίως θέλουμε να αποφύγουμε τις δευτεροταγείς δομές στις θέσεις όπου προσδένονται οι εκκινητές, αλλά και προϊόντα με πολύπλοκες δευτεροταγείς δομές. Επιλογή του καταλληλότερου ζεύγους εκκινητών για κάθε πολυμορφισμό 4.6 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Μελέτη του πολυμορφισμού rs Για τη γονοτύπηση των δειγμάτων ως προς τον πολυμορφισμό rs πραγματοποιήθηκε ενίσχυση της αλληλουχίας που τον περιέχει με την απλή μέθοδο PCR [154], ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης (κεφ. 4.9) προκειμένου να επιβεβαιώσουμε ότι παίρνουμε μόνο το επιθυμητό προϊόν, καθαρισμός αυτών (κεφ. 10) κι αλληλούχιση κατά Sanger (κεφ. 11). 4.7 Touchdown PCR Μελέτη του πολυμορφισμού rs10434 Στην περίπτωση του πολυμορφισμού rs10434 ο πολυμερισμός της αλληλουχίας εκατέρωθεν αυτού πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της Τouchdown PCR [155]. Μετά το τέλος της αντίδρασης πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης (κεφ. 4.9) προκειμένου να επιβεβαιώσουμε ότι παίρνουμε μόνο το επιθυμητό προϊόν, καθαρισμός αυτών (κεφ. 10) κι αλληλούχιση κατά Sanger (κεφ. 11). 4.8 Αllele Specific PCR Η Allele Specific PCR (AS-PCR) αποτελεί μια γρήγορη και χαμηλού κόστους μέθοδο η οποία μας επιτρέπει ταυτόχρονα με την ενίσχυση και τον προσδιορισμό του γονοτύπου. Βασίζεται στην αδυναμία ζευγαρώματος του τελευταίου νουκλεοτιδίου στο 3 άκρο του ευθύ ή του ανάστροφου εκκινητή με την αλληλουχία-στόχο εμποδίζοντας έτσι την επιμήκυνσή του από την DNA πολυμεράση. H DNA πολυμέραση δε μπορεί να δράσει ως 3' 5' εξωνουκλεάση και έτσι δε μπορεί να 66

82 απομακρύνει το λανθασμένο νουκλεοτίδιο. Για την αποτελεσματική απόδοση της αντίδρασης είναι απαραίτητη η πλήρης συμφωνία μεταξύ του 3' άκρου του εκκινητή και της αλληλουχίας-στόχου. Για την πραγματοποίηση της AS-PCR απαιτούνται τρεις εκκινητές, ένας ευθύς (forward, F) και δύο ανάστροφοι (reverse, R) ή δύο ευθείς κι ένας ανάστροφος. Η μοναδική διαφορά μεταξύ των δύο F ή των δύο R εκκινητών είναι το τελευταίο νουκλεοτίδιο στο 3' άκρο τους το οποίο είναι συμπληρωματικό με το ένα εκ των δύο αλληλομόρφων του πολυμορφισμού που μελετάται. Η υπόλοιπη αλληλουχία είναι ακριβώς η ίδια. Για κάθε δείγμα πραγματοποιούνται δύο αντιδράσεις. Η μία περιλαμβάνει τον κοινό εκκινητή και τον εκκινητή που το 3' άκρο του είναι συμπληρωματικό για το προγονικό αλληλόμορφο και η δεύτερη τον κοινό εκκινητή και τον εκκινητή που είναι συμπληρωματικός για το «μεταλλαγμένο» αλληλόμορφο (εικόνα 21). Ανάλογα με το σε ποια αντίδραση θα παραχθεί προϊόν ή αν θα παραχθεί και στις δύο προσδιορίζεται ο γονότυπος του δείγματος [156]. Εικόνα 21: Αρχή της Allele Specific-PCR (προσαρμογή από 67

83 4.8.1 Μελέτη του πολυμορφισμού rs H γονοτύπηση των δειγμάτων για τον πολυμορφισμό rs πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της AS-PCR. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ένας ευθύς και δύο ανάστροφοι εκκινητές. Οι ανάστροφοι εκκινητές σχεδιάστηκαν με τέτοιο τρόπο ώστε το τελευταίο νουκλεοτίδιο στο 3 άκρο τους να συμπληρωματικό για τα αλληλόμορφα G και A. Μετά το τέλος της αντίδρασης πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης (κεφ. 4.9) προκειμένου να προσδιοριστεί ο γονότυπος κάθε δείγματος. Για την προτύπωση της AS-PCR πραγματοποιήθηκε γονοτύπηση 10 δειγμάτων με μέθοδο αλληλούχισης κατά Sanger. Παράλληλα με τα υπό μελέτη δείγματα σε κάθε πείραμα συμπεριλαμβάνονταν 2 δείγματα, των οποίων ο γονότυπος ήταν γνωστός μέσω της αλληλούχισης κατά Sanger, ως θετικοί μάρτυρες προκειμένου να εξασφαλίσουμε την ακρίβεια της μεθόδου και των συνθηκών αυτής με βάση την επαναληψιμότητά της. Για την αντίδραση της PCR χρησιμοποιήθηκε το προτυποποιημένο σύστημα (kit) KAPA2G Fast HotStart Ready Mix (KΚ5601) της εταιρείας KAPA BIOSYSTEMS. Το σύστημα αυτό περιέχει όλα τα αντιδραστήρια που είναι απαραίτητα, εκτός από τους εκκινητές και το DNA. Συγκεκριμένα περιέχει την DNA πολυμεράση, δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps 0.2mM), MgCl 2 (1.5 mm) το οποίο ενισχύει τη δράση της πολυμεράσης και την πρόσδεση των εκκινητών στην αλληλουχία-στόχο καθώς και το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα που εξασφαλίζει το επιθυμητό περιβάλλον για τη δράση της πολυμεράσης (ph, αλατότητα). Οι αντιδράσεις της PCR πραγματοποιήθηκαν σε αποστειρωμένα σωληνάκια χωρητικότητας 200 μl (PCR tubes, Κisker). Για την προετοιμασία αυτών χρησιμοποιήθηκαν αποστειρωμένα ακρορύγχια με φίλτρο (filter tips) με σκοπό την αποφυγή επιμολύνσεων. Καθώς η αποφυγή των επιμολύνσεων είναι μια πολύ σημαντική παράμετρος που πρέπει να λάβουμε υπόψη μας κατά τη διάρκεια των αντιδράσεων της PCR, οι αντιδράσεις ετοιμάζονται σε χώρο απομακρυσμένο από το χώρο διαχείρισης των PCR προϊόντων (3 room rule). Επιπλέον, ο εργαστηριακός πάγκος στον οποίο προετοιμάζονται οι αντιδράσεις καθαρίζεται με διάλυμα DNA-OFF (Takara). 68

84 Οι εκκινητές, η στοιχειομετρία καθώς και οι συνθήκες της αντίδρασης για κάθε έναν από τους παραπάνω πολυμορφισμούς φαίνονται στους πίνακες του παραρτήματος. Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε θερμικούς κυκλοποιητές της εταιρείας Biorad και Kyratec. 4.9 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Πρόκειται για μια επαρκή κι αποτελεσματική μέθοδο για το διαχωρισμό, το χαρακτηρισμό και την απομόνωση μορίων DNA ποικίλων μεγεθών (από 100bp έως 25kb) [157]. Υλικά: Αγαρόζη (NIPPON GENETICS) Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης 1x TAE Διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων 6x orange G Βρωμιούχο αιθίδιο (Applichem) 10mg/ml Μάρτυρας μοριακών μεγεθών βήματος 100bp (NIPPON GENETICS) Ανάλογα με το μέγεθος των μορίων DNA και το σκοπό χρήσης του, το πήκτωμα έχει διαφορετική περιεκτικότητα σε αγαρόζη. Για την ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε πήκτωμα περιεκτικότητας σε αγαρόζη 1,5 % w/v. Διαδικασία: Διαλυτοποίηση με θέρμανση συγκεκριμένης ποσότητας αγαρόζης σε διάλυμα 1x TAE Προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου πριν πολυμεριστεί η αγαρόζη Μεταφορά του πηκτώματος σε ειδική μήτρα στην οποία έχει τοποθετηθεί ειδική «χτένα» ώστε να δημιουργηθούν τα κατάλληλα πηγαδάκια στα οποία τοποθετούνται τα δείγματα Τοποθέτηση του πηκτώματος, αφού πολυμεριστεί, στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Προσθήκη διαλύματος 1x TAE στη συσκευή 69

85 Προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας διαλύματος 6x Orange G στα δείγματα Μεταφορά των δειγμάτων στο πήκτωμα Εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου τάσης 85V για 40 λεπτά Παρατήρηση του πηκτώματος σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας 4.10 Καθαρισμός PCR προϊόντων Για τον καθαρισμό των PCR προϊόντων χρησιμοποιήθηκε το προτυποποιημένο σύστημα αντιδραστηρίων NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit της εταιρείας Macherey-Nagel κι ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο PCR clean up [158]. Σκοπός είναι να απομακρυνθούν υπολείμματα εκκινητών, δεοξυριβονουκλεοτιδίων, ρυθμιστικού διαλύματος, PCR ενισχυτών (DMSO, betaine) καθώς και διμερή εκκινητών τα οποία μπορούν να παρεμποδίσουν την ενζυμική αντίδραση αλληλούχισης κατά Sanger. Παρουσία χαοτροπικών αλάτων το DNA δεσμεύεται στη μεμβράνη της στήλης NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Column. Τα προαναφερθέντα «υπολείμματα» απομακρύνονται με τη βοήθεια διαλύματος που περιέχει αιθανόλη. Τέλος, το καθαρό DNA εκλούεται κάτω από συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης άλατων και υψηλού ph Αλληλούχιση κατά Sanger Η ενζυμική μέθοδος αλληλούχισης κατά Sanger (Sanger, 1977) βασίζεται στη χρήση τριφωσφορικών 2, 3 -διδεοξυνουκλεοτιδίων (ddntp) που οδηγούν σε τερματισμό της επιμήκυνσης της αλυσίδας του DNA γι αυτό κι αλλιώς ονομάζεται μέθοδος τερματισμού αλυσίδας (chain termination). Πρόκειται για νουκλεοτίδια τα οποία δεν διαθέτουν την 3 -ΟΗ ομάδα τους με αποτέλεσμα να μην μπορούν να σχηματίσουν φωσφοδιεστερικό δεσμό με το επόμενο δεοξυριβονουκλεοτίδιo. Έτσι, η επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας DNA τερματίζεται κάθε φορά που ένα τροποποιημένο νουκλεοτίδιο ενσωματώνεται σε αυτή [159]. Στις σύγχρονες μεθόδους αλληλούχισης πραγματοποιείται μια μόνο αντίδραση όπου και τα τέσσερα ddntps είναι σημασμένα με διαφορετική φθορίζουσα χρωστική το καθένα. Το προϊόντα της αντίδρασης διαχωρίζονται σε ένα ειδικό τριχοειδές πήκτωμα (capillary electrophoresis) ανάλογα με το μέγεθός τους όπως και πριν. Στο κάτω μέρος του πηκτώματος υπάρχει μια συσκευή laser η οποία διεγείρει τις φθορίζουσες χρωστικές και η ακτινοβολία που εκπέμπουν καταγράφεται. Η 70

86 αλληλουχία του DNA αποδίδεται ως μια σειρά από έγχρωμες κορυφές με κάθε χρώμα να αντιστοιχεί σε ένα συγκεκριμένο νουκλεοτίδιο (εικόνα 22) [159]. Εικόνα 22: Χρωματογράφημα αλληλούχισης κατά Sanger. Οι τέσσερις βάσεις του DNA απεικονίζονται με διαφορετικό χρώμα (προσαρμογή από ) Η ανάλυση του συνόλου των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Παθολογίας στο Πανεπιστήμιο των Ηνωμένων Αραβικών Εμιράτων από την κυρία Anne John (υπό την φροντίδα του Καθηγητή Μοριακής και Γενετικής Ιατρικής Bassam R. Ali) με τη χρήση του προτυποποιημένου συστήματος Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit της εταιρείας Applied Biosystems Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων γονοτύπησης Για την αξιολόγηση των πειραματικών αποτελεσμάτων και την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων για τον αν οι διαφορές στις συχνότητες των γονοτύπων μεταξύ των διαφορετικών ομάδων ατόμων είναι σημαντικές, πραγματοποιήθηκε στατιστική επεξεργασία αυτών. Αρχικά, διερευνήθηκε αν οι υπό μελέτη πληθυσμιακές ομάδες ικανοποιούν το νόμο Hardy-Weinberg. Εφόσον ικανοποιείται ο νόμος αυτός ακολούθησε περαιτέρω στατιστική ανάλυση των δεδομένων με τον ακριβή έλεγχο του Fisher. 71

87 Ισορροπία Hardy Weinberg Το 1908 ο Άγγλος μαθηματικός Hardy κι ο Γερμανός γιατρός Weinberg διατύπωσαν ανεξάρτητα ο ένας από τον άλλο την παρακάτω θεωρία: «Σε ένα μεγάλο κλειστό πληθυσμό χωρίς μεταναστεύσεις ή εισροές, όπου οι συζεύξεις είναι τυχαίες και δεν συμβαίνει ούτε μετάλλαξη ούτε επιλογή, οι συχνότητες των αλληλομόρφων και των γονοτύπων παραμένουν σταθερές από γενεά σε γενεά». Η πρόταση αυτή είναι γνωστή ως «νόμος Ηardy-Weinberg». Αν p η συχνότητα του ενός αλληλομόρφου και q η συχνότητα του άλλου τότε οι συχνότητες των τριών γονοτύπων δίνονται από το ανάπτυγμα του παρακάτω διωνύμου (p+q) 2 =p 2 +2pq+q 2 όπου p 2 η συχνότητα του ομοζυγώτη για το ένα αλληλόμορφο, 2pq η συχνότητα του ετεροζυγώτη και q 2 η συχνότητα του ομοζυγώτη για το άλλο αλληλόμορφο. Προκειμένου να διαπιστωθεί αν οι επιμέρους ομάδες ατόμων που μελετώνται ικανοποιούν την ισορροπία Hardy-Weinberg χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικά τεστ τα οποία δίνουν το διάγραμμα του Finetti [160] Ακριβής έλεγχος του Fisher Για τις πληθυσμιακές ομάδες που βρίσκονται σε ισορροπία Ηardy-Weinberg ακολούθησε περαιτέρω στατιστική ανάλυση με τον ακριβή έλεγχο του Fisher προκειμένου να διαπιστωθεί αν υπάρχει ή όχι στατιστικά σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στον εκάστοτε πολυμορφισμό και στις υπό μελέτη ομάδες ατόμων. Ο ακριβής έλεγχος του Fisher μας επιτρέπει να υπολογίσουμε με ακρίβεια την πιθανότητα p σε περίπτωση που το πληθυσμιακό μας δείγμα είναι μικρό. Ο υπολογισμός αυτής έγινε με τη βοήθεια του υπολογιστικού προγράμματος [161] χρησιμοποιώντας πίνακες της μορφής 3x2 και 2x In silico πρόβλεψη της επίπτωσης των υπό μελέτη πολυμορφισμών στην παραγόμενη πρωτεΐνη Προκειμένου να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις που έχουν οι υπό μελέτη πολυμορφισμοί της παρούσας εργασίας στην παραγόμενη πρωτεΐνη και πιο συγκεκριμένα αν επηρεάζουν τη θέση συναρμογής χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο Human Splicing Finder που φιλοξενείται στην ιστοσελίδα του RD-connect [162]. 72

88 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 73

89 1. Μελέτη της διαφορικής μοριακής υπογραφής τριών αιμοποιητικών ιστών κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης οντογένεσης Σε προηγούμενες μελέτες έχει βρεθεί ότι πολυμορφικές θέσεις γονιδίων τα οποία βρίσκονται εκτός του συμπλέγματος των β-σφαιρινών ενδεχομένως να σχετίζονται με την πιο ήπια κλινική εικόνα που παρουσιάζουν οι ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία σε σχέση με τους ασθενείς που πάσχουν από μείζονα β- θαλασσαιμία καθώς επίσης και με την απόκριση των διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών στη χορήγηση ΗU. Προκειμένου να καταστεί δυνατός ο εντοπισμός γονιδίων τα οποία δεν έχουν μελετηθεί έως τώρα και των οποίων η έκφραση διαφοροποιείται καθώς η ερυθροποίηση και κατά συνέπεια η έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων μετατοπίζεται από το ένα όργανο στο άλλο, μελετήθηκε το μεταγραφικό προφίλ τριών αιμοποιητικών ιστών κατά την οντογένση του ανθρώπου με τη μέθοδο των DNA-μικροσυστοιχιών. Η μελέτη της μοριακής υπογραφής των προγονικών ερυθροειδικών κυττάρων των τριών αυτών ιστών περιλαμβάνει τρεις ομάδες σύγκρισης: α) περιφερικό αίμα ενήλικου ατόμου έναντι ομφαλοπλακουντικού αίματος, β) περιφερικό αίμα ενήλικου ατόμου έναντι εμβρυϊκού ήπατος και γ) περιφερικό αίμα ενήλικου ατόμου έναντι ομφαλοπλακουντικού αίματος κι εμβρυϊκού ήπατος. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης παρουσιάζονται στα παρακάτω χρωμοδιαγράμματα (heat maps). Τα χρωμοδιαγράμματα περιλαμβάνουν μόνο τα γονίδια τα οποία έχουν p value < 0, 05 των οποίων η έκφραση διαφοροποιείται σημαντικά μεταξύ των ομάδων σύγκρισης. Κάθε γραμμή του χρωμοδιαγράμματος αντιστοιχεί σε διαφορετική ομάδα ανιχνευτών ενώ κάθε στήλη αντιστοιχεί σε διαφορετικό δείγμα. Η διακύμανση των χρωματικών αλλαγών από το κόκκινο προς το πράσινο αντιπροσωπεύει τη διαφορική έκφραση των γονιδίων. Πιο αναλυτικά, το έντονο κόκκινο χρώμα αντιπροσωπεύει τη μέγιστη τιμή υπερέκφρασης ή αλλιώς τη μεγαλύτερη τιμή διαφορικής έκφρασης. Καθώς μετακινούμαστε σε πιο σκούρες αποχρώσεις του κόκκινου μέχρι το μαύρο που αντιστοιχεί σε μηδενική διαφορική έκφραση, η διαφορική έκφραση μειώνεται. Το έντονο πράσινο χρώμα αντιστοιχεί στη μέγιστη τιμή υποέκφρασης ή αλλιώς στη χαμηλότερη τιμή διαφορικής έκφρασης. 74

90 Στην εικόνα 23 παρουσιάζεται το χρωμοδιάγραμμα της διαφορικής έκφρασης 133 γονιδίων (που αντιστοιχούν σε 165 probe sets) μεταξύ περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου κι ομφαλοπλακουντικού αίματος. Όπως βλέπουμε γονίδια τα οποία υπερεκφράζονται στον ένα ιστό υποεκφράζονται στον άλλο και το αντίστροφο. Εικόνα 23: Χρωμοδιάγραμμα διαφορικής έκφρασης γονιδίων μεταξύ HEPs περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου και HEPs ομφαλοπλακουντικού αίματος Στην εικόνα 24 παρουσιάζεται το χρωμοδιάγραμμα της διαφορικής έκφρασης 898 γονιδίων (1239 probe sets) κατά τη σύγκριση περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου με το εμβρυϊκό ήπαρ. Κι εδώ γονίδια τα οποία υπερεκφράζονται στον ένα ιστό υποεκφράζονται στον άλλο και το αντίστροφο. 75

91 Εικόνα 24: Χρωμοδιάγραμμα διαφορικής έκφρασης γονιδίων μεταξύ HEPs περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου και HEPs εμβρυϊκού ήπατος. Τέλος, ακολουθεί το χρωμοδιάγραμμα της διαφορικής έκφρασης 264 γονιδίων (348 probe sets) κατά τη σύγκριση του περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου με το ομφαλοπλακουντικό αίμα και το εμβρυϊκό ήπαρ δηλαδή μεταξύ ιστών με χαμηλά και υψηλά επίπεδα της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, HbF αντίστοιχα (εικόνα 25). 76

92 Εικόνα 25: Χρωμοδιάγραμμα διαφορικής έκφρασης γονιδίων μεταξύ ΗΕPs ιστών που εκφράζουν υψηλά και ιστών που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα HbF. Γονίδια τα οποία υπερκεφράζονται στον έναν ιστό υποεκφράζονται στον άλλο και το αντίθετο, όπως συμβαίνει και στα υπόλοιπα χρωμοδιαγράμματα. Επίσης, παρατηρούμε ότι το πρότυπο έκφρασης ενός δείγματος ομφαλοπλακουντικού αίματος διαφοροποιείται από τα υπόλοιπα. Το δείγμα αυτό δεν συμπεριελήφθη περαιτέρω στην ανάλυση των αποτελεσμάτων μας. Από τη μελέτη και των τριών χρωμοδιαγραμμάτων προκύπτει ότι ο αριθμός των γονιδίων των οποίων η έκφραση διαφοροποιείται είναι μεγαλύτερος μεταξύ των δύο πιο μακρινών οντογενετικά ιστών (περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου κι εμβρυϊκού ήπατος). 77

93 2. Επιλογή του γονιδίου VEGFA Με τη βοήθεια της βάσης δεδομένων STRING και του εργαλείου GeneΜΑΝΙΑ διερευνήθηκε πώς τα γονίδια των οποίων η έκφραση διαφοροποιείται σημαντικά μεταξύ των διαφορετικών ομάδων σύγκρισης μπορεί να συνδέονται μεταξύ τους καθώς κι αν σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα (μέσω της συνδεσής τους με άλλα γονίδια) είτε με την ερυθροποίηση είτε με τις αιμοσφαιρινοπάθειες καταλήγοντας σε μια λίστα 95 γονιδίων. Από αυτά επιλέγη να μελετηθεί εκτενέστερα το γονίδιο VEGFA με βάση κυρίως βιβλιογραφικά δεδομένα τα οποία κι αναφέρονται λεπτομερώς στη συζήτηση. Στον ακόλουθο πίνακα παρουσιάζεται η τιμή της ποσοστιαίας μεταβολής της έκφρασης του εν λόγω γονιδίου μεταξύ των HEPs των διαφορετικών ομάδων σύγκρισης όπως προέκυψε από την ανάλυση του μεταγραφικού προφίλ αυτών με τη μέθοδο των DNA μικροσυστοιχιών. Πίνακας 7: Ποσοστιαία μεταβολή της έκφρασης του γονιδίου VEGFA κατά την ανθρώπινη οντογένεση Ομάδες Σύγκρισης Ανιχνευτές (probe sets) Ποσοστιαία μεταβολή (Fold Change) HEPs περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου με ΗΕPs εμβρυϊκό ήπαρ _x_at 5, _s_at 4, _s_at 4, _x_at 3,369 HEPs περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου με ΗΕPs ομφαλοπλακουντικού αίματος +εμβρυϊκό ήπατος _x_at 2, _s_at 2,8661 Στο σημείο αυτό να αναφέρουμε ότι κάθε ομάδα ανιχνευτών (probe set) περιλαμβάνει 11 ανιχνευτές που αναγνωρίζουν 8 εναλλακτικά μετάγραφα του γονιδίου VEGFA. Από τη μελέτη του παραπάνω πίνακα προκύπτει ότι: το γονίδιο VEGFA υπερεκφράζεται στα HEPs περιφερικoύ αίματος ενήλικου ατόμου σε σχέση με αυτά του εμβρυϊκού ήπατος 78

94 το γονίδιο VEGFA υπερεκφράζεται στα HEPs περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου σε σχέση με αυτά του ομφαλοπλακουντικού αίματος μαζί με του εμβρυϊκού ήπατος Μεταξύ των HEP περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου κι αυτών του ομφαλοπλακουντικού αίματος δεν παρατηρείται σημαντική διαφορά στην έκφραση του γονιδίου VEGFA. 3. Μελέτη του μεταγραφικού προφίλ των ερυθροειδικών κυττάρων κατά τη διαφοροποίησή τους προς την ερυθρά σειρά Το μεταγραφικό προφίλ των πρώιμων ερυθροειδικών κυττάρων αίματος από ομφάλιο λώρο κι εμβρυϊκό ήπαρ ανθρώπου κατά τη διαφοροποίησή τους σε ερυθροβλάστες διερευνήθηκε περαιτέρω με τη μέθοδο αλληλούχισης του RNA (RNA-Seq). Η εν λόγω ανάλυση περιλαμβάνει δύο ομάδες σύγκρισης: α) BFU-Es έναντι CFU-Es και β) CFU-Es έναντι ερυθροβλαστών. Στο χρωμοδιάγραμμα που ακολουθεί παρουσιάζεται η διαφορική έκφραση του γονιδίου VEGFA αλλά και γονιδίων που έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται σε μονοπάτια τα οποία σχετίζονται με τα επίπεδα της HbF, το μεταβολισμό της HU και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων της ερυθράς σειράς, μεταξύ των προαναφερθέντων ομάδων σύγκρισης (εικόνα 26). Κάθε γραμμή του χρωμοδιαγράμματος αντιστοιχεί σε διαφορετικό γονίδιο ενώ κάθε στήλη αντιστοιχεί στις δύο ομάδες σύγκρισης στους δύο υπό μελέτη ιστούς. Η διακύμανση των χρωματικών αλλαγών από το κόκκινο προς το πράσινο αντιπροσωπεύει τη διαφορική έκφραση των γονιδίων. Πιο αναλυτικά, το έντονο πράσινο χρώμα αντιπροσωπεύει τη μέγιστη τιμή υπερέκφρασης ή αλλιώς τη μεγαλύτερη τιμή διαφορικής έκφρασης. Καθώς μετακινούμαστε σε πιο σκούρες αποχρώσεις του πράσινου μέχρι το μαύρο που αντιστοιχεί σε μηδενική διαφορική έκφραση, η διαφορική έκφραση μειώνεται. Το έντονο κόκκινο χρώμα αντιστοιχεί στη μέγιστη τιμή υποέκφρασης ή αλλιώς στη χαμηλότερη τιμή διαφορικής έκφρασης. 79

95 Εικόνα 26: Χρωμοδιάγραμμα διαφορικής έκφρασης γονιδίων κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων της ερυθράς σειράς Αυτό που είναι ενδιαφέρον είναι ότι γονίδια τα οποία υπερεκφράζονται στη μια ομάδα σύγκρισης υποεκφράζονται στην άλλη και το αντίθετο. Επίσης, η διαφορική έκφραση των γονιδίων παρουσιάζει το ίδιο πρότυπο ανάμεσα στους δύο ιστούς και για τις δύο ομάδες σύγκρισης. Για παράδειγμα, τα γονίδια τα οποία υπερεκφράζονται στα BFU-E σε σύγκριση με τα CFU-E στο ομφαλοπλακουντικό αίμα υπερκεφράζονται και στα BFU-E συγκριτικά με τα CFU-E του εμβρυϊκού ήπατος. Το ίδιο παρατηρείται και για τη δεύτερη ομάδα σύγκρισης και των δύο υπό μελέτη ιστών. 80

96 Όσον αφορά την έκφραση του γονιδίου VEGFA όπως προκύπτει από τον πίνακα 8 το συγκεκριμένο γονίδιο υπερεκφράζεται στα BFU-E σε σύγκριση με τους ερυθροβλάστες και στους δύο ιστούς με υψηλότερα επίπεδα διαφορικής έκφρασης σε αίμα από ομφάλιο λώρο σε σύγκριση με το εμβρυϊκό ήπαρ. Συγκεκριμένα, στο εμβρυϊκό ήπαρ η τιμή log2 fold-change είναι μικρότερη από 0,6 κι επομένως δεν παρουσιάζει σημαντική διαφορική έκφραση μεταξύ CFU-E κι ερυθροβλαστών ενώ οριακά υπερεκφράζεται στα BFU-E κύτταρα σε σχέση με τα CFU-E. Πίνακας 8: Ποσοστιαία μεταβολή της έκφρασης του γονιδίου VEGFA κατά τη διαφοροποίηση των ερυθροειδικών κυττάρων ανθρώπου Ομάδες Σύγκρισης log2 fold-change Αίμα από Εμβρυϊκό ήπαρ Ομφάλιο λώρο BFU-E έναντι CFU-E +1,66 +0,6 CFU-E έναντι ερυθροβλαστών +1,28-0,48 Επομένως, στους ιστούς που εκφράζουν υψηλά επίπεδα HbF, η έκφραση του γονιδίου VEGFA φαίνεται να μειώνεται καθώς προχωρά η διαφοροποίηση των πρώιμων ερυθροειδικών κυττάρων στις πιο ώριμες μορφές αυτών. 4. Μελέτη μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών του γονιδίου VEGFA ως τροποποιητών της κλινικής εικόνας ασθενών με β θαλασσαιμία αλλά κι ως φαρμακογονιδιωματικών δεικτών Τέλος, στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση των πολυμορφισμών rs , rs10434 και rs του γονιδίου VEGFA αφενός με τα αυξημένα επίπεδα HbF των ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία κι επομένως με την πιο ήπια κλινική εικόνα αυτών σε σχέση με τους ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία κι αφετέρου με την απόκριση ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία στη χορήγηση HU ως φαρμακευτική αγωγή. Απώτερος σκοπός ήταν ο εντοπισμός πολυμορφισμών οι οποίοι είναι ενδεικτικοί για τη βαρύτητα των κλινικών συμπτωμάτων της νόσου αλλά και 81

97 πολυμορφισμών οι οποίοι θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως φαρμακογονιδιωματικοί βιοδείκτες. Στα κεφάλαια που ακολουθούν περιγράφονται αναλυτικά τα αποτελέσματα για κάθε έναν από τους παραπάνω πολυμορφισμούς. 4.1 Μελέτη του πολυμορφισμού rs Η γονοτύπηση των δειγμάτων για τον πολυμορφισμό rs πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο αλληλούχισης κατά Sanger. Ακολουθούν μια ενδεικτική εικόνα ηλεκτροφόρησης των PCR προϊόντων που εμπεριέχουν τον υπό μελέτη πολυμορφισμό καθώς κι ένα ενδεικτικό χρωματογράφημα από την αλληλούχιση κατά Sanger τριών δειγμάτων τα οποία έχουν διαφορετικό γονότυπο (εικόνες 27 και 28 αντίστοιχα). Εικόνα 27: Ενδεικτική ανάλυση PCR προϊόντων μεγέθους 341bp που εμπεριέχουν τον SNP rs σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% w/v. Μ: μάρτυρας μοριακών μεγεθών βήματος 100bp, και Τ: αρνητικός μάρτυρας 82

98 (Α) (Β) (Γ) Εικόνα 28: Ενδεικτικό χρωματογράφημα ατόμων με διαφορετικό γονότυπο ως προς τον SNP rs (C>A). (Α) ομόζυγο άτομο για το C αλληλόμορφο (C/C) (B) ετερόζυγο άτομο (C/A) και (Γ) ομόζυγο άτομο για το Α αλληλόμορφο (Α/Α) 83

99 4.1.1 Συσχέτιση με την κλινική εικόνα της νόσου Στους πίνακες 9 και 10 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την γονοτύπηση υγιών ατόμων, ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία ως προς τον SNP rs Στην πρώτη στήλη αναφέρεται η ομάδα μελέτης, στη δεύτερη ο αριθμός των δειγμάτων και στις υπόλοιπες στήλες οι % συχνότητες των τριών γονοτύπων (πίνακας 9) ή των δύο αλληλομόρφων (πίνακας 10). Πίνακας 9: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία Ομάδες ατόμων Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Γονοτύπων rs C>A C/C C/A A/A Υγιή άτομα Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία Πίνακας 10: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία Ομάδες ατόμων Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Αλληλομόρφων rs C>A C A Υγιή άτομα Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία Όπως φαίνεται στον πίνακα 10 υπάρχει μια απόκλιση από τις συχνότητες των αλληλομόρφων που δίνονται στη βάση δεδομένων ensembl για τον Καυκάσιο πληθυσμό (C:67% και Α: 33%). Μια πιθανότητα για αυτή τη διαφορά είναι να 84

100 οφείλεται είτε στη μελέτη μικρού αριθμού δειγμάτων είτε λόγω της αποκλειστικής μελέτης δειγμάτων που ανήκουν στον ελληνικό πληθυσμό. Αφού διερευνήθηκε αν οι παραπάνω πληθυσμιακές ομάδες ικανοποιούν το νόμο Hardy-Weinberg, και βρέθηκε ότι όντως οι πληθυσμοί βρίσκονται σε ισορροπία στη συνέχεια ακολούθησε στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων με τον ακριβή έλεγχο του Fisher. Τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης φαίνονται στην πίνακα 11. Με βάση τις τιμές p που αναγράφονται στον πίνακα προκύπτει ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα των γονοτύπων μεταξύ και των τριών ομάδων σύγκρισης. Πίνακας 11:Στατιστική ανάλυση της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον rs μεταξύ υγιών ατόμων, ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία κι ασθενών με μείζονα β- θαλασσαιμία Ομάδες Σύγκρισης p value Υγιή άτομα- Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία 0,00047** Υγιή άτομα-ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία 0,003* Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία- Ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία 0,0086* *p<0,05, **p<0,001 Στην εικόνα 29, η οποία προέρχεται από τον πίνακα 9 παρουσιάζεται το ιστόγραμμα της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων C/C, C/A και A/A στην εκάστοτε ομάδα ατόμων. Από τη μελέτη αυτού προκύπτει ότι ο ομόζυγος γονότυπος για το σπάνιο αλληλόμορφο (Α/Α) παρουσιάζει μεγαλύτερη συχνότητα στους ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία σε σχέση με τους ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία γεγονός που πιθανόν υποδηλώνει ότι η παρουσία του πολυμορφισμού rs σχετίζεται σημαντικά με τα αυξημένα επίπεδα HbF στους ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και συνεπώς με τον ηπιότερο φαινότυπο αυτών. 85

101 70 % Συχνότητα γονοτύπων C/C C/A A/A 0 Υγιή άτομα Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία Εικόνα 29: Ιστόγραμμα της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία Συσχέτιση με την απόκριση διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία ασθενών στη χορήγηση HU Όπως ήδη έχει αναφερθεί η διάκριση των διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών σε ανταποκρινόμενους και μη ανταποκρινόμενους έγινε με βάση την τιμή plateau του % ποσοστού της HbF σε σχέση με τη συνολική αιμοσφαιρίνη στο αίμα τους μετά τη χορήγηση HU, με τους «ανταποκρινόμενους» να έχουν τιμή plateau πάνω από 20% ενώ οι «μη ανταποκρινόμενοι» κάτω από 20%. Στους παρακάτω πίνακες (πίνακας 12 και 13) παρουσιάζονται ο αριθμός των δειγμάτων κι οι % συχνότητες των γονοτύπων και των αλληλομόρφων μεταξύ των ανταποκρινόμενων και μη ανταποκρινόμενων διπλά ετερόζυγων ασθενών για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία. 86

102 Πίνακας 12: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών Ομάδες ατόμων Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία ανταποκρινόμενοι στην HU Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Γονοτύπων rs C>A C/C C/A A/A Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία μη ανταποκρινόμενοι στην HU Πίνακας 13: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών Ομάδες ατόμων Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Αλληλομόρφων rs C>A C A Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία ανταποκρινόμενοι στην HU Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία μη ανταποκρινόμενοι στην HU Και οι δύο πληθυσμιακές ομάδες ικανοποιούν το νόμο Hardy-Weinberg. Η τιμή p που προκύπτει από την στατιστική ανάλυση της συχότητας εμφάνισης των γονοτύπων μεταξύ ανταποκρινόμενων και μη ανταποκρινόμενων ασθενών είναι ίση με 0,00016 (p<0,001) γεγονός που υποδηλώνει ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση του πολυμορφισμού rs με την ανταπόκριση των ασθενών στη χορήγηση HU. Όπως φαίνεται και στο ιστόγραμμα της εικόνας 30 ο ομόζυγος γονότυπος για το σπάνιο αλληλόμορφο εντοπίζεται με μεγαλύτερη συχνότητα στους 87

103 μη ανταποκρινόμενους γεγονός που πιθανόν υποδηλώνει ότι η απουσία του σχετίζεται με την απόκριση στη χορήγηση HU % Συχνότητα γονοτύπων C/C C/A A/A 0 Ανταποκρινόμενοι Μη ανταποκρινόμενοι Εικόνα 30: Ιστόγραμμα της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs μεταξύ ανταποκρινόμενων και μη στην HU ασθενών 4.2.Μελέτη του πολυμορφισμού rs10434 Η γονοτύπηση των δειγμάτων ως προς τον πολυμορφισμό rs10434 πραγματοποιήθηκε με την ενζυμική μέθοδο αλληλούχισης κατά Sanger. Ενδεικτικά παρουσιάζεται μια εικόνα ηλεκτροφόρησης των PCR προϊόντων τα οποία εμπεριέχουν τον πολυμορφισμό rs10434 καθώς κι ένα ενδεικτικό χρωματογράφημα από την αλληλούχιση κατά Sanger (εικόνες 31 και 32 αντίστοιχα). Εικόνα 31: Ενδεικτική ανάλυση PCR προϊόντων μεγέθους 325bp που εμπεριέχουν τον SNP rs10434 σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% w/v. Μ: μάρτυρας μοριακών μεγεθών βήματος 100bp και Τ: αρνητικός μάρτυρας 88

104 (Α) (Β) (Γ) Εικόνα 32: Ενδεικτικό χρωματογράφημα ατόμων με διαφορετικό γονότυπο ως προς τον SNP rs10434 (G>A). (Α) ομόζυγος για το G αλληλόμορφο (G/G) (B) ετερόζυγο άτομο (G/A) και (Γ) ομόζυγος για το Α αλληλόμορφο (Α/Α) Συσχέτιση με την κλινική εικόνα της νόσου Στους παρακάτω πίνακες αναγράφονται ο αριθμός των δειγμάτων που γονοτυπήθηκαν καθώς και οι % συχνότητες εμφάνισης των γονοτύπων και των αλληλομόρφων για τον πολυμορφισμό rs10434 σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία κι ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία (πίνακες 14 και 15 αντίστοιχα). Οι συχνότητες των αλληλομόρφων που παρατηρούνται στις παραπάνω πληθυσμιακές ομάδες συμφωνούν με αυτές που 89

105 αναφέρονται στη βάση δεδομένων ensembl (G:58% και A: 42%) για τον Καυκάσιο πληθυσμό. Πίνακας 14: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs10434 σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία Ομάδες ατόμων Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα αλληλομόρφων rs10434 G>A Υγιή άτομα Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία G A Ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία Πίνακας 15: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs10434 σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία κι ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία Ομάδες ατόμων Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Γονοτύπων rs10434 G>A G/G G/A A/A Υγιή άτομα Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία Έπειτα διερευνήθηκε αν οι παραπάνω ομάδες ατόμων ικανοποιούν το νόμο Hardy- Weinberg με τη βοήθεια του διαγράμματος Finetti. Κι οι τρεις ομάδες είναι σε ισορροπία οπότε ακολούθησε στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Όπως προκύπτει από τις τιμές p οι οποίες παρουσιάζονται στον πίνακα 16 δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στις συχνότητες εμφάνισης των γονοτύπων μεταξύ των ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και 90

106 των ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία. Το ίδιο ισχύει και για τις άλλες δύο ομάδες σύγκρισης. Επομένως, ο πολυμορφισμός rs10434 δεν σχετίζεται με τη σοβαρότητα της νόσου και την πιο ήπια κλινική εικόνα των ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσσεων β-θαλασσαιμία. Πίνακας 16: Στατιστική ανάλυση της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον rs10434 μεταξύ υγιών ατόμων, ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενών με μείζονα β- θαλασσαιμία Ομάδες Σύγκρισης p value Υγιή άτομα- Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία 0,89 Υγιή άτομα-ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία 0,75 Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία- Ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία 0,82 70 % Συχνότητα γονοτύπων Υγιή άτομα Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία C/C C/A A/A Εικόνα 33: Ιστόγραμμα της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs10434 σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία Συσχέτιση με την απόκριση διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία ασθενών στη χορήγηση HU Στους πίνακες που ακολουθούν (πίνακες 17 και 18) παρουσιάζονται ο αριθμός των ανταποκρινόμενων καθώς και των μη ανταποκρινόμενων σύμφωνα με το κριτήριο 91

107 του 20% διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών που μελετήθηκε καθώς και οι % συχνότητες των γονοτύπων και των αλληλομόρφων σε κάθε ομάδα ασθενών. Παρατηρούμε ότι και σε αυτές τις πληθυσμιακές ομάδες υπάρχει μια μικρή απόκλιση από τις συχνότητες των αλληλομόρφων όπως δίνονται στο ensembl. Πίνακας 17: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs10434 μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών Ομάδες ατόμων Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία ανταποκρινόμενοι στην HU Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία μη ανταποκρινόμενοι στην HU Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Γονοτύπων rs10434 C>A G/G G/A A/A

108 Πίνακας 18: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs10434 μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών Ομάδες ατόμων Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία ανταποκρινόμενοι στην HU Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία μη ανταποκρινόμενοι στην HU Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Αλληλομόρφων rs10434 G>A G A Η τιμή p που προκύπτει από τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων στην οποία προχωρήσαμε καθώς κι οι δύο ομάδες ασθενών ικανοποιούν το νόμο Hardy- Weinberg είναι ίση με 0,93 γεγονός που υποδηλώνει ότι ο πολυμορφισμός rs10434 δεν σχετίζεται με την απόκριση των διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών με την απόκριση στην HU % Συχνότητα γονοτύπων Ανταποκρινόμενοι Μη ανταποκρινόμενοι C/C C/A A/A Εικόνα 34: Ιστόγραμμα % συχνότητας εμφάνισης γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs10434 μεταξύ ανταποκρινόμενων και μη στην HU ασθενών 93

109 4.3 Μελέτη του πολυμορφισμού rs Για τη γονοτύπηση των δειγμάτων ως προς τον πολυμορφισμό rs χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της Allele Specific-PCR. Ακουλουθεί μια ενδεικτική εικόνα AS-PCR (εικόνα 35). Για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκε μια αντίδραση με τον κοινό F εκκινητή και τον R εκκινητή να είναι συμπληρωματικός για το αρχέγονο αλληλόμορφο (Rw) και μια αντίδραση με τον κοινό F εκκινητή και τον R εκκινητή να είναι συμπληρωματικός για το «μεταλλαγμένο» αλληλόμορφο (Rm). Εικόνα 35: Ενδεικτική ανάλυση AS-PCR προϊόντων μεγέθους 248bp σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% w/v. Μ: μάρτυρας μοριακών μεγεθών βήματος 100bp, 1 και 6: δείγματα ομόζυγα για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο (Α/Α), 2-4 και 8: δείγματα ετερόζυγα (G/A), 5 και 7: δείγματα ομόζυγα για το αρχέγονο αλληλόμορφο (G/G) και Τ 1 -Τ 2 : αρνητικός μάρτυρας. Ο γονότυπος για το δείγμα 1 ήταν ήδη γνωστός από την προτύπωση της μεθόδου με αλληλούχιση κατά Sanger και χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας Συσχέτιση με την κλινική εικόνα της νόσου Στους ακόλουθους πίνακες παρουσιάζονται τα αποτελέσματα γονοτύπησης υγιών ατόμων, ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία ως προς τον rs Στους εν λόγω πίνακες αναγράφονται ο αριθμός των δειγμάτων που αναλύθηκε για κάθε πληθυσμιακή ομάδα καθώς και η % συχνότητα των γονοτύπων (πίνακας 19) και των αλληλομόρφων (πίνακας 20) σε κάθε μια από αυτές. 94

110 Πίνακας 19: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία Ομάδες ατόμων Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Γονοτύπων rs G>A GG GA AA Υγιή άτομα Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία Πίνακας 20: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία Ομάδες ατόμων Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Αλληλομόρφων rs G>A G A Υγιή άτομα Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία Σύμφωνα με τη βάση δεδομένων ensembl η συχνότητα εμφάνισης των αλληλομόρφων στον Καυκάσιο πληθυσμό είναι G: 67% και A: 33%. Με βάση τις τιμές του πίνακα 20 παρατηρείται απόκλιση από τις τιμές του ensembl γεγονός που ενδεχομένως οφείλεται στο μικρό πληθυσμιακό δείγμα της μελέτης μας αλλά και τη μελέτη δειγμάτων αποκλειστικά του ελληνικού πληθυσμού. Στη συνέχεια διερευνήθηκε αν οι πληθυσμοί που μελετώνται ικανοποιούν το νόμο των Hardy-Weinberg. Τα αποτελέσματα αυτού του ελέγχου επέτρεψαν την περαιτέρω ανάλυση των αποτελεσμάτων με τη βοήθεια του ακριβούς ελέγχου του Fisher. Σύμφωνα με τις τιμές p που αναγράφονται στον πίνακα 21 οι συχνότητες εμφάνισης των γονοτύπων παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ασθενών 95

111 με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και των ασθενών με μείζονα β- θαλασσαιμία γεγονός που υποδηλώνει πιθανή συσχέτιση του πολυμορφισμού rs με τα αυξημένα επίπεδα HbF των ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία παρατήρηση που ενισχύεται ακόμα περισσότερο από τη στατιστικά σημαντική διαφορά που παρατηρείται στη συχνότητα εμφάνισης των γονοτύπων μεταξύ των υγιών ατόμων και των ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία. Πίνακας 21: Στατιστική ανάλυση της % συχνότητας εμφάνισης των γονοτύπων για τον rs μεταξύ υγιών ατόμων, ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία κι ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία Ομάδες Σύγκρισης p value Υγιή άτομα- Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία 0,0048* Υγιή άτομα-ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία 0,22 Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία-ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία 0,0026* *p<0,05 Όπως φαίνεται και στο ιστόγραμμα της εικόνας 36 ο ομόζυγος γονότυπος για το σπάνιο αλληλόμορφο (Α/Α) απαντάται πιο σπάνια στους ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία σε σχέση με τους ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία και τα υγιή άτομα υποδηλώντας ότι ενδεχομένως η παρουσία του Α αλληλομόρφου σχετίζεται με τα χαμηλά επίπεδα HbF. 96

112 % Συχνότητα γονοτύπων C/C C/A A/A 0 Υγιή άτομα Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία Εικόνα 36: Ιστόγραμμα % συχνότητας εμφάνισης γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs σε υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία Συσχέτιση με την απόκριση διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β θαλασσαιμία ασθενών στη χορήγηση HU Στους πίνακες 22 και 23 παρουσιάζονται η % συχνότητα εμφάνισης των τριων γονοτύπων και των αλληλομόρφων αντίστοιχα για τον πολυμορφισμό rs καθώς και ο αριθμός των ανταποκρινόμενων και μη ανταποκρινόμενων διπλά ετερόζυγων ασθενών που μελετήθηκαν. Πίνακας 22: % Συχνότητα γονοτύπων για τον SNP rs μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών Ομάδες ατόμων Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία ανταποκρινόμενοι στην HU Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία μη ανταποκρινόμενοι στην HU Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Γονοτύπων rs G>A G/G G/A A/A

113 Πίνακας 23: % Συχνότητα αλληλομόρφων για τον SNP rs μεταξύ ανταποκρινομένων και μη ανταποκρινόμενων στη χορήγηση HU διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ασθενών Ομάδες ατόμων Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία ανταποκρινόμενοι στην HU Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία μη ανταποκρινόμενοι στην HU Αριθμός δειγμάτων % Συχνότητα Αλληλομόρφων rs G>A G A Σύμφωνα με τα δεδομένα του πίνακα 23 και σε αυτές τις πληθυσμιακές ομάδες υπάρχει μια μικρή απόκλιση από τις συχνότητες των αλληλομόρφων που δίνονται στο ensembl. Και οι δύο ομάδες ασθενών βρίσκονται σε ισορροπία σύμφωνα με το νόμο Hardy- Weinberg. Η τιμή p που προκύπτει από τη στατιστική ανάλυση είναι ίση με 0,367. Επομένως ο πολυμορφισμός rs δεν σχετίζεται με την απόκριση των ασθενών στη λήψη HU % Συχνότητα γονοτύπων C/C C/A A/A 0 Ανταποκρινόμενοι Μη ανταποκρινόμενοι Εικόνα 37: Ιστόγραμμα % συχνότητας εμφάνισης γονοτύπων για τον πολυμορφισμό rs μεταξύ ανταποκρινόμενων και μη στην HU ασθενών 98

114 5. In silico πρόβλεψη της επίπτωσης των υπό μελέτη πολυμορφισμών στην παραγόμενη πρωτεΐνη Περαιτέρω ανάλυση των υπό μελέτη πολυμορφισμών έδειξε ότι οι πολυμορφισμοί rs και rs βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης (linkage disequilibrium, LD) (εικόνα 38). Η διερεύνηση της σχέσης μεταξύ των αλληλομόρφων των δύο πολυμορφισμών με το εργαλείο LDpair έδειξε ότι το αλληλόμορφο Α του πολυμορφισμού rs σχετίζεται με το αλληλόμορφο C του πολυμορφισμού rs και το αλληλόμορφο G του rs σχετίζεται με το αλληλόμορφο A του rs Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, το πρότυπο των συχνοτήτων εμφάνισης των γονοτύπων των δύο αυτών πολυμορφισμών είναι σε συμφωνία με τα παραπάνω γεγονός που ενισχύει ακόμη περισσότερο την υπόθεση ότι οι πολυμορφισμοί αυτοί σχετίζονται με την βαρύτητα των κλινικών συμπτωμάτων της β-θαλασσαιμίας και την απόκριση των ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία/βθαλασσαιμία στη λήψη HU. 99

115 Εικόνα 38: Ανισορροπία σύνδεσης (LD) μεταξύ των υπό μελέτη πολυμορφισμών 100

116 Εικόνα 39: Σχέση μεταξύ των αλληλομόρφων των πολυμορφισμών rs και rs Με τη βοήθεια του εργαλείου Human Splicing Finder που φιλοξενείται στην ιστοσελίδα του RD-connect διερευνήθηκε η επίπτωση των παραπάνω πολυμορφισμών στην παραγόμενη πρωτεΐνη. Ο SNP rs δεν βρέθηκε να προκαλεί σημαντική μεταβολή του μοτίβου συναρμογής υποδηλώνοντας ότι οι SNPs που κληρονομούνται μαζί με αυτόν είναι ίσως το κλειδί στη σύνδεσή του με τα υψηλά επίπεδα HbF ενώ ο SNP rs φαίνεται να δημιουργεί μια ιντρονική περιοχή ενισχυτή ESE (Exonic Splicing Enhancer) η οποία μπορεί να επηρεάσει τη συναρμογή του πρώιμου mrna (εικόνα 40). Εικόνα 40: Αποτελέσματα από Human Splicing Finder 101