Η χρήση γονιδιωματικών δεικτών για την πρόγνωση της βαρύτητας των συμπτωμάτων της β-μεσογειακής αναιμίας

Transcript

1 ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΒΙΟΙΑΤΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Η χρήση γονιδιωματικών δεικτών για την πρόγνωση της βαρύτητας των συμπτωμάτων της β-μεσογειακής αναιμίας Χριστίνα Ταφραλή Φαρμακοποιός Επιβλέπων καθηγητής Γεώργιος Π. Πατρινός Πάτρα

2 Επιβλέπων Γεώργιος Π. Πατρινός Επίκουρος Καθηγητής Φαρμακογονιδιωματικής, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου Επίκουρος Καθηγήτρια Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Κωνσταντίνος Πουλάς Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών 2

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Ευχαριστώ, -τον επιβλέποντά μου, Γιώργο Πατρινό που με δέχτηκε στην εργαστηριακή του ομάδα, πίστεψε σε εμένα, με ενθάρρυνε, με καθοδήγησε και στήριξε τις προσπάθειες μου. Τον ευχαριστώ όχι μόνο για τη στήριξή του στη ερευνητική δουλειά, αλλά και για την ηθική και ανθρώπινη στήριξη και κατανόηση για τις δυσκολίες που πέρασα αυτό το διάστημα. -την μεταδιδακτορικό, Μαριάννα Γεωργίτση, που συντέλεσε ουσιαστικά στην επίβλεψη της ερευνητικής αυτής δουλειάς, με καθοδήγησε, με στήριξε και ήταν δίπλα μου στην προσπάθεια επίλυσης οποιουδήποτε προβλήματος που προέκυπτε. Την ευχαριστώ που ήταν δίπλα μου ως «άνθρωπος» πάνω απ όλα. -τα μέλη της τριμελούς μου επιτροπής, την Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου, για την υπομονή και επιμονή της να μου μάθει πράγματα και να με εισάγει ουσιαστικά στον κόσμο της Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής, και τον Κωνσταντίνο Πούλα, για την στήριξή του, ηθική και πρακτική και την ουσιαστική βοήθεια του σε οποιοδήποτε θέμα προέκυπτε στο εργαστήριο. -τον Γιώργιο Σπυρούλια, για τις συμβουλές του και την ηθική του στήριξη. Ευχαριστώ ακόμη, όλα τα μέλη του εργαστηρίου, -τους Γεώργιο Λαγουμιντζή, Μανούσο Καμπούρη, ΑΘανάσιο Νιάρχο, Σπύρο Τζίμα -τις Ζωή Ζαγορίτη, Κατερίνα Κασσελά, Μαρίνα Μπαρτσακούλια, Εβίρα Τσερμπίνι, Αρσινόη Παίζη, Αίμιλη Γιαννοπούλου και Όλγα Γιαννακοπούλου Με βοήθησαν, μου έδωσαν ιδέες, μου μετέδωσαν γνώσεις. Με κάποιους πιστεύω πως ήρθαμε πολύ κοντά, δημιουργήθηκαν φιλίες, μέσα από την αμοιβαία εκτίμηση και το σεβασμό. Αυτό ήταν και το μεγαλύτερο δώρο που αποκόμισα μέσα από το ταξίδι αυτό. Ευχαριστώ, την οικογένειά μου, η οποία με στήρηξε με όλους τους δυνατούς τρόπους. Χωρίς την οικογένειά μου δεν θα είχα τη δυνατότητα να ξεκινήσω και να ολοκληρώσω την μελέτη αυτή. Ευχαριστώ την μητέρα μου, που δεν με εγκατέλειψε ποτέ και με 3

4 στήριξε ηθικά, ψυχικά και πνευματικά σε όλα τα ονειρά μου, αγγαλιάζοντάς με πάντα με αγάπη. Ευχαριστώ, τους πολύ κοντινούς μου ανθρώπους, τους ανθρώπους που άγγιξαν την ψυχή μου ουσιαστικά. Ήταν κοντά μου στο ταξίδι μου αυτό, αντιλήφθηκαν τα ονειρά μου και πίστεψαν σε αυτά ακόμη και όταν εγω αμφέβαλλα για εμένα. Ευχαριστώ την Βανέσα και την Αλίκη. Ευχαριστώ τον Άγγελο, γιατί αντιλήφθηκε πρίν από εμένα τις ικανότητές μου, γιατί πίστεψε σε εμένα, γιατί μου έδωσε την ώθηση και την πίστη στον εαυτό μου και τις δυνατότητές μου και ήταν εκεί να μου υπένθυμίζει ότι μπορώ να καταφέρω πολλά. 4

5 Περίληψη Οι αιμοσφαιρινοπάθειες, και ειδικότερα η β-μεσογειακή αναιμία (β-thalassemia) και η δρεπανοκυτταρική αναιμία (sickle cell disease, SCD) αποτελούν σημαντικά προβλήματα της δημόσιας υγείας. Διαφορετικές μορφές αιμοσφαιρίνης (Hb) παράγονται κατά την εμβρυονική, την εμβρυϊκή και την ενήλικο ζωή. Η ρύθμιση της έκφρασης των G γ και A γ-σφαιρινικών γονιδίων παρουσιάζει ενδιαφέρον γιατί παρέχει μια λογική βάση για τις μοριακές στρατηγικές επανενεργοποίησης των εμβρυϊκών γ- σφαιρινικών γονιδίων στον ενήλικα με σκοπό να αντισταθμιστεί η απουσία ή ύπαρξη ελαττωματικών β-σφαιρινικών αλυσίδων (Papachatzopoulou et al., 2006). Σε μια μελέτη σε εκτεταμένη οικογένεια 153 μελών ασιατικής-ινδικής καταγωγής με ετεροκυτταρική HPFH αποκαλύφθηκε ότι το γονίδιο-κλειδί που προκαλεί την «κληρονομική εμμονή της έκφρασης εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης» (hereditary persistence of fetal hemoglobin- HPFH) εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6q (Giannopoulou et al., 2012). Η κύρια περιοχή ενδιαφέροντος χαρτογραφήθηκε αργότερα στη χρωμοσωμική περιοχή 6q και αρκετές μελέτες έδειξαν ότι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNP) σε γονίδια εντός της περιοχής αυτής συσχετίζονται με την ανταπόκριση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, HbF(α 2 γ 2 ) στη θεραπεία με υδροξυουρία (HU) σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD). Ο μηχανισμός με τον οποίο αυτός ο «γονιδιακός τόπος που σχετίζεται με ποσοτικό γνώρισμα» (Quantitative Trait Loci-QTL) στη χρωμοσωμική περιοχή 6q επηρεάζει τα επίπεδα της HbF και των F-κυττάρων παραμένει άγνωστος. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η πιθανότητα συσχέτισης των SNP που εντοπίζονται στα γονίδια PDE7B και MAP3K5 της περιοχής 6q , rs (a>c), rs (g>c), rs (c>t) και rs (t>c) και rs (a>c), αντίστοιχα, με αυξημένα επίπεδα HbF σε ασθενείς με ενδιάμεση ή μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και σε φυσιολογικά (μη-θαλασσαιμικά) άτομα με καταγωγή από την δυτική Ελλάδα. Εξετάστηκε επίσης ένα σύνολο ασθενών διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-μεσογειακή αναιμία (compound heterozygotes SCD/β-thalassemia), οι οποίοι είχαν λάβει θεραπεία με HU, με σκοπό να διευκρινιστεί η ύπαρξη συσχέτισης αυτών των SNP με την ανταπόκριση στην θεραπευτική αγωγή με HU. Οι ασθενείς αυτοί διαχωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες, τους «ανταποκρινόμενους» (responders) και «μη-ανταποκρινόμενους» (nonresponders) στη θεραπεία, ανάλογα με το έαν τα επίπεδα HbF ξεπερνούσαν ή όχι την 5

6 ποσοστιαία τιμή 20% μετά την χορήγηση της φαρμακευτικής αγωγής, αντίστοιχα. Το γονίδιο PDE7B είναι υποψήφιο λόγω της υψηλής συγγένειας και ειδικότητάς του για το camp, το οποίο έχει ανασταλτκή δράση στην έκφραση του γ-σφαιρινικού γονιδίου (Hetman et al., 2000). Το γονίδιο MAP3K5,γνωστό και ως ASK1, είναι μέλος της MAP3K οικογένειας και του MAPK σηματοδοτικού μονοπατιού. Αυτός ο σηματοδοτικός καταρράκτης αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους μηχανισμούς για την κυτταροπλασματική μεταβίβαση των εξωκυττάριων σημάτων. Η γονοτύπηση έγινε εφαρμόζοντας τρείς διαφορετικές μεθόδους, την αλληλούχηση (sequencing), την PCR-RFLP και την PCR-ARMS. Βρέθηκε ότι στην ομάδα των ασθενών με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από ήπιο φαινότυπο λόγω των υψηλών επιπέδων HbF, ο ομόζυγος για το υπολειπόμενο αλληλόμορφο (C) γονότυπος απουσίαζε για τα SNPs rs και rs του γονιδίου MAP3K5 και το rs του γονιδίου PDE7B. Πιθανόν τα SNP αυτά να αποτελούν μέρος ενός απλοτύπου που σχετίζεται με την έκφραση της γ-σφαιρίνης. Για τα rs και rs , ταυτοποιήθηκε σύνδεση (Linkage disequilibrium, LD). Όσον αφορά στους διπλά ετερόζυγους για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-μεσογειακή αναιμία ασθενείς, παρατηρήθηκε πλήρης έλλειψη του C/C γονοτύπου από τους «μηανταποκρινόμενους» ασθενείς και για τα δύο SNP του γονιδίου MAP3K5, καταδεικνύοντας την δυνατότητα πιθανής μελλοντικής χρήσης αυτών των πολυμορφισμών ως φαρμακογονιδιωματικών δεικτών της θεραπείας με HU. Η συγκεκριμένη μελέτη παρέχει νέα δεδομένα όσον αφορά στους πολυμορφισμούς των γονιδίων MAP3K5 και PDE7B της περιοχής 6q , και την συσχέτιση τους με την βαρύτητα των συμπτωμάτων την β-μεσογειακής αναιμίας, αλλά και την συσχέτιση τους με την ανταπόκριση της HbF στην θεραπεία με HU σε ασθενείς με καταγωγή από την δυτική Ελλάδα. Απώτερος στόχος της προσπάθειας αυτής είναι να προσδιοριστεί ο πιθανός ρυθμιστικός μηχανισμός με τον οποίο τα γονίδια αυτά επιδρούν στο β-σφαιρινικό σύμπλεγμα και συντελούν στην επαγωγή της έκφρασης της γ-σφαιρίνης. 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α.ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 10 Α.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 11 Α.1.1 Αιμοσφαιρίνη 11 Α.2 Δομή και λειτουργία των μορφών αιμοσφαιρίνης 11 Α.3 Ερυθροποίηση 13 Α.4 Δομή και οργάνωση των γονιδίων των σφαιρινών του ανθρώπου 16 Α.4.1 Σύμπλεγμα της α-σφαιρίνης 17 Α.4.2 Σύμπλεγμα της β-σφαιρίνης 17 Α.5 Εξελικτική πορεία έκφρασης των σφαιρινικών γονιδίων και της 18 σύνθεσης των μορφών αιμοσφαιρίνης Α.6 Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών του ανθρώπου 20 Α.6.1 Ειδικές ρυθμιστικές αλληλουχίες των γονιδίων του συμπλέγματος 21 β- σφαιρίνης Α.6.2 Η περιοχή ελέγχου LCR του γονιδιακού τόπου των β-σφαιρινών 23 (β-lcr) A.6.3 Οι ιδιότητες της περιοχής ελέγχου LCR 25 A.6.4 Μηχανισμοί ενεργοποίησης των σφαιρινικών γονιδίων από την 32 περιοχή ελέγχου LCR A.7 Γενετικοί τροποποιητές που επιδρούν στον β-γονιδιακό τόπο 38 Α.7.1 cis-δραστικά στοιχεία 38 Α.7.2 trans-δραστικά στοιχεία 41 Α.7.3 QTL-γονιδιακοί τόποι που σχετίζονται με ποσοτικά γνωρίσματα 42 A.7.4 Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (single nucleotide polymorphisms, SNP) A.7.5 Προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό γενετικών τροποποιητών 44 A.7.6 QTL των χρωμοσωμικών περιοχών Xp22, 6q23, 8q11 και 2p15 46 A Xp22 46 A q11 47 A p15 49 A q23 50 A.7.7 Αναλυτική παρουσίαση γονιδίων της περιοχής του 6q23 QTL 52 A MYB και HBS1L 52 A PDE7B 54 A MAP3K5 57 A MAP7 61 A PEX7 61 A ALDH8A1 62 A AHI1 62 A.7.8 Σχετικά QTL σε άλλα χρωμοσώματα 63 A FLT1 63 A ARG1, ARG2 και ASS 63 A NOSI και NOS2A 64 A HAO2 65 Α.8 Μεταγραφικοί παράγοντες

8 Α.8.1 Γενικοί trans-μεταγραφικοί παράγοντες 67 Α.8.2 Ερυθρο-ειδικοί trans-μεταγραφικοί παράγοντες 68 A Παράγοντες GATA 68 A Παράγοντας NF-E2 73 A Παράγοντας KLF-1 (Erythroid Krüppel-Like Factor, EKLF) 74 Α.9 Αιμοσφαιρινοπάθειες και Μεσογειακή Αναιμία (Thalassemia) 77 Α.9.1 Αιμοσφαιρινοπάθειες 77 Α.9.2 Ποσοτικές αιμοσφαιρινοπάθειες: Μεσογειακή Αναιμία 78 (Θαλασσαιμία) Α Αιτίες πρόκλησης Μεσογειακής Αναιμίας 80 Α α-μεσογειακή Αναιμία 80 Α β-μεσογειακή Αναιμία 81 Α Κλινική εικόνα ασθενών με β-μεσογειακή αναιμία 86 A Μείζων (βαριά) β-μεσογειακή αναιμία (major) 86 A Ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία (intermedia) 87 A Ετερόζυγη β-μεσογειακή αναιμία (β-thalassemia trait/ β- 88 Thalassemia minor) A β-μεσογειακή αναιμία συνδυασμένη με άλλες Hb-ανωμαλίες 88 Α Θεραπευτικές προσεγγίσεις 89 Α.10 Σκοπός της εργασίας 95 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 96 Β.1 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 97 Β.1.1 Δείγματα DNA που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη 97 Β.2 Απομόνωση ολικού γονιδιωματικού DNA 98 Β.3 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA σε ένα διάλυμα 99 Β.4 Πολυμορφισμοί-στόχοι της παρούσας μελέτης 100 Β.5 Σχεδιασμός εκκινητών (primers) 103 Β.6 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης 106 Β.7 Αντιδραστήρια και διαδικασία της PCR 107 B.8 PCR-ARMS (amplification refractory mutation system) 108 B.9 Touchdown PCR (TD-PCR) 110 B.10 Πρωτόκολλα PCR-αντιδράσεων 112 Β.10.1 Πρωτόκολλα για γονοτύπηση των SNP στο γονίδιο MAP3K5 112 Β.10.2 Πρωτόκολλα για γονοτύπηση των SNP στο γονίδιο PDE7B 114 Β.11 PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)- 117 Γονοτύπηση με κατάτμηση προϊόντων PCR με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Β.11.1 PCR-RFLP ανάλυση για το rs (T>C) 118 Β.11.2 PCR-RFLP ανάλυση για το rs (A>C) 121 Β.12 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 122 Β.13 Αλληλούχηση: προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας 127 μορίων DNA (Sequencing) Β.14 Καθαρισμός των προϊόντων PCR 131 Β.15 Στατιστική επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων 132 8

9 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 136 Γ.1 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 137 Γ.2 Ανάλυση πειραματικών δεδομένων και αποτελεσμάτων για κάθε 137 μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό(snp) Γ.2.1 MAP3K5 γονίδιο 137 Γ rs (T>C) 137 Γ rs (A>C) 142 Γ.2.2 PDE7B γονίδιο 147 Γ rs (A>C) 147 Γ rs (G>C) 149 Γ rs (C>T) 152 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 154 Δ.1 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 155 Ε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 160 9

10 A. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 10

11 Α.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1.1 Αιμοσφαιρίνη Η αιμοσφαιρίνη (Hb)είναι μια μεταλλοπρωτεΐνη που ανακαλύφθηκε από τον Hünefeld το Αποτελεί το βασικό συστατικό των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Tο μακρομόριο αυτό έχει μελετηθεί εκτεταμένα σε όλα τα επίπεδα παραγωγής του στους ανώτερους οργανισμούς και κυρίως στον άνθρωπο (Homo sapiens) και στο ποντίκι (Mus musculus). Η μελέτη των διαφόρων μορφών αιμοσφαιρίνης τόσο των φυσιολογικών όσο και των παθολογικών απέδωσε σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη σχέση δομής και βασικής λειτουργίας της πρωτεΐνης δηλαδή της μεταφοράς του οξυγόνου (Ο 2 ). Οι αιμοσφαιρινοπάθειες λειτούργησαν ως φυσικά μοντέλα μελέτης και απέδωσαν άμεσες και σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την οργάνωση και τη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων καθώς και καθοριστικά στοιχεία για το πώς επηρεάζει η οντογένεση τη γονιδιακή έκφραση. Α.2. Δομή και λειτουργία των μορφών αιμοσφαιρίνης To 1959 o Max Perutz, μετά από προσπάθειες πολλών ερευνητών (Otto Funke, Felix Hoppe-Seyler), προσδιόρισε τελικά τη δομή της αιμοσφαιρίνης με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Έκτοτε η δομή και η λειτουργία της αιμοσφαιρίνης έχουν πλήρως διαλευκανθεί. Η αιμοσφαιρίνη των θηλαστικών αποτελείται από τέσσερες πολυπεπτιδικές αλυσίδες όμοιες ανά δύο. Στους ενήλικες, το μόριο της ανθρώπινης αιμοσφαιρίνης (Hb), είναι ένα τετραμερές (Μ.Β Da) που αποτελείται συνήθως από δύο α- και δύο β- πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Άλλες μορφές της αιμοσφαιρίνης είναι δυνατόν να παρατηρηθούν με εναλλαγή των δύο β-αλυσίδων με δύο γ- ή με δύο δ-αλυσίδες ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο του ατόμου (Εικ.8). Η πρωτοταγής δομή των αλυσίδων αυτών προσδιορίσθηκε γύρω στο 1960 και βρέθηκε ότι οι α-σφαιρινικές αλυσίδες αποτελούνται από 141 αμινοξέα, ενώ οι β-σφαιρινικές αλυσίδες από 146 αμινοξέα. Παρόλο που τα δύο είδη αλυσίδων είναι παρόμοιου μεγέθους, διαφέρουν στην αλληλουχία των αμινοξικών τους καταλοίπων (Marengo-Rowe, 2006). 11

12 Η τριτοταγής δομή κάθε πολυπεπτιδικής αλυσίδας δημιουργείται από μη ομοιοπολικούς δευτερεύοντες δεσμούς. Η τεταρτοταγής δομή τους καθορίζεται από την επιφάνειά τους, η οποία καλύπτεται από πολικές (υδρόφιλες) ομάδες, κυρίως προπιονικού οξέος (Perutz et al., 1968). Οι τέσσερις αυτές αλυσίδες συγκρατούνται με μη ομοιοπολικές έλξεις. Η κάθε αλυσίδα περιέχει μία ομάδα αίμης και μία θέση δέσμευσης οξυγόνου. Η αίμη είναι μια προσθετική ομάδα που αποτελείται από ένα άτομο σιδήρου, το οποίο είναι υπεύθυνο για την δέσμευση του οξυγόνου και εντοπίζεται στο κέντρο ενός μεγάλου ετεροκυκλικού οργανικού δακτυλίου, που ονομάζεται πορφυρίνη. Ηπορφυρίνη που εντοπίζεται σε όλες τις μορφές αιμοσφαιρινών είναι η πρωτοπορφυρίνη I.X. Αυτή προσδίδει το ερυθρό χρώμα στην αιμοσφαιρίνη. Η αίμη βρίσκεται σφηνωμένη στο εσωτερικό υδρόφοβο τμήμα της κάθε υπομονάδας της αιμοσφαιρίνης, μέσω δεσμού με μία φαινυλαλανίνη, γεγονός που εξασφαλίζει τη διατήρηση του σιδήρου στην δισθενή μορφή, η οποία είναι και η βιολογικά ενεργή. Ο σίδηρος, που αποτελεί την περιοχή πρόσδεσης του οξυγόνου, συντονίζεται με τα τέσσερα άζωτα στο κέντρο του ετεροκυκλικού δακτυλίου της πορφυρίνης, τα οποία βρίσκονται όλα στο ίδιο επίπεδο. Προσδένεται ισχυρά στη πολυπεπτιδική αλυσίδα της αιμοσφαιρίνης μέσω του αζώτου του ιμιδαζολικού δακτυλίου της ιστιδίνης (F8) του, κάτω από το επίπεδο του δακτύλιου της πορφυρίνης. Μία έκτη θέση μπορεί αντιστρεπτά να προσδέσει οξυγόνο μέσω ενός ομοιοπολικού δεσμού συντονισμού, συμπληρώνοντας την οκταεδρική ομάδα των έξι προσδετών (Εικ. 1.) (Marengo-Rowe, 2006, Steinberg et al., 2001). Εικόνα 1.: Τρισδιάστατη δομή της αιμοσφαιρίνης (Hb). Με μπλέ και κόκκινο απεικονίζονται οι 4 πολυπεπτιδικές αλυσίδες, ενώ με πράσινο οι ομάδες της αίμης που συγκρατούν τον δισθενή σίδηρο. (Protein Data Bank/ 12

13 Εικόνα 2.: Ομάδα αίμης (heme B) (Caughey et al., 1975). Α.3 Ερυθροποίηση Η ερυθροποίηση είναι η διαδικασία με την οποία παράγονται τα ερυθρά αιμοσφαίρια (ερυθροκύτταρα). Η ερυθροποίηση διεγείρεται από τα μειωμένα επίπεδα O 2 στην κυκλοφορία, τα οποία γίνονται αντιληπτά από τους νεφρούς, οι οποίοι στη συνέχεια εκκρίνουν την ορμόνη ερυθροποιητίνη. Η ερυθροποιητίνη διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των πρόδρομων ερυθροκυττάρων. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη ερυθροποίηση στους αιμοποιητικούς ιστούς. Στα θηλαστικά, συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου, μετά την γέννηση η ερυθροποίηση λαμβάνει χώρα στο μυελό των οστών. Εικόνα 3.: Η προέλευση των ερυθρών αιμοσφαιρίων. ( 02.pdf) Όσον αφορά στην προέλευση των ερυθρών αιμοσφαιρίων, αυτά προέρχονται από ένα πολυδύναμο αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο (pluripotent stem cell). Το αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο διαφοροποιείται σε μυελοειδές αρχέγονο κύτταρο (CFU- 13

14 myeloid stem cell) και σε λεμφοειδές αρχέγονο κύτταρο (CFU-lymphoid stem cell). Από την κυτταρική σειρά του μυελοειδούς αρχέγονου κυττάρου προέρχεται και η ερυθρά σειρά (Εικ.3). Το κύτταρο απελευθερώνεται από τον μυελό των οστών μετά το στάδιο του «ορθοχρωματικού ερυθροβλάστη/ νορμοβλάστη», και έτσι εκ των κυκλοφορούντων ερυθροκυττάρων περίπου το 1% είναι δικτυοερυθροκύτταρα (Εικ. 4). Μετά από 1-2 ημέρες οι «νορμοβλάστες» γίνονται τελικά ώριμα ερυθρά αιμοσφαίρια. Αυτά τα στάδια αντιστοιχούν σε συγκεκριμένη μορφολογία των κυττάρων όταν χρωματίζονται με την χρωστική Wright s και εξετάζονται κάτω από οπτικό μικροσκόπιο. Η κάθε μορφολογία είναι ανάλογη των αλλαγών που συμβαίνουν στα κύτταρα κατά τα διάφορα στάδια διαφοροποίησης ( Εικόνα 4.: Πορεία ωρίμανσης των ερυθροβλαστών προς ερυθροκύτταρα ( Κατά την διαδικασία της ωρίμανσης του «βασεόφιλου προνορμοβλάστη» μετατρέπεται από ένα κύτταρο με μεγάλο πυρήνα και όγκο 900 fl σε έναν εμπύρηνο δίσκο με όγκο μόλις 95fL. Στο στάδιο του δικτυοερυθροκύτταρου, το κύτταρο έχει αποβάλλει τον πυρήνα του, αλλά διατηρεί την ικανότητά του να παράγει αιμοσφαιρίνη. Ουσιώδους σημασίας για την ωρίμανση των ερυθροκυττάρων είναι δύο βιταμίνες: η Β12 και το φυλλικό οξύ. Η έλλειψη οποιασδήποτε από αυτές τις βιταμίνες, οδηγεί στην αποτυχημένη ωρίμανση στην διαδικασία της ερυθροποίησης, το οποίο κλινικά 14

15 εκδηλώνεται ως «δικτυοερυθροκυτταροπενία», μια μη-φυσιολογική χαμηλή παροχή σε δικτυοερυθροκύτταρα ( Κατά την ωρίμανση, λοιπόν, των ερυθροβλαστών προς ερυθροκύτταρα, μεταβάλλονται τα εξής χαρακτηριστικά: 1) Παρουσιάζουν μείωση στο κυτταρικό μέγεθος 2) Το κυτταρόπλασμα αυξάνεται σε μέγεθος καταλαμβάνοντας πλέον το μεγαλύτερο μέρος του κυττάρου 3) Η αντίδραση χρώσης του κυτταροπλάσματος μεταβάλλεται από μπλέ σε ρόζκόκκινο, λόγω της μείωσης της ποσότητας RNA και DNA 4) Αρχικά ο πυρήνας ήταν μεγάλος σε μέγεθος και περιείχε ανοικτής-δομής χρωματίνη. Αλλά με την ωρίμανση των ερυθροβλαστών το μέγεθος του πυρήνα μειώνεται με την συμπύκνωση της χρωματίνης και τελικά εξαφανίζεται. Τα ώριμα ερυθροκύτταρα παράγουν κατά κύριο λόγο την αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων, HbA. Παρόλα αυτά, υπάρχει φυσιολογικά ένας υποπληθυσμός ερυθροκυττάρων, στα οποία κατά την ανάπτυξη του ανθρώπου δεν ολοκληρώνεται η μετάβαση από την εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη, HbF, σε εκείνη των ενηλίκων, HbA. Αυτά τα ερυθροκύτταρα ονομάζονται F-κύτταρα (Εικ.5). Εικόνα 5.: Διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων προς ερυθροκύτταρα και F-κύτταρα που περιέχουν εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη (Patrinos and Antonarakis, 2010). 15

16 Α.4. Δομή και οργάνωση των γονιδίων των σφαιρινών του ανθρώπου Τα γονίδια των ανθρωπίνων σφαιρινών είναι οργανωμένα σε πολυγονιδιακά συμπλέγματα (συστάδες) (clusters), το α- και το β-σφαιρινικό γονιδιακό σύμπλεγμα, αλλιώς γνωστοί και ως α- και β-γονιδιακοί τόποι. Η οργάνωση σε γονιδιακούς τόπους είναι ένας συνηθισμένος τρόπος οργάνωσης των γονιδίων των θηλαστικών. Ο γονιδιακός τόπος της α-σφαιρίνης βρίσκεται στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 16. Περιλαμβάνει μια περιοχή πλούσια σε GC, πλούσια σε γονίδια και η δομή χρωματίνης της παραμένει μόνιμα προσβάσιμη, παρόμοια με πολλά γονίδια κυτταρικής οικονομίας (housekeeping). Ο β-γονιδιακός τόπος βρίσκεται σε μια περιοχή πλούσια σε ΑΤ στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 11. Εντάσσεται σε μια ευρεία περιοχή απενεργοποιημένων γονιδίων του «ακουστικού υποδοχέα» (olfactory receptor (OR) genes). Κατά τα μεταγενέστερα στάδια της διαφοροποίησης των ερυθροκυττάρων, τα γονίδια του α- και του β- γονιδιακού τόπου εκφράζονται σε εξαιρετικά υψηλά επίπεδα. Αυτό είναι απαραίτητο προκειμένου να γεμίσει το τελικό διαφοροποιημένο ερυθροκύτταρο με αιμοσφαιρίνη. Το πώς τα β-σφαιρινικά γονίδια επιτυγχάνουν τα εξαιρετικά υψηλά επίπεδα έκφρασής τους παρά την θέση τους μέσα σε ένα κατασταλτικό περιβάλλον χρωματίνης, έχει αποτελέσει αντικείμενο εντατικής έρευνας (Maniatis et al., 1976), (Little et al., 1978). Το μήκος των συμπλεγμάτων των α- και β-σφαιρινών, συμπεριλαμβανομένων και των κύριων ρυθμιστικών τους περιοχών είναι και ζεύγη βάσεων (bp) αντίστοιχα. Η σειρά εντοπισμού των γονιδίων στους δύο γονιδιακούς τόπους με κατεύθυνση 5 προς 3 καθορίζει και την διαδοχική τους, ιστική και χρονική έκφραση στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια κατά την οντογένεση (Patrinos and Antonarakis, 2010). 16

17 Εικόνα 6.: Οι δύο γονιδιακοί τόποι που ευθύνονται για την παραγωγή της αιμοσφαιρίνης στον άνθρωπο (Patrinos and Antonarakis, 2010). Α.4.1 Σύμπλεγμα της α-σφαιρίνης Η δομή του α-σφαιρινικού συμπλέγματος (5-3 ) περιλαμβάνει το εμβρυονικό HBZ γονίδιο, ένα HBZP ψευδογονίδιο, δύο α-σφαιρινικά ψευδογονίδια, τα HBAP2 και HBAP1, τα δύο ταυτόσημα α-σφαιρινικά γονίδια, HBA2 και HBA1, και το θ- σφαιρινικό γονίδιο με άγνωστη λειτουργία. Δεν έχει ανιχνευθεί πολυπεπτίδιο θ- σφαιρίνης, ενώ μεταγράφεται κανονικά. Όσον αφορά στα δύο αντίγραφα α-σφαιρινικού γονιδίου, το α2 (ΗΒΑ2)- και α1 (ΗΒΑ1)-σφαιρινικό γονίδιο, αυτά αποδίδουν ένα ταυτόσημο πρωτεϊνικό προϊόν (Patrinos and Antonarakis, 2010). Α.4.2 Σύμπλεγμα της β-σφαιρίνης Παρομοίως, όσον αφορά στο β-σφαιρινικό σύπμλεγμα, με 5-3 κατεύθυνση συναντάται αρχικά το εμβρυονικό ε-σφαιρινικό γονίδιο (HBE) και έπειτα τα δύο εμβρυϊκά γ-σφαιρινικά γονίδια, τα G γ-(hbg2) και A γ-(hbg1), τα οποία συνθέτουν το ίδιο προϊόν με μόνη διαφορά την ύπαρξη γλυκίνης ( G γ) αντί αλανίνης ( A γ) στην θέση 136 της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Υπάρχει και ένας τρίτος τύπος γ-σφαιρινικής αλυσίδας με θρεονίνη αντί ισολευκίνη στη θέση 75 της γ-σφαιρινικής αλυσίδας (Patrinos and Antonarakis, 2010). Αυτός ο τύπος εμφανίζεται με συχνότητα έως και 40% και είναι πολυμορφικός σε ανθρώπινους πληθυσμούς. Ακολουθεί το β- ψευδογονίδιο (HBBP), το οποίο βρίσκεται μεταξύ των γονιδίων A γ- και δ- και δεν εκφράζεται αν και παρουσιάζει μεγάλη ομολογία με το γονίδιο της β-σφαιρίνης 17

18 (Stamatoyannopoulos et al., 2001). Τέλος ακολουθούν το δ-σφαιρινικό γονίδιο (HBD) και το β-σφαιρινικό γονίδο (HBB). Εκτεταμένη ανάλυση DNA αλληλούχισης έχει πραγματοποιηθεί σε όλα τα γονίδια αιμοσφαιρίνης, και η πρωτοταγής αλληλουχία τους έχει πλήρως χαρακτηριστεί. Όλα τα σφαιρινικά γονίδια έχουν πολλές δομικές ομοιότητες στην οργάνωση. Τρία εξώνια κωδικοποιούν την μοναδική αμινοξική αλληλουχία κάθε αλυσίδας σφαιρίνης. Μεταξύ των εξωνίων 1 και 2 και μεταξύ των 2 και 3 υπάρχουν παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες (IVS) ή εσώνια γνωστά ως IVS-I και IVS-II, αντίστοιχα (Patrinos and Antonarakis, 2010). Εικόνα 7.: Η οργάνωση των γονιδίων του β-γονιδιακού τόπου (Patrinos and Antonarakis, 2010). Α.5 Εξελικτική πορεία έκφρασης των σφαιρινικών γονιδίων και της σύνθεσης των μορφών αιμοσφαιρίνης Ιδιαίτερο γνώρισμα της αιμοσφαιρίνης είναι ότι συντίθενται διαφορετικές μορφές της κατά τα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια του ανθρώπου και αλλάζει κάθε φορά και ο αιμοποιητικός ιστός από τον οποίο παράγονται οι μορφές αυτές. Η ερυθροποίηση και, κατά συνέπεια, η παραγωγή των αιμοσφαιρινών, ξεκινά στον άνθρωπο από τον λεκιθικό ασκό (yolk sac). Μετά από πέντε εβδομάδες κύησης, η θέση ερυθροποίησης μεταφέρεται από το λεκιθικό ασκό στο εμβρυϊκό ήπαρ (fetal liver). Το ήπαρ παραμένει η κύρια θέση ερυθροποίησης του εμβρύου μέχρι την εικοστή εβδομάδα της κύησης. Η ερυθροποίηση μετατοπίζεται σταδιακά από αυτό το χρονικό σημείο και μετά στο σπλήνα και στο μυελό των οστών. Ο μυελός των οστών και εν μέρει ο 18

19 σπλήνας παραμένουν ως κύρια ερυρθοποιητικά όργανα και μετά την γέννηση (Εικ. 8b). Εικόνα 8.: Αναπτυξιακό διάγραμμα έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών στον άνθρωπο που δείχνει τη θέση και τα επίπεδα έκφρασης του κάθε γονιδίου κατά τη διάρκεια των διαφόρων σταδίων της ανάπτυξης του (Patrinos and Antonarakis, 2010). Κατά τα πρώϊμα στάδια της ανάπτυξης του εμβρύου οι αιμοσφαιρίνες που σχηματίζονται είναι η Gower 1 (με σύνθεση πολυπεπτιδικών αλυσίδων ζ 2 ε 2 ), η Gower 2 (α 2 ε 2 ), η Portland I (ζ 2 γ 2 ), οι οποίες αντικαθίστανται σταδιακά από την HbF (α 2 γ 2 )(Εικ.8a). Σε έμβρυο ηλικίας 37 ημερών έχει βρεθεί ότι η Gower 1 αντιπροσωπεύει το 42%, η Gower 2 το 24% και η HbF το 34% της συνολικής αιμοσφαιρίνης. Στα επόμενα στάδια της ανάπτυξης του εμβρύου η αναλογία των Gower αιμοσφαιρινών μειώνεται έτσι ώστε την 10 η -12 η εβδομάδα της κύησης ανιχνεύονται ελάχιστα ποσά τους. Σε έμβρυο ηλικίας 10 εβδομάδων η αιμοσφαιρίνη Portland ανιχνεύεται σε ποσά μέχρι 20% της ολικής αιμοσφαιρίνης. Η HbF παράγεται νωρίς κατά την κύηση και περί την 10 η εβδομάδα αντιστοιχεί στο 90% της ολικής αιμοσφαιρίνης. Το επίπεδο αυτό διατηρείται μέχρι το τέλος της κύησης (Stamatoyannopoulos et al., 2001). 19

20 Συγχρόνως με την παρουσία της HbF, η HbΑ (α 2 β 2 ) ανιχνεύεται σε φυσιολογικά έμβρυα από την 6 η εβδομάδα της κύησης σε ποσοστό 5-10% της ολικής αιμοσφαιρίνης. Μετά την γέννηση πραγματοποιείται η μεταστροφή από HbF σε HbΑ και HbΑ 2. Οι δ-αλυσίδες αρχίζουν να συντίθενται χρονικά μαζί με τις β-αλυσίδες, περί την 6 η εβδομάδα, δημιουργώντας την ΗbΑ 2 (α 2 δ 2 ), η οποία αντιπροσωπεύει το 2.5-3% της συνολικής αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων (Εικ.8a) (Wetheral and Clegg 1981, (Karlsson and Nienhuis, 1985). Α.6. Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών του ανθρώπου Η κύρια ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων γίνεται στο επίπεδο της μεταγραφής. Το πρώτο επίπεδο όμως, στο οποίο γίνεται έλεγχος της διαδικασίας έκφρασης των γονιδίων είναι το επίπεδο χρωματίνης. Αλλαγές στη δομή της χρωματίνης ελέγχουν την δυνατότητα έναρξης της μεταγραφής. Συγκεκριμένα ο βαθμός ακετυλίωσης, φωσφορυλίωσης και μεθυλίωσης των ιστονών της χρωματίνης, παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγραφική δυναμική ενός γονιδίου ή και ολόκληρης χρωμοσωμικής περιοχής όπου εδράζουν πολλά γονίδια, όπως είναι και το σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης. Ωστόσο σημαντικό ρόλο στην τελική αναλογία των σφαιρινικών αλυσίδων στο κυτταρόπλασμα, έχουν τόσο οι μετα-μεταγραφικές διεργασίες που αφορούν στην ωρίμανση του πρόδρομου RNA σε mrna της σφαιρίνης, όσο και η μετάφραση του mrna. Έτσι, οι παράμετροι που καθορίζουν την μεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων είναι: i. Η δομή της χρωματίνης, με την δομή της οποίας συνδέεται η μεταγραφική δραστηριότητα («ανοικτή ή κλειστή» δομή χρωματίνης, ακετυλίωση ιστόνων, μεθυλίωση σε δινουκλεοτίδια του τύπου CpG). ii. Η παρουσία cis-ρυθμιστικών στοιχείων, δηλαδή ρυθμιστικών αλληλουχιών που εδράζουν στο ίδιο χρωμόσωμα, ή trans-παραγόντων, δηλαδή πρωτεϊνικών ρυθμιστικών παραγόντων που προσδένονται στις παραπάνω ρυθμιστικές αλληλουχίες και παράγονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα από αυτό του β-γονιδιακού τόπου. Τα εγγύς και άπω cis-ρυθμιστικά στοιχεία, που μπορεί να είναι υποκινητές, ενισχυτές, αποσιωπητές και μονωτές ελέγχουν την αναπτυξιακώς ορθή έκφραση κάθε ξεχωριστού σφαιρινικού γονιδίου. Οι ενισχυτές (enhancers) είναι αλληλουχίες DNA οι οποίες «ενισχύουν» την μεταγραφή ενός γονιδίου, ανεξάρτητα από την απόστασή 20

21 τους από τον υποκινητή του γονιδίου ή την κατεύθυνσή τους ως προς αυτό κατά μήκος του γονιδιώματος. Μπορεί να βρίσκονται και καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου. Οι αποσιωπητές (silencers) είναι αλληλουχίες DNA που έχουν την ιδιότητα να καταστέλλουν γονίδια με τα οποία είναι συνδεδεμένοι. Οι αποσιωπητές, όπως και οι ενισχυτές, λειτουργούν ανεξάρτητα από τη θέση τους, την κατεύθυνσή τους και την απόσταση από τη θέση έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου (Stamatoyannopoulos et al., 2001). Οι μονωτές (insulators) λειτουργούν ως φραγμοί, εμποδίζοντας τις θετικές και αρνητικές επιδράσεις από την γειτονική χρωματίνη. Όταν βρίσκονται μεταξύ του υποκινητή ενός γονιδίου και κάποιου ρυθμιστικού στοιχείου αυτού, παρεμβαίνουν αναστέλλοντας την έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου (Farrell et al., 2002). Κάθε ρυθμιστικό στοιχείο, είτε υποκινητής, ενισχυτής, αποσιωπητής ή μονωτής φέρει ειδικές αλληλουχίες πρόσδεσης για ερυθροειδικούς και γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Α.6.1 Ειδικές ρυθμιστικές αλληλουχίες των γονιδίων του συμπλέγματος της β- σφαιρίνης Για καθένα από τα γονίδια του β-γονιδιακού τόπου υπάρχουν συγκεκριμένα «ρυθμιστικά στοιχεία»: HBE-γονίδιο Ο υποκινητής του ε-γονιδίου διαθέτει τις χαρακτηριστικές αλληλουχίες CACCC, CCAAT και TATA, σε μια κατεύθυνση 5 3 (Εικ.9) (Patrinos and Antonarakis, 2010). Οι ειδικοί για την ερυθροποίηση μεταγραφικοί παράγοντες GATA-1 και NF- E2, είναι ζωτικής σημασίας για την ιστοειδική έκφραση του ε-γονιδίου. Η ιστοειδική και χρονικά καθορισμένη έκφρασή του κατά το πρώιμο εμβρυονικό αναπτυξιακό στάδιο επιτυγχάνεται με έναν αποσιώπηητή μήκους 275 βάσεων, εντοπισμένο 467 bp ανοδικά της περιοχής έναρξης του γονιδίου (Cap site). Ο αποσιωπητής αυτός περιλαμβάνει GATA-1 και YY1- περιοχές πρόσδεσης. Όταν απαλείφεται η αλληλουχία του σε διαγονιδιακά ποντίκια, το ε-γονίδιο χάνει την αναπτυξιακή του ειδικότητα και συνεχίζει να εκφράζεται κατά την ώριμη φάση της ερυθροποίησης (Raich et al., 1995). 21

22 HBG2- και HBG1- γονίδια Οι αλληλουχίες των υποκινητών των γονιδίων της γ-σφαιρίνης είναι σχεδόν ταυτόσημες, λόγω του γεγονότος της γονιδιακής αναστροφής. Περιλαμβάνουν με κατεύθυνση 5 3 μια αλληλουχία CACCC, δύο CCAAT στοιχεία μέσα σε ένα διπλασιασμένο τμήμα 27 βάσεων και το στοιχείο TATA (Εικ.9) (Patrinos and Antonarakis, 2010). Παρόλο που πειραματικά δεδομένα από διαγονιδιακά ποντίκια καταδεικνύουν ότι η γ-σφαιρίνη, όπως και η ε, αποσιωπώνται αυτόνομα κατά την ενήλικο ζωή (Dillon and Grosveld, 1991), η περιοχή του αποσιωπητή του γ- σφαιρινικού γονιδίου μένει ακόμα να ανακαλυφθεί. Έχει αποδειχθεί ότι μια περιοχή 354 bp, εντοπισμένη 732 bp ανοδικά της Cap περιοχής των γ-γονιδίων της σφαιρίνης, ενδέχεται να δρά ως στοιχείο αποσιώπησης και όταν απαλείφεται, έχει ως αποτέλεσμα την συνεχή έκφραση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης κατά την ενήλικο φάση της ερυθροποίησης (Stamatoyannopoulos et al., 1993). Μια περιοχή 750 bp καθοδικά του HBG1 γονιδίου έχει φανεί πως παίζει ρόλο ενισχυτή, με βάση πειράματα κυτταρικής έκφρασης (Bodine and Ley, 1987). Το τμήμα αυτό περιλαμβάνει οκτώ θέσεις πρόσδεσης trans-παραγόντων, τρείς από τις οποίες είναι περιοχές πρόσδεσης GATA-1 (Purucker et al., 1990). HBB και HBD-γονίδια Ο υποκινητής του β-γονιδίου περιλαμβάνει με προσανατολισμό 5 3 δύο CACCC στοιχεία, ένα CCAAT και ένα TATA στοιχείο (Εικ.9). Οι μεταγραφικοί trans παράγοντες GATA-1 και KLF-1 (erythroid Krüppel- like factor (ELKF)) είναι οι πιο σημαντικοί, ειδικοί για την ερυθροποίηση μεταγραφικοί παράγοντες που προσδένονται στον υποκινητή του β-γονιδίου (Patrinos and Antonarakis, 2010). Η στοχευμένη απαλοιφή του γονιδίου KLF-1 του ποντικού, είχε ως αποτέλεσμα θνησιγόνο φαινότυπο στην αρχική φάση του ώριμου αιμοποιητικού σταδίου, λόγω εμφάνισης βαριάς δυσερυθροποίησης (Nuez et al., 1995). Επίσης, δύο ενισχυτές, o ένας μέσα και ο άλλος καθοδικά του β-γονιδίου, είναι πολύ πιθανό να ελέγχουν την έκφραση του (Antoniou et al., 1988). Ο πρώτος βρίσκεται μεταξύ του IVS-II και του εξωνίου 3, ενώ ο δεύτερος βρίσκεται αμέσως μετά την περιοχή πολυαδενυλίωσης του β-γονιδίου. Και οι δύο ενισχυτές περιλαμβάνουν τουλάχιστον τέσσερεις περιοχές πρόσδεσης GATA-1, που πιθανότατα είναι υπεύθυνες για τις λειτουργίες ενίσχυσης. Παρόλο που οι β- και δ-σφαιρίνες διαφέρουν μόνο σε δέκα αμινοξέα στις κωδικές αλληλουχίες τους, τα γονίδια που τις κωδικοποιούν διαφέρουν σημαντικά στην 22

23 περιοχή των υποκινητών τους. Η μεταγραφή του δ-γονιδίου είναι πολύ λιγότερο αποτελεσματική απ ότι του β-γονιδίου (Steinberg and Adams, 1991), κάτι που αντανακλάται στις συγκεντρώσεις των HbA2 (α 2 δ 2 ) και HbA (α 2 β 2 ), αντίστοιχα. Εικόνα 9.: Θέση των cis-ρυθμιστικών στοιχείων των υποκινητών των γονιδίων του ανθρώπινου β- γονιδιακού τόπου, σχετικά με την Cap-περιοχή τους (που υποδεικνύεται με βέλος) (Patrinos and Antonarakis, 2010). Επιπλέον, στο γονίδιο της ανθρώπινης β-σφαιρίνης έχει βρεθεί ένας ενισχυτής bp μετά τη 3' UTR περιοχή (Trudel and Costantini, 1987). Ο ενισχυτής αυτός φέρει πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης για τον παράγοντα NF-Ε1 (deboer et al., 1988) και εμπλέκεται στη ρύθμιση της αναπτυξιακής και ιστοειδικής έκφρασης του γονιδίου της β-σφαιρίνης (Antoniou et al., 1988). A.6.2 Η περιοχή ελέγχου LCR του γονιδιακού τόπου των β-σφαιρινών (β-lcr) Στα τέλη του 1980, βρέθηκε ότι η έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών εξαρτάται από απομακρυσμένα ρυθμιστικά στοιχεία, ανοδικά του συμπλέγματος. Τα στοιχεία αυτά συναποτελούν τις περιοχές τοπικού ελέγχου LCR (Locus Control Region). Οι περιοχές τοπικού ελέγχου LCR προσδιορίζονται λειτουργικά από την ικανότητά τους να ενισχύουν την έκφραση των συνδεδεμένων με αυτές τις περιοχές ελέγχου γονιδίων σε φυσιολογικά επίπεδα, κατά ιστοειδικό και εξαρτώμενο από τον αριθμό των αντιγράφων τρόπο, σε έκτοπες περιοχές χρωματίνης. Η περιοχή LCR συνίσταται από υπερευαίσθητες θέσεις στην DNAάση I (Hypersensitive Sites, HS) στη χρωματίνη των κυττάρων. Τα καθοριστικά στοιχεία σε κάθε ξεχωριστή περιοχή HS αποτελούνται από συστοιχίες θέσεων πρόσδεσης πολλαπλών γενικών και ειδικών (lineage specific) μεταγραφικών παραγόντων (Li et al., 2002). 23

24 Η περιοχή ελέγχου LCR εντοπίστηκε για πρώτη φορά στον ανθρώπινο β-γονιδιακό τόπο. Οι πρώτες μελέτες έδειξαν ότι ένα τμήμα 5kb του β-σφαιρινικού γονιδίου, περιλαμβάνοντας μια περιοχή υποκινητή μεγέθους 1.5 kb, εκφράστηκε σε κυτταρικές σειρές ερυθρολευχαιμικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι αυτό το τμήμα περιλαμβάνει όλα τα απαραίτητα ρυθμιστικά στοιχεία για την ορθή έκφραση του γονιδίου. Παρόλα αυτά, αυτό το τμήμα δεν προήγαγε ομοιόμορφα την γονιδιακή έκφραση σε διαγονιδιακά ποντίκια (Magram et al., 1985, Townes et al., 1985, Kollias et al., 1986). Το γονίδιο εκφράστηκε σε μικρό ποσοστό των διαγονιδιακών ποντικών, αλλά η έκφραση ήταν πολύ χαμηλότερη από τα φυσιολογικώς σημαντικά επίπεδα και διέφερε μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Αυτά τα ευρήματα υπέδειξαν ότι ένα μείζον ρυθμιστικό στοιχείο απαραίτητο για την συνεχή και υψηλού επιπέδου έκφραση in vivo έλειπε από αυτή τη μοριακή κατασκευή. Ενδείξεις που αφορούσαν στην φύση του στοιχείου που έλειπε προήλθαν από διάφορες παρατηρήσεις. Για παράδειγμα, παρατηρήθηκε ότι σε κάποιες μορφές της β-μεσογειακής αναιμίας τα γονίδια του β- γονιδιακού τόπου ήταν δομικά άθικτα, αλλά δεν εκφράζονταν (Kioussis et al., 1983, Driscoll et al., 1989). Έτσι εντοπίστηκε μια μεγάλη έλλειψη, που απαλείφει το β- σφαιρινικό γονίδιο. Πειραματικά, η έλλειψη αυτή οδήγησε σε μια κλειστή διαμόρφωση χρωματίνης που εκτεινόταν σε ολόκληρο τον γονιδιακό τόπο και είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης (Kioussis et al., 1983, Forrester et al., 1990). Επομένως, αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι το DNA τμήμα που απουσίαζε περιελάμβανε ένα απολύτως απαραίτητο cis-ρυθμιστικό στοιχείο, αναγκαίο για την β-γονιδιακή έκφραση in vivo. Όταν, λοιπόν, σε διαγονιδιακά ποντίκια η περιοχή LCR απουσίαζε, η μεταγραφή του ανθρώπινου β-σφαιρινικού γονιδίου έφτανε συνήθως σε επίπεδο λιγότερο από 1% του ενδογενούς β-σφαιρινικού mrna του ποντικού (Magram et al., 1985, Townes et al., 1985, Kollias et al., 1986). Η καθοριστική απόδειξη για την ύπαρξη της ρυθμιστικής περιοχής LCR προήλθε από μελέτες διαγονιδιακών ποντικών (Grosveld et al., 1987). Η σύνδεση αυτής της περιοχής με ένα β-σφαιρινικό γονίδιο σε μια ενιαία μοριακή κατασκευή είχε ως αποτέλεσμα την έκφραση του γονιδίου σε ένα επίπεδο συγκρίσιμο με τα ενδογενή β- σφαιρινικά γονίδια του ποντικού, κατά τρόπο εξαρτώμενο από την θέση και τον αριθμό των αντιγράφων. Οι ρυθμιστικές περιοχές LCR έχουν περιγραφεί σε ευρύ φάσμα γονιδιακών συστημάτων πολλών θηλαστικών, υποδεικνύοντας ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Li et al., 2002). 24

25 A.6.3 Οι ιδιότητες της περιοχής ελέγχου LCR 1. Ιδιότητα «ενισχυτή» Αποδεδειγμένα η περιοχή β-lcr αποτελεί ισχυρό στοιχείο ελέγχου της μεταγραφής, έχει μήκος 16kb και βρίσκεται 6-22 kb ανοδικά του εμβρυονικού ε-γονιδίου. Αποτελείται από πέντε υπερευαίσθητες στην DNάση I περιοχές, τις HS1 έως HS5, αριθμημένες 5 3. Οι περιοχές HS1 έως HS4 σχηματίζονται μόνο σε ερυθροποιητικά κύτταρα, ενώ η HS5 μπορεί να εντοπιστεί σε πολλές κυτταρικές σειρές (Li et al., 1999). Τα HS1-HS5 εδράζουν σε απόσταση 6,11,15,18 και 21,5kb αντίστοιχα, από τη θέση Cap του γονιδίου της σφαιρίνης ε (Shih et al., 1993). Εκτός από τις πέντε αυτές υπερευαίσθητες θέσεις, έχουν παρατηρηθεί και άλλες δύο τουλάχιστον HS περιοχές που βρίσκονται ανοδικά του 5' άκρου της LCR περιοχής και ονομάζονται HS6 και HS7 (Bulger and Groudine, 1999). Οι αποστάσεις τους από τη θέση έναρξης της μεταγραφής του ε-γονιδίου είναι 25kb και 28kb αντίστοιχα. Η δράση ενισχυτή του β-σφαιρινικού LCR εντοπίζεται στις HS2, 3 και 4, αλλά όχι στις HS1 ή ΗS5 περιοχές. Η HS2 περιοχή συμπεριφέρεται ως κλασσικός ενισχυτής. Η δράση ενισχυτή στις HS3 ή HS4 περιοχές μπορεί να ανιχνευτεί μόνο όταν είναι ενσωματωμένες σε χρωματίνη. Η προϋπόθεση αυτή υποδεικνύει ότι η τροποποίηση της δομής της χρωματίνης μπορεί να εμπλέκεται στην επαγωγή του ρόλου ενισχυτή αυτών των δύο περιοχών HS. H 5 HS5 περιοχή λειτουργεί ως μονωτής της χρωματίνης (Li and Stamatoyannopoulos, 1994, Li et al., 2002, Farrell et al., 2002). Η λειτουργία της 5 HS1 περιοχής μένει ακόμα να προσδιοριστεί. Η δράση «ενισχυτή» των 5 HSs 2 4 περιοχών εντοπίζεται σε ένα τμήμα bp, που περιλαμβάνει μια συστάδα περιοχών πρόσδεσης για γενικούς και ερυθροειδικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Μια συντηρημένη αλληλουχία μέσα στη 5 HS2 περιοχή, η TGCTGA(C/G)TCA(T/C), είναι κρίσιμη για την ισχυρή δράση ενισχυτή (Ney et al., 1990), (Talbot and Grosveld, 1991). Αυτή η αλληλουχία αποτελεί ένα «στοιχείο αναγνώρισης Maf» (MARE) και προσδένονται σε αυτή πολλαπλοί ομοδιμερείς και ετεροδιμερείς μεταγραφικοί παράγοντες (Motohashi et al., 1997). Σε αυτούς περιλαμβάνονται Maf ομοδιμερή, ετεροδιμερή με Maf υπομονάδες και άλλες bzip πρωτεΐνες (NF-E2,Nrf1, Nrf2, Bach1, Bach2), και ετεροδιμερή χωρίς Maf υπομονάδα (API). Η NF-E2 είναι η κύρια πρωτεΐνη που ανιχνεύεται σε πυρηνικά εκχυλίσματα από ερυθρολευχαιμικά κύτταρα ποντικού (MEL) και προσδένεται σε παράλληλα 25

26 MAREs του 5 HS2, ενώ η έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων συσχετίζεται στενά με το επίπεδο της δραστικότητας πρόσδεσης του NF-E2 (Kotkow and Orkin, 1995). Φαίνεται πως ο β-γονιδιακός τόπος υφίσταται σε μια συστατικά ανοικτή διαμόρφωση χρωματίνης πριν την τελική διαφοροποίηση των ερυθροβλαστών, και η προσέλκυση του NF-E2 συμπλόκου στο LCR και στους ενεργούς υποκινητές μπορεί να είναι ένα περιοριστικό βήμα ελέγχου στην ενεργοποίηση της έκφρασης των β-σφαιρινικών γονιδίων (Sawado et al., 2001). Ενώ η in vivo συσχέτιση του NF-E2 με την HS2 θέση της β-lcr περιοχής επιβεβαιώνεται με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης (ChIP assay) (Shivdasani and Orkin, 1995). Οι LCR λειτουργίες μπορεί να επιδρούν στην βασική μεταγραφική μηχανή άμεσα. Η RNA πολυμεράση II (pol II), ένα από τα βασικά συστατικά της ευκαρυωτικής μεταγραφικής μηχανής, βρέθηκε ότι σχετίζεται με την β-σφαιρινική LCR περιοχή κατά τρόπο ανεξάρτητο των p45/nf-e2, ενώ η προσέλκυσή της στον υποκινητή απαιτούσε τα p45/nf-e2. Τα δεδομένα αυτά καταδεικνύουν ότι η pol II προσεγγίζει την περιοχή LCR και τα p45/ NF-E2 επάγουν την μεταφορά της pol II στον αντίστοιχο υποκινητή, έχοντας ως αποτέλεσμα την μεταγραφική ενεργοποίηση (Johnson et al., 2001). Η ιδιότητα ενισχυτή της β-σφαιρινικής LCR περιοχής είναι ιστοειδική. Αυτό έχει ως συνέπεια η έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων να περιορίζεται σε ερυθροποιητικά κύτταρα. Επιπλέον, η β-σφαιρινική LCR περιοχή μπορεί να ενισχύσει την έκφραση των μη-σφαιρινικώνγονιδίων. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η ιστοειδικότητα δεν αποτελεί στην πραγματικότητα εγγενή ιδιότητα της LCR περιοχής, αλλά εξαρτάται και από τον υποκινητή με τον οποίο αλληλεπιδρά (Li et al., 2002). 2. Δράση «διάνοιξης της χρωματίνης κλειστής δομής» Μια άλλη ικανότητα των περιοχών LCR είναι να προσφέρουν ανεξάρτητη της θέσης, εξαρτώμενη από τον αριθμό των αντιγράφων (copy number-dependent) έκφραση ενός συνδεδεμένου γονιδίου (Grosveld et al., 1987). Η βασισμένη στον αριθμό των αντιγράφων έκφραση θεωρείται ενδεικτική της «χρωματίνης ανοικτής δομής», που καθιστά το DNA προσβάσιμο σε μεταγραφικούς παράγοντες. Η εμπλοκή της β- σφαιρινικής LCR περιοχής στην διάνοιξη της δομής της χρωματίνης προτάθηκε από την ανάλυση μεταλλάξεων στη β-μεσογειακή αναιμία με ελλείψεις της LCR περιοχής (Kioussis et al., 1983, Forrester et al., 1990). Στην ισπανική μορφή της β-μεσογειακής 26

27 αναιμίας παρατηρείται έλλειψη μιας περιοχής 35kb ανοδικά της 5 HS1 περιοχής, αλλά το υπόλοιπο τμήμα του β-γονιδιακού τόπου παραμένει άθικτο. Παρόλα αυτά κανένα από τα σφαιρινικά γονίδια δεν εκφράζεται. Η έλλειψη αυτή επιφέρει μια «κλειστή διαμόρφωση χρωματίνης» που εκτείνεται σε ολόκληρο το β-γονιδιακό τόπο (Forrester et al., 1990). Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, μόνο η άθικτη περιοχή LCR (5 HS1-5) μπορεί να παρέχει ανεξάρτητη της θέσης δράση διάνοιξης της χρωματίνης σε διαγονιδιακά ποντίκια που φέρουν ένα αντίγραφο ολόκληρου του β-γονιδιακού τόπου (Milot et al., 1996). Επίσης, σε διαγονιδιακά ποντίκια που έφεραν ένα αντίγραφο μικρών, ανασυνδυασμένων 5 HS-σφαιρινικών γονιδίων, μόνο η 5 HS3 περιοχή ήταν ικανή να προσφέρει γονιδιακή έκφραση εξαρτώμενη από τον αριθμό των αντιγράφων. Αυτές οι παρατηρήσεις οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η 5 HS3 περιοχή διαθέτει την κύρια ικανότητα διάνοιξης της δομής της χρωματίνης του β-γονιδιακού τόπου (Ellis et al., 1996). Παρόλα αυτά, η δράση διάνοιξης της χρωματίνης της 5 HS3 περιοχής μπορεί να μην είναι η πλέον καθοριστική, καθώς εξαρτάται από την σύνθεση του αντίστοιχου ανασυνδυασμένου μορίου (Li and Stamatoyannopoulos, 1994). Ο εντοπισμός των υπερευαίσθητων περιοχών, είναι αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης πολλαπλών γενικών και ερυθροειδικών trans-δραστικών παραγόντων στις HS περιοχές (Goodwin et al., 2001). 3. Ικανότητα ρύθμισης του χρόνου έναρξης της αντιγραφής Το γονιδίωμα των θηλαστικών αποτελείται από καλά καθορισμένες ζώνες που υφίστανται αντιγραφή DNA κατά έναν προγραμματισμένο τρόπο κατά τη διάρκεια της φάσης S του κυτταρικού κύκλου. Μελέτες γονιδίων έχουν δείξει ότι υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του χρόνου έναρξης της αντιγραφής και της γονιδιακής έκφρασης. Ο ανθρώπινος β-γονιδιακός τόπος αντιγράφεται καθυστερημένα στους περισσότερους κυτταρικούς τύπους, αλλά νωρίς στους ερυθροβλάστες (Epner et al., 1988, Dhar et al., 1989). Τα δεδομένα από ανάλυση φθορισμού από in situ υβριδισμό (Fluorescence in situ hybridization, FISH) σε διαγονιδιακά ποντίκια έδειξαν ότι η β-σφαιρινική LCR περιοχή ήταν ικανή να καθορίσει την έναρξη του χρόνου αντιγραφής κατά τρόπο εξαρτώμενο από το αναπτυξιακό στάδιο in vivo (Simon et al., 2001), που πιθανόν συσχετίζεται με την ικανότητα δημιουργίας ανοικτής δομής της χρωματίνης. Άλλα 27

28 αποτελέσματα πειραμάτων, στα οποία έγινε στοχευμένη απαλοιφή της LCR περιοχής έδειξαν ότι η πρώιμη έναρξη της αντιγραφής και η ανοικτή δομή χρωματίνης δεν εγγυώνται από μόνες τους υψηλά επίπεδα μεταγραφής των γονιδίων των σφαιρινών στους ερυθροβλάστες. Επομένως, μια όχι καλά καθορισμένη ομάδα cis-δραστικών στοιχείων μπορεί να παίζει ρόλο στον έλεγχο της έναρξης του χρόνου αντιγραφής, ανεξάρτητα της μεταγραφής. 4. Ιδιότητα τροποποίησης των ιστονών Η επίδραση των περιοχών LCR στην ακετυλίωση της χρωματίνης έχει μελετηθεί σε διαφορετικά πρότυπα συστήματα. Η ακετυλίωση προκαλεί μείωση της στενής επαφής του βασικού πυρήνα των ιστονών με το DNA, καθιστώντας συγκεκριμένα γονίδια περισσότερο προσβάσιμα στην μεταγραφική μηχανή (Witt et al., 2003). Η έλλειψη των 5 HS2-5 περιοχών της ανθρώπινης β-σφαιρινικής LCR περιοχής δεν επηρέασε το γενικό πρότυπο της ακετυλίωσης της ιστόνης H4 του β-γονιδιακού τόπου σε διαγονιδιακά ζώα (Schübeler et al., 2000). Άλλες μελέτες έδειξαν ότι παρόλο που η απαλοιφή της β-σφαιρινικής περιοχής LCR του ποντικού μείωσε τα επίπεδα της μεταγραφής των γονιδίων του β-γονιδιακού τόπου, δεν μετέβαλε το πρότυπο ακετυλίωσης των ιστονών H3 ή H4 στην περιοχή του υποκινητή (Schübeler et al., 2001). Επομένως, η ακετυλίωση της ιστόνης H3 ή H4 στον β-σφαιρινικό υποκινητή πιθανόν να είναι ανεξάρτητη της λειτουργίας της LCR περιοχής. Βρέθηκε όμως ότι ο μεταγραφικός παράγοντας NF-E2 απαιτείται για την υπερακετυλίωση των ιστονών στον β-σφαιρινικό υποκινητή των ενηλίκων, αλλά όχι στην περιοχή LCR (Johnson et al., 2001), (Forsberg et al., 2000). Άλλα δεδομένα έδειξαν ότι η β- σφαιρινική περιοχή LCR και οι μεταγραφικά ενεργοί υποκινητές εμπλουτίστηκαν σε ακετυλιωμένες ιστόνες στο εμβρυϊκό ήπαρ, σε ίδιο επίπεδο με τον εμβρυϊκό εγκέφαλο, ενώ οι ανενεργοί υποκινητές ήταν υποακετυλιωμένοι. Αντίθετα, η περιοχή LCR και οι ενεργοί και ανενεργοί υποκινητές ήταν υποακετυλιωμένοι στον λεκιθικό ασκό. Η 5 HS2 περιοχή ήταν επίσης υπερακετυλιωμένη σε ES κυτταρικές σειρές, δηλαδή σε πολυδύναμα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ποντικών που προέρχονται από τον επιβλαστικό ιστό από την εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης, ενώ οι β-σφαιρινικοί υποκινητές ήταν υποακετυλιωμένοι. Επομένως, το πρότυπο ακετυλίωσης διαφέρει στα διαφορετικά στάδια της οντογένεσης. Οι δυναμικές δράσεις ακετυλίωσης και απακετυλίωσης των ιστονών 28

29 παίζουν ενδεχομένως σημαντικό ρόλο στον αναπτυξιακό έλεγχο της έκφρασης των β- σφαιρινικών γονιδίων (Forsberg et al. 2000). 5. Επίδραση στην μεθυλίωση της χρωματίνης Η μεθυλίωση του DNA παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των θηλαστικών, γιατί ελέγχει την γονιδιακή έκφραση μέσω της δημιουργίας κλειστής δομής χρωματίνης και της γονιδιακής αποσιώπησης. Κατά την ανάπτυξη, γονιδιακοί τόποι που εκφράζονται με ιστοειδικό τρόπο απομεθυλιώνονται επιλεκτικά στους κατάλληλους κυτταρικούς τύπους με διαδικασίες ελάχιστα κατανοητές. Οι περιοχές ελέγχου LCR μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην ιστοειδική απομεθυλίωση του DNA. Τα ανθρώπινα εμβρυϊκά γ-σφαιρινικά γονίδια βρέθηκαν να είναι υπομεθυλιωμένα σε ιστούς όπου φυσιολογικά εκφράζονται (εμβρυϊκό ήπαρ), αλλά ήταν ισχυρά μεθυλιωμένα σε ιστούς όπου επιτελείται η ερυθροποίηση κατά την ενήλικο ζωή, όπως στο μυελό των οστών, αλλά και σε μη-ερυθροειδικούς ιστούς. Σε μια μελέτη όπου απομονώθηκαν ερυθροβλάστες από τον λεκιθικό ασκό, εμβρυϊκό ήπαρ 6-12 εβδομάδων, καθώς και ενήλικο μυελό των οστών, η υπομεθυλίωση στις περιοχές των ε-, γ- και β-γονιδίων σχετίστηκε θετικά με την έκφραση στους διαφορετικούς αυτούς ιστούς (Mavilio et al., 1983). Ανάλυση μεθυλίωσης στο β-γονιδιακό τόπο πραγματοποιήθηκε και σε άλλη μελέτη, σε DNA από ορθοχρωματικούς νορμοβλάστες από το περιφερικό αίμα ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία ή εκ γενετής αιμολυτική αναιμία μετά από σπληνεκτομή. Ελήφθησαν δείγματα αίματος από έξι ενήλικες ασθενείς, στους οποίους παρατηρήθηκαν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των γ-γονιδίων. Αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης και γονιδιακής δραστηριότητας παρατηρήθηκε για πέντε από τις οκτώ περιοχές που αναλύθηκαν. Μια περιοχή καθοδικά του β-γονιδίου ήταν πάντα μη-μεθυλιωμένη. Δύο περιοχές που οριοθετούν το ε-γονίδιο ήταν πάντοτε μεθυλιωμένες και δύο περιοχές 5 ως προς τα δύο γ-γονίδια, ήταν πάντα υπομεθυλιωμένες. Η υπομεθυλίωση αυτή συσχετίστηκε με την αυξημένη γ-γονιδιακή έκφραση στους ασθενείς. Μια περιοχή ανοδικά του δ-γονιδίου ήταν μη-μεθυλιωμένη στους νορμοβλάστες όπως και στα λευκά αιμοσφαίρια. Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι η μεθυλίωση σε συγκεκριμένες χρωμοσωμικές περιοχές συμμετέχει καθοριστικά στην ρύθμιση της έκφρασηςτων γονιδίων του β-σφαιρινικού συμπλέγματος στους ανθρώπους (Oppenheim et al., 1985). 29

30 Τρείς μηχανισμοί προτάθηκαν ως οι πιο πιθανοί να επιτελούν την διαμεσολαβούμενη από μεθυλίωση καταστολή της μεταγραφής: 1) Άμεση αλληλεπίδραση με την πρόσδεση των ειδικών μεταγραφικών παραγόντων. Ο μόνος μεταγραφικός παράγοντας που διαθέτει CpG ως μέρος της περιοχής πρόσδεσής του είναι ο Sp1 και η μεθυλίωση δεν επηρεάζει την πρόσδεση και την λειτουργία του παράγοντα αυτού. 2) Εδραίωση μιας ανενεργού δομής χρωματίνης. Μη-μεθυλιωμένες DNA αλληλουχίες, μετά την ενσωμάτωση σε κυτταροκαλλιέργεια ήταν όλες ευαίσθητες σε DNAάση I, σε αντίθεση με DNA αλληλουχίες που είχαν μεθυλιωθεί in vitro πριν την διαμόλυνση, και ήταν ανθεκτικές σε DNάση. Άρα, η CpG μεθυλίωση από μόνη της μπορεί να επάγει σχηματισμό ανενεργού χρωματίνης. 3) Πρόσδεση των μέθυλ-cpg προσδενόμενων πρωτενών. Έχει αποδειχτεί ότι ένα σύμπλοκο, με ηλεκτροφορητική κινητικότητα παρόμοια με το MeCP-1, σχηματίζεται με τον μεθυλιωμένο και όχι τον μη-μεθυλιωμένο σφαιρινικό υποκινητή. Υποδεικνύεται ένας ρόλος για το MeCP-1, ή παρόμοιο σύμπλοκο, στην αναπτυξιακή αποσιώπηση των εμβρυονικών σφαιρινικών γονιδίων στην φυσιολογική ερυθροποίηση. Μετά την ανασκόπηση αυτή, συμπεραίνει κανείς ότι ο κύριος ρόλος της β- σφαιρινικής περιοχής LCR είναι η in vivo δημιουργία και διατήρηση της χρωματίνης ανοικτής δομής μέσα στο β-γονιδιακό τόπο. Επίσης βασικός ρόλος της είναι και η ενίσχυση της μεταγραφής. Η ανοικτή δομή της χρωματίνης επιτρέπει την πρόσβαση σε μεταγραφικούς παράγοντες και τη συναρμολόγηση μιας ενεργού μεταγραφικής μηχανής. Η διάνοιξη της δομής της χρωματίνης διευκολύνεται από την αύξηση στην ευαισθησία σε DNάση I ή άλλες νουκλεάσες. Στον παρακάτω πίνακα συνοψίζονται οι επιμέρους ιδιότητες των υπερευαίσθητων στην DNAάση I περιοχών (HS) της περιοχής LCR: 30

31 Πίνακας 1: Σύνοψη των ιδιοτήτων των υπερευαίσθητων στην DNαση I περιοχών της περιοχής ελέγχου LCR. HS1 Η παρουσία μόνο αυτής κρατά τα επίπεδα της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος χαμηλά. Μαζί με τις υπόλοιπες HS του πυρήνα της LCR περιοχής (HS1-4) είναι οι κύριες υπεύθυνες περιοχές για την έκφραση των γονιδίων της β-σφαιρίνης. ΗS2 Έχει την πιο ισχυρή δραστικότητα ενισχυτή. Περιέχει έναν ενισχυτή ο οποίος αποτελείται από δύο διαδοχικές θέσεις, μία για τον γενικό παράγοντα Ap-1 και μία για τον ειδικό NF-E2. Οι θέσεις αυτές εντοπίζονται προς το 5 άκρο της HS2 θέσης. Συμβάλλει ουσιαστικά στην έκφραση του γενετικού τόπου σε όλες τις φάσεις της ανάπτυξης. HS3 Ευθύνεται για το 30% της συνολικής δράσης της περιοχής LCR. Έχει την μέγιστη ενεργότητα στο να ανοίγει και να επαναδιαμορφώνει την «κλειστή» χρωματίνη των περιοχών μεταξύ των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης. Είναι άκρως απαραίτητη για το σχηματισμό του «κέντρου ενεργού χρωματίνης» (active chromatin hub, ACH) δομής, συμβάλλοντας σημαντικά στη σταθερότητά της. HS4 Έχει χαμηλή δραστηριότητα κατά την διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, η οποία αυξάνεται κατά την ενήλικο φάση, συμβαδίζοντας με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της β- σφαιρίνης. Η έκφραση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης και της β-σφαιρίνης είναι χαμηλότερη με την παρουσία της HS2 θέσης παρά με την παρουσία των HS3 και HS4 θέσεων. HS5 Έχει δράση μονωτή της χρωματίνης, όπως και η 3 HS1 θέση της ίδιας περιοχής. 31

32 A.6.4 Μηχανισμοί ενεργοποίησης των σφαιρινικών γονιδίων από την περιοχή ελέγχου LCR ACH: Active Chromatin Hub Ένα από τα μοντέλα που ερμηνεύει τη ρυθμιστική δράση των στοιχείων της περιοχής LCR στα γονίδια των σφαιρινών είναι το μοντέλο «Active Chromatin Hub» (ACH) (κέντρο ενεργού χρωματίνης). Έχει αποδειχτεί από μελέτες σε διαγονιδιακά ποντίκια ότι τα γονίδια των σφαιρινών εκφράζονται με έναν «ανταγωνιστικό» τρόπο. Αυτός ο εναλλακτικός τρόπος μεταγραφής επιτρέπει μόνο ένα γονίδιο του β-γονιδιακού τόπου να μεταγράφεται μια δεδομένη χρονική στιγμή (Drissen et al., 2004). Ο ανταγωνισμός μεταξύ υποκινητών για την αλληλεπίδραση με ενισχυτές για το σχηματισμό του ACH είναι το σημαντικότερο στοιχείο ερμηνείας αυτού του φαινομένου. Ο ανταγωνισμός κρίνεται από την απόσταση του κάθε υποκινητή από τον ενισχυτή, από την θέση των ανταγωνιστικών γονιδίων και από την συγγένεια (affinity) του κάθε υποκινητή για έναν ενισχυτή (Choi and Engel, 1988, de Laat and Grosveld, 2003). Στους άωρους ερυθροβλάστες, η περιοχή ελέγχου LCR δεν αλληλεπιδρά με τα γονίδια του γονιδιακού τόπου. Σε αυτή τη φάση σχηματίζεται το «Chromatin Hub» (CH), μια διαμόρφωση που σχηματίζεται από τις απομακρυσμένες υπερευαίσθητες περιοχές (HS), HS-111 και 3 HS1, μαζί με το LCR. Πιο συγκεκριμένα, από μελέτες χρωμοσωμικής διαμόρφωσης φάνηκε ότι η HS5 περιοχή του LCR αλληλεπιδρά με τα HS-111 και 3 HS1, για να σχηματιστεί το CH μέσω δημιουργίας βρόγχου. Έχει βρεθεί ότι ελλείψεις που περιλαμβάνουν το 3 HS1, έχουν ως αποτέλεσμα την αύξηση της μεταγραφής του γ-γονιδίου και συγκαταλέγονται στο σύνδρομο της «κληρονομικής εμμονής της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης» (hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH). Αυτό πιθανόν να οφείλεται στην ανταλλαγή περιοχών DNA και τοποθέτηση των ενισχυτών δίπλα στα γ-γονίδια. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι ο μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός (SNP, single nucleotide polymorphism) στο 3 HS1 (+179 C>T) έχει ως αποτέλεσμα την δημιουργία μιας περιοχής πρόσδεσης του παράγοντα GATA-1 και σχετίζεται με αυξημένη παραγωγή HbF σε ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία (Papachatzopoulou et al., 2007). Στους ώριμους ερυθροβλάστες, είτε κατά την εμβρυονική ή την εμβρυϊκή (fetal) ή την ενήλικο ζωή, σχηματίζεται το «Active Chromatin Hub» (ACH). Σε αυτή τη 32

33 διαμόρφωση συμμετέχουν ενεργά μαζί με τις περιοχές που υπάρχουν στο CH, και οι HS1-4 περιοχές της LCR περιοχής, που είναι οι κύριες υπεύθυνες για την αποτελεσματική έκφραση των β-σφαιρινικών γονιδίων. Φαίνεται πως πρωτίστως οι HS2 και HS3, και κυρίως η δεύτερη, είναι σημαντικές για την σταθεροποίηση της δομής και την αποτελεσματική μεταγραφή (Patrinos et al., 2004). Επίσης συμμετέχουν τα εκάστοτε ενεργά γονίδια με τα ρυθμιστικά τους στοιχεία (π.χ. υποκινητής), όποιο δηλαδή γονίδιο είναι ενεργό σε κάθε αναπτυξιακό στάδιο. Σημαντικά συντελούν στην ACH δομή και κατάλληλοι trans-ρυθμιστικοί πρωτεϊνικοί παράγοντες. Το σύνολο των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στον σχηματισμό της δομής ACH παραμένει άγνωστο. Τα γονίδια του β-γονιδιακού τόπου που δεν εκφράζονται σε δεδομένο αναπτυξιακό στάδιο, δε συμμετέχουν στο σχηματισμό της δομής της ACH διαμόρφωσης, αλλά σχηματίζουν βρόγχους εκτός αυτής. Χαρακτηριστικό παράδειγμα που υποστηρίζει αυτήν την υπόθεση είναι αυτό του συμπλέγματος των β-σφαιρινών στα ενήλικα ποντίκια. Τα εμβρυονικά γονίδια (εy και βη1), που παρεμβάλλονται μεταξύ της LCR και των γονιδίων των σφαιρινών των ενήλικων ποντικών, σχηματίζουν βρόγχο έξω από τη δομή του ACH. Ενδιαφέρον επίσης παρουσιάζει το γεγονός ότι στα εγκεφαλικά κύτταρα, όπου ολόκληρο το σύμπλεγμα των σφαιρινών παραμένει σιωπηλό, η χρωμοσωμική περιοχή υιοθετεί, στο σύνολό της, γραμμική διαμόρφωση στον πυρήνα (Tolhuis et al., 2002). Εικόνα 10.: (Α) Σχηματική αναπαράσταση του ανθρώπινου β-γονιδιακού τόπου. (Β) Δισδιάστατη αναπαράσταση των τρισδιάστατων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των HSs και των σφαιρινικών γονιδίων στα ερυθροκύτταρα. Η περιοχή LCR μαζί με τα περισσότερα 5 και 3 HSs σχηματίζουν την ACH, 33

34 μέσω της οποίας τα σφαιρινικά γονίδια αλληλεπιδρούν σταθερά για μεταγραφή υψηλού επιπέδου. Τα γονίδια αναπαριστώνται σε διαφορετικά χρώματα, ενδεικτικά της αλληλεπίδρασής τους με την περιοχή LCR εντός της διαμόρφωσης ACH κατά την ανάπτυξη (Patrinos et al., 2004). Φαίνεται γενικά ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην τρισδιάστατη οργάνωση του β-γονιδιακού τόπου. Ο μεταγραφικός παράγοντας KLF-1 είναι απαραίτητος για τον σχηματισμό της δομής ACH και την έκφραση του β-γονιδίου των σφαιρινών. KLF-1 -/- ποντίκια, στα οποία απουσιάζει πλήρως ο KLF-1, πεθαίνουν από αναιμία λόγω ελλειματικής έκφρασης των β-σφαιρινικών γονιδίων. Θέσεις πρόσδεσης του KLF-1 υπάρχουν στην περιοχή LCR, ειδικότερα στην περιοχή 5 HS3, αλλά και στον 3 ενισχυτή του β-γονιδίου των σφαιρινών. Για τις HS περιοχές έχει προταθεί ένας γενικός οργανωτικός ρόλος. Έτσι, ερυθροειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες, όπως ο KLF-1 και άλλοι παράγοντες αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης, μπορεί να καθιστούν αυτές τις περιοχές πρόσδεσης προσιτές στον CTCF ή παρόμοιους παράγοντες (Drissen et al., 2004). Εναλλακτικά, ο CTCF μπορεί να προσδεθεί πρώτος. Σε αυτή την περίπτωση ο CTCF και άλλες σχετικές πρωτεΐνες, μπορούν να δράσουν ως αυτοοργανωτικά μόρια, παρέχοντας ένα CH σύμπλοκο για την περαιτέρω ενίσχυση της δημιουργίας βρόγχου για τον σχηματισμό της δομής ACH, μέσω της δράσης επιπλέον παραγόντων στην LCR περιοχή και τα γονίδια του β-γονιδιακού τόπου (Patrinos et al., 2004). Είναι γνωστό ότι ο παράγοντας CTCF, που προσδένεται στην αλληλουχία CCCTC, έχει ως πρωτεύοντα ρόλο, πέρα από τις μεταγραφικές του ιδιότητες, την οργάνωση της δομής της χρωματίνης. Χάρη στις έντεκα χαρακτηριστικές του περιοχές με δομή «δακτυλίου ψευδαργύρου», μπορεί να προσδένεται στο DNA και να διαμεσολαβεί τις ενδο- και διαχρωμοσωμικές επαφές και αλληλεπιδράσεις (Phillips and Corces, 2009). Παράδειγμα μορίων που τροποποιούν την χρωματίνη και προσελκύονται από μεταγραφικούς παράγοντες αποτελούν οι ακετυλοτρασφεράσες των ιστονών (HAT). Όπως άλλωστε έχει προαναφερθεί, όλα τα στοιχεία του γονιδιώματος που συμμετέχουν στο σχηματισμό ACH στο σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης εμφανίζουν υψηλό βαθμό ακετυλίωσης των ιστονών (Schübeler et al., 2001), (Forsberg et al., 2000). Γενικά, λοιπόν, η οργάνωση μιας γονιδιακής περιοχής ακολουθεί τις ίδιες βασικές αρχές με αυτές της αναδίπλωσης της δομής ενός ενζύμου για το σχηματισμό ενός «ενεργού κέντρου», αλλά σε μεγαλύτερη κλίμακα. Η αρχική αναδίπλωση της γονιδιακής περιοχής δε χαρακτηρίζεται από ειδικότητα στις θέσεις πρόσδεσης, αλλά προσφέρει τη «μήτρα» (CH) που θα επιτρέψει τη σωστή και ακριβή αναδίπλωση της 34

35 περιοχής LCR με τα λοιπά στοιχεία για την τελική ενεργή διαμόρφωση της δομής ACH. Συνολικά, λοιπόν, έχει διαπιστωθεί ότι η εξαρτώμενη από το στάδιο της οντογένεσης έκφραση των γονιδίων της β-σφαιρίνης, ελέγχεται από έναν διττό ρυθμιστικό μηχανισμό, ο οποίος περιλαμβάνει: 1) Αποσιώπηση γονιδίων Η απαλοιφή των εν δυνάμει στοιχείων αποσιώπησης του ε-γονιδίου είχε ως αποτέλεσμα την κατάργηση της αποσιώπησης του γονιδίου αυτού, με αποτέλεσμα την παραμονή της έκφρασης του κατά την ερυθροποίηση στην ενήλικο ζωή (Raich et al., 1995). Αντίστοιχη αποσιώπηση έχει επιτευχθεί και για το ζ-γονίδιο (Spangler et al., 1990). Όσον αφορά στο γ-σφαιρινικό γονίδιο (HBG2), στον υποκινητή του ανιχνεύονται στοιχεία αρνητικής ρύθμισης. Ένα από αυτά εντοπίζεται μεταξύ των και -732, και αποτελεί μια θέση πρόσδεσης του παράγοντα GATA-1. O GATA-1 στρατολογεί στη θέση αυτή ένα σύμπλοκο αποσιώπησης της έκφρασης του γονιδίου HBG2.Μια μετάλλαξη εντός της περιοχής αυτής και συγκεκριμένα μια σημειακή μεταλλαγή T>G στη θέση -567, καταργεί την πρόσδεση του παράγοντα GATA-1, ενισχύοντας έτσι την έκφραση του γ-σφαιρινικού γονιδίου, το οποίο έτσι συνεχίζει να εκφράζεται κατά την ενήλικο ζωή (Chen et al., 2008). 2) Ανταγωνισμός γονιδίων Το μοντέλο αυτό προτείνει ότι η LCR περιοχή αλληλεπιδρά άμεσα με τα εγγύς ρυθμιστικά στοιχεία, όπως οι υποκινητές, και αυτή η αλληλεπίδραση καθορίζεται από μεταγραφικούς παράγοντες. Μόνο το γονίδιο που αλληλεπιδρά επιτυχώς με την LCR περιοχή εκφράζεται. Τέσσερα διαφορετικά μοντέλα έχουν προταθεί για να επεξηγηθεί η λειτουργία της LCR περιοχής σε σχέση με τον ανταγωνισμό των γονιδίων της σφαιρίνης: a) Looping model (δημιουργία βρόγχου) Το μοντέλο δημιουργίας βρόγχου προτείνει ότι οι HS περιοχές της β-σφαιρινικής LCR περιοχής δημιουργούν ένα «ολοσύμπλοκο», στο οποίο τα κεντρικά HS στοιχεία δημιουργούν μια δραστική περιοχή που προσδένει μεταγραφικούς παράγοντες και οι αλληλουχίες εκατέρωθεν των HS στοιχείων (core-flanking sequences) περιορίζουν το «ολοσύμπλοκο» σε μια σωστή διαμόρφωση. Δημιουργείται λοιπόν, ένας βρόγχος, ώστε η LCR περιοχή να έρθει κοντά στο χώρο με τον υποκινητή. Σε κάθε χρονική 35

36 στιγμή η περιοχή LCR αντιδρά με έναν μόνο υποκινητή ενός γονιδίου και ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο, εναλάσσονται αυτοί οι υποκινητές, μια διαδικασία γνωστή ως «flip-flop» (Li et al., 2002). b) Τracking (or scanning) model (μοντέλο ιχνηλάτησης) Το μοντέλο αυτό, προτείνει ότι οι ερυθροειδικοί, αλλά και οι γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες και συμπαράγοντες προσδένονται σε αλληλουχίες αναγνώρισης στην LCR περιοχή και σχηματίζουν ένα «σύμπλοκο ενεργοποίησης», που μεταναστεύει ή εντοπίζει γραμμικά κατά μήκος του συμπλέγματος των β-γονιδίων, τα κατάλληλα cisρυθμιστικά στοιχεία. Όταν αυτό το μεταγραφικό σύμπλοκο συναντήσει την βασική μεταγραφική μηχανή εντοπισμένη στον υποκινητή του ορθού γονιδίου, σύμφωνα με το αναπτυξιακό στάδιο, τότε συναρμολογείται το πλήρες μεταγραφικό σύμπλοκο και ξεκινά πλέον η μεταγραφή του εν λόγω γονιδίου (Patrinos and Antonarakis, 2010). c) Facilitated-tracking model (μοντέλο διευκολυμένης ιχνηλάτησης) Εδώ εισάγονται πτυχές και από τα δύο προηγούμενα μοντέλα. Αυτό το μοντέλο προτείνει, ότι το σύμπλοκο της LCR περιοχής μαζί με τα μόρια-συνενεργοποιητές, σχηματίζει έναν βρόγχο για να έρθει κοντά σε καθοδικές ρυθμιστικές περιοχές, απόμακρες από τον υποκινητή στον οποίο ασκούν ρυθμιστική δράση, ώστε να απελευθερωθεί εκεί το «μεταγραφικό σύμπλοκο». Αυτό το σύμπλοκο έπειτα, προχωρά με μικρά βήματα κατά μήκος της χρωματίνης μέχρι να συναντήσει τον κατάλληλο υποκινητή με τους ρυθμιστικούς του παράγοντες προσδεμένους επάνω του. Μια δομή «σταθερού βρόγχου» επιτυγχάνεται τότε και προχωράει έτσι η γονιδιακή έκφραση ( Patrinos and Antonarakis, 2010). d) Linking model (μοντέλο σύνδεσης) Αυτό το μοντέλο προτείνει ότι πρωτεΐνες διευθέτησης της χρωματίνης που δένονται κατά μήκος του β-γονιδιακού τόπου προσδιορίζουν την περιοχή, η οποία πρέπει να μεταγραφεί και καθορίζουν την δευτερογενή πρόσδεση ειδικών για το αναπτυξιακό στάδιο μεταγραφικών παραγόντων. Πρωτεΐνες-διαμεσολαβητές που δεν προσδένονται στο DNA σχηματίζουν μια συνεχή πρωτεΐνική αλυσίδα, από το LCR προς το γονίδιο σφαιρίνης που θα πρέπει να μεταγραφεί, φέρνοντας τελικά τους κατάλληλους πρωτεΐνικούς παράγοντες στον υποκινητή του ενεργά μεταγραφόμενου γονιδίου (Patrinos and Antonarakis, 2010). 36

37 Εικόνα 11.: Τέσσερα μοντέλα που επεξηγούν τον «ανταγωνισμό» μεταξύ των γονιδίων των σφαιρινών. (a) looping, (b) scanning, (c) facilitated scanning, (d) linking. Τα σκούρα γκρί κουτάκια αντιστοιχούν στα δομικά γονίδια, τα ανοιχτά γκρί, στα κοντινά ρυθμιστικά στοιχεία των γονιδίων, μικροί και μεγάλοι κύκλοι αντιστοιχούν σε ποικίλους μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεΐνες τροποποίησης των ιστόνων, αντίστοιχα, και τα ανάγλυφα κουτάκια αντιστοιχούν στις περιοχές HS της περιοχής ελέγχου LCR (Patrinos and Antonarakis, 2010). 37

38 A.7 Γενετικοί τροποποιητές που επιδρούν στον β-γονιδιακό τόπο Στην έκφραση γονιδίων της β-σφαιρίνης, επιδρούν γονιδιακοί τόποι είτε συνδεδεμένοι (linked) ή μη-συνδεδεμένοι (unlinked) με τον β-γονιδιακό τόπο. Στους συνδεδεμένους μπορούν να συγκαταλεγούν τα cis-δραστικά στοιχεία, τα οποία αποτελούν αλληλουχίες DNA που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που εντοπίζονται στο ίδιο μόριο DNA (χρωμόσωμα). Α.7.1 cis-δραστικά στοιχεία Έχουν γίνει συσχετισμοί, διάφορων μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP), και κάποιων ελλείψεων κοντά στο β-σφαιρινικό γονίδιο, με υψηλά επίπεδα HbF σε καταστάσεις όπως η δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD), αλλά και η β-μεσογειακή αναιμία (Thein, 2008). Αυτοί οι πολυμορφισμοί συντελούν στο σύνδρομο «κληρονομικής εμμονής της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης» (Hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH), στο οποίο συνεχίζει η παραγωγή της HbF στην ενήλικο ζωή και δεν γίνεται η μετάβαση προς την έκφραση της HbA. Η γενετικά καθορισμένη παραμονή της έκφρασης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) έχει δράση «εξομάλυνσης» στη β-μεσογειακή αναιμία και την δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD), οι οποίες αποτελούν τις πιο κοινές μονογονιδιακές νόσους σε παγκόσμια κλίμακα. Το σύνδρομο HPFH έχει εντοπιστεί κυρίως σε πάσχοντες από αυτές τις νόσους, κυρίως αφρικανικής και ελληνικής καταγωγής. Ένας από τους πολυμορφισμούς που αξίζει να αναφερθεί είναι μια αντικατάσταση C>T στη θέση -158 ανοδικά του G γ-γονιδίου, στην περιοχή του υποκινητή του G γ- σφαιρινικού γονίδιου, που δημιουργεί μια περιοριστική θέση για την περιοριστική ενδονουκλεάση XmnI. Αυτό το SNP έχει συσχετιστεί με υψηλή έκφραση HbF σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία και β-μεσογειακή αναιμία. Ειδικότερα, βρέθηκε ότι το αλληλόμορφο Τ στη θέση -158 σχετίζεται με 3-11 φορές αύξηση της HbF ανά G γ-γονίδιο, που είναι μια τάξη μεγέθους λιγότερο από την συσχέτιση που έχει βρεθεί για την αντικατάσταση -202 G>C με την HbF για G γ-β + - HPFH ασθενείς (Gilman and Huisman, 1985, Labie et al., 1985). Αυτή η -158 αντικατάσταση βρίσκεται κοντά σε μια ευαίσθητη στην DNάση I περιοχή, εντοπισμένη bp ανοδικά της Cap περιοχής του γ G γονιδίου. Πιθανόν, η -158 αντικατάσταση να αυξάνει την πιθανότητα η χρωματίνη της περιοχής αυτής να έχει ανοικτή δομή, 38

39 περισσότερο προσβάσιμη σε DNάση in vitro και σε μόρια της μεταγραφικής συσκευής του ώριμου ερυθροβλάστη in vivo (Gilman and Huisman, 1985). Η αντικατάσταση αυτή επιδρά στη ρύθμιση της παραγωγής εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, πιθανόν αλληλεπιδρώντας με παράγοντες σαν αυτούς που παράγονται κατά το αιμολυτικό στρες ή άλλους μοριακούς καθοριστές που δρουν στο β-γονιδιακό τόπο. Ο -158 G γ XmnI πολυμορφισμός (T αλληλόμορφο) είναι κοινός σε όλες τις πληθυσμιακές ομάδες και παρών σε συχνότητα Είναι πιθανό, οι άλλοι πολυμορφισμοί που εντοπίζονται στην περιοχή να αποτελούν δείκτες σε σύνδεδεμένοι με τον πολυμορφισμό αυτό (Thein, 2008). Παρακάτω συνοψίζονται οι πολυμορφισμοί που αποτελούν τις κυριότερες αιτίες για το σύνδρομο HPFH. 39

40 Πίνακας 2.: Μεταλλάξεις υπεύθυνες για την πρόκληση HPFH (HbVar: A database of Human Hemoglobin Variants and Thalassemias- ΟΝΟΜΑΣΙΑ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ -202 (C G) Gγ; nd-hpfh Gγ -202 C>G Gγ -197 (C>T) Gγ -197 C>T -175 (T C) Gγ; nd-hpfh Gγ -175 T>C -114 (C A) Gγ; the Alegrian nd-hpfh Gγ -114 C>A -114 (C T) Gγ; the Japanese nd-hpfh Gγ -114 C>T -114 (C G) Gγ; the Australian nd-hpfh Gγ -114 C>G -110 (A C) Gγ; the Czech nd-hpfh Gγ -110 A>C Venezuelan nd-hpfh Aγ -211 C>T -202 (C A) Aγ; nd-hpfh Aγ -202 C>A -198 (T C) Aγ; the British nd-hpfh Aγ -198 T>C Aγ -197 C>T Aγ -197 C>T -196 (C T) Aγ; the Italian nd-hpfh Aγ -196 C>T -195 (C G) Aγ; the Brazilian nd-hpfh Aγ -195 C>G -175 (T C) Aγ; the Black nd-hpfh Aγ -175 T>C Cretan HPFH Aγ -158 C>T -117 (G A) Aγ; the Greek-Italian nd-hpfh Aγ -117 G>A -117 (G A) Aγ; the Black-Greek nd-hpfh Aγ -117 G>A -114 (C T) Aγ; the Georgia nd-hpfh Aγ -114 C>T HPFH-6 Απαλοιφή νουκλεοτιδίων από το Gγ γονίδιο προς το β-γονίδιο 13bp έλλειψη (-CAATAGCCTTGAC at -114 έως Απαλοιφή Aγ νουκλεοτιδίων ); HPFH HPFH-3; Indian Απαλοιφή νουκλεοτιδίων από το HBBP1 γονίδιο στο β-γονίδιο προς το β-γονίδιο HPFH-2; Ghanian Απαλοιφή νουκλεοτιδίων από το HBBP1 προς το β-γονίδιο HPFH-1; Black Απαλοιφή νουκλεοτιδίων από το δ- προς το β-γονίδιο -200(+C) Gγ; the Tunisian nd-hpfh HPFH-4; Italian HPFH-7; Vietnamese HPFH-5; Italian 40

41 Ενδιαφέρον παρουσιάζουν και κάποιοι πολυμορφισμοί που δεν περιλαμβάνονται στον παραπάνω πίνακα και έχουν εντοπιστεί σε ομάδα ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD) από περιοχή της βορειοανατολικής Βραζιλίας. Οι πολυμορφισμοί που ξεχώρισαν και έδειξαν να σχετίζονται με τα επίπεδα της HbF, είναι στο Α γ-γονίδιο, το SNP -271 και στο G γ-γονίδιο, η έλλειψη -396_-391, και τα SNP, -369 και Οι περισσότεροι από τους ασθενείς που δεν έφεραν την έλλειψη -396_-391 είχαν επίπεδα HbF >5.0% (p < ). Η απουσία του μεταλλαγμένου αλληλομόρφου (Τ), για το SNP -271 στο Α γ-γονίδιο σχετίστηκε επίσης με υψηλότερα επίπεδα HbF (p < ). Αντίθετα, η παρουσία του μεταλλαγμένου αλληλομόρφου (G) για το SNP -369 σχετίστηκε με υψηλότερα επίπεδα HbF (p= 0.006) (Barbosa et al., 2010). Α.7.2 trans-δραστικά στοιχεία Ενώ τα cis-δραστικά στοιχεία, συντελούν μόνο στο 10-30% της ποικιλομορφίας που αφορά στην έκφραση του β-γονιδιακού τόπου και την διακύμανση των επιπέδων HbF, περισσότερο από 50% της ποικιλομορφίας των χαρακτηριστικών (trait variance) οφείλεται σε παράγοντες που δεν είναι συνδεδεμένοι με το β-σφαιρινικό σύμπλεγμα. Αυτοί οι παράγοντες δεν σχετίζονται με το σύνδρομο «κληρονομικής εμμονής της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης» (HPFH) και επιδρούν στα επίπεδα HbF σε άτομα φυσιολογικά που δεν φέρουν το σύνδρομο αυτό. Με πλατφόρμες γονοτύπησης υψηλής απόδοσης και βελτιωμένα εργαλεία βιοπληροφορικής κατέστη δυνατόν να χαρτογραφηθούν οι μη-συνδεδεμένοι ποσοτικοί γονιδιακοί τόποι (trait loci) (QTL) στις χρωμοσωμικές περιοχές Xp22, 6q23, 8q11 και 2p15(Craig et al., 1996). Ο μηχανισμός με τον οποίο τα μησυνδεδεμένα QTL των περιοχών Xp22, 6q23, 8q11 και 2p15 επιδρούν στα επίπεδα της HbF και των F-κυττάρων παραμένει άγνωστος. Κάποια από τα QTL ενδέχεται να κωδικοποιούν trans-δραστικούς παράγοντες που αλληλεπιδρούν με άλλους παράγοντες μέσα στo β-σφαιρινικό σύμπλεγμα, οι οποίοι άμεσα επιδρούν στην μεταγραφή των γονιδίων. Άλλα QTL, όπως η «HBS1L-MYB διαγονιδιακή περιοχή» (HBS1L-MYB intergenic region, HMIP) στο 6q23, επιδρούν στην παραγωγή F- κυττάρων τροποποιώντας την κινητική της ερυθροποίησης, όπως παρατηρείται στην ερυθροποίηση υπό στρες στην μεσογειακή αναιμία (Thein, 2008). 41

42 Η μελέτη για την εύρεση δυνητικών γονιδίων που να ελέγχουν τα επίπεδα της παραγωγής της HbF και να βρίσκονται εκτός του β-γονιδιακού τόπου, είναι εξαιρετικά δύσκολη, γιατί αυτό το χαρακτηριστικό μπορεί να ελέγχεται και να επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες. Α.7.3 QTL-γονιδιακοί τόποι που σχετίζονται με ποσοτικά γνωρίσματα Ποσοτικά γνωρίσματα (quantitative traits) αναφέρονται σε φαινότυπους (χαρακτηριστικά) που διαφέρουν σε βαθμό και μπορούν να αποδοθούν σε πολυγονιδιακές επιδράσεις, να αποτελούν δηλαδή προϊόντα δύο ή περισσότερων γονιδίων και του περιβάλλοντος τους. Έτσι, οι «γονιδιακοί τόποι που σχετίζονται με ποσοτικά γνωρίσματα» (Quantitative trait loci - QTL), είναι τμήματα DNA που περιλαμβάνουν ή συνδέονται με τα γονίδια που συντελούν στο ποσοτικό γνώρισμα. Αυτά τα QTL εντοπίζονται συχνά σε διαφορετικά χρωμοσώματα. Γνωρίζοντας τον αριθμό των QTL που συντελούν σε μια «παραλλαγή» (variation) ενός φαινοτυπικού γνωρίσματος, καταλαβαίνει κανείς την γενετική βάση του γνωρίσματος αυτού. Δηλαδή, φαίνεται εάν ένα γνώρισμα καθορίζεται από πολλά γονίδια μικρής επίδρασης ή από λίγα γονίδια, που το καθένα ασκεί μεγάλη επίδραση στο γνώρισμα αυτό. Από την άλλη, η γνώση ότι μια περιοχή του γονιδιώματος αποτελεί QTL, συντελεί στην ταυτοποίηση υποψήφιων γονιδίων που επιδρούν στο εν λόγω γνώρισμα. Η περιοχή αυτή μπορεί να υποστεί αλληλούχηση και η αλληλουχία των γονιδίων της περιοχής αυτής μπορεί να συγκριθεί με βάση δεδομένων DNA για γονίδια των οποίων η λειτουργία είναι ήδη γνωστή. Η χαρτογράφηση περιοχών του γονιδιώματος που περιλαμβάνουν γονίδια που εμπλέκονται σε ένα ποσοτικό γνώρισμα, επιτελείται με τη χρήση «μοριακών δεικτών» (molecular tags) όπως οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNP). Αυτό αποτελεί πρώιμο βήμα στην ταυτοποίηση και αλληλούχιση των γονιδίων που διέπουν την παραλλαγή ενός γνωρίσματος. Γενικά, ένα μοναδικό φαινοτυπικό γνώρισμα καθορίζεται συχνά από πολλά γονίδια. Συνεπώς, πολλά QTL συνδέονται με ένα μοναδικό γνώρισμα. Η έννοια των QTL και η σύνδεσή τους με γονίδια που καθορίζουν ένα δεδομένο γνώρισμα, εντάσσεται στο φαινόμενο της «επίστασης», στο οποίο οι επιδράσεις ενός γονιδίου τροποποιούνται από ορισμένα άλλα γονίδια, που ονομάζονται και «γονίδιατροποποιητές». 42

43 A.7.4 Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (single nucleotide polymorphisms, SNP) Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός (SNP) είναι μια παραλλαγή μιας αλληλουχίας DNA που εμφανίζεται όταν ένα νουκλεοτίδιο, A, T, C ή G, μιας συγκεκριμένης γονιδιακής θέσης μεταβάλλεται μεταξύ μελών μιας βιολογικής ταξινομικής βαθμίδας ή ομόλογων χρωμοσωμάτων σε ένα άτομο. Σχεδόν όλα τα γνωστά SNP διαθέτουν μόνο δύο αλληλόμορφα, είναι δηλαδή «διμορφικά». Η γονιδιακή κατανομή των SNP δεν είναι ομοιογενής. Τα SNP εμφανίζονται συνήθως συχνότερα σε μη-κωδικές παρά σε κωδικές περιοχές, ή γενικά όπου η φυσική επιλογή δρα και ευνοεί το αλληλόμορφο που αποτελεί την πιο ευνοϊκή γενετική προσαρμογή. Πέρα από την φυσική επιλογή, άλλοι παράγοντες όπως ο ανασυνδυασμός ή ο ρυθμός μεταλλαξιγένεσης, μπορούν επίσης να καθορίσουν την πυκνότητα των SNP. Αυτή μπορεί να προβλεφθεί από την παρουσία μικροδορυφορικού DNA, αφού οι περιοχές χιλιάδων νουκλεοτιδίων από τις οποίες αποτελείται, παρουσιάζουν αυξημένη ή μειωμένη πυκνότητα SNP, ανάλογα με την αλληλουχία του μικροδορυφορικού DNA. Μέσα σε έναν πληθυσμό, στα SNP μπορεί να αποδοθεί η «συχνότητα ήσσονος αλληλομόρφου» (minor allele frequency). Αυτή είναι ουσιαστικά, η μικρότερη συχνότητα παρατήρησης κάποιου αλληλομόρφου σε συγκεκριμένο πληθυσμό, ή, με άλλα λόγια, η μικρότερη συχνότητα ανάμεσα στα δύο αλληλόμορφα ενός διμορφικού SNP. Υπάρχουν μεταβολές στην συχνότητα εμφάνισης των αλληλομόρφων μεταξύ των ανθρώπινων πληθυσμών.ένα αλληλόμορφο ενός SNP που είναι το πιο κοινό σε μια γεωγραφική ή εθνική ομάδα, μπορεί να είναι πολύ πιο σπάνιο σε άλλη. Οι πολυμορφισμοί στο ανθρώπινο DNA μπορούν να καθορίσουν την ευαισθησία των ατόμων απέναντι σε νόσους και την απόκριση σε παθογόνα, χημικά, φάρμακα και άλλους παράγοντες. Τα SNP αποτελούν επίσης στοιχεία-κλειδιά στην ιδέα της εξατομικευμένης ιατρικής. Μεγάλη είναι η σημασία τους στην βιοϊατρική έρευνα, για την σύγκριση περιοχών του γονιδιώματος μεταξύ διαφορετικών ομάδων (για παράδειγμα ομάδα ασθενών έναντι υγιών ατόμων για μία νόσο, ίδιας εθνικής προέλευσης) σε «μελέτες συσχέτισης ολόκληρου του γονιδιώματος», GWAS (genome-wide association studies). Ένα μοναδικό SNP μπορεί ακόμη να προκαλέσει και μια Μενδελική νόσο. Περισσότερο περίπλοκες νόσοι, οφείλονται σε συνδυαστική παρουσία διαφορετικών SNP, δηλαδή σε απλοτύπους. 43

44 A.7.5 Προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό γενετικών τροποποιητών Υπάρχουν τρείς κύριες γενετικές προσεγγίσεις για τον εντοπισμό «γενετικών τροποποιητών», δηλαδή γονιδιακών τόπων (QTL) συνδεδεμένων και μη συνδεδεμένων με ένα συγκεκριμένο γενετικό γνώρισμα και των πολυμορφισμών, όπως SNP, εντοπισμένων μέσα σε αυτούς. Μια κλασσική προσέγγιση είναι οι «αναλύσεις σύνδεσης» (linkage analyses). Σε αυτές εντοπίζονται γονίδια ή πολυμορφισμοί παρακολουθώντας την κληρονομικότητα της γενετικής νόσου ή του γνωρίσματος, μέσω μεγάλων οικογενειών. H προσέγγιση αυτή είναι πολύ επιτυχημένη σε μονογονιδιακές νόσους (single gene disorders), αλλά παρουσιάζει περιορισμένη αποτελεσματικότητα σε κοινές νόσους που οφείλονται σε πιο πολυπαραγοντική βάση. Η αποτυχία ίσως οφείλεται στην χαμηλή κληρονομικότητα του γονιδιακού τόπου που ευθύνεται για την πολυπαραγοντική νόσο, την γενετική ετερογένεια, δηλαδή να εμπλέκονται στη νόσο περισσότεροι του ενός γενετικοί τόποι, σε μη καλά χαρακτηρισμένους φαινότυπους και σε μη ορθά σχεδιασμένες μελέτες (Hirschhorn and Daly, 2005), (Thein, 2008). Η δεύτερη προσέγγιση είναι οι «μελέτες συσχέτισης» (association studies). Σε αυτές γίνεται προσπάθεια ανίχνευσης διαφορών στις συχνότητες των γενετικών πολυμορφισμών μεταξύ ασθενών (cases) και υγιών (controls) ατόμων ίδιας εθνικότητας, με σκοπό τον εντοπισμό πολυμορφισμών που παρουσιάζουν ισχυρή συσχέτιση με τη νόσο ή το γενετικό γνώρισμα. Σε περίπτωση που κάποιο αλληλόμορφο (variant) είναι συχνότερο στους ασθενείς ως προς την ομάδα ελέγχου (controls), τότε συμπεραίνεται η ύπαρξη συσχέτισης (Hirschhorn and Daly, 2005). Σε τέτοιες μελέτες απαιτείται μεγάλος αριθμός δειγμάτων και καλά χαρακτηρισμένοι φαινότυποι. Μέχρι πρόσφατα τα υποψήφια γονίδια επιλέγονταν σε αυτές τις μελέτες με βάση τη γνώση γύρω από την παθοφυσιολογία της νόσου, με αποτέλεσμα να μην περιλαμβάνονται αρκετά και ίσως σημαντικά γονίδια στην μελέτη. Στις «μελέτες συσχέτισης γονιδιωματικής κλίμακας» (genome wide association studies) (GWAS) γίνεται μια «αμερόληπτη» σάρωση ολόκληρου του ανθρώπινου γονιδιώματος και επομένως είναι πολύ πιο πιθανό να εντοπιστούν με αυτή τη μέθοδο ανύποπτες αλληλεπιδράσεις. Βασική προϋπόθεση των GWAS είναι η περιεκτική και ευρεία κάλυψη της γονιδιωματικής αλληλουχίας. Είναι γενικώς αποδεκτό ότι 44

45 οποιαδήποτε δύο γονιδιώματα είναι ταυτόσημα κατά 99,9% και οι GWAS ψάχνουν για διαφορές μεταξύ των γονιδιωμάτων για τον εντοπισμό των «παραλλαγών» (πολυμορφισμών) που είναι πιο κοινές στους ασθενείς όταν συγκρίνονται με την υγιή ομάδα ελέγχου. Ο πιο κοινός τύπος των πολυμορφισμών που εντοπίζονται έτσι είναι οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNP). Θετικό για τις GWAS μελέτες είναι ότι τα SNP κληρονομούνται μαζί επάνω στον ίδιο κλώνο DNA ως ομάδες απλοτύπων (haplotype blocks). Έτσι, το γονιδίωμα θεωρείται ως μια σειρά από περιοχές με ισχυρή σύνδεση (linkage disequilibrium) (LD) ή απλότυπους διαχωρισμένους από μικρά τμήματα με πολύ μικρό LD, τα οποία αναφέρονται ως «θερμά σημεία ανασυνδυασμού» (recombination hotspots). Ισχυρή σύνδεση (LD) μέσα σε μια περιοχή του γονιδιώματος συνεπάγεται ότι οι περισσότεροι από τους πολυμορφισμούς μέσα σε αυτή την περιοχή μπορούν να χαρακτηριστούν μέσω πολύ λίγων μόνο «πληροφοριακών» (informative) SNP, τα οποία ονομάζονται «tagsnp». Μέσω των «tagsnp» διευκολύνονται και επιταχύνονται οι προσπάθειες γονοτύπησης, διότι αποφεύγεται η γονοτύπηση περιττών SNP. Στο τέλος του 2007, 3 εκατομμύρια SNP είχαν χαρτογραφηθεί (Altshuler et al, 2005). Ο κατάλογος των SNP αυτών που δημιουργήθηκε ονομάστηκε «HapMap». Τα tagsnps υπάρχουν διαθέσιμα εμπορικά ως «μικροσυστοιχίες»(microarrays) ή «τσιπ» για γονοτύπηση υψηλής απόδοσης δειγμάτων DNA (high throughput genotyping) (Thein, 2008). Η DNA μικροσυστοιχία, επίσης γνωστή ως DNA τσιπ, αποτελεί συλλογή μικροσκοπικών κηλίδων με ομοιοειδείς πληθυσμούς DNA ολιγονουκλεοτιδίων (DNA spots) σε συγκεκριμένες θέσεις σε μια στερεή επιφάνεια. Κυρίως χρησιμοποιούνται για την μέτρηση των επιπέδων έκφρασης μεγάλου αριθμού γονιδίων ταυτόχρονα ή όπως αναφέρθηκε παραπάνω, για την πολλαπλή γονοτύπηση περιοχών του γονιδιώματος. Όσον αφορά στον εντοπισμό SNP, η μικροσυστοιχία ονομάζεται SNP συστοιχία, και χρησιμοποιείται για την ανάλυση τέτοιων πολυμορφισμών μέσα σε έναν πληθυσμό. Κάθε DNA κηλίδα της μικροσυστοιχίας περιλαμβάνει picomoles (10 12 moles) από έναdna ολιγονουκλεοτίδιο, γνωστό ως «ιχνηθέτης» (probe). Αυτό χρησιμοποιείται για να υβριδοποιήσει ένα DNA ή RNA δείγμα, δηλαδή την αλληλουχία-στόχο (target) κάτω από συνθήκες υψηλής ειδικότητας. Ο υβριδισμός «ιχνηθέτη-στόχου» ανιχνεύεται και ποσοτικοποιείται με ανίχνευση συνήθως φθοριζουσας επισήμανσης των αλληλουχιών-στόχων. 45

46 A.7.6 QTL των χρωμοσωμάτων Xp22, 6q23, 8q11 και 2p15 A Xp22 Όσον αφορά στη θέση Xp22, που έχει χαρακτηριστεί και ως ο γονιδιακός τόπος της παραγωγής F-κυττάρων (F-cell production locus) (FCP), σχετίστηκε με τον αριθμό των F-κυττάρων σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD), αλλά κανένα υποψήφιο γονίδιο μέσα σε αυτό το QTL δεν ταυτοποιήθηκε και ο συγκεκριμένος συσχετισμός δεν αναπαράχθηκε σε άλλες μελέτες (Thein, 2008). Στην εν λόγω μελέτη, με μικροσκοπική ακτινικής ανοσοδιάχυσης (microscopic radial immunodiffusion) και κυτταρομετρία ροής-ανοσοφθορισμού προσδιορίστηκε το ποσοστό των F-δικτυοερυθροκυττάρων και F-κυττάρων σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD) και μη-αναιμικά άτομα. Παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα των F-κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερα σε μη-αναιμικές γυναίκες απ ότι σε άντρες. Η παραγωγή των F-κυττάρων, όπως προσδιορίστηκε από τα επίπεδα των F-δικτυοερυθροκυττάρων σε SCD γυναίκες ήταν επίσης υψηλότερα απ ότι σε SCD άντρες. Επιπλέον, με ανάλυση σύνδεσης (linkage analysis), χρησιμοποιώντας πολυμορφικές θέσεις περιορισμού κατά μήκος του Χ χρωμοσώματος, σε οκτώ SCD οικογένειες και μία οικογένεια υγιών ατόμων, εντοπίστηκε η παραγωγή των F-κυττάρων (FCP) στο Xp22.2. Τα δεδομένα αυτά μαζί με αυτά προγενέστερων μελετών, υποδεικνύουν ότι το 70% των αποκλίσεων στα επίπεδα HbF στην SCD, οφείλεται στις αποκλίσεις του ποσοστού των F-δικτυοερυθροκυττάρων και ότι το ποσοστό αυτό ελέγχεται τουλάχιστον μερικώς από τον FCP τόπο στο X-χρωμόσωμα. Ο μηχανισμός με τον οποίο ο FCP τόπος επιδρά στην παραγωγή των F-κυττάρων είναι άγνωστος. Transδραστικές πρωτεΐνες προσδένονται σε περιοχές ενισχυτή ή υποκινητή του β- σφαιρινικού συμπλόκου και τροποποιούν έτσι την διαφορική έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών (Dover et al., 1992). Ένας από τους κυριότερους trans-ρυθμιστικούς παράγοντες της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών, ο GATA-1, κωδικοποιείται από ένα γονίδιο εντοπισμένο στο Χ-χρωμόσωμα, στη περιοχή Xp21.1 (Zon et al., 1990). Κι άλλος ένας παράγοντας που επηρεάζει την διαφοροποίηση των ερυθροβλαστών in vitro, έχει εντοπιστεί στο Xp Εφόσον, εξετάστηκαν καλά καθορισμένες οικογένειες που δεν παρουσιάζουν καμιά σύνδεση του FCP τόπου με την Xp

47 περιοχή, τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο FCP τόπος αντιπροσωπεύει ένα γονίδιο στο Χ χρωμόσωμα, το οποίο δεν αντιστοιχεί σε κανένα από τα δύο προαναφερθέντα γονίδια (Dover et al., 1992). O X-συνδεδεμένος παράγοντας που επιδρά στον έλεγχο της παραγωγής F-κυττάρων, έχει περιγραφεί ξανά στο παρελθόν σε μη-αναιμικούς ενήλικους Ιάπωνες, παρόλο που δεν μπόρεσε τότε να ταυτοποιηθεί μια αποδεδειγμένη και αδιαμφισβήτητη σύνδεση με περιοχή του Χ-χρωμοσώματος (Miyoshi et al., 1988). Το γεγονός ότι ο FCP τόπος χαρτογραφείται στην ίδια περιοχή στον μικρό βραχίονα (p) του Χ-χρωμοσώματος σε έγχρωμες SCD οικογένειες και σε λευκή οικογένεια, υποδεικνύει ότι στους ανθρώπους υπάρχει τουλάχιστον ένας FCP-τόπος στο Χ- χρωμόσωμα (Dover et al., 1992). Στο Xp22.2 p22.3 QTL εντοπίστηκαν SNP στα γονίδια EGFL6, GPM6B και FIGF, που εμφανίζουνσυσχέτιση με τα επίπεδα HbF. Το GPM6B γονίδιο στους ανθρώπους κωδικοποιεί την γλυκοπρωτεΐνη της μεμβράνης των νευρώνων, M6-b. Στα μελανοκύτταρα η έκφραση του γονιδίου ελέγχεται από την πρωτεΐνη MITF (Microphthalmia-associated transcription factor). Αυτή αποτελεί trans-μεταγραφικό παράγοντα, που εμπλέκεται στην ανάπτυξη μελανοκυττάρων και οστεοκλαστών. Το SNP που εντοπίστηκε στο γονίδιο GPM6B είναι το rs Το FIGF γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που είναι μέλος των αυξητικών παραγόντων των αιμοπεταλίων και αγγειακού ενδοθηλίου (PDGF/VEGF). Αυτός ο αυξητικός παράγοντας είναι ενεργός στην αγγειογένεση, στην λεμφαγγειογένεση και την ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η εκκρινόμενη αυτή πρωτεΐνη υφίσταται μια πολύπλοκη πρωτεολυτική ωρίμανση, παρέχοντας πολλές διαφορετικές μορφές της που προσδένονται στους VEGFR-2 και VEGFR-3 υποδοχείς. Το SNP που εντοπίστηκε μέσα στο γονίδιο FIGF, είναι το rs Α q11 Η συσχέτιση της θέσης 8q11 με τον β-γονιδιακό τόπο και συγκεκριμένα την έκφραση HbF, διερευνήθηκε σε σχέση με τον «XmnI G γ πολυμορφισμό». Πραγματοποιήθηκε ανάλυση δεδομένων δεικτών ολόκληρου του γονιδιώματος (genome wide markers) σε οικογένεια των ινδικής καταγωγής, κάτω από ένα μοντέλο δύο γονιδιακών τόπων, με έναν από αυτούς να είναι ο -158 G γ XmnI πολυμορφισμός. Αυτό το μοντέλο μπόρεσε να εντοπίσει σύνδεση με τόπους που έχουν επίδραση στα επίπεδα των F- κυττάρων (FC), υπό την προϋπόθεση της παρουσίας του -158 G γ XmnI 47

48 πολυμορφισμού. Τα μοντέλα πιθανοτήτων των δύο γονιδιακών τόπων είναι προεκτάσεις του απλού, μοντέλου κύριου γονιδιακού τόπου, για δεδομένα ποσοτικών γνωρισμάτων (quantitative-traits) σε οικογένειες. Οι υπολογισμοί της μέγιστης πιθανότητας των παραμέτρων του μοντέλου που χρησιμοποιήθηκε δεν αποκαλύπτουν κάποιο μηχανισμό με τον οποίο το πιθανό QTL στο χρωμόσωμα 8q αλληλεπιδρά με το γνωστό QTL στο β-σφαιρινικό σύμπλεγμα. Παρόλα αυτά, καταδεικνύεται ότι μέρος του περίπλοκου μηχανισμού περιλαμβάνει μια υπό όρους, εξαρτώμενη αλληλεπίδραση μεταξύ της χρωμοσωμικής περιοχής 8q και είτε τον -158 G γ XmnI ή άλλο κοντινό πολυμορφισμό. Το 8q QTL θα μπορούσε να κωδικοποιεί έναν ρυθμιστικό παράγοντα ή μια υπομονάδα, που ενδεχομένως να δρά ως καταστολέας ή επαγωγέας που προσδένεται απευθείας στην περιοχή που περιλαμβάνει τον -158 G γ XmnI πολυμορφισμό ή άλλη κοντινή περιοχή πρόσδεσης. Εναλλακτικά, η 8q πρωτεΐνη θα μπορούσε να δρα ως μοριακή γέφυρα στις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνηςπρωτεΐνης. Σε αυτές τις περιπτώσεις, οι επιδράσεις της όποιας αλλαγής στην transρυθμιστική πρωτεΐνη θα είχαν άμεση εξάρτηση, ως προς το δραστικό αποτέλεσμα, από την cis-περιοχή πρόσδεσης (Garner et al., 2002). Σε άλλη μελέτη βρέθηκε ότι το γονίδιο της πρωτεΐνης TOX (thymus high-mobility group box protein) εντοπίζεται μέσα στη 8q11-q12 περιοχή που στην προαναφερθείσα μελέτη βρέθηκε να αλληλεπιδρά με το SNP -158 (C>T) ανοδικά του G γ-σφαιρινικού γονιδίου και που επίσης ενδέχεται να επιδρά στην μετάβαση από την έκφραση του γ- στο β-γονίδιο. Ως μέλος της οικογένειας πρωτεΐνών HMG (high-mobility group box protein family), η πρωτεΐνη TOX περιλαμβάνει ένα μοναδικό HMG box και προσδένεται στο DNA κατά τρόπο εξαρτώμενο από και ειδικό για την αλληλουχία. Όλες οι πρωτεΐνες με HMG box, είναι ικανές να επάγουν μια απότομη κάμψη στο DNA. Η TOX έχει την ικανότητα να προσδένεται στην μικρή αύλακα του DNA και να τροποποιεί την γονιδιακή έκφραση επιδρώντας στην δομή της χρωματίνης και αλληλεπιδρώντας με ρυθμιστικά μεταγραφικά σύμπλοκα (Ma et al., 2007). Σε μελέτη με 137 ασθενείς με SCD, ταυτοποιήθηκαν SNP στο γονίδιο TOX, τα οποία σχετίζονται είτε με μεταβολή του ποσοστού (%) της HbF, είτε με μεταβολή της ποσότητας της HbF ανά μονάδα όγκου (g/dl). Στην πρώτη κατηγορία κατατάσσονται τα rs765587, rs826729, rs , rs172652, rs Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν τα rs , rs765587, rs , rs και rs Ουσιαστικά 48

49 τα SNP που βρέθηκαν να έχουν επίδραση στα επίπεδα της HbF είναι επτά (Ma et al., 2007, Patrinos and Grosveld, 2008). Α p15 Το QTL στη θέση 2p15 ταυτοποιήθηκε με GWAS σε Νοτιοευρωπαίους με αποκλίσεις ως προς τις τιμές των F-κυττάρων (FC) (Menzel et al., 2007). Η γονοτύπηση υψηλής ανάλυσης χαρτογράφησε το QTL αυτό στο BCL11A γονίδιο, που κωδικεύει μια πρωτεΐνη με δακτύλιο ψευδαργύρου (zinc finger), που αποτελεί μεταγραφικό παράγοντα απαραίτητο για την παραγωγή φυσιολογικών Β και Τ λεμφοκυττάρων. Μελέτες έχουν δείξει ότι σε ανθρώπινα πρόδρομα ερυθροποιητικά κύτταρα και σε ποντίκια με μεταλλάξεις απαλοιφής (knockout), η πρωτεΐνη BCL11A λειτουργεί ως ρυθμιστής της έκφρασης του γ-σφαιρινικού γονιδίου (Liu et al., 2003). Το BCL11A παρουσιάζει άφθονη έκφραση σε πρόδρομους ανθρώπινους CD34 ερυθροβλάστες, όπου η αποσιώπησή του από sirna ή shrna οδηγεί σε σημαντική επαγωγή της έκφρασης των γ-αλυσίδων (Sankaran et al., 2008). Οι πολυμορφισμοί στο τόπο του BCL11A σχετίζονται με υψηλά επίπεδα HbF και επάγουν την μειωμένη έκφραση BCL11Α mrna. Ως μηχανισμός δράσης του μεταγραφικού παράγοντα BCL11A προτάθηκε η πρόσδεσή του στο LCR. Μέσω μιας πρωτεομικής προσέγγισης, βρέθηκε ο παράγοντας BCL11A να αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο NURD (Nucleosome Remodelling Deacetylation), που περιλαμβάνει δύο απακετυλάσες ιστονών (HDAC1) και το συστατικό Matrin 3, με τους μεταγραφικούς παράγοντες των ερυθροκυττάρων GATA1 και FOG1 και την πρωτεΐνη SOX6 (HMGbox protein) (Cao et al., 2011). Σε επιπλέον μελέτες, η συσχέτιση του QTL στην 2p15 αναπαράχθηκε σε δύο επιπλέον ομάδες Νοτιοευρωπαίων και η ποικιλομορφία του χαρακτηριστικού (trait variance) αποδόθηκε στα BCL11A, HMIP και στο -158 G γ XmnI πολυμορφισμό, με 15.1%, 19.4 % και 10.2%, αντίστοιχα. Μαζί, τα τρία κύρια αυτά QTL είναι υπεύθυνα για την μισή από την ολική κληρονομικότητα σε F-κύτταρα και HbF στον γενικό πληθυσμό των Ευρωπαίων. Η περισσότερη από την υπόλοιπη κληρονομικότητα οφείλεται πιθανόν σε πολλαπλά QTL μικρότερης επίδρασης, όπως στις περιοχές Xp22 και 8q (Menzel et al., 2007). Λεπτομερής χαρτογράφηση στον BCL11A τόπο σε Άφροαμερικανούς με SCD αποκάλυψε τρία SNP, το rs , το rs και το rs , που ξεχωριστά σχετίζονται με την HbF. Την ισχυρότερη συσχέτιση την έδειξε το τελευταίο SNP (p=2x10-42 ). Ο πολυμορφισμός αυτός μελετήθηκε και σε 49

50 Σαρδίνιους, όπου σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε ανάμεσα σε ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία (0.21) και σε εκείνους με ενδιάμεση (0.48), όσον αφορά στη συχνότητα του C αλληλομόρφου (p<0.001). Η ανάλυση απλότυπου (με βάση τα SNP αυτά) έδειξε ότι οι απλότυποι σε αυτό τον τόπο αποδίδουν καλύτερα την φαινοτυπική ποικιλομορφία απ ότι το άθροισμα των επιδράσεων από καθένα από τα SNP (18.1 έναντι 14.7%). Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν αργότερα σε φυσιολογικό πληθυσμό διαφορετικής προέλευσης, σε φορείς β-μεσογειακής αναιμίας με καταγωγή από την Κίνα και την Ταϋλάνδη και σε ασθενείς με SCD από τις Η.Π.Α, την Βραζιλία και το Ηνωμένο Βασίλειο. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν καθαρά ότι το γονίδιο BCL11A είναι σε θέση να μετριάσει τον φαινότυπο της ομόζυγης β-μεσογειακής αναιμίας αυξάνοντας τα επίπεδα της HbF (Cao et al., 2011). Α q23 Το QTL στο 6q23 χρωμόσωμα χαρτογραφήθηκε με ανάλυση σύνδεσης σε μια εκτεταμένη οικογένεια Ασιατών-Ινδών με β-μεσογειακή αναιμία και υψηλά επίπεδα F-κυττάρων. Η οικογένεια εντοπίστηκε μέσω ενός μέλους, ομόζυγου για β 0 μεσογειακή αναιμία, με εξαιρετικά ήπια κλινική εικόνα και με επίπεδο κυκλοφορούσας HbF 12g/dl. Αυξημένα επίπεδα HbF παρατηρήθηκαν επίσης και σε άλλα μέλη της οικογένειας με ή χωρίς ετερόζυγη β-μεσογειακή αναιμία. Δοκιμασίες εντοπισμού των F-κυττάρων πραγματοποιήθηκαν σε περιφερικό αίμα με μικροσκοπία και με «διαλογή κυττάρων βασισμένη στο φθορισμό» (FACS) στα 153 δείγματα αίματος των ασθενών αυτών. Η ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης (multiple regression analysis) έδειξε ότι οι τιμές ln(fc) σε αυτή την οικογένεια επηρεάστηκαν σημαντικά από την ηλικία και την ποικιλομορφία μέσα στην περιοχή του β-γονιδίου και του G γ-γονιδίου, δηλαδή την β-μεσογειακή αναιμία και την παρουσία του 158 G γ XmnI πολυμορφισμού, αντίστοιχα. Ανάλυση διαχωρισμού (segregation analysis) που πραγματοποιήθηκε, παρείχε ενδείξεις για την παρουσία ενός γονιδίου, με συνεπικρατούσα επίδραση στη ποσότητα των F-κυττάρων και με οικογενή συσχέτιση της περιοχής. Η σύνδεση (linkage) του νεοεντοπισμένου γονιδίου με το β-σφαιρινικό σύμπλεγμα αποκλείστηκε. Για την χαρτογράφηση του νεοεντοπισμένου γονιδίου πραγματοποιήθηκε «ολογονιδιωματική έρευνα σύνδεσης» (genome wide linkage search), με χρήση 210 δεικτών καλά χαρτογραφημένων μικροδορυφορικών αλληλουχιών. Τελικά δύο δείκτες (markers) οριοθέτησαν την περιοχή στο 6q22.3- q24. Έτσι, αποδείχτηκε ότι ένα κυρίαρχο γονίδιο για την HPFH εντοπίζεται στο 50

51 χρωμόσωμα 6q. Ο εντοπισμός του γονιδίου αυτού, καταδεικνύει μια περιοχή που περιλαμβάνει τον γονιδιακό τόπο για το ARG1 γονίδιο (γονίδιο της ανθρώπινης αργινάσης του ήπατος), που κωδικοποιεί ένα ισοένζυμο που εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ, αλλά και στα ερυθροποιητικά κύτταρα (το γονίδιο αποκλείστηκε από υποψήφιο στην μελέτη αυτή). Η συγκεκριμένη μελέτη αποτελεί την πρώτη που παρουσιάζει ένα αυτοσωμικό trans-δραστικό γονίδιο ως υπεύθυνο για τον έλεγχο της παραγωγής των γ-αλυσίδων (Craig et al., 1996). Μελέτες ανασυνδυασμού απλότυπου προσδιόρισαν πιο λεπτομερώς την χρωμοσωμική αυτή περιοχή ως την 6q, σε ένα τμήμα 1.5Mb, περιλαμβάνοντας τα πέντε κωδικά γονίδια ALDH3B2 (ALDH8), HBS1L, MYB, AHI1 και PDE7B (Close et al., 2004). Η ύπαρξη αυτού του 6q23 QTL επιβεβαιώθηκε και χαρτογραφήθηκε λεπτομερώς σε Βορειοευρωπαίους, και τα υπαίτια SNP εντοπίστηκαν σε μια περιοχή μεταξύ των HBS1L και MYB, που αναφέρεται ως HBSIL-MYB διαγονιδιακός τόπος πολυμορφισμών (intergenic polymorphism locus, HMIP locus) (Thein et al., 2007). Σε άλλη μελέτη με 280 Αφροαμερικανούς ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD) πάνω από 180 SNP μελετήθηκαν σε 38 γονίδια. Και σε αυτή τη περίπτωση η ισχυρότερη συσχέτιση με την HbF βρέθηκε για SNP κοντά στο QTL που έχει εντοπιστεί στη χρωμόσωμική περιοχή 6q22.3-q23.2. Τελικά, 12 SNP που συσχετίστηκαν με 20-30% διαφορά στις συγκεντρώσεις, εντοπίστηκαν σε εσώνια τεσσάρων γονιδίων, των PDE7B, MAP7, MAP3K5 και PEX7. Έτσι, λοιπόν, τα γενετικά στοιχεία εντός του 6q22.3-q23.2 QTL, μπορεί να κωδικοποιούν transδραστικά στοιχεία που συντελούν στην τροποποίηση των βασικών HbF επιπέδων στην δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD) (Wyszynski et al., 2004). Εικόνα 12. : Παρουσίαση της 1.5 Mb υποψήφιας περιοχής. Τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες παρουσιάζονται με μαύρο, ενώ εκείνα που δεν κωδικοποιούν RNA με πράσινο. Τα ψευδογονίδια είναι χρωματισμένα κόκκινα. Οι δείκτες που οριοθετούν την περιοχή βρίσκονται επάνω στην κλίμακα. Η κατεύθυνση των βελών δείχνει την κατεύθυνση μεταγραφής (5' 3') των γονιδίων (Close et al., 2004). 51

52 A.7.7 Αναλυτική παρουσίαση γονιδίων της περιοχής του 6q23 QTL A MYB και HBS1L Ο MYB είναι ένας καλά χαρακτηρισμένος πυρηνικός μεταγραφικός παράγοντας, που εκφράζεται στις περισσότερες κύριες αιμοποιητικές κυτταρικές σειρές. Ο γονιδιακός τόπος του MYB αποτελείται από 15 εξώνια που καταλαμβάνουν έκταση περίπου 48.5 Kb στο κέντρο της υποψήφιας περιοχής του χρωμοσώματος 6. Εκφράζει ένα mrna 3.2 Kb, με την κύρια ανθρώπινη πρωτεΐνη του MYB να αποτελείται από 636 αμινοξέα και να έχει μοριακό βάρος 80 kda. Η πρωτεΐνη αυτή αποτελεί μεταγραφικό παράγοντα απαραίτητο για το μονοπάτι της ερυθροποίησης (Close et al., 2004, Thein et al., 2007). Το HBS1L ανακαλύφθηκε μεταξύ των γονιδίων στην χρωμοσωμική περιοχή 6q24. Το γονίδιο κωδικοποιεί ένα πολυπεπτίδιο 648 αμινοξέων με μοριακό βάρος περίπου 75 kda. Φυλογενετικές μελέτες υποδεικνύουν ότι ο παράγοντας HBS1L μπορεί να σχετίζεται με ριβοσώματα και να συντελεί στην διέλευση των ενεργά μεταφραζόμενων πολυπεπτιδίων μέσα από το κανάλι του ριβοσώματος. Εναλλακτικά, μπορεί να φέρνει το αμινο-άκυλ-trna στο ριβόσωμα. Και το HBS1L εκφράζεται σε πρόδρομα ερυθροποιητικά κύτταρα. Η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί διαθέτει ικανότητα πρόσδεσης GTP, αποτελεί δηλαδή μέλος της υπεροικογένειας των «GTP-ασών». Αυτές προσδένονται στο στόχο τους και υδρολύουν GTP, συμμετέχουν στην ρύθμιση ποικιλίας κρίσιμων κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνοσύνθεσης, της συναρμολόγησης του κυτταροσκελετού, και της μεταβίβασης σημάτων. Ο ρόλος του παράγοντα HBS1L στα επίπεδα των F-κυττάρων δεν είναι άμεσα εμφανής. Ενδεχομένως, να διαμεσολαβεί έμμεσα μέσω της επίδρασής του στην έκφραση ποικίλων κυτταροκινών και μεταγραφικών παραγόντων που επιδρούν στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των πρόδρομων ερυθροποιητικών κυττάρων (Close et al., 2004, Thein et al., 2007). Σε μια υψηλής ανάλυσης μελέτη συσχέτισης αναλύθηκαν δύο ομάδες (824 και άτομα, αντίστοιχα) ζευγαριών διδύμων με καταγωγή από την βόρεια Ευρώπη και ανιχνεύτηκαν SNP που συσχετίζονται ισχυρά με τα επίπεδα F-κυττάρων σε Καυκάσιους (p=10-75 ). Τα F-κύτταρα καταμετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Αυτοί οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί εντοπίζονται μέσα σε τρία μπλοκ υψηλής σύνδεσης (LD blocks), 5 του HBS1L, μέσα στο HBS1L, και μετά το HBS1L και 52

53 ανοδικά του MYB, δηλαδή στην διαγονιδιακή περιοχή και αναφέρονται ως «HBS1L MYB Intergenic Polymorphism (HMIP) blocks 1, 2, 3». Τα «HMIP blocks 1, 2 και 3» εκτείνονται σε ένα συνεχές τμήμα μήκους 79 kb, ξεκινώντας 188bp ανοδικά του εξωνίου 1 του HBS1L και καταλήγοντας 45kb ανοδικά του MYB. Έτσι, τα SNP που συσχετίζονται με υψηλά επίπεδα F-κυττάρων, συσχετίστηκαν ισχυρά και με την αυξημένη έκφραση HBS1L σε καλλιέργιες ερυθροποιητικών κυττάρων. Δώδεκα πολυμορφικοί δείκτες (markers) καθόρισαν την περιοχή «HMIP». Από αυτούς οι σημαντικότεροι που δείχνουν να επιδρούν στη ρύθμιση των επιπέδων των F-κυττάρων και της HbF είναι τα rs (p =10-75 ), rs (p =10-10 ) και rs (p=2x10-4 ). Το πρώτο αποτελεί το SNP εκείνο από το block 2 της «HMIP» περιοχής με την υψηλότερη συσχέτιση. Και στα δύο άλλα blocks όμως εντοπίστηκαν SNP με υψηλή συσχέτιση, όπως το rs στο «HMIP block 1» και το rs στο «HMIP block 3». Με βάση την ανάλυση απλότυπου υπολογίστηκε ότι 17.6% της διαφοροποίησης των επιπέδων των F-κυττάρων και της επαγωγής HbF, οφείλεται στους δείκτες (SNP) στις τρεις ομάδες απλοτυπών του HBS1L-MYB. Η συνολική κληρονομικότητα του «FC-χαρακτηριστικού» (υψηλά επίπεδα F-κυττάρων) στους Ευρωπαίους είναι 89% και φαίνεται ότι και επιπλέον γενετικοί παράγοντες συντελούν ουσιαστικά στην ποικιλομορφία του γνωρίσματος αυτού (Thein et al., 2007). 53

54 Εικόνα 13.: Επισκόπηση της 6q23 περιοχής του HMIP τόπου. (a) Οργάνωση του γονιδιώματος της 1.5 Mb υποψήφιας περιοχής και το τμήμα 126-kb με τμήματα των HBS1L και MYB γονιδίων και το διαγονιδιακό τμήμα του 6q23. Οι περιοχές που καλύπτονται από τα τρία μπλόκ (HMIP 1, 2, και 3) που παρουσιάζουν συσχέτιση με τα F-κύτταρα, παρουσιάζονται με τετράγωνα. Τα υπόλοιπα κουτιά αντιπροσωπεύουν γνωστά και δυνητικά εξώνια με τα βέλη να υποδεικνύουν την κατεύθυνση μεταγραφής. Το κόκκινο αποτελεί κωδική αλληλουχία; το λευκό, 5 -UTR. (b) Θέση των δεικτών και σημαντικότητα (_log10 P value) των στατιστικών δοκιμασιών σε περιοχές μέσα στο πλαίσιο HBS1L- MYB (Thein et al., 2007). A PDE7B Το γονίδιο PDE7B βρίσκεται στο απομακρυσμένο τελομερικό άκρο της υποψήφιας περιοχής 6q, με μόνο τον υποκινητή και το πρώτο εξώνιο του γονιδίου να εντοπίζονται μέσα στην υποψήφια περιοχή. Το mrna του PDE7B είναι 5.6 kb. Και κωδικοποιεί μιαμια πρωτεΐνη 446 αμινοξέων με μοριακό βάρος 50.1 kda. Η καταλυτική επικράτεια της PDE7B εντοπίζεται μεταξύ των νουκλεοτιδίων 667 και Εκφράζεται σε μεγαλύτερο βαθμό στο πάγκρεας και ακολούθως στον εγκέφαλο, την καρδιά, την θυρεοειδή αδένα, τους σκελετικούς μύες, τα μάτια, τις ωοθήκες, τον υπογνάθιο αδένα, την επιδιδυμίδα και το ήπαρ (Hetman et al., 2000). Οι φωσφοδιεστεράσες (PDEs) ρυθμίζουν τα ενδοκυττάρια επίπεδα camp και cgmp, καθορίζοντας ισορροπία μεταξύ παραγωγής και αποδόμησης αυτών των κυκλικών νουκλεοτιδίων. Αυτά τα κυκλικά νουκλεοτίδια παίζουν σημαντικό ρόλο ως 54

55 δευτερογενείς αγγελιοφόροι σε πολλές φυσιολογικές λειτουργίες, όπως στην σπλαχνική κινητικότητα, την απόκριση του ανοσοποιητικού, την φλεγμονή, στην νευροπλαστικότητα, την όραση και την αναπαραγωγή. Οι δραστικές πρωτεΐνες που επάγονται από τα camp και cgmp, και βρίσκονται καθοδικά του μονοπατιού αυτού, είναι η εξαρτώμενη από το camp κινάση (PKA), η εξαρτώμενη από το cgmp κινάση (PKG), ιοντικά κανάλια που ενεργοποιούνται από τα κυκλικά νουκλεοτίδια και τα camp-gefs (regulated guanine nucleotide exchange factors). Και οι ίδιες οι PDE εντοπίζονται ως δραστικοί παράγοντες καθοδικά των camp και cgmp. Οι φωσφοδιεστεράσες (PDE) διαχωρίζονται σε τρείς τάξεις, I, II και III. Οι PDE των θηλαστικών, που ανήκουν στην τάξη I των PDE, διαθέτουν μια επικράτεια «HD» στο C-τελικό άκρο και παρουσιάζουν υψηλή συγγένεια για το camp ή cgmp. Η «HD» επικράτεια αποτελεί μια ισχυρά συντηρημένη περιοχή των πρωτεΐνών. Εντοπίζεται στην υπεροικογένεια ενζύμων με γνωστή δράση φωσφουδρολάσης. Οι επικράτειες των πρωτεΐνων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ενζυματικής δραστηριότητας των PDE και στην ενδοκυττάρια θέση τους εντοπίζονται κυρίως στο Ν-τελικό άκρο. Κάποιες PDE διαθέτουν περιοχές φωσφορυλίωσης που στοχοποιούνται από πρωτεΐνικές κινάσες. Τα PDE I γονίδια κατηγοριοποιούνται σε 11 διαφορετικές οικογένειες με βάση την δομική ομοιότητα, την ομολογία της αλληλουχίας, τις πρωτεΐνικές επικράτειες και τις ενζυμικές ιδιότητες. Σχεδόν οι μισές από τις PDE οικογένειες γονιδίων (PDE2, PDE5, PDE6, PDE10, PDE11) διαθέτουν μια πρωτεΐνική επικράτεια «GAF», υπεύθυνη για τον διμερισμό και την αλλοστερική ρύθμιση, και χαρακτηρίζονται γι αυτό ως GAFPDE υποοικογένεια. Άλλες PDE (PDE1, PDE3, PDE4, PDE7 9) δεν διαθέτουν GAF επικράτεια και κατατάσσονται στην μη-gaf-pde υποοικογένεια. Δύο υποοικογένειες γονιδίων, η PDE7A και η PDE7B, κωδικοποιούν PDE ευαίσθητες στην ρολιπραμίνη και υψηλής συγγένειας και ειδικές για το camp. Mόνο η PDE7B1 έχει ταυτοποιηθεί και σε ανθρώπους και σε ποντίκια. Στους αρουραίους υπάρχουν 3 N-τελικά εναλλακτικά μετάγραφα που μεταφράζονται στις PDE7B1 έως -7B3. Η έκφραση της PDE7B στους αρουραίους διεγείρεται από το camp σε καλλιέργεια νευρώνων του ραβδωτού σώματος, μέσω της camp-εξαρτώμενης πρόσδεσης του CREB στην CRE περιοχή του υποκινητή της PDE7B1. Γενικά, η θέση εντοπισμού του PDE7B στον οργανισμό είναι άγνωστη. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη PDE7B1 πρωτεΐνη με ένα N-τελικό FLAG-tag, που εκφράζεται σε COS-7 55

56 κύτταρα, εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα (Omori and Kotera, 2007, Lerner and Epstein, 2006). Όπως προαναφέρθηκε, αποτελέσματα διαφόρων μελετών καταδεικνύουν πως το PDE7B αποτελεί ένα από τα γονίδια που παρουσιάζουν υψηλή συσχέτιση με αυξημένα επίπεδα HbF κυρίως σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD). Ανάμεσα σε 29 υποψήφια γονίδια μέσα σε γονιδιακούς τόπους που έχει αναφερθεί πως σχετίζονται με τα επίπεδα HbF (6q22.3 q23.2, 8q11 q12 and Xp22.2 p22.3) και εμπλέκονται στον μεταβολισμό της υδροξυουρίας (HU), τα οποία μελετήθηκαν σε 137 ασθενείς με SCD που έλαβαν HU, εντοπίστηκε και το γονίδιο PDE7B. Η αύξηση των επιπέδων της HbF ως απόκριση στην HU ποικίλλει μεταξύ των ασθενών με SCD. Από τα 320 SNP (tagsnp) που επιλέχτηκαν για γονοτύπηση με βάση τo HapMap, πολλά ήταν στο γονίδιο της φωσφοδιεστεράσης 7Β (PDE7B) μέσα στο 6q22 q23 QTL που σχετίστηκαν με την απόκριση της HbF στην HU. Από τα SNP αυτά,σχετίστηκαν με την επαγωγή της HbF παραγωγής στο γονίδιο PDE7B τα, rs , rs , rs , rs , rs (Ma et al., 2007, Patrinos and Grosveld, 2008). Το PDE7B θεωρείται το πιο ισχυρό υποψήφιο γονίδιο για συσχέτιση με την έκφραση HbF, λόγω της υψηλής συγγένειας και ειδικότητας της φωσφοδιεστεράσης αυτής για την κυκλική μονοφωσφορική αδενοσίνη, camp (Thein, 2008). Το camp παράγεται από την τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) μέσω της αδενυλικής κυκλάσης. Σε μελέτη όπου καλλιεργήθηκαν ανθρώπινα CD34-μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος σε σύστημα που μιμείται την in vivo παραγωγή των F-κυττάρων, η αναστολή της αδενυλικής κυκλάσης μείωσε την επαγωγή του γ-σφαιρινικού mrna. Έτσι, στις ανθρώπινες CD34(+) καλλιέργειες, η παραγωγή camp απαιτείται για την πλήρη επαγωγή HbF από την HU (Keefer et al., 2006). Αντίθετα, σε K562 κύτταρα, η camp-εξαρτώμενη οδός παίζει αρνητικό ρόλο στην έκφραση των γ-σφαιρινικών γονιδίων, ενώ η παραγωγή cgmp είναι κρίσιμη για την επαγωγή HbF (Inoue et al., 2004, Keefer et al., 2006). Τα camp και cgmp μπορεί να έχουν διαφορετικούς ρόλους στη ρύθμιση της έκφρασης των γ-σφαιρινικών γονιδίων στα ερυθροκύτταρα (Inoue et al., 2004). Επιπλέον, σε άλλη μελέτη έχει βρεθεί ότι η «camp-εξαρτώμενη οδός» προκάλεσε αποτελεσματική έκφραση της γ-σφαιρίνης σε ερυθροβλάστες ενηλίκων από ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία (Bailey et al., 2007). Πιθανόν, λοιπόν, η «camp-ειδική οδός» να εμπλέκεται στην επαγωγή HbF κατά έναν ελεγχόμενο τρόπο, εξαρτώμενο από τον εκάστοτε κυτταρικό πληθυσμό των 56

57 ερυθροποιητικών κυττάρων, δηλαδή να είναι σημαντικά ενεργοποιημένη σε εμβρυϊκούς ερυθροβλάστες και απενεργοποιημένη σε ενήλικους. Ενδεχομένως να διαδραματίζει κάποιο ρόλο στην μετάβαση από την γ- στη β-γονιδιακή έκφραση, μέσω της εμπλοκής μεταγραφικών παραγόντων που να προσδένονται στους υποκινητές των σφαιρινικών γονιδίων ή στην περιοχή LCR (Inoue et al., 2004, Bailey et al., 2007). A MAP3K5 Η MAP3K5 (mitogen activated protein kinase kinase kinase 5) ή αλλιώς ASK1 (Apoptosis signal regulating kinase 1) πρωτεΐνη είναι μέλος της οικογένειας των MAP3 κινασών (MAP kinase kinase kinase family) και συνεπώς μέρος του MAPK σηματοδοτικού μονοπατιού. Ο σηματοδοτικός καταρράκτης των MAPK, αποτελεί ένα μονοπάτι μεταβίβασης σήματος καλά συντηρημένο σε κύτταρα, από τις ζύμες μέχρι και τα σπονδυλωτά, και αποτελείται από τρία διαφορετικά μέλη της οικογένειας των πρωτεΐνικών κινασών, συμπεριλαμβάνοντας τις MAP κινάσες (MAPK), τις MAPK κινάσες (MAPKK) και τις MAPKK κινάσες (MAPKKK). Η MAPKKK φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί έτσι την MAPKK, η οποία με τη σειρά της φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την MAPK. Η ενεργοποιημένη MAPK μπορεί να μεταβεί στον κυτταρικό πυρήνα και να ρυθμίσει τις δράσεις των μεταγραφικών παραγόντων και έτσι να ελέγξει την γονιδιακή έκφραση. Υπάρχουν τουλάχιστον δύο καλά καθορισμένα MAPK σηματοδοτικά πρότυπα που λειτουργούν στα κύτταρα των θηλαστικών: 1) Το Raf MAPKK MAPKμονοπάτι 2) Το MEKK SEK1 (ή MKK4) SAPK (ή JNK) μονοπάτι Τα MAPK σηματοδοτικά μονοπάτια αποτελούν τους σημαντικότερους μηχανισμούς για την μεταγωγή εξωκυττάριων σημάτων εντός του κυτταροπλάσματος. Η MAP3K5 ενεργοποιείται από ποικίλα ερεθίσματα, όπως το οξειδωτικό στρες (Εικ.14). Μελέτες έχουν αποδείξει ότι προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως ο TNF-α, ενεργοποιούν την MAP3K5, η οποία επάγει στη συνέχεια την κυτταρική απόπτωση. O TNF-α επάγει την ενεργοποίηση του JNK μέ έναν τρόπο εξαρτώμενο από σχετικούς με τον TNF-α παράγοντες, τους TRAF. Η μεσολάβηση της MAP3K5 στο μονοπάτι αυτό κρίνεται απαραίτητη. Επιπλέον, ένας ανταγωνιστικός αγωνιστής έναντιτου Fas, ο 57

58 οποίος ενεργοποιεί τον υποδοχέα Fas (Fas death receptor), επάγει την ενεργοποίηση της MAP3K5, μέσω της αλληλεπίδρασης της MAP3K5 με την Daxx (Hattori et al., 2009). Ο υποδοχέας Fas (FasR) γνωστός επίσης ως «αντιγόνο απόπτωσης 1» (APO-1, APT ή CD95), αποτελεί «υποδοχέα θανάτου» στην επιφάνεια των κυττάρων, που οδηγεί σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση), μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού της Jun N-τελικής κινάσης (JNK) (Chang et al., 1998). Σε μελέτη που έγινε σε κύτταρα του θύμου αδένα στα οποία απουσίαζε η MAP3K5 τα επίπεδα ενεργοποίησης των JNK και p38 μετα την ενεργοποίηση από το Fas ήταν μειωμένα. Επίσης, έχει αποδειχτεί ότι η MAP3K5 είναι απαραίτητη για την μεταβίβαση σήματος μέσω TLR4. Η σηματοδότηση μέσω του ασβεστίου (Ca ++ ) ενεργοποιεί επίσης το μονοπάτι MAP3K5-p38. Σε πρόδρομα νευρικά κύτταρα σε ποντίκια με έλλειψη MAP3K5, η p38 ενεργοποίηση που προκλήθηκε από την εισρροή ασβεστίου στα κύτταρα μειώθηκε σημαντικά (Hattori et al., 2009). Εικόνα 14.: Το μονοπάτι της MAP κινάσης στα θηλαστικά. Οι ASK1 και ASK2 ανήκουν στην MAPKKK οικογένεια, της οποιάς τα μέλη ανταποκρίνονται σε ποικίλα εξωτερικά ερεθίσματα και ξεκινούν τον MAPK καταρράκτη. Υπάρχουν τουλάχιστον 20 διαφορετικές MAPKKK στα σπονδυλωτά που επιλεκτικά φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τις MAPKK οδηγώντας σε συγκεκριμένο πρότυπο ενεργοποίησης των μελών της οικογένειας MAPK. Η ASK οικογένεια μπορεί να ενεργοποιήσει τα JNK και p38 μονοπάτια, αλλά όχι το ERK μονοπάτι (Hattori et al., 2009). P kinase cascade Το γονίδιο της ανθρώπινης MAP3K5, που εδράζεται στην περιοχή 6q22.33, κωδικοποιεί ένα πολυπεπτίδιο με αμινοξέα. Με ανάλυση Northern αποδείχτηκε 58

59 ότι μετάγραφα του γονιδίου της MAP3K5 είναι άφθονα στην ανθρώπινη καρδιά και στο πάγκρεας. Όσον αφορά στα δομικά της μοτίβα και χαρακτηριστικά, η πρωτεΐνη διαθέτει μια κεντρική περιοχή με ενεργότητα κινάσης σερίνης/θρεονίνης και ένα σπειρωμένο σπείραμα στο Ν και στο C τελικό άκρο (Εικ.15). Διαθέτει συνολικά 11 υπομονάδες κινάσης. Η καταλυτική περιοχή της MAP3K5 παρουσιάζει μια τυπική αναδίπλωση πρωτεΐνικής κινάσης, περιλαμβάνοντας 5 β φύλλα και έλικα αc, αποτελώντας τον μικρό λοβό (κατάλοιπα ) και έναν μεγαλύτερο κυρίως ελικοειδή C τελικό λόβό (κατάλοιπα ). Η περιοχή που συνδέει τις δύο επικράτειες, ο σύνδεσμος (hinge), φέρει την καταλυτική περιοχή πρόσδεσης ATP, που καταλαμβάνεται από τον ανταγωνιστικό αναστολέα ATP σταυροσπορίνη, σε σύμπλοκο με την οποία προσδιορίστηκε η δομή της MAP3K5 με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ (Εικ. 14). Γενικά η MAP3K5 είναι μόνο μακρινά συγγενική ως προς την αλληλουχία, με κινάσες γνωστής δομής (Bunkoczi et al., 2007). Εικόνα 15.: Τρισδιάστατη δομή της MAP3K5 (Bunkoczi et al., 2007). 59

60 Η MAP3K5 (ASK1) αλληλεπιδρά με μεγάλο αριθμό μορίων, σχηματίζοντας ένα υψηλού μοριακού βάρους σύμπλοκο περίπου 1,500 2,000kDa, το οποίο ονομάζεται το «ASK1 signalosome». Στην κατάσταση ηρεμίας της η ASK1 σχηματίζει ένα ομοδιμερές, το οποίο σταθεροποιείται από το C τελικό σπειρωμένο σπείραμα. Το Ν τελικό άκρο προσδένεται στην redox ρυθμιστική πρωτεΐνη, θειορεδοξίνη (TRX), αποτρέποντας την ενεργοποίησή της. Το οξειδωτικό στρες οδηγεί στο σχηματισμό δισουλφιδικής γέφυρας στη TRX και στην αποδέσμευσή της από την MAP3K5, και σε φωσφορυλίωση της στο κατάλοιπο της περιοχής ενεργοποίησής της, Thr838. Η ενεργοποιημένη MAP3K5 έπειτα φωσφορυλιώνει άμεσα τις MKK3/MKK6 και MKK4/MKK7, έχοντας ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των p38 και JNK MAPK, αντίστοιχα (Bunkoczi et al., 2007). Εικόνα 16: Δίκτυο αλληλεπιδράσεων της MAP3K5 ( Το γονίδιο MAP3K5 ταυτοποιήθηκε μαζί με άλλα γονίδια στο QTL της 6q23 χρωμοσώμικής περιοχής. Η περιοχή χαρτογραφήθηκε αρχικά με ανάλυση σύνδεσης σε μια εκτεταμένη οικογένεια Ασιατών-Ινδών με β-μεσογειακή αναιμία (Craig et al., 1996), (Thein et al., 2007). Σε μελέτη με 280 Αφροαμερικανούς ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD), ταυτοποιήθηκαν SNP σε εσώνια τεσσάρων γονιδίων, ανάμεσα στα οποία και αυτό της MAP3K5 (Wyszynski et al., 2004). Δύο SNP στο γονίδιο MAP3K5 εντοπίστηκαν να συσχετίζονται με την επαγωγή της παραγωγής HbF. Αυτά τα SNP είναι τα rs και rs (Patrinos and Grosveld, 2008). Το μονοπάτι μέσω του οποίου συμμετέχει η MAP3K5 στην επαγωγή της έκφρασης των γ-σφαιρινών έχει μελετηθεί σε έρευνες των τελευταίων 60

61 ετών. Έτσι αποδείχτηκε ότι η υπερακετυλίωση των ιστόνων μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού της p38-mapk έχει συσχετιστεί με την ενεργοποίηση της έκφρασης της γ-σφαιρίνης μέσω της διέγερσης της σύνθεσης HbF από την απισιδίνη (apicidin). Η απισιδίνη ανήκει στους αναστολείς της απακετυλάσης των ιστονών (HDAC inhibitors), όπως η 5-αζακυτιδίνη και η υδροξυουρία (HU), και αποδείχτηκε πως επάγει την σύνθεση HbF σε K562 κύτταρα, με ειδικότητα στην έκφραση του γ- σφαιρινικού mrna μέσω του p38 και όχι του ERK- ή του JNK-MAPΚ σηματοδοτικού μονοπατιού (Witt et al., 2003), (Pace and Zein, 2006). A MAP7 Η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο MAP7 ονομάζεται ενσκονσίνη (Ensconsin). Αποτελεί μια πρωτεΐνη που σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους και εκφράζεται κυρίως σε κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης. Τέτοιου είδους πρωτεΐνες θεωρείται ότι εμπλέκονται στη δυναμική των μικροσωληνίσκων, κάτι απαραίτητο για την κυτταρική πόλωση και διαφοροποίηση. Αποδείχτηκε πως αυτή η πρωτεΐνη μπορεί να σταθεροποιήσει τους μικροσωληνίσκους, και μπορεί να τροποποιήσει τις λειτουργίες τους. Τα SNP εντός του γονιδίου MAP7 που έχουν συσχετιστεί με σημαντική μεταβολή (p<0.05) του ποσοστού της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης [HbF (%)] είναι τα rs , rs , rs997139, rs Τα rs και rs έχουν συσχετιστεί με σημαντική μεταβολή (p<0.05) της ποσότητας της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης σε γραμμάρια [HbF (g)]. Ο απλότυπος C-T-T-T για τα SNP στo γονίδιο MAP7 σχετίστηκε σημαντικά με αύξηση των συγκεντρώσεων της HbF (Wyszynski et al., 2004). A PEX7 Το γονίδιο PEX7 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη (peroxisomal biogenesis factor 7) που ανήκει στην ομάδα των PEX πρωτεΐνών (peroxisomal assembly (PEX) proteins). Μέσα στα κύτταρα αυτές οι πρωτεΐνες είναι υπεύθυνες για την εισαγωγή συγκεκριμένων ενζύμων μέσα στα υπεροξυσώματα (peroxisomes). Τα ένζυμα αυτά διασπούν πολλές διαφορετικές ουσίες, όπως λιπαρά οξέα και ορισμένα τοξικά σύμπλοκα. Στο γονίδιο της PEX7, τα SNP που έχουν συσχετιστεί με σημαντική μεταβολή (p<0.05) τόσο του ποσοστού της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης [HbF (%)], όσο και της ποσότητας της σε γραμμάρια [HbF (g)] είναι τα rs , rs και 61

62 rs Με αύξηση των επιπέδων της HbF σχετίστηκε ο απλότυπος T-C-C όσον αφορά στα SNP στο γονίδιο PEX7 (Wyszynski et al., 2004). A ALDH8A1 Το ALDH8A1 ταυτοποιήθηκε αρχικά μέσω μιας λειτουργικής προσέγγισης για τον εντοπισμό γονιδίων υπεύθυνων για τον 9-cis-ρετινικό μεταβολισμό. Το cdna του γονιδίου έχει μήκος 2551bp και αποτελείται από 7 εξώνια. Η έκφρασή του λαμβάνει χώρα σε ποικιλία ιστών, όπως τον μυελό των οστών. (Close et al., 2004). Το γονίδιο ALDH8A1 ταυτοποιήθηκε σε μια μελέτη σε μια μεγάλη οικογένεια ασιατικής-ινδικής καταγωγής με ετεροκυτταρική HPFH, β-μεσογειακή αναιμία και α-μεσογειακή αναιμία, να εμφανίζονται σε επτά γενεές. Σε αυτή την εκτεταμένη οικογένεια είχε νωρίτερα εντοπιστεί σημαντική σύνδεση μεταξύ της χρωμοσωμικής περιοχής 6q22.3- q24 και της αυξημένης έκφρασης HbF (Craig et al., 1996). Η αλληλουχία για την υποψήφια περιοχή (candidate interval) δόθηκε αργότερα από το «Human Genome Mapping Project». Έτσι, εννέα γονίδια ταυτοποιήθηκαν μέσα στο υποψήφιο τμήμα μεγέθους 1.5 Mb της χρωμοσωμικής περιοχής 6q23, ανάμεσα στα οποία και το ALDH8A1 (Close et al., 2004). A AHI1 Το γονίδιο AHI1 ταυτοποιήθηκε και αυτό εντός του υποψήφιου τμήματος ενδιαφέροντος μεγέθους 1.5 Mb της χρωμοσωμικής περιοχής 6q23. Αποκάλυφθηκε η ύπαρξη 7 μεταγράφων για το AHI1. Το πρωταρχικό μετάγραφο (AJ459824) είναι ένα cdna μήκους 5538 bp που κωδικοποιείται από 28 εξώνια, καλύπτωντας σχεδόν 215kb DNA γύρω από το κέντρο της υποψήφιας περιοχής του γονιδιώματος. Μια νησίδα CpG καλύπτει το εξώνιο 1 του γονιδίου. Το πολυπεπτίδιο που κωδικοποιείται από το γονίδιο αποτελείται από 1197 αμινοξέα με μοριακό βάρος περίπου 136 kda (Close et al., 2004). 62

63 A.7.8 Σχετικά QTL σε άλλα χρωμοσώματα A FLT1 Η πρωτεΐνη FLT1 (vascular endothelial growth factor (VEGF)/vascular permeability factor receptor) αποτελεί υποδοχέα για τον αυξητικό παράγοντα VEGF, ο οποίος αποτελεί κύριο επαγωγέα της αγγειογένεσης. Η πρωτεΐνη FLT1 διαθέτει δραστικότητα κινάσης της τυροσίνης, που είναι απαραίτητη για τον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης. Στη μελέτη που έγινε σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD) η πλέον σημαντική συσχέτιση με την ανταπόκριση της HbF στην HU εντοπίστηκε για το SNP rs στο γονίδιο FLT1, στο χρωμοσωμικό σκέλος 13q. Η αύξηση της HbF σε άτομα που φέρουν το αλληλόμορφο Α του rs , ήταν σχεδόν έξι φορές υψηλότερη σε σχέση με άτομα που έφεραν τον γονότυπο GG (Εικ.17). Σημαντική συσχέτιση παρουσίασαν και τα rs και rs Λιγότερο σημαντική συσχέτιση βρέθηκε για τα rs και rs (Ma et al., 2007), (Patrinos and Grosveld, 2008). Εικόνα 17.: Η μεταβολή HbF συναρτήσει του SNP rs (a) σε ποσοστό (%) και (b) σε γραμμάρια (g/dl) (Ma et al., 2007). A ARG1, ARG2 και ASS Σημαντική συσχέτιση βρέθηκε επίσης με SNP σε εσώνια των γονιδίων της αργινάσης τύπου 1 και 2, ARG2 και ARG1,επί των χρωμοσωμάτωνς 6 και 14, αντίστοιχα, τα οποία κωδικοποιούν ένζυμα που υδρολύουν την αργινίνη προς ορνιθίνη. Η μεταβολή 63

64 των απόλυτων επιπέδων της HbF συσχετίστηκε ιδιαίτερα σημαντικά με το SNP rs στο γονίδιο ARG2. Μικρότερη συσχέτιση υπήρξε και με το rs Τα SNP μέσα στο γονίδιο ASS (Argininosuccinate synthetase) του χρωμοσώματος 9, rs , rs , rs , rs543048, και της ARG1, rs , rs , rs , παρατηρήθηκε να έχουν ισχυρή συσχέτιση με την μεταβολή των επιπέδων HbF, κάτι που δεν εντοπίστηκε από την ανάλυση συσχέτισης ενός μοναδικού SNP (single SNP association analysis). Αυτό καταδεικνύει πως τα δύο αυτά γονίδια μπορεί να εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση με άλλα γονίδια για την ρύθμιση της απόκρισης στην θεραπεία με HU (Ma et al., 2007, Patrinos and Grosveld, 2008). A NOSI και NOS2A Τα SNP rs , rs , rs στο γονίδιο της NOSI (12q24.2-q24.31, νευρωνική συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου-no) και τα rs και rs στο γονίδιο της NOS2A (17q), μιας συνθετάσης NO που εκφράζεται στο ήπαρ, συσχετίστηκαν με την απόκριση της HbF στην HU (Ma et al., 2007), (Patrinos and Grosveld, 2008). Όπως προαναφέρθηκε, το μονοξείδιο του αζώτου (NO) προσδένεται και ενεργοποιεί την διαλυτή γουανυλική κυκλάση, sgc (soluble guanylate cyclase), που αυξάνει την παραγωγή cgmp. Σε μελέτη με ερυθρολευχαιμικά κύτταρα K562 και ανθρώπινους πρόδρομους ερυθροβλάστες, χρησιμοποιήθηκε στις κυτταροκαλλιέργειες S- νιτροκυστεΐνη (CysNO), ένας δότης μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ), και βρέθηκε παρόμοια δοσο- και χρόνο-εξαρτώμενη επαγωγή του γ-σφαιρινικού mrna και της HbF πρωτεΐνης, όπως είχε παρατηρηθεί και με την χρήση HU. Συνεπώς, και η HU και το CysNO αύξησαν τα επίπεδα cgmp. Αντίθετα, οι αναστολείς της γουανυλικής κυκλάσης (ODQ, NS 2028, και LY 83,538), εξαφάνισαν την έκφραση της γ- σφαιρίνης που είχε επαχθεί από την HU και από το CysNO. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι υπάρχει ένας μηχανισμός επαγωγής της HbF από το ΝΟ. Υπάρχουν αρκετοί μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζονται από την σηματοδοτική οδό NO/cGMP, που ενδέχεται να συμμετέχουν στην διαφορική έκφραση της αιμοσφαιρίνης. Η ενισχυτική δράση και η επαγωγή στην περιοχή του υποκινητή της γ-σφαιρίνης εξαρτώνται από την συνεργιστική δράση των πρωτεΐνών που προσδένονται στην πρωτεΐνη AP-1, μια ετεροδιμερή πρωτεΐνη που αποτελείται από τις υπομονάδες c-fos και c-jun. Η οδός «ΝΟ-γουανυλική κυκλάση-cgmp» είναι 64

65 γνωστό πως αυξάνει τα επίπεδα των c-fos και c-jun mrna και επάγει την πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 στο DNA. Η κυτταρική δραστηριότητα της AP-1 ρυθμίζεται επίσης από την φωσφορυλίωση των c-fos και c-jun από τις κινάσες MAPK. Αυτές ενεργοποιούνται με φωσφορυλίωση ανοδικών MAPKK και MAPKKK. Έχει αναφερθεί αυξημένη φωσφορυλίωση της p38 MAPK σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα και άλλους κυτταρικούς τύπους από το ΝΟ και το cgmp. Επίσης το μοτίβο CCACCC του παράγοντα Sp1 έχει αναφερθεί ως κρίσιμο για την υψηλή δραστηριότητα του γ-σφαιρινικού υποδοχέα. Έχει αναφερθεί ότι το ΝΟ αυξάνει την δραστηριότητα του υποκινητή του γονιδίου TNF-α στοχεύοντας στην Sp1 περιοχή πρόσδεσης. Επομένως, το ΝΟ θα μπορούσε να επιδρά στην έκφραση της γ-σφαιρίνης μέσω του Sp1 ή άλλων σχετικών μεταγραφικών παραγόντων, όπως και μέσω του AP- 1 (Cokic et al., 2003). Επιπλέον, είναι γνωστό ότι το cgmp δρά ως ενδοκυττάριος δεύτερος αγγελιοφόρος, ενεργοποιώντας την εξαρτώμενη από το cgmp πρωτεΐνική κινάση (PKG). Έτσι, αποδείχτηκε ότι το sgc-pkg μονοπάτι παίζει ρόλο, τουλάχιστον μερικό, στην ρύθμιση της έκφρασης του γ-σφαιρινικού γονιδίου σε ερυθρολευχαιμικά κύτταρα και σε πρόδρομους ερυθροβλάστες, αφού η αυξημένη έκφραση του γ-σφαιρινικού γονιδίου από το βουτυρικό ή την αιμίνη ανεστάλη, μέσω της παρεμπόδισης της δραστηριότητας της sgc ή της PKG (Ikuta et al., 2001). A HAO2 Συσχέτιση με την ανταπόκριση της HbF στην HU, εντοπίστηκε και για το γονιδίο HAO2 του χρωμοσωμικού σκέλους 1p. Συγκεκριμένα το SNP rs συσχετίστηκε με την μεταβολή στο ποσοστό (%) της HbF.. Το HΑΟ2 (Long chain L-2-hydroxy acid oxidase 2) είναι ένα ένζυμο που εκφράζεται στους νεφρούς και το ήπαρ. Πρόσφατα ταυτοποιήθηκε ως υποψήφιο γονίδιο σε QTL συνδεδεμένο με την πίεση του αίματος, αλλά το φυσιολογικό του υπόστρωμα και ο ρόλος του in vivo παραμένουν άγνωστα. To ΗΑΟ2 φαίνεται να εμπλέκεται στον μεταβολισμό της HU (Patrinos and Grosveld, 2008). Στον παρακάτω πίνακα συνοψίζονται οι πολυμορφισμοί που εντοπίστηκαν και χαρακτηρίστικαν ως δείκτες της ανταπόκρισης της HbF στην θεραπευτική αγωγή με HU. 65

66 Πίνακας 3. : Σύνοψη μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP) σε γονίδια εκτός του β- γονιδικού τόπου-πιθανοί φαρμακογονιδιωματικοί δείκτες της ανταπόκρισης της HbF στην HU σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD). Τα επίπεδα της HbF είναι υπολογισμένα και ως απόλυτη τιμή και ως ποσοστό. Τα [+] ή [-] συμβολίζουν την αύξηση ή μη των επιπέδων της HbF μετά την χορήγηση HU (Patrinos and Grosveld, 2008). Γονίδιο (αριθμός των SNPs) Χρωμόσωμα Πιθανός μηχανισμός HAO2 (1) 1 Μεταβολισμός HU MAP3K5 (2) 6 Παραγωγή HbF (QTL) Αριθμός των περιστατικών SNP (variant nt) Σχετική αύξηση HbF 137 rs [+] [+] 137 rs [-] [+] rs [-] [+] PDE7B (5) 6 Παραγωγή HbF (QTL) 137 rs rs rs rs rs [+] [-] [+] [-] [+] [-] [+] [-] [+] [-] TOX (7) 8 Ρύθμιση της μεταγραφής DNA (QTL) 137 rs rs rs rs rs rs rs [+] [ ] [+] [+] [+] [ ] [+] [+] [+] [+] [ ] [+] [ ] [+] NOSI (3) 12 Παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου FLTI (5) 13 Κυτταρικός πολλαπλασιασμός/ διαφοροποίηση 137 rs rs rs rs rs rs rs rs [+] [ ] [+] [+] [ ] [+] [+] [ ] [+] [+] [+] [+] [+] [ ] [+] [+] ARG2 (2) 14 Παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου NOS2A (2) 17 Παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου 137 rs rs rs rs [+] [+] [+] [+] [ ] [+] [ ] [+] 66

67 Α.8 Μεταγραφικοί παράγοντες Οι μεταγραφικοί παράγοντες είναι ίσως τα στοιχεία με το σημαντικότερο ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Αποτελούν ουσιαστικά τους τελικούς αποδέκτες των περιβαλλοντικών μηνυμάτων και αλλάζουν τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων ενός κυττάρου ώστε αυτό να μπορεί να αποκριθεί κατάλληλα στις αλλαγές που επιβάλλουν αυτά τα μηνύματα. Οι μεταγραφικοί παράγοντες χαρακτηρίζονται από συγκεκριμένες περιοχές (ή επίτοπους), από τις οποίες κάποια είναι υπεύθυνη και για την αλληλεπίδραση με το DNA, συνήθως στις θέσεις των υποκινητών ή των ενισχυτών. Η θέση πρόσδεσης στο DNA (DNA binding domain) χαρακτηρίζεται από μία σειρά κοινών δομικών μοτίβων, όπως: a) zinc fingers (δάκτυλος ψευδάργυρου) b) helix-turn-helix (έλικα στροφή έλικα) c) helix-loop-helix (έλικα βρόγχος έλικα) d) leucine zipper (φερμουάρ λευκίνης) Η επιφάνεια αυτών των μοτίβων έχει την ιδιότητα ισχυρής και ειδικής πρόσδεσης σε συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA, ενώ μικρές αλλαγές στην αμινοξική τους αλληλουχία μπορούν να επηρεάσουν δραματικά τη συγγένεια της πρωτεΐνης ως προς την ειδική αλληλουχία πρόσδεσης. Α.8.1 Γενικοί trans-μεταγραφικοί παράγοντες Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης ένας υποκινητής ρυθμίζεται από γενικούς αλλά και ιστοειδικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Οι γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες, που εμπλέκονται στην δημιουργία του συμπλόκου έναρξης της μεταγραφής, υπάρχουν σε όλα τα είδη των κυττάρων. Είναι γνωστό ότι η έναρξη της μεταγραφής γίνεται από την RNA πολυμεράση-ii. Για την πραγματοποίηση αυτής της διαδικασίας είναι απαραίτητη η παρουσία πέντε γενικών μεταγραφικών παραγόντων, των TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE. Οι παράγοντες αυτοί συγκροτούν ένα σύμπλοκο έναρξης της μεταγραφής. Το σύμπλοκο αυτό αρχίζει να σχηματίζεται με τον TFIID 67

68 που αναγνωρίζει και συνδέεται με την αλληλουχία ΤΑΤΑ. Η ένωση αυτή σταθεροποιείται παρουσία του TFIIA, και αμέσως ενώνεται και ο TFIIB στο ήδη δημιουργηθέν σύμπλεγμα. Ο παράγοντας TFIIB δρα σαν γέφυρα μεταξύ της RNA πολυμεράσης II και του παράγοντα TFIID. Σχηματίζεται ο πρώτος φωσφοδιεστερικός δεσμός του RNA. Ο TFIIE είναι DNA-εξαρτώμενη ΑΤΡάση, η οποία είναι απαραίτητη για την παραγωγή ενέργειας προκειμένου να γίνει η μεταγραφή. Ο TFIIF είναι απαραίτητος για το ξετύλιγμα της έλικας του DNA. Τέλος ο TFIIH έχει διάφορες ενζυμικές δράσεις, όπως ATPαση, DNA ελικάση, και κινάση. Η δράση του TFIIH ως κινάση είναι αναγκαία για την φωσφορυλιώση του καρβοξυτελικού άκρου της RNA πολυμεράσης-ιι, έτσι ώστε να αποσυνδεθεί η RNA πολυμεράση-ιι από τους υπόλοιπους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες και να μετατραπεί στην κατάλληλη μορφή για την επιμήκυνση του μεταγράφου. Επίσης ο TFIIH παίζει ρόλο και στην επιδιόρθωση του DNA κατά τη διάρκεια της μεταγραφής. Αυτοί οι παράγοντες θεωρείται ότι καθορίζουν περισσότερο τη συχνότητα έναρξης της μεταγραφής παρά την ακρίβεια της έναρξής της. Υπάρχουν και άλλοι γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες όπως οι πρωτεΐνης κυτταρικής οικονομίας (housekeeping proteins) CP1, SP1, AP1, και ΥΥ1, οι οποίοι βρίσκονται σε πολλά είδη κυττάρων. Η παρουσία αυτών των γενικών μεταγραφικών παραγόντων είναι απαραίτητη για την μεταγραφή. Α.8.2 Ερυθρο-ειδικοί trans-μεταγραφικοί παράγοντες Σε περιπτώσεις κυτταρικής διαφοροποίησης, όπως η ερυθροποίηση, ποσοτικός και χρονικός έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης είναι απαραίτητος. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της παρουσίας των κατάλληλων μεταγραφικών παραγόντων, των κατάλληλων μεταμεταγραφικών τροποποιήσεων και, τέλος, της συνεργασίας πολλών πρωτεϊνών κυτταρικής οικονομίας, καθώς και πολλών ιστοειδικών μεταγραφικών παραγόντων που λειτουργούν σχηματίζοντας διαφορετικά σύμπλοκα. A Παράγοντες GATA Οι GATA 1-3 είναι μεταγραφικοί παράγοντες με τη γενική ονομασία GATA και συνιστούν μια οικογένεια πρωτεϊνών που αναγνωρίζουν και προσδένονται στην αλληλουχία (A/T)GATA(A/G) του DΝΑ. Η πρόσδεσή τους μεσολαβείται από δύο 68

69 πολύ συντηρημένους δακτυλίους ψευδαργύρου, οι οποίοι είναι ομόλογοι σε όλα τα μέλη της οικογένειας αυτής. Διακρίνονται στους: α) αιμοποιητικούς παράγοντες GAΤΑ 1-3, που προσδένονται σε ειδικές θέσεις πρόσδεσης των ερυθροβλαστών, των μεγακαρυοκυττάρων, των ιστιοκυττάρων και των Τ-λεμφοκυττάρων (Εικ.18), και β) μη αιμοποιητικούς παραγόντες GATA 4-6, οι οποίοι εκφράζονται σε άλλους τύπους κυττάρων. Ο GATA-4 είναι ρυθμιστής-κλειδί της ανάπτυξης της καρδιάς και του ήπατος, προσδένεται σε WGATAR μοτίβα, και επάγει ξεδίπλωμα της χρωματίνης απουσία άλλων ρυθμιστικών μορίων. Εικόνα 18.: Η έκφραση των παραγόντων GATA κατά την ερυθροποίηση. Τα πρότυπα έκφρασης των GATA 1-3, όπως έχει καταγραφεί από την βιβλιογραφία από διάφορες μελέτες. Οι συμβολισμοί του θετικού και αρνητικού προσήμου βασίζονται κυρίως σε RT-PCR ανάλυση των επιπέδων mrna, παρά στην ποσοστική ανάλυση των επιπέδων των πρωτεΐνών. (HSC= hematopoietic stem cell; CMP,=common myeloid progenitor; CLP= common lymphoid progenitor; GMP= granulocyte/macrophage progenitor; MEP,=megakaryocyte/ erythrocyte progenitor; NK=natural killer; BFU-E=burstforming unit-erythroid; Poly=polychromatic erythroblast; Ret=reticulocyte;RBC= red blood cell) (Bresnick et al., 2005). Εκτός από την ρύθμιση της μεταγραφής του β-σφαιρινικού γονιδίου και άλλων ερυθροειδικών γονιδίων, ο παράγοντας GATA-1 απαιτείται για την διαφοροποίηση 69

70 των ερυθροποιητικών κυττάρων. Ο διπλός ρόλος των παραγόντων GATA στην μεταγραφή, αλλά και στην διαφοροποίηση, αποτελεί χαρακτηριστική ιδιότητά τους (Bresnick et al., 2005). Ο παράγοντας GATA-1, προσδένεται στις υπερευαίσθητες περιοχές (HS) του LCR και στους υποκινητές των γονιδίων του β-σφαιρινικού τόπου (Woon Kim et al., 2011). Οι παράγοντες GATA εκτελούν βιολογικές δραστηριότητες μέσω της επαγωγής και της καταστολής των γονιδίων-στόχων. Τα γονίδια GATA-2 και GATA-1 εκφράζονται αμοιβαία κατά την ερυθροποίηση, με τα επίπεδα του παράγοντα GATA-1 να αυξάνονται όσο τα επίπεδα του GATA-2 ελαττώνονται (Grass et al., 2003). Όχι μόνο είναι ο GATA-2 ο πιο έντονα εκφραζόμενος GATA παράγοντας στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (Hemopoietic stem cells, HSCs), αλλά η επιβίωση και η λειτουργία των HSC απαιτεί την παρουσία του παράγοντα GATA-2. Πέρα από τις μοναδικές και ξεχωριστές ιδιότητες κάθε παράγοντα GATA, μπορεί να διαθέτουν και κάποιες κοινές χαρακτηριστικές ιδιότητες. Ο GATA-1 και ο GATA-2 ρυθμίζουν την μεγακαρυοποίηση και την γένεση εμβρυονικών (πρώιμων) ερυθροκυττάρων. Μελέτη σε G1E κύτταρα προσέγγισε την ειδικότητα της πρόσδεσης επί της αλληλουχίας WGATAR εντός του β-σφαιρινικού τόπου από τον παράγοντα GATA-1. Παρόλο που εντοπίστηκαν πάνω από 280 WGATAR μοτίβα, ο GATA-1 προσδέθηκε μόνο μέσα στο LCR και τον ενεργό υποκινητή του β maj -γονιδίου των ποντικών, δηλαδή περιοχές που περιλαμβάνουν μόνο μικρό αριθμό WGATAR μοτίβων (Bresnick et al., 2005). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι GATA-1 και GATA-2 συχνά προσδένονται στην ίδια περιοχή ενός γονιδιακού τόπου, απλά σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια. Η διερεύνηση του εάν η καταστολή της μεταγραφής του GATA-2 από τον GATA-1 παράγοντα είναι άμεση ή έμμεση, υπέδειξε ότι ο GATA-1 προσδένεται σε συντηρημένες περιοχές ανοδικά του GATA-2 γονιδιακού τόπου (Grass et al., 2003), (Pal et al., 2004). Όταν τα επίπεδα GATA-1 είναι ανεπαρκή, ο GATA-2 προσδένεται σε αυτές τις περιοχές, σύμφωνα με την θετική αυτορρύθμιση. Ο GATA-1 εκτοπίζει τον GATA-2, και αυτή η αλλαγή συνδέεται ισχυρά με την μειωμένη πρόσδεση των ανοδικών ρυθμιστικών περιοχών από CBP/p300 και την μειωμένη ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 κατά μήκος του γονιδιακού τόπου (Grass et al., 2003). Αφού μικρή μείωση της ακετυλίωσης των ιστονών επάγει υψηλότερου βαθμού αναδίπλωση της 70

71 χρωματίνης, η απακετυλίωση του GATA-2 τόπου που προκαλείται από τον GATA-1, θεωρείται ότι μειώνει την προσβασιμότητα του DNA σε μεταγραφικούς παράγοντες και ότι «κλειδώνει» τον τόπο σε μια κατεσταλμένη κατάσταση. Γνωρίζοντας ότι ο GATA-2 έχει την ικανότητα να επάγει την επιβίωση των HSCs και την λειτουργικότητά τους, είναι πιθανό η έκφραση του GATA-1 σε ένα HSC, που έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή του GATA-2, να επάγει την απώλεια της μορφής του «βλαστοκυττάρου» και να προωθεί την τελική διαφοροποίηση. Ο GATA-2 επιλεκτικά προσδένεται στην περιοχή -2.8-kb του GATA-2 τόπου σε ενεργή κατάσταση, παρόλο που υπάρχουν πολλά μοτίβα GATA κατά μήκος του τόπου. Ο GATA-1 και ο GATA-2 προσδένονται κατά προτίμηση ο καθένας σε δύο επιπλέον περιοχές, την -3.9 και -1.8 kb του GATA-2 γονιδιακού τόπου, αντίστοιχα. Έτσι, προτείνεται ότι η μεταγραφή του GATA-2 γονιδίου ρυθμίζεται μέσω των συλλογικών δράσεων συμπλεγμάτων που συγκροτούνται στις και -1.8-kb περιοχές, που διαθέτουν παρόμοιες ιδιότητες, και μέσω μιας ποιοτικά πιο απομακρυσμένης δραστηριότητας του -3.9-kb συμπλόκου. Συνεπώς, ο GATA-1 και ο GATA-2 δεν αλληλεπιδούν το ίδιο με όλες τις χρωματινικές περιοχές στόχους (Martowicz et al., 2005). Επιπλέον αποτελέσματα μελετών αποκαλύπτουν ότι, σε χιμαιρικά ποντίκια, η έλλειψη του GATA-1 έχει ως αποτέλεσμα την αποτυχία της παραγωγής ώριμων ερυθροβλαστών (Pevny et al., 1991) και της μεταγραφής του βh1 σφαιρινικού γονιδίου του ποντικού σε φυσιολογικά επίπεδα σε κύτταρα εμβρυϊκού λεκιθικού ασκού (Fujiwara et al., 1996). Σε ερυθρολευχαιμικά κύτταρα ποντικών (MEL), η μεταγραφή του β-σφαιρινικού γονιδίου εξαρτάται από τους μεταγραφικούς παράγοντες GATA-1 και NF-E2, που απαιτούνται για την πρόσδεση της RNA πολυμεράσης II (pol II) στον σφαιρινικό υποκινητή (Johnson et al., 2002). Η στόχευση των GATA-1 ή p45/nf-e2 παρεμπόδισε την μεταγραφή των γ-σφαιρινικών γονιδίων, το σχηματισμό των υπερευαίσθητων περιοχών (HS) στο LCR και το σχηματισμό βρόγχου της χρωματίνης στο β-γονιδιακό τόπο, αλλά η ακετυλίωση των ιστονών κατά μήκος του τόπου μειώθηκε μόνο στην περίπτωση της απαλοιφής GATA-1. Σε κύτταρα με απαλοιφή των p45/nf-e2, η πρόσδεση του GATA-1 διατηρήθηκε στα HS του LCR και στον γ-σφαιρινικό υποκινητή, αλλά η πρόσδεση του NF-E2 στα HS μειώθηκε στα κύτταρα με απαλοιφή του GATA-1 ανεξάρτητα από την ποσότητα του p45/nf-e2 στα K562 κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η ακετυλίωση των ιστονών εξαρτάται από την πρόσδεση του 71

72 GATA-1, αλλά η πρόσδεση του GATA-1 δεν είναι επαρκής για την επαγωγή της μεταγραφής των γ-γονιδίων, του σχηματισμού των HS και του βρόγχου της χρωματίνης, διότι απαιτείται και η παρουσία του μεταγραφικού παράγοντα NF-E2 (Woon Kim et al., 2011). Έχει βρεθεί επίσης ότι, στα ποντίκια ο GATA-1 προσδένεται στον υποκινητή του β maj -γονιδίου και στο HS2 του LCR. H πρόσδεσή του αυτή καθορίζεται και από έναν δεύτερο παράγοντα, τον FOG-1. Αποδείχτηκε ότι η καταστολή της πρόσδεσης του FOG-1 με τον GATA-1 μείωσε σημαντικά την δημιουργία βρόγχου μεταξύ LCR και του υποκινητή του β maj -γονιδίου, με αποτέλεσμα την μείωση της έκφρασης του γονιδίου. Η αλληλεπίδραση του παράγοντα FOG-1 με τον GATA-1 επάγει την συγκρότηση διαφορετικών GATA-1-συμπλόκων, με αποτέλεσμα την επαγωγή ή καταστολή της έκφρασης γονιδίων. Μέσω επιπλέον μελετών, όπου χρησιμοποιήθηκαν HOX-11 αθανατοποιημένα κύτταρα που έχουν υποστεί απαλοιφή του FOG-1(FOG-1 _/_ HOX- 11), G1E κύτταρα, G1E ER GATA-1 κύτταρα, και ER GATA-1 κύτταρα που έχουν υποστεί απαλοιφή του FOG-1 (FOG-1 _/_ -ER GATA-1) και εκφράζουν σταθερά ER GATA-1, βρέθηκε ότι η αλληλεπίδραση των GATA-1 και FOG-1 επιφέρει στον GATA-1 υψηλότερη συγγένεια ως προς την χρωματίνη απ ότι αυτή της αλληλεπίδρασης GATA-1 WGATAR. Υπάρχουν δύο προτεινόμενοι μηχανισμοί (Pal et al., 2004) (Εικ.19): i. O GATA-1 μπορεί να συναντά τον FOG-1 επάνω στη χρωματίνη και να σχηματίζουν εκεί ένα σύμπλοκο που να εξωθεί τον GATA-2 από την θέση του. ii. Ένα GATA-1 FOG-1 σύμπλοκο μπορεί να σχηματίζεται πριν την πρόσδεση επάνω στην χρωματίνη και να αντικαθιστά το GATA-2 FOG-1 σύμπλοκο. 72

73 Εικόνα 19.: Μοντέλο διαμεσολαβητή της πρόσδεσης στην χρωματίνη από τον παράγοντα FOG- 1(chromatin occupancy facilitator activity) (Pal et al., 2004). Συμπερασματικά, ο παράγοντας GATA-1 είναι παρόν σε όλα τα στάδια της ανάπτυξης της ερυθράς σειράς και υπάρχει στα πολυδύναμα πρόδρομα κύτταρα, περιορίζοντας την περαιτέρω ωρίμανσή τους προς μια συγκεκριμένη κατεύθυνση. Αλληλεπιδρά και με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι Sp1, EKLF και LMO-2. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις υποδεικνύουν συνεργασία στη δράση αυτών των παραγόντων στη μεταγραφική ενεργοποίηση. A Παράγοντας NF-E2 Ένας επιπλέον εντατικά μελετημένος παράγοντας της ρύθμισης των γονιδίων των σφαιρινών είναι η ετεροδιμερής πρωτεΐνη, NF-E2. Ο NF-E2 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας με μία υδρόφοβη περιοχή που φέρει ένα φερμουάρ λευκίνης (leucine zipper) ως περιοχή ενεργοποίησης και με μία βασική περιοχή πρόσδεσης στο DNA. Ο NF-E2 (p45) σχηματίζει ένα λειτουργικό ετεροδιμερές με μια μικρότερη πρωτεϊνική υπομονάδα 18kD (p18). Έτσι αποτελείται από δύο υπομονάδες πρόσδεσης στο DNA, την πανταχού παρούσα MafK υπομονάδα ή p18 NF-E2 και το ερυθρο-ειδικό μόριο p45 NF-E2. Ο NF-E2 προσδένεται στο HS2 του LCR ερυθροβλαστών εμβρυϊκού ήπατος από ποντίκι και σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, ενώ μικρότερο ποσοστό πρόσδεσης παρατηρείται στον υποκινητή του β-σφαιρινικού γονιδίου σε ερυθροβλάστες ενηλίκων. 73

74 Ο NF-E2 συμμετέχει μαζί με τον παράγοντα GAΤΑ-1 στην έκφραση των γονιδίων της ερυθράς σειράς, στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα, στα μεγακαρυοκύτταρα και στα ιστιοκύτταρα. Όπως προαναφέρθηκε, πειράματα σε ΜΕL κύτταρα δείχνουν ότι υπάρχει άμεση εμπλοκή του NF-E2 στη ρύθμιση του β-γονιδίου διαμέσου της ενεργοποίησης της περιοχής LCR. Πιο συγκεκριμένα, θέσεις πρόσδεσης για τον NF- E2 έχουν βρεθεί στις θέσεις HS 2, 3 και 4 της LCR του β-σφαιρινικού γονιδίου. Έχει δειχθεί επίσης ότι η NF-E2 είναι η κύρια πρωτεΐνη του πυρηνικού εκχυλίσματος των κυττάρων ΜΕL που δένεται στις αλληλουχίες MARE (Martix Attachment Region) της περιοχής HS2. Η έκφραση του σφαιρινικού γονιδίου είναι ανάλογη με το ποσό της NF-E2 που προσδένεται σε αυτές στις αλληλουχίες (Woon Kim et al., 2011). Παρόλα αυτά φάνηκε ότι, σε κυτταρικές σειρές ο p45 NF-E2 απαιτείται για την έκφραση των γονιδίων της β-σφαιρίνης, ενώ σε ποντίκια με απαλοιφή του p45 NFE2, τα επίπεδα έκφρασης του b maj -γονιδίου ήταν μόνο ελαφρώς μειωμένα. Μια εξήγηση γι αυτή τη διαφορά μπορεί να είναι ότι στα ποντίκια, απουσία του p45 NF-E2, άλλοι σχετικοί παράγοντες μπορεί να σχετίζονται με το MafK, όπως για παράδειγμα ο Nrf- 2, αναπληρώνοντας την έλλειψη του. Συμπερασματικά, η in vivo λειτουργία του p45 NF-E2 μπορεί να αναπληρωθεί από άλλα μόρια που μπορούν να συμμετέχουν στο διμερισμό του παράγοντα NF-E2, όπως ο Nrf2. Παρόλα αυτά, ποντίκια στα οποία λείπουν και ο p45 NF-E2 και ο Nrf2, ή ο p45 NF-E2 και ο Nrf3, η έκφραση β-σφαιρίνης απουσιάζει. A Παράγοντας KLF-1 (Erythroid Krüppel-Like Factor, EKLF) Ο αυθεντικός παράγοντας χαρακτηρίστηκε στην Drosophila melanogaster ως ένα γονίδιο «χάσματος κατάτμησης», η ομόζυγη μεταλλαγή του οποίου είχε ως αποτέλεσμα την απουσία θώρακα και πρόσθιας κοιλιακής χώρας στα έμβρυα. Για το λόγο αυτό οι Γερμανοί ερευνητές ονόμασαν το γονίδιο αυτό «Krüppel» (στα Αγγλικά, cripple=σακάτης). Το πρώτο γονίδιο των θηλαστικών με ομολογία στο «Krüppel» ταυτοποιήθηκε το 1993 και η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί ονομάστηκε «ερυθροειδικός Krüppel-like παράγοντας» (erythroid Krüppel-like factor, EKLF), λόγω της ειδικής έκφρασής του στα ερυθροκύτταρα (Cao et al., 2010). Ο KLF-1 αρχικά απομονώθηκε από MEL κύτταρα και έχει μοριακό βάρος 38kD. Αρχικά η έκφρασή του εντοπίστηκε στο μυελό των οστών και στο σπλήνα, δηλαδή τα δύο ερυθροποιητικά όργανα του ποντικού. Ο KLF-1 εκφράζεται κυρίως σε ερυθροειδικά 74

75 κύτταρα και σε κύτταρα του συνδετικού ιστού. Είναι γνωστό ότι προσδένεται σε αλληλουχίες CACC που τις συναντούμε σε πολλούς υποκινητές ερυθροειδικών γονιδίων, ενώ εμφανίζει ειδικότητα για την αλληλουχία 5 -CCACACCCT-3 (Raich and Romeo, 1993). Επιπλέον ο KLF-1 εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια για την CACC αλληλουχία του υποκινητή του β-σφαιρινικού γονιδίου του ανθρώπου σε σχέση με αυτήν του γ-γονιδίου. Ο KLF-1 αποτελεί μεταγραφικό παράγοντα της οικογένειας Sp/XKLF (specificity protein/ Krüppel-Like Factor). Αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες προσδένονται σε αλληλουχίες GC και GT/TATA (boxes) που βρίσκονται σε υποκινητές, ενισχυτές και LCR μεγάλου αριθμού γονιδίων. Μία περιοχή πρόσδεσης στο DNA, μεγέθους 81 αμινοξέων, που βρίσκεται κοντά στο καρβοξυτελικό-άκρο, χαρακτηρίζει αυτή την πρωτεϊνική οικογένεια. Αποτελείται από ένα συνδυασμό τριών διατηρημένων δακτυλίων ψευδαργύρου του τύπου Cys2-His2. Στο ανθρώπινο γονιδίωμα, 24 γονίδια έχουν ομαδοποιηθεί σε αυτήν την οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων. Οχτώ από αυτά ανήκουν στην υποοικογένεια των Spπαραγόντων (Sp1-Sp8). Αυτοί εκτός από τον δακτύλιο ψευδαργύρου έχουν και μία συντηρημένη αλληλουχία ακριβώς στο αμινοτελικό-άκρο της θέσης του δακτύλιο ψευδαργύρου. Οι XKLF είναι γενικά μια ετερογενής οικογένεια, αλλά σχηματίζουν υποομάδες ανάλογα σύμφωνα με συγκεκριμένα συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα μεταξύ του κάθε δακτυλίου (Bieker, 2001). Το γράμμα «X» αντικαθίσταται από ένα γράμμα,ενδεικτικό της βασικής θέσης παραγωγής και έκφρασης του παράγοντα. Έτσι ο KLF-1 ή EKLF (Erythroid) εκφράζεται σε ερυθροειδικά κύτταρα, ο GKLF (Gut) σε κύτταρα του εντέρου ενώ ο LKLF (Lung) σε κύτταρα των πνευμόνων. Σε διαγονιδιακά KLF-1 -/- ποντίκια (knockout) που φέρουν ανθρώπινο β-γονιδιακό τόπο, η απαλοιφή του KLF-1 είχε ως αποτέλεσμα την απουσία της έκφρασης του β- γονιδίου, ενώ η έκφραση του γ-γονιδίου παρέμεινε αυξημένη (Wijgerde et al., 1996, Hodge et al., 2006). Ο KLF-1 είναι απαραίτητος για την έκφραση του β-σφαιρινικού γονιδίου στα ποντίκια, μετά από αλληλεπίδραση με τον αντίστοιχο υποκινητή, καθώς αποτελεί πρωταρχικής σημασίας μεταγραφικό επαγωγέα για την μετάβαση από την έκφραση της γ-σφαιρίνης στη β-σφαιρίνη (Perkins et al., 1996). Αντίθετα από τον KLF-1, ο GATA-1 σε αντίστοιχες κυτταρικές σειρές δρά ως μεταγραφικός καταστολέας (Hodge et al., 2006). 75

76 Οι πρώιμοι ερυθροβλάστες, στους οποίους έχει γίνει απαλοιφή του KLF-1 παρουσιάζουν βλάβες στην μορφολογία τους και την γονιδιακή έκφραση. Δεδομένου όμως ότι αυτά τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν φυσιολογική διάρκεια ζωής, ίσως άλλες πρωτεΐνες που προσδένονται στο CACC μοτίβο, όπως ο LKLF (KLF2) αντισταθμίζουν την απουσία του KLF-1 στους υποκινητές των εμβρυονικών ερυθροβλαστών (ζ-γονίδιο, ε-γονίδιο κτλ) (Hodge et al., 2006). Εκτός από το κυριότερο γονίδιο-στόχο του μεταγραφικού παράγοντα KLF-1, που είναι το β- σφαιρινικό γονίδιο, υπάρχουν και πολλά άλλα. Σημαντικό είναι και το γονίδιο της ντεμαντίνης (demandin). Αποτελεί πρωτεΐνη-κλειδί του κυτταροσκελετού και προσδένει την F-ακτίνη. Η απουσία της ή η μεταλλαγή του τμήματος της κεφαλής της έχει ως αποτέλεσμα την δημιουργία εύθραυστων ερυθροκυττάρων και τελικά την αιμόλυση. Άλλα γονίδια που ρυθμίζει ο KLF-1 και αποτελούν μεταγραφικούς παράγοντες είναι τα p45-nf-e2, CHOP, LMO2, ETO, BKLF (KLF3), RARγ, RARα, pokemon (Zbtb7), Btebl (KLF9), Gli3 και hemogen. Ειδικά ο BKLF εμφανίζεται σημαντικά μειωμένος σε εμβρυϊκά ηπατικά κύτταρα, στα οποία δεν εκφράζεται ο KLF-1. Είναι από τις πιο κοινές πρωτεΐνες που προσδένονται στο CACC-box και η απουσία του στην παραπάνω περίπτωση επισημαίνει το ρόλοκλειδί του στην ερυθροποίηση και στην αποσιώπηση του γ-σφαιρινικού γονιδίου (Hodge et al., 2006). Σημαντικό είναι ότι η δράση του KLF-1 ως επαγωγέα της μεταγραφής είναι κυρίως άμεση (direct). Η μειωμένη έκφραση του KLF-1 έχει συσχετιστεί με αυξημένα επίπεδα HbF και σε άλλες μελέτες (Borg et al., 2010). Δέκα από 27 μέλη μιας οικογένειας από την Μάλτα παρουσίασαν HPFH. Σάρωση ολόκληρου του γονιδιώματος για SNP (genome-wide SNP scan) υπέδειξε μια υποψήφια περιοχή, την 19p για την συσχέτιση με τα υψηλά επίπεδα HbF. Με DNA-αλληλούχηση αποκαλύφθηκε η ύπαρξη μιας μηνοηματικής μεταλλαγής στο γονίδιο KLF-1, η p.k288x, που ως αποτέλεσμα έχει την απώλεια της περιοχής πρόσδεσης του KLF-1 στο DNA. Η δεύτερη μεταλλαγή που εντοπίστηκε, p.m39l, ήταν ουδέτερη και συνεπώς σιωπηλή. Η ανάλυση έκφρασης και τα λειτουργικά πειράματα αποκάλυψαν ότι στα άτομα με HPFH τα γονίδια-στόχοι του KLF-1 παρουσίαζαν μειωμένη έκφραση. Συγκεκριμένα ο KLF-1 είναι επαγωγέας του γονιδίου BCL11A, το οποίο κωδικοποιεί έναν καταστολέα της έκφρασης της HbF. Η μεταλλαγή p.k288x απουσίαζε από τυχαίο δείγμα του γενικού πληθυσμού της Μάλτας. Συμπερασματικά, είναι πιθανό, εκτός της άμεσης δράσης του KLF-1 στον υποκινητή του β-γονιδίου, η επαγωγή της έκφρασής του να διαμεσολαβείται και 76

77 έμμεσα μέσω της επαγωγής του BCL11A από τον KLF-1, και συνεπώς καταστολή της έκφρασης της γ-σφαιρίνης. Έχει εντοπιστεί άλλωστε ισχυρή πρόσδεση του KLF-1 στον υποκινητή του γονιδίου BCL11A και η απουσία KLF-1 σε πειράματα είχε ως αποτέλεσμα την μειωμένη έκφραση του BCL11A (Borg et al., 2010). Όσον αφορά στην συμμετοχή του KLF-1 στην δημιουργία της «ενεργού διαμόρφωσης της χρωματίνης» (ACH), βρέθηκε ότι σε διαγονιδιακά ποντίκια με απαλοιφή της έκφρασης του KLF-1 (KLF-1 -/- ), οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της LCR περιοχής και του β maj -γονιδίου χάνονται όταν ο KLF-1 είναι απών. Για να εξεταστεί εάν ο KLF-1 έχει άμεση επίδραση στην δημιουργία βρόγχου (looping), εκτελέστηκαν επιπλέον πειράματα σε KLF-1 -/- διαγονιδιακά ποντίκια, στα οποία εκφράστηκε ειδική KLF-1- πρωτεΐνη σύντηξης, που ταχέως μετατοπίζεται στον πυρήνα. Αυτή η μετατόπιση στον πυρήνα σε κύτταρα με ανεσταλμένη την ικανότητα πρωτεΐνικής σύνθεσης, έδειξε αναδιαμόρφωση της ACH δομής και μερική αποκατάσταση της έκφρασης του β maj -γονιδίου, υποδεικνύοντας ότι ο KLF-1 εμπλέκεται άμεσα στον σχηματισμό βρόγχου μεταξύ LCR και του υποκινητή του β maj -γονιδίου. Η περιοχή του LCR με την οποία αλληλεπιδρά ο KLF-1 είναι η 5 HS3. Τέλος, έχει αποδειχθεί ότι για τη δράση του KLF-1 ως πρωτεΐνη που επηρεάζει τη δομή της χρωματίνης είναι απαραίτητη η ύπαρξη αλληλεπίδρασής του με έναν συνενεργοποιητή. Ο συνενεργοποιητής αυτός ταυτοποιήθηκε ως ο E-RC1 (KLF-1 coactivator remodeling complex) που είναι μέλος της SWI/SNF οικογένειας στα θηλαστικά (Drissen et al., 2004). Α.9 Αιμοσφαιρινοπάθειες και Μεσογειακή Αναιμία (Thalassemia) Α.9.1 Αιμοσφαιρινοπάθειες Οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι κληρονομούμενες μονογονιδιακές διαταραχές. Στις περισσότερες περιπτώσεις κληρονομούνται ως αυτοσωμικά συνεπικρατή χαρακτηριστικά. Στις κοινές αιμοσφαιρινοπάθειες συγκαταλέγεται και η δρεπανοκυτταρική αναιμία (sickle-cell disease) (SCD). Η έρευνα στην ανθρώπινη αιμοσφαιρίνη ξεκίνησε μελετώντας την δρεπανοκυτταρική αναιμία το Το 1925 οι Cooley και Lee πρώτοι περιέγραψαν μια μορφή βαριάς αναιμίας που συσχετίστηκε με σπληνομεγαλία και χαρακτηριστικές αλλαγές των οστών. Αυτή η κατάσταση έχει μείνει γνωστή από τότε ως θαλασσαιμία, ένας όρος που προέρχεται από την ελληνική 77

78 λέξη «θάλασσα», αναφερόμενη στην Μεσόγειο θάλασσα ή αλλιώς και αναιμία του Cooley (Patrinos and Antonarakis, 2010). Μελέτες με αντικείμενο τις ανθρώπινες αιμοσφαιρίνες έχουν προχωρήσει με εντατικούς ρυθμούς, ξεκινώντας με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των αμινοξέων και τις δομής του μορίου της αιμοσφαιρίνης το Το σύστημα της αιμοσφαιρίνης αποτελεί παράδειγμα για την κατανόηση της δράσης των γονιδίων σε μοριακό επίπεδο. Υπολογίζεται ότι 7% του παγκόσμιου πληθυσμού (420 εκατ.) είναι φορείς, με 60% του συνόλου και 70% των παθολογικών καταστάσεων να εντοπίζονται στην Αφρική. Οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι πιο κοινές σε πληθυσμιακές ομάδες από την Αφρική, την λεκάνη της Μεσογείου και την νοτιοανατολική Ασία. Οι αιμοσφαιρινοπάθειες ορίζονται ως η γενετική βλάβη που έχει ως αποτέλεσμα την μη-φυσιολογική δομή μιάς εκ των αλυσίδων των σφαιρινών του μορίου της αιμοσφαιρίνης ή την μειωμένη παραγωγή τους. Στην πρώτη περίπτωση γίνεται λόγος για τις ποιοτικές αιμοσφαιρινοπάθειες, ενώ στην δεύτερη για τις ποσοτικές. Όσον αφορά στις ποιοτικές αιμοσφαιρινοπάθειες, η γενετική βλάβη μπορεί να οφείλεται σε: i. αντικατάσταση ενός αμινοξέος με άλλο (όπως με την HbS και HbC και την πλειονότητα των άλλων μη φυσιολογικών αιμοσφαιρινών) ii. απαλοιφή ενός αριθμού αμινοξέων από την αμινοξική αλληλουχία (Hb Gun Hill), iii. μη φυσιολογικό υβριδισμό μεταξύ των δύο αλυσίδων (Hb Lepore) iv. μη φυσιολογική επιμήκυνση της σφαιρινικής αλυσίδας (Hb Constant Spring). Στις ποιοτικές αιμοσφαιρινοπάθειες η μη φυσιολογική αλυσίδα που προκύπτει μπορεί να είναι η α αλυσίδα (Hb G Philadelphia), η β αλυσίδα (Hb S, Hb C), η γ αλυσίδα (Hb F Texas), ή η δ αλυσίδα (Hb A 2Flatbush). Α.9.2 Ποσοτικές αιμοσφαιρινοπάθειες: Μεσογειακή Αναιμία (Θαλασσαιμία) Ο παγκόσμιος οργανισμός υγείας έχει υπολογίσει την ύπαρξη περίπου 270 εκατ. φορέων παγκοσμίως με μεταλλαγές σε σφαιρινικά γονίδια, 80 εκατ. εκ των οποίων είναι φορείς για την β-μεσογειακή αναιμία, και περίπου σοβαρά προσβεβλημένα νεογνά γεννιούνται κάθε χρόνο. Λόγω του επιλεκτικού πλεονεκτήματος των ετεροζυγωτών ενάντια στην ελονοσία, οι συχνότητες της μεσογειακής αναιμίας είναι υψηλές σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές της Ασίας, 78

79 της Μεσογείου και της Μέσης Ανατολής. Η μεσογειακή αναιμία αποτελεί αυτοσωμική υπολοιπόμενη νόσο που έχει τις ρίζες της στην περιοχή της Μεσογείου. Η μεσογειακή αναιμία ορίζεται ως μια γενετική βλάβη που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή χαμηλής ή/ και παντελή έλλειψη συγκεκριμένης αλυσίδας ή αλυσίδων σφαιρίνης. Η μοριακή αιτιολογία της μεσογειακής αναιμίας είναι ιδιαίτερα ετερογενής. Είναι άξιο λόγου, ότι η πρόοδος στην κατανόηση της νόσου σε μοριακό επίπεδο έχει οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση της φύσης και της ποικιλίας των ανθρώπινων μεταλλαγών γενικότερα. Ανάλογα με το ποια σφαιρινική αλυσίδα είναι απούσα ή ποσοτικά μειωμένη, οι μορφές της μεσογειακής αναιμίαςμπορούν να διακριθούν στην ως α-, β-, γ- και δ-μεσογειακή αναιμία, με την τελευταία να περιλαμβάνει αποκλειστικά μεταλλαγές ελλείψεων ( Α γδβ-, γδβ-, εγδβ-μεσογειακή αναιμία). Οι πιο κοινές και κλινικά πιο σημαντικές είναι η α- και β-μεσογειακή αναιμία, ενώ η δ-μεσογειακή αναιμία αποτελεί μια κλινικά σιωπηλή κατάσταση. Ο προσδιορισμός του μηχανισμού ρύθμισης των γονιδίων των σφαιρινών έχει ευνοηθεί σημαντικά από την διερεύνηση των ποικίλλων μεταλλαγμένων αλληλομόρφων των διαφόρων μορφών της μεσογειακής αναιμίας. Το αποτέλεσμα των διαφόρων μεταλλαγών είναι μια ανισορροπία στην παραγωγή των σφαιρινικών αλυσίδων και στην παραγωγή ενός ανεπαρκούς αριθμού ερυθροκυττάρων. Τα κύτταρα που παράγονται είναι υποχρωμικά/μικροκυτταρικά και χαρακτηρίζονται από κορεσμό από φυσιολογικές αλυσίδες που δεν μπορούν να ζευγαρώσουν στοιχειομετρικά με την ανεπαρκή παροχή των αλυσίδων που απουσιάζουν. Αυτές οι μη ζευγαρωμένες αλυσίδες καταστρέφονται στον μυελό των οστών (μη αποδοτική ερυθροποίηση) και την κυκλοφορία (αιμόλυση), έχοντας ως αποτέλεσμα τις ανεπιθύμητες κλινικές εκδηλώσεις της μεσογειακής αναιμίας. Η συχνότητα των φορέων της α-μεσογειακής αναιμίας κυμαίνεται από 1% (για παράδειγμα στην νότια Ισπανία) έως 90% (για παράδειγμα σε συγκεκριμένες φυλές του πληθυσμού της Ινδίας), ενώ η συχνότητα των φορέων της β-μεσογειακής αναιμίας κυμαίνεται από 1% (για παράδειγμα στη βόρεια Ιταλία) έως 70% (για παράδειγμα σε κάποιες περιοχές της νοτιοανατολικής Ασίας). Σημαντικές γονοτυπικές παραλλαγές εμφανίζονται ακόμη και μέσα στα όρια μιας χώρας. Ωστόσο, η επιδημιολογία της νόσου αλλάζει. Στις αναπτυσσόμενες χώρες, ο αριθμός των προσβεβλημένων παιδιών αυξάνεται, λόγω της μειωμένης θνησιμότητας εξαιτίας της διατροφής που βελτιώνεται και του καλύτερου ελέγχου των λοιμώξεων. Στις πιο αναπτυγμένες 79

80 χώρες, η επιδημιολογία της νόσου έχει επηρεαστεί από την πτώση στο συνολικό ποσοστό των γεννήσεων και από προγράμματα πρόληψης και προγεννητικού ελέγχου. Όμως, λόγω των πρόσφατων μεταναστεύσεων πληθυσμών, η μεσογειακή αναιμία έχει εξελιχθεί σε σημαντικό κομμάτι της κλινικής πρακτικής στην βόρεια Ευρώπη, συμπεριλαμβανομένου του Ηνωμένου Βασιλείου, των Η.Π.Α και της Αυστραλίας. Α Αιτίες πρόκλησης Μεσογειακής Αναιμίας Δύο είναι οι κύριες αιτίες της μεσογειακής αναιμίας: 1. Η διατάραξη της έκφρασης κάποιου από τα σφαιρινικά γονίδια. Μείωση ή έλλειψη των επιπέδων της α- ή της β-σφαιρίνης προκαλεί α- ή β-μεσογειακή αναιμία αντίστοιχα. Η δυσαναλογία που προκαλείται από τη μείωση κάποιας από τις σφαιρίνες έχει ως αποτέλεσμα την μείωση των επιπέδων της αιμοσφαιρίνης στα ερυθρά αιμοσφαίρια και κατά συνέπεια την πρόκληση αναιμίας. 2. Η περίσσεια των σφαιρινικών αλυσίδων που δε συμετέχουν στη δημιουργία του συμπλόκου της αιμοσφαιρίνης προκαλεί και μηχανικές βλάβες στα κύτταρα, καθιστώντας τα συνήθως πιο ευαίσθητα σε μηχανικές δυνάμεις και στην απόπτωση και συμβάλλοντας με αυτόν τον τρόπο στο φαινότυπο αναιμίας του ασθενή. Εκτός από τις μεταλλαγές στο ίδιο το σφαιρινικό γονίδιο, σημειακές μεταλλαγές και ελλείψεις ρυθμιστικών περιοχών, ακόμα και μεταλλαγές σε γονίδια transρυθμιστικών παραγόντων που είναι υπεύθυνοι για την ρύθμιση της έκφρασης των σφαιρινικών γονιδίων, ενδέχεται να έχουν ως αποτέλεσμα την διατάραξη της έκφρασης του αντίστοιχου γονιδίου (Stamatoyannopoulos et al., 2001). Α α-μεσογειακή Αναιμία Η μελέτη και η κατανόηση της μοριακής βάσης της α-μεσογειακής αναιμίας χρειάστηκε περισσότερο χρόνο αναλογικά με την β-μεσογειακή αναιμία και αυτό ερμηνεύεται από το γεγονός ότι για πολλά χρόνια υπήρχε άγνοια της ύπαρξης του δεύτερου αντιγράφου του α-σφαιρινικού γονιδίου στον α-γονιδιακό τόπο του χρωμοσώματος 16. Λόγω της ύπαρξης αυτού του δεύτερου αντιγράφου οι περιπτώσεις α-μεσογειακής αναιμίας μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε δύο ομάδες ανάλογα με την παραγωγή και των δύο γονιδίων που βρίσκονται σε κάθε χρωμόσωμα. Όταν και τα δύο γονίδια είναι ανενεργά η κατάσταση αυτή 80

81 χαρακτηρίζεται ως α 0 -μεσογειακή αναιμία. Ο ετερόζυγος γονότυπος μπορεί να γραφεί ως --/αα. Όταν ένα από τα δύο συνδεδεμένα γονίδια είναι ανενεργό τότε μιλάμε για α + -μεσογειακή αναιμία και ο γονότυπος μπορεί να γραφεί ως α/αα, όταν το ένα από τα δύο γονίδια έχει υποστεί απαλοιφή (deleted), ή α Τ α/αα, όταν ένα από τα δύο γονίδια έχει απενεργοποιηθεί λόγω κάποιας μετάλλαξης. Συνδυασμός δύο α 0 αλληλομόρφων προκαλεί το φαινότυπο της Hb Bart s που έχει ως αποτέλεσμα το θάνατο του ατόμου κατά τα τελευταία εμβρυϊκά στάδια. Αντίστοιχα, συνδυασμός ενός α 0 και ενός α + αλληλομόρφου είναι υπεύθυνος για την εμφάνιση του φαινοτύπου HbΗ που χαρακτηρίζεται από αναιμία σοβαρής μορφής και από ποικίλα επίπεδα HbH στο αίμα. Ο καθοριστικότερος παράγοντας για την πρόκληση του παθολογικού φαινοτύπου είναι η ανισορροπία στη σύνθεση των α- και β-σφαιρινικών αλυσίδων. Αυτός ο παράγοντας είναι ενδεικτικός της σημαντικότητας του ρόλου που παίζει η καταστροφική για την παραγωγή και την επιβίωση των ερυθρών κυττάρων περίσσεια σφαιρινικών αλυσίδων που δεν σχηματίζουν το τετραμερές της πρωτεΐνης. Γενικά λοιπόν, σε φαινότυπο α 0 -μεσογειακής αναιμίας μπορούν να οδηγήσουν οι εξής μεταλλαγές: i) Ελλείψεις που απομακρύνουν όλο ή μέρος του συμπλόκου των α- σφαιρινικών γονιδίων. ii) Ελλείψεις που περιλαμβάνουν την ρυθμιστική περιοχή HS-40 των α- σφαιρινικών γονιδίων, αντίστοιχη με την LCR των β-σφαιρινικών γονιδίων. iii) Ελλείψεις ανοδικά του συμπλέγματος των α-σφαιρινικών γονιδίων. Αντίστοιχα, ο φαινότυπος της α + -μεσογειακής αναιμίας προκαλείται είτε από μεγάλες ελλείψεις, που καταργούν το ένα από τα δύο α-γονίδια, είτε από μεταλλαγές που το απενεργοποιούν. Η δεύτερη κατηγορία μεταλλαγών χαρακτηριστικά ονομάζεται μη ελλειπτικού τύπου (non-deletion types). Α β-μεσογειακή Αναιμία Η β-μεσογειακή αναιμία είναι μία από τις εκτενέστερα μελετημένες μονογονιδιακές ασθένειες στον άνθρωπο. Ενδεικτικό στοιχείο αυτού είναι το γεγονός ότι έχουν παρατηρηθεί και μελετηθεί περισσότερες από διακόσιες διαφορετικές μεταλλάξεις που έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση φαινοτύπου β-μεσογειακής αναιμίας. Οι 81

82 κληρονομούμενοι με υπολοιπόμενο τρόπο τύποι β-μεσογειακής αναιμίας είναι διαδεδομένοι σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές του κόσμου και οφείλουν την υψηλή συχνότητα εμφάνισης τους σε ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα, την ανθεκτικότητα απέναντι στο Plasmodium falciparum που προκαλεί την ελονοσία. Δύο είναι οι πιο κοινές μορφές β-θαλασσαιμικών αλληλομόρφων. Η β 0, που χαρακτηρίζεται από πλήρη έλλειψη παραγωγής β-σφαιρινικών αλυσίδων, και η β + η οποία χαρακτηρίζει τις περιπτώσεις μειωμένης παραγωγής. Οι φορείς (ετεροζυγώτες) της β-μεσογειακής αναιμίας είναι κλινικά φυσιολογικοί με ήπια αναιμία και συνήθως δεν γνωρίζουν καν ότι είναι φορείς. Η HbA 2 είναι ελαφρώς ανεβασμένη, ενώ τα ερυθρά αιμοσφαίρια είναι μικρότερα και με λιγότερη περιεκτικότητα σε αιμοσφαιρίνη και τιμές μέσου κυτταρικού όγκου. Οι ετεροζυγώτες συνήθως δεν χρήζουν ιατρικής παρακολούθησης ή θεραπείας. Οι σοβαρά νοσούντες ομοζυγώτες με β-μεσογειακή αναιμία παρουσιάζουν σοβαρή αναιμία και χρειάζονται μεταγγίσεις αίματος. Η HbA λείπει εντελώς σε β 0 ομοζυγώτες, και είναι σημαντικά μειωμένη σε β + -ομοζυγώτες. Η νόσος σχετίζεται με αδυναμία ανάπτυξης και συχνά οδηγεί σε θάνατο στην ενήλικο ζωή ή και νωρίτερα. Μεσογειακή αναιμία με β 0 -ομοζυγωτία ή β + /β 0 -σύνθετη ετεροζυγωτία αποτελούν σοβαρές αιμοσφαιρινοπάθειες. Λιγότερο επιβλαβή αλληλόμορφα β-μεσογειακής αναιμίας περιλαμβάνουν τα β ++ και β silent, αντιπροσωπεύοντας το ελάχιστο έλλειμα σε β-σφαιρινικές αλυσίδες. Όμως, την σοβαρότητα της κλινικής εικόνας της β- μεσογειακής αναιμίας δεν την καθορίζουν μόνο οι καθεαυτές μεταλλαγές στο β- σφαιρινικό γονίδιο. Παράγοντες που επιδρούν καθοριστικά στην διαμόρφωση της βαρύτητας της νόσου είναι: (1) Η περίσσεια των α-αλυσίδων, που έχει ως αποτέλεσμα την κατακρήμνισή τους στα ερυθρά αιμοσφαίρια και τελικά την καταστροφή των ερυθροκυττάρων. Η συγκληρονόμηση α-μεσογειακής αναιμίας προκαλεί έναν πιο ήπιο φαινότυπο της β- μεσογειακής αναιμίας. Ίσως στο σημείο αυτό έχει σημασία και ο ρυθμός πρωτεόλυσης της περίσσειας των α-αλυσίδων, χωρίς όμως να υπάρχουν σαφείς ενδείξεις που να επιβεβαιώνουν αυτές τις υποθέσεις. (2) Τα επίπεδα σύνθεσης των γ-αλυσίδων. Η έμφυτη ικανότητα παραγωγής της εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνης HbF (Σύνδρομα κληρονομικής εμμονής της HbF-HPFH) λειτουργεί αντισταθμιστικά στην ανεπάρκεια της αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων HbA. 82

83 Επίσης, σε μικρότερο βαθμό λειτουργούν αντισταθμιστικά και τα επίπεδα των δ- αλυσίδων, δηλαδή η ανεβασμένη ποσότητα HbA 2. (3) Ποικίλοι γενετικοί τροποποιητικοί παράγοντες (modifiers), που εντοπίζονται σε γενετικούς τόπους είτε συνδεδεμένους (linked) είτε μη- συνδεδεμένους (unlinked) με το β-σφαιρινικό σύμπλοκο. Η απουσία ή η μη λειτουργικότητα των β-σφαιρινικών αλυσίδων, που χαρακτηρίζει τις περιπτώσεις β-μεσογειακής αναιμίας, είναι αποτέλεσμα μεταλλαγών που επηρεάζουν όλα τα επίπεδα λειτουργίας του συμπλέγματος των β-σφαιρινικών γονιδίων, δηλαδή τη μεταγραφή, την ωρίμαση του mrna, τη μετάφραση και τη μετα-μεταφραστική σταθερότητα της πολυπεπτιδικής αλυσίδας της β-σφαιρίνης. Ορισμένοι από τους σημαντικότερους τύπους μεταλλάξεων που έχει παρατηρηθεί ότι προκαλούν φαινότυπο β-μεσογειακής αναιμίας αναφέρονται παρακάτω: i) Ελλείψεις των β-σφαιρινικών γονιδίων. Δεν αποτελεί τόσο κοινό τύπο μεταλλαγών ως αίτιο πρόκλησης β-μεσογειακής αναιμίας σε αντίθεση με την α- μεσογειακή αναιμία, όπου φαίνεται να είναι ο συχνότερος τύπος μεταλλαγών. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα ετερόζυγα άτομα για αυτό τον τύπο των μεταλλαγών εμφανίζουν και ασυνήθιστα υψηλά επίπεδα παραγωγής HbA 2 στους ετεροζυγώτες. ii) Μεταλλαγές στον υποκινητή του β-σφαιρινικού γονιδίου. Αρκετές μεταλλαγές έχουν παρατηρηθεί μέσα ή γύρω από τις συντηρημένες αλληλουχίες που βρίσκονται ανοδικά του β-σφαιρινικού γονιδίου και αποτελούν τα διάφορα στοιχεία του υποκινητή του. Περιλαμβάνουν αντικαταστάσεις νουκλεοτιδίων σε αλληλουχίες όπως το στοιχείο ATA (30bp ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής) ή η εγγύς και η άπω αλληλουχία CCAC. Αυτές οι μεταλλαγές μειώνουν την παραγωγή του mrna του γονιδίου της β-σφαιρίνης. iii) Μεταλλαγές στη θέση πρόσδεσης της καλύπτρας. Η αντικατάσταση στη θέση +1(A>C) έχει ως αποτέλεσμα νοσηρό φαινότυπο ήπιας μορφής. Η μετάλλαξη σε αυτή τη θέση που αποτελεί και θέση έναρξης της μεταγραφής μπορεί να επηρεάζει το στάδιο της μεταγραφής, το στάδιο της ωρίμανσης του RNA μεταγράφου ή και τα δύο αυτά στάδια. iv) Μεταλλαγές στην 5 μη-μεταφραζόμενη περιοχή του β-σφαιρινικού γονιδίου. Αρκετές μεταλλαγές έχουν αναφερθεί σε αυτή την περιοχή και σχετίζονται με ποικιλία φαινοτύπων που μπορεί να κυμαίνουνται από τελείως σιωπηλοί στους 83

84 ετεροζυγώτες μέχρι βαριάς μορφής β-μεσογειακή αναιμία. Παρ όλα αυτά είναι σχεδόν ξεκάθαρο το γεγονός ότι όταν αυτές οι περιπτώσεις συνδυαστούν με άλλες μορφές μεσογειακής αναιμίας τείνουν να δώσουν πιο βαρύ φαινότυπο. v) Μεταλλαγές στις θέσεις συρραφής (ή μάτισματος) (splicing) στα όρια εσωνίου-εξωνίου. Τα σύνορα μεταξύ εσωνίου-εξωνίου χαρακτηρίζονται πάντα από τα δινουκλεοτίδια GT- στο 5 άκρο και -AG στο 3 άκρο. Μεταλλάξεις σε οποιαδήποτε από αυτές τις θέσεις καταργούν τη φυσιολογική συρραφή και μπορούν να δημιουργήσουν φαινότυπο β-μεσογειακής αναιμίας. Όμως, υπάρχουν γειτονικές συντηρημένες αλληλουχίες που αναγνωρίζονται κατά τη διαδικασία της συρραφής. Μεταλλαγές σε αυτές τις αλληλουχίες μπορεί να μειώσουν την αποτελεσματικότητα της συρραφήςς. Αυτό συμβαίνει γιατί παρόλο που η μεταγραφή του γονιδίου φαίνεται να είναι φυσιολογική, υπάρχει πλήρης απενεργοποίηση της συρραφής στη θέση με τη μεταλλαγή. Σε αυτές τις περιπτώσεις άλλες θέσεις που μπορούν να λειτουργήσουν ως κρυφές θέσεις συρραφής (cryptic sites), και που φυσιολογικά δε συμμετέχουν στη συρραφή, χρησιμοποιούνται με αποτέλεσμα να έχουμε συγκέντρωση μη φυσιολογικά επεξεργασμένων RNA μεταγράφων στους πρόδρομους ερυθροβλάστες, διαταραγμένες αναλογίες α- και β-σφαιρινικών αλυσίδων και τελικά φαινότυπο β- μεσογειακής αναιμίας. vi) Μεταλλαγές σε κρυφές θέσεις συρραφής (ή ματίσματος) σε εξώνια Μεταλλαγές σε αυτές τις θέσεις μπορεί να επηρεάσουν τόσο τη διαδικασία της συρραφής, μέσω της δημιουργίας εναλλακτικών θέσεων συρραφής, όσο και την αμινοξική αλληλουχία της β-σφαιρίνης, αφού μεταλλάξεις εντός του εξωνίου μπορούν να επηρεάσουν και την αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης. vii) Μεταλλαγές σε κρυφές θέσεις συρραφής (ή ματίσματος) σε εσώνια Μεταλλαγές μπορεί να παρατηρηθούν ακόμα και σε «κρυφές» θέσεις συρραφής σε εσώνια παρά το γεγονός ότι οι φυσιολογικές θέσεις παραμένουν ανέπαφες. Έχουν ως αποτέλεσμα την παραγωγή μη φυσιολογικού mrna λόγω της παρουσίας επιπλέον αμινοξικών αλληλουχιών που προέρχονται από τα εσώνια. Οι αλλαγές που παρατηρούνται μπορεί να δημιουργήσουν είτε μία επιπλέον θέση «δέκτη» είτε μία επιπλέον θέση «δότη». viii) Μεταλλαγές στη θέση πολυαδενυλίωσης Η αλληλουχία AAUAAA της 3 UTR του mrna του β-σφαιρινικού γονιδίου αποτελεί το σήμα για την αποκοπή και την πολυαδενυλίωση του μεταγράφου. 84

85 Αρκετές διαφορετικές μεταλλαγές έχουν παρατηρηθεί σε αυτήν την περιοχή με διαφορετική κλινική εικόνα η κάθε μία. ix) Μεταλλαγές που έχουν ως αποτέλεσμα τη μη φυσιολογική μετάφραση του mrna του β-σφαιρινικού γονιδίου Οι μεταλλαγές που ανήκουν σε αυτήν την κατηγορία κατατάσσονται περαιτέρω σε τρεις υποκατηγορίες. Η πρώτη από αυτές χαρακτηρίζεται από νουκλεοτιδικές αντικαταστάσεις που επηρεάζουν τη φύση ενός αμινοξέος μετατρέποντάς το σε κωδικόνιο τερματισμού της μετάφρασης με αποτέλεσμα την παραγωγή πρωτεΐνης μειωμένου μήκους. Η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει ενθέσεις ή ελλείψεις νουκλεοτιδίων αριθμού διάφορου του τρία ή των πολλαπλασίων του. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη διατάραξη του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης και την παραγωγή πρωτεϊνης με ανώμαλη αλληλουχία και μήκος. Τέλος, η τρίτη κατηγορία συγκεντρώνει τις λίγες μεταλλαγές που εντοπίζονται στο κωδικόνιο έναρξης της μεταγραφής και επηρεάζουν με αυτό τον τρόπο την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης. x) Ασταθείς β-σφαιρίνες Όπως και στην περίπτωση των ασταθών παραγώγων του α-σφαιρινικού γονιδίου, τα παράγωγα αυτά αδυνατούν να σχηματίσουν σταθερά τετραμερή. Τα τετραμερή που σχηματίζονται αποδομούνται ταχύτατα με αποτέλεσμα την εμφάνιση φαινοτύπου β 0 / β 0 μεσογειακής αναιμίας. Η μελέτη αυτών των παραγώγων γίνεται μέσω της μελέτης της αλληλουχίας του DNA από το οποίο προέρχονται και αυτό γιατί δεν είναι δυνατή η απομόνωσή τους λόγω της αστάθειάς που εμφανίζουν. Και σε αυτήν την περίπτωση μεταλλαγών η κλινική εικόνα μπορεί να εμφανίζει μεγάλη ποικιλομορφία. Αντίθετα με τις κλασσικές υπολειπόμενες μορφές β-μεσογειακής αναιμίας, που ως αποτέλεσμα έχουν την μειωμένη παραγωγή φυσιολογικών β-σφαιρινικών αλυσίδων, κάποιες σπάνιες μεταλλαγές έχουν ως αποτέλεσμα την σύνθεση εξαιρετικά ασταθών β-σφαιρινικών παραλλαγμένων αλυσίδων που κατακρημνίζονται σε πρόδρομα ερυθροκύτταρα προκαλώντας μη-αποδοτική ερυθροποίηση. Αυτές οι μεταλλαγές σχετίζονται με έναν κλινικά ανιχνεύσιμο φαινότυπο μεσογειακής αναιμίας στους ετεροζυγώτες και συντελούν γι αυτό το λόγο στην εμφάνιση «επικρατούς β- μεσογειακής αναιμίας». 85

86 Α Κλινική εικόνα ασθενών με β-μεσογειακή αναιμία Τρεις είναι οι κύριες μορφές την κλινικής εικόνας της β-μεσογειακής αναιμίας και διαχωρίζονται σύμφωνα με τη βαρύτητα του φαινοτύπου της ασθένειας. A Μείζων (βαριά) β-μεσογειακή αναιμία (major) Η μείζων β-μεσογειακή αναιμία χαρακτηρίζεται από πολύ σημαντική έλλειψη HbA λόγω της αδυναμίας παραγωγής β-σφαιρινικών αλυσίδων. Και τα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου της β-σφαιρίνης φέρουν μεταλλαγές. Πρόκειται είτε για μία ομόζυγη ή για δύο συνδυασμένες ετερόζυγες μεταλλάξεις γονιδίων, που αφορούν στη σύνθεση της β-αλυσίδας (β + / β 0, β 0 / β 0 ή β + / β + ). Τα κλινικά συμπτώματα της νόσου εμφανίζονται μεταξύ 6-24 μηνών στο νεογνό, καθώς κατά το διάστημα αυτό μειώνονται σταδιακά τα επίπεδα παραγωγής της HbF. Το νεογνό γίνεται σταδιακά χλωμό, παρουσιάζει προβλήματα στην πρόσληψη τροφής, διάρροια, ευερεθιστότητα, επαναλαμβανόμενες εξάρσεις πυρετού και ενδεχομένως να εμφανίσει σταδιακή μεγέθυνση του κοιλιακού χώρου, λόγω διόγκωσης της σπλήνας και του ήπατος. Ιδιαίτερα σε αναπτυσσόμενες χώρες, όπου λόγω της έλλειψης πόρων, οι ασθενείς δεν δέχονται κάποια θεραπεία ή μεταγγίζονται σπάνια, η κλινική εικόνα της μείζονος β-μεσογειακής αναιμίας χαρακτηρίζεται από καθυστερημένη ανάπτυξη, ωχρότητα, ίκτερο, φτωχό μυϊκό σύστημα, βλαισό γόνατο, ηπατοσπληνομεγαλία, έλκη των κάτω άκρων, ανάπτυξη μαζών λόγω εξωμυελικής αιμοποίησης και σκελετικές μεταβολές, λόγω της επέκτασης του μυελού των οστών. Αυτές οι μεταβολές περιλαμβάνουν κυρίως αλλοιώσεις στα μακρά οστά των κάτω άκρων και τυπικές κρανιοπροσωπικές αλλαγές (Galanello and Origa, 2010). Έτσι, λοιπόν, τα κλινικά χαρακτηριστικά του ασθενή εμφανίζουν μεγάλη ποικιλία που εξαρτάται από τη διαχείριση της νόσου και πιο συγκεκριμένα από τη συχνότητα των μεταγγίσεων που θα πραγματοποιηθούν. Αν ξεκινήσει άμεσα από την βρεφική σχεδόν ηλικία ένα τακτικό πρόγραμμα μεταγγίσεων, το οποίο να διατηρεί μια ελάχιστη συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης στα 9,5-10,5 g/dl, τότε η ανάπτυξη τείνει να είναι φυσιολογική έως το έτος της ηλικίας του παιδιού. Σε γενικές γραμμές, ένας ασθενής με βαριά β-μεσογειακή αναιμία χρειάζεται συχνές μεταγγίσεις αίματος, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα την υπερφόρτωση του οργανισμού σε σίδηρο και την ανάγκη εφαρμογής θεραπειών αποσιδήρωσης. Ασθενείς, οι οποίοι δεν μεταγγίζονται 86

87 τακτικά, συνήθως καταλήγουν πριν την 2 η - 3 η δεκαετία της ζωής τους. Η επιβίωση των ατόμων που τακτικά μεταγγίζονται και λαμβάνουν αντίστοιχη θεραπεία αποσιδήρωσης εκτιμάται πέρα από την ηλικία των 40 ετών (Galanello and Origa, 2010). A Ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία (intermedia) Μια ετερογένεια μοριακών γεγονότων μπορούν να προκαλέσουν τον φαινότυπο αυτό. Τα κλινικά χαρακτηριστικά μπορεί επίσης να ποικίλουν από σχεδόν σιωπηλό φαινότυπο μέχρι και πολύ σοβαρό φαινότυπο που πλησιάζει τη βαρύτητα αυτού της μείζονος β-μεσογειακής αναιμίας. Στην ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία δεν παρατηρούνται μεταλλαγές απαραίτητα και στα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου της β-σφαιρίνης (β + / β + ή β 0 /β). Συνήθως η παραγωγή των β-αλυσίδων είναι χαμηλή. Τρία βασικά χαρακτηριστικά διαχωρίζουν τους ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία από αυτούς με μείζονα: i. Η καθυστερημένη εμφάνιση της νόσου και των κλινικών συμπτωμάτων της ii. Η πιο ήπια μορφή αναιμίας iii. Η απουσία ανάγκης μεταγγίσεων ή συχνών μεταγγίσεων Απαιτούνται μόνο αραιές ή και καθόλου μεταγγίσεις αίματος, γιατί τα άτομα αυτά συνήθως διαθέτουν υψηλά επίπεδα HbF, που αντισταθμίζουν την έλλειψη της HbA. Σημαντικός παράγοντας για τη διάγνωση της νόσου είναι ο χρόνος εμφάνισής της που επίσης μπορεί να ποικίλει. Όσον αφορά την εκδοχή της βαρύτερης κλινικής εικόνας της ενδιάμεσης β- μεσογειακής αναιμίας, εμφανίζεται σε ασθενείς 2-6 ετών, οι οποίοι παρόλο που είναι σε θέση να επιβιώνουν χωρίς συνεχείς μεταγγίσεις αίματος, παρουσιάζουν καθυστερημένη ανάπτυξη. Κατά τα άλλα, οι ασθενείς με τον βαρύτερο φαινότυπο της μορφής αυτής, εμφανίζουν συχνά παρόμοια συμπτώματα με αυτά των ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία, όπως είναι για παράδειγμα η υπερτροφία του μυελού των οστών και η εξωμυελική ερυθροποίηση, ως μηχανισμός αντιστάθμισης του μυελού των οστών για να αντιμετωπιστεί η χρόνια αναιμία. Συνεπακόλουθο αυτού είναι οι παραμορφώσεις των οστών και του προσώπου και η οστεοπόρωση. Από την άλλη, όσον αφορά τον ήπιο φαινότυπο της ενδιάμεσης β-μεσογειακής αναιμίας, οι συγκεκριμένοι ασθενείς είναι εντελώς ασυμπτωματικοί μέχρι την 87

88 ενήλικο ζωή με ήπια μόνο αναιμία. Χαρακτηριστικό είναι το γεγονός ότι πολλές φορές η διάγνωση της νόσου γίνεται τυχαία μέσω αιματολογικών εξετάσεων ρουτίνας (Galanello and Origa, 2010). A Ετερόζυγη β-μεσογειακή αναιμία/ στίγμα (β-thalassemia trait/ β- Thalassemia minor) Χαρακτηρίζεται ως η ετερόζυγη κατάσταση για την β 0 ή την β + -μεσογειακή αναιμία. Είναι πάντα ασυμπτωματική με πολύ ομοιογενή αιματολογικά χαρακτηριστικά σε κάθε περίπτωση, παρόλη την ετερογένεια της νόσου. Πιο συγκεκριμένα παρατηρείται μικροκυττάρωση, υποχρωμία με μειωμένες τιμές MCV και MCH ενώ χαρακτηρίζεται από αυξημένα επίπεδα HbA 2 και ελαφρώς αυξημένα επίπεδα HbF στο 50% των περιπτώσεων. Οι μόνες περιπτώσεις όπου παρατηρείται απόκλιση από αυτή την κλινική εικόνα είναι αυτές όπου συνδυάζεται με ετερόζυγη α-μεσογειακή αναιμία. Σε αυτές τις περιπτώσεις οι τιμές MCH και MCV είναι πολύ πιο κοντά στις φυσιολογικές, ενώ η τιμή της HbA 2 είναι και πάλι αυξημένη (Stamatoyannopoulos et al., 2001). A β-μεσογειακή αναιμία συνδυασμένη με άλλες Hb-ανωμαλίες Α. HbE/β-μεσογειακή αναιμία Η αλληλεπίδραση HbE και β-μεσογειακής αναιμίας έχει ως αποτέλεσμα φαινοτύπους μεσογειακής αναιμίας που κυμαίνονται από καταστάσεις που δεν διαχωρίζονται από την μείζονα β-μεσογειακή αναιμία έως και ήπιους φαινοτύπους παρόμοιους με την ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία. Τρείς κατηγορίες υπάρχουν ανάλογα με την βαρύτητα των συμπτωμάτων: 1) Ήπια HbE/β-μεσογειακή αναιμία (15% των περιπτώσεων στην νοτιοανατολική Ασία, Hb 9-12 g/dl) 2) Μέτρια βαριά HbE/β-μεσογειακή αναιμία (πλειονότητα των περιπτώσεων, Hb 6-7g/dl) 3) Βαριά HbE/β-μεσογειακή αναιμία (παρόμοια συμπτώματα με μείζονα β- μεσογειακή αναιμία, Hb 4-5g/ dl) 88

89 B. HbC/β-μεσογειακή αναιμία Ασθενείς με HbC/β-μεσογειακή αναιμία μπορεί να ζήσουν χωρίς συμπτώματα και να διαγνωστούν τυχαία κατά τη διάρκεια μιας εξέτασης ρουτίνας. Όταν υπάρξουν κλινικές εκδηλώσεις, αυτές είναι αναιμία και μεγέθυνση του σπλήνα. Μεταγγίσεις αίματος απαιτούνται σπάνια. Μικροκυττάρωση και υποχρωμία εντοπίζονται σε κάθε περίπτωση. Στο φίλμ αίματος εντοπίζονται διακριτοί HbC κρύσταλλοι. Γ. HPFH + β-μεσογειακή αναιμία Η συγκληρονόμηση της «κληρονομικής εμμονής της έκφρασης της HbF» (HPFH) με την β-μεσογειακή αναιμία μετριάζει τη κλινική εικόνα που ποικίλλει από φυσιολογική έως παρόμοια με της ενδιάμεσης β-μεσογειακής αναιμίας. Δ. HbS/β-μεσογειακή αναιμία Άτομα με HbS/β-μεσογειακή αναιμία παρουσιάζουν μια κλινική πορεία παρόμοια με αυτή της HbSS. Η HbS/ β + είναι κοινή σε έγχρωμους. Α Θεραπευτικές προσεγγίσεις Βασική θεραπευτική αντιμετώπιση της σοβαρής αναιμίας που υφίστανται οι ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία είναι η μετάγγιση αίματος. Μέσω αυτής επιδιώκεται: i. Η διόρθωση της αναιμίας ii. Η καταστολή της ερυθροποίησης iii. Η αναστολή της απορρόφησης σιδήρου από το γαστρεντερικό. Η αυξημένη απορρόφηση σιδήρου υπάρχει στα άτομα που δεν έχουν μεταγγιστεί σαν συνέπεια της αυξημένης μη αποτελεσματικής ερυθροποίησης. Η ανάγκη για μετάγγιση καθορίζεται από τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης στο αίμα. Η έναρξη μεταγγίσεων ξεκινάει όταν Hb<7g/dl, και υπάρχει σοβαρή αναιμία για πάνω από δύο εβδομάδες. Μπορεί να αποφασιστεί να γίνει μετάγγιση και σε περίπτωση που Hb>7g/dl, όταν συνοδεύεται με αλλαγές στο πρόσωπο, φτωχή ανάπτυξη, αυξανόμενη σπληνομεγαλία και μη-φυσιολογική επέκταση των οστών. Η διαδικασία 89

90 των μεταγγίσεων αίματος δεν πρέπει να καθυστερήσει πέρα από το δεύτερο ή τρίτο έτος, σε περιπτώσεις σοβαρής αναιμίας, γιατί διαφορετικά σχηματίζονται αντισώματα έναντι των ερυθροκυττάρων και δεν μπορεί να βρεθεί μετά κατάλληλος δότης. Η συχνότητα των μεταγγίσεων κυμαίνεται στις 2-4 εβδομάδες. Η ποσότητα μεταγγίσιμων ερυθροκυττάρων δεν πρέπει να υπερβαίνει τα ml/ kg/ ημέρα, με μέγιστο ρυθμό 5ml/ kg/ hr, για την αποφυγή ταχείας ανόδου του όγκου του αίματος. Δύο παράμετροι είναι σημαντικό να υπολογιστούν κατά την μετάγγιση αίματος: 1) Η απαίτηση σε ερυθρά αιμοσφαίρια 2) Η ανάγκη ως προς την πρόσληψη σιδήρου Η πιο κοινή επιπλοκή της μετάγγισης αίματος είναι η υπερσιδήρωση. Επιπλέον επιπλοκές είναι οι λοιμώξεις, κυρίως ιογενείς, αλλά και από βακτήρια και παράσιτα, οι αιμολυτικές αντιδράσεις, οξείες και μη, και οι μη-αιμολυτικές αντιδράσεις, όπως για παράδειγμα οι αλλεργικές και αναφυλακτικές αντιδράσεις (Galanello and Origa, 2010). Ασθενείς, λοιπόν, που δέχονται μόνιμα αγωγή μετάγγισης αίματος, εμφανίζουν διάφορες κλινικές εκδηλώσεις ως συνέπειες της υπερσιδήρωσης, όπως: i. Υπογοναδισμός (35-55% των ασθενών) ii. Υποθυρεοειδισμός (9-11% των ασθενών) iii. Υποπαραθυρεοειδισμός (4%) iv. Διαβήτης (6-10%) v. Ηπατική ίνωση και καρδιακή δυσλειτουργία (33%) Τα επίπεδα του σιδήρου θα πρέπει να προσδιορίζονται με ακρίβεια, προκειμένου να εκτιμηθεί η κλινική του σημασία και η ανάγκη αγωγής αποσιδήρωσης. Η φερριτίνη του ορρού σχετίζεται με τις αποθήκες σιδήρου του σώματος και οι διαδοχικές της μετρήσεις παραμένουν η πιο αξιόπιστη και εύκολη μέθοδος της εκτίμησης των επιπέδων σιδήρου. Μέχρι πριν από 10 χρόνια, η υπερσιδήρωση μπορούσε να αντιμετωπιστεί μόνο με υποδόρια έγχυση ενός συμπλοκοποιητικού μορίου του σιδήρου, της δεσφερροξαμίνης, που χορηγούνταν 5-7 νύχτες την εβδομάδα. Η χορήγηση του φαρμάκου αυτού είχε θεαματικά οφέλη ως προς τη νοσηρότητα και θνησιμότητα. Πιο πρόσφατα, οι από του στόματος ενεργοί συμπλοκοποιητικοί παράγοντες του σιδήρου, 90

91 όπως η δεφερριπρόνη και η δεφερρασιρόξη, εισήχθησαν στην κλινική πράξη. Η δεφερριπρόνη κυκλοφόρησε στην Ευρώπη το 1999 για ενήλικες με μείζονα μεσογειακή αναιμία που δεν μπορούσαν να θεραπευτούν αποτελεσματικά με δεσφερριοξαμίνη, αλλά δεν έχει ακόμη εγκριθεί στην βόρεια Αμερική. Η μονοθεραπεία με δεφερριπρόνη επέτυχε να ελέγξει τις συγκεντρώσεις του σιδήρου στο ήπαρ μόνο σε λίγους ασθενείς, αλλά όταν η δεσφερροξαμίνη δόθηκε επίσης 2-4 φορές την εβδομάδα, περισσότεροι ασθενείς πέτυχαν μια ισορροπία στις συγκεντρώσεις σιδήρου. Η δεφερρασιρόξη έχει πάρει άδεια κυκλοφορίας στη βόρεια Αμερική και την Ευρώπη από το 2006 για τη θεραπεία διάφορων νόσων με υπερσιδήρωση λόγω μετάγγισης, και έχει αποδειχτεί αποτελεσματική στην βελτίωση του σιδήρου του ήπατος, της φερριτίνης του ορού και του σιδήρου του μυοκαρδίου, επιδεικνύοντας αποδεκτή ανεκτικότητα σε μελέτες με πάνω από 7000 ασθενείς. Οριστική θεραπεία που προσφάτως είναι διαθέσιμη για ασθενείς με θαλασσαιμία είναι η μεταμόσχευση μυελού των οστών (bone marrow transplantation, BMT). Οι επιδράσεις της BMT σχετίζονται με τις επικρατούσες κλινικές συνθήκες πριν την μεταμόσχευση, ειδικά από την παρουσία ηπατομεγαλίας, εκτεταμμένη ίνωση του ήπατος, ιστορικό συχνής αποσιδήρωσης και βαρύτητα της συσσώρευσης σιδήρου. Σε τέτοιους ασθενείς χωρίς τους παραπάνω παράγοντες κινδύνου, η μεταμόσχευση βλαστοκυττάρων από έναν δίδυμο με ταυτόσημο τύπο HLA προσφέρει ένα επίπεδο επιβίωσης πάνω από 90%. Το μεγάλο μειονέκτημα της αλλογενούς BMT είναι η έλλειψη ενός συμβατού δότη με ταυτόσημο τύπο HLA για την πλειονότητα των νοσούντων. Εάν η BMT είναι αποτελεσματική, η υπερσιδήρωση μπορεί να μειωθεί με επαναλαμβανόμενη φλεβοτομή, εξαλείφοντας την ανάγκη για αποσιδήρωση. Η χρόνια νόσος του μοσχεύματος έναντι του ξενιστή (Chronic graft-versus-host disease, GVHD) ποικίλης βαρύτητας μπορεί να εμφανιστεί σε 5-8% των ενηλίκων. Μια τρίτη θεραπευτική προσέγγιση αποτελεί η μεταμόσχευση ομφάλιου αίματος (cord blood transplantation). Αυτή η μεταμόσχευση από έναν συγγενικό δότη προσφέρει μια καλή πιθανότητα επιτυχημένης θεραπείας και συνδέεται με χαμηλό κίνδυνο για GVHD. Για ζευγάρια που έχουν ήδη ένα παιδί με μεσογειακή αναιμία και που υπόκεινται σε προγεννητικό έλεγχο σε μια επόμενη εγκυμοσύνη, η προγεννητική ανίχνευση της συμβατότητας HLA μεταξύ του νοσούντος παιδιού και του υγιούς εμβρύου επιτρέπει την συλλογή του αίματος από τον πλακούντα κατά τη γέννα και με αυτό το τρόπο τη δυνατότητα μεταμόσχευσης ομφάλιου αίματος για τη θεραπεία του νοσούντος παιδιού. Από την άλλη, σε περιπτώσεις με ένα έμβρυο το οποίο νοσεί και 91

92 ένα πρώτο φυσιολογικό παιδί, το ζευγάρι μπορεί να αποφασίσει να συνεχίζει την εγκυμοσύνη και να επιλέξει την οδό της BMT αργότερα, χρησιμοποιώντας το φυσιολογικό παιδί ως δότη (Galanello and Origa, 2010). Μια πιο σύγχρονη προσέγγιση της θεραπείας της β-μεσογειακής αναιμίας αποτελεί, η παρέμβαση σε επίπεδο έκφρασης σφαιρινικών αλυσίδων με δύο διαφορετικούς τρόπους: 1) Η επαγωγή της αυξημένης έκφρασης γ-σφαιρινικών αλυσίδων 2) Η μείωση της έκφρασης των α-αλυσίδων Στη πρώτη περίπτωση, επιδιώκεται η HbF να αντισταθμίσει την έλλειψη της HbA. Στη δεύτερη περίπτωση, επιδιώκεται να αποκατασταθεί η ισορροπία, δηλαδή να μειωθεί και το ποσοστό των α-αλυσίδων, ώστε να μην υπάρχουν ελεύθερες σε περίσσεια λόγω ανυπαρξίας β-αλυσίδων, με επιδιωκώμενο αποτέλεσμα την μηκατακρήμνιση α-αλυσίδων εντός των ερυθρών αιμοσφαιρίων και την αποφυγή της τελικής καταστροφής αυτών. Κλινικές μελέτες γενετικής έδειξαν ότι οποιαδήποτε από τις δύο αυτές παρεμβάσεις θα προσφέρει σημαντικά και ουσιώδη κλινικά οφέλη στους ασθενείς με β-μεσογειακή αναιμία. Οι περισσότερες φαρμακολογικές έρευνες έχουν επικεντρωθεί στην μελέτη της επαγωγής της έκφρασης γ-σφαιρίνης, αλλά δεν παρέχουν μια βάσιμη επεξήγηση του μηχανισμού ρύθμισης των σφαιρινικών γονιδίων. Οι κυριότεροι φαρμακευτικοί παράγοντες που έχουν χρησιμοποιηθεί για το σκοπό αυτό είναι: 1) Κυτταροστατικοί παράγοντες (υδροξυκαρβαμίδη ή υδροξυουρία (HU)) 2) Παράγοντες απομεθυλίωσης του DNA (αζακυτιδίνη, δεσιταβίνη) 3) Αναστολείς των απακετυλασών (βουτυρικό νάτριο) Όσον αφορά στους κυτταροστατικούς παράγοντες, αυτοί οδηγούν τα ενεργά κυκλοφορούντα προγονικά κύτταρα σε απόπτωση και διαταράσσουν την ροή κυτταρικής ανάπτυξης για να δώσουν το ερέθισμα για ταχεία κινητική αναγέννησης και το σχηματισμό ώριμων ερυθροβλαστών που να διαφοροποιούνται προς F- κύτταρα, δηλαδή ερυθροκύτταρα που περιλαμβάνουν HbF. Τα κυτταροτοξικά φάρμακα της φάσης S, όπως η κυτοσίνη αραβινοσίδη, το myleran, η βινβλαστίνη και 92

93 η υδροξυουρία (HU), επάγουν την παραγωγή HbF στα πρωτεύοντα και στους ανθρώπους μέσω αυτού του μηχανισμού. Τα ακριβή μοριακά γεγονότα που συμβαίνουν για να επιτευχθεί η ενεργοποίηση των γ-γονιδίων κάτω από αυτές τις συνθήκες παραμένουν άγνωστα. Είναι γνωστό ότι η ταχεία αναγέννηση των ερυθροκυττάρων, επιτρέπει στα προγονικά κύτταρα που διαθέτουν ενεργό αναβολισμό HbF να επιλεγούν προς ωρίμανση (Pace and Zein, 2006). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η HU επάγει την δημιουργία της ρίζας του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) in vivo, και γι αυτό τέθηκε η υπόθεση ότι οι ιδιότητες ενός δότη του NO μπορεί να καθορίσουν τον τύπο της αιμοσφαιρίνης. Η αύξηση των επιπέδων του μονοξειδίου του αζώτου (NO) φαίνεται πως ενεργοποιεί την διαλυτή γουανυλική κυκλάση, με αποτέλεσμα την αύξηση του κυκλικού GMP και στη συνέχεια την ενεργοποίηση της σύνθεσης της γ-σφαιρίνης, που είναι απαραίτητη για το σχηματισμό της HbF (Cokic et al., 2003). Η υδροξυουρία (HU), ως αναστολέας της αναγωγάσης των ριβονουκλεοτιδίων, έχει αποδειχτεί ότι αυξάνει την συγκέντρωση της HbF σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD), και είναι το μόνο εγκεκριμένο από τους FDA και EMEA φάρμακο για τη θεραπεία της SCD. Οι περισσότεροι, αλλά όχι όλοι, ασθενείς ανταποκρίνονται στην HU με αύξηση της HbF, αλλά όπως και με τα βασικά επίπεδα HbF, τα οποία διαφέρουν πολύ μεταξύ των ασθενών, έτσι και ο βαθμός της απόκρισης στην HU ποικίλλει (Ma et al., 2007). Παρόλα αυτά, αποδεδειγμένα η νοσηρότητα και η θνησιμότητα σε ασθενείς με SCD έχει σημαντικά ελαττωθεί από την εισαγωγή της HU στη θεραπευτική το Μια πρόσφατη ενημέρωση από την MSH (Multicenter Study of Hydroxyurea) μελέτη έδειξε ότι στα 9 χρόνια παρακολούθησης, τα επίπεδα θνησιμότητας στους ασθενείς που λάμβαναν HU μειώθηκαν κατά 40% σε σύγκριση με τους ασθενείς που δεν έλαβαν το φάρμακο (Bakanay et al., 2005). Όσον αφορά στους υπόλοιπους φαρμακευτικούς παράγοντες, οι παράγοντες απομεθυλίωσης του DNA, συντελούν στην υπομεθυλίωση των γ-σφαιρινικών γονιδίων και αυξάνουν την έκφρασή τους. Οι αναστολείς της απακετυλάσης αυξάνουν την έκφραση της γ-σφαιρίνης μέσω της ακετυλίωσης των ιστονών. Παρόλο που κάποιες από αυτές τις πειραματικές θεραπείες έχουν επιφέρει αξιοσημείωτα αποτελέσματα σε πρώιμης φάσης κλινικές δοκιμές,τα αποτελέσματα 93

94 δεν ήταν τόσο ενθαρρυντικά ώστε να αναπτυχθούν μεγάλης κλίμακας δοκιμές. Επιπλέον, παρά την εκτεταμένη ανάλυση, αυτοί οι παράγοντες έχουν άνω της μίας δράσεις, και ο τρόπος λειτουργίας τους ώστε να αυξηθεί η έκφραση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης δεν είναι πλήρως κατανοητός. Η πρόοδος στην κατανόηση του μεταγραφικού μονοπατιού που ρυθμίζει την μετάβαση από την έκφραση της γ- στην έκφραση της β-σφαιρίνης, έχει προσφέρει πολλούς νέους πιθανούς στόχους για επέμβαση. Καθώς αποκαλύπτονται επιπλέον μεταγραφικοί παράγοντες, συμπαράγοντες, και παράγοντες σχετιζόμενοι με την χρωματίνη σε αυτό το μονοπάτι, η λεπτομερής κατανόηση της μετάβασης θα μπορέσει να μεταφραστεί σε μια προσέγγιση που να βασίζεται πλέον σε έναν σαφή μηχανισμό της επανενεργοποίησης της παραγωγής HbF στη β-μεσογειακή αναιμία (Higgs et al., 2012). Η μεσογειακή αναιμία ήταν μεταξύ των πρώτων νόσων για τις οποίες προτάθηκε η εφαρμογή γονιδιακής θεραπείας. Η διαδικασία θεωρείται σχετικά απλή. Αρχικά συλλέγονται αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (Haemopoietic stem cells, HSC) από τον ασθενή. Στη συνέχεια τροποποιημένοι ιοί που περιέχουν το β-σφαιρινικό γονίδιο μαζί με τα ανοδικά του ρυθμιστικά στοιχεία, διαμολύνουν τα HSC και μετάγουν την «μοριακή συσκευή του β-γονιδίου» μέσα στο γονιδίωμα των HSC. Μετά από μυελοκαταστολή, τα αυτόλογα βλαστικά κύτταρα μετάγονται πίσω στον ασθενή. Υπάρχουν βέβαια και σοβαροί περιορισμοί και προβλήματα που προκύπτουν από την χρήση της γονιδιακής θεραπείας και συγκεκριμένα των ιών: i. Οι ιοί μπορούν να φιλοξενήσουν μόνο μικρού μήκους τμήματα DNA. Υπήρξε δύσκολη η ανάπτυξη ιικών μοριακών δομών που να περιέχουν όλες τις απαραίτητες αλληλουχίες για έκφραση των σφαιρινικών αλυσίδων. ii. Η έκφραση τέτοιων μοριακών δομών επηρεάζεται θετικά ή αρνητικά από την θέση ενσωμάτωσής τους στο γονιδίωμα του ξενιστικού κυττάρου. iii. Μεγάλη ανησυχία έχει προκαλέσει το γεγονός, ότι στην περίπτωση χρήσης ρετροϊών ως φορέων, η εισδοχή των μεταγώμενων αλληλουχιών δίπλα σε κρίσιμα γονίδια του αιμοποιητικού, οδηγήσε στην ανάπτυξη λευχαιμίας. 94

95 Α.10 Σκοπός της εργασίας Τα αυξημένα επίπεδα εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) μετριάζουν την βαρύτητα των διαταραχών που αφορούν στην β-σφαιρίνη, δηλαδή τη δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD) και την β-μεσογειακή αναιμία, που αποτελούν σημαντικές αιτίες παγκόσμιας νοσηρότητας και θνησιμότητας. Γι αυτό το λόγο είναι μακροχρόνιο το ενδιαφέρον για την ανάπτυξη θεραπευτικών προσεγγίσεων για την επαγωγή της παραγωγής HbF. Η αναζήτηση μορίων που ρυθμίζουν την μετάβαση από την έκφραση της εμβρυϊκής (HbF) στην έκφραση της αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων (HbA) και που συντελούν στην διατήρηση της αποσιώπησης ή αντίθετα στην ενεργοποίηση της έκφρασης της HbF στους ανθρώπους αποτελεί πολυετές αντικείμενο έρευνας με σκοπό την στόχευση αυτών των παραγόντων για την επαγωγή της HbF (Sankaran et al., 2011). Έτσι, εκτός από τα cis-ρυθμιστικά στοιχεία, έχουν εντοπιστεί και trans-ρυθμιστικά στοιχεία, τα οποία είτε αποτελούν μεταγραφικούς παράγοντες είτε QTL (quantitative trait loci). Η περιοχή του 6q23 χρωμοσώματος έχει σε διάφορες μελέτες προσδιοριστεί ως ένα QTL, το οποίο συνδέεται με την μεταβολή των επιπέδων της HbF σε ασθενείς με SCD (Close et al., 2004, Thein et al., 2007, Wyszynski et al., 2004). Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι διττός: A. Ο εντοπισμός μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP) εντός των γονιδίων MAP3K5 και PDE7B του QTL στην 6q23 χρωμοσωμική περιοχή, που να σχετίζονται με αυξημένα επίπεδα HbF. B. Η αξιολόγηση των SNP αυτών ως φαρμακογονιδιωματικών δεικτών, που να σχετίζονται με την μεταβλητότητα των επιπέδων της HbF ως απόκριση στη θεραπεία με HU. 95

96 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 96

97 Β.1 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1.1 Δείγματα DNA που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη Τέσσερις διαφορετικές ομάδες ατόμων συμπεριλήφθησαν στην μελέτη: Ασθενείς με Μείζονα β-μεσογειακή αναιμία (β-thalassemia major) Ασθενείς με Ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία (β-thalassemia intermedia) Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία και β- μεσογειακή αναιμία υπό θεραπεία με υδροξυουρία (SCD/β-thalassemia compound heterozygote receiving hydroxyurea HU) Φυσιολογικά άτομα (μη αναιμικά) (δείγματα αναφοράς) (non-thalassemic/ controls) Τα δείγματα προήλθαν από το Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών. Πιο συγκεκριμένα, όσον αφορά στο πλήθος και την προέλευση των δειγμάτων, συλλέχθηκαν 94 δείγματα ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία, 11 δείγματα ενδιάμεσης β-μεσογειακής αναιμίας, που είχαν περιγραφεί σε προγενέστερη μελέτη (Galanello and Origa, 2010, Pace and Zein, 2006) και 96 δείγματα ενήλικων υγιών ατόμων (μη-θαλασσαιμικών), ίδιας εθνικότητας και καταγωγής από δυτική Ελλάδα. Επιπλέον, αναλύθηκε ένα σύνολο 38 ασθενών, διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία και β-μεσογειακή αναιμία (β-thalassemia/scd compound heterozygous patients) με καταγωγή από δυτική Ελλάδα, που έλαβαν θεραπεία με υδροξυουρία (HU) (Cokic et al., 2003). Γραπτή συναίνεση ελήφθη από όλους τους ασθενείς που συμπεριλήφθησαν στην μελέτη από τις επιτροπές δεοντολογίας των αντίστοιχων ιδρυμάτων. Οι ασθενείς που ήταν διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία και β-μεσογειακή αναιμία με επίπεδα HbF χαμηλότερα του 20% μετά την θεραπεία με HU in vivo, θεωρήθηκαν ως «μη-ανταποκρινόμενοι» (non-responders), ενώ εκείνοι με επίπεδα υψηλότερα του 20% μετα την θεραπεία με HU in vivo, χαρακτηρίστηκαν «ανταποκρινόμενοι» (responders). Ο διαχωρισμός αυτός με όριο το 20%, έγινε με σκοπό να καταστεί η ανάλυση πιο ακριβής. 97

98 Β.2 Απομόνωση ολικού γονιδιωματικού DNA Η απομόνωση του ολικού γονιδιωματικού DNA από αίμα έγινε με την χρήση του προτυποποιημένου συστήματος QIAamp Blood Midi Kit (Spin Protocol). Απομονώθηκε γονιδιωματικό DNA από 1 ml περιφερικού, ολικού αίματος, στο οποίο είχε προστεθεί EDTA ως αντιπηκτικό. Η μέθοδος αυτή δεν απαιτεί το διαχωρισμό των λευκοκυττάρων με φυγοκέντρηση σε φικόλη, αλλά χρησιμοποιεί στήλες χαλαζία. Ο μηχανισμός με τον οποίο γίνεται η απομόνωση του DNA βασίζεται στην πρόσδεση (προσρόφηση) των νουκλεϊκών οξέων στη στήλη, σε περιβάλλον υψηλής ιοντικής ισχύος και χαμηλού ph που δημιουργείται από την προσθήκη χαοτροπικού παράγοντα, ενώ η έκλουσή του γίνεται με νερό ή με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (TE) σε ph 8,3. Η διαδικασία με την οποία έγινε η απομόνωση του DNA περιλαμβάνει τα εξής στάδια: 1) Προστίθενται 200 μl του αντιδραστηρίου QIAGEN Protease σε σωλήνα φυγοκέντρησης 15 ml. 2) 1 ml δείγματος αίματος αναμιγνύονται με 1 ml PBS (Phosphate buffered saline) και αναδεύονται στο σωλήνα. 3) Προστίθενται 2,4 ml διαλύματος AL (διάλυμα λύσης) και γίνεται ανάδευση για 1 min. 4) Το μίγμα επωάζεται στο υδατόλουτρο για 10 min στους 70ºC. 5) Προστίθενται 2 ml αιθανόλης (96-100%) στο μίγμα και γίνεται ανάδευση. 6) Μεταφέρεται η μισή ποσότητα του δείγματος στην QIAamp Midi spin στήλη (τοποθετημένη σε σωλήνα φυγοκέντρησης 15 ml). Φυγοκεντρείται για 3 min στα 1850 x g, σε θερμοκρασία δωματίου (25ºC). 7) Απορρίπτεται το διήθημα και τοποθετείται και η υπόλοιπη μισή ποσότητα του δείγματος στη στήλη και επαναλαμβάνεται η φυγοκέντριση. 8) Ακολουθεί προσθήκη 2 ml διαλύματος AW1 (διάλυμα πλύσης) στη στήλη και φυγοκέντρηση στα 4500 x g, για 1 min. 9) Μετά προστίθενται 2 ml διαλύματος AW2 (διάλυμα πλύσης) στη στήλη. Ακολουθεί πάλι φυγοκέντρηση στα 4500 x g, για 15 min. 98

99 10) Η QIAamp Midi spin στήλη τοποθετείται έπειτα σε ένα καθαρό σωλήνα φυγοκέντρισης όγκου 15 ml. 11) Προστίθενται 300 μl διαλύματος έκλουσης ΑΕ και γίνεται επώαση, για 5 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 4500 x g, για 2 min. 12) Για να επιτευχθεί μεγαλύτερη τελική συγκέντρωση DNA, το προηγούμενο βήμα επαναλαμβάνεται, κάνοντας μία δεύτερη έκλουση, φορτώνοντας ξανά το διήθημα από τη στήλη κι επωάζοντας για 5 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Φυγοκέντρηση στα 4500 x g, για 2 min. 13) Το διήθημα που προκύπτει και περιέχει το απομονωμένο γονιδιωματικό DNA, συλλέγεται και αποθηκεύεται στους -20 o C. Β.3 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA σε ένα διάλυμα Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των δειγμάτων DNA έγινε με τη χρήση της συσκευής NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer, που είναι ένα φασματοφωτόμετρο πλήρους φάσματος, που μετράει τη συγκέντρωση νουκλεϊκών οξέων ή πρωτεϊνών σε ένα διάλυμα. Τα πλεονεκτήματα της χρήσης της συσκευής αυτής είναι: 1. η ταχύτητα πραγματοποίησης των μετρήσεων (10 δευτερόλεπτα) 2. η μικρή ποσότητα του δείγματος που απαιτείται για μία μέτρηση (1μl για δείγματα DNA και RNA) 3. η ικανότητα μέτρησης πολύ πυκνών διαλυμάτων (μέχρι 3700 ng/μl για dsdna, RNA) 4. η αποφυγή χρήσης κυψελίδων 5. ο αυτόματος υπολογισμός των τιμών 260/280 nm και 260/330 nm. Όσον αφορά τη χρήση του, γίνεται πρώτα μηδενισμός της συσκευής με το διάλυμα έκλουσης του DNA. Έπειτα γίνεται τοποθέτηση μίας σταγόνας DNA δείγματος, όγκου 1 μl, στην ειδική βάση όταν ο βραχίονας είναι ανοιχτός. Όταν ο βραχίονας κλείνει, το δείγμα σχηματίζει μία στήλη. Ο βραχίονας αυτόματα μετακινείται προς τα κάτω και υπολογίζει τη συγκέντρωση του δείγματος με τη βοήθεια οπτικών ινών. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων, καταγράφονται αυτόματα στον υπολογιστή που βρίσκεται σε σύνδεση με τη συσκευή, για ευκολότερη ανάλυση. Στο τέλος κάθε 99

100 μέτρησης, απλά καθαρίζονται τα υπολείμματα με διηθητικό χαρτί. Η φωτομέτρηση για το DNA γίνεται σε μήκος κύματος 260nm και από την τιμή της οπτικής απορρόφησης (O.D.), το Nanodrop υπολογίζει αυτόματα τη συγκέντρωση του DNA. Ταυτόχρονα εκτελείται και η μέτρηση του ίδιου δείγματος στα 280nm για τον έλεγχο της περιεκτικότητας του δείγματος σε πρωτεΐνες. Ως γνωστόν, ο λόγος της O.D. 260nm /O.D. 280nm εκφράζει την καθαρότητα του δείγματος DNA. Το καθαρό DNA δίνει λόγο 1,8-2,0, ενώ εάν υπάρχουν προσμίξεις πρωτεΐνης στο δείγμα, ο λόγος είναι μικρότερος από 1,8 και ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA δε θεωρείται ακριβής. Β.4 Πολυμορφισμοί-στόχοι της παρούσας μελέτης Οι πολυμορφισμοί που μελετώνται ως γενετικοί δείκτες προέρχονται από δύο διαφορετικά γονίδια, που βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα, το χρωμόσωμα 6. Αυτά είναι τα γονίδια MAP3K5 και PDE7B. Οι γενετικοί αυτοί δείκτες αποτελούν «μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς», (single nucleotide polymorphisms, SNP). Εικόνα 19. : Περιοχή εντοπισμού του γονιδίου MAP3K5. ( Εικόνα 20. : Περιοχή εντοπισμού του γονιδίου PDE7B. ( 100

101 Η επιλογή των συγκεκριμένων αυτών SNPs προς ανάλυση στηρίχτηκε κυρίως σε προηγούμενη μελέτη, στην οποία αυτοί οι πολυμορφισμοί είχαν συσχετιστεί σημαντικά με την ανταπόκριση στην HU σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD), που έλαβαν HU σε σχέση με την ανύψωση των επιπέδων (%) της HbF (p=0.034 για το rs και p=0.036 για το rs ). Στη συγκεκριμένη μελέτη εξετάστηκαν 320 tagsnp σε 33 υποψήφια γονίδια. Tα tagsnp επιλέχτηκαν με βάση τα δεδομένα του HapMap project (Phase I, Yoruba sample) με χρήση του προγράμματος Haploview (v3.2). Η γονοτύπηση πραγματοποιήθηκε σε 137 δείγματα ενήλικων Αφροαμερικανών με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD). 17 SNP συσχετίστηκαν σημαντικά με την μεταβολή του ποσοστού της HbF. Σε αυτά περιλαμβάνονταν τα δύο SNP στο γονίδιο MAP3K5,πέντε SNP στο γονίδιο TOX, δύο στο NOS1, τρία στο FLT1, δύο στο ARG2 και δύο SNP στο NOS2A. 20 SNP παρουσίασαν σημαντική συσχέτιση με την μεταβολή της απόλυτης τιμής της HbF. Μεταξύ αυτών ήταν και πέντε SNP στο γονίδιο PDE7B, τα rs , rs , rs , rs και rs Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το rs , που είναι tagsnp για τον πληθυσμό των Καυκασίων, το οποίο στην εν λόγω μελέτη έδειξε να σχετίζεται με σημαντική μεταβολή (p=0.041) στα επίπεδα απόλυτης HbF in (g/dl) μετά την θεραπεία με HU (Ma et al., 2007). Ορμώμενοι λοιπόν από τα αποτελέσμτα της μελέτης αυτής σε πληθυσμό Αφροαμερικανών, αποφασίστηκε η διερεύνηση των πολυμορφισμών που αφορούν στα γονίδια της MAP3K5 και PDE7B, και στον ελληνικό πληθυσμό. Όμως για τον εντοπισμό των πολυμορφισμών, εκτός από τη αναζήτηση βιβλιογραφικών πηγών, χρησιμοποιήθηκαν και υπολογιστικές μέθοδοι. Με τον τρόπο αυτό έγινε ο in silico προσδιορισμός των tagsnp. Ένα tagsnp αποτελεί αντιπροσωπευτικό SNP μιας περιοχής του γονιδιώματος με υψηλή ανισορροπία σύνδεσης (linkage disequilibrium, LD), δηλαδή με μη-τυχαία συσχέτιση αλληλομόρφων σε δύο ή περισσότερων γονιδιακών τόπων. Με τον εντοπισμό των tagsnp εντοπίζονται πολυμορφισμοί (variants) χωρίς να είναι αναγκαία η γονοτύπηση κάθε SNP που υπάρχει σε μια συγκεκριμένη χρωμοσωμική περιοχή. Πρόσφατα προτάθηκε μια μέθοδος προσδιορισμού των tagsnp που αξιοποιεί το στατιστικό κριτήριο r 2 για τον έλεγχο της σύνδεσης μεταξύ των SNP (Carlson et. al., 2004). Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται για προσδιορισμό των tagsnp ενός μόνο πληθυσμού, διότι τα πρότυπα LD διαφέρουν μεταξύ διαφορετικών πληθυσμών (Lan Liu et. al., 2010). 101

102 Στην παρούσα μελέτη, λοιπόν, τα tagsnp κατά μήκος των γονιδίων MAP3K5 και PDE7B εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα επιλογής tagsnps μέσω του HapMap project ( for HapMap] (Release 27, Phase II+III, Feb09, NCBI36 assembly) και του προγράμματος «LD TAG SNP Selection (TagSNP)» που φιλοξενείται στην ιστοσελίδα του «National Institute of Environmental Health Sciences» ( for NIEHS]. Για την επιλογή tagsnp για τον Kαυκάσιο πληθυσμό, επιλέχτηκε μια επιθετική μέθοδος πολλαπλών δεικτών, με μια τιμή R 2 =0.8 (cut off value) και ελάσσων συχνότητα εμφάνισης αλληλομόρφου, MAF (minor allele frequency), σε τιμή ουδού (cut-off value) Πίνακας 2.: Σύνοψη μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP) που εξετάστηκαν στη παρούσα μελέτη. Γονίδια SNP Aλλαγή Θέση MAP3K5 rs T>C 6: rs A>C 6: PDE7B rs G>C 6: rs C>T 6: rs A>C 6: (Οι θέσεις των γονιδίων έχουν προσδιοριστεί με βάση το Ensembl release 68 - July 2012 ) Η ανισορροπία σύνδεσης, LD (Linkage Disequilibrium), μεταξύ των πολυμορφισμών που αναλύθηκαν στα γονίδια MAP3K5 και PDE7B μελετήθηκε με χρήση της βάσης δεδομένων για τους Καυκάσιους (CEU) [REF for HapMap], HapMap Phase I+II (Release 24, November 2008) και οπτικοποιήθηκε στο πρόγραμμα Haploview 4.2 [REF for HaploView]. 102

103 Β.5 Σχεδιασμός εκκινητών (primers) Για τον σχεδιασμό των εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν ορισμένα προγράμματα και ακολουθήθηκαν συγκεκριμένα βήματα: 1. Eντοπίστηκε η θέση των υπό μελέτη πολυμορφισμών, μέσω της βάσης δεδομένων Ensembl στη διεύθυνση: ( όπου δίνεται και μέρος της αλληλουχίας που περιβάλλει τον εκάστοτε πολυμορφισμό. 2. Με βάση την αλληλουχία από το Ensembl έγινε ο σχεδιασμός των εκκινητών με χρήση του προγράμματος Primer3 ( Το προϊόν της PCR σχεδιάστηκε έτσι ώστε ο πολυμορφισμός να εντοπίζεται περίπου στο κέντρο του. Στο Primer3 μπορούν να ελεγχθούν κάποιες βασικές παράμετροι, όπως η θερμοκρασία τήξης (T m ) των εκκινητών και η ποσοστιαία σύστασή τους σε βάσεις γουανίνης και κυτοσίνης (GC content). Γενικά, θα πρέπει οι T m των εκκινητών να είναι παρόμοιες και μεταξύ 52-62ºC, ώστε να υβριδοποιούνται καλά επάνω στο DNA στόχο. Η περιεκτικότητα σε GC πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 40-60%, ώστε ο υβριδισμός των εκκινητών να είναι ισχυρός και σταθερός. 3. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε το BLAST (Basic Local Alignment Tool) του Ensembl ( Το Blast εξετάζει κατά πόσο οι εκκινητές που έχουν σχεδιαστεί είναι ειδικοί μόνο για την αλληλουχία-στόχο του ανθρώπινου γονιδιώματος στην οποία στοχεύει το εν λόγω πείραμα. Αν οι εκκινητές έχουν ομολογία σε περισσότερες από μια περιοχές ο καθένας, ενδεχομένως η αντίδραση PCR στην οποία θα χρησιμοποιηθούν να αποδώσει και μη-ειδικά προϊόντα. 4. Με το πρόγραμμα DNAMAN ελέγχθηκε η συμπληρωματικότητα των εκκινητών μεταξύ τους, αλλά και ο καθένας με τον εαυτό του (self-complementarity). Είναι σημαντικό να αποκλειστούν τα ενδεχόμενα σχηματισμού διμερών εκκινητών (primer dimers) που θα στερήσει από την PCR αντίδραση την απαραίτητη ποσότητα εκκινητών για σωστή απόδοση. 5. Το πρόγραμμα DINAMELT ( αποτελεί εργαλείο πρόβλεψης του υβριδισμού και της τήξης των νουκλεϊκών οξέων. Χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής (αναδίπλωσης) της αλληλουχίας του PCR προϊόντος που οριοθετείται από τις αλληλουχίες των εκκινητών. Σημαντικό είναι να μην σχηματίζονται βρόγχοι και άλλες αναδιπλώσεις 103

104 στα άκρα της αλληλουχίας, δηλαδή στις περιοχές των εκκινητών, διότι αυτό θα παρεμποδίσει την προσδεσή των εκκινητών και την εξέλιξη της PCR-αντίδρασης. Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται συνοπτικά οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την γονοτύπηση για κάθε SNP. 104

105 Πίνακας 3.: Συνοπτικός πίνακας των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την διεξαγωγή των πειραμάτων. Γονίδιο Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός (SNP) Αλληλουχία εκκινητών MAP3K5 rs CTTTCTTCAGGCAAGTCTCGG (ευθύς εσωτερικός για το G αλληλόμορφο) rs CATCTCAGGGAAACAAGGAAAGAA (αντίστροφος εξωτερικός για το G αλληλόμορφο) GTTCCACCTGCAGTGAAAAACAT (ευθύς εσωτερικός για το T αλληλόμορφο) CATCATGCCCAGGAAACAACA (αντίστροφος εσωτερικός για το T αλληλόμορφο) TTCCCTGGCACACCATTG (αντίστροφος) ATCTCCCACTGCTCCACAAA (ευθύς) PDE7B rs AAGAGACAGGGAGGTTGTGC (αντίστροφος) rs rs ACAGCAGACATTTGGAAGTCA (ευθύς) GAAACAAGAGCGTTCTGTTCTAACAC (ευθύς εσωτερικός για το C αλληλόμορφο) CAGAGCTCATTGGAATAATGCAAT (αντίστροφος εξωτερικός για το C αλληλόμορφο) CGTGAAAGATACTTTAACTCCCGC (ευθύς εξωτερικός για το G αλληλόμορφο) CTCCATTTGCCTCATGTTTGTC (αντίστροφος εσωτερικός για το G αλληλόμορφο) TAAAGACTCCAAACAAAACAC (αντίστροφος 1, για το C αλληλόμορφο) TAAAGACTCCAAACAAAACAT (αντίστροφος 2, για το T αλληλόμορφο) GCCTGGTGAAAGTATGAATG (ευθύς) Μέγεθος προϊόντος (bp) 147bp (προϊόν G αλληλομόρφου) 298bp (προϊόν T αλληλομόρφου) 404bp (εξωτερικό προϊόν) 576bp 591bp 142bp (προϊόν C αλληλομόρφου) 213bp (προϊόν G αλληλομόρφου) 307bp (εξωτερικό προϊόν ) 361bp (προϊόν C αλληλομόρφου) 361bp (προϊόν T αλληλομόρφου) 105

106 Β.6 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Η βασικότερη από τις εργαστηριακές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκε στα πλαίσια της μελέτης αυτής είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). Η PCR περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Kary Mullis στη δεκαετία του 1980 (Mullis et al., 1986), εργασία για την οποία τιμήθηκε με το βραβείο Νόμπελ το Στην PCR γίνεται εκθετικός πολλαπλασιασμός των μορίων DNA από μια θερμοσταθερή DNA πολυμεράση, όπως αυτή του Thermus aquaticus (Taq). Κατά την PCR χρησιμοποιείται ένα ζεύγος συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων, οι εκκινητές, καθένας από τους οποίους υβριδοποιείται σε έναν κλώνο ενός δίκλωνου μορίου DNA-στόχου. Με το ζεύγος των εκκινητών ορίζεται η περιοχή που θα πολλαπλασιαστεί εκθετικά. Οι υβριδοποιημένοι εκκινητές λειτουργούν ως υπόστρωμα για την DNA πολυμεράση κι έτσι για κάθε κλώνο του στόχου δημιουργείται ένας συμπληρωματικός κλώνος DNA μέσω της διαδοχικής προσθήκης ελεύθερων δεοξυνουκλεοτιδίων. Η διαδικασία της PCR συνήθως περιλαμβάνει τρία βήματα που επαναλαμβάνονται σε κάθε κύκλο: 1. Αποδιάταξη του DNA-στόχου (denaturation of DNA template) στους 94 ή 95 ο C 2. Πρόσδεση των εκκινητών (υβριδισμός) στις συμπληρωματικές τους ακολουθίες (primer annealing), σε θερμοκρασία που εξαρτάται από το μήκος και την αλληλουχία των τμημάτων, και 3. Επιμήκυνση των συνδεδεμένων εκκινητών (elongation) στους 72 ο C με κατεύθυνση 5 3 σχηματίζοντας έτσι τους νέους θυγατρικούς κλώνους DNA με. Τα τρία αυτά βήματα επαναλαμβάνονται για n κύκλους (όπου n συνήθως κύκλοι αποδιάταξης-υβριδισμού-επιμήκυνσης), με αποτέλεσμα τα μόρια που παρήχθησαν στον προηγούμενο κύκλο να χρησιμεύουν ως στόχοι για κάθε επόμενο κύκλο. Η αύξηση του αριθμού των αντιγράφων-κλώνων είναι εκθετική και θεωρητικά ισούται με 2 n. Όμως, η απόδοση συνήθως είναι μικρότερη της θεωρητικά αναμενόμενης. 106

107 Τα δείγματα τοποθετούνται στον θερμικό κυκλοποιητή (thermal cycler), ειδική συσκευή σχεδιασμένη να εκτελεί τα βήματα των κύκλων της PCR στους επιθυμητούς χρόνους και θερμοκρασίες. Γενικά, η PCR είναι μια μέθοδος που εμφανίζει ιδιαίτερη ευαισθησία, καθώς μπορεί να εφαρμοστεί με ελάχιστη ποσότητα αρχικού DNA και ενέχει υψηλή πιστότητα αντιγραφής (Ma et al., 2007). Εικ. 21: Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων DNA κατά την PCR ( Β.7 Αντιδραστήρια και διαδικασία της PCR Για την PCR χρησιμοποιήθηκε το προτυποποιημένο σύστημα KAPA2G Fast HotStart ReadyMix της εταιρίας KAPABIOSYSTEMS (MA, USA). KAPA2G Fast HotStart ReadyMix Kits έχουν σχεδιαστεί για ταχεία PCR υψηλής απόδοσης, στην οποία ο ολικός χρόνος αντίδρασης μειώνεται κατά 20-70% σε σχέση με αυτόν των συμβατικών PCR. Το έτοιμο αυτό μίγμα περιλαμβάνει όλα τα αντιδραστήρια για ταχεία PCR, εκτός από τους εκκινητές και το υπόστρωμα. Έτσι, περιλαμβάνει την KAPA2G Fast HotStart DNA πολυμεράση, το KAPA2G Fast HotStart PCR (Buffer) 107

108 ρυθμιστικό διάλυμα, dntp (0.2mM κάθε dntp στη συγκεκριμένη αντίδραση), MgCl2 (1.5 mm) και σταθεροποιητές. Σε αυτή την «θερμής έναρξης» (hot start) φόρμουλα το ένζυμο συνδυάζεται με ένα αντίσωμα το οποίο απενεργοποιεί το ένζυμο έως το πρώτο βήμα αποδιάταξης. Αυτό εξαλείφει τα μη-ειδικά προϊόντος πολυμερισμού που προκύπτουν από μη-ειδικές αλληλεπιδράσεις των εκκινητών (nonspecific-priming events) κατά την ανάμιξη των αντιδραστηρίων, και αυξάνει έτσι την συνολική απόδοση και ειδικότητα της αντίδρασης. Όσον αφορά το χώρο στον οποίο έγινε η ανάμιξη των αντιδραστηρίων χρησιμοποιήθηκε θάλαμος νηματικής ροής LABCAIRE και του UV cabinet. Η στειρότητα του χώρου αποτελεί σημαντική προυπόθεση για την αποφυγή των επιμολύνσεων των αντιδράσεων από ξένο DNA που πιθανόν να αιωρείται στην ατμόσφαιρα του χώρου προετοιμασίας της PCR. Όσον αφορά στα σωληνάρια της PCR-αντίδρασης (PCR-tubes), χρησιμοποιήθηκαν strips 8 θέσεων, όγκου 0,2 ml το καθένα, της εταιρίας Kisker. Για την ετοιμασία της PCR-αντίδρασης χρησιμοποιήθηκαν αποκλειστικά ακρορύγχια με φίλτρο (filter tips) της εταιρίας Greiner, με σκοπό και πάλι την διασφάλιση της αποφυγής των επιμολύνσεων. B.8 PCR-ARMS (amplification refractory mutation system) Το σύστημα ARMS (amplification refractory mutation system), που έχει περιγραφεί και ως «αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ειδική για αλληλόμορφο» ( allele-specific PCR, ASP) και «αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για ενίσχυση ειδικών αλληλομόρφων» (PCR amplification of specific alleles, PASA), αποτελεί μέθοδο που βασίζεται στην PCR για την ανίχνευση μεταλλαγών μιας βάσης (Bakanay et al., 2005) και χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη για την γονοτύπηση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP). Η τεχνική διαθέτει την ικανότητα διάκρισης χαμηλών επιπέδων της μεταλλαγμένης αλληλουχίας σε υπόβαθρο με υψηλό θόρυβο από την φυσιολογική αλληλουχία DNA (Higgs et al., 2012). Ένα ολιγονουκλεοτίδιο λειτουργεί ως εκκινητής για την PCR μόνο όταν υβριδοποιείται στην επιλεγμένη DNA αλληλουχία στόχο του. Η παρουσία της ειδικής αλληλουχίας-στόχου σε ένα δείγμα DNA αποκαλύπτεται ταχέως και απλά με 108

109 οπτικοποίηση του προϊόντος με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Για παράδειγμα, για την ανίχνευση του μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού (G>C), o ειδικός για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο εκκινητής είναι συμπληρωματικός με την αλληλουχία στόχο, με το 3 τελικό νουκλεοτίδιό του (G) να είναι συμπληρωματικό με την σημειακή μεταλλαγή (C). Όμως το 3 νουκλεοτίδιο αυτού του εκκινητή σχηματίζει μια αναντιστοιχία (G-G) με την φυσιολογική αλληλουχία στόχο που περιλαμβάνει το αλληλόμορφο του αγρίου τύπου (G). Στην περίπτωση αυτή παρεμποδίζεται η σύνθεση του προϊόντος πολυμερισμού. Για την ενίσχυση της ειδικότητας του εκκινητή, δημιουργείται μια εσκεμμένη αναντιστοιχία με την αλληλουχία στόχο αλλάζοντας την αλληλουχία του εκκινητή στο δεύτερο, τρίτο, ή ακόμα και τέταρτο νουκλεοτίδιο από το 3 άκρο του. Έτσι, για την διεξαγωγή μιας PCR-ARMS αντίδρασης σχεδιάζονται τρείς εκκινητές, ένας αντίστροφος και δύο διαφορετικοί ευθείς, ταυτόσημοι μεταξύ τους με μόνη διαφορά το 3 τελικό νουκλεοτίδιό τους, που είναι συμπληρωματικό με ένα εκ των δύο αλληλομόρφων του SNP που εξετάζεται. Όσον αφορά την προετοιμασία της PCR, ετοιμάζονται δύο διαφορετικά μίγματα, με μόνη τους διαφορά τον ευθύ εκκινητή. Για κάθε λοιπόν δείγμα γονιδιωματικού DNA πραγματοποιείται η αντίδραση PCR δύο φορές, προκειμένου να διαπιστωθεί για ποιό εκ των δύο αλληλομόρφων θα παραχθεί προϊόν PCR. Μια επιπλέον παραλλαγή της PCR-ARMS αποτελεί η «PCR-tetra-ARMS». Σε αυτή απαιτούνται για κάθε PCR αντίδραση τέσσερις εκκινητές, ένα ζευγάρι εσωτερικών ειδικών για τα αλληλόμορφα (allele-specific, AS) εκκινητών και ένα ζευγάρι εξωτερικών βασικών εκκινητών. Κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR δημιουργείται ένα μόνο μίγμα αντιδραστηρίων στο οποίο προστίθενται και οι τέσσερις εκκινητές. Για καθένα από τα δύο αλληλόμορφα του SNP παράγονται διαφορετικά PCR προϊόντα, τα οποία σχηματίζονται πάντα με τη βοήθεια ενός εκ των δύο εσωτερικών εκκινητών και ενός εκ των εξωτερικών βασικών εκκινητών. Οι εξωτερικοί εκκινητές έχουν σχεδιαστεί έτσι ώστε τα των δύο αλληλομόρφων που παράγονται να διαφέρουν σε μέγεθος και να είναι δυνατή η ανάλυση και ο διαχωρισμός τους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Και στην tetra-arms PCR εισάγεται επίτηδες μια αναντιστοιχία στην τρίτη θέση από το 3 άκρο καθενός από τους δύο εσωτερικούς εκκινητές για αύξηση της ειδικότητας για το αλληλόμορφο-στόχος (Ye et al., 2001). 109

110 Εικόνα 22: Σχηματική αναπαράσταση του σχεδιασμού εκκινητών για tetra-primer ARMS PCR. Το SNP (G/A) παρουσιάζεται ως παράδειγμα. Τέσσερις εκκινητές, ένα ζευγάρι εσωτερικών ειδικών για τα αλληλόμορφα (allele-specific, AS) εκκινητών και ένα ζευγάρι εξωτερικών στάνταρ εκκινητών, απαιτούνται για κάθε PCR αντίδραση. Δύο AS προιόντα, ένα για το G αλληλόμορφο και το άλλο για το Α αλληλόμορφο πολυμερίζονται χρησιμοποιώντας τα δύο ζευγάρια των εκκινητών. Το πρώτο προιόν παράγεται από έναν G AS εκκινητή και έναν εξωτερικό στανταρ εκκινητή, και το άλλο προϊόν από έναν A AS εκκινητή και έναν εξωτερικό στανταρ εκκινητή. Μια αναστιστοιχία (επισημαίνεται με *) εισάγεται επίτηδες στην τρίτη θέση από το 3 άκρο καθενός από τους δύο εκκινητές για αύξηση της ειδικότητας για το αλληλόμορφο-στόχος. Οι εξωτερικοί στάνταρ εκκινητές έχουν σχεδιαστεί έτσι ώστε τα προϊόντα των δύο αλληλομόρφων που παράγονται να διαφέρουν σε μέγεθος και να είναι δυνατή η ανάλυση και ο διαχωρισμός τους σε ηλεκτροφόρηση πηκτώματος αγαρόζης (Shu Ye et al, 2001). Και η PCR-ARMS, όπως και η tetra-pcr-arms δεν συντελούν απλώς όπως η συμβατική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), στον πολυμερισμό μιας δεδομένης αλληλουχίας, αλλά αποτελούν μεθόδους άμεσης γονοτύπησης, σε συνδυασμό πάντα με την ηλεκτροφόρηση πηκώματος αγαρόζης ή πολυακρυλαμίδης. B.9 Touchdown PCR (TD-PCR) H Touchdown PCR (TD-PCR) παρέχει έναν εύκολο και ταχύ τρόπο βελτιστοποίησης της PCR αντίδρασης, αυξάνοντας την ειδικότητα, την ευαισθησία και την απόδοση, εξαλείφοντας την ανάγκη επανασχεδιασμού των εκκινητών. Η λήψη μη ειδικών προϊόντων PCR προκαλείται συχνά από ακατάλληλη Tm (θερμοκρασία τήξεως) και μη ιδανικές συνθήκες υβριδοποίησης. Ως γνωστόν, ο υβριδισμός μεταξύ μορίων νουκλεικών οξέων εξαρτάται από την πειραματική τιμή της θερμοκρασίας τήξεως (Tm). Η συνολική πιστότητα (fidelity) οποιασδήποτε 110

111 επιτυχημένης PCR βασίζεται στον ακριβή υπολογισμό αυτής της μεταβλητής. Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος υπολογισμού της Tm των ολιγονουκλεοτιδίωνεκκινητών είναι η εξίσωση: 4(G + C) + 2(A + T). Παρόλα αυτά, παρουσιάζει αρκετούς περιορισμούς, διότι η κινητική του σχηματισμού του δίκλωνου DNA, καθορίζεται από επιπρόσθετους παράγοντες πέρα από το περιεχόμενο σε νουκλεοτίδια. Τέτοιοι είναι: i) η διάταξη των νουκλεοτιδίων στην αλληλουχία, ii) η συγκέντρωση κάθε ssdna, iii) οι συνθήκες του διαλύτη (συγκέντρωση αλάτων, ιονική ισχύς) iv) η συγκέντρωση των αποδιατακτικών παραγόντων στο ρυθμιστικό. Για το λόγο αυτό πολλοί διαφορετικοί τρόποι έχουν προταθεί για αύξηση της ειδικότητας της αντίδρασης, όπως η αλλαγή της θερμοκρασίας υβριδισμού ή η μεταβολή κάποιων από τις προαναφερθείσες συνθήκες. Παρόλα αυτά η αποτελεσματικότητα αυτών είναι συχνά περιορισμένη. H TD-PCR αναπτύχθηκε για την ελαχιστοποίηση του ακατάλληλου υβριδισμού των εκκινητών και την παραγωγή μη-ειδικών προϊόντων PCR. Η TD-PCR μπορεί να εισαχθεί ως βασικό κομμάτι οποιασδήποτε PCR για να ενισχύσει την ειδικότητα και να ξεπεράσει τα προβλήματα που σχετίζονται με υψηλές θερμοκρασίες υβριδισμού που απαιτούνται κάποιες φορές. Ειδικότερα είναι χρήσιμη για υποστρώματα που είναι δύσκολο να ενισχυθούν, όπως αυτά με εκτεταμμένες δευτεροταγείς δομές, νησίδες GC με υψηλό ποσοστό νουκλεοτιδίων γουανίνης και κυτοσίνης (G + C). Βασική αρχή της TD-PCR είναι η αποτελεσματική αξιοποίηση των χαμηλότερων θερμοκρασιών υβριδισμού, ξεκινώντας από μια θερμοκρασία υβριδισμού υψηλότερη της Tm που έχει προβλεφθεί με συμβατικό τρόπο, και μεταβαίνοντας σταδιακά στην πιο χαμηλή θερμοκρασία υβριδισμού (συνήθως την συμβατικά προβλεφθείσα Tm), που θεωρείται η λιγότερο αυστηρή και περιοριστική συνθήκη. Αυτή η προσέγγιση εκμεταλλεύεται την εκθετική φύση της PCR, στην οποία τα πρώτα στάδια υβριδισμού και πολυμερισμού είναι τα πιο κρίσιμα για την παραγωγή του προϊόντος PCR. Μειώνοντας την θερμοκρασία υβριδισμού κατά 0.5 ο C ανά κύκλο, οποιαδήποτε διαφορά στην Tm μεταξύ σωστού και λάθους υβριδισμού θα αποδώσει διπλάσιο πλεονέκτημα ανά κύκλο ή τετραπλάσιο ανά 1 ο C. Για παράδειγμα, μια διαφορά 5 ο C θα αποδώσει μια 4 5 μεταβολή, με την παρουσία των επιπλέον μη-ειδικών προϊόντων να είναι μειωμένη ή να έχει απαλειφθεί εντελώς. Το πρόγραμμα των κύκλων στην TD-PCR περιλαμβάνει λοιπόν δύο ξεχωριστές φάσεις, την πρώτη όπου ξεκινάει με θερμοκρασία υβριδισμού υψηλότερη της Tm των 111

112 εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην συγκεκριμένη αντίδραση (συνήθως, Tm + 10 ο C), μειώνοντας την θερμοκρασία υβριδισμού κατά 1 ο C ανά κύκλο μέχρι την Tm των εκκινητών ή μια θερμοκρασία κοντά σε αυτή και την δεύτερη, που αποτελεί γενική φάση πολυμερισμού κύκλων, χρησιμοποιώντας ως τελική θερμοκρασία υβριδισμού αυτή στην οποία καταλήγει η πρώτη φάση της TD-PCR. Ιδανικά, ο ολικός αριθμός των κύκλων της πρώτης και δεύτερης φάσης δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τους 30 ή 35 κύκλους, διότι επιπλέον κύκλοι πιθανόν να επιφέρουν το σχηματισμό μη ειδικών προϊόντων ή διμερών των εκκινητών (Korbie and Mattick, 2008). B.10 Πρωτόκολλα PCR-αντιδράσεων Γενικά, για κάθε αντίδραση PCR αναμιγνύονται τα αντιδραστήρια με συγκεκριμένη και ίδια πάντα σειρά. Για καθένα από τα 5 SNP για τα οποία πραγματοποιήθηκε γονοτύπηση ακολουθήθηκε όμως διαφορετικό πρωτόκολλο. Β.10.1 Πρωτόκολλα για γονοτύπηση των SNP στο γονίδιο MAP3K5 (α) rs Πρωτόκολλο αντιδραστηρίων PCR σύνθεσης Αντιδραστήριο Αρχική Τελική Όγκος (μl) Συγκέντρωση Συγκέντρωση Η 2 Ο (PCR-grade) - - 8μl KAPA2G Fast ,5 μl HotStart ReadyMix Ευθύς εκκινητής 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μl Αντίστροφος εκκινητής 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μl DNA-στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 μl Τελικός όγκος μl αντίδρασης 112

113 Συνθήκες της αντίδρασης PCR Βήμα Θερμοκρασία Χρόνος 1 ο : Ενεργοποίηση του ενζύμου 95º C 1 min 2 ο : Αποδιάταξη 95º C 10 sec 3 ο : Υβριδοποίηση 65 º C 10 sec 4 ο : Επιμήκυνση 72º C 1 sec 5 ο : Επανάληψη των βημάτων 2-4 για 39 φορές 6 ο : Τελική επιμήκυνση 72º C 30 sec (β) rs Πρωτόκολλο αντιδραστηρίων PCR σύνθεσης Αντιδραστήριο Αρχική Τελική Όγκος (μl) Συγκέντρωση Συγκέντρωση Η 2 Ο (PCR-grade) - - 8μl KAPA2G Fast ,5 μl HotStart ReadyMix Ευθύς έξω εκκινητής 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μl Αντίστροφος έξω 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μl εκκινητής DNA-στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 μl Τελικός όγκος αντίδρασης μl Συνθήκες της αντίδρασης PCR Βήμα Θερμοκρασία Χρόνος 1 ο : Ενεργοποίηση του ενζύμου 95º C 1 min 2 ο : Αποδιάταξη 95º C 10 sec 3 ο : Υβριδοποίηση 60 º C 10 sec 4 ο : Επιμήκυνση 72º C 1 sec 5 ο : Επανάληψη των βημάτων 2-4 για 39 φορές 6 ο : Τελική επιμήκυνση 72º C 30 sec 113

114 Β.10.2 Πρωτόκολλα για γονοτύπηση των SNP στο γονίδιο PDE7B (α) rs Πρωτόκολλο αντιδραστηριών PCR σύνθεσης: Αντιδραστήριο Αρχική Τελική Όγκος (μl) Συγκέντρωση Συγκέντρωση Η 2 Ο (PCR-grade) μl KAPA2G Fast ,5 μl HotStart ReadyMix Ευθύς εκκινητής 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μl Αντίστροφος 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μl εκκινητής DNA-στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 μl Τελικός όγκος αντίδρασης μl Συνθήκες της αντίδρασης PCR Βήμα Θερμοκρασία Χρόνος 1 ο : Ενεργοποίηση του ενζύμου 95º C 1 min 2 ο : Αποδιάταξη 95º C 10 sec 3 ο : Υβριδοποίηση 63 º C 10 sec 4 ο : Επιμήκυνση 72º C 1 sec 5 ο : Επανάληψη των βημάτων 2-4 για 39 φορές 6 ο : Τελική επιμήκυνση 72º C 30 sec 114

115 (β) rs Πρωτόκολλο αντιδραστηρίων PCR σύνθεσης (1*) Αντιδραστήριο Αρχική Τελική Όγκος (μl) Συγκέντρωση Συγκέντρωση Η 2 Ο (PCR-grade) - - 5,75 μl KAPA2G Fast ,5 μl HotStart ReadyMix Ευθύς εκκινητής C 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μl αλληλομόρφου Αντίστροφος εκκινητής 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μl Ευθύς εκκινητής T- 10 μμ 0,7 μμ 1,75 μl αλληλομόρφου DNA-στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 μl MgCl 2 * 25 mm 0,5mM 0,5 μl Τελικός όγκος αντίδρασης μl *Εκτελέστηκε PCR-ARMS αντίδραση, δηλαδή ετοιμάζονται δύο διαφορετικά μίγματα PCR-αντίδρασης. Και τα δύο περιλαμβάνουν τα ίδια αντιδραστήρια εκτός απ τους εκκινητές, όπου συνδυάζονται ανα δύο, στη μία περίπτωσηευθύς εκκινητής για το C αλληλόμορφο και στην άλλη περίπτωση ευθύς εκκινητής για το Τ- αλληλόμορφο με τον αντίστροφο εκκινητή. Μόνο το μίγμα με τον ευθύ εκκινητή για το C αλληλόμορφο περιλαμβάνει MgCl

116 Συνθήκες της αντίδρασης PCR Βήμα Θερμοκρασία Χρόνος 1 ο : Ενεργοποίηση του ενζύμου 95º C 1 min 2 ο : Αποδιάταξη 95º C 10 sec 3 ο : Υβριδοποίηση 63 º C 10 sec 4 ο : Επιμήκυνση 72º C 1 sec 5 ο : Επανάληψη των βημάτων 2-4 για 33 φορές 6 ο : Τελική επιμήκυνση 72º C 30 sec (γ) rs Πρωτόκολλο αντιδραστηρίων PCR σύνθεσης Αντιδραστήριο Αρχική Τελική Όγκος (μl) Συγκέντρωση Συγκέντρωση Η 2 Ο (PCR-grade) - - 4,5 μl KAPA2G Fast ,5 μl HotStart ReadyMix Ευθύς εσωτερικός 10 μμ 0,5μΜ 1,25 μl εκκινητής C αλληλομόρφου Αντίστροφος 10 μμ 0,5 μμ 1,25 μl εξωτερικός εκκινητής C αλληλομόρφου Ευθύς εξωτερικός 10 μμ 0,7μΜ 1,75μl εκκινητής G αλληλομόρφου Αντίστροφος 10 μμ 0,7μΜ 1,75 μl εσωτερικός εκκινητής G αλληλομόρφου DNA-στόχος 50 ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 μl MgCl 2 * 50 mm 2mM 1 μl Τελικός όγκος αντίδρασης μl 116

117 *Εκτελέστηκε PCR-ARMS αντίδραση, δηλαδή ετοιμάζονται δύο διαφορετικά μίγματα PCR-αντίδρασης. Και τα δύο περιλαμβάνουν τα ίδια αντιδραστήρια εκτός απ τους εκκινητές, όπου συνδυάζονται ανα δύο, ως ευθύς εσωτερικός με αντίστροφο εξωτερικό και αντίστροφος εσωτερικός με ευθύ εξωτερικό. Μόνο το μίγμα με τον ευθύ εσωτερικό εκκινητή, ειδικό για το C αλληλόμορφο περιλαμβάνει MgCl 2. Συνθήκες της αντίδρασης PCR Βήμα Θερμοκρασία Χρόνος 1 ο : Ενεργοποίηση του ενζύμου 95º C 1 min 2 ο : Αποδιάταξη 95º C 10 sec 3 ο : Υβριδοποίηση º C * 10 sec 4 ο : Επιμήκυνση 72º C 1 sec 5 ο : Επανάληψη των βημάτων 2-4 για 36 φορές 6 ο : Τελική επιμήκυνση 72º C 30 sec * Εκτελέστηκε TD-PCR, δηλαδή η θερμοκρασία υβριδισμού κυμάνθηκε από ο C: 65C x 3 κύκλους, 64 ο C x 3 κύκλους, 63 ο C x 3 κύκλους, 62 ο C x 27 κύκλους. Β.11 PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)- Γονοτύπηση με κατάτμηση προϊόντων PCR με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Με την τεχνική της PCR-RFLP μπορεί να γίνει γονοτύπηση μόνο εάν ο πολυμορφισμός που μελετάται εντοπίζεται σε περιοριστική θέση, δηλαδή εντός μιας αλληλουχίας αναγνώρισης από κάποια περιοριστική ενδονουκλεάση. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες (restriction enzymes) είναι ένζυμα που αναγνωρίζουν συγκεκριμένες δίκλωνες αλληλουχίες DNA, τις περιοριστικές θέσεις (restriction sites), και πέπτουν το μόριο μέσα ή κοντά στην αλληλουχία αναγνώρισης, υδρολύοντας τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και δημιουργώντας περιοριστικά θραύσματα (restriction fragments). Οι περιοριστικές θέσεις είναι ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες, μήκους συνήθως 4-8 bp και συχνά είναι παλίνδρομες. Τα περιοριστικά ένζυμα στην πλειονότητά τους έχουν απομονωθεί από βακτήρια, στα οποία 117

118 συντελούν στην προστασία από ιικές μολύνσεις. Τρείς είναι οι βασικότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την δραστικότητα των περιοριστικών ενδονουκλεασών: i. το ph (στο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (buffer)) ii. η ιοντική συγκέντρωση (στο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (buffer)) iii. η θερμοκρασία επώασης (στην οποία πραγματοποιείται η αντίδραση πέψης) Η βασική αρχή της εφαρμογής PCR-RFLP στην γονοτύπηση πολυμορφισμών βασίζεται στο παρακάτω σκεπτικό. Αν η περιοριστική αλληλουχία εντοπίζεται σε περιοχή όπου υπάρχει SNP, τότε είναι δυνατόν αυτή να εμφανίζεται ή να εξαφανίζεται, ανάλογα με το αλληλόμορφο του SNP που είναι παρόν σε κάθε περίπτωση. Το περιοριστικό ένζυμο, λοιπόν, κατατέμνει την αλληλουχία μόνο σε περίπτωση εμφάνισης ενός συγκεκριμένου αλληλομόρφου. Επομένως στις περιπτώσεις ομοζυγωτίας για το αγρίου τύπου αλληλόμορφο, για το σπάνιο (μεταλλαγμένο) αλληλόμορφο ή στην περίπτωση ετεροζυγωτίας, λαμβάνεται διαφορετικό πρότυπο ζωνών κατά την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR- RFLP σε πήκτωμα αγαρόζης. Άρα λοιπόν πάντοτε πραγματοποιείται αρχικά ενίσχυση του τμήματος DNA που περιλαμβάνει τον πολυμορφισμό με PCR, κατάτμηση των PCR προϊόντων με το κατάλληλο ένζυμο περιορισμού και διαχωρισμός των τμημάτων που προκύπτουν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε PCR-RFLP ανάλυση για τα SNP rs (MAP3K5) και rs (PDE7B). Β.11.1 PCR-RFLP ανάλυση για το rs (T>C) Το ένζυμο που επιλέχτηκε για την PCR-RFLP ανάλυση για το συγκεκριμένο SNP είναι το PvuII-HF της NEB (NEW ENGLAND BioLabs Inc., city, state). Το ένζυμο αυτό αναγνωρίζει την περιοριστική θέση: To PvuII-HF πέπτει την αλληλουχία μεταξύ γουανίνης (G) και κυτοσίνης (C). Στη περίπτωση αυτή είναι πολυμορφική η θέση της κυτοσίνης (C). Έτσι, μόνο όταν υπάρχει το C αλληλόμορφο το ένζυμο πέπτει την αλληλουχία, ενώ όταν εντοπίζεται το T αλληλόμορφο στη θέση αυτή δεν πραγματοποιείται πέψη. 118

119 Το PvuII-HF αποτελεί ένζυμο «υψηλής πιστότητας» (HF-high fidelity), έχει την ίδια ειδικότητα με το PvuII, αλλά έχει παρασκευαστεί έτσι ώστε να παρουσιάζει μειωμένη «star activity». Η δραστικότητα «star activity» είναι πρακτικά η μεταβολή της ειδικότητας ενός περιοριστικού ενζύμου στην κατάτμηση μιας αλληλουχίας DNA σε συγκεκριμένη θέση περιορισμού. Η δραστικότητα αυτή εμφανίζεται σε συνθήκες που αποκλίνουν σημαντικά από τις ιδανικές για την σωστή λειτουργία του ενζύμου. Αποτέλεσμά της είναι η πέψη σε «μη-κανονικές» περιοριστικές θέσεις και κάποιες φορές χάνεται πλήρως όποια ειδικότητα και γίνεται πέψη σε μη-ειδικές θέσεις της DNA αλληλουχίας. Η «star activity» μπορεί να προκληθεί από: i. χαμηλή ιοντική ισχύ ii. υψηλό ph iii. υψηλή (>5% v/v) συγκέντρωση γλυκερόλης (ανεπαρκής αραίωση του ενζύμου μπορεί να προκαλέσει «star activity») Εκτός από την παραπάνω ιδιότητα, τα ένζυμα «υψηλής πιστότητας» έχουν το πλεονέκτημα ότι δρούν σε σημαντικά μειωμένο χρόνο. Γενικά λοιπόν χαρακτηρίζονται από υψηλή πιστότητα και δραστικότητα. Το PvuII-HF της NEB συνοδεύεται από κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, το NEBuffer4, που εξασφαλίζει την 100% δράση του ενζύμου. Η σύσταση του διαλύματος 1 NEBuffer 4 είναι: 20 mm Tris-οξικό οξύ, 50 mm οξικό κάλιο, 10 mm οξικό μαγνήσιο, 1 mm διθειοθρεϊτόλη (DTT), ph 7,9 στους 25 ºC. Προτείνεται από τον παραγωγό επώαση στους 37 ο C με 1xNEBuffer για χρονικό διάστημα όχι πάνω από μία ώρα. Η απενεργοποίηση του ενζύμου γίνεται με θερμότητα. Προτείνεται θέρμανση στους 80 ο C για 20min. Η συσκευασία στην οποία παραλήφθηκε το PvuII-HF της NEB, ήταν τα units, σε συγκέντρωση units/ml. Το 1 unit ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για την κατάτμηση 1μg/λ DNA σε 1 ώρα στους 37 ο C σε ολικό όγκο αντίδρασης 50μl. Για την αντίδραση κατάτμησης με το ένζυμο PvuII-HF για γονοτύπηση του SNP rs , ακολουθήθηκε το εξής πρωτόκολλο: 119

120 Αντιδραστήριο Όγκος (μl) PCR προϊόν 8 NEBuffer 4 (10 ) 1,5 PvuII-HF (20U/μl) 0,5 Τελικός όγκος αντίδρασης 10 Όσον αφορά στις συνθήκες της αντίδρασης κατάτμησης, πραγματοποιήθηκε επώαση των προϊόντων PCR με το ένζυμο στους 37 ºC για 3 hrs. Παρόλο που ο μέγιστος χρόνος επώασης που προτείνεται από τον παρασκευαστή είναι 1 hr, μετά από πολλές δοκιμές φάνηκε πως οι 3 hrs ήταν το καταλληλότερο χρονικό διάστημα για την επίτευξη πλήρους κατάτμησης. Το στάδιο απενεργοποίησης του ενζύμου για 20 min στους 80 ºC παραλήφθηκε εντελώς, γιατί είχε αρνητικές επιπτώσεις στην τελική έκβαση της κατάτμησης. Έτσι με άμεση ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της κατάτμησηςς σε πήκτωμα αγαρόζης, και με την επίδραση του ρυθμιστικού TAE 1x, θεωρήθηκε ότι απενεργοποιήθηκε το ένζυμο λόγω συμπλοκοποίησης και δέσμευσης από το EDTA των απαραίτητων για την δραστικότητά του μεταλλικών ιόντων από το περιβάλλον του. Το στάδιο της επώασης πραγματοποιήθηκε στο ειδικό όργανο Dry Block Heating Thermostat (Bio TDB-120) της εταιρίας Biosan. Τελικά, έγινε ο διαχωρισμός των προϊόντων της κατάτμησης με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 2%, μέσω της οποίας γίνεται η ταυτοποίηση του γονότυπου ανάλογα με τον αριθμό των περιοριστικών θραυσμάτων που προκύπτουν από την κατάτμηση. Έτσι, παρουσία του ήσσονος αλληλομόρφου σε ομοζυγωτία, προέκυπταν πάντα τρία θραύσματα DNA από το αρχικό προϊόν PCR, με μεγέθη 22bp, 196bp και 356bp. Παρουσία του επικρατούς αλληλομόρφου σε ομοζυγωτία εντοπιζόταν μόνο το άθικτο προϊόν PCR 576bp, ενώ σε περίπτωση ετεροζυγωτίας εμφανίζονταν όλα τα θραύσματα. 120

121 Β.11.2 PCR-RFLP ανάλυση για το rs (A>C) Για την PCR-RFLP ανάλυση του συγκεκριμένου SNP χρησιμοποιήθηκε το ένζυμο HaeII της NEB (NEW ENGLAND BioLabs Inc., city, state). Aυτό αναγνωρίζει την εξής περιοριστική θέση: Το HaeII πέπτει την περιοριστική αλληλουχία μεταξύ κυτοσίνης (C) και οποιουδήποτε νουκλεοτιδίου ακολουθεί. Έτσι, όταν υπάρχει το C αλληλόμορφο, το HaeII θα αναγνωρίσει την θέση περιορισμού και θα πέψει την DNA αλληλουχία, ενώ στην περίπτωση του αλληλομόρφου Α δεν θα πραγματοποιηθεί πέψη. Το HaeII της NEB συνοδεύεται από κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, το NEBuffer4, που υπόσχεται την 100% δράση του ενζύμου. Η σύσταση του διαλύματος 1 NEBuffer 4 είναι: 20 mm Tris-οξικό οξύ, 50 mm οξικό κάλιο, 10 mm οξικό μαγνήσιο, 1 mm διθειοθρεϊτόλη (DTT), ph 7,9 στους 25 ºC. Επίσης συνοδεύεται από αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA), που συντελεί στο να μήν προσροφάται το ένζυμο ηλεκτροστατικά στα πλαστικά τοιχώματα των σωλήνων μικροφυγοκέντρησης. Προτείνεται από τον παραγωγό επώαση στους 37 ºC με 1xNEBuffer και 100μg/ ml BSA για χρονικό διάστημα όχι πάνω από μία ώρα. Η απενεργοποίηση του ενζύμου γίνεται με θερμότητα. Προτείνεται θέρμανση στους 80 ºC για 20min. Η συσκευασία στην οποία παραλήφθηκε το HaeII της NEB, ήταν τα units, σε συγκέντρωση units/ml. Για την αντίδραση πέψης με το ένζυμο HaeII για γονοτύπηση του SNP rs , ακολουθήθηκε το παρακάτω πρωτόκολλο: 121

122 Αντιδραστήριο Όγκος (μl) PCR προϊόν 8 NEBuffer 4 (10 ) 0,5 BSA 0,5 HaeII (20U/μl) 1 Τελικός όγκος αντίδρασης 10 Όσον αφορά στις συνθήκες της πέψης, πραγματοποιήθηκε επώαση των PCRπροιόντων με το ένζυμο στους 37 ºC για 4,5 hrs. Παρόλο που ο μέγιστος χρόνος επώασης που προτείνεται από τον παρασκευαστή είναι 1 hr, μετά από πολλές δοκιμές φάνηκε πως οι 4,5 hrs ήταν το καταλληλότερο χρονικό διάστημα για την επίτευξη πλήρους πέψης. Το στάδιο απενεργοποίησης του ενζύμου για 20 min στους 80 ºC παραλήφθηκε και σε αυτή τη περίπτωση και έγινε αμέσως μετά την πάροδο των 4,5 ωρών η ηλεκτροφόρηση των προιόντων της πέψης σε πήκτωμα αγαρόζης. Το στάδιο της επώασης πραγματοποιήθηκε και σε αυτή τη περίπτωση στο ειδικό όργανο Dry Block Heating Thermostat (Bio TDB-120) της εταιρίας Biosan. Έτσι, παρουσία του ήσσονος αλληλίου σε ομοζυγωτία, προέκυπταν δύο τμήματα DNA από το αρχικό προϊόν PCR, μεγέθους 230bp και 360bp. Παρουσία του μείζονος αλληλίου σε ομοζυγωτία εντοπιζόταν μόνο το άθικτο προϊόν PCR 591bp. Σε περίπτωση ετεροζυγωτίας εμφανίζονταν και τα τρία προϊόντα PCR. Β.12 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος διαχωρισμού, χαρακτηρισμού και απομόνωσης τμημάτων DNA και αυτό γιατί είναι απλή, γρήγορη στην εφαρμογή και αρκετά ευαίσθητη στο διαχωρισμό τμημάτων DNA. Η ηλεκτροφόρηση είναι μια διαδικασία κατά την οποία το αρνητικά φορτισμένο μόριο του DNA κινείται μέσα σε ένα πορώδες πήκτωμα υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Για τον διαχωρισμό μικρών τμημάτων DNA που διαφέρουν κατά λίγα νουκλεοτίδια προτιμάται η χρήση πηκτωμάτων ενός άλλου πολυμερούς, της πολυακρυλαμίδης. 122

123 Καθώς μετακινούνται, τα διαφορετικά μόρια DNA σχηματίζουν χαρακτηριστικές ζώνες σε διαφορετικές (ανάλογα με το μέγεθός τους) περιοχές του πηκτώματος. Οι ζώνες γίνονται ορατές με προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου στο πήκτωμα και έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Το βρωμιούχο αιθίδιο ενσωματώνεται στις αύλακες του δίκλωνου μορίου DNA και φθορίζει όταν διεγείρεται με UV. Η κινητικότητα του DNA σε ένα πήκτωμα αγαρόζης εξαρτάται από τους παρακάτω παράγοντες: 1. Το μέγεθος του μορίου DNA. Όσο μεγαλύτερα είναι τα μόρια, τόσο μικρότερη θα είναι και η κινητικότητά τους, διότι δυσκολεύονται να διέλθουν μέσα από τους πόρους του πηκτώματος. 2. Η διαμόρφωση της δομής των μορίων του DNA. Αυτή η παράμετρος είναι σημαντική γιατί το υπερελικωμένο DNA, το κυκλικό DNA με εγκοπές (nicked) και το γραμμικό DNA έχουν διαφορετική κινητικότητα ακόμα και αν έχουν το ίδιο μέγεθος. 3. Η συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα. Γενικότερα ισχύει μια γραμμική σχέση μεταξύ του λογαρίθμου της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του DNA (μ) και της συγκέντρωσης του πηκτώματος (τ) που περιγράφεται από τον τύπο: log μ = log μ 0 -K r τ όπου μ 0 είναι η ελεύθερη κινητικότητα του DNA και Κ r ο συντελεστής καθυστέρησης που έχει σχέση με τις ιδιότητες του πηκτώματος, το μέγεθος και το σχήμα των κινούμενων μορίων. 4. Η παρεχόμενη τάση ηλεκτρικού ρεύματος. Σε χαμηλές τάσεις η κινητικότητα των μορίων είναι ανάλογη της τάσης που εφαρμόζεται. Αντίθετα σε αυξημένη τάση παρατηρείται μείωση της ικανότητας διαχωρισμού των μεγαλύτερων σε μέγεθος τμημάτων DNA. 5. Η κατεύθυνση του ηλεκτρικού πεδίου. Παροδικές αλλαγές στην κατεύθυνση του ηλεκτρικού πεδίου χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό μεγάλων τμημάτων DNA με μέγεθος από Kb σε μήκος. 6. Η σύσταση των βάσεων του τμήματος του DNA και η θερμοκρασία. Αυτοί οι παράγοντες δεν επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό την κινητικότητα του DNA. 7. Χημικά που παρεμβάλλονται στη δομή του DNA, όπως το EtBr, μειώνοντας έτσι την κινητικότητά του. 8. Σύσταση του διαλύματος ηλεκτροφόρησης. 123

124 Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης χρησιμοποιείται και για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης του DNA σε ένα διάλυμα και γίνεται ουσιαστικά μέσω της σύγκρισης της έντασης της ζώνης του υπό εξέταση μορίου DNA σε σχέση με την ένταση των ζωνών του DNA αναφοράς, δηλαδή του δείκτη μοριακών μεγεθών (ladder, marker) του οποίου η συγκέντρωση είναι δυνατόν να υπολογιστεί από γνωστά δεδομένα για την κάθε ζώνη (Marengo-Rowe, 2006). Για την παρασκευή πηκτώματος αγαρόζης χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: 1) Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (1x) Σύσταση (50 ): 242 g Tris 100 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) 57,1 ml Glacial acetic acid Αποσταγμένο Η 2 Ο (dd Η 2 Ο) έως τελικού όγκου 1000 ml 2) Αγαρόζη της εταιρίας Biorad (Molecular Biology Agarose) 3) Βρωμιούχο αιθίδιο (10 mg/ml) Για την διαδικασία της ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιήθηκαν: 1) Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (1x) (Running buffer) 2) Διάλυμα φόρτωσης/gel Loading Buffer (6 ) της εταιρίας NEB Σύσταση (1 ): 2,5% Ficoll mm EDTA 3,3 mm Tris-HCl 0,017% SDS 0,015% μπλε της βρωμοφαινόλης ph 8 στους 25ºC 3) Μάρτυρας μεγεθών σταθερού βήματος 50 bp DNA (Ladder) της εταιρίας New England Biolabs (NEB) 124

125 Είδος του πηκτώματος αγαρόζης που χρησιμοποιήθηκε για την διεξαγωγή της παρούσας μελέτης: Το πήκτωμα αγαρόζης που χρησιμοποιήθηκε είχε διαφορετική περιεκτικότητα ανάλογα με το σκοπό της χρήσης του. Έτσι για απλή ηλεκτροφόρηση PCR προϊόντων παρασκευαζόταν συνήθως πήκτωμα με περιεκτικότητα 1% w/v (κυρίως για PCR προιόντα μεγαλύτερου μεγέθους, όπως bp ). Σε περίπτωση προϊόντων PCR μικρότερου μεγέθους ή για την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR-RFLP και PCR-ARMS, χρησιμοποιήθηκε πήκτωμα υψηλότερης περιεκτικότητας σε αγαρόζη, δηλαδή 2% w/v, για καλύτερο διαχωρισμό των προϊόντων που συχνά διέφεραν μόνο κατά λίγες βάσεις. Ο όγκος του πηκτώματος που παρασκευαζόταν κάθε φορά ήταν ανάλογος με τον αριθμό των δειγμάτων, κυμαινόταν δηλαδή μεταξύ 50 και 100 ml. Το πήκτωμα της αγαρόζης παρασκευάστηκε με τον παρακάτω τρόπο: i. Διαλυτοποιήθηκε με θέρμανση ποσότητα αγαρόζης (1-2g) σε 50 ή 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος 1xΤΑΕ, αντίστοιχα. ii. Σε θερμοκρασία περίπου 50-60ºC σε ρευστό ακόμα πήκτωμα, πρίν τον πολυμερισμό της αγαρόζης προστέθηκαν 5-10 μl βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr). iii. Μεταφέρθηκε το υγρό ακόμα πήκτωμα αγαρόζης στο κατάλληλο καλούπι, αφού προηγουμένως έχει τοποθετηθεί σε απόσταση περίπου 2 cm από την άκρη του καλουπιού μία πλαστική «χτένα», κάθετα στο καλούπι. Η «χτένα» είναι βυθισμένη στο πήκτωμα, έτσι ώστε μετά τον πολυμερισμό, να δημιουργηθούν κατάλληλα μικρά φρεάτια (wells) στο πήκτωμα, σημεία στα οποία θα τοποθετηθούν τα προς διαχωρισμό δείγματα DNA. iv. Μετά τον πολυμερισμό, το πήκτωμα εμβαπτίστηκε σε διάλυμα ηλεκτροφόρησης TAE (Running buffer). v. Πριν φορτωθούν τα δείγματα DNA στα φρεάτια, προστέθηκε στα δείγματα μικρή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (loading buffer). Το διάλυμα φόρτωσης περιέχει φικόλη, η οποία διαθέτει μοριακό βάρος (Μ.Β) μεγαλύτερο του νερού και συντελεί στην καθίζηση των δειγμάτων εντός των φρεατίων. 125

126 vi. vii. viii. Στο πρώτο φρεάτιο, προστέθηκαν 3 μl από τον μάρτυρα μοριακών μεγεθών (χρησιμοποιήθηκε κυρίως ο μάρτυρας 50bp). Εφαρμόστηκε ηλεκτρικό πεδίο στα δύο άκρα της δεξαμενής ηλεκτροφόρησης, με τη βοήθεια κατάλληλου τροφοδοτικού, η οποία διακόπτεται περίπου μετά από min ανάλογα με την τάση που έχει εφαρμοστεί (συνήθως V). Για την παρατήρηση του αποτελέσματος, τοποθετήθηκε το πήκτωμα πάνω σε λάμπα UV (UV Transilluminator). 126

127 Εικόνα 23: Συσκευή ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης Ένα πήκτωμα αγαρόζης τοποθετείται στη συσκευή που είναι γεμάτη με ρυθμιστικό διάλυμα και ηλεκτρικό πεδίο εφαρμόζεται μέσω κατάλληλου τροφοδοτικού. Το αρνητικά φορτισμένο άκρο βρίσκεται στην περιοχή όπου συνδέεται το μαύρο καλώδιο. Το αρνητικά φορτισμένο DNA μετακινείται έτσι πρός το θετικά φορτισμένο πόλο, δηλαδή το άκρο της συσκευής όπου συνδέεται το κόκκινο καλώδιο ( Β.13 Αλληλούχηση: προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας μορίων DNA (Sequencing) Η αλληλούχηση αποτελεί μέθοδο διευκρίνισης της σειράς των νουκλεοτιδικών βάσεων, αδενίνη, γουανίνη, κυτοσίνη, θυμίνη σε ένα μόριο DNA. Η μεγάλη ταχύτητα με την οποία επιτελείται η σύγχρονη μέθοδος αλληλούχησης έχει αποδειχτεί κρίσιμος παράγοντας στην διαλεύκανση του ανθρώπινου γονιδιώματος κατά το «Human Genome Project». Η τεχνική της αλληλούχησης ξεκίνησε με την αλληλούχηση του RNA (RNA sequencing). Ορόσημο αποτελεί η πρώτη πλήρης αλληλούχηση γονιδίου και ολόκληρου του γονιδιώματος του βακτηριοφάγου MS2 από τον Walter Fiers και τους συνεργάτες του τα έτη (University Ghent, Belgium). Η μέθοδος που έγινε σύντομα μέθοδος επιλογής λόγω της αξιοπιστίας και ευκολίας χρήσης της για την αλληλούχηση του DNA είναι η ενζυμική μέθοδος που επινόησε ο Sanger (Perutz et al., 1968, Sanger et al., 1977), η κλασσική μέθοδος «τερματισμού της επιμήκυνσης αλυσίδας» (chain termination). Η βασική αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στη χρήση τριφωσφορικών 2',3' διδεοξυνουκλεοτιδίων (ddntp), ως μόρια τερματισμού της DNA-αλληλουχίας. Για την εφαρμογή της μεθόδου αυτής απαιτείται ένα μονόκλωνο DNA υπόστρωμα, ένας DNA-εκκινητής, μια DNAπολυμεράση, φυσιολογικά δεόξυνουκλεοτίδια (dntp) και τα τροποποιημένα 127

128 τριφωσφορικά 2',3' διδεοξυνουκλεοτίδια (ddntp), τα οποία τερματίζουν την επιμήκυνση του DNA-κλώνου. Τα ddntps είναι επισημασμένα με φθορίζουσες ομάδες ή ραδιενεργά στοιχεία, για να καταστεί δυνατή η ανίχνευση σε μηχανήματα αυτόματης αλληλούχησης είτε με τη χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας ή αυτοραδιογραφίας Το DNA-δείγμα που πρόκειται να αλληλουχηθεί διαχωρίζεται σε τέσσερεις ξεχωριστές αντιδράσεις, που περιέχουν: i. Φυσιολογικά τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (datp, dgtp, dctp, dttp) ii. DNA-πολυμεράση iii. Σε κάθε αντίδραση προστίθεται μόνο ένα τριφωσφορικό 2',3' διδεοξυνουκλεοτίδιο (ddαtp, ddgtp, ddctp, ddttp), που τερματίζει τον σχηματισμό της αλυσίδας DNA, διότι δεν διαθέτει 3 -ΟΗ ομάδα που απαιτείται για τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ δύο νουκλεοτιδίων, τερματίζοντας την επιμήκυνση και καταλήγοντας στο σχηματισμό τμημάτων DNA ποικίλου μήκους. iv. DNA-στόχο v. Εκκινητές vi. Κατάλληλα άλατα και χημικά, όπως το Mg ++ Το αποτέλεσμα της αλληλούχησης, οπτικοποιείται στη συνέχεια και ερμηνεύεται με τον εξής τρόπο: i. Τα νεοσυντιθέμενα και επισημασμένα DNA-τμήματα αποδιατάσσονται με θερμότητα και διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθος (με ακρίβεια ενός νουκλεοτιδίου) με ηλεκτροφόρηση σε πηκτωμα πολυακρυλαμίδης-ουρίας, με τα προϊόντα καθεμιάς αντίδρασης να τρέχουν σε ένα από τα τέσσερα ξεχωριστά φρεάτια (A, T, G, C) (Εικ.24). ii. Οι μπάντες οπτικοποιούνται μετά με εφαρμογή υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) ή αυτοραδιογραφίας ανάλογα με τον τρόπο της επισήμανσης των ddntp και η αλληλουχία DNA μπορεί να διαβαστεί άμεσα από την εικόνα του πηκτώματος. iii. Οι σχετικές θέσεις των διαφόρων μπαντών στο πήκτωμα αγαρόζης (τμημάτων DNA μετά από τερματισμό) για τις τέσσερεις σειρές, χρησιμοποιούνται ώστε να διαβαστεί από κάτω προς τα πάνω η DNA-αλληλουχία. 128

129 Κάποιες τεχνικές αποκλίσεις της μεθόδου περιλαμβάνουν: a) Επισήμανση των DNA τμημάτων μέσω επισήμανσης του εκκινητή στο 5 άκρο του με φθορίζουσα χρωστική αντί επισήμανσης των ddntps b) Ανάπτυξη (Leroy Hood και συνεργάτες) και χρήση των επισημασμένων με φθορισμό ddntps και ταυτόχρονη χρήση επισημασμένων εκκινητών, που έθεσε την βάση για την αυτοματοποιημένη και υψηλής απόδοσης (high throughput) DNA αλληλούχηση. Στο εμπόριο κυκλοφορούν πλέον πολλές έτοιμες συσκευασίες για χρήση σε αλληλούχηση. Η τεχνική παρουσιάζει ωστόσο και καποιους περιορισμούς, όπως: i. Μη ειδική πρόσδεση του εκκινητή στο DNA-στόχο. ii. Δευτεροταγείς δομές στο DNA που επηρεάζουν την πιστότητα της αλληλουχίας που διαβάζεται. Εικόνα 24: Κλασσική μέθοδος αλληλούχησης με τερματισμό επιμήκυνσης (Sanger method) ( Παραλλαγή της μεθόδου που περιγράφτηκε παραπάνω αποτελεί η «αλληλούχηση με τερματισμό επιμήκυνσης με χρώση» (dye-terminator sequencing) (Εικ.25). Βασίζεται στην επισήμανση κάθε ddntp με διαφορετική φθορίζουσα χρωστική, που εκπέμπει φως σε διαφορετικό μήκος κύματος, κάτι το οποίο επιτρέπει την 129

130 αλληλούχηση να γίνει σε μία αντίδραση και όχι σε τέσσερις όπως περιγράφτηκε στην κλασσική μέθοδο και να ηλεκτροφορηθεί σε μία διαδρομή (φρεάτιο). Λόγω ταχύτητας αποτελεί μέθοδο επιλογής στην αυτοματοποιημένη αλληλούχηση. Οι περιορισμοί της μεθόδου αφορούν στην ανίχνευση της χρωστικής και τις διαφορές στην ενσωμάτωση των ddntp στο νεοσυντιθέμενο DNA τμήμα, οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ανομοιόμορφων κορυφών στο χρωματογράφημα που λαμβάνεται μετά την ηλεκτροφόρηση με τριχοειδείς σωλήνες. Ουσιαστικά οι συσκευές αλληλούχησης εκτελούν ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς για διαχωρισμό κατά μέγεθος, ανίχνευση και καταγραφή της έντασης του φθορισμού των χρωστικών και απόδοση των δεδομένων ως φθοριζουσών κορυφών σε χρωματογράφημα. Ο πολυμερισμός σε θερμοκυκλοποιητή, ο καθαρισμός και η αναδιάλυση σε ρυθμιστικό διάλυμα πριν την φόρτωση του δείγματος στη συσκευή αλληλούχησης εκτελούνται ξεχωριστά. Κατάλληλα πακέτα λογισμικών μπορούν να κάνουν αυτόματη απαλοιφή των χαμηλής ποιότητας σημάτων από DNA-τμήματα, με χρήση ειδικών αλγορίθμων. Ιδιαίτερος λόγος γίνεται πλέον τα τελευταία χρόνια για την «αλληλούχηση υψηλής απόδοσης ή αλληλούχηση επόμενης γενεάς» (High-throughput sequencing/ next generation sequencing). Σε αυτή εκτελείται παράλληλα η διαδικασία της αλληλούχησης, παράγοντας χιλιάδες ή εκατομμύρια αλληλουχίες με μιας. 130

131 Εικόνα 25: Μέθοδος αλληλούχησης με τερματισμό επιμήκυνσης με χρώση. (dye-terminator sequencing). Ένας εκκινητής υβριδοποιείται στην δίκλωνη αλληλουχία-στόχο που έχει προηγουμένως αποδιαταχθεί και προστίθενται τα αντιδραστήρια, δηλαδή η DNA-πολυμεράση, τα δεοξυνουκλεοτίδια (dntps) και μια μικρή ποσότητα από τα διδεοξυνουκλεοτίδια (ddntps) επισημασμένα το καθένα με διαφορετική φθορίζουσα χρωστική. Κατά την φάση της επιμήκυνσης της αντίδρασης PCR η τυχαία ενσωμάτωση ενός ddntp αντί ενός dntp τερματίζει την σύνθεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας, διότι η έλλειψη της υδροξυλομάδας στα ddntp δεν επιτρέπει το σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού. Ετσι προκύπτουν αλληλουχίες DNA διαφορετικού μήκους που μετακινούνται με διαφορετική ταχύτητα κατά την ηλεκρτοφόρηση τριχοειδούς και καθεμία, που είναι επισημασμένη με μία από τις τέσσερις διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές, διεγείρεται από υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Με τη χρήση κατάλληλου λογισμικού κατασκευάζεται το χρωματοφράφημα της αλληλούχησης, στο οποίο κάθε κορυφής αναπαριστά ένα νουκλεοτίδιο της αλληλουχίας ( Β.14 Καθαρισμός των προϊόντων PCR Πριν την εκτέλεση της αλληλούχησης είναι απαραίτητο τα προϊόντα PCR να καθαριστούν από υπολείμματα εκκινητών, δεοξυνουκλεοτιδίων και ρυθμιστικού διαλύματος, προκειμένου το χρωματογράφημα που προκύπτει να είναι όσο το δυνατόν πιο ποιοτικό, με μειωμένο θόρυβο που προκύπτει από το υπόβαθρο. Για τον καθαρισμό χρησιμοποιήθηκε το σύστημα αντιδραστηρίων PureLink PCR Purification Kit της εταιρείας Invitrogen. Η διαδικασία καθαρισμού εκτελέστηκε σε θερμοκρασία δωματίου ως εξής: 131

132 i. Προστέθηκε H 2 O στα δείγματα μέχρι τελικού όγκου 50 μl. ii. Αμέσως μετά προστέθηκαν 200 μl διαλύματος πρόσδεσης PureLink Binding Buffer με ακόλουθη καλή ανάδευση. iii. Το μίγμα μεταφέρθηκε στη στήλη PureLink Spin Column. iv. Έγινε φυγοκέντρηση της στήλης, σε θερμοκρασία δωματίου, σε ταχύτητα g, για 1 min και στη συνέχεια απόρριψη του διηθήματος. v. Έπειτα προστέθηκαν στη στήλη 650 μl διαλύματος πλύσης Wash Buffer, στο οποίο είχε προστεθεί εξαρχής αιθανόλη σύμφωνα με τις οδηγίες του παραγωγού. vi. Η στήλη φυγοκεντρήθηκε πάλι, σε θερμοκρασία δωματίου, σε ταχύτητα g, για 1 min και το διήθημα απορρίφθηκε. vii. Για να απομακρυνθεί όλη η ποσότητα του Wash Buffer επαναλήφθηκε η φυγοκέντρηση της στήλης σε ταχύτητα g και σε θερμοκρασία δωματίου. viii. Αμέσως μετά η στήλη τοποθετήθηκε σε καθαρό 1.7 ml PureLink Elution Tube. ix. Προστέθηκαν στη συνέχεια 50 μl από το διάλυμα έκλουσης Elution Buffer στη στήλη. x. Ακολούθως έγινε επώαση για 1 min, σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκέντρηση της στήλης για 2 min, σε ταχύτητα g. xi. Το τελικό διήθημα περιλάμβανε το καθαρό προϊόν και αποθηκεύτηκε στους - 20 ο C. Β.15 Στατιστική επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων Γενικά, ο απώτερος στόχος κάθε έρευνας ή της επιστημονικής ανάλυσης είναι να βρίσκει τις σχέσεις μεταξύ των μεταβλητών. Η φιλοσοφία της επιστήμης μας διδάσκει ότι δεν υπάρχει κανένας άλλος τρόπος για να αναζητήσουμε τη σημασία ενός φαινομένου εκτός από από την συσχέτιση ποσοτικών και ποιοτικών χαρακτηριστικών, επομένως την αναζήτηση σχέσεων μεταξύ των μεταβλητών. Κατά συνέπεια, η στατιστική ανάλυση μας βοηθά να αξιολογήσουμε τις σχέσεις μεταξύ των μεταβλητών. Οι δύο πιό στοιχειώδεις ιδιότητες κάθε σχέσης μεταξύ των μεταβλητών είναι το μέγεθος της σχέσης και η αξιοπιστία της. Το μέγεθος είναι πολύ ευκολότερο να το καταλάβουμε και να το μετρήσουμε σε σχέση με την αξιοπιστία. Η αξιοπιστία μιας σχέσης αναφέρεται στη "αντιπροσωπευτικότητα" του αποτελέσματος 132

133 που βρίσκεται στο συγκεκριμένο δείγμα μας για ολόκληρο τον πληθυσμό. Εάν η μελέτη ικανοποιεί μερικά ειδικά κριτήρια, η αξιοπιστία μιας σχέσης μεταξύ των μεταβλητών που παρατηρούνται στο δείγμα μας μπορεί να υπολογιστεί ποσοτικά και να αντιπροσωπευθεί χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο μέτρο, το οποίο εκφράζεται ως p-value ή στατιστικό επίπεδο σημαντικότητας. Έτσι λοιπόν, η στατιστική σημαντικότητα ενός αποτελέσματος είναι η πιθανότητα η παρατηρηθείσα σχέση (π.χ., μεταξύ των μεταβλητών) ή η διαφορά (π.χ., μεταξύ των μέσων) σε ένα δείγμα να εμφανίστηκε από καθαρή τύχη και ότι στον πληθυσμό από τον οποίο το δείγμα προήλθε, καμία τέτοια σχέση ή διαφορά δεν υπάρχει. Η τιμή της p-value αντιπροσωπεύει έναν δείκτη της αξιοπιστίας ενός αποτελέσματος. Όσο υψηλότερη η p-value, τόσο λιγότερο μπορούμε να πιστέψουμε ότι η παρατηρηθείσα σχέση μεταξύ των μεταβλητών στο δείγμα είναι ένας αξιόπιστος δείκτης της σχέσης μεταξύ των αντίστοιχων μεταβλητών στον πληθυσμό. Για παράδειγμα, μια p-value του 0.05 (δηλ., 1/20) δείχνει ότι υπάρχει μια πιθανότητα 5% ότι η σχέση μεταξύ των μεταβλητών που βρίσκονται στο δείγμα μας να είναι "ψευδής". Σε πολλούς τομείς της έρευνας, η p-value του 0.05 είναι συνήθως η διαχωριστική γραμμή ως αποδεκτό "επίπεδο λάθους"(steinberg et al., 2001). Στην παρούσα μελέτη ένα μέρος της στατιστικής ανάλυσης των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με σύγκριση των συχνοτήτων με εφαρμογή του κριτηρίου χ 2. Το κριτήριο χ 2 χρησιμοποιείται για την εκτίμηση της απόκλισης ανάμεσα σε θεωρητικά αναμενόμενες συχνότητες και στις παρατηρούμενες. Το χ 2 υπολογίζεται από την εξίσωση: χ 2 = (Π-Α) 2 Α όπου Π είναι οι παρατηρούμενες τιμές και Α οι θεωρητικώς αναμενόμενες τιμές. Ουσιαστικά, αυτό που υπολογίζεται μέσω του χ 2, είναι η πιθανότητα (p) συμφωνίας των θεωρητικά αναμενόμενων τιμών με τις τιμές που παρατηρήθηκαν, για συγκεκριμένους βαθμούς ελευθερίας (Β.Ε.) κάθε φορά. Οι Β.Ε. εκφράζουν κατά πόσους τρόπους είναι δυνατόν να μεταβληθεί ένα σύστημα. Σαν επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε το 5%. Όταν η τιμή p που υπολογίζουμε είναι μικρότερη του επιπέδου σημαντικότητας 0,05, αυτό σημαίνει πως υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά των θεωρητικών και πραγματικών τιμών. 133

134 Για την εφαρμογή όμως του κριτηρίου χ 2 πρέπει να πληρούνται ορισμένες προυποθέσεις: i. Το συνολικό μέγεθος του δείγματος πρέπει να είναι συνήθως μεγαλύτερο του 50. ii. Λαμβάνονται υπ όψιν οι απόλυτες τιμές και όχι σχετικές, όπως π.χ. ποσοστά ή αναλογίες, για τον υπολογισμό του κριτηρίου χ 2. iii. Όλες οι τάξεις (ομάδες) ατόμων πρέπει συνήθως να έχουν μέγεθος μεγαλύτερο του 5. Στην περίπτωση της παρούσας μελέτης, η μέθοδος χ 2 χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση τιμών μεταξύ περισσότερων ομάδων κριτηρίων, δηλαδή για σύγκριση της συχνότητας των γονοτύπων μεταξύ δύο (ή τριών) ομάδων ατόμων (ή παρατηρήσεων). Για παράδειγμα για σύγκριση της συχνότητας των τριών γονοτύπων όσον αφορά έναν μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό (SNP), ομοζυγωτία για το αλληλόμορφο αγρίου τύπου, το μεταλλαγμένο, ή ετεροζυγωτία, ανάμεσα σε δύο ομάδες ατόμων, δηλαδή σε ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία (β-thalassemia major) και σε υγιή άτομα (controls). Στη περίπτωση αυτή, οι ομάδες των γονοτύπων χαρακτηρίζονται ως «τάξεις» και οι ομάδες των ατόμων ως «κλάσεις». Όταν λοιπόν μια μεταβλητή υποδιαιρείται σε περισσότερες από δυο τάξεις, τότε κατατάσσουμε τις τιμές σε πίνακα 2 Ν. Τάξη 1 Τάξη 2 Τάξη 3 Σύνολο Κλάση 1 α 1 β 1 γ 1 n 1 Κλάση 2 α 2 β 2 γ 2 n 2 Σύνολο N 1 N 2 N 3 N Ο υπολογισμός της τιμής χ 2 γίνεται από το άθροισμα των επιμέρους χ 2 για κάθε τάξη της μεταβλητής ως εξής: χ 2 = χ χ χ 3 2 όπου, χ 2 1 = (α 1 n 2 -α 2 n 1 ) 2 /n 1 n 2 N 1 χ 2 2 = (β 1 n 2 -β 2 n 1 ) 2 /n 1 n 2 N 2 χ 2 3 = (γ 1 n 2 -γ 2 n 1 ) 2 /n 1 n 2 N 3 134

135 Όταν οι προϋποθέσεις της μεθόδου χ 2 δεν πληρούνταν, τότε αυτή δεν εφαρμοζόταν. Στις περιπτώσεις αυτές χρησιμοποιήθηκε το Fisher exact probability test, το οποίο είναι ελεύθερα διαθέσιμο στο διαδίκτυο ( Το Fisher's exact test εφαρμόζεται κυρίως όταν το μέγεθος των δειγμάτων είναι μικρό και δεν μπορεί να εφαρμοστει γι αυτό το λόγο το κριτήριο χ 2. Θεωρείται «δοκιμασία ακριβείας», διότι η σημαντικότητα της απόκλισης από την «μηδενική υπόθεση» μπορεί να υπολογιστεί με ακρίβεια. Δεν βασίζεται σε μια ανακριβή προσέγγιση που γινεται ακριβής στο όριο καθώς το μέγεθος του δείγματος προσεγγίζει το άπειρο, όπως στα περισσότερα στατιστικά τέστ. Η τιμή p που προσδιορίζεται μέσω του Fisher's exact test, υπολογίζεται με τέτοιο τρόπο, ώστε τα κελιά του πίνακα να θεωρούνται προκαθορισμένα (σταθερά). Η υπεργεωμετρική κατανομή μέσω της οποίας υπολογίζεται η πιθανότητα (p, probability), σε έναν πίνακα 2x2 είναι: Τάξη 1 Τάξη 2 Σύνολο Κλάση 1 A B a + b Κλάση 2 C D c + d Σύνολο a + c b + d a+b+c+d (=n), όπου το είναι ο διωνυμικός συντελεστής (binomial coefficient) και το σύμβολο! υποδεικνύει τον παραγοντικό χειριστή (factorial operator). 135

136 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 136

137 Γ.1 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στη παρούσα μελέτη ερευνήθηκε η ύπαρξη πιθανής συσχέτισης μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP) εντός εσωνίων των γονιδίων PDE7B και MAP3K5 της 6q περιοχής με αυξημένα επίπεδα εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF), σε ασθενείς με μείζονα ή ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία και σε φυσιολογικά (μηθαλασσαιμικά) άτομα. Στόχος ήταν ο εντοπισμός ενδεικτικών για τη βαρύτητα των κλινικών συμπτωμάτων της νόσου πολυμορφισμών. Επιπρόσθετα, εξετάστηκε και ένα σύνολο ατόμων διπλά ετερόζυγων για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-μεσογειακή αναιμία (compound heterozygous SCD/βthalassemia), που είχαν υποστεί θεραπεία με υδροξυουρία (HU). Η γονοτύπηση για τα δείγματα αυτά έγινε μόνο για τα SNP που εντοπίζονται στο γονίδιο MAP3K5. Σε αυτή τη περίπτωση στόχος ήταν ο χαρακτηρισμός των συγκεκριμένων πολυμορφισμών ως φαρμακογονιδιωματικών δεικτών. Στην ενότητα που ακολουθεί παρουσιάζονται όλα τα πειραματικά αποτελέσματα που βρέθηκαν εφαρμόζοντας διαφορετικές μεθόδους γονοτύπησης για κάθε μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό (SNP). Γ.2 Ανάλυση πειραματικών δεδομένων και αποτελεσμάτων για κάθε μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό(snp) Γ.2.1 MAP3K5 γονίδιο Γ rs (T>C) Το SNP αυτό αναλύθηκε με PCR-RFLP. Ενδεικτικά δίνονται οι παρακάτω εικόνες από πήκτωμα αγαρόζης όπου ηλεκτροφορήθηκαν τα προϊόντα που προκύπτουν από κατάτμηση με την περιοριστική ενδονουκλεάση PvuII-HF. 137

138 Εικόνα 26.: Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης της PCR-RFLP για το rs (T>C) δειγμάτων DNA ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία. M=δείκτης μοριακών μεγεθών βήματος 50bp. Διαδρομές 1, 4, 6, 7, 9, 12, 13: ομόζυγοι για τον αγρίου τύπου γονότυπο (Τ/Τ). Διαδρομές 2, 3, 5, 8, 10, 11: ετερόζυγοι (T/C). Διαδρομή C: Ακατάτμητο προϊόν PCR. Εικόνα 27.: Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης της PCR-RFLP για το rs (T>C) δειγμάτων DNA ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία. M=δείκτης μοριακών μεγεθών βήματος 50bp. Διαδρομές 1, 4, 6: ομόζυγοι για τον αγρίου τύπου γονότυπο (Τ/Τ). Διαδρομές 2, 5: ετερόζυγοι (T/C). Διαδρομή 3: ομόζυγος για το σπάνιο (μεταλλαγμένο) αλληλόμορφο (C/C). Διαδρομή 7: Ακατάτμητο προϊόν PCR. 138

139 Εικόνα 28.: Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης της PCR-RFLP για το rs (T>C) δειγμάτων DNA ασθενών με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία. M=δείκτης μοριακών μεγεθών βήματος 50bp. Διαδρομές 2, 4, 5, 6: ομόζυγοι για τον αγρίου τύπου γονότυπο (Τ/Τ). Διαδρομές 1, 3, 7, 8, 9, 10, 11: ετερόζυγοι (T/C). Διαδρομή 12: Ακατάτμητο προϊόν PCR. Πίνακας 3.: Συχνότητες γονοτύπων για τις τρείς ομάδες ατόμων για το SNP rs (T>C). Δείγματα Μείζων β- μεσογειακή αναιμία Ενδιάμεση β- μεσογειακή αναιμία Γονότυποι T/T T/C C/C 0,4347 0,4456 0,1195 0,3636 0, Υγιείς 0,4395 0,4285 0,1318 Πίνακας 4.: Συχνότητες αλληλομόρφων για τις τρείς ομάδες ατόμων για το SNP rs (T>C). Δείγματα Αλληλόμορφα T C Μείζων β-μεσογειακή αναιμία 0,6576 0,3423 Ενδιάμεση β-μεσογειακή 0,6818 0,3181 αναιμία Υγιείς 0,6538 0,

140 T/T C/T C/C Υγιείς β-μείζονες β-ενδιάμεσοι Εικόνα 29.: Συχνότητες (%) για τους γονοτύπους στις τρείς ομάδες ατόμων για το rs (t>c). Στη συγκεκριμένη περίπτωση για την εύρεση της στατιστικής σημαντικότητας δεν ήταν δυνατόν να εφαρμοστεί το κριτήριο του χ 2, κυρίως λόγω του σχετικά περιορισμένου πλήθους δειγμάτων των ασθενών με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία. Έτσι χρησιμοποιήθηκε το Fisher s exact test για τον προσδιορισμό της τιμής p. Συγκρίνοντας τα στατιστικά δεδομένα μεταξύ ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και υγιών ατόμων, η τιμή της μεταβλητής υπολογστηκε, p=0,96. Η τιμή αυτή είναι μεγαλύτερη από την τιμή 0.05, συνεπώς δεν προκύπτει κάποιο στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα. Παρόλα αυτά, αξιοσημείωτη είναι η έλλειψη ενός από τους τρείς γονοτύπους, δηλαδή του ομόζυγου για στο σπάνιο αλληλόμορφο (C/C) από την ομάδα των ασθενών με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία. 140

141 Ανταποκρινόμενοι (>20% HbF επίπεδα) για το rs % 15% T/T T/C C/C 46% Μη-ανταποκρινόμενοι (<20% HbF επίπεδα) για το rs % 0% 23% T/T T/C C/C Εικόνα 30.: 38 δείγματα ασθενών που έλαβαν θεραπεία με HU υπέστησαν γονοτύπηση για το SNP rs ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για β-μεσογειακή/δρεπανοκυτταρική αναιμία χαρακτηρίστηκαν ως «ανταποκρινόμενοι» και 22 χαρακτηρίστηκαν ως «μη-ανταποκρινόμενοι». Για 3 δείγματα δεν κατέστη δυνατή η γονοτύπηση. Πίνακας 5.: Συχνότητες γονοτύπων για τις δύο ομάδες ατόμων, «αναποκρινόμενοι» και «μη-ανταποκρινόμενοι», για το SNP rs (T>C). Δείγματα Γονότυποι T/T T/C C/C Ανταποκρινόμενοι 0,4615 0,3846 0,1538 Μηανταποκρινόμενοι 0,2272 0, Πίνακας 6.: Συχνότητες αλληλομόρφων για τις δύο ομάδες ατόμων, «αναποκρινόμενοι» και «μη-ανταποκρινόμενοι» για το SNP rs (T>C). Δείγματα Αλληλόμορφα Ανταποκρινόμενοι 0,6538 0,3461 T C Μη-ανταποκρινόμενοι 0,6136 0,3863 Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα, ο ομόζυγος γονότυπος για το σπάνιο (μεταλλαγμένο) αλληλόμορφο (C/C), απουσίαζε από την ομάδα των «μηανταποκρινόμενων» ασθενών, ενώ παρατηρήθηκε με συχνότητα περίπου 15% στην ομάδα των «ανταποκρινόμενων» ασθενών. Τα ευρήματά μας σε σχέση με την διπλή 141

142 ετερόζυγο κατάσταση για β-μεσογειακή/δρεπανοκυτταρική αναιμία (compound SCD/β-thalassemia) υποστηρίζουν την ύπαρξη μιας ισχυρής συσχέτισης για το rs με την ανταπόκριση στην θεραπεία με HU, με βάση την αύξηση των επιπέδων HbF στην ομάδα των «ανταποκρινόμενων» ασθενών. Η τιμή p στη σύγκριση μεταξύ των δύο αυτών ομάδων υπολογίστηκε με Fisher s exact test (2x3) ως, p=0,026, συνεπώς το αποτέλεσμα θεωρείται πράγματι στατιστικά σημαντικό. Γ rs (A>C) Το SNP αυτό αναλύθηκε με αλληλούχηση (sequencing). Ενδεικτικά δίνονται οι παρακάτω εικόνες χρωματογραφίας από αλληλούχηση. Εικόνα 31.: Αλληλούχηση (sequencing) για το SNP rs (A>C) σε δείγμα ασθενούς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία. Η αλληλούχηση εκτελέστηκε με τον αντίστροφο εκκινητή. Το συγκεκριμένο δείγμα έχει ετερόζυγο γονότυπο A/C. Εικόνα 32.: Αλληλούχηση (sequencing) για το SNP rs (A>C) σε δείγμα υγιούς ατόμου. Η αλληλούχηση εκτελέστηκε με τον αντίστροφο εκκινητή. Το συγκεκριμένο δείγμα έχει ομόζυγο γονότυπο A/A. 142

143 Πίνακας 7.: Συχνότητες γονοτύπων για τις τρείς ομάδες ατόμων για το SNP rs (Α>C). Δείγματα Μείζων β- μεσογειακή αναιμία Ενδιάμεση β- μεσογειακή αναιμία Γονότυποι Α/Α Α/C C/C 0,3846 0,4615 0,1538 0,3636 0, Υγιείς 0,3861 0,4851 0,1287 Πίνακας 8.: Συχνότητες αλληλομόρφων για τις τρείς ομάδες ατόμων για το SNP rs (Α>C). Δείγματα Αλληλόμορφα Α C Μείζων β-μεσογειακή αναιμία 0,6153 0,3846 Ενδιάμεση β-μεσογειακή 0,6818 0,3181 αναιμία Υγιείς 0,6287 0,3712 Α/Α A/C C/C Υγιείς β-μείζονες β-ενδιάμεσοι Εικόνα 33.: Συχνότητες (%) για τους γονοτύπους στις τρείς ομάδες ατόμων για το rs (A>C)

144 Για τον προσδιορισμό της τιμής του «p-value» χρησιμοποιήθηκε το Fisher s exact test, σε πίνακα 2x3. Συγκρίνοντας τα στατιστικά δεδομένα μεταξύ ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και υγιών ατόμων, η τιμή της μεταβλητής υπολογίστηκε, p=0,873. Η τιμή αυτή είναι μεγαλύτερη από την τιμή 0.05, συνεπώς δεν προκύπτει κάποιο στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα. Αξιοσημείωτη είναι και σε αυτή την περίπτωση η έλλειψη ενός από τους τρείς γονοτύπους, δηλαδή του ομόζυγου για στο σπάνιο αλληλόμορφο (C/C) από την ομάδα των ασθενών με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία. Η γονοτύπηση για την ομάδα των ασθενών διπλά ετερόζυγων για β- μεσογειακή/δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD/β-thalassemia patients) για το rs έγινε με αλληλούχηση (sequencing) και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται παρακάτω. Ανταποκρινόμενοι (>20% HbF επίπεδα) για το rs Μη-ανταποκρινόμενοι (<20% HbF επίπεδα) για το rs % 21% A/A A/C C/C 50% 83% 0% 17% A/A A/C C/C Εικόνα 34.: 38 δείγματα ασθενών που έλαβαν θεραπεία με HU υπέστησαν γονοτύπηση για το SNP rs ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για β-μεσογειακή/δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD/βthalassemia) χαρακτηρίστηκαν ως «ανταποκρινόμενοι» και 23 χαρακτηρίστηκαν ως «μηανταποκρινόμενοι». Για ένα δείγμα δεν κατέστη δυνατή η γονοτύπηση. Πίνακας 9.: Συχνότητες γονοτύπων για τις δύο ομάδες ατόμων, «αναποκρινόμενοι» και «μηανταποκρινόμενοι», για το SNP rs (Α>C). Δείγματα Γονότυποι Α/Α Α/C C/C Ανταποκρινόμενοι 0,5 0,2142 0,2857 Μηανταποκρινόμενοι 0,1739 0,