ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Transcript

1 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΦΩΤΟΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΑΠΟΙΚΟ ΟΜΗΣΗΣ ΤΟΥ TRIMETHORPIM ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο ΤΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΥ. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ Χριστίνα Ι. Κοσµά 1, ήµητρα Α. Λαµπροπούλου 2, Τριαντάφυλλος Α. Αλµπάνης 1 1 Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων, Ιωάννινα, 45110, Ελλάδα 2 Τµήµα Χηµείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης, Θεσσαλονίκη, 54124, Ελλάδα me01715@cc.uoi.gr, dlambro@chem.auth.gr, talbanis@uoi.gr ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία πραγµατοποιήθηκε πειραµατικός σχεδιασµός πολλών µεταβλητών για τη βελτιστοποίηση της φωτοκαταλυτικής αποικοδόµησης του βακτηριοστατικού αντιβιοτικού Trimethoprim (TMP). Αρχικά, χρησιµοποιήθηκε ο κλασµατικός παραγοντικός σχεδιασµός δύο επιπέδων (two-level fractional factorial design) µε τη διακύµανση πέντε παραγόντων µε σκοπό να αποκλειστούν οι µη σηµαντικοί παράγοντες. Στη συνέχεια, πραγµατοποιήθηκε η χρήση του Κεντρικού Σύνθετου Σχεδιασµού (Central Composite Design, CCD) βασισµένου στη Μεθοδολογία Απόκρισης της Επιφάνειας (Response Surface Methodology, RSM) για την εκτίµηση της επίδρασης του κάθε ενός παράγοντα ξεχωριστά και της αλληλεπίδρασης µεταξύ τους και τελικά τον προσδιορισµό των βέλτιστων συνθηκών για την αποικοδόµηση του TMP. Στη συνέχεια, ακολούθησε ο προσδιορισµός των προϊόντων διάσπασης και τέλος, για την εκτίµηση της τοξικότητας κατά τη φωτοκαταλυτική διεργασία χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος Microtox bioassay (Vibrio fischeri). OPTIMIZATION OF PHOTOCATALYTIC DEGRADATION OF TRIMETHOPRIM BY MULTIVARIABLE EXPERIMENTAL DESIGN. PHOTOPRODUCTS IDENTIFICATION AND TOXICITY STUDIES Christina I. Kosma 1, Dimitra A. Lambropoulou 2, Triantafyllos A. Albanis 1 1 Department of Chemistry, University of Ioannina, Ioannina 45110, Greece 2 Department of Chemistry, Aristotle University of Τhessaloniki, Thessaloniki, 54124, Greece me01715@cc.uoi.gr, dlambro@chem.auth.gr, talbanis@uoi.gr ABSTRACT In the present study an experimental design methodology in the optimization of photocatalytic degradation of a bacteriostatic antibiotic, Trimethoprim (TMP), have been performed. At first, a two-level fractional factorial design with the variation of five factors was used in order to eliminate unimportant factors. Next, the use of a multivariable Central Composite Design (CCD) based on response surface methodology (RSM) was applied to estimate the individual and interaction factors and determine the roughly optimal conditions for TMP degradation. The photocatalytic degradation of TMP followed by a study of photoproduct identification and in order to evaluate the toxicity of the irradiated solutions, Microtox bioassay (Vibrio fischeri) was used.

2 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα τελευταία χρόνια η ύπαρξη φαρµακευτικών ουσιών και προϊόντων προσωπικής φροντίδας (Pharmaceuticals and Personal Care Products, PPCPs) στο περιβάλλον, έχει προκαλέσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον στη επιστηµονική κοινότητα που αυξάνει συνεχώς. Υψηλές συγκεντρώσεις φαρµακευτικών ουσιών φτάνουν στις µονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων (Wastewater Treatment Plants, WWTPs) µέσω της απέκκρισης του ανθρώπινου οργανισµού και τελικά καταλήγουν στα υπόγεια ύδατα καθώς και στο πόσιµο νερό και προκαλούν αρνητικές επιδράσεις τόσο στο χερσαίο όσο και στο υδάτινο οικοσύστηµα [1]. Τα προϊόντα αποικοδόµησης (Degradation products, DPs) των φαρµακευτικών ουσιών που υπάρχουν στο περιβάλλον ή σχηµατίζονται κατά την παραµονή τους στις µονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων, έχουν αποσπάσει αυξανόµενο ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια, µιας και µπορεί να είναι πολύ πιο τοξικά από την αρχική ουσία [2]. Η ετερογενής φωτοκατάλυση είναι ένα χαρακτηριστικό παράδειγµα των προχωρηµένων οξειδωτικών διεργασιών (Advanced Oxidation Processes, AOPs), που χρησιµοποιείται για την αποµάκρυνση οργανικών και ανόργανων ουσιών από τα νερά και τα απόβλητα, παρουσία οξειδωτικών ηµιαγωγών [3]. Ανάµεσα στους πιο συχνά χρησιµοποιούµενους ηµιαγωγούς είναι το TiO 2, ο οποίος θεωρείται ο καταλληλότερος σε σχέση µε τους άλλους, γιατί είναι µη τοξικός, έχει την υψηλότερη φωτοκαταλυτική δραστικότητα και είναι χαµηλού κόστους [4]. Στην παρούσα εργασία πραγµατοποιήθηκε πειραµατικός σχεδιασµός για τη βελτιστοποίηση της φωτοκαταλυτικής αποικοδόµησης του βακτηριοστατικού αντιβιοτικού Trimethoprim (TMP). Αρχικά, χρησιµοποιήθηκε ο κλασµατικός παραγοντικός σχεδιασµός δύο επιπέδων (two-level fractional factorial design) µε τη διακύµανση πέντε παραγόντων µε σκοπό να αποκλειστούν οι µη σηµαντικοί παράγοντες. Στη συνέχεια, πραγµατοποιήθηκε η χρήση του Κεντρικού Σύνθετου Σχεδιασµού (Central Composite Design, CCD) βασισµένου στη Μεθοδολογία Απόκρισης της Επιφάνειας (Response Surface Methodology, RSM) για την εκτίµηση της επίδρασης του κάθε ενός παράγοντα ξεχωριστά και της αλληλεπίδρασης µεταξύ τους και τελικά τον προσδιορισµό των βέλτιστων συνθηκών για την αποικοδόµηση του TMP. Στη συνέχεια, ακολούθησε ο προσδιορισµός των προϊόντων διάσπασης και τέλος, για την εκτίµηση της τοξικότητας κατά τη φωτοκαταλυτική διεργασία χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος Microtox bioassay (Vibrio fischeri). 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 Αντιδραστήρια και Υλικά Η φαρµακευτική ουσία Trimethoprim (TMP) προµηθεύτηκε από τον οίκο Sigma-Aldrich- Fluka. Το διοξείδιο του τιτανίου, TiO 2 (Degussa) είναι µίγµα από 80% ανατάση και 20% ρουτίλιο. Έχει µέγεθος πόρων 30 nm και δραστική επιφάνεια 50 m 2 /gr. Χρησιµοποιήθηκε δις απεσταγµένο νερό και διηθηµένο σε ανισοτροπικές µεµβράνες 0.45 mm (HA cellulose acetate, Millipore). Ο χρωµατογραφικός διαλύτης Ακετονιτρίλιο (ACN) προµηθεύτηκε από τον οίκο Merck (Darmstadt, Germany). Χρησιµοποιήθηκε εµπορικό διάλυµα υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ) (30% (v/v), Merck AG). Η χρωµατογραφική ανάλυση του TMP πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Η µελέτη των προϊόντων διάσπασης πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση υγρής χρωµατογραφίας διαδοχικής φασµατοµετρίας µαζών (liquid chromatography tandem mass spectrometry-lc-ms/ms). Ως πηγή ακτινοβολίας χρησιµοποιήθηκε ο προσοµοιωτής ηλιακού φωτός Suntest CPS+ (λυχνία Xe 1,5 kw, Hanau, Germany).

3 2.2 Χρωµατογραφία HPLC Χρησιµοποιήθηκε υγρός χρωµατογράφος της εταιρείας Simadzu (Kyoto, Japan) µε ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας µε διάταξη συστοιχίας διόδων λυχνιών SPD-M10A (UV/Diode Array Detector, UV/DAD). Το σύστηµα της HPLC περιλαµβάνει αντλία LC-10AD, σύστηµα απαέρωσης της κινητής φάσης DGU-14A και σύστηµα µίξης των διαλυτών FCV-10AL. Χρησιµοποιήθηκε σύστηµα ισοκρατικής έκλουσης (isocratic elution) µε µίγµα διαλυτών (A) H 2 O µε 0.1 % formic acid και (B) ACN και ταχύτητα ροής 1 ml/min. Η θερµοκρασία του φούρνου ήταν σταθερή στους 40 C και η ταυτοποίηση βασίστηκε στο χρόνο κατακράτησης των ουσιών και στο φάσµα απορρόφησης το οποίο συγκρίθηκε µε αυτό που δίνεται στη βιβλιοθήκη [2]. 2.3 Χρωµατογραφία LC-MS/MS Χρησιµοποιήθηκε υγρή χρωµατογραφία µαζών Thermo Scientific LC-MS/MS. Παγίδα ιόντων υψηλής απόδοσης LTQ XL, high performance linear ion trap (Thermo Fisher; Waltham, MA, USA), συνδεδεµένη µέσω electrospray ionization (ESI) µε ένα χρωµατογραφικό σύστηµα HPLC εφοδιασµένο µε τετραµελή αντλία (quaternary pump). Χρησιµοποιήθηκε σύστηµα βαθµωτής έκλουσης (gradient elution) µε µίγµα διαλυτών (A) H 2 O µε 0.1 % formic acid και (B) ACN και ταχύτητα ροής 1 ml/min. Η 2.4 Πειράµατα φωτοκατάλυσης Τα πειράµατα φωτοκατάλυσης του TMP πραγµατοποιήθηκαν σε κυλινδρικό pyrex αντιδραστήρα (100 ml pyrex glass UV reactor) στον οποίο προστέθηκαν 50 ml διαλύµατος της ουσίας TMP. Τα υδατικά διαλύµατα περιείχαν διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις της ουσίας TMP, του ηµιαγωγού TiO 2, του H 2 O 2 και της τιµής του ph µε βάση τον πειραµατικό σχεδιασµό. Πριν την ακτινοβόληση, το διάλυµα παρέµεινε στο σκοτάδι για 30 λεπτά υπό ανάδευση έως ότου φτάσει σε ισορροπία προσρόφησης στην επιφάνεια του ηµιαγωγού. 2.5 Πειραµατικός σχεδιασµός Αρχικά, χρησιµοποιήθηκε ο κλασµατικός παραγοντικός σχεδιασµός δύο επιπέδων (two-level fractional factorial design) µε τη διακύµανση πέντε παραγόντων, την αρχική συγκέντρωση του TMP, την τιµή του ph, την ένταση της λάµπας, τη συγκέντρωση του H 2 O 2 και τη συγκέντρωση του TiO 2, µε σκοπό να αποκλειστούν οι µη σηµαντικοί παράγοντες. Για το σχεδιασµό αυτό πραγµατοποιήθηκαν 18 πειράµατα, στα οποία συνδυάστηκαν οι πέντε µεταβλητές µε δύο κεντρικά σηµεία (central points). Οι συγκεντρώσεις του TMP κυµάνθηκαν από 5-20 mg/l, του TiO 2 από mg/l, του H 2 O 2 από 1-20 mm, οι τιµές του ph κυµάνθηκαν από 3,72-10 και τέλος η ένταση της λάµπας κυµάνθηκε από W/m 2. Σε κάθε πείραµα πάρθηκε δείγµα µετά από 5 λεπτά ακτινοβόλησης. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι η συγκέντρωση του TiO 2, η αρχική συγκέντρωση του TMP και η ένταση της λάµπας εµφανίζουν σηµαντική επίδραση (significant impact, p < 0.05) στην αποικοδόµηση του TMP. Έτσι, λαµβάνοντας υπόψη τους τρείς αυτούς σηµαντικούς παράγοντες, πραγµατοποιήθηκε η χρήση του Κεντρικού Σύνθετου Σχεδιασµού (Central Composite Design, CCD) βασισµένου στη Μεθοδολογία Απόκρισης της Επιφάνειας (Response Surface Methodology, RSM) για την εκτίµηση τόσο της επίδρασης του κάθε ενός παράγοντα ξεχωριστά και της αλληλεπίδρασης µεταξύ τους, αλλά και τελικά τον προσδιορισµό των βέλτιστων συνθηκών για την αποικοδόµηση του TMP. Πραγµατοποιήθηκαν 17 πειράµατα Κεντρικού Σύνθετου Σχεδιασµού µε τρία κεντρικά σηµεία. Ως µετρήσιµη απόκριση χρησιµοποιήθηκε η αποικοδόµηση του ΤΜΡ στα 5 λεπτά της φωτοκαταλυτικής διεργασίας για κάθε σειρά πειραµατικών πορειών.

4 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι πειραµατικές µεταβλητές είναι σύµφωνες µε τις προβλεπόµενες, υποδεικνύοντας τη χρηστικότητα του µοντέλου και την επιτυχία της RSM στη βελτιστοποίηση των συνθηκών της φωτοκατάλυσης (Σχήµα 1). Οι βέλτιστες συνθήκες τελικά βρέθηκαν να είναι η εξής: η αρχική συγκέντρωση mg/l του TMP, η ένταση της λάµπας 628,266 W/m 2 και η συγκέντρωση του καταλύτη 460,885 mg/l. Η προσαρµογή των πειραµατικών δεδοµένων σε δευτεροβάθµια πολυωνυµικά µαθηµατικά πρότυπα έδωσε την ακόλουθη σχέση: Αποικοδόµηση (%) = * A *B *C *A*B *A*C- 3.09*B*C *A *B *C 2 Όπου, Α, Β και C, είναι η συγκέντρωση του TiO 2, η ένταση της λάµπας και η αρχική συγκέντρωση της ουσίας TMP, αντίστοιχα. Σχήµα 1. Συσχέτιση µεταξύ παρατηρούµενων και επιθυµούµενων τιµών αποικοδόµησης του ΤΜΡ. 3.1 Προϊόντα Φωτοκατάλυσης Κατά τη διάρκεια της φωτοκαταλυτικής αποικοδόµησης της ουσίας TMP (m/z 291, C 14 H 19 N 4 O 3, πρωτονιακό µόριο) προσδιορίστηκαν τουλάχιστον 7 προϊόντα διάσπασης. 3.2 Τοξικότητα Η δοκιµή της τοξικότητα της ουσίας TMP και των δειγµάτων που πάρθηκαν σε διαφορετικούς χρόνους ακτινοβολίας πραγµατοποιήθηκε µε την τεχνική Microtox (Model 500 Toxicity Analyzer). Η δοκιµή της τοξικότητας Microtox είναι ταχεία δοκιµή οξείας τοξικότητας µε την οποία µετρείται ο επηρεασµός της φωταύγειας του βακτηρίου Photobacterium Phosphoreum (Vibrio Fischeri) που προκαλείται από την επίδραση των τοξικών ουσιών στο σύστηµα µεταφοράς ηλεκτρονίων µέσω των µεµβρανών. Η τοξικότητα εκφράστηκε ως επί τοις % αναστολή της φωταύγειας του βακτηρίου V. Fischery. Αρχικά, η % αναστολή της φωταύγειας του βακτηρίου V. Fischery ήταν 10 %. Στη συνέχεια, µετά από 2,5 λεπτά ακτινοβόλησης, λόγω του σχηµατισµού των προϊόντων διάσπασης η αναστολή αυξάνει στο 64%. Μετά από 10 λεπτά ακτινοβόλησης µειώνεται στο 37%, και µετά από 30 λεπτά ακτινοβόλησης φτάνει το 20% και τελικά µετά από 60 λεπτά δεν υπάρχει καθόλου

5 αναστολή. Όπως φαίνεται τα προϊόντα διάσπασης είναι πιο τοξικά από την αρχική ουσία TMP, καθώς επίσης φαίνεται να υπάρχουν και συνεργιστικές δράσεις µεταξύ τους. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η µέθοδος του πειραµατικού σχεδιασµού εφαρµόστηκε για τη βελτιστοποίηση της φωτοκαταλυτικής αποικοδόµησης του βακτηριοστατικού αντιβιοτικού Trimethoprim (TMP). Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι η συγκέντρωση του TiO 2, η αρχική συγκέντρωση του TMP και η ένταση της λάµπας είναι οι σηµαντικοί παράγοντες στην αποικοδόµηση του TMP. Οι βέλτιστες συνθήκες τελικά βρέθηκαν να είναι η εξής: η αρχική συγκέντρωση mg/l του TMP, η ένταση της λάµπας 628,266 W/m 2 και η συγκέντρωση του καταλύτη 460,885 mg/l. Κατά τη διάρκεια της φωτοκαταλυτικής αποικοδόµησης του TMP προσδιορίστηκαν τουλάχιστον 7 προϊόντα διάσπασης. Όπως φαίνεται από τη δοκιµή της τοξικότητας, τα προϊόντα διάσπασης είναι πιο τοξικά από την αρχική ουσία TMP, καθώς επίσης φαίνεται να υπάρχουν και συνεργιστικές δράσεις µεταξύ τους. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Kosma C., Lambropoulou D. and Albanis T. (2010) Occurrence and removal of PPCPs in municipal and hospital wastewaters in Greece Journal of Hazardous Materials, Vol. 179, pp Lambropoulou D., Hernando M., Konstantinou I., Thurman E., Ferrer I., Albanis T. and Fernández-Alba A. (2008) Identification of photocatalytic degradation products of bezafibrate in TiO 2 aqueous suspensions by liquid and gas chromatography Journal of Chromatography A, Vol. 1183, pp Yurdakal S., Loddo V., Augugliaro V., Palmisano G. and Palmisano L. (2007) Photodegradation of pharmaceutical drugs in aqueous TiO2 suspensions: Mechanism and kinetics Catalysis Today, Vol. 129, pp Konstantinou I., Sakkas V., Albanis T. (2002) Photocatalytic degradation of propachlor in aqueous TiO2 suspensions, Determination of the reaction pathway and identification of intermediate products by various analytical methods Water Research, Vol. 36, pp