Αρχές και εφαρμογές τεχνικών Αλυσιδωτής Αντίδρασης πολυμεράσης-polymerase Chain Reaction (PCR) στην Αιματολογία- BIOBANKING

Transcript

1 Αρχές και εφαρμογές τεχνικών Αλυσιδωτής Αντίδρασης πολυμεράσης-polymerase Chain Reaction (PCR) στην Αιματολογία- BIOBANKING Δασούλα Αγγελική, βιολόγος

2 Kary Mullis, 16 december 1983 : first PCR demonstration The New York Times : highly original and significant, virtually dividing biology into the two epochs of before P.C.R. and after P.C.R. 1993: Nobel Prize in Chemistry

3

4 In 1980s.. Nowadays

5

6 Σήμερα οι μοριακές τεχνικές χρησιμοποιούνται για να γίνουν αντιληπτές βλάβες που βρίσκονται στο επίπεδο του γενετικού υλικού Οι περισσότερες μοριακές εξετάσεις βασίζονται στην PCR και τις παραλλαγές της με μια τάση για πιο «εξελιγμένες» τεχνικές Μοριακές τεχνικές στη διάγνωση-κατάταξη αιματολογικών νεοπλασμάτων και πρόγνωση και λήψη θεραπευτικών αποφάσεων

7 Variations on the basic PCR technique Multiplex PCR Nested PCR AS-PCR (Allele Specific PCR) ARMS (Amplification Refractory Mutation System) Restriction enzyme digestion SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism) DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) Reverse trancription PCR (RT-PCR) Real time Quantitative PCR (RQ-PCR) Melting curve analysis Pyrosequencing-direct sequencing Fragment analysis

8 Multiplex PCR Simultaneous amplification of many targets of interest in one reaction by using more than one pair of primers. +:time, PCR reagents -: primers design, false results??

9 Nested PCR Nested PCR Low propability of nonspecific products

10 Reverse trancriptase RT-PCR RT-PCR technique: converts mrna into DNA and copies the specific sequence of interest Detection of DIAGNOSIS!!!!! chimeric mrna resulting from chromosomal translocation-first

11

12 Step 1: RNA extraction from peripheral blood/bone marrow(10.10⁶cells) (1h) Step 2: cdna Synthesis (1 ½ h) Multiplex Nested RT- PCR Step 3: 1 st Round PCR (3½h) Step 4: 2 nd Round PCR (3½h) Template: Diluted PCR products from the 1 st run Step 5: Agarose gel electrophoresis (1 h)

13 RT-PCR for PMLRARa translocation(15;17)(q22;q21) % of AML cases Intron 2 Bcr3, intron 3, 55% Bcr1, intron 6, 40%

14 PML-RARa Multiplex nested RT-PCR Mix1: RARa internal control Mix 2b: S- and L-forms Mix 2c:L-form Case 1: negative Case 2:positive-first diagnosis!!! Always: blk, positive, negative controls and sample!!!!!!!!!

15 Fusion transcripts RT-PCR for bcr-abl

16 Bcr/abl Mix1a,1b:Abl, internal cntrl Mix 2a, 2b,2c: p190 Mix 3a,3b,3c,3d:p210 + p230 Samples 1,2,3,4:unknown 5: positive cntr for p190 6:positive cntr for p210 7: negative cntr Sample 1: negative for p190 and 210 Samples 3,4: negative for p190 and p210 Multiplex nested RT-PCR Sample 2: positive for p210

17 Real Time Quantitative PCR RQ PCR

18

19

20

21 In >95% CML and ~30%ALL cases presence of Ph chromosome

22

23

24 RNA extraction from per.bl/bone mar (10.10⁶ cells) cdna synthesis (1h) Light Cycler 480 Samples preparation results evaluation

25

26 Standard curve for abl gene Efficieny:1,921 Slope: -3,526 Error:0,0150 Bcr/abl gene Abl:control gene, sample s quality

27 Amlpification curves

28 Other applications: chimeric proteins (PML/RARa t{15;17}, RUNX1-RUNX1T1 t{8;21}, CBFB-MYH11 inv.16, DEK-CAN t{6;9} ) Monitoring of minimal residual disease-mrd (FISH less sensitive than RQ-PCR) Quantification of viral load in clinical samples

29

30 Direct sequencing (Sanger) direct visualization of sequence time consuming, expensive, requires specialized equipment

31

32

33

34

35 Capillaries electrophoresis-fragments analysis

36

37 FLT3-ITD (fms like tyrosine kinase 3) knowing FLT3 mutation status can guide treatment decisions most common mutations: internal tanden duplication (ITD) or tyrosine kinase domain mutations (TKD) in the juxtamembrane domain of the receptor (ex.d835) FLT3ITD mutation: % of AML patients, vary in size and region of ITD involvement that ranges from 3 to >400bp, poor survival Capillary electrophoresis, in vivo scribe

38 NPMI 35% of adult AML patients at diagnosis,50-60% of all adult AML cases with normal karyotype >26 mutations in AML TCTG insertion: most common mutation, 80% of AML NPM1 mutated cases Capillary electrophoresis, in vivo scribe

39 Laiko: capillaries size, Y-N Insertion 4 noucleotides

40 Biobanking Τι είναι βιοτράπεζα; Ο όρος βιοτράπεζα αναφέρεται στη συλλογή δειγμάτων βιολογικού υλικού, τα οποία συνδέονται με προσωπικά δεδομένα των δοτών των δειγμάτων αυτών. Βιολογικά υλικά Τα βιολογικά δείγματα μπορεί να είναι ιστοί, κύτταρα, αίμα ή DNA, RNA που απομονώθηκαν από ασθενείς (δότες). 40

41 Best Practices for Biobanking in the Era of Precision Medicine JSCO 50 th Annual Meeting Yokohama, Japan October 27,

42 42

43 Population Patient TISSUE DATA Personal Demographic Clinical Organization Storage Biobank research product Retrieval Analysis

44 Απαραίτητη προϋπόθεση η ενημέρωση και η έγγραφη συγκατάθεση των ασθενών 44

45 45

46 46

47 47

48 48

49 Βιοτράπεζες στην Ελλάδα Αναμενόμενα οφέλη για τη χώρα από την ύπαρξη σύγχρονων βιοτραπεζών: Πληρέστερη ενημέρωση και συντονισμός των Ελλήνων ερευνητών Διασύνδεση με την πανευρωπαϊκή προσπάθεια Δυνατότητα πρόσβασης σε βιολογικό υλικό άλλων βιοτραπεζών Η Αιματολογική κλινική του ΠΠΓΝΙ και το Κέντρο Βιοτράπεζας Καρκίνου του ΠΙ συμβάλλουν σε μια αξιόλογη προσπάθεια για τη λειτουργία Βιοτράπεζας στα Ιωάννινα Το Κέντρο Βιοτράπεζας Καρκίνου του ΠΙ έγινε δεκτό ως μια από τις δύο Ελληνικές Βιοτράπεζες που εντάχθηκαν στο δίκτυο 274 Ευρωπαϊκών Βιοτραπεζών BBMRI (Biobanking and Biomolecular Resources Research Infrastructure)

50 50

51

52 Σκοπός των βιοτραπεζών να συμβάλουν : σε ακαδημαϊκές έρευνες για γενετικές ασθένειες στη δημιουργία κλινικών αρχείων για διαγνωστικούς σκοπούς σε πληθυσμιακές έρευνες για την μελέτη γενετικής ποικιλότητας Πρώτες βιοτράπεζες: Ισλανδία Δεκέμβριο 1998 Εσθονία Δεκέμβριο 2000 Βρετανία 2002 Σουηδία Ιανουάριος

53 Ο χώρος της Βιοτράπεζας θα πρέπει να είναι συγκεκριμένος και να πληρεί κάποιες προϋποθέσεις: Συνεχής αερισμός του χώρου Δοχεία για τη φύλαξη σε υγρό άζωτο (κύτταρα) Καταψύκτες στους -80 o C (DNA, RNA) Συναγερμός αυξομείωσης θερμοκρασίας, διαρροής αζώτου Εικόνα 1. Σύγχρονη μονάδα υγρού αζώτου με προσαρμοσμένο σύστημα συναγερμού για τη φύλαξη βιολογικού υλικού (Technical Standards and Protocols for Biological Resource Centers, International Agency for Research on Cancer, Within the Framework of BBMR1 WP3) 53

54 Εικόνα 2. Αποθήκευση κυττάρων σε υγρό άζωτο στους -196 ο C Εικόνα 3.Καταψύκτης φύλαξης βιολογικού υλικού θερμοκρασίας C (Technical Standards and Protocols for Biological Resource Centers, International Agency for Research on Cancer, Within the Framework of BBMR1 WP3) 54

55 Δοχείο αποθήκευσης αζώτου αέριας φάσης

56 Σήμερα στη Βιοτράπεζα Πανεπιστημίου Ιωαννίνων συμβαίνει.. Απομόνωση και φύλαξη: DNA από επίχρισμα επιθηλιακών κυττάρων του εσωτερικού των παρειών των ασθενών (Buccal cells) μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (peripheral blood mononuclear cells- PBMC) ή μυελού των οστών (bone marrow mononuclear cells-bmmc) Στα μονοπύρηνα κύτταρα ανήκουν: λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, βασεόφιλα, δενδριτικά κύτταρα. Επίσης, τα πλασματοκύτταρα καθώς και οι βλάστες. Τα μονοπύρηνα συλλέγονται από όλες τις βιοτράπεζες παγκοσμίως Με την αποθήκευση σε υγρό άζωτο σταματούν όλες τις λειτουργίες του κυττάρου 56

57 I. Απομόνωση DNA από επιθηλιακά κύτταρα του εσωτερικού των παρειών Συλλογή επιχρίσματος με τη χρήση απλών βαμβακοφόρων στυλεών 57

58 ΙΙ. Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων Η απομόνωση έγινε με χρήση φυκόλης: Επιτρέπει βαθμιαία στρωματοποίηση του αίματος. Μετά από ήπια φυγοκέντρηση στην κορυφή της στρωματοποίησης υπάρχει το πλάσμα, ακολουθεί το στρώμα των μονοπύρηνων, η φυκόλη και τέλος τα κοκκιοκύτταρα (όπως ουδετερόφιλα και ηωσινόφιλα) και τα ερυθροκύτταρα στον πυθμένα του σωλήνα φυγοκέντρησης. 58

59 Για το Biobanking Κάθε φορά κατά την επεξεργασία κάποιου δείγματος καταγράφονται τα στοιχεία του ασθενούς, αλλά και του δείγματος σε μια ηλεκτρονική βάση δεδομένων. Αναλυτικά: ονοματεπώνυμο ασθενούς νόσος, φάση νόσου (πρωτο-διάγνωση, υποτροπή, υπο-θεραπεία) ημερομηνία και ακριβής ώρα λήψης του δείγματος από τον θεράποντα ιατρό ακριβής ώρα παραλαβής δείγματος από το εργαστήριο ημερομηνία και ώρα έναρξης επεξεργασίας δείγματος στο εργαστήριο περιγραφή αρχικού υλικού (μυελός ή αίμα) ποσότητα παρατηρήσεις σχετικά με το υλικό τι ακριβώς υλικό από τον ασθενή κρατήσαμε (μονοπύρηνα κύτταρα, DNA/RNA, DNA από buccal cells κλπ..) 59

60 60