5. Η εξειδίκευση στη σηματοδότηση των ΜΑΡΚ στο ζυμομύκητα S. cereviciae Διαφορές των Fus3 και Κss1

Transcript

1 11 ο Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ Κινασών 1. Σηματοδοτικά μονοπάτια των MAP κινασών Οργάνωση και συστατικά του μονοπατιού των ΜΑΡΚ Οργάνωση των ΜΑΡΚs σε πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα Σηματοδοτικά μονοπάτια των ΜΑΡ στα θηλαστικά 2. Τρόποι ενεργοποίησης των μονοπατιών ΜΑΡΚ Ενεργοποίηση των ΜΑΡΚ από υποδοχείς κινάσες τυροσίνης Ενεργοποίηση των ΜΑΡΚ από GPCRs 3. Μετάδοση του μηνύματος από την ERK 4. Το σηματοδοτικό μονοπάτι της JNK Ενεργοποίηση του μονοπατιού ASK1/JNK από στρεσογόνους παράγοντες Ενεργοποίηση της JNK από το μη κανονικό μονοπάτι του Wnt Πρωτεΐνες σκαλωσιάς (Scaffold proteins) της JNK Έρευνες για το μονοπάτι JNK σε γενετικά τροποποιημένα ποντίκια 5. Η εξειδίκευση στη σηματοδότηση των ΜΑΡΚ στο ζυμομύκητα S. cereviciae Διαφορές των Fus3 και Κss1 6. Σηματοδότηση των ΜΑΡΚ στα φυτά Ο ρόλος των ΜΑΡΚ στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση των φυτικών ορμονών Ο ρόλος των ΜΑΡΚ στην απάντηση των φυτών σε αβιοτικό στρες Ο ρόλος των ΜΑΡΚ στην αντιμετώπιση παθογόνων Ο ρόλος των ΜΑΡΚ στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου κατά την κυτταροκίνηση

2 372 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών 1. Σηματοδοτικά μονοπάτια των ΜΑΡ Κινασών Μετά την ενεργοποίηση των διαμεμβρανικών υποδοχέων από τον εξωκυτταρικό διαβιβαστή, η μετάδοση του μηνύματος στο εσωτερικό του κυττάρου ακολουθεί δυο μονοπάτια. Στο πρώτο μονοπάτι, η ενεργοποίηση των υποδοχέων οδηγεί στη δημιουργία δεύτερων διαβιβαστών (camp, DAG, IP 3 ), οι οποίοι με τη σειρά τους ενεργοποιούν πρωτεΐνες (PKA, PKC, CAM-kinase) που μεταδίδουν περαιτέρω το μήνυμα. Μέσω αυτού του σηματοδοτικού μονοπατιού, το μήνυμα μπορεί να μεταφερθεί μέχρι τον πυρήνα προκαλώντας μια βραχυπρόθεσμη αντίδραση, όπως για παράδειγμα η έκκριση ουσιών, η ρύθμιση του μεταβολισμού ή η συσταλτότητα του κυττάρου. Στο δεύτερο μονοπάτι, το οποίο είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τη ρύθμιση της αύξησης και της διαφοροποίησης, η ενεργοποίηση των υποδοχέων οδηγεί στη μακροπρόθεσμη ενεργοποίηση αλυσιδωτών αντιδράσεων κινασών πρωτεϊνών. Επειδή αυτό το μονοπάτι ενεργοποιείται από μιτογόνους παράγοντες (μιτογόνους: που προωθούν δραστηριότητες της κυτταρικής διαίρεσης), η αλληλουχία των αντιδράσεων κινασών είναι γνωστή ως mitogenic activated protein kinases cascade ή MAPK cascade. Το κάθε μονοπάτι των ΜΑΡ κινασών περιλαμβάνει τουλάχιστον τρεις διαφορετικές κινάσες πρωτεϊνών, οι οποίες φωσφορυλιώνουν η μια την άλλη. Οι MAPKs επάγουν διάφορες κυτταρικές διαδικασίες όπως: πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση, απάντηση στο stress και απόπτωση. Οργάνωση και συστατικά του μονοπατιού των ΜΑΡΚs Το μονοπάτι των MAPKs περιέχει τρεις πρωτεϊνικές κινάσες, οι οποίες φωσφορυλιώνονται διαδοχικά η μία από την άλλη. Οι ΜΑΡΚΚΚs φωσφορυλιώνουν τις ΜΑΡΚΚs, οι οποίες φωσφορυλιώνουν τις ΜΑΡΚs. Το κάθε μονοπάτι ΜΑΡΚ είναι οργανωμένο ως πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο, με τη βοήθεια πρωτεϊνών σκαλωσιάς (scaffold proteins). Πρωτεΐνες σκαλωσιάς των ΜΑΡΚs βρέθηκαν για πρώτη φορά στο ζυμομύκητα S. Cerevisiae, η Ste5 και η Pbs2p. Η οργάνωση των ΜΑΡΚs σε ένα σύμπλοκο έχει δυο σημαντικά πλεονεκτήματα: 1) ευνοεί τη γρήγορη

3 ΚΑΦΑΛΑΙΟ μετάδοση του μηνύματος και 2) εγγυάται την εξειδίκευση της μεταγωγής του σήματος εμποδίζοντας ανεπιθύμητες διασταυρώσεις με άλλα μονοπάτια ΜΑΡΚ. α. β. Εικόνα 11.1 Μεταγωγή σήματος μέσω του καταρράκτη των MAP κινασών. α. Το κάθε μονοπάτι ΜΑΡΚ είναι οργανωμένο ως πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο, με τη βοήθεια πρωτεϊνών σκαλωσιάς (scaffold proteins). β. Η πρωτεΐνη σκαλωσιάς JIP-1 που δρα στο σηματοδοτικό μονοπάτι της JNK. Τα κύτταρα περιέχουν διαφορετικές MAPKs, οι οποίες μπορεί να διαφέρουν ως προς τη φύση του διεγέρτη τους και ως προς τη φύση της πρωτεΐνης που θα φωσφορυλιώσουν. Μέχρι σήμερα 3 διακριτά μονοπάτια MAPKs είναι γνωστά στα θηλαστικά, καθένα από τα οποία ενεργοποιείται από διαφορετικό είδος σήματος, και παίρνει το όνομά του από το όνομα της τελευταίας ΜΑΡ-κινάσης: 1. Το μονοπάτι που ενεργοποιείται από ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες: Raf MEK1-2 ERK1-2 (Extracellular signal-regulated Kinase). 2. Το μονοπάτι που ενεργοποιείται από εξωκυτταρικούς στρεσογόνους παράγοντες (TNF-α, UV, κυτοκίνες): ΜΕΚΚ1-5, ΤΑΚ1, ΑSK1 ΜΕΚ4,7 JNK (Jun NH 2 - terminal Kinase) ή SAPK (stress activated protein kinase). 3. Το μονοπάτι που ενεργοποιείται από εξωκυτταρικούς στρεσογόνους παράγοντες (TNF-α, UV, Η 2 Ο 2 ): MEKK4, ΤΑΚ1, ASK1 ΜΕΚ3,4,6 p38/hog.

4 374 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών Προσδέτες Ενεργοποιητές Μονοπάτι ERK Μονοπάτι JNK/SAPK Μονοπάτι p38/hog Αυξητικοί παράγοντες ορμόνες TNF-α, UV, ILs, stress TNF-α, UV, H 2 O 2, stress GEF Grb2/hSos - - GTP-binding protein Ras Rac/Cdc42 - Raf MEKK1-5, TAK1, ASK1 MEKK4, TAK1, ASK1 Πρωτεϊνικές κινάσες MEK1-2 MEK4,7 MEK3,4,6 ERK1-2 JNK ή SAPKs p38/hog Μεταγραφικοί παράγοντες p62tcf c-jun, p62tcf, ATF2 c-jun, CREB, ATF2 Εικόνα 11.2 Τα μονοπάτια των ΜΑΡΚs. Το πιο καλά μελετημένο μονοπάτι ΜΑΡΚ είναι το μονοπάτι των ΕRKs (Extracellular signal-regulated Kinases). Το μονοπάτι αυτό ενεργοποιείται από την πρωτεΐνη Ras (ή άλλα μέλη της υπερ-οικογένειας Ras). - H Ras ενεργοποιεί τις κινάσες ΜΑΡΚΚΚ (κυρίως τη Raf). Οι κινάσες αυτές είναι πρωτεϊνικές κινάσες Ser/Thr, οι οποίες φωσφορυλιώνουν στη συνέχεια, σε δυο κατάλοιπα Ser, τις κινάσες ΜΑΡΚΚ (κυρίως τη MEK: MAP/ERK Kinase).

5 ΚΑΦΑΛΑΙΟ Οι ΜΑΡΚΚ (ΜΑΡΚ Κινάσες) είναι μια ειδική κατηγορία πρωτεϊνικών κινασών που έχουν τη δυνατότητα να φωσφορυλιώνουν ταυτόχρονα κατάλοιπα Thr και Tyr, τα οποία αναγνωρίζουν σε μια αλληλουχία -ΤhrXTyr-. Οι MARKK εξαιτίας αυτής τους της ιδιότητας ονομάζονται πρωτεϊνικές κινάσες διπλής εξειδίκευσης, και διαφέρουν σημαντικά από τις άλλες κινάσες που μπορούν να φωσφορυλιώνουν είτε κατάλοιπα Ser/Thr είτε κατάλοιπα Tyr. Οι ενεργοποιημένες ΜΑΡΚΚ φωσφορυλιώνουν το τελευταίο μέλος του μονοπατιού, τις ΜΑΡΚ (τις ΕRKs). - Οι ΜΑΡΚ (ΜΑΡ Κινάσες) περιέχουν καλά διατηρημένη την αλληλουχία -ΤhrXTyr-, φωσφορυλίωση της οποίας οδηγεί στην ενεργοποίησή τους. Οι ενεργοποιημένες ΜΑΡΚ είτε μεταφέρονται στον πυρήνα, όπου ενεργοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες είτε φωσφορυλιώνουν άλλους τελεστές. ενεργοποιημένος υποδοχέας ενεργοποιημένος υποδοχέας MEKK: MEK Kinase MEK: MAP/ERK Kinase ERK: Extracellular Regulated Εικόνα 11.3 Συστατικά και ενεργοποίηση του μονοπατιού των ERKs. Το εξωκυτταρικό μήνυμα το οποίο λαμβάνει ο υποδοχέας μεταφέρεται στη Ras. H ενεργοποιημένη Ras ενεργοποιεί μια ΜΑΡΚΚΚ, την Raf ή την MEKK-1. Οι κινάσες αυτές φωσφορυλιώνουν δυο κατάλοιπα σερίνης μιας ΜΑΡΚΚ (της ΜΕΚ). Η ΜΕΚ στη συνέχεια, φωσφορυλιώνει σε ένα κατάλοιπο θρεονίνης και ένα κατάλοιπο τυροσίνης το τελευταίο μέλος του μονοπατιού, την ΜΑΡΚ (ή ΕRK1-2). Τέλος η ERK ενεργοποιεί μεταγραφικούς παράγοντες μεταφέροντας το μήνυμα στον πυρήνα είτε φωσφορυλιώνει άλλους τελεστές. 2. Τρόποι ενεργοποίησης των μονοπατιών ΜΑΡΚ Οι ΜΑΡΚ μπορούν να ενεργοποιηθούν από υποδοχείς αυξητικών παραγόντων (RTKs), από υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες (GPCRs) με τη μεσολάβηση των G πρωτεϊνών ή με μηχανισμούς ανεξάρτητους από τις G πρωτεΐνες. Ενεργοποίηση των μονοπατιών ΜΑΡΚ από υποδοχείς-κινάσες Tyr Οι αυξητικοί παράγοντες, όπως PDGF (platelet derived growth factor) αυξητικός παράγοντας από αιμοπετάλια και EGF (epidermical growth factor) επιδερμικός αυξητικός

6 376 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών παράγοντας δεσμεύονται στους μονομερείς υποδοχείς τους (RTKs), προκαλείται διμερισμός των υποδοχέων και αυτοφοσφωρυλίωση τους σε κατάλοιπα Tyr. Στις φωσφορυλιωμένες Tyr του υποδοχέα συνδέεται μέσω της SH2 περιοχής της, η πρωτεΐνη προσαρμογέας Grb2 (growth factor receptor binding protein). Στην Grb2 στη συνέχεια συνδέεται ο SOS, ένας παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης, ο οποίος ενεργοποιεί τη μικρή GTPάση Ras.GDP, ανταλλάσσοντας το GDP με GTP. Η Ras μέσω του C-τελικού πρενυλιωμένου άκρου της βρίσκεται στην πλασματική μεμβράνη. Η ενεργοποιημένη Ras.GTP στρατολογεί στη μεμβράνη την πρώτη κινάση του μονοπατιού των ΜΑΡΚ, την κινάση Ser/Thr Raf, μια MAP kinase kinase kinase (MAPKKK). Η Raf σε κατάσταση ηρεμίας βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα σε μια αναδιπλωμένη μορφή της, συνδεδεμένη μέσω των φωσφορυλιωμένων καταλοίπων Ser με την πρωτεΐνη Σε αυτή τη διαμόρφωση οι θέσεις σύνδεσης της Ras, αλλά και οι θέσεις σύνδεσης των φωσφολιπιδίων βρίσκονται κρυμμένες. Η διέγερση του αυξητικού παράγονται ενεργοποιεί παράλληλα και μια φωσφατάση (την πρωτεϊνική φωσφατάση 2Α), η οποία αποφωσφορυλιώνει την Raf, οδηγώντας σε μια ανοιχτή διαμόρφωση που επιτρέπει τη σύνδεση της Raf στα λιπίδια της μεμβράνης και στη Ras. Στην κατάσταση ηρεμίας, η κινάση ΜΑΡΚΚ, ΜΕΚ, βρίσκεται συνδεδεμένη με την πρωτεΐνη σκαλωσιάς KSR, η οποία λόγω της φωσφωρυλιωμένης της κατάστασης συνδέεται μέσω φωσφοσερινών με την πρωτεΐνη και παραμένει στο κυτταρόπλασμα. Η διέγερση του αυξητικού παράγοντα και η ενεργοποίηση της φωσφατάσης 2Α, αποφωσφορυλιώνει την KSR, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα την σύνδεση της ERK στη σκαλωσιά και τη στρατολόγηση του συμπλόκου στην πλασματική μεμβράνη. Η KSR περιέχει, όπως και η Raf, θέσεις σύνδεσης φωσφολιπιδίων. Συνεπώς, η Raf και το σύμπλοκο KSR-MEK-ERK συναντώνται στη μεμβράνη και το σηματοδοτικό a. σύμπλοκο ολοκληρώνεται (KSR/ Raf-MEK-ERK) και ενεργοποιείται. [1] [2] Εικόνα 11.4 α. Σε κατάσταση ηρεμίας η Raf καθώς και η πρωτεΐνη σκαλωσιάς KSR με την ΜΕΚ, βρίσκονται συνδεδεμένες με την πρωτεΐνη , στο κυτταρόπλασμα [1]. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα αυξητικού παράγοντα, αφενός ενεργοποιεί την Ras (Ras.GTP) και αφετέρου οδηγεί στην αποφωσφορυλίωση της Raf και της KSRκαι στην αλλαγή της διαμόρφωσής τους, γεγονός που τους επιτρέπει τη σύνδεση με τη μεμβράνη και την Ras [2]. Από Anderson D., Role of lipids in the MAPK signalling pathway, Progress in Lipid Res. 2006, 45, β. Δομή της πρωτεΐνης Raf. Διακρίνεται η Ν-τελική περιοχή CR1, η οποία περιέχει ένα Ras-binding domain (RBD) και ένα cysteine-rich domain (CRD). Η CR2 περιοχή περιέχει θέσεις φωσφορυλίωσης Ser/Thr, ενώ η περιοχή κινάσης (ΚD) βρίσκεται στο C-τελικό τμήμα CR3. β. Η Raf

7 ΚΑΦΑΛΑΙΟ Η ενεργοποιημένη Raf φωσφορυλιώνει σε δύο κατάλοιπα Ser την ΜΕΚ (ΜΑΡ/ΕRK Kinase), ένας τύπος ΜΑΡ kinase kinase (MAPKK). Στη συνέχεια, η ΜΕΚ φωσφoρυλιώνει στηthr183 και στην Tyr185 την ERΚ μια MAPK κινάση Ser/Thr. ΕRK Εικόνα 11.5 Τριτοταγής δομή της κινάσης ERK. (β) Διακρίνονται τα δυο φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα pt183 (θρεονίνη183) και py185 (τυροσίνη185). Μετά την ενεργοποίηση το σύμπλεγμα διαχωρίζεται. Η KSR φωσφορυλιώνεται από την κινάση C-TAK1 στη Ser392 σημείο σύνδεσης της , και επανέρχεται στο κυτταρόπλασμα. Εικόνα 11.6 Ο κύκλος ρύθμισης της πρωτεΐνης-σκαλωσιάς KSR. Η ανενεργή KSR (kinase suppressor of Ras) βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα συνδεδεμένη με την , την Α και C υπομονάδα της φωσφατάσης PP2 και την ΙΜΡ (impedes mitogenic signal propagation), η οποία επάγει την φωσφορυλίωσή της. Ενεργοποίηση του EGF-R οδηγεί στη ενεργοποιημένη Ras-GTP, η οποία επάγει την αποφωσφορυλίωση της Ser392, μέσω της σύνδεσης της Β-υπομονάδας της ΡΡ2 στις Α και C υπομονάδες της. Επιπλέον η Ras-GTP επάγει την ουβικουϊτινίωση της ΙΜΡ. Σε αυτή τη διαμόρφωση, η KSR στρατολογείται στη μεμβράνη, όπου συνδέεται με την Raf και την ERK. Από Kolch W., Coordinating ERK/MAPK signaling throught scaffolds and inhibitors, Nature Reviews, Mol. Cell Biol., 2005, 6,

8 378 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών Αυτός είναι ο κλασικός τρόπος ενεργοποίησης των ΜΑΡΚs από τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Όμως, οι RTKs έχουν τη δυνατότητα να ενεργοποιήσουν και τη PLCγ (βλπ Κεφάλαιο 9). Η παραγωγή DAG και η αύξηση Ca 2+ οδηγούν στην ενεργοποίηση της PKC. Πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι η PKC μπορεί να ενεργοποιήσει τη Raf-1 (ΜΑΡΚΚΚ) και την JNK (ΜΑΡΚ), ενδυναμώνοντας με αυτόν τον τρόπο το αρχικό σήμα των αυξητικών παραγόντων. RTK RTK -TyrPO 4 PLCγ Protein Kinase C ΜΕΚ/ΕRΚ Εικόνα 11.7 Ενεργοποίηση του καταρράκτη των ΜΑΡ κινασών που ξεκινάει από τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων κινάσες τυροσίνης. Ο ενεργοποιημένος RTK ενεργοποιεί τη Ras, η οποία στρατολογεί στη μεμβράνη την κινάση Raf. Όταν συνδεθεί στη μεμβράνη, η Raf ενεργοποιείται και κατά συνέπεια και το μονοπάτι MEK/ERK. Οι φωσφορυλιωμένες Tyr του ενεργοποιημένου υποδοχέα είναι επίσης θέσεις σύνδεσης της PLCγ, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί την κινάση PKC. Η PKC έχει τη δυνατότητα φωσφορυλιώνοντας να ενεργοποιήσει τη Raf ενισχύοντας το σήμα του αυξητικού παράγοντα. Ενεργοποίηση των μονοπατιών ΜΑΡΚ από GPCRs Τα τελευταία χρόνια έγινε φανερό ότι οι GPCRs εκφράζονται σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, όπου ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση τους, καθώς επίσης μεταλλάξεις GPCRs συνδέονται με τη δημιουργία καρκίνων σε πολλούς κυτταρικούς τύπους. Οι GPCRs ελέγχουν την κυτταρική αύξηση ενεργοποιώντας το μονοπάτι των MAPKs. Σε ορισμένες περιπτώσεις, εμφανίζονται να χρησιμοποιούν, ως μεσάζοντες τους RTKs, των οποίων ο ρόλος στη μιτογένεση είναι γνωστός και καλά τεκμηριωμένος, ενώ σε άλλες περιπτώσεις, οι GPCRs ενεργοποιούν τις MAPKs ανεξάρτητα από τους RTΚs. Ένας μεγάλος αριθμός GPCRs, όπως οι υποδοχείς αδενοσίνης Α 1, ενδοθηλίνης-1, θρομβίνης, βομβεσίνης, λυσοφωσφατιδικού οξέος (LPA), α-αδρενεργικοί, μουσκαρινικοί χολινεργικοί (mach), βραδυκινίνης, θρομβοξάνης Α 2 και ντοπαμινεργικοί υποδοχείς, έχει βρεθεί να ενεργοποιούν τις ΜΑPKs, και κατ επέκταση τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Το πώς οι GPCRs ενεργοποιούν τις ΜΑΡΚs εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο, καθώς και από το είδος της πρωτεΐνης G με την οποία συνδέονται.

9 ΚΑΦΑΛΑΙΟ Όλα τα μέχρι τώρα μοντέλα που περιγράφουν μονοπάτια που συνδέουν τους GPCRs υποδοχείς με τις ΜΑΡKs, προήλθαν από πειράματα, τα οποία συνήθως χρησιμοποιούν κυτταρικές σειρές (όπως τα COS-7, τα HEK-293 κύτταρα) στις οποίες συνεκφράζονται η MAPK με τον GPCR υποδοχέα που μας ενδιαφέρουν. Στη συνέχεια, επωάζοντας τα κύτταρα με διάφορους παράγοντες προσπαθούμε να αναγνωρίσουμε τα μόρια που ίσως εμπλέκονται στη βιοχημική οδό που ξεκινά από ένα GPCR υποδοχέα και καταλήγει στην MAP κινάση. Για παράδειγμα χρησιμοποιούνται: o Η τοξίνη του κοκίτη (PTX), η οποία εμποδίζει τη σύνδεση των Gα i αλλά όχι και των Gα q στον υποδοχέα, και μας επιτρέπει να αποφανθούμε για το είδος της Gα πρωτεΐνης που εμπλέκεται. Επίσης χρησιμοποιούνται ουσίες απομάκρυνσης των G βγ υπομονάδων για να αποφανθούμε αν οι G βγ υπομονάδες εμπλέκονται επίσης στην οδό αυτή. o Ειδικοί αναστολείς. Πχ αν παρουσία ενός αναστολέα της ΡΙ3-κινάσης, ο GPCR δεν καταφέρει να ενεργοποιήσει τη ΜΑΡΚ, τότε η PI3Κ συμμετέχει στο μονοπάτι. o Υπερέκφραση ή χρήση υπερενεργών μεταλλαγμένων μορίων. Αν παρουσία ενός υπερενεργού μεταλλάγματος της ΡΙ3-κινάσης, ο GPCR υπερ-ενεργοποιήσει τη ΜΑΡΚ, τότε η PI3Κ συμμετέχει στη βιοχημική οδό ενεργοποίησης της ΜΑΡΚ. o Υπερέκφραση ανενεργών μεταλλαγμένων μορίων. Αν παρουσία ενός ανενεργού μεταλλάγματος της ΡΙ3-κινάσης, ο GPCR δεν μπορεί να ενεργοποιήσει τη ΜΑΡΚ, τότε η PI3Κ συμμετέχει στη βιοχημική οδό ενεργοποίησης της ΜΑΡΚ. Με βάση λοιπόν τα πειραματικά δεδομένα έχουν προταθεί τουλάχιστο τρεις κύριοι οδοί μέσω των οποίων συνδέονται οι GPCRs με τις MAPKs. 1. Μέσω της trans-ενεργοποίησης των RTKs 2. Μέσω της ενεργοποίησης της ΡΚΑ 3. Μέσω της ενεργοποίησης της PKC Βεβαίως είμαστε ακόμη μακριά από την πλήρη αποκρυπτογράφηση όλων των οδών που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση των ΜΑPKs μέσα στα κύτταρα. Πόσο μάλλον που μέχρι σήμερα έχουν ανακαλυφθεί 12 διαφορετικές MAPKs, 7 MAPKKs και 14 MAPKKKs, πολλές από τις οποίες συνυπάρχουν στο ίδιο κύτταρο. Ο ρόλος των G πρωτεϊνών στην ενεργοποίηση των MAPKs Μετά την ενεργοποίηση του, ο GPCR συνδέεται και ενεργοποιεί την ετεροτριμερή G πρωτεΐνη, η οποία διαχωρίζεται σε Gα και Gβγ υπομονάδες. Οι ισομορφές των Gα υπομονάδων είναι πολλές: Gαs, Gαq, Gαi, Gα12. Kάθε μια δείχνει να ενεργοποιεί τις ΜΑΡΚ με διαφορετικό μηχανισμό. Gas Όταν αποχωριστεί από τις βγ υπομονάδες, η αs υπομονάδα αλληλεπιδρά και ενεργοποιεί την αδενυλική κυκλάση, η οποία με την σειρά της

10 380 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών παράγει μεγάλα ποσά cαμρ Το camp τότε δρα ως δεύτερο μήνυμα για να ενεργοποιήσει είτε μια ΡΚΑ, είτε έναν Ras-GEF (RAS-guanine nucleotide exchange factor), τον Epac (exchange protein directly activated by camp). Το καθένα από τα δυο αυτά συστατικά μπορεί στη συνέχεια να ενεργοποιήσει τη μικρή GΤΡάση Rap1, η οποία ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο ενεργοποιεί ή αναστέλλει το μονοπάτι ΜΑΡΚ/ERK. Για παράδειγμα, σε ενδοκρινή και νευρικά κύτταρα που εκφράζουν τη B-Raf, η Rap1 ενεργοποιεί την B-Raf, η οποία ενεργοποιεί το μονοπάτι ΕRK, ενώ σε κύτταρα, όπως οι ινοβλάστες, τα αστροκύτταρα και τα αιμοποιητικά, που εκφράζουν κυρίως ή μόνο Raf1, η Rap1 αναστέλλει τη Raf1, και κατά συνέπεια αναστέλλει το μονοπάτι ERK. Ενδοκρινή/νευρικά κύτταρα που περιέχουν Β-Raf Αστροκύτταρα που περιέχουν Raf-1 Εικόνα 11.8 Σε ενδοκρινή και νευρικά κύτταρα που εκφράζουν τη B-Raf, η Rap1 ενεργοποιεί την B- Raf, η οποία ενεργοποιεί το μονοπάτι ΕRK, ενώ σε κύτταρα, όπως οι ινοβλάστες και αιμοποιητικά, που εκφράζουν κυρίως ή μόνο Raf1, η Rap1 αναστέλλει τη Raf1, και κατά συνέπεια το μονοπάτι ERK. Από Stork P., Schmitt J., Crosstalk between camp and MAP kinase signaling in the regulation of cell proliferation, Trends in Cell Biology, 2002, 12, Επιπλέον, η ΡΚΑ μπορεί να αναστείλει τη δράση της Raf1 είτε έμμεσα: μέσω ενεργοποίησης της κινάσης Src, η οποία ενεργοποιώντας την GTPαση Rap1, αναστέλλει τη δράση της Raf1, και μέσω ενεργοποίησης της κινάσης Akt, η οποία φωσφορυλιώνοντας την Raf1 σε διάφορα κατάλοιπα Ser την απενεργοποιεί, είτε άμεσα φωσφορυλιώνοντάς την Raf1 σε διάφορα κατάλοιπα Ser, αναστέλλει τη δράση της.

11 ΚΑΦΑΛΑΙΟ Εικόνα 11.9 H ΡΚΑ μπορεί να ενεργοποιήσει μέσω της κινάσης Src, την GTPαση Rap1, η οποία αναστέλλει τη δράση της Raf1, ή να αναστείλει άμεσα τη δράση της Raf1 φωσφορυλιώνοντάς την σε διάφορα κατάλοιπα Ser. Επίσης, μπορεί να αναστείλει τη δράση της Raf1 ενεργοποιώντας την κινάση Akt. Από Stork P., Schmitt J., Crosstalk between camp and MAP kinase signaling in the regulation of cell proliferation, Trends in Cell Biology, 2002, 12, Gαi Αντίθετα με την αs, η αi υπομονάδα έχει ανασταλτικό αποτέλεσμα στην αδενυλική κυκλάση οδηγώντας σε μείωση του camp. Έχει δειχθεί ότι μια υπερ-ενεργή μετάλλαξη της αi (η ογκογόνα gip2) ενεργοποιεί το μονοπάτι ΜΑΡΚ σε πολλούς κυτταρικούς τύπους, και επίσης οι GPCRs που δρουν μέσω Gi πρωτεϊνών μπορούν να ενεργοποιήσουν τις ΜΑΡΚs. Είναι σχεδόν βέβαιο ότι οι Gi-coupled receptors ενεργοποιούν τις ΜΑΡΚs κυρίως μέσω των Gβγ υπομονάδων, οι οποίες προκαλούν την ενεργοποίηση της ΡΙ3-κινάσης, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί την κινάση Src, που φωσφορυλιώνει τον υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα EGF (EGFR). Έτσι, μέσω της transενεργοποίησης του EGFR ενεργοποιείται το μονοπάτι των ΜΑΡΚ. Κατά δεύτερο λόγο, και η αi υπομονάδα, μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με μια Rap-GAP, μπορεί να καταστείλει τη δράση της Rap1 (μικρή GTPαση), η οποία, όπως είδαμε ενεργοποιεί τη Β-Raf (μια ΜΑΡΚKK) ή αναστέλλει τη Raf-1 (μια ΜΑΡΚKK), ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο.

12 382 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών Gαq Οι Gαq υπομονάδες εμπλέκονται με πολλούς και διαφορετικούς τρόπους στην ενεργοποίηση των ΜΑΡKs. H Gαq ενεργοποιεί αρχικά τη μεμβρανική φωσφολιπάση C (PLC β ), η οποία διασπά την φωσφατιδυλ-διφωσφορική ινοσιτόλη (ΡΙΡ 2 ) σε: DAG (διακυλογλυκερόλη) και IP 3 (τριφωσφορική ινοσιτόλη). Η ΙΡ 3 προκαλεί την αύξηση του ενδοκυτταρικού Ca 2+, το οποίο: είτε ενεργοποιεί την CaM kinase II, η οποία αναστέλλει τη Ras-GAP (Ras-GTPaseactivating protein) οδηγώντας στην ενεργοποίηση της Ras και του μονοπατιού Raf/MEK/ERK. είτε προκαλεί τη μετακίνηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) στη μεμβράνη, όπου ενεργοποιείται από την DAG. Η PKC μπορεί άμεσα να ενεργοποιήσει τη Raf, μέσω ενός μηχανισμού ανεξάρτητου από τη Ras. Η ΡΚC μπορεί να ενεργοποιήσει την ΡΥΚ2 (μια πρωτεϊνική κινάση τυροσίνης, ΡΤΚ). Η ενεργοποίηση της ΡΥΚ2 οδηγεί στην trans-ενεργοποίηση ενός υποδοχέα κινάση τυροσίνης, ο οποίος ενεργοποιεί το μονοπάτι Grb-Sos-Ras Raf/MEK/ERK. Η ΡΚC μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει μια άλλη κινάση τυροσίνης, τη Src. Η ομή της Ras ενεργοποίηση της Src οδηγεί, μέσω της Shc, στην trans-ενεργοποίηση ενός RTK, ο οποίος ενεργοποιεί το μονοπάτι Grb-Sos-Ras Raf/MEK/ERK Η ΡΚC, σε ορισμένους κυτταρικούς τύπους, μπορεί να αναστείλει μια άλλη κινάση τυροσίνης, τη BTK (Bruton tyrosine kinase), της οποίας ο μηχανισμός δράσης είναι ανάλογος με τις προηγούμενες κινάσες τυροσίνης. Η αναστολή της ΒΤΚ οδηγεί, στην ελάττωση της δραστηριότητας της ERK κινάσης, ενώ σε άλλους κυτταρικούς τύπους ενεργοποιεί το μονοπάτι JNK. Έχει επίσης βρεθεί ότι η ΒΤΚ μπορεί να ενεργοποιηθεί απευθείας από την Gαq, ανεξάρτητα από την PLC. Ras Grb Shc Sos Raf GPCR aq PLCβ DAG PKC Ras Raf Ras-GAP MEK ERK Src PYK2 BTK IP 3 /Ca 2+ MEK ERK CAM

13 ΚΑΦΑΛΑΙΟ Gα 12 Μολονότι αυτή η υπομονάδα δεν έχει μελετηθεί τόσο εκτενώς όπως οι άλλες, έχει δειχθεί πρόσφατα ότι η α 12 προκαλεί τη διέγερση της ΒΤΚ και την αναστολή της Ras-GAP. Η α 12 αλληλεπιδρά με τις δυο αυτές πρωτεΐνες συνδεόμενη στην περιοχή ΡΗ (pleckstrin homology) που εμφανίζουν και οι δυο. Η περιοχή ΡΗ, η οποία αποτελείται από 100 περίπου αμινοξέα, μπορεί να συνδεθεί με φωσφολιπίδια της ινοσιτόλης, προκαλώντας τη σύνδεση της πρωτεΐνης στη μεμβράνη, και επιπλέον επιτρέπει τη φυσική αλληλεπίδραση πρωτεΐνηςπρωτεΐνης. ΒΤΚ α 12 ΡΗ Pro-Pro-Pro SH3 SH2 Kinase p120 Ras-GAP α 12 SH2 SH3 SH2 ΡΗ Ras-GAP domain Εικόνα Δομικές περιοχές της κινάσης ΒΤΚ και του p120 Ras-GAP. Φαίνεται ότι αλληλεπιδρούν με την Gα 12 μέσω των ΡΗ περιοχών τους. Όπως είδαμε, η ΒΤΚ μπορεί να ενεργοποιήσει το μονοπάτι των MAPKs μέσω της trans-ενεργοποίησης των RΤΚ, οι οποίοι επιστρατεύουν το Grb-Sοs-Ras μονοπάτι. Η αλληλεπίδραση της α 12 με τη Ras-GAP ενεργοποιεί τη Ras-GAP, προκαλώντας την απενεργοποίηση της Ras με αποτέλεσμα τη μείωση της δραστικότητας της κινάσης ERK. Επίσης, η Gα 12 μπορεί να ενεργοποιήσει το μονοπάτι των ΜΑΡΚ μέσω της ενεργοποίησης των Rho. Οι α 12 ενεργοποιούν τις Rho, είτε μέσω της απευθείας διέγερσης των Rho-GEF, είτε μέσω των PTKs, οι οποίοι διεγείρουν στη συνέχεια τις Rho-GEF. Gβγ Οι Gβγ μπορούν να ενεργοποιήσουν τις MAPKs μέσω πολλών μηχανισμών που εξαρτώνται από τους κυτταρικούς τύπους και τους GPCRs, οι οποίοι εμπλέκονται. Το μόριοκλειδί στη δράση των βγ είναι η ΡΙ3-Κ. Ενεργοποίηση της ΡΙ3-Κ από τις βγ οδηγεί σε ενεργοποίηση: Κινασών τυροσίνης (πχ. Src), οι οποίες trans-ενεργοποιούν τους RTKs. Οι RTKs στη συνέχεια μέσω του μονοπατιού Grb-Sos-Ras ενεργοποιούν τις ΜΑΡΚs. Του Vav (ένας Rac-GEF), ο οποίος ενεργοποιεί τη μικρή GTPάση Rac. Στη συνέχεια, η Rac ενεργοποιεί το μονοπάτι JNK. Του Ras-GEF (Ras-guanine-specific nucleotide-exchange factor), ο οποίος οδηγεί σε ενεργοποίηση της Ras και κατ επέκταση των MAPKs.

14 384 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών Εικόνα Συνολική εικόνα των διαφόρων μονοπατιών που οδηγούν στην ενεργοποίηση των ΜΑΡ Κινασών, και συγκεκριμένα των καλύτερα μελετημένων Raf/MEK/ERK. Τα μονοπάτια ενεργοποίησης των ΜΑΡΚ ξεκινούν από: 1. RTK, ο οποίος μέσω των Shc/Sos/Grb2 ενεργοποιεί τη Ras, η οποία με τη σειρά της οδηγεί στην ενεργοποίηση της Raf/ΜΕΚ/ERK. 2. GPCR, ο οποίος μπορεί μέσω της Gαs /camp/pka ή EpaC να ενεργοποιήσει τη Rap, η οποία ενεργοποιεί τη ΒRaf και αναστέλλει τη Raf-1 μέσω της Gaq /PLCβ /PKC να ενεργοποιήσει τη Raf-1, μέσω της Gaq /PLCβ /ΡΥΚ2 να tras-ενεργοποιήσει έναν RTK μέσω της Gβγ / ΡΙ3 Κινάσης / Src να tras-ενεργοποιήσει έναν RTK μέσω της β-αρρεστίνης / Src να tras-ενεργοποιήσει έναν RTK.. Από Marinissen M., Gutkind S., G-protein coupled receptors and signaling networks: emerging paradigms, Trends in Pharmacol. Sci., 2001, 22, Ενεργοποίηση των MAPKs από GPCRs, μέσω μηχανισμών ανεξάρτητων από τις G- πρωτεΐνες Πρόσφατα δείχθηκε ότι οι GPCRs μπορούν να ενεργοποιήσουν το μονοπάτι των MAPKs, με μηχανισμούς ανεξάρτητους από τις G πρωτεΐνες. 1. Ο ρόλος της μεταλλοπρωτεάσης στην trans-ενεργοποίηση των RTKs από GPCRs Ένας νέος μηχανισμός για την ενεργοποίηση των RTKs από τους GPCRs προϋποθέτει την ενεργοποίηση μιας μεταλλοπρωτεάσης. Αυτή η μεταλλοπρωτεάση κόβει το πρόδρομο μόριο του αυξητικού παράγοντα, proheparin-binding EGF (pro-hb-egf), και προκαλεί την απελευθέρωση του ΗΒ-ΕGF. Στη συνέχεια, ο ΗΒ-EGF ενεργοποιεί τον υποδοχέα κινάσητυροσίνης ΕGFR, o οποίος ενεργοποιεί τις MAPKs.

15 ΚΑΦΑΛΑΙΟ HB-EGF Pro-HB-EGF Shc 2. Ο ρόλος της β-αρεστίνης στην ενεργοποίηση των MAPKs Οι GPCRs αφού ενεργοποιηθούν από έναν αγωνιστή, στη συνέχεια ενδοκυτταρώνονται. Αυτή η διαδικασία προϋποθέτει φωσφορυλίωση του υποδοχέα από GPCR-κινάσες (GRKs) και σύνδεση στο ενδοκυτταρικό του τμήμα, πρωτεϊνών, όπως η β-αρρεστίνη, η AP2 (adaptor protein-2) κλπ. Η σύνδεση της β-αρρεστίνης στον υποδοχέα σταματά την ενεργοποίηση της G-πρωτεΐνης και οδηγεί στην ενδοκυττάρωση του υποδοχέα με τη βοήθεια κυστιδίων καλυμμένων με κλαθρίνη. Εικόνα (α) Μετά τη σύνδεση του αγωνιστή, ο GPCR συνδέεται με την G πρωτεΐνη και μεταφέρει το μήνυμα. (β) Στη συνέχεια φωσφορυλιώνεται από τις GRKs, γεγονός που οδηγεί στη σύνδεση της β-αρρεστίνης και στην απευαισθητοποίηση του GPCR. (γ) Η σύνδεση της β-αρρεστίνης οδηγεί στην εσωτερίκευση του GPCR μέσα σε κυστίδια κλαθρίνης. Από Lefkowitz R., Whalen E., β- arrestins: traffic cops of cell signaling, Current Opin. Cell Biol. 2004, 16,

16 386 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών Εκτός από τον κλασικό όμως ρόλο, στον τερματισμό του μηνύματος των GPCRs, πρόσφατες έρευνες αποδεικνύουν ότι οι β-αρρεστίνες δρουν και ως μεταγωγείς σήματος. Έκφραση μιας αρνητικής μετάλλαξης της β-αρρεστίνης στα COS-κύτταρα, αναστέλλει την ενεργοποίηση των ΜΑΡΚs που εξαρτάται από τον β-αδρενεργικό υποδοχέα. Ο ρόλος που έχει αποδοθεί στη β-αρρεστίνη είναι διπλός: 1. Η στρατολόγηση στη μεμβράνη της κινάσης τυροσίνης Src, η οποία εμπλέκεται σε διάφορα σηματοδοτικά γεγονότα, όπως: α) η φωσφορυλίωση της δυναμίνης, η οποία καθορίζει την ενδοκύττωση του υποδοχέα, β) η ενεργοποίηση του μονοπατιού Ras/ Raf- MEK-ERK1/2, που οδηγεί στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και γ) η εξωκύτωση των κοκκίων στα λευκοκύτταρα μετά από διέγερση της ιντερλευκίνης-8. Εικόνα Ο ρόλος της εξαρτώμενης από β-αρρεστίνη στρατολόγησης των Src κινασών της τυροσίνης στη σηματοδότηση των GPCRs. Τα σηματοδοτικά γεγονότα που σχετίζονται με τη στρατολόγηση αυτή είναι: 1) η φωσφορυλίωση της δυναμίνης που οδηγεί στην αποκοπή των κυστιδίων κλαθρίνης από τη μεμβράνη, 2) η Ras εξαρτώμενη ενεργοποίηση του μονοπατιού ERK1/2 και 3) η απελευθέρωση των κοκκίων από τα ουδετερόφιλα. Από M. Luttrell and J. Lefkowitz, The role of b-arrestins in the termination and transduction of G-protein-coupled receptor signals, Journal of Cell Science 115, , Η σύνδεση των β-αρρεστινών στους φωσφορυλιωμένους GPCRs, βοηθάει επίσης στη συναρμολόγηση του συμπλέγματος των ΜΑΡ κινασών, χρησιμοποιώντας τη β-αρρεστίνη ως πρωτεΐνη σκαλωσιάς. Το σύμπλεγμα GPCR / β-αρρεστίνη / Raf-MEK-ERK εντοπίζεται σε ενδοσωμικά κυστίδια και ο σχηματισμός του εμποδίζει τη μεταφορά των ενεργοποιημένων ΕRK στον πυρήνα. Η ενεργοποίηση της ERK1/2 από τη σκαλωσιά β-αρρεστίνης πιθανόν να ευνοεί τη φωσφορυλίωση των κυτταροπλασματικών υποστρωμάτων της ΕRK1/2. Εναλλακτικά, η ενεργοποίηση της ERK από τη β-αρρεστίνη μπορεί να οδηγήσει στην

17 ΚΑΦΑΛΑΙΟ ενεργοποίηση κάποιων άλλων κινασών, οι οποίες κατά τη μεταφορά τους στον πυρήνα φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τους πυρηνικούς μεταγραφικούς παράγοντες που ενεργοποιούν τη σύνθεση DNA και την κυτταροδιαίρεση. Εικόνα Ο ρόλος της β-αρρεστίνης στη στοχοθέτηση των ΜΑΡ κινασών. Η συνδεδεμένη με τον ενεργοποιημένο GPCR υποδοχέα, β-αρρεστίνη, λειτουργεί ως σκαλωσιά που διευκολύνει τη σύνδεση των ΜΑΡ κινασών σε ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο (GPCR/β-αρρεστίνη/Raf-MEK- ERK) και την ενεργοποίησή τους. Σε αυτήν την περίπτωση, η ERK δεν εισέρχεται στον πυρήνα, αλλά ενεργοποιεί άλλες κινάσες (οι οποίες πιθανόν εισέρχονται στον πυρήνα) ή πρωτεϊνικά υποστρώματα. Από M. Luttrell and J. Lefkowitz, The role of β-arrestins in the termination and transduction of G-protein-coupled receptor signals, Journal of Cell Science 115, , Συνεπώς, οι πρωτεΐνες σκαλωσιάς εκτός του γεγονότος ότι ενισχύουν τη σηματοδότηση, αυξάνοντας την τοπική συγκέντρωση των κινασών-στόχων του σηματοδοτικού μονοπατιού, ρυθμίζουν και την υποκυτταρική τοποθέτηση του συμπλέγματος των ΜΑΡΚ. Το μονοπάτι Raf-MEK-ERK, μέσω της πρωτεΐνης-σκαλωσιάς KSR είδαμε ότι εντοπίζεται στην πλασματική μεμβράνη, ενώ μέσω της β-αρρεστίνης εντοπίζεται στα πρώιμα ενδοσώματα. Μια άλλη πρωτεΐνη-σκαλωσιάς, η ΜΡ1 (MEK partner 1), μέσω αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη προσαρμογέα p14, συνδέεται με την ΜΕΚ και την ERK (αλλά όχι με την Raf) και τις μεταφέρει στα όψιμα ενδοσώματα. Η τοποθέτηση των ΜΑΡΚ στα ενδοσώματα, μπορεί να είναι μια εναλλακτική ρύθμιση των στόχων των ΜΑΡΚ. Εικόνα Διαφορετικές πρωτεΐνες σκαλωσιάς τοποθετούν τα στοιχεία του σηματοδοτικού συμπλέγματος των ΜΑΡΚ στην πλασματική μεμβράνη (KSR), στα πρώιμα ενδοσώματα (β-αρρεστίνη) ή στα όψιμα ενδοσώματα (ΜΡ1). Από Anderson D., Role of lipids in the MAPK signalling pathway, Progress in Lipid Res. 2006, 45,

18 388 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών 3. Μετάδοση του μηνύματος από την ERK 1. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ERK ΣΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΠΡΩΙΜΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ. Η ERK είμαι η τελευταία κινάση στο μονοπάτι των ΜΑΡΚ. Η φωσφορυλίωσή της, προωθεί τη μετατόπισή της στον πυρήνα, όπου ενεργοποιεί τη μεταγραφή γονιδίων πρώιμης απόκρισης (early response genes). Όταν η αρχική διέγερση προέρχεται από τον EGF ή τον PDGF, τα γονίδια πρώιμης απόκρισης ενεργοποιούνται σε μια ώρα από τη διέγερση των υποδοχέων και η ενεργοποίησή τους είναι παροδική. Γονίδια πρώιμης απόκρισης που ενεργοποιούνται είναι τα γονίδια των μεταγραγικών παραγόντων c-fos, c-myc και c-jun, οι οποίοι καταλαμβάνουν μια κεντρική θέση στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων. Η περιοχή του προαγωγέα του c-fos, περιλαμβάνει ένα SRE (serum response element), όπου συνδέονται οι μεταγραφικοί παράγοντες p62 TCF και p62 SRF για να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφή του γονιδίου. Ο ERK φωσφορυλιώνει τον p62 TCF και ενεργοποιεί τη σύνδεση του p62 TCF με τον p62 SRF και την περιοχή SRE, προωθώντας τη μεταγραφή του γονιδίου c-fos. Στη συνέχεια, οι μεταγραφικοί παράγοντες c-fos και c-jun, συνδέονται μεταξύ τους δημιουργώντας ένα σύμπλοκο διεγερτικών πρωτεϊνών (ΑΡ-1, activator protein complex), το οποίο προωθεί την έκφραση άλλων γονιδίων. Ενεργοποίηση της μεταγραφής από την ERK μεταγραφικοί παράγοντες γονίδια πρώιμης απόκρισης (σε 1ώρα) Εικόνα Ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων πρώιμης απόκρισης (c-fos) από την ΕRK. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα του EGF οδηγεί στην ενεργοποίηση του μονοπατιού των ΜΑΡΚ μέσω της μικρής GTPάσης Ras. Η τελευταία ΜΑΡ κινάση (ERK) εισέρχεται στον πυρήνα, όπου φωσφορυλιώνει το μεταγραφικό παράγοντα p62 TCF. O p62 TCF ενεργοποιείται, συνδέεται με τον p62 SRF, και το σύμπλοκό τους συνδέεται στον προαγωγέα του γονιδίου c-fos, επάγοντας τη μεταγραφή του. Από Gomberts B., Kramer I., Tatham P., Signal Transduction, Elsevier, 2002.

19 ΚΑΦΑΛΑΙΟ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ERK ΣΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΟΣΥΝΘΕΣΗΣ. Τα σήματα που ξεκινούν από τους αυξητικούς παράγοντες απαιτούν έναν αυξημένο ρυθμό πρωτεϊνοσύνθεσης και μια επιλεκτική μετάφραση ειδικών mrna. Η ERK συμμετέχει σε αυτή τη διαδικασία ενεργοποιώντας την έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης. Για το άνοιγμα της φουρκέτας στο 5 άκρο του mrna, ώστε αυτό να μπορέσει να προσδεθεί στη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα 40S, απαιτείται η πρόσδεση στο κάλυμμα του mrna, ενός παράγοντα έναρξης, του eif-4e. Όταν ο eif-4e συνδεθεί στο σύμπλοκο έναρξης που βρίσκεται ήδη συνδεδεμένο στο κάλυμμα του mrna και αποτελείται από τους παράγοντες eif-4g, eif-4a και eif-4βη, η φουρκέτα ανοίγει και το mrna συνδέεται στην 40S ριβοσωμική υπομονάδα. Η ERK ενεργοποιεί την πρόσδεση του eif-4e, μέσω της ενεργοποίησης της κινάσης, της MNK-1 (MAP kinase integrating kinase-1), η οποία όταν φωσφορυλιωθεί από την ERK, φωσφορυλιώνει τον eif-4e, επιτρέποντας την πρόσδεσή του στα υπόλοιπα συστατικά του συμπλόκου έναρξης mrna. Εικόνα Ενεργοποίηση της πρωτεϊνοσύνθεσης από την ΕRK. Η ERK προκαλεί τη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της κινάσης ΜΝΚ-1, η οποία με τη σειρά της φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί τον παράγοντα έναρξης eif-4e. Αυτός αλλάζει διαμόρφωση και ενεργοποιεί το σύμπλοκο έναρξης (eif-4g, eif-4a, eif-4b) στην πολυ-α ουρά του mrna, το οποίο στη συνέχεια ανοίγει την έλικα αναδίπλωσης επιτρέποντας την πρόσδεση του mrna στη ριβοσωμική 40S υπομονάδα. Από Gomberts B., Kramer I., Tatham P., Signal Transduction, Elsevier, Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ERK ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ. Η ERK μπορεί να ρυθμίσει την κυτταρική μετανάστευση, με τη μεσολάβηση της παξιλλίνης, μιας πολυδεσμευτικής πρωτεΐνης, η οποία βρίσκεται στα σημεία εστιακής προσκόλλησης. Η παξιλλίνη είναι μόνιμα συνδεδεμένη με την ΜΕΚ, και σε απάντηση της σύνδεσης του αυξητικού παράγοντα των ηπατακυττάρων HGF (hepatocyte growth factor) στον υποδοχέα του c-met στατολογείται και συνδέεται η Raf-1. Η σύνδεση της ERK στην παξιλλίνη απαιτεί τη φωσφορυλίωση της

20 390 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών Τyr118 της παξιλλίνης από την Src. Όταν η ERK συνδεθεί στην παξιλλίνη ενεργοποιείται και την φωσφορυλιώνει στην Ser83, προωθώντας τη σύνδεση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης FAK (focal adhesion kinase). Η FAK έχει ένα διπλό ρόλο: αφενός ενεργοποιεί την κινάση ΡΙ3-Κ και μέσω αυτής την GTPάση της Rho οικογένειας, Rac, η οποία προκαλεί τη δημιουργία λαμελλιποδίων, και αφετέρου η FAK καταστρέφει τα σημεία εστιακής προσκόλλησης, οδηγώντας στην αποκόλληση του κυττάρου από το υπόστρωμά του επιτρέποντας τη μετανάστευσή του. Εικόνα Η παξιλλίνη συνδέει το μονοπάτι της ERK και της FAK. Η παξιλλίνη είναι ένα εσωτερικό συστατικό των σημείων εστιακής προσκόλλησης. Είναι μόνιμα συνδεδεμένη με την ΜΕΚ, και μετά τη σύνδεση του HGF στον υποδοχέα c-met και τη φωσφορυλίωσή της από τη Src συνδέει την Raf και την ERK. Σαν αποτέλεσμα, δημιουργούνται λαμελλιπόδια και καταστρέφονται τα σημεία εστιακής προσκόλλησης επιτρέποντας τη μετανάστευση του κυττάρου. Από Kolch W., Coordinating ERK/MAPK signaling through scaffolds and inhibitors, Nature Reviews, Mol. Cell Biol., 2005, 6, ΤΕΡΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΜΗΝΥΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ERK. Ένα από τα γονίδια, τα οποία ενεργοποιεί η ERK, είναι και το γονίδιο της φωσφατάσης ΜΚΡ-1, η οποία αποφωσφορυλιώνει την ERK και σταματάει τη δράση της. Είναι ένας μηχανισμός αρνητικής ανατροφοδότησης. ΜΚΡ-1 (ΜΑΡ kinase phosphatase-1), μια φωσφατάση αρνητικός ρυθμιστής των ΜΑΡ κινασών Εικόνα Η δράση της ERK σταματάει, μέσω ενός μηχανισμού αρνητικής ανατροφοδότησης, ενεργοποιώντας τη μεταγραφή του γονιδίου της φωσφατάσης MKP-1, η οποία αποφωσφορυλιώνει και απενεργοποιεί την ERK.. Από Gomberts B., Kramer I., Tatham P., Signal Transduction, Elsevier, 2002.

21 ΚΑΦΑΛΑΙΟ Το σηματοδοτικό μονοπάτι της JNK Η ενεργοποίηση του μονοπατιού της JNK (c-jun NH 2 terminal kinase, κινάση του ΝΗ 2 - τελικού άκρου του c-jun) προκαλείται από σήματα stress, όπως ακτινοβολία, προφλεγμονώδεις κυτοκίνες (όπως η ιντερλευκίνη-1 και ο παράγοντας νέκρωσης όγκων TNFtumor necrosis factor), περιβαλλοντικά stress (θερμοκρασία, ωσμωτικό σοκ, ph), ενδοκυτταρικό Ca 2+, γι αυτό και συχνά ονομάζεται και μονοπάτι SAPK (stress-activated protein kinase). Το stress ενεργοποιεί μια ΜΑΡΚΚΚ [ΜΕΚΚ1-5, ΤΑΚ-1 (TGF-β activating kinase), ASK-1 (apoptosis signal-regulatory kinase)], η οποία φωσφορυλιώνει μια ΜΑΡΚΚ (ΜΕΚ4,7), η οποία με τη σειρά της φωσφορυλιώνει την JNK1-3 (Εικ ). Μετά από διπλή φωσφορυλίωση, η JNK ενεργοποιείται και φωσφορυλιώνει το μεταγραφικό παράγοντα c-jun (πυρηνική φωσφοπρωτεϊνη). Ο c-jun μαζί με τον c-fos δημιουργούν το σύμπλοκο των μεταγραφικών παραγόντων Ap-1 (Activator protein 1). Το Ap-1 είναι παρών στα περισσότερα κύτταρα και σχετίζεται με τη μιτογένεση, τη διαφοροποίηση, το μετασχηματισμό, την απόπτωση και με φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Εκτός από τον c-jun, έχουν βρεθεί και άλλοι στόχοι της JNK, όλοι μεταγραφικοί παράγοντες (ΑΤF2, p53 κλπ). Η κύρια συνέπεια της παρατεταμένης σηματοδότησης της JNK είναι η επαγωγή της απόπτωσης (βλπ Κεφάλαιο 16, Απόπτωση), ενώ η οξεία και έντονη σηματοδότηση της JNK φαίνεται να έχει προστατευτικό αποτέλεσμα. Stress/προφλεγμονώδεις κυτοκίνες (TNFα) ΜΕΚΚ1-5, ΤΑΚ1, ΑSK1 (ΜΑΡΚΚΚ) ΜΕΚ4,7 (ΜΑΡΚΚ) JNK1-3 (ΜΑΡΚ) c-jun c-fos -PO 4 -PO 4 AP-1 TRE: TPA Responsive Element (DNA binding element) Εικόνα Το stress και προφλεγμονώδεις κυτοκίνες (TNFα) ενεργοποιούν το μονοπάτι JNK. Η JNK στη συνέχεια φωσφορυλιώνοντας το μεταγραφικό παράγοντα c-jun επάγει τη δημιουργία του συμπλόκου ΑΡ-1. Το ΑΡ-1 (c-jun + c-fos) συνδέεται σε ειδικές θέσεις σύνδεσης στο DNA (TRE) ενεργοποιώντας τη μεταγραφή γονιδίων, που οδηγούν σε κυτταρικό θάνατο, επιβίωση ή διαφοροποίηση. Ενεργοποίηση του μονοπατιού ASK1/JNK από στρεσογόνους παράγοντες Βασικό ρόλο στην ενεργοποίηση της JNK από διάφορα είδη εξωκυτταρικού ή ενδοκυτταρικού στρες παίζει η κινάση ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase 1). Η ASK1 είναι μια ΜΑΡΚΚΚ κινάση Ser/Thre, η οποία ενεργοποιείται μετά από οξειδωτικό στρες, όπως αυτό που προκαλείται από αύξηση του Η 2 Ο 2, μετά από ενεργοποίηση των υποδοχέων θανάτου αλλά και υποδοχέων GPCRs, από συσσώρευση στο ενδοπλασματικό δίκτυο μη σωστά διαμορφωμένων πρωτεϊνών και μετά από αύξηση Ca 2+. Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις,

22 392 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών η ASK1 ενεργοποιεί τις ΜΚΚ4/ΜΚΚ7 και ΜΚΚ3/ΜΚΚ6, οι οποίες φωσφορυλιώνουν την JNK οδηγώντας το κύτταρο σε απόπτωση. Η ΑSK1 σε κατάσταση ηρεμίας βρίσκεται σαν ομοδιμερές, συνδεδεμένο μέσω της C- τελικής coiled-coil περιοχής της. Συχνά σε ειδικές θέσεις της, συνδέονται διάφορες ανασταλτικές πρωτεΐνες, οι οποίες αναστέλλουν τη δράση της, πχ οι πρωτεΐνες και η Τrx, μια πρωτεΐνη που ρυθμίζεται από την οξειδοαναγωγή. Η ενεργοποίηση της ASK1, μετά την απομάκρυνση των ανασταλτικών πρωτεϊνών, οδηγεί στην αυτοφωσφορυλίωση της σε ένα κατάλοιπο Thr (Thr845 στο ποντίκι, Thr838 στον άνθρωπο) που βρίσκεται στην περιοχή κινάσης. ΑSK1 Εικόνα Σχηματική αναπαράσταση της πρωτεΐνης ASK1. Από Matsukawa J., Takeda K., Ichijo H., The ASK1-MAP kinase cascades in mammalian stress response, J. Biochem., 2004, 136, ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ ΚΑΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ASK1. Η υπέρμετρη παραγωγή ROS (reactive oxygen species) ενεργών ριζών οξυγόνου (όπως το Η 2 Ο 2 ) οδηγεί σε καταστροφή των κυτταρικών συστατικών, απώλεια της κυτταρικής λειτουργίας και τελικά σε απόπτωση, που είναι υπεύθυνη για την καρδιακή ανεπάρκεια και το θάνατο των νευρώνων. Η παραγωγή Η 2 Ο 2 οξειδώνει την Trx, η οποία απομακρύνεται από την ASK1 επιτρέποντας την αυτοφωσφορυλίωσή της. Διάφοροι παράγοντες που οδηγούν σε παραγωγή ROS βρέθηκαν να ενεργοποιούν το μονοπάτι ASK1/JNK: η προφλεγμονώδης κυτοκίνη TNFα (tumor necrosis factor) μέσω της ενεργοποίησης του παράγοντα TRAF2 (TNF receptor associated factor 2) και η αγγειοτενσίνη ΙΙ μέσω του υποδοχέα GPCR της στην καρδιά. Μέσω αυτού του μηχανισμού, ο TNFα προκαλεί απόπτωση πολλών κυτταρικών τύπων, ενώ η αγγειοτενσίνη ΙΙ οδηγεί σε καρδιακή δυσλειτουργία. ΣΤΡΕΣ ΤΟΥ ΕΔ ΚΑΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ASK1. Το μονοπάτι ASK1/JNK ενεργοποιείται επίσης από τη συσσώρευση στο ενδοπλασματικό δίκτυο πρωτεϊνών με λανθασμένη διαμόρφωση. Η συσσώρευση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση πρωτεϊνικών κινασών Ser/Thr που βρίσκονται στη μεμβράνη του ΕΔ, όπως η IRE1, η οποία αυτοφωσφορυλιώνεται και ενεργοποιεί την ASK1, μέσω του παράγοντα TRAF2. Η απόπτωση που προκαλείται από το στρες του ΕΔ συνδέεται με πολλές παθολογικές καταστάσεις, όπως η νευροεκφυλιστική χορεία του Huntington κατά την οποία, η πρωτεΐνη huntingtin εμφανίζει ένα πολυq άκρο. Η λανθασμένη διαμόρφωση της πρωτεΐνης οδηγεί στην ενεργοποίηση της ASK1/JNK και συνεπώς στην απόπτωση του νευρώνα. ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ Ca 2+ ΚΑΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ASK1. Το Ca 2+ παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση νευρικών λειτουργιών και η Ca 2+ -εξαρτώμενη ενεργοποίηση της ΕRK επηρεάζει τη συναπτική πλαστικότητα. Πρόσφατα βρέθηκε ότι η καλμοδουλινο-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση IΙ (CaMKIΙ) ενεργοποιεί το μονοπάτι ASK1/p38, με σημαντική δράση στην ανάπτυξη των νευρώνων. ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΘΑΝΑΤΟΥ ΚΑΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ASK1. Το καλύτερα χαρακτηρισμένο μέλος της οικογένειας των υποδοχέων θανάτου είναι ο Fas, ο οποίος ενεργοποιείται από τον

23 ΚΑΦΑΛΑΙΟ FasL και οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση μέσω δυο μηχανισμών: μέσω της πρωτεΐνης FADD και της κασπάσης 8, και μέσω της πρωτεΐνης Daxx, η οποία συνδέεται στο Ν-τελικό άκρο της ASK1 και οδηγεί στην ενεργοποίηση της JNK (βλπ Κεφάλαιο 16, Απόπτωση). αγγειοτενσίνη TNF receptor associated factor2 Apoptosis signal regulating kinase 1 Εικόνα Ρυθμιστικοί μηχανισμοί της ASK1 σε απάντηση σε διάφορα είδη στρες. Η ASK1 σε κατάσταση ηρεμίας βρίσκεται ως ομοδιμερές συνδεδεμένη με την πρωτεΐνη Trx, η οποία ρυθμίζεται από την οξειδοαναγωγή. Η αύξηση των ROS που προκαλείται από τον ΤΝFα ή από την ενεργοποίηση GPCR, οξειδώνει και απομακρύνει την Trx, επιτρέποντας την ενεργοποίηση της ASK1 μέσω αυτοφωσφορυλίωσης. Η ASK1 μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί από την αύξηση του Ca 2+, μέσω της κινάσης CaMKII, και από το στρες του ΕΔ που δημιουργείται λόγω συσσώρευσης μη σωστά διαμορφωμένων πρωτεϊνών. Σε κάθε περίπτωση η ενεργοποίηση της ASK1 οδηγεί σε ενεργοποίηση της JNK και στην απόπτωση του κυττάρου. Από Matsukawa J., Takeda K., Ichijo H., The ASK1-MAP kinase cascades in mammalian stress response, J. Biochem., 2004, 136, ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ GPCR ΚΑΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ JNK. Το μονοπάτι της JNK μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί και από τους GPCRs. Είδαμε ότι η αγγειοτενσίνη ενεργοποιώντας τους υποδοχείς της που συνδέονται με μια Gα 13 μπορεί να ενεργοποιήσει την JNK, ενεργοποιώντας μια ΜΑΡΚΚΚ, την ASK1, η οποία φωσφορυλιώνει την ΜΚΚ4/7, την κινάση που ενεργοποιεί την JNK. Επίσης, οι GPCRs που συνδέονται με την Gα q ή Gα 13 μπορούν να ενεργοποιήσουν το μονοπάτι της JNK μέσω ενός Rac/Cdc42 εξαρτώμενου μηχανισμού (Εικ ).

24 394 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών Εικόνα Οι GPCRs μπορούν επίσης να ενεργοποιήσουν το μονοπάτι της JNK. Οι GPCRs που συνδέονται με την Gα q ή Gα 13 ενεργοποιούν το μονοπάτι της JNK μέσω ενός Rac/Cdc42 εξαρτώμενου μηχανισμού. Επίσης η Gα 13 μπορεί να ενεργοποιήσει την JNK, ενεργοποιώντας μια ΜΑΡΚΚΚ, την ASK1, η οποία φωσφορυλιώνει την ΜΚΚ4/7, την κινάση που ενεργοποιεί την JNK. 5. Η εξειδίκευση στη σηματοδότηση των ΜΑΡΚ στο ζυμομήκυτα S. cereviciae Ένας περιορισμένος αριθμός μονοπατιών σηματοδότησης δημιουργεί μια τεράστια ποικιλία αποκρίσεων, ιδιαίτερη για κάθε κυτταρικό τύπο. Αλλά ακόμη και στον ίδιο κυτταρικό τύπο, ένα μονοπάτι μπορεί να οδηγήσει σε περισσότερες διαφορετικές αποκρίσεις ανάλογα με το εξωκυτταρικό μήνυμα. Η εξειδίκευση στη σηματοδότηση μπορεί να προέλθει από ποικίλες ιδιότητες ενός συγκεκριμένου μονοπατιού, συμπεριλαμβάνοντας τη δημιουργία πολυπρωτεϊνικών συμπλεγμάτων με τη βοήθεια πρωτεϊνών σκαλωσιάς, τη διάρκεια και την ένταση του σήματος, την τοποθεσία των διαφορετικών συστατικών, που συμμετέχουν στο μονοπάτι, και το κυτταρικό περιβάλλον. Οι καταρράκτες αντιδράσεων των ΜΑΡΚs (mitogen activated protein kinases) αποτελούν ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα στην εξειδίκευση του σήματος γιατί συχνά λειτουργούν ως ένα κοινό κανάλι μεταφοράς για μυριάδες εξωκυτταρικά ερεθίσματα. Στις ζύμες, 5 διαφορετικά μονοπάτια ΜΑΡΚs διαβιβάζουν σήματα φερομόνης που οδηγούν σε σύζευξη (mating), σήματα έλλειψης θρεπτικών που οδηγούν σε διεισδυτική ανάπτυξη (invasive growth), σήματα υψηλής oσμωμοριακότητας που οδηγούν σε σύνθεση οσμωλυτών, σήματα

25 ΚΑΦΑΛΑΙΟ υποτονικού σοκ που οδηγούν σε αναδιάρθρωση του κυτταρικού τοιχώματος, και σήματα έλλειψης αζώτου και άνθρακα που οδηγούν σε δημιουργία σπορίων. Εικόνα Πέντε διαφορετικά μονοπάτια ΜΑΡΚ κινασών επεξεργάζονται διαφορετικά σήματα οδηγώντας το καθένα σε διαφορετική απόκριση. 1. Οι φερομόνες ενεργοποιούν το μονοπάτι της Fus3 οδηγώντας σε σύζευξη των ζυμομυκήτων. 2. Έλλειψη θρεπτικών ενεργοποιεί το μονοπάτι Kss1, το οποίο οδηγεί σε νηματώδη ανάπτυξη. 3. Υψηλή οσμωμοριακότητα ενεργοποιεί το μονοπάτι Hog1, το οποίο οδηγεί σε σύνθεση οσμωλυτών. 4. Υποτονικό shock ενεργοποιεί το μονοπάτι Mpk1, το οποίο επάγει αναδιαμόρφωση του κυτταρικού τοιχώματος. 5. Έλλειψη C και N ενεργοποιεί το μονοπάτι Smk1, το οποίο επάγει τη δημιουργία σπορίων.

26 396 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών ΦΕΡΟΜΟΝΕΣ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΕΓΓΕΝΟΥΣ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΣΤΙΣ ΖΥΜΕΣ. Εκτός από την αγενή αναπαραγωγή με εκβλάστηση, οι σακχαρομύκητες Saccharomyces cerevisiae μπορούν να αναπαράγονται και εγγενώς. Υπάρχουν δύο τύποι απλοειδών κύτταρων, τα α κύτταρα και τα a κύτταρα. Τα δύο αυτά κύτταρα διαφέρουν ως προς το γεγονός ότι εκκρίνουν διαφορετικές φερομόνες (στεροειδή που βοηθούν στην επικοινωνία μεταξύ ατόμων διαφορετικού φύλου): τα α κύτταρα εκκρίνουν α φερομόνες, οι οποίες δεσμεύονται στους υποδοχείς των a κυττάρων, και τα a κύτταρα εκκρίνουν a φερομόνες που προσδένονται στους υποδοχείς των α κυττάρων. Η έκκριση αυτή των χημικών σημάτων οδηγεί στη σύζευξη δύο απλοειδών κυττάρων σε ένα διπλοειδές, μέσω ενός μηχανισμού, όπου κύριο ρόλο παίζει το μονοπάτι των ΜΑΡΚ (Ste11/Ste7/Fus3). Όταν οι φερομόνες προσδένονται σε έναν υποδοχέα GPCR απελευθερώνονται οι βγ υπομονάδες των G-πρωτεϊνών, οι οποίες με τη σειρά τους ενεργοποιούν την πρωτεΐνη σκαλωσιάς Ste5 και το αντίστοιχο μονοπάτι ΜΑΡΚ. Συγκεκριμένα, μια άνωθεν κινάση, η Ste20, ενεργοποιεί την Ste11 (MAPKKK), η οποία οδηγεί στη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της Ste7 (MAPKK), η οποία τελικά φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί δύο MAPKs την Fus3 και την Kss1. Όταν ενεργοποιηθούν οι Fus3 και Kss1 φωσφορυλιώνουν το μεταγραφικό παράγοντα Ste12, οδηγώντας στη μεταγραφή των γονιδίων που απαιτούνται για τη σύζευξη (Εικόνα 11.28). Ένας άλλος στόχος των ΜΑΡΚs είναι η Far1, μια πρωτεΐνη που είναι απαραίτητη για τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την πόλωση του κυττάρου της ζύμης προς το σύντροφο του για σύζευξη.

27 ΚΑΦΑΛΑΙΟ Εικόνα Το μονοπάτι απόκρισης στη φερομόνη (α ή a mating factor) του S. cerevisiae. Η φερομόνη προσδένεται στον GPCR και ενεργοποείται η G πρωτεΐνη. Οι υπομονάδες Gβγ ενεργοποιούν την Bem1, μια GAP πρωτεΐνη, που ενεργοποιεί τις μικρές μονομερείς G πρωτεΐνες (Cdc42 και Cdc24), οι οποίες ανήκουν στην οικογένεια Rho και είναι υπεύθυνες για τον έλεγχο της αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού ακτίνης και για την πόλωση, με αποτέλεσμα την αλλαγή του σχήματος του κυττάρου (morphogenesis) ώστε να πολωθεί και να είναι ικανό για σύζευξη. Στη συνέχεια, ενεργοποιείται ο καταρράκτης των ΜΑΡΚ (Ste11, Ste7, Fus3/Kss1), ο οποίος οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου με φωσφορυλίωση της Far1 πρωτεΐνης από την Fus3 και στην ενεργοποίηση ειδικών γονίδιων, που είναι υπεύθυνα για τη σύζευξη, με φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα Ste12 και από τις δύο ΜΑΡκινάσες.

28 398 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών παράγοντας a παράγοντας α υποδοχέας παράγοντα α υποδοχέας παράγοντα a Συγκόλληση ιακοπή του κυτταρικού κύκλου Μορφογένεση Κυτταρική σύντηξη Πυρηνική σύντηξη ιπλοειδές κύτταρο Με θρεπτικά Μιτωτική αύξηση Χωρίς θρεπτικά Μείωση ημιουργία σπορίων Εικόνα Κύκλος ζωής του Saccharomyces cerevisiae. Εκτός από την αγενή αναπαραγωγή με εκβλάστηση, οι ζύμες μπορούν να αναπαράγονται και εγγενώς. Υπάρχουν δύο τύποι των απλοειδών κύτταρων τα α κύτταρα και τα a κύτταρα. Τα δύο αυτά κύτταρα διαφέρουν ως προς το γεγονός ότι εκκρίνουν διαφορετικές φερομόνες: τα α κύτταρα εκκρίνουν α φερομόνες, οι οποίες δεσμεύονται στους υποδοχείς των a κυττάρων, και τα a κύτταρα εκκρίνουν a φερομόνες που προσδένονται στους υποδοχείς των α κυττάρων. Η έκκριση αυτή των χημικών σημάτων οδηγεί στην σύζευξη των απλοειδών κυττάρων σε ένα διπλοειδές. Υπό συνθήκες ασιτίας, όπως έλλειψη αζώτου, τα διπλοειδή κύτταρα διασπώνται σε τέσσερα απλοειδή.

29 ΚΑΦΑΛΑΙΟ Πίνακας 11.1 Συγκεντρωτικός πίνακας με όλα τις σημαντικότερες πρωτεΐνες που συμμετέχουν στα μονοπάτια των ΜΑΡΚs καθώς και τις πρωτεΐνες-αγκυροβόλιά τους, στα θηλαστικά και στις ζύμες. Από Garington T. and Johnson G., Organization and regulation of mitogen-activated protein kinase signaling pathways, Current Opinion in Cell Biology 1999, 11, Βιβλιογραφία Anderson D., Role of lipids in the MAPK signalling pathway, Progress in Lipid Res. 2006, 45, Breikreutz Ashton and Mike Tyers, MAPK signaling specificity: it takes two to tango, Trends in Cell Biology, 2002, 12, Garington T. and Johnson G., Organization and regulation of mitogen-activated protein kinase signaling pathways, Current Opinion in Cell Biology 1999, 11, Graeme M. Walker, Yeast, Physiology and Biotechnology, 2000.

30 400 Σηματοδοτική οδός των ΜΑΡ κινασών Jonak C., Okresz L., Borge L., Hirt H., Complexity, cross talk ant integration of MAP kinase signaling, Current Opinion in Plant Biology 2002, 5, Kolch W., Coordinating ERK/MAPK signaling though scaffolds and inhibitors, Nature Reviews, Mol. Cell Biol., 2005, 6, Kraus S., Naor Z., Seger R., Intracellular signaling pathways mediated by the GnRH receptor, Arch. Med. Res., 2001, 32, Lefkowitz R., Whalen E., β-arrestins: traffic cops of cell signaling, Current Opin. Cell Biol. 2004, 16, Lefkowitz R., Shenoy S., Transduction of Receptor Signals by β-arrestins, Science 2005, 308, Liebmann C., Regulation of MAP kinase by peptide receptors signaling pathway: Paradigms of multiplicity, Cellular Signalling, 2001, 13, Lowes V., Ip N., Wong Y., Integration of signals from receptor tyrosine kinases and G- protein-coupled receptors, Neurosignals, 2002, 11, Luttrell LM and Robert J. Lefkowitz, The role of β-arrestins in the termination and transduction of G-protein-coupled receptor signals, Journal of Cell Science 2002, 115, Matsukawa J., Takeda K., Ichijo H., The ASK1-MAP kinase cascades in mammalian stress response, J. Biochem., 2004, 136, Naor Z., Benard O., Seger R., Activation of MAPK cascades by G-protein-coupled receptors: the case of GnRH receptor, TEM, 2000, 11, Park HS, Huh SH, Seo JS, Choi EJ Hsp72 functions as a natural inhibitory protein of c-jun N-terminal kinase. EMBO J. 2001, 20: Putcha GV, Moulder KL, Golden JP Induction of BIM, a proapoptotic BH3-only BCL-2 family member, is critical for neuronal apoptosis. Neuron 2001, 29: Rincon M, Davis RJ, Flavell RA Signal transduction by MAP kinases in T lymphocytes. Oncogene 2001, 20, Shenoy S., Lefkowitz R., Multifaceted roles of β-arrestins in the regulation of sevenmembrane-spanning receptor trafficking and signaling, Biochem. J., 2003, 375, Stork P., Schmitt J., Crosstalk between camp and MAP kinase signaling in the regulation of cell proliferation, Trends in Cell Biology, 2002, 12, Tena G., Asai T., Chiu W, Sheen J., Plant mitogen-activated protein kinase cascades, Current Opinion in Plant Biology 2001, 4, Weston C.R., & Roger J Davis. The JNK signal transduction pathway. Current Opinion in Genetics & Development 2002, 12, Whitfield J, Neame SL, Paquet L,Ham J. Dominant negative c Jun promotes neuronal survival by reducing BIM expression and inhibiting mitohondial cytocrome c release. Neuron 2001, 29, Wulf GM, Ryo A, Wulf GG, Lee SW Pin1 is overexpressed in breast cancer and cooperates with Ras signaling in increasing the transcriptional activity of c-jun towards cyclin D1. EMBO J 2001, 20, Yamamoto T, Ogawa S, Hirai H, Nishida E. The evi-1 oncoprotein inhibits c-jun N-terminal kinase and prevents stress-induced cell death. EMBO J 2000, 19,