Μαρία Τσοπανοµίχαλου PhD. Μοριακής Βιολογίας. ΝΕΕΣ Κοργιαλένειο Μπενάκειο

HTML
DOWNLOAD

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Μαρία Τσοπανοµίχαλου PhD. Μοριακής Βιολογίας. ΝΕΕΣ Κοργιαλένειο Μπενάκειο"

Ἀρταξέρξης Μήτζου
9 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Μαρία Τσοπανοµίχαλου PhD. Μοριακής Βιολογίας ΝΕΕΣ Κοργιαλένειο Μπενάκειο

2 Καταφεύγουµε στις µοριακές τεχνικές Συλλέγουµε το δείγµα για µοριακές τεχνικές

3 ιάσπαση ιστικών δοµών ιαχωρισµός των κυττάρων ιάσπαση των κυτταρικών µεµβρανών ιάσπαση των πυρηνικών µεµβρανών Αποµόνωση πρωτεϊνών, DNA, RNA συνολικά ή κλασµατικά

4 DNA genomics RNA transcriptomics Πρωτεΐνη πρωτεΐνες proteomics

5 genomics

6 genomics

7 genomics

11 οριζόντια κάθετη

12 genomics

13 genomics

14 Μέτρηση Απορρόφησης στα 260nm και 280nm (ratio A 260/280 ) Καθαρό DNA ~1.8 Καθαρό RNA ~2.0 % νουκλεϊκό οξύ % πρωτεΐνη A 260/ ΟΠΤΙΚΗ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ (OD): 1OD=50µgr/ml dsdna genomics

0 % νουκλεϊκό οξύ % πρωτεΐνη A 260/280 100 0 2.

15 genomics

16 genomics

17 ΜΕΓΑΛΕΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΜΕΤΑΘΕΣΕΙΣ ΕΛΛΕΙΨΕΙΣ ΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟΙ Μέθοδοι ανίχνευσης ΙΝ SITU ΥΒΡΙ ΙΣΜΟΣ SOUTHERN BLOT PCR ΜΙΚΡΕΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ genomics ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ Μέθοδοι ανίχνευσης PCR Sequencing

SOUTHERN BLOT PCR ΜΙΚΡΕΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ

18 genomics

19 genomics

20 genomics

21 genomics

24 genomics

25 genomics

27 transcriptomics

28 transcriptomics

30 ΑΛΛΑΓΕΣ ΕΠΙΠΕ ΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙ ΙΩΝ Που οφείλονται σε αλλαγές του DNA ΑΥΞΗΣΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΜΕΙΩΣΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ Μέθοδοι ανίχνευσης NORTHERN BLOT qpcr Που δεν οφείλονται σε αλλαγές του DNA transcriptomics

31 transcriptomics

32 transcriptomics

34 transcriptomics

35 transcriptomics

36 transcriptomics

37 in situ hybridization PCR, qpcr υνατότητα ανίχνευσης ιών υνατότητα ανίχνευσης DNA, RNA υνατότητα ανίχνευσης µεταθέσεων υνατότητα ανίχνευσης µεταλλάξεων υνατότητα ιών ανίχνευσης υνατότητα ανίχνευσης DNA, RNA υνατότητα ανίχνευσης µεταθέσεων υνατότητα µεταλλάξεων ανίχνευσης

38 in situ hybridization PCR, qpcr Ανίχνευση µεταθέσεων, ελλείψεων, διπλασιασµό σχετικά µεγάλων τµηµάτων DNA Ανίχνευση µεταθέσεων, ελλείψεων, διπλασιασµό και µικρών τµηµάτων DNA Ηµι-ποσοτική εκτίµηση ιατήρηση της δοµής Ηµι-ποσοτική και απόλυτη εκτίµηση Εκχύλιση συστατικών συνολικά και κλασµατικά

39 in situ hybridization PCR, qpcr Ελάχιστη απαιτούµενη ποσότητα DNA 10 mg (10-3 g) καθαρού DNA εν επηρεάζεται από την παρουσία παραφίνης Χρόνος πειράµατος 4-24h Ελάχιστη απαιτούµενη ποσότητα DNA 200 ng (200 X10-9 g) καθαρού DNA Ιδιαίτερα ευαίσθητα στην παρουσία αναστολέων Χρόνος πειράµατος 2-3h

40 Η PCR ως µεθοδολογία είναι δυσκολότερη τεχνικά αλλά µπορεί να χρησιµοποιηθεί σε µικρές ποσότητες DNA/RNA και να ανιχνεύσει σηµειακές µεταλλαγές

46 proteomics

47 proteomics

48 proteomics

49 proteomics

50 ΑΛΛΑΓΕΣ ΠΟΣΟΤΗΤΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ Που οφείλονται σε αλλαγές του DNA ΑΥΞΗΣΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΜΕΙΩΣΗ ΕΚΦΡΑΣΗς Μέθοδοι ανίχνευσης WESTERN BLOT ELISA MASS SPECTROMETRY 2D SDS PAGE Που οφείλονται σε αλλαγές του RNA Που δεν οφείλονται σε αλλαγές του DNA Που δεν οφείλονται σε αλλαγές του RNA proteomics

52 ΑΛΛΑΓΕΣ ΠΡΟΣ ΕΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΤΗΤΑΣ ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ (π.χ φωσφορυλιώση, µεθυλίωση) Μέθοδοι ανίχνευσης WESTERN BLOT MASS SPECTROMETRY 2D SDS PAGE ELISA proteomics

53 proteomics

54 proteomics

55 proteomics

56 proteomics

57 proteomics

58 proteomics

59 ΑΝΟΣΟΙΣΤΟΧΗΜΕΙΑ ιατήρηση της δοµής WESTERN BLOT, SDS PAGE, ELISA Μη διατήρηση της δοµής Συσχέτιση έκφρασης πρωτεϊνών µε δοµή Συσχέτιση έκφρασης πρωτεϊνών µε λειτουργικότητα Μη ακριβής ποσοτικοποίηση Ακριβής ποσοτικοποίηση

61 Καθαρότητα δείγµατος Αποστειρωµένες συνθήκες Απουσία καταστροφικών ενζύµων (Dnase, Rnase, πρωτεάσες) Μέθοδοι ορισµού του κατώτερου επιπέδου ανίχνευσης Μέθοδος ορισµού ειδικότητας αντίδρασης Ποσοστό καρκινικών/ φυσιολογικών κυττάρων δυνατότητα ανίχνευσης 1 µεταλλαγµένου κυττάρου µεταξύ wild-type alleles

62 Λήψη δείγµατος µε καθαρά (ει δυνατόν αποστειρωµένα) εργαλεία και τοποθέτηση σε αποστειρωµένα φιαλίδια. Αν υπάρχει ένδειξη για χρήση µοριακών τεχνικών όχι έγκλειση σε παραφίνη. Φύλαξη σε -20 ο C για βραχύχρονη φύλαξη. Φύλαξη σε -70 ο C για µακρόχρονη φύλαξη. Φύλαξη περισσότερων του ενός φιαλιδίου ΌΧΙ ΠΑΓΩΜΑ ΚΑΙ ΞΕΠΑΓΩΜΑ.

63 Λήψη αµιγών ιστικών δειγµάτων (π.χ.αµιγής καρκίνος ή µικρό ποσοστό φυσιολογικών κυττάρων). Συγκεκριµένο ζητούµενο άρα συγκεκριµένη τεχνική Συγκεκριµένο ζητούµενο άρα συγκεκριµένη τεχνική προσέγγιση

64 Milbury CA, Li J, Makrigiorgos GM. PCR-Based Methods for the Enrichment of minority Alleles and Mutations. Clin Chem April ; 55(4): Anne-Claude Gingras AC, Matthias Gstaiger M, Brian Raught B, Aebersold R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, (August 2007) Netto GI, Saad RD, Dysert DA. Diagnostic molecular pathology: current techniques and clinical applications, part I. BUMC PROCEEDINGS 2003;16: Cordon-Cardo C. Applications of Molecular Diagnostics: Solid Tumor Genetics Can Determine Clinical Treatment Protocols. Mod Pathol 2001;14(3):

Σχετικά έγγραφα

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Εργαστήριο

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Εργαστήριο Ενότητα 10: Μοριακή Βιολογία και Μικροβιολογία Τροφίμων (1/2), 1ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Διδάσκοντες: Ευστάθιος Ζ. Πανάγου Πασχαλίτσα