ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΑΛΛΑΓΩΝ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ASS1 ΚΑΙ NOS2A ΣΤΗΝ ΑΥΞΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΗΣ ΕΜΒΡΥΙΚΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΕΛΛΗΝΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ Β-ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗ ΤΟΥΣ ΣΤΗΝ ΥΔΡΟΞΥΟΥΡΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΤΑΒΙΑΝΑΤΟΥ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ-ΓΕΡΑΣΙΜΟΥΛΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ, ΙΟΥΝΙΟΣ

2 2

3 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γεώργιος Π. Πατρινός Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακευτικής Βιοτεχνολογίας και Φαρμακογονιδιωματικής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κωνσταντίνος Πουλάς Αναπληρωτής Καθηγητής Βιοχημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Γενικής Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 3

4 4

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα ερευνητική εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης, για την ολοκλήρωση του κύκλου σπουδών του Μεταπτυχιακού Προγράμματος στις «Φαρμακευτικές Επιστήμες και την Τεχνολογία» του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Το πειραματικό μέρος πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας (ΕΜΒΙΑ) κατά τα ακαδημαϊκά έτη , υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή Γεώργιου Πατρινού. Με την ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τον επιβλέποντα καθηγητή μου, κ. Γεώργιο Πατρινό, αναπληρωτή καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής, για την ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω τη διπλωματική μου εργασία στο ΕΜΒΙΑ και να ασχοληθώ με ένα τόσο ενδιαφέρον θέμα, την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, καθώς και την πολύτιμη καθοδήγησή του κατά τη διάρκεια διεξαγωγής της συγκεκριμένης εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Κωνσταντίνο Πουλά, αναπληρωτή καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής και την κα Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου, αναπληρώτρια καθηγήτρια του τμήματος Ιατρικής, που δέχτηκαν να συμμετάσχουν στην εξεταστική επιτροπή, καθώς και για τη συνεργασία τους. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στη μεταδιδακτορική ερευνήτρια Δρ. Θεοδώρα Κατσίλα, για τις πολύτιμες συμβουλές της, τις γνώσεις και την εμπειρία που μου προσέφερε, καθώς και τη στήριξή της, τόσο σε πρακτικό, όσο και ψυχολογικό επίπεδο. Επιπροσθέτως, θα ήθελα να ευχαριστήσω τις συνεργάτιδες, αλλά και φίλες Κατερίνα Γραβιά και Βασιλική Χονδρού, για την καθοδήγηση και την εμπειρία που μου προσέφεραν, την ηθική συμπαράσταση και τις συμβουλές τους για την αντιμετώπιση κάθε δυσκολίας. Ακόμη, ευχαριστώ πάρα πολύ τους: Αγγελική Μπαλασοπούλου, Ασπασία Σκαρπαθιώτη, Κωνσταντίνα Χαλικιοπούλου, Αλεξάνδρα Κολλιοπούλου και Αποστόλη Στρατόπουλο για το ευχάριστο και φιλικό κλίμα συνεργασίας που επικρατούσε στο εργαστήριο, τις ενδιαφέρουσες ιδέες και τις γνώσεις που μου μετέδωσαν. Επίσης, τους Σταυρούλα Σιαμόγλου και Βαγγέλη Μουρδουκούτα για την άριστη συνεργασία. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα υπόλοιπα μέλη του ΕΜΒΙΑ για τη συνεργασία και το φιλικό κλίμα. Τέλος, ευχαριστώ την οικογένεια και τους φίλους μου, που στάθηκαν δίπλα μου όλο αυτό το διάστημα και χωρίς τους οποίους δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί η παρούσα εργασία. Τους ευχαριστώ για τη βοήθεια, την αγάπη, την υποστήριξη και την υπομονή τους. 5 Ταβιανάτου Αναστασία-Γερασιμούλα, Πάτρα, Ιούλιος 2015

6 6

7 7

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη 11 Abstract...12 Α. Εισαγωγή...13 Α.1 Αιμοσφαιρίνη: δομή, λειτουργία, μορφές.15 Α.2 Γονίδια σφαιρινών του ανθρώπου..17 Α.2.1 Δομή και οργάνωση γονιδίων των σφαιρινών...17 Α.2.2 Έκφραση γονιδίων των σφαιρινών κατά την οντογένεση..18 Α.2.3 Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος της β σφαιρίνης 20 Α.3 Αιμοσφαιρινοπάθειες..23 Α.3.1 β-θαλασσαιμία (β- Μεσογειακή αναιμία)..24 Α Μοριακή βάση της β θαλασσαιμίας Α Τύποι της ασθένειας και παθοφυσιολογία...27 A.3.2 Δρεπανοκυτταρική αναιμία 29 Α Μοριακή βάση της Δρεπανοκυτταρικής αναιμίας..30 Α Τύποι της ασθένειας και παθοφυσιολογία...30 Α.4 Θεραπευτικές προσεγγίσεις...32 Α.5 Φαρμακογονιδιωματική.35 A.5.1 Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)..35 Α.5.2 Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί που πιθανόν σχετίζονται με την ρύθμιση των επιπέδων της HbF 36 A.5.3 Το γονίδιο ASS1 38 Α rs (A>G)..39 Α.5.4 Το γονίδιο NOS2A.39 Α rs (C>T) 40 A rs (G>A)...41 Α.6 Σκοπός της εργασίας

9 Β. Υλικά και Μέθοδοι..43 B.1 Δείγματα γενετικού υλικού (DNA)...45 Β.2 Απομόνωση DNA (ολικό αίμα).45 Β.3 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA..47 Β.4 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR) 47 Β.4.1 Βασική αρχή της μεθόδου..47 Β PCR Gradient..48 B PCR ARMS (Amplification Refractory Mutation System) με τρεις εκκινητές..50 B.4.2 Σχεδιασμός εκκινητών (primers) 50 B Σχεδιασμός εκκινητών για απλή PCR.50 Β Σχεδιασμός εκκινητών για PCR ARMS(τριπλέτα).51 B.4.3 Πρωτόκολλο και αντιδραστήρια PCR 52 Β Πρωτόκολλο γονοτύπησης του rs (NOS2A)...53 B Πρωτόκολλο γονοτύπησης του rs (NOS2A).. 54 B.4.4 PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism), Γονοτύπηση με κατάτμηση PCR προϊόντων με περιοριστικές ενδονουκλεάσες..56 Β PCR-RFLP ανάλυση για τον rs (ASS1).57 B.4.5 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 59 Β.5 Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας μορίων DNA με τη μέθοδο αλληλούχησης κατά Sanger (Sanger sequencing)...60 Β.5.1 Πρωτόκολλο καθαρισμού PCR προϊόντων 60 Β.6 Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων 61 Γ. Αποτελέσματα 63 Γ.1 Ανάλυση πειραματικών δεδομένων για κάθε μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό 65 Γ.1.1 rs (ASS1)...65 Γ.1.2 rs (NOS2A)..69 9

10 Γ.1.3 rs (NOS2A)...72 Δ. Συζήτηση 75 Δ.1 Συμπεράσματα-Συζήτηση...77 Δ.2 Συμπεράσματα-Μελλοντικές προοπτικές..79 Ε. Βιβλιογραφία.81 10

11 Περίληψη Οι αιμοσφαιρινοπάθειες, ιδιαίτερα η δρεπανοκυτταρική αναιμία και η β- θαλασσαιμία, αποτελούν δύο από τις πιο κοινές μονογονιδιακές ασθένειες, με παγκόσμιo επιπολασμό. Σήμερα, δεν υπάρχουν αποτελεσματικές προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση και θεραπεία των ασθενειών αυτών. Η επαγωγή της έκφρασης της γ-σφαιρίνης φαίνεται να αποτελεί ελπιδοφόρα θεραπευτική προσέγγιση, με ικανοποιητικά αποτελέσματα για την κλινική εικόνα των ασθενών (Gravia et al, 2014). Μια από τις ενώσεις με ικανότητα επαγωγής της γ-σφαιρίνης είναι η υδροξυουρία, η οποία, όμως, δεν επιφέρει τα ίδια ικανοποιητικά αποτελέσματα για όλους τους ασθενείς. Κάποιοι ασθενείς ανταποκρίνονται ικανοποιητικά στη χορήγηση του φαρμάκου και παρουσιάζουν αυξημένα ποσοστά εμβρυικής αιμοσφαιρίνης (HbF), άλλοι παρουσιάζουν μικρότερη αύξηση της HbF, ενώ μια τρίτη κατηγορία δεν ανταποκρίνεται καθόλου στη συγκεκριμένη θεραπεία (Banan,2013). Έχουν πραγματοποιηθεί αρκετές μελέτες για να ερμηνευτεί το γεγονός αυτό. Η μελέτη του Ma και των συνεργατών του το 2007, υπέδειξε αρκετούς πολυμορφισμούς σε γονίδια εκτός του γονιδιακού τόπου των γονιδίων της β-σφαιρίνης, οι οποίοι παρουσίαζαν σημαντική συσχέτιση με την αύξηση των επιπέδων της HbF και την ανταπόκριση στη θεραπεία με υδροξυουρία (Ma et al,2007). Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος τριών μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών: rs (ASS1), rs (NOS2A) και rs (NOS2A) στην αύξηση των επιπέδων της εμβρϋικής αιμοσφαιρίνης ή/και την ανταπόκριση στην υδροξυουρία Ελλήνων ασθενών με β-θαλασσαιμία. Ως μέθοδοι γονοτύπησης χρησιμοποιήθηκαν οι PCR-RFLP και PCR-ARMS, ενώ η προτύπωση των μεθοδολογιών έλαβε χώρα με αλληλούχηση κατά Sanger. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, κανένας από τους υπό μελέτη πολυμορφισμούς των γονιδίων ASS1 και NOS2A δεν φαίνεται να συσχετίζεται με την αύξηση των επιπέδων της εμβρϋικής αιμοσφαιρίνης ή/και την ανταπόκριση στην υδροξυουρία Ελλήνων ασθενών με β-θαλασσαιμία. 11

12 Abstract Hemoglobinopathies, particularly sickle cell disease and β-thalassemia, are two of the most common single-gene disorders worldwide. Nowadays, notwithstanding, there are not many truly effective therapeutic approaches available. The induction of gamma globin induction seems to be a promising approach, as it is able to improve patients health condition (Gravia et al, 2014). Certain drugs, such as hydroxyurea, can induce fetal hemoglobin (HbF) production. However, hydroxyurea is not always effective. Some patients are characterized as good responders to hydroxyurea, as their health condition is really improved and HbF levels are significantly increased after this treatment. Other patients are characterized as minor responders as their health condition is not significantly improved and HbF levels show a modest increase. Moreover, there are patients that do not respond to the treatment at all ( non responders ) (Banan, 2013). According to Ma et al, there are plenty of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes that are located outside the beta globin gene locus and can be significantly associated with increased levels of HbF as well as drug response (hydroxyurea treatment). The aim of this study was to investigate the association of three SNPs, namely rs (ASS1), rs (NOS2A) and rs (NOS2A) with the increased levels of HbF and/or hydroxyurea response. For this purpose, samples from (i) β-thalassemia major patients, (ii) non-transfusion dependent β- thalassemia patients, (iii) sickle cell disease/non-transfusion dependent β thalassemia patients upon hydroxyurea treatment and (iv) healthy donors were analyzed. Genotyping was carried out by PCR-RFLP, PCR ARMS and Sanger sequencing. Our findings imply that neither of the three SNPs of interest were found to be associated either with the increase of HbF levels and/or hydroxyurea response to treatment. 12

13 Α. Εισαγωγή 13

14 14

15 Α.1 Αιμοσφαιρίνη: Δομή, λειτουργία, μορφές Το αίμα στα σπονδυλωτά αποτελείται από κύτταρα (ερυθροκύτταρα και λευκοκύτταρα) που αιωρούνται στο πλάσμα και αιμοπετάλια, τα οποία είναι κυτταρικά θραύσματα. Τα συστατικά του αίματος έχουν διακριτούς ρόλους: τα ερυθροκύτταρα (το 99% των κυττάρων του αίματος) μεταφέρουν οξυγόνο στους ιστούς, τα λευκοκύτταρα αποσκοπούν στην προστασία του οργανισμού από μολύνσεις, ενώ τα αιμοπετάλια συμβάλλουν στην πήξη του αίματος. Τα ερυθροκύτταρα έχουν σχήμα αμφίκοιλου δίσκου. Το σχήμα και το μικρό τους μέγεθος (διάμετρο 6-8 μm και πάχος 2 µm) τους προσδίδει μια υψηλή αναλογία επιφάνειας προς όγκο, ώστε το οξυγόνο και το διοξείδιο του άνθρακα να μπορούν να διαχέονται γρήγορα από και προς το εσωτερικό του κυττάρου. Σημείο παραγωγής των ερυθροκυττάρων είναι ο μυελός των οστών. Καθώς πραγματοποιείται η κυτταρική διαφοροποίηση, τα πρόδρομα ερυθροκύτταρα παράγουν αιμοσφαιρίνη και στη συνέχεια, χάνουν τους πυρήνες και τα οργανίδιά τους, διατηρώντας λίγα ριβοσώματα (δικτυοερυθροκύτταρα). Η απώλεια των ριβοσωμάτων από τα δικτυοερυθροκύτταρα, εν τέλει, οδηγεί στα ώριμα ερυθροκύτταρα, τα οποία θα εισέλθουν στη συστεμική κυκλοφορία (Vender et al, 2011). Η αιμοσφαιρίνη αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη των ερυθροκυττάρων του αίματος των σπονδυλωτών. Η δομή της προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της κρυσταλλογραφίας με ακτίνες χ από τον Max Perutz το 1959.Είναι ένα τετραμερές μόριο, που αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, ανά δύο όμοιες (δύο α και δύο β). Κάθε μία από τις τέσσερις υπομονάδες της σχηματίζεται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα, τη σφαιρίνη και μια προσθετική ομάδα, την αίμη (εικόνα 1). Εικόνα 1: η δομή της ανθρώπινης αιμοσφαιρίνης (Προσαρμογή από: 15

16 Η αίμη, η δομή της οποίας φαίνεται στην εικόνα 2, αποτελείται από ένα άτομο σιδήρου, το οποίο είναι υπεύθυνο για τη δέσμευση του οξυγόνου και εντοπίζεται στο κέντρο ενός μεγάλου ετεροκυκλικού οργανικού δακτυλίου, που ονομάζεται πορφυρίνη. Η πορφυρίνη που εντοπίζεται σε όλες τις μορφές αιμοσφαιρινών, είναι η πρωτοπορφυρίνη I.X και προσδίδει το ερυθρό χρώμα στην αιμοσφαιρίνη. Η πρωτοπορφυρίνη αποτελείται από τέσσερις πυρρολικούς δακτυλίους. Το άτομο του σιδήρου βρίσκεται στο κέντρο της πρωτοπορφυρίνης ενωμένο με τα τέσσερα πυρρολικά άτομα αζώτου και υπό κανονικές συνθήκες, είναι στην κατάσταση οξείδωσης (Fe 2+ ). Εικόνα 2: η δομή της αίμης (Προσαρμογή από: Κατά τα διάφορα στάδια της ζωής του ο άνθρωπος, παράγει διαφορετικούς τύπους αιμοσφαιρίνης, ωστόσο, με παρόμοια τετραμερή δομή. Κάθε μορφή αποτελείται από δύο αλυσίδες α-σφαιρίνης (α-like) και δύο αλυσίδες μη-α (non-α). H αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων είναι η αιμοσφαιρίνη Α (HbA) και αποτελείται από δύο α- και δύο β-πολυπεπτιδικές αλυσίδες (α 2 β 2 ). Οι τέσσερις αλυσίδες αναδιπλώνονται και συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας ένα σφαιρικό τετραμερές μόριο. Οι δύο αλυσίδες-α έχουν σχεδόν το ίδιο μήκος με τις αλυσίδες-β: οι αλυσίδες-α αποτελούνται από 141 αμινοξέα, ενώ οι αλυσίδες-β από 146. Οι αλυσίδες αυτές εμφανίζουν σημαντική ομοιότητα, τόσο ως προς την αμινοξική τους ακολουθία (πρωτοταγής δομή), όσο και ως προς την τρισδιάστατη διαμόρφωσή τους (τριτοταγής δομή). Όλα τα ενήλικα άτομα διαθέτουν ένα μικρό ποσό (>3%) της αιμοσφαιρίνης HbA 2 (α 2 δ 2 ). Η δ σφαιρίνη διαφέρει από τη β μόνο ως προς τη θέση δέκα αμινοξέων. Μια άλλη σημαντική αιμοσφαιρίνη είναι η εμβρυική αιμοσφαιρίνη HbF (α 2 γ 2 ) που συνιστά το 70% της αιμοσφαιρίνης κατά τη γέννηση. Ένα μικρό ποσό (>2%) της 16

17 αιμοσφαιρίνης αυτής παρατηρείται και στα ενήλικα άτομα. Οι αλυσίδες των α- σφαιρινών στις HbA, HbA 2 και HbF είναι όμοιες, ενώ η γ-σφαιρίνη διαφέρει σημαντικά από τις σφαιρίνες α και β. Υπάρχουν δύο τύποι γ-αλυσίδων σφαιρίνης με παρόμοιες ιδιότητες, που διαφέρουν ως προς το αμινοξύ που φέρουν στη θέση 136. Οι αλυσίδες Αγ φέρουν το αμινοξύ αλανίνη στη θέση αυτή, ενώ οι αλυσίδες Gγ το αμινοξύ γλυκίνη στην ίδια θέση. Επιπλέον, υπάρχει ένας τρίτος τύπος γ σφαιρίνης που φέρει το αμινοξύ θρεονίνη, αντί για ισολευκίνη στη θέση 75. Αυτή η αλυσίδα εμφανίζεται σε συχνότητα 40% και αποτελεί πολυμορφισμό στον ανθρώπινο πληθυσμό. Υπάρχουν ακόμη οι εξής τρεις αιμοσφαιρίνες, χαρακτηριστικές της εμβρυικής και της εμβρυονικής ανάπτυξης: η Hb Gower 1 (ζ 2 ε 2 ), η Hb Gower 2 (α 2 ε 2 ) και η Hb Portland (ζ 2 γ 2 ). Οι ζ και ε αλυσίδες εξαφανίζονται μετά το πέρας των 8-10 εβδομάδων από την έναρξη της ζωής του εμβρύου. Σημειώνεται πως η ενήλικη αιμοσφαιρίνη μπορεί να εντοπιστεί στα έμβρυα στο στάδιο των 6-8 εβδομάδων (Patrinos and Antonarakis, 2010). Α.2 Γονίδια σφαιρινών του ανθρώπου Α.2.1 Δομή και οργάνωση γονιδίων των σφαιρινών Στον άνθρωπο τα γονίδια των σφαιρινών βρίσκονται τοποθετημένα σε πολυγονιδιακά συμπλέγματα (multigene clusters), τα α-like και β-like συμπλέγματα σφαιρινών. Αυτός ο τύπος γονιδιακής οργάνωσης είναι συνήθης στα θηλαστικά. Το α-γονιδιακό σύμπλεγμα βρίσκεται στο βραχύ σκέλος του 16 ου χρωμοσώματος. Το σύμπλεγμα αυτό περιλαμβάνει με κατεύθυνση 5-3 το εμβρυονικό γονίδιο HBZ, που κωδικοποιεί τη ζ αλυσίδα, το ψευδογονίδιο HBZP, τα δύο ψευδογονίδια HBAP 2 και HBAP 1, τα λειτουργικά γονίδια HBA 2 και HBA 1 (α 2 και α 1 ) και το HBQ 1 ή γονίδιο θ, του οποίου η λειτουργία δεν είναι ακόμη γνωστή. Τα δύο γονίδια-α είναι παρόμοια μεταξύ τους και κωδικοποιούν τις αλυσίδες-α που είναι απαραίτητες για τη σύσταση των αιμοσφαιρινών των ενήλικων ατόμων HbA και HbA 2, της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF, καθώς και της εμβρυονικής αιμοσφαιρίνης Hb Gower 2. Αυτός ο γονιδιακός τόπος βρίσκεται κάτω από το ρυθμιστικό έλεγχο του ενισχυτή της α-σφαιρίνης, HS-40. Το β-γονιδιακό σύμπλεγμα εδράζεται στο βραχύ σκέλος του 11 ου χρωμοσώματος. Στο σύμπλεγμα αυτό περιλαμβάνονται τα εξής γονίδια: το ΒΗΕ που κωδικοποιεί την εμβρυονική σφαιρίνη ε, τα HBG 2 ( G γ) και HBG 1 ( A γ), που κωδικοποιούν την εμβρυική αιμοσφαιρίνη HbF, το β ψευδογονίδιο ΗΒΒΡ, το HBD (γονίδιο δ), που κωδικοποιεί τη δ-σφαιρίνη και το ΗΒΒ (γονίδιο β), που κωδικοποιεί τη β-σφαιρίνη. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, η σωστή έκφραση αυτών των γονιδίων ελέγχεται από την περιοχή ελέγχου του γενετικού τόπου της β σφαιρίνης, LCR (locus control region).τα α και β γονιδιακά συμπλέγματα φαίνονται στην εικόνα 3 (Patrinos et al, 2005). 17

18 Τα γονίδια των αιμοσφαιρινών έχουν πολλές λειτουργικές ομοιότητες στην οργάνωσή τους. Συγκεκριμένα, καθένα από τα γονίδια αυτά διαθέτει τρία εξόνια. Μεταξύ του πρώτου και του δεύτερου εξονίου, όπως και μεταξύ του δεύτερου και του τρίτου εξονίου υπάρχουν παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες (ιντρόνια), IVS-I και IVS-II (Patrinos and Antonarakis, 2010). Εικόνα 3: Τα β- και α-γονιδιακά συμπλέγματα (Προσαρμογή από: Α.2.2 Έκφραση γονιδίων των σφαιρινών κατά την οντογένεση Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης στον άνθρωπο παράγονται διαφορετικοί τύποι αιμοσφαιρινών. Η σειρά με την οποία βρίσκονται τοποθετημένα τα γονίδια των αιμοσφαιρινών σε καθένα από τα δύο γονιδιακά συμπλέγματα συμπίπτει με τη σειρά της οντογενετικής έκφρασης των γονιδίων αυτών και της παραγωγής του αντίστοιχου τύπου αιμοσφαιρίνης (εικόνα 4). Καθώς εναλλάσσονται τα αναπτυξιακά στάδια, ο αιμοποιητικός ιστός από τον οποίο παράγονται οι διαφορετικοί τύποι αιμοσφαιρίνης που κυριαρχούν σε κάθε στάδιο μεταβάλλεται. Στον άνθρωπο, λοιπόν, η ερυθροποίηση ξεκινά από τον λεκιθικό σάκο, όπου παράγονται οι α-, ζ- και ε-σφαιρίνες. Στη συνέχεια και μετά το πέρας πέντε εβδομάδων κύησης, η ερυθροποίηση πραγματοποιείται στο ήπαρ του εμβρύου, όπου συντίθενται μεγάλες ποσότητες α- και γ-αλυσίδων σφαιρίνης. Το ήπαρ παραμένει ο κύριος ερυθροποιητικός ιστός μέχρι την εικοστή εβδομάδα της κύησης. Κατά την παιδική ηλικία, αλλά και αργότερα κατά την ενήλικη ζωή, οι α-, β- και δ-αλυσίδες σφαιρίνης παράγονται στο μυελό των οστών και τον σπλήνα, που σταδιακά μετατρέπονται σε κύριους ιστούς αιμοποίησης (Patrinos and Antonarakis,2010). 18

19 Αναλυτικότερα, οι εμβρυονικές αιμοσφαιρίνες Gower 1 (ε 2 ζ 2 ), Gower 2 (α 2 ε 2 ) και Portland 1 (γ 2 ζ 2 ) αποτελούν τις αιμοσφαιρίνες του εμβρύου κατά τα πρώτα αναπτυξιακά στάδια. Οι αιμοσφαιρίνες αυτές αντικαθίστανται σταδιακά από την εμβρυική αιμοσφαιρίνη HbF (α 2 γ 2 ). Ενδεικτικά, σε έμβρυο 10 εβδομάδων η αιμοσφαιρίνη Portland 1 ανιχνεύεται σε ποσοστό μέχρι και 20% της συνολικής αιμοσφαιρίνης του εμβρύου, ενώ από τη δέκατη εβδομάδα και μετά, η HbF αποτελεί το 90% της συνολικής αιμοσφαιρίνης του εμβρύου (διατηρείται στα επίπεδα αυτά μέχρι το τέλος της κύησης). Μετά τη γέννηση, τα επίπεδα της HbF μειώνονται απότομα στο 2-3%. Σε διάστημα δέκα μηνών από τη γέννηση, η παραγωγή της HbF πραγματοποιείται αποκλειστικά από έναν συγκεκριμένο πληθυσμό ερυθροκυττάρων, τα κύτταρα F. Τα επίπεδα της HbF, καθώς και των κυττάρων F, καθορίζονται γενετικά και ο αριθμός τους ποικίλει στους ενήλικες διαφορετικών πληθυσμών. Η κύρια αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων, HbA (α 2 β 2 ), ανιχνεύεται στα έμβρυα από την 6 η εβδομάδα της κύησης σε ποσοστό 5-10% της συνολικής αιμοσφαιρίνης. Μετά τη γέννηση, αυξάνεται η παραγωγή, τόσο της HbA, όσο και της HbA 2 (α 2 δ 2 ). Η παραγωγή των δ-αλυσίδων ξεκινά την 6 η εβδομάδα της κύησης, μαζί με την παραγωγή των β-αλυσίδων. Η αιμοσφαιρίνη HbA 2 ανιχνεύεται σε ποσοστό 2,5-3% στα ενήλικα άτομα (Stamatoyannopoulos et al., 2001, Gravia et al., 2014). Εικόνα 4: α, οι αιμοσφαιρίνες και η έκφρασή τους στα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια στον άνθρωπο και β, διάγραμμα που απεικονίζει τη διαφορική έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών στον άνθρωπο κατά τα διάφορα αναπτυξιακά στάδια, καθώς και τη θέση ερυθροποίησης (Προσαρμογή από: Patrinos and Antonarakis, 2010) 19

20 Α.2.3 Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος της β- σφαιρίνης Κατά τη διάρκεια της εμβρυονικής και εμβρυικής ανάπτυξης πραγματοποιούνται δύο εναλλαγές στην έκφραση των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης: α) η έκφραση του γονιδίου ε και η παραγωγή των εμβρυονικών αιμοσφαιρινών ακολουθείται από την έκφραση των γονιδίων γ και την παραγωγή HbF κατά τη διάρκεια του πρώτου τριμήνου ζωής και β) η έκφραση των γονιδίων γ και η παραγωγή της HbF ακολουθείται από την έκφραση του γονιδίου β και την παραγωγή της HbA κοντά στη γέννηση. Η ρύθμιση των αλλαγών αυτών στο κατάλληλο αναπτυξιακό στάδιο ελέγχεται από ένα διπλό ρυθμιστικό μηχανισμό, που περιλαμβάνει τον ανταγωνισμό των γονιδίων για ενεργοποίηση από την περιοχή ελέγχου του γονιδιακού τόπου, LCR (locus control region) και την αποσιώπηση των γονιδίων που ήταν ενεργά κατά το προηγούμενο αναπτυξιακό στάδιο (Chen et al, 2008). Επιπρόσθετα, για τη ρύθμιση και την εναλλαγή της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης στο κατάλληλο αναπτυξιακό στάδιο είναι απαραίτητα συγκεκριμένα ρυθμιστικά στοιχεία. Τα στοιχεία αυτά μπορεί να είναι cis-ρυθμιστικά στοιχεία (ρυθμιστικά στοιχεία που βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα με το σύμπλεγμα) ή trans-ρυθμιστικά στοιχεία (στοιχεία που βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα, αλλά κωδικοποιούν παράγοντες που μπορούν να προσδεθούν σε συγκεκριμένες ρυθμιστικές αλληλουχίες του συμπλέγματος και να επηρεάσουν την έκφραση των γονιδίων). Τα cis-ρυθμιστικά στοιχεία μπορεί να είναι υποκινητές, ενισχυτές ή ανασταλτικά στοιχεία. Περιλαμβάνουν θέσεις πρόσδεσης για ερυθροειδικούς, αλλά και απλούς, μη εξειδικευμένους μεταγραφικούς παράγοντες, οι οποίοι αλληλεπιδρούν με άλλους συμπαράγοντες, ώστε να επιτευχθεί η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Κάθε γονίδιο του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης διαθέτει συγκεκριμένο μοτίβο θέσεων πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων: ένα TATA box και δύο χαρακτηριστικά μοτίβα το CCAAT box και το CACCC box (Patrinos and Antonarakis, 2010).Το σημαντικότερο στοιχείο που ρυθμίζει την έκφραση όλων των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης είναι η περιοχή ελέγχου του γονιδιακού τόπου, LCR. Η περιοχή αυτή, εδράζεται στο 5 άκρο του γονιδιακού τόπου των γονιδίων της β-σφαιρίνης, σε απόσταση περίπου 20kb από το εμβρυονικό γονίδιο ε. Αποτελείται από πέντε θέσεις (HS), υπερευαίσθητες στην έκθεση σε DNαση I. Κάθε μία από αυτές έχει μήκος bp και περιέχει μια περιοχή, τον πυρήνα, που είναι υπεύθυνη για τις δραστηριότητές της. Ο πυρήνας περιέχει θέσεις πρόσδεσης για ποικίλους ερυθροειδικούς, αλλά και ευρείας δράσης μεταγραφικούς παράγοντες. Η LCR δρα, είτε ως ενισχυτής της γονιδιακής έκφρασης (θέσεις HS2-4 με ισχυρότερο ενισχυτή τον HS-2), είτε ως μονωτής της γονιδιακής έκφρασης (θέση HS-5). Η θέση HS-1 δεν έχει γνωστή λειτουργία (Stamatoyannopoulos et al, 1993, Patrinos and Antonarakis, 2010). Η LCR ενεργοποιεί μεταγραφικά κάθε γονίδιο του συμπλέγματος ξεχωριστά, με πιο αποδεκτό τρόπο, το μοντέλο σχηματισμού χρωματινικής θηλειάς. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, σχηματίζεται χρωματινική θηλειά, μέσω της οποίας 20

21 έρχονται σε άμεση επαφή οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες που προσδένονται στην LCR με εκείνες που προσδένονται στον υποκινητή του γονιδίου που ενεργοποιείται μεταγραφικά κάθε φορά. Η απόσταση από την LCR επηρεάζει σημαντικά τη σειρά έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης κατά την ανάπτυξη. Πιο κοντά στην LCR βρίσκεται το εμβρυονικό γονίδιο ε, ακολουθούν τα εμβρυικά γονίδια γ και τέλος, τα γονίδια δ και β που εκφράζονται στους ενήλικες. Τα γονίδια είναι τοποθετημένα σε σειρά που αντιστοιχεί στη σειρά με την οποία εκφράζονται κατά την ανάπτυξη. Τα γονίδια ε και γ τελικά αποσιωπούνται, καθώς προχωρά η διαδικασία της ανάπτυξης, χάρη σε τοπικές ρυθμιστικές αλληλουχίες που δρουν στο κατάλληλο αναπτυξιακό στάδιο, όπως θα αναλυθεί παρακάτω (Suzuki et al, 2014). Τέλος, η LCR μπορεί να κατευθύνει το χρόνο της αντιγραφής με έναν αναπτυξιακά ειδικό τρόπο in vivo, με αποτέλεσμα η περιοχή της β-σφαιρίνης στον άνθρωπο να αντιγράφεται αργά στους περισσότερους κυτταρικούς τύπους, αλλά νωρίς στα ερυθροκύτταρα (Patrinos and Antonarakis, 2010). Άλλοι σημαντικοί παράγοντες για τη ρύθμιση των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης είναι οι εξής (εικόνα 5). Το σύμπλοκο DRED(direct repeat erythroid-definitive): αποτελείται από τους πυρηνικούς υποδοχείς TR2 και TR4. Καταστέλλουν την έκφραση των γονιδίων γ και ε σε ενήλικα άτομα. Σημειακή μετάλλαξη στα σημεία πρόσδεσής τους στον υποκινητή του γονιδίου της γ-σφαιρίνης οδηγεί σε αυτόνομη, αυξημένη σύνθεση της γ-σφαιρίνης σε ενήλικα άτομα. Η διαταραχή αυτή ονομάζεται «κληρονομική διατήρηση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης», HPFH (hereditary persistence of fetal hemoglobin) (Suzuki et al, 2014). Ο ερυθροειδικός μεταγραφικός παράγοντας GATA: αποτελεί βασικό παράγοντα για την ανάπτυξη και την τελική διαδικασία ωρίμανσης των ερυθροκυττάρων. Καταστέλλει τη μεταγραφή των γονιδίων γ στα ενήλικα άτομα, μέσω σύνδεσης στη μεταγραφική συσκευή άμεσα ή με τη βοήθεια άλλων πρωτεϊνικών παραγόντων, επηρεάζοντας την αλλαγή στη χρωματινική δομή της περιοχής, ρυθμίζοντας τη μεταγραφική δραστηριότητα του BCL11A (Horak et al, 2002). Επίσης, σχετίζεται με την αποσιώπηση του εμβρυονικού γονιδίου ε (Chen et al, 2008). Το γονίδιο MYB: κωδικοποιεί ένα μεταγραφικό παράγοντα που είναι κρίσιμος για τα βλαστικά και πρόγονα ερυθροποιητικά κύτταρα. Ρυθμίζει έμμεσα τη μεταγραφή των γονιδίων της γ-σφαιρίνης, μειώνοντας την παραγωγή των καταστολέων TR2/TR4 και BCL11A. Η αύξηση της δραστηριότητάς του οδηγεί στο σύνδρομο HPFH. Η αποδιοργάνωση της μεσογονιδιακής περιοχής των MYB και HBS1L οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων γ και ε (Suzuki et al, 2014). Ο παράγοντας BCL11A (B-cell lymphoma leukemia A): μεταγραφικός παράγοντας ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη των Β λεμφοκυττάρων. Καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης μέσω πρόσδεσης στη μεσογονιδιακή περιοχή μεταξύ τους, αλλά και στη θέση HS3 της LCR 21

22 (Tallacka and Perkinsa,2013). Επίσης, εμποδίζει την έκφραση των γ και ε γονιδίων, μέσω αλληλεπίδρασης με τον παράγοντα SOX6 ή κατά τον σχηματισμό συμπλόκου με την GATA-1 και άλλες πρωτεΐνες (Suzuki et al, 2014) ή δρώντας συνεργατικά με την LSD1, μέσω ενός συμπλόκου που περιλαμβάνει τον CoREST (repressor element-1 silencing factor co-repressor- 1) (Ginder, 2015). Ο παράγοντας KLF1 (erythroid Kruppel like factor): μεταγραφικός παράγοντας που συμβάλει στην αντικατάσταση των εμβρυικών γονιδίων γ από το γονίδιο β της HbA εντός του ενεργού χρωματινικού κόμβου (ACH) που σχηματίζεται μεταξύ της LCR και των γονιδίων που εκφράζονται κάθε φορά, σύμφωνα με το μοντέλο σχηματισμού θηλειάς. Επίσης, ο KLF1 διαδραματίζει καίριο ρόλο στη διαδικασία της ερυθροποίησης, που επάγεται λόγω στρες σε περιπτώσεις οξείας αναιμίας, οδηγεί στην αύξηση της παραγωγής ερυθροκυττάρων και σχετίζεται με την επαγωγή της HbF. Τέλος, ο εν λόγο παράγοντας ρυθμίζει το εύρος της ερυθροποίησης και επομένως, τα επίπεδα της HbF, ελέγχοντας τον κυτταρικό κύκλο (Tallacka and Perkinsa,2013). Τα micrornas: μικρά μόρια RNA, μήκους περίπου 20 νουκλεοτιδίων που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση. Στοχεύουν mrnas με σκοπό να τα οδηγήσουν στην καταστροφή ή να επάγουν την μεταφραστική καταστολή τους. Τα micrornas 23a και 27 οδηγούν στην καταστολή των μεταγραφικών παραγόντων KLF3 και SP1 αντίστοιχα, οι οποίοι είναι καταστολείς της έκφρασης του γονιδίου της β-σφαιρίνης. Επιπλέον, τα 23a και 27 επάγουν την έκφραση των γ και ε γονιδίων (Ma et al, 2013). Το mir-96 καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης, ενώ τα mir-15a και mir-16-1 ενισχύουν την έκφρασή τους, μέσω του MYB σε άτομα με τρισωμία 21. Το mir-210 εμπλέκεται στην αύξηση της έκφρασης των γ γονιδίων (Ma et al, 2013). Τέλος, το mir-486-3p καταστέλλει την έκφραση του BCL11A, επάγοντας την έκφραση των εμβρυικών γονιδίων (Ginder,2015). Πέραν όλων των παραπάνω στοιχείων, στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης εμπλέκονται και επιγενετικές τροποποιήσεις (αλλαγές που πραγματοποιούνται στο DNA και τις ιστόνες μετά τη σύνθεσή τους και μπορούν να επηρεάσουν την γονιδιακή έκφραση). Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι επιγενετικές τροποποιήσεις αποτελούν σήμα αναγνώρισης για πρωτεΐνες ή πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Βασική επιγενετική τροποποίηση αποτελεί η μεθυλίωση του γενετικού υλικού σε κατάλοιπα κυτοσίνης σε αλληλουχίες CpG. Η μεθυλίωση σε συγκεκριμένες θέσεις στις ρυθμιστικές περιοχές ενός γονιδίου οδηγεί στη μεταγραφική αποσιώπησή του. Η απομεθυλίωση τέτοιων θέσεων στα γ γονίδια οδηγεί στη μεταγραφική τους ενεργοποίηση. Εξίσου σημαντική είναι η μεθυλίωση των ιστονών, η οποία μπορεί να αποτελεί σήμα, τόσο γονιδιακής ενεργοποίησης, όσο και αποσιώπησης. Υπεύθυνες για τη μεθυλίωση των ιστονών είναι οι μεθυλοτρανσφεράσες, όπως οι PRMTs (protein arginine methyltransferases). 22

23 Ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο που εξαρτάται από την PRMT5 συμβάλλει στην αποσιώπηση των γ γονιδίων. Επιπλέον, η μεθυλίωση της αργινίνης 3 στην Η4 δρα ως σήμα για την DNMT3A που μεθυλιώνει με τη σειρά της τους υποκινητές των γονιδίων γ. Μια άλλη πρωτεΐνη της οικογένειας PRMT, η PRMT1 σχετίζεται με την αποσιώπηση της έκφρασης των γ γονιδίων μέσω της πρωτεΐνης FoP (friend of PRMT1). Η PRMT1 διευκολύνει, επίσης, μια σειρά ακετυλιώσεων των ιστονών, οδηγώντας σε μεταγραφική ενεργοποίηση του β γονιδίου. Συνεπώς, η PRMT1 μπορεί να συμβάλει στην αποσιώπηση των γ γονιδίων, αυξάνοντας την ικανότητα του γονιδίου β να ανταγωνιστεί τα γονίδια αυτά ως προς την ενισχυτική επίδραση της LCR (Ginder,2015). Έτερη επιγενετική τροποποίηση, η ακετυλίωση των καταλοίπων λυσίνης ιστονών, έχει ως αποτέλεσμα χρωματίνη με πιο «ανοιχτή» δομή, γεγονός που διευκολύνει τη μεταγραφή. Η ακετυλίωση των ιστονών στις περιοχές κοντά στα γονίδια γ οδηγεί σε μεταγραφή τους και αύξηση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF. Εικόνα 5: παράγοντες που επηρεάζουν την έκφραση των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης (Προσαρμογή από: Suzuki et al, 2014) Α.3 Αιμοσφαιρινοπάθειες Ως αιμοσφαιρινοπάθειες χαρακτηρίζονται όλες οι γενετικές ασθένειες που σχετίζονται με την αιμοσφαιρίνη. Μπορεί να επηρεάζουν, τόσο την ποσότητα, όσο και την ποιότητα των μορίων αιμοσφαιρίνης που παράγονται. Διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες: α) τις θαλασσαιμίες, όταν οι γενετικές αλλαγές οδηγούν σε προβλήματα κατά τη σύνθεση των αιμοσφαιρινών, με αποτέλεσμα να παράγεται αιμοσφαιρίνη σε μικρότερη ποσότητα και β) τις ασθένειες που σχετίζονται με δομικές αλλαγές του μορίου της αιμοσφαιρίνης, με αποτέλεσμα την παραγωγή της αιμοσφαιρίνης με αλλοιωμένη μορφή. 23

24 Οι θαλασσαιμίες είναι αποτέλεσμα μεταλλάξεων στους γονιδιακούς τόπους των γονιδίων της α- και β-σφαιρίνης. Ως εκ τούτου, διακρίνονται σε α- και β-, ανάλογα με το αν επηρεάζουν τη σύνθεση των α- ή β- αλυσίδων της σφαιρίνης και κληρονομούνται, κυρίως, με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο. Οι αιμοσφαιρινοπάθειες που σχετίζονται με την παραγωγή αιμοσφαιρινών με αλλοιωμένη δομή, οφείλονται σε αλλαγές στην αμινοξική ακολουθία της α- ή της β- σφαιρίνης. Οι αιμοσφαιρινοπάθειες αυτού του τύπου διακρίνονται στις εξής υποκατηγορίες: α) αυτές που οδηγούν σε σχηματισμό δρεπανοκυττάρων, όπως η δρεπανοκυτταρική αναιμία, SCD (sickle cell disease), β) αυτές που οδηγούν στη σύνθεση μη φυσιολογικών αιμοσφαιρινών, όπως της HbE, γ) αυτές που οδηγούν σε σύνθεση αιμοσφαιρινών με τάση κατακρήμνισης και οδηγούν σε αιμόλυση, όπως η Hb Koln και τέλος, δ) αυτές που έχουν ως αποτέλεσμα τη σύνθεση αιμοσφαιρινών που αδυνατούν να διεκπεραιώσουν σωστά τη διαδικασία μεταφοράς του οξυγόνου και οδηγούν σε εκ γενετής πολυκυτταραιμία ή κυάνωση. Η τρίτη και η τέταρτη κατηγορία οδηγούν σε σοβαρά κλινικά συμπτώματα σε ετεροζυγώτες, ενώ είναι θανατηφόρες για τα ομόζυγα άτομα (Kohne,2011). Στη συνέχεια, θα αναλυθούν εκτενέστερα η β-θαλασσαιμία και η δρεπανοκυτταρική αναιμία, που αποτελούν τις συχνότερα εμφανιζόμενες αιμοσφαιρινοπάθειες. Α.3.1 Β-Θαλασσαιμία (Μεσογειακή Αναιμία) Η β-θαλασσαιμία είναι μια από τις πιο συνηθισμένες ασθένειες που κληρονομούνται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο παγκοσμίως. Κυρίως, συναντάται σε πληθυσμούς της Μεσογείου, στη Μέση και Άπω Ανατολή, την Ινδία και την Κεντρική Ασία, όπως επίσης και σε πληθυσμούς προερχόμενους από την Βόρεια Αφρική και τη Νότια Αμερική. Τα μεγαλύτερα ποσοστά της ασθένειας, όμως, παρουσιάζονται στην Κύπρο (14%), τη Σαρδηνία (10,3%) και τη νοτιοανατολική Ασία (Fard et al,2013). Στην χώρα μας, περίπου 1 στα 10 άτομα είναι ετεροζυγώτες για τη β-θαλασσαιμία ή άλλες αιμοσφαιρινοπάθειες. Στην εικόνα 6, αναπαρίστανται σχηματικά οι πιθανότητες που έχουν οι υποψήφιοι γονείς που είναι ετεροζυγώτες για τη νόσο, να αποκτήσουν υγιές ή πάσχον παιδί ( Η υψηλή συχνότητα εμφάνισης της ασθένειας στις περιοχές αυτές σχετίζεται πιθανόν με το γεγονός ότι οι φορείς της παρουσιάζουν ανθεκτικότητα έναντι στο Plasmodium falciparum, το παρασιτικό πρωτόζωο που προκαλεί την ελονοσία στον άνθρωπο. Οπότε, λόγω εξελικτικής πίεσης, η μετάλλαξη διατηρήθηκε στις περιοχές αυτές όπου είναι συχνά τα περιστατικά ελονοσίας, καθώς παρείχε εξελικτικό πλεονέκτημα στους φορείς. Σήμερα, όμως, λόγω μετανάστευσης των πληθυσμών και δουλεμπορίου, η ασθένεια εμφανίζεται και σε περιοχές, όπως η Βόρεια Ευρώπη και η Αμερική, η Καραϊβική και η Αυστραλία (Cao and Galanello, 2010). 24

25 Εικόνα 6: πιθανότητες κληρονόμησης β-θαλασσαιμίας στους απογόνους ετεροζυγωτών για την ασθένεια (Προσαρμογή από: Α Μοριακή βάση της ασθένειας Η β-θαλασσαιμία προκαλείται όταν υπάρχει ελλιπής (β + ) ή παντελής απουσία σύνθεσης (β 0 ) της β-αλυσίδας σφαιρίνης. Επίσης, υπάρχουν μεταλλάξεις που αυξάνουν σε μεγάλο βαθμό τη σύνθεση των αλυσίδων αυτών και ονομάζονται β ++, καθώς και μεταλλάξεις που έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία β-αλυσίδων με μειωμένη σταθερότητα. Σήμερα, έχουν περιγραφεί περισσότερες από 200 μεταλλάξεις που επηρεάζουν την έκφραση των β γονιδίων, με αποτέλεσμα την εμφάνιση β-θαλασσαιμίας (Thompson and Thomson, 2007). Οι μεταλλάξεις αυτές μπορεί να βρίσκονται στην κωδική περιοχή του γονιδίου, τις ρυθμιστικές περιοχές του ή σε άλλες περιοχές στο γονιδίωμα, οι οποίες εμπλέκονται στον ερυθροειδικό μηχανισμό ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων αυτών. Στην πλειοψηφία τους είναι σημειακές νουκλεοτιδικές αλλαγές (ενδεικτικά, αντικαταστάσεις μιας βάσης, ελλείμματα ή ενθέσεις λίγων νουκλεοτιδίων). Γενικά, οι μεταλλάξεις του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες. Η πρώτη οδηγεί σε διαταραχή της παραγωγής της β- σφαιρίνης και προκαλεί την απλή β-θαλασσαιμία, που παρατηρείται στην πλειονότητα των ασθενών. Η δεύτερη κατηγορία μεταλλάξεων περιλαμβάνει μεγάλα χρωμοσωματικά ελλείμματα, που οδηγούν σε εξάλειψη του γονιδίου της β-σφαιρίνης, καθώς και ενός ή περισσότερων γονιδίων του συμπλέγματος ή της LCR. Οι μεταλλάξεις αυτού του τύπου προκαλούν τη σύνθετη β-θαλασσαιμία και είναι πιο σπάνιες (Thompson and Thomson, 2007, Cao and Galanello,2010). Οι περισσότερες μεταλλάξεις που προκαλούν την απλή β-θαλασσαιμία οδηγούν σε μείωση των επιπέδων του mrna της β-σφαιρίνης. Οι σημειακές αυτές μεταλλάξεις ομαδοποιούνται με βάση το μηχανισμό με τον οποίο τροποποιούν την σύνθεση των β-αλυσίδων (τη μεταγραφή, τη μετα-μεταγραφική επεξεργασία ή τη μετάφραση του mrna). Μεταλλάξεις που οδηγούν σε μη αποτελεσματική μεταγραφή του γονιδίου β βρίσκονται, είτε στις συντηρημένες περιοχές (ΤΑΤΑ box, αλληλουχίες CCAAT, CACCC) του DNA του υποκινητή του γονιδίου, είτε στην 5 UTR. Κατά κανόνα, τέτοιου τύπου μεταλλάξεις προκαλούν μια ήπια έως πολύ 25

26 μικρή επίπτωση στην παραγωγή των β-αλυσίδων. Υπάρχουν τουλάχιστον 50 μεταλλάξεις που επηρεάζουν τις μετά-μεταγραφικές τροποποιήσεις του mrna του γονιδίου β, εμποδίζοντας τη σύνθεση του φυσιολογικού ώριμου mrna. Τέτοιου τύπου μεταλλάξεις μπορεί να βρίσκονται στις θέσεις συναρμογής, στις συντηρημένες περιοχές στα άκρα των ιντρονίων, καθώς και σε εναλλακτικές θέσεις συναρμογής, σε ιντρόνια ή εξώνια. Μεταλλάξεις που δεν επιτρέπουν τη σύνθεση του φυσιολογικού mrna είναι και αυτές που τροποποιούν την προσθήκη της καλύπτρας ή της πολύ-α ουράς στο mrna, προκαλώντας τη β + μεσογειακή αναιμία (Traeger-Synodinos et al, 2011). Μεταλλάξεις στην κωδική περιοχή μπορούν, επίσης, να επηρεάσουν τη συναρμογή του mrna. Στην κατηγορία αυτή, ανήκουν οι μεταλλάξεις εντός του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης, οι οποίες τροποποιώντας ή όχι την αμινοξική ακολουθία, ενεργοποιούν ένα κρυφό σημείο συναρμογής σε ένα εξώνιο. Οι μεταλλάξεις αυτές, συνήθως, προκαλούν πιο ήπιο φαινότυπο, β + ή β ++ (Thompson and Thomson, 2007).Τέλος, μεταλλάξεις που παρεμποδίζουν τη μετάφραση μπορεί να βρίσκονται στο κωδικόνιο έναρξης, οπότε να μην μπορεί να πραγματοποιηθεί καθόλου η διαδικασία (β 0 μεσογειακή αναιμία), να μετατοπίζουν το πλαίσιο ανάγνωσης ή να προκαλούν πρόωρο τερματισμό (ανερμηνεύσιμες μεταλλάξεις), με αποτέλεσμα να προκύπτει μη λειτουργικό προϊόν. Μεταλλάξεις που προκαλούν τη μετατόπιση του πλαισίου ανάγνωσης στο 3ο εξώνιο (κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης) οδηγούν σε παράταση της μετάφρασης και δημιουργούν πρωτεΐνες με μεγαλύτερο μήκος από το φυσιολογικό. Στις περιπτώσεις αυτές, δεν παρατηρείται εκδήλωση β 0 μεσογειακής αναιμίας, αλλά παράγεται ένα μεγάλο ποσό παθολογικής πρωτεΐνης. Τέτοιου τύπου β-θαλασσαιμία κληρονομείται με επικρατή τρόπο (Traeger-Synodinos et al, 2011). Επιπρόσθετα, υπάρχουν και σιωπηλές μεταλλάξεις, οι οποίες διακρίνονται μόνο από μια ήπια ανισορροπία στην αναλογία σύνθεσης α/β αλυσίδων σφαιρίνης, χωρίς να έχουν κάποια επίπτωση στην κλινική εικόνα του ατόμου (Cao and Galanello,2010). Οι μεταλλάξεις που ευθύνονται συχνότερα για τη β-θαλασσαιμία, είναι αυτές που επηρεάζουν τις μετά-μεταγραφικές τροποποιήσεις του mrna. Οι μεταλλάξεις αυτές μπορούν να οδηγήσουν σε β 0, β + ή β ++ μεσογειακή αναιμία. Τη δεύτερη σε συχνότητα αιτία εμφάνισης β-θαλασσαιμίας αποτελούν οι μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη μετάφραση. Λιγότερο συχνές είναι οι μεταλλάξεις που προκαλούν β-θαλασσαιμία και οφείλονται σε ελλείμματα στο σύμπλεγμα των β γονιδίων. Τα μεγάλα ελλείμματα που προκαλούν σύνθετες θαλασσαιμίες εξαλείφουν εκτός από το γονίδιο της β-σφαιρίνης και ένα ή περισσότερα άλλα γονίδια. Επίσης, μπορεί να εξαλείφουν την LCR του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης. Ανάλογα με τα γονίδια που λείπουν μπορεί να προκύψει δβ 0 θαλασσαιμία, Α γδβ 0 θαλασσαιμία (Cao and Galanello,2010). Τα ελλείμματα είναι πολύ σπάνια και μπορούν να τα κατηγοριοποιηθούν ως εξής: σε αυτά που δεν επιτρέπουν καθόλου την έκφραση των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης και σε αυτά που αφήνουν ανέπαφο, τουλάχιστον ένα από τα γονίδια των γ-σφαιρινών. Τα ελλείμματα της πρώτης κατηγορίας έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση εγδβ 0 μεσογειακής αναιμίας και χωρίζονται σε δύο ομάδες: στα ελλείμματα εκείνα που αφαιρούν ολόκληρο ή το μεγαλύτερο μέρος του συμπλέγματος των β 26

27 γονιδίων, μαζί με το β γονίδιο και στα ελλείμματα που αφαιρούν την περιοχή προς το 5 άκρο του συμπλέγματος, αφήνοντας ανέπαφο το β γονίδιο. Στην περίπτωση αυτή, η καταστολή της έκφρασης οφείλεται στην έλλειψη της LCR περιοχής και εμφανίζεται εγδβ 0 θαλασσαιμία. Οι ασθενείς που φέρουν μεταλλάξεις της δεύτερης κατηγορίας εκδηλώνουν ανάλογα με το έλλειμμα δβ 0, θαλασσαιμία ή «κληρονομική διατήρηση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης» (HPFH). Τα ομόζυγα άτομα για οποιαδήποτε από τις δύο αυτές διαταραχές επιβιώνουν, γιατί τα γονίδια της γ- σφαιρίνης που παραμένουν είναι ενεργά και μετά τη γέννηση του ατόμου, παράγοντας αιμοσφαιρίνη HbF, αντισταθμίζοντας την έλλειψη της αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων, HbA. Εκτός από τα ελλείμματα που προκαλούν την αύξηση της αιμοσφαιρίνης HbF, υπάρχουν και ελλείμματα που αφαιρούν ένα μέρος του υποκινητή του β γονιδίου και οδηγούν στην αύξηση της αιμοσφαιρίνης HbA 2, εκτός από της HbF, στα ετερόζυγα άτομα. Αυτό συμβαίνει, γιατί με την αφαίρεση του υποκινητή του β γονιδίου, το γονίδιο αυτό δεν ανταγωνίζεται πλέον τα γονίδια γ και δ για αλληλεπίδραση με την περιοχή LCR, με αποτέλεσμα αυτά να αλληλεπιδρούν ελεύθερα με την LCR και κατά συνέπεια, να ενισχύεται η έκφρασή τους (Traeger- Synodinos et al, 2011, Thompson and Thomson, 2007). Α Τύποι της ασθένειας και παθοφυσιολογία Οι διάφορες μορφές της ασθένειας διακρίνονται, κυρίως, από την έκταση της ανισορροπίας μεταξύ α και β αλυσίδων σφαιρίνης και συνεπώς, την κλινική τους βαρύτητα. Συγκεκριμένα, υπάρχουν ασθενείς που παράγουν μικρότερη ποσότητα αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων από την κανονική (13,0-18,8g/dl στους άντρες και 11,6-16,4g/dl στις γυναίκες, αλλά δεν παρουσιάζουν σοβαρά προβλήματα υγείας, καθώς είναι ετεροζυγώτες/φορείς της β-θαλασσαιμίας. Τα άτομα αυτά ίσως εμφανίσουν ήπια μικροκυτταρική αναιμία, καθώς και αύξηση της αιμοσφαιρίνης HbA 2. Συνήθως, φέρουν ένα φυσιολογικό γονίδιο για τη β-αλυσίδα και ένα με μετάλλαξη (γονότυπος: β + /β ή β 0 /β). Βαρύτερη εικόνα της ασθένειας μπορούν να παρουσιάσουν μόνο σε περίπτωση συν- κληρονόμησης της μετάλλαξης που οδηγεί σε αύξηση της παραγωγής των α-αλυσίδων σφαιρίνης, με αποτέλεσμα την αύξηση της ανισορροπίας μεταξύ α- και μη α-αλυσίδων ή σε περίπτωση μετάλλαξης, που οδηγεί σε σχηματισμό β-αλυσίδων σφαιρίνης με αυξημένη αστάθεια (Cao and Galanello,2010). Στον αντίποδα, βρίσκεται η μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία (beta-thalassemia intermedia). Τα άτομα με αυτή τη μορφή της ασθένειας, αν και φέρουν μεταλλάξεις και στα δύο αλληλόμορφα για τη β-αλυσίδα, εξακολουθούν να την παράγουν, αλλά σε μικρότερη ποσότητα από τα υγιή άτομα (γονότυπος: β + /β + ή β 0 /β). Η σοβαρότητα της αναιμίας, καθώς και τα προβλήματα υγείας που παρουσιάζουν τα άτομα αυτά, εξαρτώνται από τον τύπο των μεταλλάξεων που 27

28 φέρουν. Τα κλινικά τους συμπτώματα μπορεί να είναι ήπια, όπως των φορέων ή παρόμοιας σοβαρότητας με των ατόμων που πάσχουν από μείζονα β-θαλασσαιμία. Η αιματολογική τους εικόνα παρουσιάζει, επίσης, μεγάλη ετερογένεια, δημιουργώντας δυσκολίες στη διάγνωση της ασθένειας. Συνήθως, έχουν φυσιολογική ζωή και οι περισσότεροι χρειάζονται μεταγγίσεις αίματος μόνο σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως σε περιόδους ασθένειας ή εγκυμοσύνης (Musallam et al, 2012). Τέλος, την πιο σοβαρή μορφή της ασθένειας αποτελεί η ομόζυγος/μείζονα β- θαλασσαιμία ή αναιμία του Cooley (beta-thalassemia major). Τα άτομα που πάσχουν φέρουν μεταλλάξεις και στα δύο αλληλόμορφα για τη β-αλυσίδα, με αποτέλεσμα την ολοκληρωτική έλλειψη της αλυσίδας αυτής (γενότυπος: β + /β 0 ή β 0 /β 0 ). Σε άτομα με β 0 β-θαλασσαιμία παρατηρείται παντελής έλλειψη της HbA, ενώ οι αιμοσφαιρίνες HbF και HbA 2 ανιχνεύονται σε επίπεδα 95-98% και 2-5%, αντίστοιχα. Σε ασθενείς με β + μεσογειακή αναιμία και διπλούς ετεροζυγώτες με β + /β 0 μεσογειακή αναιμία, η HbA ανιχνεύεται σε ποσοστά 10-30%, ενώ οι HbF και HbA2 σε ποσοστά 70-90% και 2-5%, αντίστοιχα. Τα άτομα που πάσχουν εμφανίζουν σοβαρή αναιμία και χρειάζονται μεταγγίσεις αίματος, καθώς και ιατρική φροντίδα σε όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Thompson and Thomson, 2007, Patrinos and Antonarakis, 2010). Τα κύρια κλινικά χαρακτηριστικά της β-θαλασσαιμίας είναι η μειωμένη παραγωγή της β-σφαιρίνης, που οδηγεί σε μειωμένη περιεκτικότητα των ερυθροκυττάρων σε HbA και μικροκυτταρική αναιμία (μειωμένος όγκος ερυθροκυττάρων), καθώς και η ποσοτική ανισορροπία σύνθεσης των σφαιρινών, που οδηγεί σε καθίζηση της περίσσειας των αδιάλυτων α-αλυσίδων. Η τελευταία προκαλεί καταστροφές στη μεμβράνη των ερυθροκυττάρων, με αποτέλεσμα την καταστροφή τους. Το γονίδιο δ παραμένει ανέπαφο, οπότε η παραγωγή της αιμοσφαιρίνης HbA 2 πραγματοποιείται κανονικά. Στους ετεροζυγώτες για την ασθένεια τα επίπεδα της HbA 2 εμφανίζονται αυξημένα (>3,8%). Επίσης, αύξηση παρατηρείται και στα επίπεδα της HbF, όχι λόγω επανενεργοποίησης των γονιδίων γ, αλλά επιλεκτικής επιβίωσης και ίσως, αυξημένης παραγωγής του μικρού πληθυσμού των ώριμων ερυθροκυττάρων που περιέχουν HbF (κύτταρα F) (Thompson and Thomson, 2007). Η μη αποτελεσματική αιμοποίηση, η αύξηση της εντερικής απορρόφησης σιδήρου, η αιμόλυση και η υπερπηκτικότητα του αίματος, που παρουσιάζονται στους ασθενείς με β-θαλασσαιμία, μπορούν να οδηγήσουν σε ποικίλα προβλήματα, όπως η υπερσιδήρωση, η πνευμονική υπέρταση κ.α. (Musallam et al, 2012). 28

29 Α.3.2 Δρεπανοκυτταρική αναιμία Η δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι μια κληρονομούμενη με υπολειπόμενο τρόπο ασθένεια (εικόνα 7). Χαρακτηρίζεται από αιμόλυση και απόφραξη των αιμοφόρων αγγείων, που οδηγούν σε δυσλειτουργία πολλών οργάνων και πρόωρο θάνατο (J Freed et al,2012). Η ασθένεια αυτή, συνήθως, εμφανίζεται σε περιοχές με θερμό κλίμα, όπως η Αφρική (70% των περιστατικών), η Ινδία και η Καραϊβική. Λόγω μετανάστευσης των πληθυσμών, πλέον, η ασθένεια εμφανίζεται σε περιοχές, όπως η Δυτική Ευρώπη, η Ανατολική ακτή της Νότιας Αμερικής και η Βόρεια Αμερική (Pleasants, 2014). Στις Ηνωμένες Πολιτείες είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενη κληρονομούμενη με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο νόσος, καθώς 1 στους 400 Αφρο-αμερικάνους εμφανίζει την ασθένεια (Bhatnagar et al,2011). Εικόνα 8: περιγραφή του τρόπου κληρονόμησης τη δρεπανοκυτταρικής αναιμίας ( Σημειώνεται, εδώ, πως οι ετεροζυγώτες για την ασθένεια παρουσιάζουν πλεονέκτημα έναντι της προσβολής από ελονοσία. Αυτό συμβαίνει, γιατί το Plasmodium falciparum εισβάλει στα ερυθροκύτταρα για να πολλαπλασιαστεί, αλλά η παρουσία δρεπανοκυτταρικής αιμοσφαιρίνης, καθώς και οι βιολογικές αλλαγές στο αίμα των φορέων της ασθένειας καθιστά τα ερυθροκύτταρα των ατόμων αυτών λιγότερο φιλόξενα για το παράσιτο (Pleasants, 2014). Α Μοριακή βάση της Δρεπανοκυτταρικής αναιμίας Η δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι μονογονιδιακή ασθένεια (οφείλεται σε μια μετάλλαξη στο γονίδιο β της αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων). Συγκεκριμένα, η υποκατάσταση της αδενίνης από θυμίνη στο 6ο κωδικόνιο έχει ως αποτέλεσμα την 29

30 αμινοξική υποκατάσταση του έκτου αμινοξέος στην πρωτεϊνική αλυσίδα (του γλουταμικού οξέος από βαλίνη). Το γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μεταλλαγμένης αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων, της δρεπανοκυτταρικής αιμοσφαιρίνης, HbS. Η μεταλλαγμένη αυτή αιμοσφαιρίνη περιγράφηκε πρώτη φορά από το Linus Pauling, το 1949 (Marengo-Rowe,2006). Σε συνθήκες έλλειψης οξυγόνου, η μεταλλαγμένη δεοξυ-αιμοσφαιρίνη παρουσιάζει πέντε φορές μικρότερη διαλυτότητα σε σχέση με τη φυσιολογική (Thompson and Thomson, 2007). Σε αυτό το γεγονός οφείλεται το φαινόμενο της δρεπάνωσης, κατά το οποίο η μεταλλαγμένη αιμοσφαιρίνη HbS πολυμερίζεται και σχηματίζει ίνες στο εσωτερικό των ερυθροκυττάρων, δίνοντάς τους δρεπανοειδή μορφή, όπως φαίνεται στην εικόνα 8 (Driss et al,2009). Το φαινόμενο αυτό προκαλεί βλάβες στη μεμβράνη των ερυθροκυττάρων, τα οποία χάνουν την ελαστικότητά τους, συναθροίζονται και προκαλούν απόφραξη των αιμοφόρων αγγείων. Ακόμη, τα δρεπανοειδή ερυθροκύτταρα προσκολλώνται στα ενδοθηλιακά κύτταρα και αλληλεπιδρούν με διάφορες κυτοκίνες (Marengo-Rowe,2006,Steinberg, 2008). Όταν η HbS βρίσκεται σε οξυγονωμένη μορφή, η μετάλλαξη δεν την επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό και δεν παρατηρούνται φαινόμενα δρεπάνωσης. Συχνά, μαζί με τη μετάλλαξη που προκαλεί τη δρεπανοκυτταρική αναιμία εμφανίζονται και άλλες μεταλλάξεις στο β γονίδιο, με αποτέλεσμα να προκύπτουν διπλοί ετεροζυγώτες με δρεπανοκυτταρική αναιμία και β- θαλασσαιμία (Steinberg, 2008). Εικόνα 8:δρεπανοκύτταρο και φυσιολογικό ερυθροκύτταρο (Προσαρμογή από: Α Τύποι της ασθένειας και παθοφυσιολογία Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η δρεπανοκυτταρική αναιμία προκαλείται από μια μονο-νουκλεοτιδική αλλαγή. Τα ετερόζυγα άτομα (φορείς) για την αλλαγή αυτή, κατά κανόνα, δεν εμφανίζουν συμπτώματα της ασθένειας, καθώς φέρουν τη μετάλλαξη μόνο στο ένα αλληλόμορφο για το γονίδιο β. Όμως, σε συνθήκες πολύ χαμηλής πίεσης οξυγόνου τα ερυθροκύτταρά τους μπορεί να αποκτήσουν δρεπανοειδή μορφή, αν και αυτό είναι κάτι πολύ σπάνιο (Thompson and Thomson, 2007). 30

31 Οι ομοζυγώτες για τη δρεπανοκυτταρική αναιμία, φέρουν δύο μεταλλαγμένα αλληλόμορφα για το γονίδιο β. Αν και η γονοτυπική τους εικόνα είναι ίδια, ο κλινικός τους φαινότυπος παρουσιάζει μεγάλη ετερογένεια. Η καταστροφή της μεμβράνης των ερυθροκυττάρων από την υψηλή συγκέντρωση της HbS στο εσωτερικό τους, οδηγεί σε μείωση του χρόνου επιβίωσής τους και χρόνια αιμολυτική αναιμία, που μπορεί να οδηγήσει σε καρδιακή ανεπάρκεια, εγκεφαλικό επεισόδιο κ.α. (Marengo- Rowe,2006). Ακόμη, η χρόνια αιμολυτική αναιμία οδηγεί σε απελευθέρωση στην κυκλοφορία τόσο της αιμοσφαιρίνης όσο και της ενδοκυτταρικής αργινάσης των ερυθροκυττάρων. Αυτό το γεγονός μπορεί να ευθύνεται για κάποιες από τις επιπλοκές που παρουσιάζονται στους ασθενείς, καθώς αυτοί οι δύο παράγοντες σχετίζονται με τη βιοδιαθεσιμότητα του μονοξειδίου του αζώτου. Το μονοξείδιο του αζώτου αλληλεπιδρά γρήγορα με την ελεύθερη αιμοσφαιρίνη. Ο φυσιολογικός ρόλος του στον οργανισμό είναι να ενεργοποιεί τη γουανυλική κυκλάση που καταλύει τη μετατροπή του GTP σε κυκλικό cgmp, το οποίο συμβάλει στην αγγειοδιαστολή. Ο κορεσμός του μονοξειδίου του αζώτου από την ελεύθερη αιμοσφαιρίνη, δεν του επιτρέπει να διαδραματίσει το φυσιολογικό του ρόλο. Επιπλέον, η αργινάση που απελευθερώνεται από τα ερυθροκύτταρα δεσμεύει την L-αργινίνη, που αποτελεί το υπόστρωμα για τη βιοσύνθεση του μονοξειδίου του αζώτου, προκαλώντας ακόμη μεγαλύτερη ανεπάρκεια του παράγοντα αυτού στον οργανισμό. Η ανεπάρκεια αυτή οδηγεί σε αναστολή της αγγειοδιαστολής, ενεργοποίηση και πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Κατά την κατάσταση αυτή, ενεργοποιούνται παράγοντες, όπως η συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου 2 (NOS2A), η ερυθροποιητίνη και ο ενδοθηλιακός αγγειακός αυξητικός παράγοντας (Steinberg, 2008, Driss et al, 2009). Επίσης, όταν τα ερυθροκύτταρα έχουν δρεπανοειδή μορφή δεν μπορούν να διέλθουν εύκολα από τα αιμοφόρα αγγεία, γεγονός που οδηγεί σε αγγειοαποφρακτικά επεισόδια. Τα επεισόδια αυτά μπορούν να επηρεάσουν τη λειτουργία πολλών συστημάτων στον οργανισμό και να προκαλέσουν πνευμονική εμβολή, επίπονες κρίσεις κ.α. (Marengo-Rowe,2006). Επιπλέον, το 40% των ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία (κυρίως παιδιά) εμφανίζουν οξύ σύνδρομο θώρακα, που στη συνέχεια οδηγεί σε χρόνια αναπνευστική νόσο. Τέλος, το 10% των παιδιών που φέρουν τη νόσο υφίστανται σιωπηλά εγκεφαλικά επεισόδια με αποτέλεσμα νευρολογικές βλάβες (Freed et al, 2012). Η κλινική σοβαρότητα των συμπτωμάτων εξαρτάται κάθε φορά από τη συγκέντρωση της μεταλλαγμένης αιμοσφαιρίνης HbS στα ερυθροκύτταρα, καθώς και από τις συγκεντρώσεις των φυσιολογικών αιμοσφαιρινών HbF και HbA 2. Επιπρόσθετα, σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν οι συγκεντρώσεις ποικίλων ενδοθηλιακών παραγόντων, καθώς και του μονοξειδίου του αζώτου (Marengo- Rowe,2006). Έχει παρατηρηθεί ότι σε άτομα που φέρουν εκτός από τη μετάλλαξη για τη δρεπανοκυτταρική αναιμία και μετάλλαξη για β 0 β-θαλασσαιμία, η αιμολυτική αναιμία είναι πιο ήπια, ενώ είναι ακόμη ηπιότερη σε ασθενείς με HbS/β + β- θαλασσαιμία (Steinberg, 2008). Σήμερα, περισσότεροι από 100 μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί, SNPs (single nucleotide polymorphisms) έχουν συσχετιστεί με την κλινική εικόνα της ασθένειας. Οι πολυμορφισμοί αυτοί σχετίζονται με γονίδια που 31

32 δρουν ως ρυθμιστές σε φλεγμονώδεις αποκρίσεις, σχετίζονται με τη βιολογία του μονοξειδίου του αζώτου ή με τη ρύθμιση της λειτουργίας των αγγείων, καθώς και με παράγοντες κυτταρικής προσκόλλησης (Driss et al, 2009). A.4 Θεραπευτικές προσεγγίσεις Σήμερα, ο μόνος τρόπος για αποτελεσματική και πλήρη θεραπεία, τόσο της β- θαλασσαιμίας, όσο και της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας, είναι η μεταμόσχευση βλαστικών αιμοποιητικών κυττάρων, σε περίπτωση που βρεθεί συμβατός δότης. Η θεραπεία αυτή δεν ενδείκνυται για ηλικιωμένους ασθενείς, καθώς μπορεί να οδηγήσει σε επιπλοκές που θα έθεταν τη ζωή τους σε κίνδυνο (Freed et al,2012, Kohne, 2011, Scott, 2014). Για την αντιμετώπιση των ασθενειών αυτών και την ανακούφιση των συμπτωμάτων των ασθενών χρησιμοποιούνται αρκετές μέθοδοι. Για τους ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία συνίστανται συχνές μεταγγίσεις αίματος, καθώς και θεραπεία αποσιδήρωσης. Οι μεταγγίσεις αίματος ξεκινούν με στόχο η συγκέντρωση της HbA να φτάσει τιμές τουλάχιστον 9-10,5 gr/dl. Για τη θεραπεία αποσιδήρωσης χρησιμοποιούνται φάρμακα, όπως τα deferoxamine και deferasirox. Πολλές φορές στους ασθενείς αυτούς πραγματοποιείται σπληνεκτομή, λόγω της μεγάλης διόγκωσης του σπλήνα. Σε κάποιους ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-μεσογειακή αναιμία χρειάζονται επίσης μεταγγίσεις, ιδιαίτερα αν δεν μπορούν να διατηρήσουν σταθερά τα επίπεδα της αιμοσφαιρίνης και σε τιμή πάνω από 8gr/dL. Οι ετεροζυγώτες για την ασθένεια, εμφανίζουν ήπια αναιμία, που καταπολεμείται με συμπληρώματα φολικού οξέως (Kohne, 2011, Musallam et al, 2012). Όσον αφορά την αντιμετώπιση της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας, πραγματοποιούνται κυρίως μεταγγίσεις, καθώς αυξάνουν την ικανότητα του αίματος να μεταφέρει οξυγόνο στους ιστούς και μειώνουν τον αριθμό των δρεπανοκυττάρων στον οργανισμό των ασθενών. Στους ασθενείς αυτούς, ωστόσο, μπορεί να προκληθεί υπερσιδήρωση (Marengo-Rowe,2006). Μια άλλη θεραπευτική προσέγγιση που θα μπορούσε να συμβάλλει στη θεραπεία και τη βελτίωση της κλινικής εικόνας των ατόμων που πάσχουν από τις δύο αυτές ασθένειες, αποτελεί η επαγωγή της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης, HbF. Η HbF, αναστέλλει τον πολυμερισμό της δρεπανοκυτταρικής αιμοσφαιρίνης HbS. Επίσης, η αύξηση της παραγωγής γ-αλυσίδων συμβάλλει στη μείωση της ανισορροπίας α- και μη α-αλυσίδων στον οργανισμό των ασθενών με β-θαλασσαιμία (Chen et al, 2008). Επειδή έχει παρατηρηθεί ότι η κλινική εικόνα των ατόμων με δρεπανοκυτταρική αναιμία παρουσιάζει λιγότερες επιπλοκές και επίπονες κρίσεις, όταν η παραγωγή HbF στον οργανισμό τους είναι αυξημένη, από τα μέσα της δεκαετίας του 50 γίνονταν προσπάθειες για την ανεύρεση φαρμακευτικών παραγόντων, που θα οδηγούσαν στην 32

33 επαγωγή της (Marengo-Rowe,2006, Bhatnagar et al, 2011). Η αναζήτηση τέτοιων παραγόντων ήταν αναγκαία και για τη θεραπεία ασθενών με μεσογειακή αναιμία. Δοκιμάστηκαν, λοιπόν, διάφορες προσεγγίσεις και φαρμακευτικοί παράγοντες για το σκοπό αυτό. Σήμερα, χρησιμοποιείται η υδροξυουρία ή υδροξυκαρβαμίδη (HU), που συνήθως χορηγείται ως αντικαρκινικό φάρμακο για την αντιμετώπιση χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας και οξείας λευχαιμίας τελικού σταδίου (Green and Barral,2014). Η δομή της φαίνεται στην εικόνα 8. Η χρήση της σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία εγκρίθηκε από τον FDA το 1998 (Humphries,2014). Το φάρμακο αυτό αυξάνει τα ποσοστά της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης στους ασθενείς, μειώνοντας τις ανάγκες για μεταγγίσεις. Επίσης, μειώνει τα ποσοστά των λευκοκυττάρων (εμφανίζονται αυξημένα στους ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία, προκαλώντας υπερ-λευκοκυττάρωση, η οποία οδηγεί σε πλήθος επιπλοκών, όπως η φλεβική απόφραξη) (Freed et al, 2012). Η υδροξυουρία φαίνεται να έχει πιο σημαντικά αποτελέσματα κατά τη θεραπεία της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας, όπου δρα αποτελεσματικά στο 50% των ασθενών, ούσα ταυτόχρονα η πιο χρήσιμη και αποτελεσματική για μακρόχρονη θεραπεία (Fard et al,2013, Humphries,2014). Εικόνα 8:δομή υδροξυουρίας (Προσαρμογή από:wikimedia.org/) Η υδροξυουρία αποτελεί αναστολέα της ριβονουκλεοτιδικής ρεδουκτάσης, ενός ενζύμου απαραίτητου για την αναγέννηση των ριβονουκλεοτιδίων και την αντιγραφή του γενετικού υλικού κατά την S φάση του κυτταρικού κύκλου (Green and Barral,2014). Για την επαγωγή της παραγωγής της HbF έχουν προταθεί δύο μοντέλα. Σύμφωνα με το πρώτο μοντέλο δράσης, η υδροξυουρία επάγει την ερυθροποίηση λόγω στρες, εμποδίζοντας τη σύνθεση DNA στα ταχέως πολλαπλασιαζόμενα ώριμα ερυθροκύτταρα, τα οποία παράγουν την αιμοσφαιρίνη HbA. Αυτό το γεγονός δημιουργεί επιλεκτικό πλεονέκτημα για τα λιγότερο ώριμα κύτταρα F, τα οποία παράγουν εμβρυική αιμοσφαιρίνη, με αποτέλεσμα να αυξάνονται τα επίπεδα της HbF στον οργανισμό των ασθενών (Banan,2013,Green and Barral,2014). Επιπρόσθετα, η υδροξυουρία αναστέλλει την πρωτεϊνοσύνθεση, επηρεάζοντας την κινητική της ερυθροποίησης, μειώνει τα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα GATA-1, καθυστερώντας την ωρίμανση των ερυθροβλαστών και επάγει την έκφραση των γονιδίων, που σχετίζονται με την απόπτωση στα ώριμα ερυθροκύτταρα (Banan,2013). Τέλος, η υδροξυουρία φαίνεται να επηρεάζει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ λευκοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων, μειώνοντας την κυτταρική προσκόλληση με αποτέλεσμα τη βελτίωση της κυκλοφορίας του αίματος στα τριχοειδή και τη μείωση των προφλεγμονοδών κυτταρικών αλληλεπιδράσεων (Green and Barral,2014). 33

34 Σύμφωνα με το δεύτερο μοντέλο δράσης της υδροξυουρίας, η επαγωγή της γ- σφαιρίνης πραγματοποιείται μέσω της αναγέννησης του μονοξειδίου του αζώτου και της ενεργοποίησης ποικίλων σηματοδοτικών μονοπατιών. Το μονοξείδιο του αζώτου, δρα ως σηματοδοτικό μόριο και προκαλεί την αγγειοδιαστολή και τοπική αύξηση της ροής του αίματος. Η αυξημένη ενεργότητα του ενζύμου αργινάση στα ερυθροκύτταρα προκαλεί τη μείωση των επιπέδων μονοξειδίου του αζώτου, καθώς και οι δύο παράγοντες ανταγωνίζονται για το μεταβολισμό της L-αργινίνης. Η υδροξυουρία αντιδρά με την αίμη, με αποτέλεσμα την άμεση παραγωγή του μονοξειδίου του αζώτου, το οποίο στη συνέχεια ενεργοποιεί το ένζυμο γουανυλική κυκλάση που καταλύει τη σύνθεση του κυκλικού GMP (cgmp). Το φάρμακο μπορεί να επάγει την παραγωγή του μονοξειδίου και έμμεσα, μέσω της ρύθμισης της δραστηριότητας των ενζύμων NOS, που καταλύουν τη σύνθεση του μονοξειδίου του αζώτου (Cokic et al,2003, Lou et al.,2009, Banan,2013). Τα cgmps επάγουν την έκφραση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης μέσω της ρύθμισης μεταγραφικών παραγόντων. Το μονοπάτι NO/cGMP αυξάνει τα επίπεδα των mrnas των c-fos και c-jun, καθώς επίσης και την ικανότητα του μεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1 να προσδένεται στο DNA. Ως ανταπόκριση στη δράση των παραγόντων που σχετίζονται με το κυτταρικό στρες, όπως το ΝΟ, ενεργοποιούνται οι κινάσες ΜΕΚ, που με τη σειρά τους ενεργοποιούν τις κινάσες MAPK. Οι κινάσες αυτές φωσφορυλιώνουν τις πρωτεΐνες c-fos και c-jun, που ρυθμίζουν την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1. Το μονοπάτι αυτό φαίνεται να εμπλέκεται και στη ρύθμιση του μεταγραφικού παράγοντα SP-1, ο οποίος προσδένεται σε ένα κρίσιμο μοτίβο για την υψηλή δραστηριότητα του υποκινητή των γονιδίων της γ-σφαιρίνης (Cokic et al,2003). Επιπλέον, το cgmp συμβάλλει στην ενεργοποίηση του μονοπατιού του camp, που οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης της γ-σφαιρίνης. Άλλος ένας τρόπος αύξησης των επιπέδων της γ-σφαιρίνης αφορά στο μονοπάτι p38mapk/creb1, που φυσιολογικά συμβάλλει στη διατήρηση σταθερών επιπέδων της γ-σφαιρίνης. Η υδροξυουρία επάγει τη φωσφορυλίωση της p38mapk, επάγοντας και το συγκεκριμένο μονοπάτι (Banan,2013, Ronchi and Ottolenghi,2013). Ακόμη, επάγει την έκφραση της πρωτεΐνης SAR (secretion associates and Ras related protein), που εμπλέκεται στην ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων και σηματοδοτικών μονοπατιών σε κύτταρα του αιμοποιητικού (Green and Barral,2014). Τέλος, η υδροξυουρία φαίνεται να επάγει την έκφραση των micrornas mir-26b και mir-151 3p, τα οποία σχετίζονται με την αύξηση των επιπέδων της HbF(Banan,2013). Κάποια από τα βασικά μονοπάτια δράσης του φαρμάκου παρουσιάζονται στην εικόνα 9. 34

35 Εικόνα 9: σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιεί η Υδροξυουρία (Προσαρμογή από: Banan,2013) Α.5 Φαρμακογονιδιωματική Η φαρμακογονιδιωματική μελετά τη συσχέτιση του γενετικού υπόβαθρου ενός ασθενούς με τις φαρμακοκινητικές και φαρμακοδυναμικές ιδιότητες ενός φαρμάκου. Σκοπός της φαρμακογονιδιωματικής είναι η επίτευξη της εξατομικευμένης θεραπείας, της κατά το δυνατό καταλληλότερης θεραπείας για τον κάθε ασθενή (ενισχυμένη αποτελεσματικότητα, μειωμένη τοξικότητα) (Katsila and Patrinos, 2015). A.5.1 Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί αποτελούν την πιο συχνή μορφή γενετικής ποικιλομορφίας στον άνθρωπο (ποσοστό εμφάνισης στον πληθυσμό μεγαλύτερο από 1%). Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί μπορούν να βρίσκονται στην κωδική περιοχή ενός γονιδίου, στις ρυθμιστικές αλληλουχίες του ή σε ιντρόνια. Επίσης, μπορούν να σχετίζονται με συγκεκριμένες ασθένειες, οπότε η μελέτη και η ανίχνευσή τους κρίνεται σημαντική. Τέλος, ο συνδυασμός πολυμορφισμών στο ίδιο χρωμόσωμα που συν-κληρονομούνται (απλότυπος) αποτελεί σημαντικό διαγνωστικό εργαλείο ( 35

36 Α.5.2 Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί που πιθανόν σχετίζονται με τη ρύθμιση των επιπέδων της HbF Η αύξηση των επιπέδων της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης αποτελεί μια αισιόδοξη θεραπευτική στρατηγική για την αντιμετώπιση της β-θαλασσαιμίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Για το σκοπό αυτό, άλλωστε, χορηγείται υδροξυουρία. Εντούτοις, το φάρμακο δεν είναι αποτελεσματικό για όλους τους ασθενείς, οι οποίοι μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε αυτούς που αποκρίνονται πολύ καλά στην υδροξυουρία (χρειάζονται λιγότερο συχνά μεταγγίσεις και αυξάνονται σημαντικά τα επίπεδα της αιμοσφαιρίνης τους, κατόπιν χορήγησης), σε εκείνους που αποκρίνονται μέτρια στο φάρμακο (παρουσιάζουν βελτίωση σε σχέση με τα παραπάνω, αλλά όχι κλινικά σημαντική) και τέλος, σε αυτούς που δεν αποκρίνονται στο φάρμακο. Υπάρχουν διάφορες υποθέσεις για τους λόγους για τους οποίους δεν αποκρίνονται το ίδιο όλοι οι ασθενείς στην υδροξυουρία. Είναι αληθές πως τα επίπεδα της HbF στον οργανισμό αποτελούν κληρονομικό γνώρισμα και μάλιστα, έχουν βρεθεί διάφοροι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί που σχετίζονται, τόσο με τα επίπεδα της HbF, όσο και με την απόκριση στο φάρμακο. Οι πολυμορφισμοί αυτοί βρίσκονται στο σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης, αλλά και σε άλλους γενετικούς τόπους, όπως σε γονίδια που σχετίζονται με την απόκριση στο στρες (Banan, 2013). Σε 137 ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία, στους οποίους χορηγείτο υδροξυουρία για τουλάχιστον δύο χρόνια, αναλύθηκαν 320 μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί σε 29 τέτοια γονίδια από τον Ma και τους συνεργάτες του (Ma et al,2007, Banan 2013, Green and Barral,2014). Από τη μελέτη αυτή εντοπίστηκαν 17 SNPs που επηρεάζουν σημαντικά την αύξηση του ποσοστού της HbF, με σημαντικότερο τον rs που βρίσκεται στο γονίδιο FLT1, απουσία του οποίου ανιχνεύτηκαν πολύ υψηλά ποσοστά εμβρυικής αιμοσφαιρίνης στους ασθενείς. Επίσης, εντοπίστηκαν 20 SNPs που σχετίζονται με τη μεταβολή ανά μονάδα όγκου της HbF, με σημαντικότερο τον rs , που βρίσκεται στο γονίδιο ARG2. Ακόμη, στα γονίδια ASS1 και ARG1 εντοπίστηκαν πολυμορφισμοί, που φαίνεται να σχετίζονται σημαντικά με τα επίπεδα της HbF, αν και τα γονίδια αυτά δεν εντοπίστηκαν με τις δύο παραπάνω αναλύσεις. Το εν λόγω εύρημα υποδηλώνει ότι ίσως τα γονίδια αυτά επηρεάζουν την απόκριση στην υδροξυουρία, δρώντας συνεργατικά με άλλα γονίδια (Ma et al,2007). Οι πολυμορφισμοί που ανιχνεύτηκαν συνοψίζονται στον πίνακα 1. Οι περισσότεροι SNPs που σχετίζονται με την HbF ως βιοδείκτη απόκρισης στη θεραπεία με υδροξυουρία και εντοπίστηκαν με την παραπάνω μελέτη εντοπίστηκαν, είτε σε μη μεταφραζόμενες περιοχές των γονιδίων, είτε σε ιντρόνια. Το πιο πιθανό είναι οι πολυμορφισμοί αυτοί να βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης με σημαντικά λειτουργικά στοιχεία και έτσι, να επηρεάζουν την απόκριση στο φάρμακο ή οι βιολογικοί μηχανισμοί στους οποίους εμπλέκονται να επηρεάζουν την έκφραση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης και τη συγκέντρωση της HbF (Ma et al,2007). Στην παρούσα μελέτη διερευνώνται δύο πολυμορφισμοί στο γονίδιο NOS2A, καθώς και ένας πολυμορφισμός στο γονίδιο ASS1. Το πρώτο γονίδιο κωδικοποιεί το ένζυμο συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου 2, ενώ το δεύτερο καταλύει το 36

37 προτελευταίο βήμα του βιοσυνθετικού μονοπατιού της αργινίνης, η οποία αποτελεί υπόστρωμα για τη σύνθεση του μονοξειδίου του αζώτου. Έτεροι πολυμορφισμοί στο γονίδιο ASS1 συσχετίζονται σημαντικά με την πρόβλεψη της απόκρισης ή μη στην υδροξυουρία (Ma et al,2007). Η έκφραση των ARG1, ARG2 και ASS1 έχει βρεθεί να διαφέρει ανάμεσα σε άτομα που αποκρίνονται στην υδροξυουρία και ασθενείς που δεν αποκρίνονται στη θεραπεία. Επίσης, η υδροξυουρία επάγει την φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση των ενζύμων NOS, τα οποία ανταγωνίζονται με τις αργινάσες, καθώς χρησιμοποιούν την αργινίνη ως υπόστρωμα σε διαφορετικά μονοπάτια (Pourfarzad,2012, Lou et al,2009). Τα επίπεδα των πρωτεϊνών NOS φαίνεται να μειώνονται κατά τη διαφοροποίηση των ερυθροκυττάρων, όπως και η γ-σφαιρίνη, πράγμα που ενισχύει τη συσχέτισή τους με την επαγωγή της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης, μέσω της παραγωγής και δράσης του μονοξειδίου του αζώτου (Cokic et al,2008). Η χορήγηση υδροξυουρίας σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία οδηγεί σε υψηλά επίπεδα των πρωτεϊνών NOS και μειωμένη ενεργότητα αργινάσης, κάτι που υποδεικνύει την ρύθμιση των επιπέδων ΝΟ από το φάρμακο και μέσω της ρύθμισης της ενεργότητας των πρωτεϊνών αυτών (Lou et al,2009). Πίνακας 1: SNPs που συσχετίστηκαν με την HbF από τη μελέτη του Ma και των συνεργατών του (Ma et al,2007) SNPs που σχετίζονται με τη μεταβολή των επιπέδων της HbF SNPs που σχετίζονται με τη μεταβολή (ανά μονάδα όγκου) της HbF Γονίδιο SNP Γονίδιο SNP HAO2 rs HAO2 rs MAP3K5 rs PDE7B rs MAP3K5 rs PDE7B rs TOX rs PDE7B rs TOX rs PDE7B rs TOX rs PDE7B rs TOX rs TOX rs TOX rs TOX rs NOS1 rs TOX rs NOS1 rs TOX rs FLT1 rs TOX rs FLT1 rs NOS1 rs

38 FLT1 rs NOS1 rs ARG2 rs FLT1 rs ARG2 rs FLT1 rs NOS2A rs FLT1 rs NOS2A rs FLT1 rs FLT1 ARG2 ARG2 rs rs rs Α.5.3 Το γονίδιο ASS1 Το γονίδιο αυτό εδράζεται στο χρωμόσωμα 9 και συγκεκριμένα, στη θέση 34q11 (εικόνα 10) και κωδικοποιεί για το ένζυμο αργινοηλεκτρική συνθετάση 1. Το ASS1 εκφράζεται σε όλους τους ιστούς (μεγαλύτερα ποσοστά έκφρασης στα ηπατοκύτταρα) και αποτελείται από 16 εξώνια και 16 ιντρόνια (OMIM). Έχει μέγεθος 63kb. Υπάρχουν αντίγραφά του στο γονιδίωμα, με μόνο λειτουργικό αυτό στο χρωμόσωμα 9 (RefGene). Εικόνα 10: θέση του γονιδίου ASS1 στο χρωμόσωμα 9 (Προσαρμογή από: Το ένζυμο αργινοηλεκτρική συνθετάση 1 συμμετέχει στον κύκλο της ουρίας. Συγκεκριμένα, καταλύει το τρίτο βήμα του κύκλου, την παραγωγή του αργινοηλεκτρικού οξέος από κιτρουλίνη και ασπαρτικό οξύ. Το μονοπάτι αυτό οδηγεί, τελικά, στην παραγωγή L-αργινίνης, η οποία αποτελεί υπόστρωμα και για τη σύνθεση του μονοξειδίου του Αζώτου (Qualls et al, 2012, Genetic Home References). 38

39 Α rs (A>G) Ο συγκεκριμένος πολυμορφισμός βρίσκεται σε ιντρόνιο του ASS1 και συγκεκριμένα, στη θέση 9: Έχει δείκτη MAF(minor allele frequency) 0,31 και οι συχνότητες στις οποίες εντοπίζεται σε Ευρωπαίους και Καυκάσιους, παρουσιάζονται στην εικόνα 11( Καυκάσιοι Ευρωπαίοι Α 62% G 38% Α 66% G 34% Εικόνα 11: Συχνότητες εμφάνισης του rs σε Ευρωπαίους και Καυκάσιους (Προσαρμογή από: Α.5.4 Το γονίδιο NOS2A Το γονίδιο αυτό εδράζεται στο χρωμόσωμα 17, συγκεκριμένα στη θέση 17q11.2 (εικόνα 12) και κωδικοποιεί για το ένζυμο συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου 2, που ονομάζεται και επαγώγιμη συνθετάση του NO (OMIM). Το NOS2A εκφράζεται κυρίως σε ηπατοκύτταρα, κύτταρα του αμφιβληστροειδούς, κύτταρα των οστών, στα μακροφάγα των πνευμονικών κυψελίδων και στα επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών στους πνεύμονες (Payton et al,2009, ProteinLounge.com). Αποτελείται από 26 εξώνια και 25 ιντρόνια. Έχει μέγεθος 37 kb (OMIM). Εικόνα 12: θέση του γονιδίου NOS2A στο χρωμόσωμα 17 (Προσαρμογή από: Το ένζυμο συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου 2 χρησιμοποιεί την L- αργινίνη ως υπόστρωμα για να παράγει μονοξείδιο του αζώτου και L-κιτρουλίνη, όπως φαίνεται στην εικόνα 13. Επίσης, το ένζυμο αυτό είναι υπεύθυνο για την 39

40 αύξηση της παραγωγής του μονοξειδίου του αζώτου ως απόκριση σε τραύμα ή μόλυνση (Payton et al,2009, OMIM). Εικόνα 13: Μονοπάτια δράσης των γονιδίων ASS1 και NOS2A(Προσαρμογή από: Α rs (C>T) Ο πολυμορφισμός αυτός βρίσκεται σε ιντρόνιο του NOS2A και συγκεκριμένα, στη θέση 17: Έχει δείκτη MAF ίσο προς 0,41 και οι συχνότητες στις οποίες εντοπίζεται σε Ευρωπαίους και Καυκάσιους, παρουσιάζονται στην εικόνα 14 ( Ευρωπαίοι Καυκάσιοι C 58% T 42% C 58% T 41% Εικόνα 14: Συχνότητες εμφάνισης rs σε Ευρωπαίους και Καυκάσιους (Προσαρμογή από: 40

41 Α rs (G>A) Ο πολυμορφισμός rs εδράζεται σε εξώνιο του NOS2A και συγκεκριμένα, στη θέση 17: Αποτελεί συνώνυμη αλλαγή. Έχει δείκτη MAF ίσο 0,19. Οι συχνότητες στις οποίες εντοπίζεται σε Ευρωπαίους και Καυκάσιους, παρουσιάζονται στην εικόνα 15 ( Καυκάσιοι Ευρωπαίοι G 78% A 22% G 76% A 24% Εικόνα 14: Συχνότητες εμφάνισης rs σε Ευρωπαίους και Καυκάσιους (Προσαρμογή από: 41

42 Α.6 Σκοπός της εργασίας Η β-θαλασσαιμία είναι μια κληρονομούμενη ασθένεια που παρουσιάζει μεγάλη ετερογένεια συμπτωμάτων και κλινικής εικόνας, πολλές φορές, απουσία γονοτυπικών διαφορών. Ο προσδιορισμός των παραγόντων και των γενετικών παραλλαγών που εμπλέκονται στην ετερογένεια της νόσου κρίνεται αναγκαίος, καθώς ίσως κάποιοι από αυτούς θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για θεραπευτικούς σκοπούς (Musallam et al, 2012). Έχει αποδειχτεί ότι η επαγωγή της παραγωγής της εμβρϋικής αιμοσφαιρίνης, HbF, τόσο σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία, όσο και σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία, βελτιώνει την κλινική τους εικόνα. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιούνται έρευνες για την ανεύρεση φαρμακευτικών παραγόντων που επάγουν την έκφραση της HbF. Ένας από τους παράγοντες αυτούς είναι η υδροξυουρία. Το φάρμακο αυτό χορηγείται για την αντιμετώπιση των παραπάνω ασθενειών, χωρίς όμως η χρήση του να έχει πάντα τα ίδια επιθυμητά αποτελέσματα. Η διερεύνηση των μηχανισμών και των γενετικών παραλλαγών που εμπλέκονται στη ρύθμιση και την επαγωγή της HbF, καθώς και στη δράση φαρμάκων (όπως η υδροξυουρία) θα μπορούσε να συμβάλλει στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση των ασθενειών αυτών (Banan,2013). Η παρούσα μελέτη στοχεύει στη διερεύνηση του ρόλου των γονιδιακών αλλαγών των ASS1 (rs ) και NOS2A (rs944725, rs ) στην αύξηση των επιπέδων της HbF Ελλήνων ασθενών με β-θαλασσαιμία και την ανταπόκρισή τους στην υδροξυουρία. Για το σκοπό αυτό, αναλύθηκαν δείγματα DNA σύνθετων ετεροζυγωτών για β-θαλασσαιμία μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων και δρεπανοκυτταρική αναιμία. Ταυτόχρονα, οι προαναφερθείσες γενετικές παραλλαγές διερευνήθηκαν σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων και μείζονα β-θαλασσαιμία, συγκριτικά με υγιείς εθελοντές. 42

43 Β. Υλικά και Μέθοδοι 43

44 44

45 Β.1 Δείγματα γενετικού υλικού (DNA) Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις διαφορετικές κατηγορίες δειγμάτων DNA: Δείγματα μη θαλασσαιμικών ατόμων (controls) Δείγματα ασθενών με β-μεσογειακή αναιμία μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων Δείγματα ασθενών με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία Δείγματα ασθενών, διπλά ετερόζυγων για μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία, στους οποίους χορηγείται Υδροξυουρία Όλα τα δείγματα προήλθαν από άτομα με ελληνική ιθαγένεια, από το Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών. Τα δείγματα ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία επιλέχτηκαν σύμφωνα με το κριτήριο της αυξημένης HbF (>50% της ολικής αιμοσφαιρίνης). Αυτοί οι ασθενείς σημειώνεται πως δεν έχουν συν-κληρονομήσει καμία μετάλλαξη για α-θαλασσαιμία, ούτε το σύνδρομο HPFH. Ακόμη, δε φέρουν επιπλέον αντίγραφα των γ γονιδίων στο γονιδίωμά τους (Papachatzopoulou et al,2006). Οι διπλά ετερόζυγοι ασθενείς ταξινομήθηκαν σε δύο ομάδες, ανάλογα με το αν ανταποκρίνονταν στη θεραπεία με Υδροξυουρία ή όχι (14 «ανταποκρινόμενοι», 23 «μη ανταποκρινόμενοι»). Ως δείκτης για την ανταπόκρισή τους στο φάρμακο χρησιμοποιήθηκε το % ποσοστό της HbF μετά τη θεραπεία. Όσοι ασθενείς παρουσίασαν αύξηση των επιπέδων της HbF>20%, θεωρήθηκαν «ανταποκρινόμενοι» στη θεραπεία. Αντίθετα, ασθενείς με αύξηση των επιπέδων της HbF<20%, θεωρήθηκαν «μη ανταποκρινόμενοι». Β.2 Απομόνωση DNA (ολικό αίμα) Η απομόνωση DNA από 3ml ολικού αίματος πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Gentra Puregene blood kit: 1. Προσθήκη 9ml διαλύματος λύσης RBC, σε σωλήνα φυγοκέντρου (falcon) χωρητικότητας 15ml. Το διάλυμα αυτό οδηγεί σε λύση των ερυθροκυττάρων. 2. Ήπια ανάδευση του δείγματος αίματος, προσθήκη στο διάλυμα λύσης RBC και ανάδευση στο σωλήνα (περίπου δέκα φορές για μέγιστη απόδοση) για ομογενοποίηση και λύση. 3. Επώαση 5 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου ( C) με ήπιες αναδεύσεις κατά τη διάρκεια. Για φρέσκο δείγμα (που συλλέχτηκε σε διάστημα μιας ώρας πριν την έναρξη της διαδικασίας) αυξάνεται κατά 3 λεπτά ο χρόνος επώασης για να επιτευχθεί ολοκληρωτική λύση των ερυθροκυττάρων. 45

46 4. Φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα 2000g για να ιζηματοποιηθούν τα λευκοκύτταρα. 5. Προσεχτική απόρριψη υπερκειμένου (μένουν περίπου 200λ μαζί με το ίζημα των λευκοκυττάρων). Σε περίπτωση που το ίζημα δεν είναι καθαρό, πραγματοποιείται επανάληψη των βημάτων 4 και 5 προσθέτοντας τον τριπλάσιο όγκο RBC (600λ) και επωάζοντας για 10 λεπτά χωρίς ανάδευση. 6. Έντονη ανάδευση σε συσκευή vortex, για πλήρη επαναδιάλυση του ιζήματος. 7. Προσθήκη 3ml cell lysis solution και ανάδευση σε συσκευή vortex για 10sec για πλήρη επαναδιάλυση. Αν δεν πραγματοποιείται ομογενοποίηση, ακολουθεί επώαση στους 37 0 C μέχρι το διάλυμα να ομογενοποιηθεί. 8. Προσθήκη 1ml protein precipitation solution για κατακρήμνιση των πρωτεϊνών και έντονη ανάδευση σε συσκευή vortex για 20 δευτερόλεπτα σε υψηλή ταχύτητα. 9. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 2000g. Οι πρωτεΐνες που έχουν κατακρημνιστεί πρέπει να σχηματίζουν ένα σφιχτό ίζημα. Διαφορετικά, ακολουθεί επώαση για 5 λεπτά και επαναλαμβάνεται η φυγοκέντρηση. 10. Προσθήκη 3ml ισοπροπανόλης σε καθαρό σωλήνα και προσεχτική προσθήκη του υπερκειμένου. 11. Ήπια ανάδευση για ομογενοποίηση 50 φορές μέχρι το DNA να είναι ορατό ως κλωστές ή ογκίδιο. Με τη διαδικασία αυτή επιτυγχάνεται συμπύκνωση του γενετικού υλικού. 12. Φυγοκέντρηση για 3 λεπτά στα 2000g. Το DNA μπορεί να είναι ορατό σαν λευκό ίζημα. 13. Προσεχτική απομάκρυνση του υπερκειμένου και ξήρανση με αναστροφή του σωλήνα, προσέχοντας να μην απομακρυνθεί το ίζημα για περίπου 5 λεπτά. 14. Προσθήκη 3ml 70% παγωμένης αιθανόλης και ανάδευση για πλύση. Η αιθανόλη απομακρύνει επίσης την ισοπροπανόλη. 15. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 2000g 16. Προσεχτική απομάκρυνση του υπερκειμένου και ξήρανση για 5-10 λεπτά 17. Προσθήκη 100λ DNA hydration solution και ανάδευση σε συσκευή vortex για 5 δευτερόλεπτα σε μέση ταχύτητα για ομογενοποίηση. Το διάλυμα αυτό εκλούει το DNA και το διαλυτοποιεί. Πρέπει να βρίσκεται στους 65 0 C για βέλτιστη απόδοση. 18. Επώαση στους 65 0 C για 1 ώρα. 19. Επώαση υπό ήπια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου overnight (18 ώρες) Στη συνέχεια, τα δείγματα μπορούν να μεταφερθούν σε tubes αποθήκευσης, όπου και διατηρούνται στους C. 46

47 Β.3 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA Για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του DNA που απομονώθηκε, χρησιμοποιήθηκε η συσκευή NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer (φασματοφωτόμετρο πλήρους φάσματος). Η συσκευή αυτή έχει τη δυνατότητα μέτρησης της συγκέντρωσης γενετικού υλικού, αλλά και πρωτεϊνών. Αρχικά, πραγματοποιείται μηδενισμός της συσκευής με τη χρήση διαλύματος έκλουσης DNA. Στη συνέχεια, τοποθετείται δείγμα όγκου 1μl στην ειδική βάση, όταν ο βραχίονας είναι ανοιχτός. Το δείγμα σχηματίζει στήλη με το κλείσιμο του βραχίονα, ο οποίος μετακινείται προς τα κάτω και υπολογίζει τη συγκέντρωση του δείγματος μέσω οπτικών ινών. Ταυτόχρονα, πραγματοποιείται άμεση καταγραφή των αποτελεσμάτων σε υπολογιστή. Η φωτομέτρηση του δείγματος γίνεται σε μήκος κύματος 260nm, όπου απορροφά το DNA. Επίσης, πραγματοποιείται μέτρηση του δείγματος στα 280nm, όπου απορροφούν οι πρωτεΐνες για να εντοπιστεί η τυχόν παρουσία τους στο δείγμα, καθώς και στα 230nm, για να εντοπιστεί η πιθανή παρουσία οργανικών προσμίξεων. Ο εν λόγω υπολογισμός πραγματοποιείται, χρησιμοποιώντας το λόγο της τιμής της οπτικής απορρόφησης (O.D.) στα 260nm προς την τιμή της οπτικής απορρόφησης στα 280nm ή στα 230nm, αντίστοιχα. Στην πρώτη περίπτωση, λόγος με τιμή 1,8-2 υποδεικνύει καθαρό DNA, ενώ αν ο λόγος αυτός έχει τιμή μικρότερη του 1,8 στο δείγμα υπάρχουν πρωτεΐνες και ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA δεν μπορεί να θεωρηθεί ακριβής. Στη δεύτερη περίπτωση, ο λόγος των δύο τιμών πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 2,0-2,2, ώστε το δείγμα DNA να μπορεί να θεωρηθεί καθαρό και η μέτρηση της συγκέντρωσης του DNA αξιόπιστη. Β.4 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Β.4.1 Βασική αρχή της μεθόδου Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκε κατά κύριο λόγο η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Η μέθοδος αυτή περιγράφηκε πρώτη φορά από τον Kary Mullis στη δεκαετία του 1980 (Mullis et al. 1992). Κατά τη PCR, πραγματοποιείται εκθετικός πολλαπλασιασμός των μορίων DNA, με τη βοήθεια του ενζύμου DNA πολυμεράση. Σήμερα, χρησιμοποιείται κυρίως η θερμοσταθερή πολυμεράση του βακτηρίου Thermus aquaticus, η Taq πολυμεράση. Το ένζυμο αυτό διαθέτει την ικανότητα να προσθέτει νουκλεοτίδια στο 3 ΟΗ άκρο ενός ολιγονουκλεοτιδίου. Ως εκ τούτου, για να πραγματοποιηθεί η αντίδραση χρειάζεται ένα ζεύγος συνθετικών ολιγονουκλεοτιδικών τμημάτων DNA, που το κάθε ένα είναι συμπληρωματικό με έναν από τους δύο κλώνους του DNA. Τα τμήματα αυτά αποτελούν τους εκκινητές («primers»). Κατά τη διαδικασία, πραγματοποιείται αποδιάταξη του δίκλωνου DNA, ώστε να μπορέσουν να προσδεθούν οι εκκινητές στα συμπληρωματικά τους τμήματα. Το ζεύγος εκκινητών, ουσιαστικά, απομονώνει την περιοχή που θα πολλαπλασιαστεί μέσω της αντίδρασης. Με την πρόσδεση των 47

48 εκκινητών, δημιουργείται το απαραίτητο υπόστρωμα για τη δράση της πολυμεράσης, η οποία προσθέτει δεοξυριβονουκλεοτίδια, συμπληρωματικά προς τον κλώνο-στόχο κάθε φορά, με κατεύθυνση 5-3, επιμηκύνοντας τη νεοσχηματιζόμενη αλυσίδα. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα στους θερμικούς κυκλοποιητές. Ένα ενδεικτικό πρόγραμμα για την πραγματοποίηση της αντίδρασης αποδίδεται ακόλουθα: C για 2 min (αποδιάταξη του DNA) C για 15 sec C, ανάλογα με τη θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών, για 15sec (υβριδοποίηση εκκινητών με το συμπληρωματικό τους DNA στόχο) C για 1sec (δράση Taq πολυμεράσης και επιμήκυνση αλυσίδας) 5. Επανάληψη από το βήμα 2 για 39 φορές C για 30 sec C (διατήρηση των pcr προϊόντων) Καθώς επαναλαμβάνονται τα παραπάνω βήματα για κύκλους, τα μόρια που παρήχθησαν σε ένα κύκλο χρησιμοποιούνται ως στόχοι για κάθε νέο κύκλο. Η αύξηση των μορίων DNA είναι εκθετική και θεωρητικά ισούται με 2 n (n: αριθμός κύκλων). Πρακτικά, η πραγματική απόδοση της αντίδρασης είναι μικρότερη. Σχηματικά, η αντίδραση αναπαρίσταται στην εικόνα 15. Εικόνα 15: Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης, PCR (Προσαρμογή από: en.wikipedia.org) Β PCR-Gradient Ο συγκεκριμένος τύπος PCR πραγματοποιείται για να εντοπιστεί η βέλτιστη θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών με το DNA-στόχο. Η επιλογή των θερμοκρασιών που θα δοκιμαστούν γίνεται με βάση τις θερμοκρασίες υβριδισμού των εκκινητών. Συνήθως, οι δύο οριακές θερμοκρασίες που ορίζονται για την PCR gradient είναι λίγο πιο πάνω και λίγο πιο κάτω από τις θερμοκρασίες αυτές. Κατά την 48

49 PCR gradient, ορίζεται διαφορετική θερμοκρασία αντίδρασης σε κάθε θέση με συγκεκριμένο πρόγραμμα του κυκλοποιητή (gradient calculator),. Β PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System) με τρεις εκκινητές Ο συγκεκριμένος τύπος PCR χρησιμοποιείται, τόσο για την ανίχνευση μεταλλάξεων, όσο και για την ανίχνευση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στο ότι η έλλειψη συμπληρωματικότητας ανάμεσα στο 3 νουκλεοτίδιο ενός εκκινητή και την αλληλουχία-στόχο του DNA οδηγεί σε μείωση ή παρεμπόδιση της επιμήκυνσης του μορίου από την Taq πολυμεράση. H Taq πολυμεράση δε διαθέτει δράση 3-5 εξωνουκλεάσης κι έτσι, δεν μπορεί να απομακρύνει το μη συμπληρωματικό νουκλεοτίδιο, ώστε να συνεχίσει την επιμήκυνση. Επομένως, χωρίς πλήρη συμπληρωματικότητα στο 3 άκρο, η αντίδραση δε θα είναι αποδοτική και θα αποδώσει ελάχιστο έως καθόλου προϊόν. Για τον εντοπισμό ενός SNP με τη μέθοδο αυτή, χρησιμοποιείται α) ένας εκκινητής συμπληρωματικός με το πολυμορφικό νουκλεοτίδιο, προκειμένου να πραγματοποιηθεί η ενίσχυση της αλληλουχίας από τον εκκινητή, εάν υπάρχει ο πολυμορφισμός και β) ένας εκκινητής συμπληρωματικός για το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο, έτσι, ώστε αν πραγματοποιηθεί ενίσχυση της αλληλουχίας από τον εκκινητή, το γεγονός αυτό να συνάδει με την απουσία του πολυμορφισμού στην αλληλουχία που μελετάται. Αν και οι δύο εκκινητές ενισχύσουν την αλληλουχία υπό μελέτη, το άτομο είναι ετεροζυγώτης και φέρει τον πολυμορφισμό που μελετάται μόνο στο ένα αλληλόμορφο. Παράδειγμα τέτοιας αντίδρασης φαίνεται στην εικόνα

50 Εικόνα 15:PCR ARMS με 3 εκκινητές (Προσαρμογή από: Human Molecular Genetics, Garland Science 2004) Β.4.2 Σχεδιασμός εκκινητών (primers) Ο σχεδιασμός των εκκινητών αποτελεί ένα σημαντικό βήμα για τη σωστή απόδοση της PCR. Ανάλογα με το είδος PCR που εφαρμόζεται κάθε φορά, σχεδιάζονται και οι αντίστοιχοι εκκινητές. Β Σχεδιασμός εκκινητών για απλή PCR Για το σχεδιασμό εκκινητών για απλή αντίδραση PCR ακολουθούνται τα εξής βήματα: 1. Μέσω της βάσης ensembl ( πραγματοποιείται o εντοπισμός του SNP που μελετάται, καθώς και της αλληλουχίας που τον περιβάλλει (flanking sequence). Η βάση αυτή δίνει χρήσιμες πληροφορίες για κάθε γονίδιο, όπως την ακριβή θέση και το μήκος του γονιδίου, αλλά και για κάθε πολυμορφισμό (τη συχνότητα εμφάνισής του σε συγκεκριμένους πληθυσμούς). 2. Για το σχεδιασμό των εκκινητών χρησιμοποιείται το πρόγραμμα Primer 3 input, version 0.4.0( Με την εισαγωγή της αλληλουχίας που περιβάλει τον πολυμορφισμό, αφού σημειωθεί ο πολυμορφισμός και αποκλειστούν οι περιοχές που θεωρούνται ακατάλληλες για το σχεδιασμό εκκινητών, το πρόγραμμα προτείνει ζεύγη εκκινητών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση και τον πολλαπλασιασμό της επιθυμητής αλληλουχίας. Για την επιλογή του καταλληλότερου από τα προτεινόμενα ζεύγη εκκινητών χρησιμοποιούνται κριτήρια, όπως το μήκος των εκκινητών (17-20 νουκλεοτίδια), η διαφορά 50

51 μεταξύ των θερμοκρασιών υβριδοποίησης των εκκινητών (ιδανικά 1-2 βαθμοί), το ποσοστό σε G/C (40-60%) και αν υπάρχουν αλληλουχίες Α-Τ στο 3 άκρο τους (αποφεύγονται για σταθερότερη πρόσδεση εκκινητή-dna στόχου). 3. Ελέγχεται η ειδικότητα των εκκινητών στο γονιδίωμα. Αποφεύγονται τα ζεύγη εκκινητών με πολλά σημεία αναγνώρισης προς αποφυγή της δημιουργίας παραπροϊόντων. Ο έλεγχος της ειδικότητας πραγματοποιείται μέσω της επιλογής Blast/Blat της βάσης ensembl. 4. Ελέγχεται, αν οι δύο εκκινητές είναι συμπληρωματικοί μεταξύ τους (πρόγραμμα DNAMAN). Αν ναι, θα σχηματίσουν διμερή, μειώνοντας την απόδοση της αντίδρασης. 5. Ελέγχεται με το πρόγραμμα DINA MELT-two state melting ( αν στο PCR προϊόν που θα παραχθεί θα σχηματιστούν βρόγχοι. Β Σχεδιασμός εκκινητών για PCR-ARMS Στο συγκεκριμένο τύπο PCR, απαιτείται ο σχεδιασμός τριών εκκινητών: ενός συμπληρωματικού με τον πολυμορφισμό στο 3 άκρο, ενός συμπληρωματικού με το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο στο 3 άκρο και ενός συμπληρωματικού με τον άλλο κλώνο, που είναι κοινός για όλες τις αντιδράσεις. Για τον σχεδιασμό των εκκινητών αυτών ακολουθούνται τα παρακάτω βήματα: 1. Εντοπισμός του SNP και της αλληλουχίας που τον περιβάλλει στη βάση ensembl και εισαγωγή της στο πρόγραμμα Primer 3 input, version 0.4.0, όπως κατά το σχεδιασμό εκκινητών για απλή αντίδραση pcr. Η διαφορά βρίσκεται στο ότι οι δύο εκκινητές, ο συμπληρωματικός για τον πολυμορφισμό και ο συμπληρωματικός για το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο είναι ήδη γνωστοί. Αποτελούνται από τον SNP (ή το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο, αντίστοιχα) και τα 19 ακόμη νουκλεοτίδια, που ακολουθούν στην υπό μελέτη αλληλουχία του DNA. Ως εκ τούτου, αυτοί οι εκκινητές εισάγονται στο πρόγραμμα, το οποίο προτείνει τον συμπληρωματικό για τον άλλο κλώνο εκκινητή. Από τους προτεινόμενους εκκινητές επιλέγονται αυτοί που προτείνει το πρόγραμμα και στις δύο περιπτώσεις και στη συνέχεια, εξετάζονται τα προαναφερθέντα κριτήρια για τα δύο ζεύγη εκκινητών (κοινός-συμπληρωματικός για τον SNP, κοινός-συμπληρωματικός για το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο). Είναι σημαντικό, τέλος, ο κοινός εκκινητής να αντιδρά το ίδιο αποδοτικά και στις δύο περιπτώσεις, ώστε να υπάρχει αξιόπιστο αποτέλεσμα. 2. Πραγματοποιούνται οι προαναφερθείσες δοκιμασίες (blat/blast, dinaman και dinamelt) για τα δύο διαφορετικά ζεύγη εκκινητών και εν τέλει, επιλέγονται οι εκκινητές προς χρήση. 51

52 B.4.3 Πρωτόκολλο και αντιδραστήρια PCR Για την πραγματοποίηση όλων των PCR, χρησιμοποιήθηκε το σύστημα KAPA2G Fast HotStart ReadyMix (KAPABIOSYSTEMS, MA,USA), το οποίο περιλαμβάνει: Taq KAPA2G Fast HotStart DNA πολυμεράση, το βασικό ένζυμο που απαιτείται για την πραγματοποίηση της αντίδρασης Ρυθμιστικό διάλυμα KAPA2G Fast HotStart PCR (Buffer), MgCl 2 σε συγκέντρωση 1.5 mm, το οποίο συμβάλλει στη δράση της πολυμεράσης και την υβριδοποίηση των εκκινητών με το DNA-στόχο dntps, σε συγκέντρωση 0.2mM Το σύστημα αυτό βελτιώνει το χρόνο αντίδρασης κατά 20-70% σε σχέση με τις συμβατικές PCR και παρέχει αντιδράσεις υψηλών αποδόσεων. Φυλάσσεται σε θερμοκρασία C. Όλες οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε στείρες συνθήκες για την αποφυγή επιμολύνσεων και σε πάγο, για τη διατήρηση των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων. Κατά την πραγματοποίησή τους, χρησιμοποιήθηκαν ακρορύγχια με φίλτρο (filter tips) και strips 8 θέσεων, χωρητικότητας 0,2ml (Kisker, Lab Supplies). Σε όλες τις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν τα αντιδραστήρια που αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα 2, με τη σειρά που αναγράφονται. Μετά την προσθήκη των αντιδραστηρίων τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε θερμικό κυκλοποιητή (labtech technologies), ρυθμισμένο στο κατάλληλο πρόγραμμα, ανάλογα με τον πολυμορφισμό που αναλυόταν κάθε φορά. Πίνακας 2: Αντιδραστήρια PCR Αντιδραστήριο Αρχική συγκέντρωση Τελική συγκέντρωση ddh KAPA2G Fast HotStart ReadyMix 2Χ 1Χ Ευθύς εκκινητής, (Forward Primer, F) 10μΜ 0,5μΜ Αντίστροφος εκκινητής (Reverse Primer,R) 10μΜ 0,5μΜ Δείγμα DNA 50ng/μl 50 ng/αντίδραση 52

53 Β Πρωτόκολλο γονοτύπησης του rs (NOS2A) Για τη γονοτύπηση του πολυμορφισμού rs εφαρμόστηκε PCR-ARMS. Η μέθοδος προτυπώθηκε με αλληλούχηση κατά Sanger. Για την πραγματοποίηση της PCR-ARMS χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω εκκινητές (Eurofins Genomics): Ευθύς εκκινητής: 5 CACCATGCCGAAGAGTGC 3 (Tm:58,82 0 C) Αντίστροφος εκκινητής 1(ενισχύει το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο): 5 GCCATCTTTTTGTTGGGGAG 3 (Tm:57,25 0 C) Reverse Primer 2 (ενισχύει τον πολυμορφισμό): 5 GCCATCTTTTTGTTGGGGAA 3 (Tm:56,78 0 C) Από την αντίδραση αυτή προκύπτει PCR-ARMS προϊόν, μεγέθους 339bp. Κατά την προτύπωση της μεθόδου, χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εκκινητές (Eurofins Genomics): Ευθύς εκκινητής: 5 CGAAGAGTGCAGCCTCCAA 3 (Tm:60 0 C) Αντίστροφος εκκινητής: 5 TCAGCACCAGGGTTTCTAGC 3 (Tm:59,7 0 C) Από την αντίδραση αυτή προκύπτει PCR προϊόν, μεγέθους 520bp. Κατά τις αντιδράσεις PCR-ARMS και PCR, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντιδραστήρια στις συγκεντρώσεις και τους όγκους που καταγράφονται στον πίνακα 3. Πίνακας 3: συγκεντρώσεις και ποσότητες αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη γονοτύπηση του πολυμορφισμού rs Αντιδραστήριο Αρχική συγκέντρωση Τελική συγκέντρωση Όγκος (μl) PCR-ARMS Όγκος(μl) αλληλούχηση κατά Sanger ddh KAPA2G Fast HotStart 2Χ 1Χ 7,5 12,5 ReadyMix Ευθύς εκκινητής (Forward Primer, 10μΜ 0,5μΜ 0,75 1,25 F) Αντίστροφος εκκινητής 10μΜ 0,5μΜ 0,75 1,25 (Reverse Primer,R) Δείγμα DNA 50ng/μl 50ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος κάθε αντίδρασης: PCR-ARMS:15μl, αλληλούχηση κατά Sanger:25μl Για την πραγματοποίηση των PCR αντιδράσεων, ο θερμικός κυκλοποιητής ρυθμίστηκε στο παρακάτω πρόγραμμα: 53

54 C για 2 min (αποδιάταξη του DNA) C για 15 sec (περιθώριο για πλήρη αποδιάταξη) C, κατά την PCR-ARMS, 62 0 C για την PCR για 15sec (υβριδοποίηση εκκινητών με το συμπληρωματικό τους DNA-στόχο) C για 1 sec (δράση πολυμεράσης και επιμήκυνση αλυσίδας) 5. Επανάληψη από το βήμα 2 για 39 φορές C για 30 sec C (διατήρηση των PCR-ARMS/PCR προϊόντων) Για τον εντοπισμό της κατάλληλης θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών με το DNA στόχο, προηγήθηκε η εφαρμογή της PCR gradient. Δοκιμάστηκαν οι θερμοκρασίες 60 0 C, 59 0 C, C, 57 0 C και C (PCR-ARMS) και 62 0 C, 61 0 C, C, 59 0 C, C και 57 0 C (PCR). Μετά την αντίδραση, τα PCR-ARMS/PCR προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης για έλεγχο της απόδοσης της αντίδρασης, της απουσίας επιμολύνσεων και παραπροϊόντων και στην περίπτωση της PCR-ARMS, για άμεση γονοτύπηση των δειγμάτων. Οι συνθήκες ηλεκτροφόρησης για την ανάλυση του συγκεκριμένου πολυμορφισμού ήταν: 85volts για 25 λεπτά σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 1,5% (PCR-ARMS) και 1% (PCR). B Πρωτόκολλο γονοτύπησης του rs (NOS2A) Για τη γονοτύπηση του πολυμορφισμού rs εφαρμόστηκε PCR-ARMS. Η μέθοδος προτυπώθηκε με αλληλούχηση κατά Sanger. Για την πραγματοποίηση της PCR-ARMS χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω εκκινητές (Eurofins Genomics): Ευθύς εκκινητής: 5 CCTGTTGCTGGACCTCTAGA 3 (Tm:58,44 0 C) Αντίστροφος εκκινητής 1 (ενισχύει το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο) 5 GAGTCCGGGACTTCTGTGAC 3 (Tm:59,76 0 C) Αντίστροφος εκκινητής 2(ενισχύει τον πολυμορφισμό): 5 GAGTCCGGGACTTCTGTGAT 3 (Tm:58,81 0 C) Το μέγεθος του PCR-ARMS προϊόντος που προκύπτει είναι 358bp. Κατά την προτύπωση της μεθόδου, χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εκκινητές (Eurofins Genomics): Ευθύς εκκινητής: 5 TGTTGCTGGACCTCTAGAGTG 3 (Tm:59,10 0 C) Αντίστροφοςεκκινητής: 5 TTGGGCCCAGGAGTTAAAGG 3 (Tm:59,59 0 C) Το μέγεθος του PCR προϊόντος που προκύπτει είναι 551bp. Στον πίνακα 4 καταγράφονται τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για τις αντιδράσεις αυτές, οι όγκοι και οι συγκεντρώσεις τους. Κατά την PCR-ARMS, 54

55 χρειάστηκε η προσθήκη DMSO (5%) και βεταΐνης (1Μ), γιατί σχηματίζονταν δομές βρόγχων στους εκκινητές, μειώνοντας την απόδοση (και την ειδικότητα) της αντίδρασης (Frackman et al, 1998). Πίνακας 4: συγκεντρώσεις και ποσότητες αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη γονοτύπηση του πολυμορφισμού rs Αντιδραστήριο Αρχική συγκέντρωση Τελική συγκέντρωση Όγκος (μl) PCR- ARMS Όγκος(μl) αλληλούχηση κατά Sanger ddh ,25 9 DMSO 0,75 - Βεταίνη 5Μ 1Μ 3 - KAPA2G Fast HotStart 2Χ 1Χ 7,5 12,5 ReadyMix Ευθύς εκκινητής (Forward Primer, 10μΜ 0,5μΜ 0,75 1,25 F) Αντίστροφος εκκινητής 10μΜ 0,5μΜ 0,75 1,25 (Reverse Primer,R) Δείγμα DNA 50ng/μl 50ng/αντίδραση 1 1 Τελικός όγκος κάθε αντίδρασης: PCR-ARMS:15μl, αλληλούχηση κατά Sanger:25μl Κατά τη διεξαγωγή των αντιδράσεων αυτών, ο θερμικός κυκλοποιητής ρυθμίστηκε στο εξής πρόγραμμα: C για 2min (αποδιάταξη του DNA) C για 15sec (περιθώριο για πλήρη αποδιάταξη) C, κατά την PCR-ARMS, με προσθήκη DMSO-Βεταΐνης, 60 0 C για την PCR για 15sec (υβριδοποίηση εκκινητών με το συμπληρωματικό τους DNAστόχο) C για 1sec (δράση πολυμεράσης και επιμήκυνση αλυσίδας) 5. Επανάληψη από το βήμα 2 για 39 φορές C για 30sec C (διατήρηση των pcr προϊόντων) Για τον εντοπισμό της κατάλληλης θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών με το DNA-στόχο, χρησιμοποιήθηκε PCR gradient. Αρχικά, για την PCR- ARMS δοκιμάστηκαν οι θερμοκρασίες 60 0 C, 59,1 0 C, 58 0 C και 57,1 0 C, που λόγω της προσθήκης Βεταΐνης δεν έδωσαν ικανοποιητικό αποτέλεσμα, οπότε στη συνέχεια δοκιμάστηκαν οι εξής χαμηλότερες θερμοκρασίες: 58 0 C, 57 0 C, 56,1 0 C, 55 0 C και 53 0 C. Κατά τις αντιδράσεις PCR που πραγματοποιήθηκαν, δοκιμάστηκαν οι θερμοκρασίες 62 0 C, 61 0 C, 60,1 0 C, 59 0 C, 58,1 0 C και 57 0 C. 55

56 Μετά την αντίδραση, τα PCR-ARMS/PCR προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι συνθήκες ηλεκτροφόρησης για την ανάλυση του συγκεκριμένου πολυμορφισμού ήταν: 85volts για 25 λεπτά σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 1,5% (PCR-ARMS) και 1% (PCR). B.4.4 PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism), γονοτύπηση με κατάτμηση PCR προϊόντων με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Με την τεχνική αυτή, πραγματοποιείται η γονοτύπηση των δειγμάτων με τη βοήθεια ενζύμων περιορισμού (περιοριστικές ενδονουκλεάσες). Τα ένζυμα αυτά, έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν συγκεκριμένες ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες (4-8 ζεύγη βάσεων) στο δίκλωνο DNA, καθώς και να κόβουν μέσα ή κοντά στις αλληλουχίες αυτές, υδρολύοντας τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. Οι αλληλουχίες που αναγνωρίζονται από το ένζυμο αποτελούν τις «περιοριστικές θέσεις» και μπορούν να είναι παλίνδρομες. Μετά την κατάτμηση από το ένζυμο, μπορεί να προκύπτουν θραύσματα γενετικού υλικού, τόσο με προεξέχοντα, όσο και με τυφλά άκρα. Για τη γονοτύπηση με τη βοήθεια ενζύμων περιορισμού, αναγκαία προϋπόθεση αποτελεί, ο πολυμορφισμός που μελετάται να περιέχεται στην αλληλουχία αναγνώρισης ενός τέτοιου ενζύμου. Αρχικά, απομονώνεται και πολλαπλασιάζεται η αλληλουχία που περιλαμβάνει τον πολυμορφισμό και στη συνέχεια, πραγματοποιείται η κατάτμηση με το κατάλληλο περιοριστικό ένζυμο. Επειδή τα ένζυμα αυτά, αναγνωρίζουν και κατατέμνουν συγκεκριμένες αλληλουχίες, το ένζυμο θα επιτελέσει τη διαδικασία της κατάτμησης, μόνο αν στην αλληλουχία αναγνώρισης βρίσκεται ο πολυμορφισμός που μελετάται αν στην αλληλουχία αυτή βρίσκεται το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο. Ανάλογα με το αν θα πραγματοποιηθεί κατάτμηση ή όχι, προκύπτουν διαφορετικά τμήματα DNA. Με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης, εντοπίζεται το μέγεθος των ζωνών DNA που προκύπτουν μετά την κατάτμηση και αναλόγως, ο γονότυπος. Για τον εντοπισμό κατάλληλου περιοριστικού ενζύμου, το οποίο αναγνωρίζει και κόβει σε θέση στην οποία περιέχεται ο SNP που μελετάται, χρησιμοποιείται το πρόγραμμα NEB cutter (v2.0)( Στο πρόγραμμα αυτό, εισάγεται η αλληλουχία του PCR προϊόντος, μια φορά με τον SNP και μία με το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο, ώστε το πρόγραμμα να εντοπίσει το ένζυμο που αναγνωρίζει μόνο το ένα από τα δύο νουκλεοτίδια. Το ένζυμο περιορισμού μπορεί να κατατέμνει την αλληλουχία σε περισσότερα του ενός σημεία, αρκεί να μπορούν να αναγνωριστούν οι ζώνες κατά την ηλεκτροφόρηση, ώστε να πραγματοποιηθεί αξιόπιστα η γονοτύπηση. Γενικά, το μέγεθος των περιοριστικών θραυσμάτων που δημιουργούνται δεν πρέπει να είναι πολύ μικρότερο από 100bp, ώστε οι ζώνες να είναι διακριτές. Επίσης, αν το ένζυμο πραγματοποιεί κατάτμηση, δημιουργώντας 56

57 θραύσματα με τυφλά άκρα, πρέπει να κόβει ακριβώς στην πολυμορφική θέση για να μπορεί να χρησιμοποιηθεί κατά τη γονοτύπηση. Τέλος, γίνεται έλεγχος για το αν μπορεί να δημιουργηθεί η αλληλουχία αναγνώρισης του ενζύμου σε κάποια άλλη πολυμορφική θέση στην αλληλουχία του PCR προϊόντος, Β PCR-RFLP ανάλυση για τον rs (ASS1) Για τη γονοτύπηση του πολυμορφισμού αυτού, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος PCR-RFLP. Για την πραγματοποίηση της PCR χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εκκινητές (Eurofins Genomics): Forward Primer: 5 CCTTCTGTCCATCATCCCCC 3 (Tm:59,5 0 C) Reverse Primer: 5 GCTGAAAGCGCACTCGAATC 3 (Tm:60,2 0 C) Το μέγεθος του PCR προϊόντος που προκύπτει είναι 551bp. Στον πίνακα 5, καταγράφονται τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν. Πίνακας 5: συγκεντρώσεις και ποσότητες αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη γονοτύπηση του πολυμορφισμού rs Αρχική Τελική Όγκος (μl) Αντιδραστήριο συγκέντρωση συγκέντρωση ddh KAPA2G Fast HotStart 2Χ 1Χ 12,5 ReadyMix Ευθύς εκκινητής (Forward Primer, 10μΜ 0,5μΜ 1,25 F) Αντίστροφος εκκινητής 10μΜ 0,5μΜ 1,25 (Reverse Primer,R) Δείγμα DNA 50ng/μl 50ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος κάθε αντίδρασης:25μl Κατά τη διεξαγωγή των PCR αντιδράσεων χρησιμοποιήθηκε το εξής πρόγραμμα: C για 2 min (αποδιάταξη του DNA) C για 15 sec (περιθώριο για πλήρη αποδιάταξη) C για 15 sec (υβριδοποίηση εκκινητών με το συμπληρωματικό τους DNAστόχο) C για 1sec (δράση πολυμεράσης και επιμήκυνση αλυσίδας) 5. Επανάληψη από το βήμα 2 για 39 φορές C για 30 sec 57

58 C (διατήρηση των pcr προϊόντων) Για τον εντοπισμό της κατάλληλης θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών με το DNA-στόχο, εφαρμόστηκε PCR gradient, στην οποία δοκιμάστηκαν οι παρακάτω θερμοκρασίες: 61 0 C, 60,1 0 C, 59 0 C, 58,1 0 C. Μετά την αντίδραση, τα PCR προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν στα 85volts για 25 λεπτά σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 1%. Το ένζυμο που επιλέχτηκε μέσω του προγράμματος NEB cutter (v2.0) για τη γονοτύπηση του πολυμορφισμού αυτού είναι το MluCI (New England, BioLabs). Το MluCI αναγνωρίζει την παρακάτω θέση: 5' A A T T... 3' 3'...T T A A... 5' Το MluCI δημιουργεί προεξέχοντα άκρα στο 5 άκρο και κατατέμνει την αλληλουχία μεταξύ αδενίνης και θυμίνης. Ο πολυμορφισμός που μελετάται είναι Α/G, οπότε το ένζυμο θα κόψει την αλληλουχία, μόνο, εάν το άτομο είναι ομόζυγο για το φυσιολογικό αλληλόμορφο (Α/Α) ή ετερόζυγο για τον πολυμορφισμό (Α/G). Προκειμένου το εν λόγω ένζυμο να δράσει με πλήρη απόδοση χρειάζεται το ρυθμιστικό διάλυμα CutSmart από το οποίο συνοδεύεται. Η σύσταση του διαλύματος αυτού είναι η ακόλουθη: 50Mm οξικό κάλιο, 20mM Tris οξικό, ph=7,9 στους 25 0 C, 10mM οξικό μαγνήσιο και BSA:100μg/ml. Το ένζυμο αποθηκεύεται στους C. Δρα σε θερμοκρασία 37 0 C, σε συγκέντρωση 1Χ CutSmart buffer και χαρακτηρίζεται ως «time saver» (απαιτούνται 5-15 λεπτά στην παραπάνω θερμοκρασία για να επιτελέσει πλήρη πέψη). Η συσκευασία στην οποία παραλήφθηκε το ένζυμο ήταν τα 1000 units σε συγκέντρωση units/ml (1unit ορίζεται ως το ποσό του ενζύμου που απαιτείται, ώστε να γίνει πέψη 1μg DNA/μl σε 1 ώρα, στους 37 0 C με τελικό όγκο αντίδρασης 50μl). Για την αντίδραση της κατάτμησης και τη γονοτύπηση του rs , δοκιμάστηκαν οι συνθήκες: 5 units ενζύμου στους 37 0 C για 10, 15 και 30 λεπτά, καθώς και 10 units ενζύμου στους 37 0 C για 10, 15 και 30 λεπτά. Τελικά επιλέχτηκαν ως καταλληλότερες συνθήκες αντίδρασης οι εξής: 5 units ενζύμου στους 37 0 C, για 15 λεπτά. Οι γονότυποι που χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή των συνθηκών αυτών επιβεβαιώθηκαν και με αλληλούχηση κατά Sanger. Η επώαση με το ένζυμο πραγματοποιήθηκε στη συσκευή Dry Block Heating Thermostat (Bio TDB-120) της Biosan. Για τις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν τα αντιδραστήρια στους όγκους που αναγράφονται στον πίνακα 6. 58

59 Πίνακας 6: όγκοι και αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την αντίδραση κατάτμησης Buffer (cutsmart) 1,5 H 2 O 3 Ένζυμο(MIuCI) 0,5 DNA 10 Total 15 Μετά την αντίδραση, τα προϊόντα της ενζυμικής κατάτμησης ηλεκτροφορήθηκαν στα 75volts για 45 λεπτά, σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 2%, όπου ανάλογα με τον αριθμό και το μέγεθος των ζωνών, πραγματοποιείται η γονοτύπηση των δειγμάτων. Σε περίπτωση ομοζυγωτίας για τον πολυμορφισμό (γονότυπος Α/Α), το ένζυμο κόβει και προκύπτουν δύο ζώνες, μεγέθους 262bp και 198bp. Σε περίπτωση ομοζυγωτίας για το φυσιολογικό αλληλόμορφο, το ένζυμο δεν κόβει και προκύπτει ζώνη μεγέθους 460bp. Τέλος, σε περίπτωση ετεροζυγωτίας, το ένζυμο κόβει μόνο για το ένα αλληλόμορφο και προκύπτουν τρεις ζώνες, μεγέθους 262bp, 198bp και 460bp. Επίσης, το συγκεκριμένο ένζυμο κόβει σε μια επιπλέον θέση, η οποία δεν επηρεάζει τη γονοτύπηση του πολυμορφισμού, με αποτέλεσμα να προκύπτει πάντα και μια ζώνη μεγέθους 91bp. B.4.5 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μέθοδο διαχωρισμού τμημάτων γενετικού υλικού, με βάση το μέγεθός τους. Βασίζεται στο γεγονός ότι αρνητικά φορτισμένα τμήματα DNA, διέρχονται μέσα από το πορώδες πήκτωμα αγαρόζης, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Τα μόρια μεγαλύτερου μεγέθους κινούνται με χαμηλότερη ταχύτητα μέσα στο πήκτωμα, σε αντίθεση με τα μικρότερα, που στον ίδιο χρόνο διανύουν μεγαλύτερο μέρος του πηκτώματος. Εκτός από το μέγεθος των μορίων, την κινητικότητά τους στο πήκτωμα επηρεάζουν και άλλοι παράγοντες: η δομή των μορίων (γραμμικό ή κυκλικό DNA), η περιεκτικότητα του πηκτώματος σε αγαρόζη (μεγαλύτερη περιεκτικότητα οδηγεί σε ειδικότερο διαχωρισμό και πιο ευδιάκριτες ζώνες), η τάση του ηλεκτρικού ρεύματος που εφαρμόζεται (σε χαμηλές τάσεις η κινητικότητα των μορίων είναι ανάλογη της τάσης που εφαρμόζεται, ενώ σε υψηλές παρατηρείται μείωση της ικανότητας διαχωρισμού των μεγαλύτερων τμημάτων) και η κατεύθυνση του ηλεκτρικού πεδίο, η σύσταση του διαλύματος ηλεκτροφόρησης, η σύσταση του τμήματος DNA και τέλος, η παρεμβολή ουσιών, όπως το βρωμιούχο αιθίδιο. Επομένως, τα διάφορα μόρια σχηματίζουν ζώνες σε διαφορετικά σημεία του πηκτώματος. Για να γίνουν διακριτές οι ζώνες αυτές, απαιτείται η προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου, το οποίο έχει την ικανότητα να προσκολλάται στην μεγάλη 59

60 αύλακα του DNA και να ακτινοβολεί υπό την UV έκθεση. Για να γίνει καλύτερος διαχωρισμός και να προκύψουν πιο διακριτές ζώνες, το ποσοστό της αγαρόζης μπορεί να αυξηθεί, να μειωθεί η τάση της ηλεκτροφόρησης ή να αυξηθεί η διάρκειά της. Η παρασκευή πηκτωμάτων αγαρόζης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των εξής αντιδραστηρίων: αγαρόζη (Bio-Rad Laboratories), ρυθμιστικό διάλυμα TAE (1 ) και βρωμιούχο αιθίδιο. Για την παρασκευή του διαλύματος TAE (1 ), χρησιμοποιήθηκαν: 242 g Tris, 100 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0), 57,1ml glacial acetic acid και αποσταγμένο H 2 O (dd H 2 O) έως τελικού όγκου 1000 ml. Κατά την ηλεκτροφόρηση, χρησιμοποιήθηκαν: TAE (1 ), χρωστική orange G (με σύσταση Glycerol:30ml,Orange G:0.25gr και ddh 2 O:70ml), η οποία συμβάλλει στο να γίνει ορατό το μέτωπο της ηλεκτροφόρησης, ενώ η γλυκερόλη που περιέχει, αυξάνει το βάρος του δείγματος και εμποδίζει το DNA να διαχυθεί λόγω ιξώδους από τα πηγαδάκια, και τέλος μάρτυρα ( bp, της εταιρείας NEB), που περιέχει τμήματα γενετικού υλικού γνωστών μεγεθών. Β.5 Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας μορίων DNA με τη μέθοδο αλληλούχησης κατά Sanger (Sanger sequencing) Η βασική αρχή της μεθόδου έγκειται στο γεγονός ότι με τη χρήση τριφωσφορικών 2,3 - διδεοξυνουκλεοτιδίων (ddntp) σταματά η σύνθεση μιας αλληλουχίας DNA. Τα ddntp αυτά, σημαίνονται με φθορίζουσες ομάδες, για να είναι δυνατή η ανίχνευσή τους σε αυτόματους αναλυτές αλληλούχισης. Κατά τη μέθοδο αυτή απαιτούνται: το μονόκλωνο τμήμα DNA που αναλύεται ( 5μl για κάθε αντίδραση) ένας από τους εκκινητές DNA-πολυμεράση φυσιολογικά δεοξυνουκλεοτίδια (dntp) τριφωσφορικά 2,3 - διδεοξυνουκλεοτίδια, που μετά την προσθήκη τους στην αλυσίδα, τερματίζουν την επιμήκυνση του DNA, καθώς δεν διαθέτουν 3 -ΟΗ. Κάθε ένα από τα τέσσερα 2,3 - διδεοξυνουκλεοτίδια σημαίνεται με διαφορετική φθορίζουσα ουσία. Οι φθορίζουσες ουσίες που χρησιμοποιούνται, εκπέμπουν σε διαφορετικό μήκος κύματος η κάθε μια, με αποτέλεσμα να είναι διακριτό κάθε φορά το τελευταίο 2,3 - διδεοξυνουκλεοτίδιο, στο οποίο σταμάτησε η σύνθεση της αλυσίδας DNA. Τα σημασμένα μόρια που παράγονται, διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση (capillary electrophoresis) σε ειδικό τριχοειδές πήκτωμα, που προσφέρει τη δυνατότητα διαχωρισμού τμημάτων γενετικού υλικού που διαφέρουν κατά ένα μόνο νουκλεοτίδιο. Στη συνέχεια, τα τμήματα αυτά, διέρχονται από μια διάταξη laser αισθητήρων, που οδηγούν σε φθορισμό των χρωστικών με τις οποίες έχουν σημανθεί τα 2,3 - διδεοξυνουκλεοτίδια στο άκρο κάθε τμήματος. Ο φθορισμός ανιχνεύεται από ειδικούς αναλυτές, τα δεδομένα αποθηκεύονται και με ειδικό 60

61 λογισμικό το σήμα φθορισμού μεταφέρεται σε ψηφιακά αρχεία ( Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Παθολογίας του Πανεπιστημίου των Ηνωμένων Αραβικών Εμιράτων σε συνεργασία με την κυρία Anne John (υπό την φροντίδα του Καθηγητή Μοριακής και Γενετικής Ιατρικής Bassam R. Ali). Β.5.1 Πρωτόκολλο καθαρισμού PCR προϊόντων Πριν την αλληλούχηση, κρίνεται απαραίτητος ο καθαρισμός των PCR προϊόντων που θα αναλυθούν, ώστε η αλληλούχηση να είναι όσο το δυνατόν αποδοτικότερη. Με τη διαδικασία του καθαρισμού, απομακρύνονται εκκινητές, ελεύθερα δεοξυριβονουκλεοτίδια και υπολείμματα αντιδραστηρίων, που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διεξαγωγή της αντίδρασης PCR. Για τον καθαρισμό των PCR προϊόντων, χρησιμοποιήθηκε το NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit της εταιρείας Macherey-Nagel, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Β.6 Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων Η στατιστική επεξεργασία όλων των πειραματικών δεδομένων κρίνεται απαραίτητη για να διαπιστωθεί αν τα απορρέοντα αποτελέσματα δίνουν σημαντικό και αξιόπιστο αποτέλεσμα. Μετά το τέλος της πειραματικής διαδικασίας, λοιπόν, πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση των πειραματικών δεδομένων, ώστε να αξιολογηθούν οι παρατηρούμενες διαφορές στις συχνότητες κάθε γονοτύπου και αλληλομόρφου μεταξύ των διαφορετικών ομάδων που εξετάστηκαν. Κατά την ανάλυση των αποτελεσμάτων διερευνήθηκε πρωταρχικά η ισχύς της «αρχής των Hardy-Weinberg». Σε έναν παμμεικτικό πληθυσμό, η τυχαία διασταύρωση μεταξύ των διάφορων γονοτύπων ισοδυναμεί με το τυχαίο συνδυασμό των γαμετών που παράγονται από τους γονοτύπους αυτούς. Σύμφωνα με την «αρχή των Hardy- Weinberg», οι συχνότητες παμμειξίας παραμένουν σταθερές από γενεά σε γενεά, απουσία διαδικασιών που αλλάζουν τις συχνότητες των γόνων (π.χ. επιλογή, μεταλλαγή, τυχαία γενετική παρέκκλιση και μετανάστευση). Η «αρχή των Hardy-Weinberg» αποδίδεται μαθηματικά ως p 2 + 2pq + q 2 = 1, όπου p: η συχνότητα του ενός αλληλομόρφου και q: η συχνότητα του άλλου. Είναι, λοιπόν, προφανές ότι p 2 και q 2 θα είναι οι συχνότητες των ομόζυγων για κάθε αλληλόμορφο, ενώ 2pq θα είναι η συχνότητα των ετερόζυγων. Σε μελέτες γενετικής των πληθυσμών, η εξίσωση αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστούν οι αναμενόμενες συχνότητες και να αξιολογηθεί, στη συνέχεια, η διαφορά αυτών από τις παρατηρούμενες από το πείραμα συχνότητες. Η μη ισχύς της «αρχής των Hardy- Weinberg» μπορεί να είναι ενδεικτική α) λανθασμένης γονοτύπησης, β) φαινομένων παρτίδας (συστηματικών διαφοροποιήσεων μεταξύ των δειγμάτων, που απορρέουν 61

62 από πειραματικά και όχι βιολογικά χαρακτηριστικά) (Reese et al, 2013), γ) κοινής καταγωγής του πληθυσμού, δ) μικρού πληθυσμιακού δείγματος. Στη συνέχεια, για να εξακριβωθεί αν η διαφορά μεταξύ των παρατηρούμενων και των αναμενόμενων συχνοτήτων είναι στατιστικά σημαντική, πραγματοποιήθηκε ο έλεγχος Chi Square Goodness-of-Fit, κατά τον οποίο υπολογίστηκε το x 2 σύμφωνα με την ακόλουθη σχέση: x 2 n = (O i E i ) 2 i=1, E i όπου O i : η παρατηρούμενη συχνότητα ενός γονοτύπου, Ε i : η αναμενόμενη συχνότητά του, βάσει της HWE και n: ο αριθμός των γονοτύπων. Βάσει της τιμής του x 2, πραγματοποιήθηκε ο έλεγχος των υποθέσεων: α) Η 0 : δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ παρατηρούμενων - αναμενόμενων συχνοτήτων/ ο πληθυσμός βρίσκεται σε ισορροπία H-W και β) Η 1 : υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των συχνοτήτων/ ο πληθυσμός δε βρίσκεται σε ισορροπία H-W. Για την πραγματοποίηση του ελέγχου ορίστηκε όριο εμπιστοσύνης 95% (επίπεδο σημαντικότητας 0,05) και υπολογίστηκαν οι βαθμοί ελευθερίας (d.f) του συγκεκριμένου συστήματος, σύμφωνα με τη σχέση d.f = k 1 m, όπου k: ο αριθμός των τάξεων (στην προκειμένη περίπτωση, των γονοτύπων) και m: ο αριθμός των ανεξάρτητων μεταβλητών. Στο σύστημα που εξετάζουμε υπάρχει ένας βαθμός ελευθερίας, καθώς οι διαφορετικοί γονότυποι είναι τρεις και η ανεξάρτητη μεταβλητή μία. Σύμφωνα με όλα τα παραπάνω, εφόσον η τιμή του x 2 δεν υπερβαίνει την κριτική τιμή (στην παρούσα μελέτη, η τιμή αυτή είναι 3,841), η οποία καθορίζεται από τους βαθμούς ελευθερίας και το επίπεδο σημαντικότητας, η μηδενική υπόθεση Η 0 είναι αποδεκτή και ο υπό εξέταση πληθυσμός βρίσκεται σε ισορροπία HW. Με το δεδομένο της ισχύος της «αρχής των Hardy-Weinberg», τέλος, πραγματοποιήθηκε ο ακριβής έλεγχος του Fisher (Fisher's exact test) για να εξετάσει αν υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση καθεμιάς από τις υπό μελέτη γενετικές παραλλαγές και των ομάδων (ασθενών, υγιών) που εξετάστηκαν. Ο ακριβής έλεγχος του Fisher προτιμάται, καθώς δίδεται η δυνατότητα ορθού υπολογισμού της τιμής p (p value), κυρίως, για μικρού μεγέθους δείγματα, όπως στη μελέτη αυτή. Οι υπολογισμοί για κάθε έλεγχο πραγματοποιήθηκαν κάνοντας χρήση του υπολογιστικού προγράμματος ( 62

63 Γ. Αποτελέσματα 63

64 64

65 Κατά τη μελέτη αυτή αναλύθηκαν οι πολυμορφισμοί rs (γονίδιο ASS1), rs και rs (γονίδιο NOS2A). Οι παραπάνω πολυμορφισμοί αξιολογήθηκαν τόσο ως προς τη συσχέτιση τους με την κλινική εικόνα ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσιαμία και μείζονα β-θαλασσαιμία και την αύξηση των επιπέδων της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF, όσο και ως προς τη συσχέτιση τους με την ανταπόκριση ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία/δρεπανοκυτταρική αναιμία στη θεραπεία με υδροξυουρία. Ο πρώτος πολυμορφισμός αναλύθηκε με τη μέθοδο PCR-RFLP ενώ οι δύο πολυμορφισμοί στο γονίδιο NOS2A με τη μέθοδο PCR ARMS. Οι μέθοδοι και στις τρεις περιπτώσεις προτυπώθηκαν με αλληλούχιση κατά sanger. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν παρουσιάζονται αναλυτικά στη συνέχεια. Γ.1 Ανάλυση πειραματικών δεδομένων για κάθε μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό Γ.1.1 rs (ASS1) Ο πολυμορφισμός αυτός αναλύθηκε με PCR-RFLP (Εικόνες 16,17 και 18). Στην πρώτη περίπτωση, φαίνονται τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν για τον εντοπισμό των καταλληλότερων συνθηκών ενζυμικής πέψης με τρία δείγματα υγιών ατόμων (Εικόνα 16), στη δεύτερη περίπτωση (Εικόνα 18), τα δείγματα προέρχονται από 17 ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία, ενώ στην τρίτη (Εικόνα 19) αφορούν σε 19 υγιή άτομα (controls). Εικόνα 17: ενζυμική αντίδραση με 5 και 10 units, σε διαφορετικούς χρόνους αντίδρασης (10,15 και 30 λεπτά), σε τρία διαφορετικά δείγματα 65

66 Εικόνα 17:ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, pcr προϊόντων από δείγματα 17 ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία Εικόνα 18: ηλεκτροφόρηση προϊόντων κατάτμησης με την περιοριστική ενδονουκλεάση MluCI (19 υγιή άτομα). Στα δείγματα 20,94,182,400,403,409,412 και 423 παρατηρούνται 4 ζώνες, οπότε τα άτομα είναι ετερόζυγα για τον πολυμορφισμό. Στα δείγματα 22,64,82,168 και 197, παρατηρούνται 2 ζώνες, οπότε τα άτομα είναι ομόζυγα για το φυσιολογικό αλληλόμορφο, G. Στα δείγματα 40,181,191,401 και 424 παρατηρούνται 3 ζώνες, οπότε τα άτομα αυτά είναι ομόζυγα για τον πολυμορφισμό, Α. Στην πρώτη θέση, διακρίνεται ο θετικός μάρτυρας, ενώ στην τελευταία, ο αρνητικός μάρτυρας. Συνολικά, για τον πολυμορφισμό rs αναλύθηκαν 82 δείγματα μη θαλασσαιμικών ατόμων, 18 δείγματα ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία και 73 δείγματα ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία. Οι υπό μελέτη ομάδες ικανοποιούν την «αρχή των Hardy-Weinberg». Στα παρακάτω διαγράμματα παρουσιάζονται οι % συχνότητες εμφάνισης των γονοτύπων που παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία, ασθενείς με β-θαλασσαιμία μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων και υγιείς, καθώς και οι % συχνότητες των αλληλομόρφων ανά πληθυσμιακή ομάδα. 66

67 Διάγραμμα 1: % συχνότητες εμφάνισης γονοτύπων σε ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία (n=73), ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία (n=18) και υγιείς (n=82) που μελετήθηκαν για τον rs G/G A/A A/G 10 0 Υγιείς Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία Διάγραμμα 2: % συχνότητες εμφάνισης αλληλομόρφων σε ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία (n=73), ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία(n=18) και υγιείς (n=82) που μελετήθηκαν για τον rs G A 0 Υγιείς Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία Ασθενείσ με μείζονα β- θαλασσαιμία Οι συχνότητες στις οποίες εμφανίζονται τα αλληλόμορφα παρουσιάζουν μικρή απόκλιση από τις συχνότητες που δίδονται από τη βάση Εnsembl (Α:62%, G:38%). Η τιμή p που προέκυψε από τη σύγκριση, τόσο ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία με υγιή άτομα (p=0,5224), όσο και ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία έναντι υγιών ατόμων (p=0,5147), δεν έδειξε κάποια συσχέτιση του πολυμορφισμού αυτού με την ασθένεια. Η σύγκριση μεταξύ ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και μείζονα β-θαλασσαιμία (p=0,7792), δεν έδειξε συσχέτιση του πολυμορφισμού αυτού με την κλινική εικόνα της ασθένειας. 67

68 Στο διάγραμμα 3, παρουσιάζονται οι % συχνότητες στις οποίες εμφανίζονται, για τις πληθυσμιακές ομάδες των «ανταποκρινόμενων» και «μη ανταποκρινόμενων» στη θεραπεία με υδροξυουρία. Στο διάγραμμα 4, παρουσιάζονται οι % συχνότητες των αλληλομόρφων ανά πληθυσμιακή ομάδα. Οι πληθυσμιακές αυτές ομάδες ικανοποιούν την «αρχή των Hardy-Weinberg». Διάγραμμα 3: % συχνότητες εμφάνισης γονοτύπων σε HU «ανταποκρινόμενους»(n=14) και «μη ανταποκρινόμενους» (n=23) ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία που μελετήθηκαν για τον rs G/G A/A A/G 0 Ανταποκρινόμενοι σε HU Μη ανταποκρινόμενοι σε HU Διάγραμμα 4: % συχνότητες εμφάνισης αλληλομόρφων σε HU «ανταποκρινόμενους»(n=14) και «μη ανταποκρινόμενους» (n=23)ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία που μελετήθηκαν για τον rs Ανταποκρινόμενοι σε HU Μη ανταποκρινόμενοι σε HU G A Οι % συχνότητες στις οποίες εμφανίζονται τα αλληλόμορφα παρουσιάζουν απόκλιση από τις συχνότητες που δίνονται από τη βάση Εnsembl (MAFs, Α:62%, G:38%), παρατήρηση που πιθανώς οφείλεται στο μικρό μέγεθος του υπό μελέτη δείγματος πληθυσμού. Η τιμή p που προέκυψε από τη σύγκριση «ανταποκρινόμενων» και «μη ανταποκρινόμενων» ασθενών στη θεραπεία με υδροξυουρία (p=0,514) δεν έδειξε 68

69 κάποια συσχέτιση του εν λόγω πολυμορφισμού με την ανταπόκριση των ασθενών στη συγκεκριμένη θεραπεία. Γ.1.2 Γονίδιο rs (NOS2A) Ο πολυμορφισμός rs αναλύθηκε με PCR-ARMS και η προτύπωση πραγματοποιήθηκε με sanger sequencing (Εικόνες 19 και 20). Αρχικά, φαίνεται η PCR gradient που πραγματοποιήθηκε για τον εντοπισμό της καταλληλότερης θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών για τις αντιδράσεις PCR που θα πραγματοποιούνταν ώστε να παραχθούν κατάλληλα προϊόντα για γονοτύπηση με sanger sequencing. Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά δείγματα υγιών ατόμων (Εικόνα 19). Στην εικόνα 20, φαίνεται αντίδραση PCR-ARMS που πραγματοποιήθηκε για τη γονοτύπηση 16 ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία. Εικόνα 19: PCR-gradient στην οποία δοκιμάστηκαν 6 διαφορετικές θερμοκρασίες για την εύρεση της καταλληλότερης για την υβριδοποίησης των εκκινητών της PCR που παρήγαγε τα προϊόντα που γονοτυπήθηκαν με αλληλούχιση κατά Sanger Εικόνα 20: PCR-ARMS για τη γονοτύπηση 16 ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία. Όλοι οι ασθενείς είναι ετερόζυγοι για τον πολυμορφισμό, εκτός από αυτούς στις σειρές 32 και 39 που είναι ομόζυγοι για τον πολυμορφισμό 69

70 Συνολικά, για τον πολυμορφισμό rs αναλύθηκαν 32 δείγματα μη θαλασσαιμικών ατόμων, 9 δείγματα ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία και 39 δείγματα ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία. Οι ομάδες που μελετήθηκαν ικανοποιούν την «αρχή των Hardy-Weinberg». Στα παρακάτω διαγράμματα παρουσιάζονται οι % συχνότητες εμφάνισης των γονοτύπων, που παρατηρήθηκαν στις τρεις αυτές ομάδες που μελετήθηκαν, καθώς και οι % συχνότητες των αλληλομόρφων ανά πληθυσμιακή ομάδα. Διάγραμμα 5: % συχνότητες εμφάνισης γονοτύπων σε ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία(n=38), ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία (n=9) και υγιείς (n=39) που μελετήθηκαν για τον rs Υγιείς Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία Ασθενέις με μείζονα β- θαλασσαιμία C/C T/T C/T Διάγραμμα 6: % συχνότητες εμφάνισης αλληλομόρφων σε ασθενείς με μείζονα β- θαλασσαιμία(n=38), ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία (n=9) και υγιείς (n=39) που μελετήθηκαν για τον rs Υγιείς Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία Ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία C T Οι % συχνότητες στις οποίες εμφανίζονται τα αλληλόμορφα δεν παρουσιάζουν απόκλιση από τις συχνότητες που δίδονται από τη βάση ensembl (C:59%, T:41%). Η μικρή διαφορά από τις συχνότητες αυτές που παρατηρείται στους ασθενείς με μη 70

71 εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και στα μη θαλασσαιμικά άτομα, πιθανότατα οφείλεται στο μικρό μέγεθος του δείγματος που αναλύθηκε. Η τιμή p που προέκυψε από τη σύγκριση, τόσο ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία με υγιή άτομα (p=0,7361), όσο και ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία έναντι υγιών ατόμων (p=0,8975), δεν έδειξε κάποια συσχέτιση του πολυμορφισμού αυτού με την ασθένεια. Η σύγκριση μεταξύ ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β- θαλασσαιμία και μείζονα β-θαλασσαιμία (p=0,5819 ) δεν έδειξε συσχέτιση του υπό μελέτη πολυμορφισμού με την κλινική εικόνα της ασθένειας. Στο διάγραμμα 7, παρουσιάζονται οι % συχνότητες γονοτύπων που εμφανίζονται, σε «ανταποκρινόμενους» και «μη ανταποκρινόμενους» σε θεραπεία με υδροξυουρία, ενώ στο διάγραμμα 8, οι % συχνότητες των αλληλομόρφων στις ομάδες αυτές. Οι ομάδες αυτές ικανοποιούν την «αρχή των Hardy-Weinberg». Διάγραμμα 7: % συχνότητες εμφάνισης γονοτύπων σε HU «ανταποκρινόμενους» (n=13)και «μη ανταποκρινόμενους» (n=23) ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία που μελετήθηκαν για τον rs Ανταποκρινόμενοι σε HU Μη ανταποκρινόμενοι σε HU C/C T/T C/T Διάγραμμα 8: % συχνότητες εμφάνισης αλληλομόρφων σε HU «ανταποκρινόμενους» (n=13) και «μη ανταποκρινόμενους»(n=23) ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία που μελετήθηκαν για τον rs C T Ανταποκρινόμενοι σε HU Μη ανταποκρινόμενοι σε HU 71

72 Οι % συχνότητες στις οποίες εμφανίζονται τα αλληλόμορφα δεν παρουσιάζουν απόκλιση από τις συχνότητες που δίδονται από τη βάση ensembl (C:59%, T:41%). Η τιμή p που προέκυψε από τη σύγκριση των δύο αυτών ομάδων (p:0,5917) δεν έδειξε κάποια συσχέτιση του εν λόγω πολυμορφισμού με την ανταπόκριση των ασθενών στη συγκεκριμένη θεραπεία. Γ.1.3 Γονίδιο rs (NOS2A) Ο συγκεκριμένος πολυμορφισμός αναλύθηκε με PCR-ARMS. Η προτύπωση της μεθόδου πραγματοποιήθηκε με αλληλούχιση κατά Sanger (Εικόνες 21 και 22). Στην εικόνα 21, φαίνεται η ηλεκτροφόρηση μετά από PCR-gradient που πραγματοποιήθηκε για τον εντοπισμό της καταλληλότερης θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών για τις PCR που θα πραγματοποιούνταν, ώστε να παραχθούν κατάλληλα προϊόντα προς γονοτύπηση με αλληλούχιση κατά Sanger. Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά δείγματα υγιών ατόμων. Στην εικόνα 22, φαίνεται ηλεκτροφόρηση μετά από PCR για την παραγωγή προϊόντων κατάλληλων προς γονοτύπηση με αλληλούχιση κατά Sanger. Εικόνα 21: PCR-gradient στην οποία δοκιμάστηκαν 6 διαφορετικές θερμοκρασίες για την εύρεση της καταλληλότερης για την υβριδοποίησης των εκκινητών της PCR που παρήγαγε τα προϊόντα που γονοτυπήθηκαν με αλληλούχιση κατά Sanger Εικόνα 22: PCR με δείγματα DNA από 18 υγιή άτομα, για την παραγωγή προϊόντων, κατάλληλων για γονοτύπηση αλληλούχιση κατά Sanger 72