Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΣΙΛΙΜΠΙΝΙΝΗΣ (SILIBININ) ΣΤΗΝ ΚΑΡΔΙΑΚΗ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ ΣΤΟ IN VITRO ΜΟΝΤΕΛΟ ΤΩΝ H9c2 ΚΑΡΔΙΟΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΑΝΕΣΤΟΠΟΥΛΟΣ ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΣΙΛΙΜΠΙΝΙΝΗΣ (SILIBININ) ΣΤΗΝ ΚΑΡΔΙΑΚΗ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ ΣΤΟ IN VITRO ΜΟΝΤΕΛΟ ΤΩΝ H9c2 ΚΑΡΔΙΟΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 Στους γονείς μου Παύλο και Βασιλική

3 Ευχαριστίες Ευχαριστώ θερμά την επιβλέπουσα Καθηγήτρια κα Αντιγόνη Λάζου για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντάς μου τη συγκεκριμένη εργασία, τη μεσολάβησή της προκειμένου να διεξαχθεί η παρούσα εργασία σε συνεργασία με την Επίκουρο Καθηγήτρια κα Αγλαΐα Παππά στο Τμήμα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής του Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης, καθώς επίσης και για τις πολύτιμες συμβουλές της. Ευχαριστώ ιδιαίτερα την συνεπιβλέπουσα Επίκουρο Καθηγήτρια κα Αγλαΐα Παππά για τη δυνατότητα εκπόνησης της διπλωματικής μου εργασίας στο εργαστήριό της, στο Τμήμα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής του Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης στην Αλεξανδρούπολη. Επιπλέον, θα ήθελα να την ευχαριστήσω για την καθημερινή μας επαφή, την καθοδήγηση και τη στήριξη καθ όλη τη διάρκεια της εργασίας. Ευχαριστώ την Καθηγήτρια κα Μαργαρίτα Χατζοπούλου-Κλαδαρά για την τιμή που μου έκανε να συμμετέχει στην τριμελή μου επιτροπή. Ευχαριστώ τον Πρόεδρο του Τμήματος Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής, Καθηγητή κ. Αλέξανδρο Κορτσάρη για τη φιλοξενία του στο χώρο κυτταροκαλλιεργειών στο Εργαστήριο Βιοχημείας της Ιατρικής Σχολής του Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης. Επίσης, ευχαριστώ τους Επίκουρους Καθηγητές του Τμήματος Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής κα Αικατερίνη Χλίχλια και κ. Νικόλαο Γλυκό για το ενδιαφέρον τους και τις επιστημονικές τους παρατηρήσεις κατά τη διάρκεια της μεταπτυχιακής μου εργασίας. Τέλος, ευχαριστώ πολύ τις υποψήφιες διδάκτορες κ.κ Γεωργία-Περσεφόνη Βουλγαρίδου, Ελευθερία Γαλάτου, Παναγιώτα Γεωργούλια, Άννα Ιορδανίδου, Αγγελική Κουρπέτη- Τιπτιρή, όπως και τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια κ. Μαρία Κουρέτα, για τη βοήθειά τους στην εκμάθηση των τεχνικών και για όλες τις ώρες που περάσαμε μαζί στο εργαστήριο. Ευχαριστώ επίσης και την προπτυχιακή φοιτήτρια κ. Ανθούλα Κάβο για τη βοήθειά της σε μέρος της πειραματικής διαδικασίας.

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Καρδιακή υπερτροφία-γενικά χαρακτηριστικά Σηματοδοτικά μονοπάτια που εμπλέκονται στην καρδιακή υπερτροφία Το σηματοδοτικό μονοπάτι των MAPKs (Mitogen activated protein kinases) H υποοικογένεια των ERK (extracellular signal regulated kinases) H υποοικογένεια των p38 MAPKs H υποοικογένεια των JNKs (SAPKs/JNKs) Το σηματοδοτικό μονοπάτι της Akt/PKB Οξειδωτικό στρες και καρδιακή υπερτροφία-αντιοξειδωτικές ενώσεις Σιλιμπινίνη (SILIBININ) Eφαρμογές της σιλιμπινίνης-μοριακοί μηχανισμοί δράσης Αντιοξειδωτική-Ηπατοπροστατευτική δράση Χημειοπροστατευτική-Αντικαρκινική δράση Σιλιμπινίνη και αποπτωτικός θάνατος Σιλιμπινίνη και υποχοληστερολαιμία Σιλιμπινίνη και καρδιακές παθήσεις...35 ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΙΙ. ΥΛΙΚΑ...37 Ι. Βιολογικό υλικό

5 ΙΙ. Χημικά αντιδραστήρια...37 ΙΙΙ. Φωτογραφικά υλικά...39 ΙΙΙ. ΜΕΘΟΔΟΙ Κυτταρική καλλιέργεια των κυττάρων H9c Προετοιμασία κυτταρικών εκχυλισμάτων Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεΐνης (BCA assay) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS- PAGE) Ηλεκτροφορητική μεταφορά πρωτεϊνών Ανοσοεντόπιση πρωτεϊνικών αντιγόνων στη νιτροκυτταρίνη ή PVDF (Immunoblotting) Απομόνωση RNA Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Προσδιορισμός της επιφάνειας καρδιομυοκυττάρων Μέθοδος εκτίμησης του αποπτωτικού θανάτου. Δοκιμασία κατακερματισμού DNA Προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής δράσης της σιλιμπινίνης- Mέθοδος DPPH Μέθοδος κυτταρικής βιωσιμότητας SRB (Soulforodamine B) Μέθοδος εκτίμησης των ολικών επιπέδων κυτταρικής πρωτεΐνης Ανάλυση αποτελεσμάτων με χρήση λογισμικών προγραμμάτων...51 IV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...52

6 1. Eκτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης της ουσίας silibinin in vitro Eπίδραση της silibinin στη βιωσιμότητα των καρδιακών μυοκυττάρων H9c2 in vitro Eπίδραση της silibinin στη βιωσιμότητα των καρδιακών μυοκυττάρων H9c2 κάτω από συνθήκες οξειδωτικού στρες Eπίδραση της silibinin στην προκαλούμενη από Η 2 Ο 2 απόπτωση σε καρδιακά μυοκύτταρα H9C2 in vitro Επίδραση της silibinin στην επαγόμενη από α 1 -αδρενεργικούς αγωνιστές και αγωνιστές ΑΤ υποδοχέων, υπερτροφία σε καρδιακά μυοκύτταρα H9c2 in vitro Επίδραση της silibinin στις οδούς μεταγωγής μηνυμάτων μέσω των α- 1 αδρενεργικών υποδοχέων Εκτίμηση της μέγιστης ενεργοποίησης των σηματοδοτικών μονοπατιών των Akt, ERK1/2 και p38mapk, μετά από επαγωγή με φαινυλεφρίνη σε καρδιομυοκύτταρα Η9c Επίδραση της silibinin στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη ενεργοποίηση της Akt, των ERK1/2 και της p38mapk Eπίδραση της silibinin στην επαγόμενη απο τη φαινυλεφρίνη ενεργοποίηση της Akt και των ERK1/2-Χρονική επίδραση 15 λεπτών...70

7 4.2.2 Eπίδραση της silibinin στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη ενεργοποίηση της Akt και των ERK1/2-Χρονική επίδραση 30 λεπτών Eπίδραση της silibinin στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη ενεργοποίηση των ERK1/2 της p38mapk και της Akt - Xρονική επίδραση 24 ωρών...74 V.ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας και της αντιοξειδωτικής επίδρασης της silibinin στη βιωσιμότητα καρδιακών μυοκυττάρων H9c Eπίδραση της silibinin στη βιωσιμότητα υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες και στην επαγόμενη από οξειδωτικό στρές (Η 2 Ο 2 ) απόπτωση καρδιακών μυοκυττάρων H9c Επίδραση της silibinin στην επαγόμενη από α 1 -αδρενεργικούς αγωνιστές και αγωνιστές ΑΤ υποδοχέων, υπερτροφία καρδιακών μυοκυττάρων H9c Ο ρόλος της silibinin στα επαγόμενα από αγωνιστές α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων σηματοδοτικά μονοπάτια των MAPKs και Akt...85 VI. ΠΕΡΙΛΗΨΗ...90 VII. SUMMARY...92 VIII. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...93

8 Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι καρδιαγγειακές παθήσεις αποτελούν μια από τις σημαντικότερες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας, τόσο στις αναπτυγμένες χώρες όσο και στην Ελλάδα. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας ( είναι υπεύθυνες για το θάνατο 16,7 εκατομμυρίων ανθρώπων ετησίως ανά την υφήλιο, ενώ στην Ευρώπη προκαλούν το 50% των συνολικών θανάτων, ιδιαίτερα μεταξύ ατόμων που υπερβαίνουν την ηλικία των 65 ετών. Αξιοσημείωτη είναι η εκτίμηση ότι το 2010 οι καρδιαγγειακές παθήσεις θα αποτελούν την κυριότερη αιτία θανάτου στις αναπτυσσόμενες χώρες. Μεταξύ των καρδιαγγειακών παθήσεων περιλαμβάνονται η υπέρταση, το έμφραγμα του μυοκαρδίου, η στεφανιαία νόσος, οι εγκεφαλοαγγειακές παθήσεις. Οι παθήσεις αυτές συχνά συγκλίνουν και αποτελούν τους συχνότερους παράγοντες που προκαλούν καρδιακή ανεπάρκεια. Η καρδιακή ανεπάρκεια, η αδυναμία της καρδιάς να εφοδιάσει επαρκώς τους ιστούς και κατ επέκταση τα όργανα του ανθρώπινου σώματος με την απαραίτητη ποσότητα αίματος και οξυγόνου, αποτελεί μία μακροχρόνια πάθηση. Πρόκειται για ένα σύνδρομο που αφορά όλες τις ηλικίες, ακόμα και τα παιδιά, χωρίς διαχωρισμό φύλου (Dickstein et al., 2008). Στη χώρα μας υπολογίζεται ότι υπάρχουν περίπου ασθενείς και διαγιγνώσκονται περίπου νέες περιπτώσεις κάθε χρόνο. Ως συμπτώματα αναφέρονται η δύσπνοια, ο έντονος βήχας, το πρήξιμο των αστραγάλων, καθώς και η μειωμένη ικανότητα για άσκηση. Η νόσος εξελίσσεται και επιδεινώνεται με γοργούς ρυθμούς, ενώ η πρόγνωσή της είναι χειρότερη από αυτή του καρκίνου ή του AIDS (Hunt et al., 2005). Η έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία αποτελούν επιτακτική ανάγκη όσον αφορά την αναστολή της εξέλιξης της νόσου, αλλά και τηv αύξηση της επιβίωσης και της ποιότητας ζωής των ασθενών. 1

9 1. ΚΑΡΔΙΑΚΗ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ-ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Tα καρδιομυοκύτταρα είναι τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα, που αποσύρονται από τον κυτταρικό κύκλο κατά τη διάρκεια της περιγεννητικής περιόδου. Επομένως ανταποκρίνονται τόσο σε εγγενή όσο και σε εξωγενή ερεθίσματα, με αποτέλεσμα την αύξηση του μεγέθους τους και συνεπώς του μεγέθους της καρδιάς (Sugden and Clerk, 2006b). Η αύξηση του όγκου της καρδιάς, δίχως τον πολλαπλασιασμό των προϋπαρχόντων κυττάρων, ονομάζεται καρδιακή υπερτροφία. Τα κύτταρα χαρακτηρίζονται από αύξηση της πρωτεϊνικής σύνθεσης και αλλαγές στην οργάνωση των σαρκομεριδίων (Nadal-Ginard et al., 2003a;Frey et al., 2004a). Η καρδιακή υπερτροφία διακρίνεται σε δύο κατηγορίες : α) την φυσιολογική και β) την παθολογική υπερτροφία. Στην πρώτη περίπτωση η αύξηση του μεγέθους της καρδιάς προκύπτει ως απόκριση στην ανάγκη για αυξημένη καρδιακή παροχή και άσκηση. Αποτελεί μια αντισταθμιστική-προσαρμοστική απόκριση του μυοκαρδίου, καθώς παροδικά ομαλοποιεί το μηχανικό στρες, βελτιώνει τη λειτουργία της καρδιακής αντλίας και δε σχετίζεται με πρόκληση καρδιακής βλάβης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η φυσιολογική καρδιακή υπερτροφία των αθλητών (Dorn et al., 2003e;Levy et al., 1990b). Στην παθολογική υπερτροφία, παρόλο που αύξηση του όγκου της καρδιάς είναι αρχικά αντισταθμιστική, η παρατεταμένη υπερτροφία είναι δυνατόν να οδηγήσει σε καρδιακή ανεπάρκεια. Συνήθως παρατηρείται σε περιπτώσεις υπερβολικού στρες, όπου απαιτείται αυξημένη καρδιακή παροχή (υπέρταση) (Levy et al., 1990c;Dorn et al., 2003d). Η φυσιολογική υπερτροφία χαρακτηρίζεται από αύξηση του μεσοκοιλιακού τοιχώματος και του διαφράγματος, η οποία είναι συγκρίσιμη με αύξηση των θαλάμων της καρδιάς. Στη δεύτερη περίπτωση, είναι εμφανής η πάχυνση του μεσοκοιλιακού τοιχώματος και του διαφράγματος, αλλά με παράλληλη μείωση του μεγέθους των κοιλιακών τοιχωμάτων (Ho et al., 1998;Liang and Gardner, 1999). Η καρδιακή υπερτροφία με βάση το φαινότυπο, διακρίνεται σε δύο διαφορετικούς τύπους: α) την ομόκεντρη, η οποία προκαλείται από την παρατεταμένη-χρόνια πίεση και έχει ως συνέπεια τη μείωση του όγκου της αριστερής κοιλίας και την αύξηση του πάχους των καρδιακών τοιχωμάτων (Εικόνα 1). Σε κυτταρικό επίπεδο, διακρίνεται 2

10 από την οργάνωση των σαρκομεριδίων παράλληλα. β) την έκκεντρη, που επάγεται από την αύξηση του όγκου, προκαλώντας διαστολή και λέπτυνση των κοιλιακών τοιχωμάτων. Στην περίπτωση αυτή η οργάνωση των σαρκομεριδίων παρατηρείται σε σειρά. (Dorn et al., 2003c;Wakatsuki et al., 2004a). Κοινό γνώρισμα και στις δύο μορφές της καρδιακής υπερτροφίας, αποτελεί η αύξηση του αριθμού των ινοβλαστών, που προκαλεί ίνωση και αυξημένη δυσκαμψία του μυοκαρδίου (Wakatsuki et al., 2004b). Εικόνα 1. Ερεθίσματα πρόκλησης φυσιολογικής και παθολογικής υπερτροφίας. Αντίστοιχα μορφολογικά χαρακτηριστικά. (Barry et al., 2008). Εκτός από τις μορφολογικές τροποποιήσεις που παρατηρούνται στην καρδιακή υπερτροφία, υπάρχει και ένα σύνολο αλλαγών τόσο σε μοριακό, όσο και βιοχημικό επίπεδο. Συγκεκριμένα λαμβάνουν χώρα αλλαγές στα πρότυπα της γονιδιακής έκφρασης και πρωτεϊνοσύνθεσης, που αποσκοπούν στην τελική εκδήλωσή της (Barry, Davidson, and Townsend, 2008). Αρχικά παρατηρείται επανέκφραση ενός εμβρυϊκού προγράμματος γονιδίων, που εκφράζεται μόνο κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης της καρδιάς και καταστέλλεται στο ενήλικο μυοκάρδιο. Σε αυτή την ομάδα γονιδίων περιλαμβάνεται το κολπικό νατριουρητικό πεπτίδιο ANP (atrial natriuretic peptide) ή κολπικός νατριουρητικός παράγοντας ANF (atrial natriuretic factor) και το β-τύπου 3

11 νατριουρητικό πεπτίδιο BNP (β-type natriuretic peptide). Τα πεπτίδια αυτά δρουν ως καταστολείς της καρδιακής υπερτροφίας (Gardner et al., 2007b;Richards, 2007b). Επίσης ενισχύεται η έκφραση της σκελετικής α-ακτίνης SKA (skeletal α- actin,ska),όπως και της βαριάς αλυσίδας της β-μυοσίνης (beta-myosin heavy chain, B-MHC), που σχετίζονται με τη μειωμένη καρδιακή σύσπαση (Lowes et al., 1997;Hoshijima and Chien, 2002c;Dorn et al., 2003b). Τα προαναφερόμενα γονίδια αυτά αποτελούν χρήσιμους μοριακούς δείκτες υπερτροφίας. Παράλληλα, παρατηρείται άμεση και αυξημένη επαγωγή πρώιμων γονιδίων, τα οποία κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες, όπως c-jun, c-fos, egr-1 (Hoshijima and Chien, 2002b;Dorn et al., 2003a). Με τη σειρά τους, επάγουν την ανάπτυξη σε μέγεθος των καρδιομυοκυττάρων που έχουν χάσει την ικανότητα να αντιγράφουν το γενετικό τους υλικό. Στο γενικότερο πλαίσιο της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης, εξέχουσα θέση κατέχει η ακετυλίωση των ιστονών. Μετά-μεταφραστικές αλλοιώσεις της δομής των ιστονών, τροποποιούν την πρόσβαση μεταγραφικών παραγόντων στις ειδικές ακολουθίες του DNA, επάγοντας ή καταστέλλοντας τη γονιδιακή έκφραση (Latronico et al., 2008). Η ακετυλίωση των ιστονών από τις ακετυλτρανσφεράσες των ιστονών (Histone acetyltransferases, HATs), έχει ως αποτέλεσμα την αποσυμπύκνωση της χρωματίνης και συνεπώς την επαγωγή-έναρξη της γονιδιακής έκφρασης. Η αντίστροφη διαδικασία, η απακετυλίωση των ιστονών από τις απακετυλάσες των ιστονών (Histone deacetylases, HDACs), προάγει την συμπύκνωση της χρωματίνης και την καταστολή της μεταγραφής (Backs and Olson, 2006). Η ισορροπία μεταξύ HATs και HDACs, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και κατ επέκταση καθορίζει την εμφάνιση ή όχι της υπερτροφίας στα καρδιομυοκύτταρα (Antos et al., 2003;Hamamori and Schneider, 2003;Kook et al., 2003). Στα θηλαστικά έχουν περιγραφεί τουλάχιστον 10 γονίδια HDAC, τα οποία διακρίνονται σε δυο κατηγορίες: HDAC I (HDACs I, 1,2,3,8) και HDAC II (HDACs II, 4,5,6,7,9,10). Οι δυο κατηγορίες των HDAC σύμφωνα με πρόσφατες έρευνες, αποτελούν τελικούς στόχους κυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών, τα οποία εμπλέκονται στην επαγωγή διαφοροποιημένης γονιδιακής έκφρασης στην καρδιακή υπερτροφία (Frey et al., 2004b), ενώ παρουσιάζουν και διαφορετικούς ρόλους. Η κατηγορία HDAC I, καταστέλλει αντι-υπερτροφικά γονίδια, επάγοντας με τον τρόπο 4

12 αυτό την καρδιακή υπερτροφία (McKinsey and Olson, 2004), ενώ η κατηγορία HDAC II καταστέλλει προ-υπερτροφικά γονίδια, συμβάλλοντας στην καταστολή της καρδιακής υπερτροφίας (Kolodziejczyk et al., 1999;Miska et al., 1999;Lu et al., 2000) (Εικόνα 2). Εικόνα 2: Ρύθμιση γονιδιακής έκφρασης στα καρδιομυοκύτταρα, από τις δυο κατηγορίες των HDACs (Barry, Davidson, and Townsend, 2008). Τα τελευταία 20 χρόνια, στο επίκεντρο των ερευνών, βρίσκονται τα ερεθίσματα που προκαλούν καρδιακή υπερτροφία. Πρωταρχικό ρόλο διαδραματίζουν νευροορμονικοί παράγοντες, όπως οι κατεχολαμίνες που περιλαμβάνουν αγωνιστές των συζευγμένων με G πρωτεΐνες β-αδρενεργικών υποδοχέων, όπως η αδρεναλίνη και η νοραδρεναλίνη (Sugden and Clerk, 1998d;Molkentin and Dorn, 2001) Επίσης σημαντικός είναι και ο ρόλος παρακρινών παραγόντων που απελευθερώνονται από τα μυοκύτταρα ή άλλους κυτταρικούς τύπους στην καρδιά, όπως ο αγωνιστής των συζευγμένων με G πρωτεΐνες α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων φαινυλεφρίνη, καθώς και ο αγωνιστής των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων ΑΤ αγγειοτενσίνη (Amin et al., 2001b). Οι αγωνιστές αυτοί δρουν σε μεμβρανικούς υποδοχείς, όπου και προσδένονται, ενεργοποιώντας ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια, τα οποία συγκλίνουν με στόχο την εκδήλωση της καρδιακής υπερτροφίας. Επιπλέον, επαγωγή της υπερτροφίας προκαλείται από πεπτιδικούς αυξητικούς παράγοντες, όπως ο TGF-β (Transforming growth factor β), o IGF (Insulin like growth factor), o FGF (Fibroblast growth factor), που δρουν μέσω υποδοχέων κινάσης τυροσίνης, ενεργοποιώντας σηματοδοτικά μονοπάτια (Sugden and Clerk, 1998e;Yamazaki and Yazaki, 2000a;Sugden and Clerk, 1998c). Διάφορα ερεθίσματα, όπως η υποξία και η φυσική 5

13 διάταση (strech), δημιουργούν μηχανικό στρες, που είναι ικανό να προκαλέσει μία φαινοτυπική και γενετική υπερτροφική απάντηση (Sadoshima and Izumo, 1997;Ruwhof and van der, 2000b;Sugden, 2001). Πρόσφατες βιβλιογραφικές αναφορές υποστηρίζουν ότι το οξειδωτικό στρες εμπλέκεται επίσης στην εκδήλωση της καρδιακής υπερτροφίας (Dhalla et al., 2000d;Sawyer et al., 2002a). Το οξειδωτικό στρες έγκειται στην αυξημένη παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS, reactive oxygen species). Οι ROS περιλαμβάνουν ελεύθερες ρίζες, όπως τα ανιόντα του υπεροξειδίου(ο2 - ), τα ελεύθερα υδροξύλια (ΟΗ - ) και χημικές ενώσεις όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), που μετατρέπεται σε μη ενεργές ρίζες. Όλες οι μορφές των ROS, παράγονται κατά την ατελή αναγωγή του μοριακού οξυγόνου από την επιτυχή μεταφορά μεμονωμένων ηλεκτρονίων στο στάδιο της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης στα μιτοχόνδρια, συμβάλλοντας στον οξειδοαναγωγικό έλεγχο φυσιολογικών σηματοδοτικών μονοπατιών (Giordano, 2005a;Giordano, 2005b;Murdoch et al., 2006). Επίσης υπάρχουν και κυτταροπλασματικές πηγές ROS, όπως τα κυτταρικά οξειδωτικά σύμπλοκα, που περιλαμβάνουν την NADPH οξειδάση, την οξειδάση της ξανθίνης και την οξειδάση του νιτρικού οξέος (Griendling et al., 2000) (Εικόνα 3). Σε καρδιακό επίπεδο, πηγές παραγωγής ελευθέρων ριζών αποτελούν τα καρδιομυοκύτταρα, τα ενδοθηλιακά και τα φαγοκύτταρα (McCord, 1985). 6

14 Εικόνα 3: Σχηματική απεικόνιση μονοπατιών παραγωγής ROS και αντιοξειδωτικά συστήματα στην καρδιά. Επιπτώσεις χαμηλών και υψηλών επιπέδων ενεργών μορφών οξυγόνου σε κυτταρικό επίπεδο (Takimoto and Kass, 2007). Υπό φυσιολογικές συνθήκες, η τοξική επίδραση των ROS, αντισταθμίζεται από αντιοξειδωτικά ένζυμα, τα οποία περιλαμβάνουν τη δισμουτάση του υπεροξειδίου (superoxide dismutase, SOD), την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (glutathione peroxidase GSHPx), καθώς και μη ενζυμικά αντιοξειδωτικά, όπως οι βιταμίνες Ε και C (Nordberg and Arner, 2001) (Εικόνα 3). Η παραγωγή ROS προκαλεί την οξείδωση των μεμβρανικών φωσφολιπιδίων, των πρωτεϊνών και του DNA. Η αυξημένη παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνου συνδέεται με μεταβολές στην κυτταρική δομή και λειτουργία των καρδιομυοκυττάρων, καθώς προκαλεί δυσλειτουργία της συσταλτικότητας και δομικές αλλοιώσεις του μυοκαρδίου. Επίσης, ενδέχεται να αποτελεί και έναν από τους βασικότερους παράγοντες που προκαλούν απόπτωση, χαρακτηριστικό φαινόμενο σε διαφορετικούς τύπους καρδιοπαθειών (Tsutsui, 2001b) (Εικόνα 4), ενώ είναι αξιοσημείωτο το γεγονός ότι παρατηρήθηκε αύξηση των ROS στο μυοκάρδιο ασθενών και ζώων με καρδιακή ανεπάρκεια (Amin et al., 2001a;Pimentel et al., 2001). 7

15 Εικόνα 4: Ο ρόλος των ενεργών μορφών οξυγόνου στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση στο καρδιομυοκύτταρο (Carreno et al., 2006). 8

16 2. ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗ ΚΑΡΔΙΑΚΗ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ 2.1 Το σηματοδοτικό μονοπάτι των MAPKs (Mitogen activated protein kinases) Τα ευκαρυωτικά κύτταρα αποκρίνονται σε διαφορετικά εξωτερικά ερεθίσματα, ενεργοποιώντας μηχανισμούς ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, οι οποίοι τροποποιούν τη γενικότερη γονιδιακή έκφραση. Αξίζει να αναφέρουμε πως τα διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος δεν πρέπει να λαμβάνονται υπ όψιν μεμονωμένα, αλλά ως σύνολο, καθώς συχνά συγκλίνουν, επάγοντας την εκδήλωση διαφορετικών αλλά συνάμα αλληλοεπικαλυπτόμενων αποκρίσεων (Clerk et al., 2007). Ένα από τα σημαντικότερα συστήματα που συμμετέχουν στη μεταγωγή σήματος από την κυτταρική μεμβράνη στο κυτταρόπλασμα, καθώς και στον πυρήνα, είναι η υπεροικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από μιτογόνα (mitogen activated protein kinases MAPKs). Τα μέλη της υψηλά συντηρημένης οικογένειας των MAPKs, εμπλέκονται στη ρύθμιση διαφορετικών κυτταρικών διαδικασιών, όπως η κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση, ο κυτταρικός κύκλος, η κυτταρική επιβίωση και θάνατος (Ravingerova et al., 2003b). Οι MAPKs, αποτελούν κινάσες Ser/Thr, οι οποίες ενεργοποιούνται μέσω διπλής φωσφορυλίωσης στα κατάλοιπα Thr-Χ-Tyr της τριπλής ακολουθίας, γνωστής ως βρόχος ενεργοποίησης (activation loop). Στην εν λόγω ακολουθία, η ταυτότητα του Χ αμινοξέος καθορίζει την ταξινόμηση της υπεροικογένειας των MAPKs σε τρείς επιμέρους υποοικογένειες, που έχουν μελετηθεί εκτενώς. Συγκεκριμένα το γλουταμινικό οξύ αντιστοιχεί στην υποοικογένεια των ERKs (extracellular signal regulated kinases), το αμινοξύ προλίνη καθορίζει τις JNKs (c-jun NH-terminal kinases) και το αμινοξύ γλυκίνη αντιστοιχεί στις p38-mapks (Sugden and Clerk, 1998b). Η επαγωγή του πολύπλοκου μονοπατιού των MAPKs, επιτυγχάνεται από ένα ευρύ φάσμα ερεθισμάτων και περιλαμβάνει ορμόνες (ινσουλίνη), αυξητικούς παράγοντες (epidermal growth factor, EGF, platelet-derived growth factor, PDGF, fibroblast growth factor, FGF), κυτοκίνες (tumor necrosis factor TNF), υπεριώδη ακτινοβολία, οξειδωτικό μηχανικό και θερμικό σοκ, ισχαιμικό επεισόδιο κ.ά. Τα συγκεκριμένα 9

17 ερεθίσματα δρουν μέσω διαφορετικών υποδοχέων που περιλαμβάνουν υποδοχείς συζευγμένους με G πρωτεΐνες (G-protein coupled receptors, GPCRs), υποδοχείς κυτοκινών, υποδοχείς Ser/Thr κινάσης, καθώς και υποδοχείς με ενδογενή δράση τυροσίνης (RPTKs, receptor protein tyrοsine kinase) (Seger and Krebs, 1995b;Bogoyevitch, 2000c;Krishna and Narang, 2008b). Παρόλο που κάθε υποοικογένεια των MAPKs είναι ξεχωριστή, αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι παρουσιάζουν ένα κοινό χαρακτηριστικό, όσον αφορά την ενεργοποίησή τους. Οι MAPKs αποτελούν το τελικό μέλος του σηματοδοτικού μονοπατιού των MAPKs που περιλαμβάνει τρείς διαφορετικές κινάσες: τις κινάσες MAP kinases (MAPKs), τις κινάσες MAPK kinases (MAPKKs ή ΜΕΚs) και τις κινάσες MAPK kinases kinases (MAPKKKs ή ΜEKKs). Η ενεργοποίηση των MAPKs προϋποθέτει τη συντονισμένη και διαδοχική ενεργοποίηση των κινασών MΑPKKKs και ΜAPKΚs, σύμφωνα με το πρότυπο MAPKKK MAPKK MAPK (MEKK MEK MAPK) (Ruwhof and van der, 2000a;Krishna and Narang, 2008c) (Εικόνα 5). Εικόνα 5: Σηματοδοτικό μονοπάτι των MAPKs. Διακρίνονται οι τρείς οδοί των: ERK1/2, p38 MAPK, και JNKs, τα τρία επιμέρους επίπεδα των οδών (MAPKKK, MAPKK, MAPK), όπως επίσης και τα διαφορετικά υποστρώματα-στόχοι τους (Krishna and Narang, 2008a). 10

18 Οι MEKKs συνιστούν Ser/Thr κινάσες οι οποίες ενεργοποιούνται μέσω φωσφορυλίωσης που επάγεται από την αλληλεπίδρασή τους με μικρές G πρωτεΐνες της οικογένειας Ras/Rho, ως απόκριση σε εξωκυτταρικά ερεθίσματα. Η ενεργοποίηση των MEKKs, έχει ως αποτέλεσμα την επακόλουθη ενεργοποίηση των ΜΕΚ κινασών, που επιτυγχάνεται μέσω διπλής φωσφορυλίωσης σε αμινοξικά κατάλοιπα Ser και Ser/Thr, που βρίσκονται στο μοτίβο Ser-XXX-Ser/Thr. Στη συνέχεια οι ΜΕΚ κινάσες, οι οποίες συνιστούν κινάσες με διπλή ειδικότητα φωσφορυλίωσης, ενεργοποιούν τις ΜΑP κινάσες φωσφορυλιώνοντας αμινοξικά κατάλοιπα Thr/Tyr, που βρίσκονται στο συντηρημένο μοτίβο Thr-XXX-Tyr. Οι MAPKs αποτελούν κινάσες που φωσφορυλιώνουν υποστρώματα-στόχους στα αμινοξέα Ser/Thr, μόνο στην περίπτωση που ακολουθεί το αμινοξύ προλίνη (Pro) και για την ειδικότητά τους αυτή ονομάζονται προλινο-κατευθυνόμενες (proline-directed) (Cobb et al., 1991;Davis, 1993;Zheng and Guan, 1994). Το μεγάλο εύρος δράσης των MAPKs αντικατοπτρίζεται από το πλήθος των υποστρωμάτων που φωσφορυλιώνουν, όπως μεταγραφικούς παράγοντες, φωσφολιπάσες και πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον κυτταρικό σκελετό. Επίσης οι MAPKs φωσφορυλιώνουν και άλλες κατηγορίες πρωτεϊνικών κινασών: τις πρωτεϊνικές κινάσες ενεργοποιούμενες από τις MAPKs (MAPK-activated protein kinases, ΜΚs), οι οποίες εξασφαλίζουν επιπλέον ειδικότητα και ενίσχυση του σηματοδοτικού μονοπατιού των MAPKs. Η κατηγορία των MKs περιλαμβάνει την p90 ριβοσωμική κινάση S6 (RSK-1), κινάσες που ενεργοποιούνται από μιτογόνα και το στρες (MSK-1), τις κινάσες MK2-3-5 ή MAPKAP αντίστοιχα (MAPK-activated protein kinases, MAPKAP), όπως και τις κινάσες που αλληλεπιδρούν με τις MAPKs MNK1-2 (MAPK-interacting kinases) (Roux and Blenis, 2004;Krishna and Narang, 2008e). Ένας δεύτερος μηχανισμός που επιπλέον συνεισφέρει στην εξειδίκευση των καταρρακτών MAPKs, αποτελεί η δημιουργία πολυπρωτεϊνικών συμπλόκων μεταξύ μελών των σηματοδοτικών μονοπατιών MAPKs και πρωτεϊνών που ονομάζονται πρωτεΐνες σκαλωσιάς (scaffolding proteins). Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η καταστολή ενεργοποίησης των σηματοδοτικών μονοπατιών από μη ειδικά ερεθίσματα, η δομική σταθερότητα των μελών του σηματοδοτικού μονοπατιού (καταστολή δράσης φωσφατασών), καθώς και η αύξηση της κινητικής ενεργοποίησης του μονοπατιού (Kolch, 2005). Συγκεκριμένα η οδός των JNKs, ρυθμίζεται από διάφορες πρωτεΐνες σκαλωσιάς, όπως η οικογένεια των JIP (JNK interacting 11

19 proteins), που χαρακτηρίζεται από τρία μοτίβα: το μοτίβο JBD (JNK binding domain), το μοτίβο SH3 (src binding domain) και το μοτίβο PTB (phosphotyrosine binding domain). Η οδός των ERKs χαρακτηρίζεται από την πρωτεΐνη σκαλωσιάς KSR (kinase suppressor of ras), που αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Raf και τις κινάσες MEK και ERK, ενισχύοντας την ενεργοποίηση των ERKs, καθώς και από την MP1 (ΜΕΚ partner 1), η οποία συνδέει την ERK με την κινάση της MEK (Schaeffer et al., 1998;Morrison and Davis, 2003). Το σηματοδοτικό μονοπάτι των MAPKs αποτελεί ένα σύνθετο σηματοδοτικό δίκτυο, που επάγεται από διαφορετικά εξωγενή και ενδογενή ερεθίσματα. Πρόσφατες έρευνες, τόσο σε ανθρώπινα όσο και σε ζωϊκά μοντέλα, απέδειξαν τη συμμετοχή των MAPKs σε διάφορα φυσιοπαθολογικά φαινόμενα σε καρδιακό επίπεδο (υπερτροφία, ανακοπή καρδιάς, διαφοροποίηση, ισχαιμία). Για το λόγο αυτό κρίνεται αναγκαία η αποσαφήνιση των μηχανισμών της κάθε υποοικογένειας των MAPKs, που εμπλέκεται στην εκδήλωση των παραπάνω καταστάσεων και ειδικότερα στην εκδήλωση της καρδιακής υπερτροφίας Η υποοικογένεια των ERK (extracellular signal regulated kinases) Η υποοικογένεια των ERKs είναι η πρώτη MAPK που ταυτοποιήθηκε και η περισσότερο μελετημένη στα θηλαστικά. Οι καλύτερα χαρακτηρισμένες ERKs είναι η κινάση ERK1 (MB:42kDa), η ERK2 (MB:44kDa) και η ERK3 (ΜΒ:63kDa). Σε ενήλικα καρδιομυοκύτταρα, τα ποσοστά έκφρασης της ERK3 μειώνονται, ενώ επικρατέστερες είναι οι κινάσες ERK1 και ΕRK2 (Boulton et al., 1991). Η ενεργοποίηση της υποοικογένειας των ERKs επάγεται από την επίδραση αναπτυξιακών παραγόντων και διαφόρων μιτογόνων σε υποδοχείς τυροσίνης κινάσης (receptors tyrosine kinase, RTKs) και/ή σε υποδοχείς συζευγμένους με πρωτεΐνες G (G-protein coupled receptors, GPCRs) (Sadoshima and Izumo, 1995b;Sugden and Bogoyevitch, 1995). Πρόσφατες έρευνες σε απομονωμένη καρδιά επίμυ, απέδειξαν ενεργοποίηση των ERΚ1/2 και μετατόπισή τους στον πυρήνα, ως απόκριση σε φυσική τάνηση επαγόμενη από αύξηση της ενδοκοιλιακής πίεσης (Domingos et al., 2002). Παράλληλα σε απομονωμένα καρδιομυοκύτταρα, έρευνες απέδειξαν ότι η ενεργοποίηση των ERKs οφείλεται στην ενισχυμένη είσοδο ιόντων Ca +2 στο κύτταρο, 12

20 ως αποτέλεσμα της φωσφορυλίωσης της κινάσης Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase) και του υποδοχέα EGFR (epidermal growth factor receptor) (Tahara et al., 2001). Στο σηματοδοτικό μονοπατιών ERK1/2, καθοριστικό ρόλο στην ενεργοποίησή τους κατέχει η οικογένεια των κινασών ΜΕΚ1/2 (MAPKK). Μέσω υποδοχέων RPTKs και GPRCs, το σηματοδοτικό ερέθισμα μεταφέρεται στις μικρές πρωτεΐνες G (π.χ Ras), οι οποίες με τη σειρά τους μεταφέρουν το ερέθισμα στην κινάση Raf. Παρόλο που ο μηχανισμός ενεργοποίησης της Raf δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως, έχει αποδειχθεί ότι είναι αναγκαία η μετατόπιση της πρωτεΐνης Ras στην κυτταρική μεμβράνη και η πολλαπλή της φωσφορυλίωση (Campbell et al., 1998;Chong et al., 2003). Η ενεργοποιημένη Raf προσδένεται και φωσφορυλιώνει τις κινάσες MEK1/2 στα δυο κατάλοιπα Ser στις υποπεριοχές VII-VIII, που με τη σειρά τους φωσφορυλιώνουν τις ERK1/2 στην αλληλουχία Thr-Glu-Tyr και τις ενεργοποιούν. Η συνέχεια του μονοπατιού περιλαμβάνει τη φωσφορυλίωση διαφορετικών υποστρωμάτων-στόχων, τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και στον πυρήνα από τις ERK1/2, στο μοτίβο Leu- Ser/Thr-Pro. Στο κυτταρόπλασμα οι ERK1/2, φωσφορυλιώνουν την S6 κινάση p90rsk (90kDa ribosomal kinase, RSK), τη φωσφολιπάση Α2 (cpla2), όπως και πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον κυτταροσκελετό. Ένα σημαντικό ποσοστό των ERK1/2, μεταναστεύουν στον πυρήνα και ενεργοποιούν υποστρώματα που περιλαμβάνουν μεταγραφικούς παράγοντες όπως ο Elk-1, c-jun, c-fos, c-myc, καθώς και ένζυμα όπως STATs (signal transducer and activator of transcription proteins) (Yoon and Seger, 2006). Αρκετές έρευνες έχουν αποδείξει τη συμμετοχή των κινασών ERKs στην εκδήλωση καρδιακής υπερτροφίας, καθώς αγωνιστές που επάγουν την υπερτροφία όπως η αγγειοτενσίνη (Ang), η ενδοθηλίνη-1 (ET-1) και η φαινυλεφρίνη (PE), διεγείρουν την ενεργοποίηση των ERK1/2, σε καρδιομυοκύτταρα (Clerk et al., 1994c;Yue et al., 2000c). Επιμόλυνση καρδιομυοκυττάρων με συνεχώς ενεργοποιημένες πρωτεΐνες του μονοπατιού των ERKs, επάγει το χαρακτηριστικό εμβρυϊκό πρότυπο γονιδιακής έκφρασης, όπως και την αύξηση του μεγέθους των καρδιομυοκυττάρων, που αποτελούν δείκτες καρδιακής υπερτροφίας (Sugden, 1999). Διέγερση καρδιομυοκυττάρων επίμυ είχε ως αποτέλεσμα την εκδήλωση υπερτροφίας, μέσω ενεργοποίησης των MEK1/2-EKR1/2 (Xiao et al., 2001). Επίσης μελέτες σε καρδιομυοκύτταρα επίμυων, απέδειξαν ότι η καταστολή του μονοπατιού των ERKs, ανέτρεψε την αύξηση του μεγέθους των κυττάρων, την αναδιοργάνωση των 13

21 σαρκομεριδίων και την έκφραση της β-βαριάς αλυσίδας της μυοσίνης, επαγόμενες από τους υπερτροφικούς παράγοντες ET-1 και PE (Yue et al., 2000b) H υποοικογένεια των p38 MAPKs Η υποοικογένεια των p38 MAPKs αποτελείται από τέσσερις διαφορετικές ισομορφές: p38α, p38β, p38γ και p38δ. Οι δυο πρώτες εκφράζονται σε όλους τους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου και του καρδιακού, η p38γ εκφράζεται κατά κύριο λόγο στους σκελετικούς μύες, ενώ η p38δ στους πνεύμονες, στο πάγκρεας, στους νεφρούς και το λεπτό έντερο (Ono and Han, 2000b;Ono and Han, 2000a;Sugden and Clerk, 1998a). Διάφορα ερεθίσματα ενεργοποιούν τις p38 MAPKs και περιλαμβάνουν κυτοκίνες (TNF-1, IL-1), αυξητικούς παράγοντες (EGF, IGF, PDGF), φυσικό και χημικό στρες (οξειδωτικό στρες, υπεριώδη ακτινοβολία, υποξία, ισχαιμία), καθώς και αγωνιστές υποδοχέων συζευγμένων με G-πρωτεΐνες, όπως είναι η αγγειοτενσίνη (Ang), η ενδοθηλίνη-1 (ET-1) και η φαινυλεφρίνη (PE) (Bogoyevitch et al., 1994b;Lazou et al., 1998c;Chen et al., 2001a). Κατά το πρότυπο ενεργοποίησης των MAPKs: MAPKKK MAPKK MAPK, στην ενεργοποίηση των κινασών p38 MAPKs, συμμετέχουν διάφορες MAPKKKs, που περιλαμβάνουν τις MTK-1, MLK2-3, DLK, ASK-1, TAK, που με τη σειρά τους ενεργοποιούν τις MAPKKs: ΜΚΚ3 και MKK6. Αξίζει να αναφέρουμε πως ενώ οι MKK6 ενεργοποιούν όλες τις ισομορφές των p38 ΜAPKs, οι MKK3 παρουσιάζουν ένα είδος επιλεκτικότητας καθώς φωσφορυλιώνουν μόνο τις p38α-β MAPKs. Η ενεργοποίηση των διαφόρων ισομορφών των p38mapks επιτυγχάνεται μέσω διπλής φωσφορυλίωσης στην αμινοξική ακολουθία Thr-Gly-Thr, στο βρόχο ενεργοποίησής τους (activation loop) (New and Han, 1998;Enslen et al., 2000). Σύμφωνα με βιβλιογραφικές αναφορές, οι p38 MAPKs, εντοπίζονται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα. Έρευνες έχουν αποδείξει ότι άμεσο αποτέλεσμα της ενεργοποίησής τους αποτελεί η μετανάστευσή τους στον πυρήνα, ενώ άλλες αναφέρουν πως εντοπίζονται και στο κυτταρόπλασμα (Raingeaud et al., 1995;Ben- Levy et al., 1998). Πέρα από τις αντικρουόμενες αναφορές, οι p38 MAPKs, φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν πλήθος υποστρωμάτων, στα οποία συγκαταλέγονται οι MAPKAP2 κινάσες που ενεργοποιούν την πρωτεΐνη Hsp 27 (heat shock protein 27, ανθρώπινη ισομορφή), καθώς και μεταγραφικούς παράγοντες 14