Μέρος 5 ο. Γονιδιακοί δείκτες

Transcript

1 Μέρος 5 ο Γονιδιακοί δείκτες R.C. Lewontin 1966 K.B. Mullis 1983

2 Εισαγωγή στη δασική γενετική Γονιδιακοί δείκτες Όπως είδαµε στα προηγούµενα κεφάλαια, η γενετική πληροφορία είναι οργανωµένη πάνω σε µια «µαθηµατική» βάση και ο τρόπος µετάβασής της από γενιά σε γενιά ακολουθεί συγκεκριµένους κανόνες. Οι κανόνες αυτοί ισχύουν για όλους τους φυλετικά αναπαραγόµενους οργανισµούς και συνδέουν τους γενότυπους των γονέων µε αυτούς των απογόνων. Για το λόγο αυτό, το γονίδιο θεωρείται σήµερα ως η µονάδα της κληρονοµικότητας. Το γονίδιο στην πράξη αναγνωρίζεται µέσα από πειράµατα, όπως για παράδειγµα η παρατήρηση των απογόνων ύστερα από ελεγχόµενες διασταυρώσεις. Στα πειράµατα αυτά όµως δεν είµαστε σε θέση να βλέπουµε το γενότυπο των γονέων και των απογόνων που εξετάζουµε, αλλά το φαινότυπό τους. Άρα, πέρα από τη γνώση των γενετικών κανόνων της κληρονοµικότητας χρειαζόµαστε και αυτήν του τρόπου κληρονόµησης ενός χαρακτηριστικού, τη σχέση δηλαδή που διέπει το γενότυπο µε το φαινότυπό του. Μόνον τότε µπορούµε να προχωρήσουµε σε γενετικές έρευνες. Τα πειράµατα αυτού του τύπου λέγονται «αναλύσεις κληρονοµικότητας» ή πιο απλά τεστ κληρονοµικότητας. Ο σκοπός της ανάλυσης κληρονοµικότητας είναι να καταλήξουµε από τον άµεσα παρατηρούµενο φαινότυπο στο γενότυπο που τον καθορίζει. Αυτό σηµαίνει, ότι πρέπει να χρησιµοποιήσουµε χαρακτηριστικά που είναι ανεξάρτητα της επίδρασης του περιβάλλοντος, δηλαδή επηρεάζονται απ ευθείας από το γενότυπο. Τέτοιο χαρακτηριστικό είναι π.χ. το χρώµα του µπιζελιού του Mendel, αφού αυτό καθορίζεται από το συγκεκριµένο γονίδιο µε τα δύο αλληλόµορφα, ανεξάρτητα από το περιβάλλον που φυτρώνουν τα φυτά. Άλλο παράδειγµα χαρακτηριστικού που επηρεάζεται µόνο από το γενότυπο είναι η οµάδα αίµατος στα θηλαστικά. Τα λεγόµενα «συνεχή» (ποσοτικά) χαρακτηριστικά, όπως το ύψος ή ο όγκος ενός δέντρου, είναι αποτέλεσµα της συνδυασµένης δράσης πολλών γονιδίων και του περιβάλλοντος και για το λόγο αυτό είναι ακατάλληλα για ανάλυση κληρονοµικότητας. Αν και τα χαρακτηριστικά αυτά είναι πολύ σηµαντικά για τη δασοπονία, δεν χρησιµοποιούνται από τους γενετιστές για τις αναλύσεις τους, επειδή δεν µπορούν να «γεφυρώσουν» τους παρατηρούµενους φαινότυπους µε τους γενότυπους. Οι γενετιστές προτιµούν τα «ασυνεχή» (ποιοτικά) χαρακτηριστικά, των οποίων οι παρατηρήσεις µπορούν να ταξινοµηθούν σε συγκεκριµένες οµάδες (π.χ. αυτά που ακολουθούν τη διωνυµική κατανοµή) και από αυτά µόνο τα περιβαλλοντικά σταθερά. Γενικά ισχύει ότι γνωρίσµατα που ελέγχονται από µικρό αριθµό γονιδίων εµφανίζουν διακριτές κατανοµές. Στο σηµείο αυτό είναι σκόπιµο να ξαναδούµε ορισµένες βασικές έννοιες της Γενετικής, υπό το πρίσµα των γνώσεων που αποκτήσαµε στα περασµένα µαθήµατα. Ο φαινότυπος ενός οργανισµού είναι η άµεσα παρατηρήσιµη έκφραση ενός χαρακτηριστικού του. Η παρατήρηση µπορεί να προέρχεται από τη φύση ή από έναν πειραµατικό κήπο (π.χ. το σχήµα ή το χρώµα των καρπών ενός φυτού). Φαινότυποι παρατηρούνται επίσης και στα εργαστήρια, όπως είναι οι ζώνες ενός gel ύστερα από ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ή τµηµάτων DNA. Στην περίπτωση της ανάλυσης πρωτεϊνών και στην περιγραφή των ισοενζύµων, οι φαινότυποι λέγονται ζυµογράµµατα. Ο γενότυπος είναι η γενετική πληροφορία που ελέγχει το φαινότυπο. Η γενετική πληροφορία είναι κατανεµηµένη σε συγκεκριµένους γονιδιακούς τόπους ή γονιδιακές θέσεις (gene loci). Τα χαρακτηριστικά που επιλέγονται για ανάλυση κληρονοµικότητας ελέγχονται συνήθως από έναν ή πολύ λίγες γενετικές θέσεις. Οι διαφορετικές µορφές που µπορεί να λάβει ένα γονίδιο λέγονται αλληλόµορφα. Οι διπλοειδείς οργανισµοί έχουν δύο αλληλόµορφα σε κάθε γονιδιακό τόπο. Το ένα προέρχεται από το θηλυκό γονέα και το άλλο από τον αρσενικό. Και τα δύο αλληλόµορφα µαζί σχηµατίζουν το γενότυπο του οργανισµού σε ένα γονιδιακό τόπο. Αν και τα δύο αλληλόµορφα είναι ίδια, τότε έχουµε έναν οµοζυγωτό οργανισµό για το συγκεκριµένο γονιδιακό τόπο. Αν τα αλληλόµορφα είναι διαφορετικά τότε µιλάµε για έναν ετεροζυγωτό οργανισµό. Σε περίπτωση που το ένα αλληλόµορφο είναι κυρίαρχο πάνω σε ένα άλλο, τότε δεν είναι δυνατή η αναγνώριση του γενότυπου στην ετεροζυγωτή µορφή και στην οµοζυγωτή µορφή του κυρίαρχου. Μόνο όταν εµφανίζεται ο υποτελής χαρακτήρας είµαστε σίγουροι για το γενότυπο, ο οποίος είναι οµοζυγωτός για το υποτελές αλληλόµορφο. Αν για παράδειγµα ένας άνθρωπος έχει οµάδα αίµατος Α ή Β δεν γνωρίζουµε αν πρόκειται για γενότυπο ΑΑ ή ΑΟ και ΒΒ ή ΒΟ. Αν όµως κάποιος έχει φαινότυπο Ο, τότε έχει σίγουρα γενότυπο ΟΟ. 56

3 Γονιδιακοί δείκτες Η πιο ιδανική περίπτωση για την παρατήρηση του γενότυπου µέσα από έναν φαινότυπο είναι αυτή της συγκυριαρχίας, όπου η ετεροζυγωτή µορφή είναι σύνθεση των δύο αλληλοµόρφων. Σε αυτήν την περίπτωση, όλοι οι φαινότυποι οδηγούν σε συγκεκριµένους γενότυπους. Έτσι για παράδειγµα, οι άνθρωποι µε οµάδα αίµατος ΑΒ είναι σίγουρα ετεροζυγωτοί για τα αλληλόµορφα Α και Β και έχουν γενότυπο ΑΒ. Ένα χαρακτηριστικό, το οποίο µας επιτρέπει να συµπεράνουµε το γενότυπο ενός ατόµου από το φαινότυπό του λέγεται γονιδιακός δείκτης. Οι γονιδιακοί δείκτες χρησιµοποιούνται για τη µελέτη της γενετικής ποικιλότητας γιατί είναι ανεξάρτητοι από την επίδραση του περιβάλλοντος. Πρέπει όµως πριν χρησιµοποιηθούν για το σκοπό αυτό να τεκµηριωθεί η ιδιότητά τους αυτή. Πρέπει µε λίγα λόγια να αποδειχτεί ότι ένα χαρακτηριστικό είναι κατάλληλο για γονιδιακός δείκτης. Για το λόγο αυτό γίνεται η ανάλυση κληρονοµικότητας του χαρακτηριστικού αυτού. Αν η ανάλυση κληρονοµικότητας είναι επιτυχής, τότε ο γονιδιακός τόπος τεκµηριώνεται σαν γονιδιακός δείκτης. Μια ανάλυση κληρονοµικότητας αποδεικνύει τη σύνδεση µεταξύ του παρατηρούµενου φαινότυπου και του γενότυπου που τον ρυθµίζει. Μόνο τότε µπορεί κανείς να οδηγηθεί µε σιγουριά από το φαινότυπο στο γενότυπο και να υπολογίσει τη γενετική ποικιλότητα. Τύποι γονιδιακών δεικτών Ο ιδανικός γονιδιακός δείκτης θα πρέπει να εµφανίζει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: να ελέγχεται από λίγες γονιδιακές θέσεις και αν είναι δυνατόν από µία µόνο, να µην υπάρχει κυριαρχία ανάµεσα στα αλληλόµορφα, να υπάρχει ανεξαρτησία από το περιβάλλον. Επειδή στη φύση τα χαρακτηριστικά του τύπου αυτού σπανίζουν, καταφεύγουµε στο εργαστήριο. Στην ιστορία της Γενετικής έχουν χρησιµοποιηθεί πολλοί διαφορετικοί γονιδιακοί δείκτες. Κάποιοι από αυτούς έχουν καθιερωθεί και παρουσιάζονται στο σηµείο αυτό. Μορφολογικοί χαρακτήρες Η χρήση µορφολογικών χαρακτήρων σαν γονιδιακούς δείκτες και η περιγραφή της γενετικής ποικιλότητας στους οργανισµούς περιλαµβάνει δύο προσεγγίσεις: τη µελέτη διακριτών χαρακτηριστικών µε σαφή διαχωρισµό φαινοτυπικών κλάσεων και τη µελέτη ποσοτικών ή συνεχών γνωρισµάτων. Στην πρώτη κατηγορία υπάγονται τα µορφολογικά χαρακτηριστικά και οι χρωµατισµοί στα φυτά που µελέτησε πρώτος ο MENDEL το Στα δασικά δέντρα, ορισµένες σπάνιες µορφές φύλλων που παρατηρούνται σε ορισµένα δασικά δέντρα (Fagus, Betula, Acer) ελέγχονται από µία κυρίαρχη γονιδιακή θέση που προκαλεί αλλαγές στα άκρα τους. Πρόκειται για φαινοτυπικούς συνδυασµούς που έχουν ευρεία εφαρµογή για καλλωπιστικούς λόγους. Ορισµένοι χρωµατισµοί δασικών δέντρων, όπως είναι το σκούρο κόκκινο χρώµα των φύλλων (µορφή "purpurea") ελέγχονται επίσης από µία γονιδιακή θέση µε αλληλόµορφα µε σχέση κυριαρχίας υποτέλειας. Άλλο ένα παράδειγµα χαρακτηριστικού είναι το χρώµα του ρετσινιού στα είδη Pinus echinata και P. Elliottii, που ελέγχεται από ένα µόνο γονίδιο. Άλλα χαρακτηριστικά του τύπου αυτού έχουν αναφερθεί σε προηγούµενα κεφάλαια, όπως είναι οι περιπτώσεις γονιδίων που δρουν επιστατικά το ένα στο άλλο και ρυθµίζουν το χρώµα του τριχώµατος των θηλαστικών. Οι χαρακτήρες αυτοί είναι σπάνιοι στη φύση και στα δασικά φυτά έχουν κυρίως εφαρµογή για καλλωπιστικούς σκοπούς, αλλά δεν προσφέρονται για τη µελέτη της γενετικής ποικιλότητας των φυτών. Επίσης επειδή υπάρχει σχεδόν πάντα κυριαρχία, χρειάζονται διασταυρώσεις µεταξύ των φυτών για την τελική διαπίστωση των γενοτύπων. Μορφολογικοί συνεχείς χαρακτήρες, όπως είναι για παράδειγµα το ύψος ή η διάµετρος ενός δέντρου, χρησιµοποιούνται για την περιγραφή της γενετικής ποικιλότητας, αν και δεν θα µπορούσε να τους χαρακτηρίσει κανείς γονιδιακούς δείκτες, καθώς δεν διαθέτουν ούτε ένα από τα απαιτούµενα χαρακτηριστικά. Στη δασοπονία όµως υπάρχει συχνή µέτρηση των χαρακτηριστικών αυτών σε κοινό περιβάλλον. Πρόκειται για την εγκατάσταση και µετέπειτα αξιολόγηση πειραµατικών φυτειών σύγκρισης µεταξύ φυτών διαφορετικών ειδών, προελεύσεων ή οικογενειών, που γίνεται σύµφωνα µε πειραµατικό σχεδιασµό και στατιστικές αναλύσεις που αποτελούν 57

4 Εισαγωγή στη δασική γενετική αντικείµενο της ποσοτικής γενετικής. Το κοινό περιβάλλον εξασφαλίζει µια σχετική περιβαλλοντική ανεξαρτησία της ποικιλότητας που µετράται, αλλά παραµένει ακόµη η δράση του µικροπεριβάλλοντος και της αλληλεπίδρασης γενότυπου περιβάλλοντος. Η φιλοσοφία της ανάλυσης δεδοµένων τέτοιου τύπου βασίζονται στην ανάλυση της διακύµανσης και τον καταµερισµό της παρατηρούµενης φαινοτυπικής ποικιλότητας σε γενετικό και περιβαλλοντικό µέρος. Η εγκατάσταση και παρακολούθηση παρόµοιων πειραµάτων στη δασοπονία είναι µακροχρόνια και δαπανηρή και εξυπηρετεί κυρίως βελτιωτικούς σκοπούς. Ποσοτικά µορφολογικά χαρακτηριστικά µπορούν επίσης να µετρηθούν απ ευθείας σε φυσικούς πληθυσµούς ζώων και φυτών. Οι µετρήσεις αυτές περιέχουν τον περιβαλλοντικό παράγοντα και δεν είναι δυνατή η περιγραφή της γενετικής ποικιλότητας. Έρευνες τέτοιου τύπου βασίζονται κυρίως σε µορφοµετρικές µεθόδους και αφορούν την ποικιλότητα χαρακτηριστικών που αποδεδειγµένα διαχωρίζουν ράτσες και είδη µεταξύ τους. Ενδείκνυνται για τη µελέτη της επίδρασης περιβαλλοντικών παραµέτρων στον φαινότυπο ή της µείξης µεταξύ διαφορετικών ειδών ή υποειδών στη φύση. Κατά το παρελθόν, µορφοµετρικές αναλύσεις είχαν χρησιµοποιηθεί για την ταυτοποίηση παραγωγικών κλώνων λεύκης ή ευκαλύπτου. Σήµερα η εφαρµογή των µεθόδων αυτών αφορά σε µεγάλο βαθµό την περιγραφή της ποικιλότητας σε πληθυσµούς ζώων, ενώ οι σχετικές έρευνες σε φυτά είναι περιορισµένες. ευτερογενή προϊόντα Το περιεχόµενο συγκεκριµένων δευτερογενών προϊόντων, που προκύπτουν σαν αποτέλεσµα πολύπλοκων µεταβολικών διεργασιών, ελέγχονται συχνά από ένα ή λίγα γονίδια. Για παράδειγµα, ένα αλληλόµορφο που ευθύνεται για την υψηλή παραγωγή ενός τερπενίου είναι συχνά κυρίαρχο πάνω στο αντίστοιχο αλληλόµορφο που ευθύνεται για τη χαµηλή παραγωγή της ίδιας χηµικής ουσίας. Η περιεκτικότητα φυτικών ιστών σε τερπένια έχει χρησιµοποιηθεί κατά κόρον από πολλούς ερευνητές που µελέτησαν τη γενετική ποικιλότητα των κωνοφόρων. Απαιτείται χηµικό εργαστήριο µε χρωµατογράφο. Η όλη διαδικασία αποδείχτηκε µε τον καιρό προβληµατική, αφού δεν µπορούν να αναγνωριστούν οι ετεροζυγωτοί γενότυποι, ενώ δεν είναι δυνατή και η ανάλυση κληρονοµικότητας. Σήµερα τα τερπένια χρησιµοποιούνται κυρίως για το χαρακτηρισµό ειδών και υποειδών και σπάνια πια για τη µέτρηση της γενετικής ποικιλότητας. Ισοένζυµα Το 1966, ο R.C. Lewontin (φωτογραφία) χρησιµοποίησε για πρώτη φορά την ηλεκτροφόρηση ενζύµων για την περιγραφή της γενετικής ποικιλότητας σε οργανισµούς. Η βάση της τεχνικής αυτής είναι απλή και ιδιαίτερα αποτελεσµατική, αφού επέτρεψε για πρώτη φορά τη µελέτη της ποικιλότητας σε επίπεδο αλληλοµόρφων. Τα ένζυµα που καταλύουν τις ίδιες βιοχηµικές αντιδράσεις του µεταβολισµού αλλά διαφέρουν ως προς τη δοµή τους και κυρίως την αλληλουχία των αµινοξέων τους λέγονται ισοένζυµα. ιαφορετικά ισοένζυµα προκαλούνται από τη ν έκφραση διαφορετικών αλληλοµόρφων. Πρόκειται για ένα γονιδιακό δείκτη που έχει χρησιµοποιηθεί µε µεγάλη επιτυχία στις γενετικές έρευνες των δασικών ειδών από τη δεκαετία του 1970 ως τώρα. Αν και έχει πλέον µειωθεί η εφαρµογή τους λόγω της ραγδαίας ανάπτυξης των δεικτών του DNA, παραµένουν σηµαντικά εργαλεία, κυρίως για πληθυσµιακές έρευνες. Η λειτουργία της µεθόδου των ισοενζύµων βασίζεται στην αρχή «ένα γονίδιο ένα πολυπεπτίδιο». Υπάρχει δηλαδή µια στενή σχέση ανάµεσα στην ποικιλότητα των γονιδιακών τόπων που ρυθµίζουν τα ένζυµα και την ποικιλότητα των εργαστηριακών φαινοτύπων των ισοενζύµων (ζυµογράµµατα), αφού τα ένζυµα είναι η πιο χαρακτηριστική οµάδα πολυπεπτιδίων. Η χρήση των ισοενζύµων εξαπλώθηκε σε µεγάλο βαθµό λόγω µιας σειράς πλεονεκτηµάτων τους, όπως είναι η σταθερότητα των αποτελεσµάτων σε όλα τα περιβάλλοντα, η δυνατότητα χρήσης σε διαφορετικά οντογενετιικά στάδια (π.χ. σπόροι, ενήλικα φυτά, γαµέτες), η απλότητα και η χαµηλή τιµή της πειραµατικής διαδικασίας, η συγκυριαρχία που χαρακτηρίζει τους περισσότερους γονιδιακούς τόπους και η µεγάλη ποικιλότητα που εµφανίζει ο δείκτης αυτός στα δασικά είδη. Τα 58

5 Γονιδιακοί δείκτες µειονεκτήµατα που υπάρχουν στα ισοένζυµα είναι η εφαρµογή τους σε έναν περιορισµένο αριθµό ενζύµων του πρωτογενούς µεταβολισµού, που αφορά ένα µικρό ποσοστό του γενώµατος, και η γενικά µικρή ποικιλότητα που παρατηρείται σε ορισµένες κατηγορίες οργανισµών (π.χ. θηλαστικά, άνθρωπος, καλλιεργούµενα φυτά). Όπως είχαµε αναφέρει και παλαιότερα, ο πιο σηµαντικός τρόπος εξέτασης των ισοενζύµων σε έναν ιστό είναι η ηλεκτροφόρηση, η τοποθέτηση δηλαδή κατάλληλα προετοιµασµένου δείγµατος σε ένα gel σε ηλεκτρικό πεδίο για το διαχωρισµό των ενζύµων αυτών που διαφέρουν στο φορτίο, στο µέγεθος ή στο σχήµα τους. Η «ανάγνωση» των αποτελεσµάτων γίνεται ύστερα από τη βαφή του gel µε ειδικό µείγµα για κάθε ένζυµο, που περιέχει το υπόστρωµα της αντίδρασης που καταλύει το συγκεκριµένο ένζυµο και κάποιες χρωστικές ουσίες. Εργαστηριακή διαδικασία ανάλυσης ισοενζύµων Μοριακοί δείκτες (DNA) Η απευθείας εξέταση του ίδιου το DNA, όπου βρίσκεται η γενετική πληροφορία είναι η πιο πρόσφατη εξέλιξη στον τοµέα των γονιδιακών δεικτών και έχει πλέον διαδοθεί σε όλες τις βιολογικές επιστήµες. Αυτή η εξέλιξη έχει συµβεί στα δασικά είδη κυρίως τα τελευταία 15 χρόνια. Από την πληθώρα των µοριακών δεικτών που έχουν διαµορφωθεί, εµείς θα αναφέρουµε ενδεικτικά µόνο τους πιο κοινούς. Η επιλογή ανάµεσα στους πολλούς µοριακούς δείκτες γίνεται ανάλογα µε το σκοπό της κάθε έρευνας. Η εξέλιξη των µοριακών δεικτών είναι ραγδαία και νέες µεθοδολογίες προκύπτουν διαρκώς. Υπάρχουν δύο βασικές προσεγγίσεις στην ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας µε µοριακούς δείκτες. Η πρώτη είναι η µελέτη περιοχών του DNA που σχετίζονται µε συγκεκριµένα γονίδια που ενδιαφέρουν την πράξη. Ο πολυµορφισµός που παρατηρείται είναι σε επίπεδο νουκλεοτιδίων στις συγκεκριµένες αυτές περιοχές του DNA. Για να χρησιµοποιηθούν τέτοιοι δείκτες χρειάζεται η γνώση της σχέσης µεταξύ συγκεκριµένων θέσεων στο γένωµα και των χαρακτηριστικών που αυτά επηρεάζουν, καθώς επίσης και της πλήρους αλληλουχίας του τµήµατος που εξετάζουµε. Οι δείκτες αυτοί δεν είναι (ακόµη) ιδιαίτερα διαδεδοµένοι στη µελέτη δασικών ειδών, καθώς η γνώση που απαιτείται για τον προσδιορισµό των περιοχών του DNA που µας ενδιαφέρουν απαιτεί δαπανηρά και µακρόχρονα πειράµατα στο εργαστήριο και στο πεδίο. 59

6 Εισαγωγή στη δασική γενετική Μια πιo απλή κατηγορία µοριακών δεικτών εξετάζει την ποικιλότητα στο µήκος διαφορετικών τµηµάτων DNA, που προκύπτουν είτε από την κοπή τους µε συγκεκριµένα ένζυµα ή µε τον επιλεκτικό πολλαπλασιασµό τους. Σχεδόν όλοι οι µοριακοί δείκτες που χρησιµοποιούνται σήµερα στην περιγραφή της ποικιλότητας ακολουθούν την αρχή αυτή. Οι δείκτες αυτοί είναι πολυποίκιλοι και χρήσιµοι στον εντοπισµό διαφορών στο DNA µεταξύ οργανισµών, αλλά δεν περιγράφουν ποικιλότητα σε αλληλόµορφα συγκεκριµένων γονιδίων. Ο πολυµορφισµός που περιγράφεται δηλαδή αφορά τη δοµή του DNA χωρίς αυτός να αντιστοιχεί σε πραγµατικά αλληλόµορφα, ούτε να γνωρίζουµε οι διαφορές αυτές τι επίδραση έχουν στη λειτουργία των οργανισµών που µελετάµε. Ένας νέος σχετικά κλάδος της Γενετικής, η γενωµική (genomics) αναπτύσσεται την εποχή αυτή και στα δασικά είδη. Η γενωµική εξετάζει τη λειτουργική σηµασία µεµονωµένων γονιδίων που µπορούν να περιγραφούν στο εργαστήριο και ταυτόχρονα έχουν συγκεκριµένη επίδραση στην έκφραση οικονοµικά σηµαντικών χαρακτηριστικών. Η εξέλιξη της τεχνικής αυτής αναµένεται να είναι ραγδαία στα επόµενα χρόνια. Το πρώτο εργαστηριακό βήµα πριν από οποιαδήποτε χρήση µοριακού δείκτη είναι η αποµόνωση (εκχύλιση) του DNA από τον ιστό του οργανισµού που θέλουµε να µελετήσουµε. Εφαρµόζονται συγκεκριµένες τεχνικές που περιλαµβάνουν τη µηχανική ρήξη των κυτταρικών τοιχωµάτων, τη λύση των κυττάρων και το διαχωρισµό του DNA από τα υπόλοιπα κυτταρικά συστατικά. Για την αποµόνωση καλής ποιότητας DNA χρειάζεται συνήθως φρέσκος ιστός αν και έχουν αναπτυχθεί τεχνικές που µπορούν να χρησιµοποιήσουν ξερά φύλλα ή υπολείµµατα ιστών. Μία µέθοδος ανάλυσης του DNA είναι o «πολυµορφισµός µήκους τµηµάτων DNA µετά από κοπή µε ένζυµα περιορισµού» (Restriction Fragment Length Polymorphisms - RFLPs). Η µέθοδος αυτή είναι η πρώτη ανάλυση DNA που εφαρµόστηκε στη δεκαετία του 1980 και περιλαµβάνει την κοπή («χώνευση») τµηµάτων DNA από συγκεκριµένα περιοριστικά ένζυµα (restriction enzymes). 60

7 Γονιδιακοί δείκτες Τα περιοριστικά ένζυµα είναι έτσι δοµηµένα ώστε να κόβουν το DNA σε συγκεκριµένες ακολουθίες νουκλεοτιδίων τεσσάρων ή έξι βάσεων και γι αυτόν το λόγο λέγονται και «µοριακά ψαλίδια». Αφού λοιπόν το DNA κοπεί σε συγκεκριµένα σηµεία από το ένζυµο, προκύπτουν τµήµατα του DNA, των οποίων το µέγεθος διαχωρίζεται και γίνεται ορατό µε τη µέθοδο της ηλεκτροφόρησης. Η ποικιλότητα προκύπτει µε την ύπαρξη ή όχι µιας συγκεκριµένης ακολουθίας νουκλεοτιδίων. Αν π.χ. δύο µόρια DNA από δύο διαφορετικούς οργανισµούς διαφέρουν ως προς την ακολουθία που ψάχνει να βρει το περιοριστικό ένζυµο που εµείς εφαρµόζουµε, τότε αυτά θα κοπούν σε διαφορετικά σηµεία και τελικά θα προκύψουν τµήµατα διαφορετικού µήκους. Αφού διαχωριστούν αυτά µέσα από την ηλεκτροφόρηση αγαρόζης, µεταφέρεται το DNA από το gel σε µία µεµβράνη (π.χ. από nylon). Για να εµφανιστούν οι διαφορές των δύο DNA για τη συγκεκριµένη ακολουθία νουκλεοτιδίων πρέπει να χρησιµοποιηθούν πολύπλοκες και χρονοβόρες τεχνικές µε ήδη γνωστά αποτελέσµατα για τα ίδια είδη και σύγκριση µε τα αποτελέσµατα του πειράµατος. Επίσης απαραίτητη είναι η ραδιενεργός σήµανση της µεµβράνης και η φωτογράφηση µε ακτίνες Χ. Πλεονεκτήµατα της µεθόδου των RFLPs είναι η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων και η συγκυριαρχία. Εργαστηριακά όµως, η τεχνική αυτή απαιτεί µεγάλες ποσότητες DNA, είναι χρονοβόρος και δεν είναι απόλυτα ασφαλής για τον εργαζόµενο καθώς περιλαµβάνει τη χρήση ραδιενέργειας. Για τους λόγους αυτούς, αλλά και λόγω της ανάπτυξης πιο απλών τεχνικών, τα RFLPs µε τον καιρό υποχωρούν µπροστά σε άλλες πιο σύγχρονες τεχνικές. Το 1983 επινοήθηκε από τον Κ.Β. Mullis (φωτογραφία) µία τεχνική πολλαπλασιασµού συγκεκριµένων τµηµάτων DNA που έδωσε τεράστια ώθηση στους µοριακούς δείκτες απλοποιώντας τις εργαστηριακές τεχνικές. Η τεχνική αυτή λέγεται είναι η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης, γνωστή και σαν PCR (Polymerase Chain Reaction). Η PCR επιτυγχάνει τον πολλαπλασιασµό τµηµάτων DNA µέσα από µία συγκεκριµένη εναλλαγή θερµοκρασιών και τη δράση του ενζύµου taq-πολυµεράση του DNA. Το ένζυµο αυτό βρέθηκε στο θερµόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus και µπορεί να λειτουργεί πολλαπλασιάζοντας το DNA ακόµα και σε υψηλές θερµοκρασίες κοντά στους 100 C. Η διαδικασία αυτή έδωσε λύση στο πρόβληµα του µεγέθους του δείγµατος του DNA που θέλουµε να αναλύσουµε, κάτι που δρούσε σαν ανασταλτικός παράγοντας ως την ανακάλυψή της. Έτσι τώρα µπορούµε µέσα από την PCR να µελετήσουµε το DNA πολύ µικρών δειγµάτων ιστών. Επικόλληση των εκκινητών (primer) και καθορισµός της περιοχής πολυµερισµού Για να πραγµατοποιηθεί η αντίδραση της PCR πρέπει πρώτα να οριστεί η περιοχή του DNA που θα πολυµερίσει η taq-πολυµεράση. Το ένζυµο αυτό ξεκινά τον πολυµερισµό του DNA όταν συναντά έναν εκκινητή (pimer). Ο primer είναι µια µικρή αλληλουχία νουκλεοτιδίων που επικάθεται πάνω στο DNA όταν βρει την αντίστοιχη συµπληρωµατική αλληλουχία. Η taq-πολυµεράση ξεκινά τον πολυµερισµό από τον primer και µετά, για όλη την υπόλοιπη αλυσίδα του DNA. Ένας άλλος primer προσκολλάται στην αντίθετη αλυσίδα του DNA και προκαλεί τον πολυµερισµό προς την αντίθετη κατεύθυνση. Το τµήµα του DNA που πολυµερίζεται και πολλαπλασιάζεται σε εκατοµµύρια αντίτυπα είναι αυτό που βρίσκεται ανάµεσα στους δύο primer. 61

8 Εισαγωγή στη δασική γενετική 62

9 Γονιδιακοί δείκτες Θερµικός κυκλοποιητής Επιλέγοντας τον primer µπορούµε να καθορίσουµε ποιο κοµµάτι DNA θέλουµε να πολλαπλασιάσουµε και στη συνέχεια να αναλύσουµε. Οι primer αποτελούνται συνήθως από νουκλεοτίδια. Η αντίδραση PCR γίνεται σε ένα ελεγχόµενο περιβάλλον. Τα στάδια της PCR καθορίζονται από διαφορετικές θερµοκρασίες που επιτυγχάνονται σε ειδικά µηχανήµατα που λέγονται θερµικοί κυκλοποιητές. Αρχικά διαχωρίζονται οι κλώνοι του DNA, στη συνέχεια προσκολλούνται οι primer και αρχίζει ο πολυµερισµός. Μετά από 20 ως 30 επαναλήψεις (κύκλους) της διαδικασίας αυτής έχουµε εκατοµµύρια αντίτυπα της περιοχής του DNA που επιλέξαµε. Τα αποτελέσµατα της PCR εξαρτώνται από τον τύπο του primer που επιλέγουµε για κάθε αντίδραση. Πάνω σε αυτήν την επιλογή στηρίζονται όλοι οι παρακάτω µοριακοί δείκτες που αναφέρονται. Οι πιο απλοί µοριακοί δείκτες που προκύπτουν από την PCR είναι οι «τυχαία πολλαπλασιασµένοι πολυµορφισµοί του DNA» (Random Amplified Polymorphic DNA - RAPDs). Ο πολλαπλασιασµός του DNA γίνεται µε τη χρήση τυχαίων primer λίγων νουκλεοτιδίων (10bps). Τα τµήµατα DNA που προκύπτουν διαχωρίζονται µε ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης. Η τελική πληροφορία που παίρνουµε είναι η ποικιλότητα ανάµεσα σε οργανισµούς σε σχέση µε γενετική πληροφορία που δεν µπορούµε να αναπαράγουµε, ούτε γνωρίζουµε τη σηµασία της. Για το λόγο αυτό επίσης δεν είναι δυνατόν να αναγνωριστούν τα ετεροζυγωτά άτοµα. Η τεχνική αυτή βρήκε ευρεία εφαρµογή στη µελέτη πολλών δασικών ειδών, επειδή αυτά δεν είναι ακόµα µελετηµένα εις βάθος και είναι άγνωστες οι αλληλουχίες που εµφανίζουν ποικιλότητα και µπορούν να έχουν γενετική σηµασία. Η τεχνική αυτή γνώρισε άνθηση στα τέλη της δεκαετίας του Αν και έχουν εξελιχτεί πιο αξιόπιστοι δείκτες, η εφαρµογή των RAPDs ενδείκνυται όταν προσπαθούµε να εξετάσουµε γενετικά κάποιο είδος φυτού για πρώτη φορά. Τρόπος λειτουργίας των RAPDs 63

10 Εισαγωγή στη δασική γενετική Ένας δείκτης που βασίζεται στην PCR και εφαρµόζεται συχνά στη γενετική έρευνα των φυτών είναι τα PCR-RFLPs. Πρόκειται για µία µέθοδο που εκµεταλλεύεται τα θετικά των RFLPs (συγκυριαρχία, αξιοπιστία) αποφεύγοντας τα αρνητικά της µεθόδου αυτής (ραδιενεργός σήµανση, χρονοβόρα και κουραστική διαδικασία). Η ανάλυση ξεκινά µε την αποµόνωση µικρής ποσότητας DNA και τον πολλαπλασιασµό συγκεκριµένων περιοχών του DNA αυτού µε PCR. Το προϊόν της PCR, τα πολλαπλασιασµένα τµήµατα του DNA κόβονται επιπλέον από ένζυµα περιορισµού, όπως γίνεται στη µέθοδο των RFLPs. Γίνεται αναγνώριση του µήκους των τεµαχίων του DNA που προκύπτουν µέσα από ηλεκτροφόρηση µε gel αγαρόζης ή ακρυλαµιδίου. Με τη βοήθεια υπεριώδους ακτινοβολίας και µιας ψηφιακής φωτογραφικής µηχανής αποτυπώνονται οι γραµµές του gel που δείχνουν το µέγεθος των τµηµάτων DNA που κόπηκαν. Η µέθοδος αυτή είναι πιο γρήγορη και πιο ασφαλής από αυτή των RFLPs. Φωτογραφηµένο gel αγαρόζης µετά από κοπή µε ένζυµα περιορισµού Πολλά είδη φυτών και ζώων διαθέτουν µικρά κοµµάτια DNA, που αποτελούνται από δύο ή τρία ζευγάρια βάσεων και επαναλαµβάνονται στο γένωµα πολλές φορές. Πρόκειται για «επαναλήψεις απλών αλληλουχιών» (Simple Sequence Repeats - SSRs), που επίσης είναι γνωστές και ως µικροδορυφόροι (microsatellites). Τα κοµµάτια αυτά του DNA δεν εκφράζονται και δεν οδηγούν στη σύνθεση πρωτεϊνών αλλά εµφανίζονται συχνά εξαιρετικά πολυµορφικά ως προς τον αριθµό των επαναλήψεων που περιέχουν. Μπορεί κανείς να εντοπίσει την ποικιλότητα αυτή µε εφαρµογή της PCR και ειδικά διαµορφωµένων primer. Οι primer επικολλούνται στην αρχή και στο τέλος των µικροδορυφόρων και οδηγούν στον πολλαπλασιασµό των περιοχών αυτών. Όσο πιο πολλές επαναλήψεις έχει το τµήµα που πολυµερίζεται, τόσο πιο µεγάλο είναι αυτό. Το µέγεθος των πολλαπλασιασµένων τµηµάτων DNA διαχωρίζεται σε ειδικά gel µε ηλεκτροφόρηση. Η µέθοδος των µικροδορυφόρων δίνει συγκυρίαρχα αποτελέσµατα στο πυρηνικό DNA. Επίσης έχει βρει µεγάλη εφαρµογή στην ανάλυση του DNA των πλαστιδίων. Οι µικροδορυφόροι θεωρούνται ιδανικοί δείκτες για τη µελέτη της ροής γονιδίων και του αναπαραγωγικού συστήµατος, λόγω της µεγάλης τους ποικιλότητας. Η µέθοδος αυτή όµως απαιτεί εξειδικευµένους primer για κάθε είδος 64

11 Γονιδιακοί δείκτες που εξετάζουµε. Με τον τρόπο αυτό δυσχεραίνεται πολύ η γενετική έρευνα σε καινούρια είδη, καθώς είναι απαραίτητη πρώτα η ανάπτυξη των σχετικών primer, κάτι που απαιτεί εµπειρία και γνώσεις µοριακής βιολογίας και πολύ χρόνο. Η µόνη περίπτωση που µπορούν να χρησιµοποιηθούν primer κοινοί για κάποια είδη είναι όταν εξετάζουµε το χλωροπλαστικό DNA (cpdna). Τρόπος λειτουργίας των SSR Μια άλλη διαδεδοµένη µέθοδος ανάλυσης DNA που βασίζεται στην PCR είναι οι «πολυµορφισµοί µεγέθους πολλαπλασιασµένων τµηµάτων» (amplified fragment length polymorphisms - AFLPs). Η µέθοδος αυτή εµφανίζει οµοιότητες µε αυτή των PCR-RFLP µε τη διαφορά ότι το DNA του φυτού κόβεται πρώτα από τα περιοριστικά ένζυµα σε συγκεκριµένα τµήµατα και µετά αυτά πολλαπλασιάζονται µε PCR. Ανάµεσα στα δύο αυτά στάδια, αφού δηλαδή ολοκληρωθεί η κοπή του DNA µε περιοριστικά ένζυµα, προστίθενται στα τµήµατα που προέκυψαν άλλα µικρότερα κοµµάτια DNA µε µικρές και γνωστές συχνότητες. Με τον τρόπο αυτό σηµαίνονται οι άκρες των τµηµάτων και µε ειδικούς primer που αναγνωρίζουν τις συχνότητες αυτές ακολουθεί ο πολλαπλασιασµός των τµηµάτων µε PCR και ο διαχωρισµός τους µε ηλεκτροφόρηση. Η τεχνική των AFLPs είναι πολύ διαδεδοµένη για τη µελέτη της γενετικής ποικιλότητας στα φυτά. Πλεονεκτήµατα της µεθόδου είναι η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων και το πλήθος των γραµµών που παρατηρεί κανείς στο gel. Αυτό µπορεί όµως να είναι και µειονέκτηµα, καθώς απαιτούνται µεγάλα gel ακρυλαµιδίου για το διαχωρισµό των γραµµών. Επιπλέον, ο δείκτης αυτός δίνει κυρίαρχα αποτελέσµατα. Σηµαντικό πλεονέκτηµα των AFLPs είναι επίσης η καλή αντιπροσώπευση όλου του γενώµατος µέσα από τις ζώνες που εξετάζονται. Οι δείκτες που παρουσιάστηκαν στο κεφάλαιο αυτό αποτελούν ένα µικρό µόνο µέρος των µεθόδων που υπάρχουν στην πράξη. Η εξέλιξη νέων µοριακών δεικτών που βασίζονται στην PCR είναι ραγδαία και νέες τεχνικές εµφανίζονται καθηµερινά. Αυτό συµβαίνει επειδή η παραγωγή των primer γίνεται συνθετικά και είναι απλή από τη στιγµή που γνωρίζουµε την αρχική ακολουθία του DNA που µας ενδιαφέρει. Προβλέπουµε ότι σε λίγα χρόνια, η ανάλυση του DNA απευθείας στα δασικά είδη θα απλοποιηθεί ακόµα περισσότερο και θα γίνει πιο προσιτή και πιο διαδεδοµένη. 65

12 Εισαγωγή στη δασική γενετική Η τεχνική που αναµένεται να κυριαρχήσει στο σύντοµο µέλλον είναι η µελέτη της ποικιλότητας σε επίπεδο αλληλουχίας του DNA. Η πιο λεπτοµερής εικόνα που µπορεί κανείς να πάρει από µια ανάλυση DNA είναι η πλήρης ακολουθία των βάσεων ενός ή περισσότερων γονιδίων (DNA sequencing). Αυτό είναι δυνατό χάρη στα καινούρια µηχανήµατα που έχουν εξελιχτεί για το σκοπό αυτό (φωτογραφία). Η έρευνα συγκεκριµένων γονιδίων µε γνωστή λειτουργία µέσω του πολλαπλασιασµού τους µε PCR (Sequence Characterized Amplified Regions - SCARs) αναµένεται να κυριαρχήσει στις επόµενες δεκαετίες. Ένας άλλος δείκτης που αρχίζει να εµφανίζεται σε δηµοσιεύσεις ποικιλότητας δασικών ειδών είναι οι «πολυµορφισµοί µεµονωµένων νουκλεοτιδίων» (Single Nucleotide Polymorphisms SNPs). Πρόκειται για ειδικές τεχνικές όπου η ποικιλότητα πλέον περιγράφεται σε επίπεδο σηµειακών µεταλλάξεων στο DNA. Αξίζει στο σηµείο αυτό να εξηγήσουµε ότι ο κάθε διαφορετικός δείκτης έχει ιδιαιτερότητες, που πιθανόν να είναι αναντικατάστατες για µελέτες πληθυσµών, όσο και αν ξεπεραστεί η τεχνολογία του. Για το λόγο αυτό συνυπάρχουν και συχνά χρησιµοποιούνται παράλληλα πολλοί διαφορετικοί δείκτες. Τα πληθυσµιακά αποτελέσµατα που πιστοποιούνται από την ανάλυση περισσότερων του ενός δεικτών, είναι πιο αξιόπιστα και ερµηνεύονται πιο ολοκληρωµένα, από την χρησιµοποίηση ενός και µόνου γονιδιακού δείκτη. Ανάλυση κληρονοµικότητας Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, η ανάλυση κληρονοµικότητας στοχεύει στον καθορισµό του τρόπου κληρονόµησης ενός χαρακτηριστικού και µε τον τρόπο αυτό µπορούν να αναγνωρίζονται οι γονιδιακοί δείκτες. Η αναγνώριση αυτή είναι απαραίτητη ακόµα και για δείκτες που θεωρούνται ότι βρίσκονται πολύ κοντά στο γονίδιο, όπως είναι τα ισοένζυµα και οι αναλύσεις DNA. Ακόµα και σε αυτές τις περιπτώσεις δεν πρέπει να ξεχνούµε ότι βλέπουµε πειραµατικά αποτελέσµατα, δηλαδή φαινότυπους, που πρέπει πρώτα να αναχθούν σε γενότυπους, πριν χρησιµοποιηθούν σαν γονιδιακοί δείκτες. 66

13 Γονιδιακοί δείκτες Μία ανάλυση κληρονοµικότητας συνήθως βασίζεται στην παρατήρηση της φαινοτυπικής ποικιλότητας ανάµεσα στους απόγονους ύστερα από τη διασταύρωση γνωστών γονέων. Τα κλασσικά πειράµατα περιλαµβάνουν ελεγχόµενες διασταυρώσεις και παρατήρηση των απογόνων, όπως έκανε ήδη ο Mendel το Όµως για διάφορους τεχνικούς λόγους, τα δασικά δέντρα διασταυρώνονται τεχνητά πολύ δύσκολα. Έτσι πέρα από την κλασσική ανάλυση κληρονοµικότητας µε τεχνητές διασταυρώσεις έχουν αναπτυχθεί µέθοδοι που δεν απαιτούν µια τέτοια διαδικασία. Ελεγχόµενες διασταυρώσεις Το παράδειγµα των πειραµάτων του Mendel είναι το πιο χαρακτηριστικό για τον τρόπο µε τον οποίο ελέγχονται οι αναµενόµενες αναλογίες στους απογόνους της F1 και F2 γενιάς. Ένα παράδειγµα δασικού είδους, για το οποίο έχει γίνει ανάλυση κληρονοµικότητας µε ελεγχόµενη διασταύρωση είναι η ερυθρελάτη (Picea abies) για το χαρακτηριστικό χρώµα aurea, που εµφανίζουν ορισµένα δέντρα στις βελόνες τους. Τα κανονικά φυτά έχουν βαθυπράσινες βελόνες. ιασταυρώνοντας δύο δέντρα µε κανονικό χρώµα έχουµε την F1 γενιά µε οµοιόµορφα δέντρα µε κανονικό χρώµα (περίπτωση a στο σχήµα). ιασταυρώνοντας ένα κανονικό φυτό µε ένα aurea έχουµε τους µισούς απογόνους κανονικούς και τους µισούς aurea (περίπτωση b στο σχήµα). Οι απόγονοι της διασταύρωσης δύο δέντρων µε χρώµα aurea (c) εµφανίζουν τις παρακάτω αναλογίες: ¼ είναι σκούρα πράσινα, ½ είναι aurea και το υπόλοιπο ¼ εµφανίζει αλβινισµό και παθαίνει σύντοµα. Τα παραπάνω αποτελέσµατα αποδεικνύουν ότι ο χαρακτήρας του χρώµατος των βελονών της ερυθρελάτης ελέγχεται από έναν γονιδιακό τόπο µε δύο αλληλόµορφα, G και g. Ο γενότυπος GG δίνει σκούρα πράσινες βελόνες, ο Gg δίνει το χρώµα aurea και ο gg οδηγεί σε αλβινισµό. Tα πειράµατα (b) και (c) µπορούν να θεωρηθούν σαν ανάλυση κληρονοµικότητας. Τουλάχιστον ένας γονέας από το ζευγάρι που διασταυρώνουµε πρέπει να είναι ετεροζυγωτός σε ένα γονιδιακό τόπο για να παρατηρηθεί ποικιλότητα ανάµεσα στους απογόνους. Η αναµενόµενη αναλογία των φαινοτύπων στους απογόνους εξαρτάται από τον αριθµό των γονιδιακών τόπων που εµπλέκονται στο χαρακτηριστικό, τις σχέσεις υποτέλειας κυριαρχίας µεταξύ των αλληλοµόρφων και τους γενότυπους και των δύο γονέων. Για όλα τα παραπάνω κάνουµε µία υπόθεση και την ελέγχουµε πειραµατικά. Τα αποτελέσµατα οι αναλογίες των φαινοτύπων των απογόνων των πειραµάτων ελέγχονται ως προς τις αναλογίες που αναµένουµε για µία συγκεκριµένη υπόθεση. Αν αυτή δεν απορριφθεί, τότε θεωρούµε ότι ισχύει και ότι ανακαλύψαµε τον τρόπο κληρονόµησης του εξεταζόµενου χαρακτηριστικού. Ο στατιστικός έλεγχος µπορεί να γίνει µε το τεστ χ 2. Η κληρονόµηση της ποικιλότητας στην περίπτωση των ισοενζύµων µπορεί επίσης να ελεγχθεί µέσω τεχνητών διασταυρώσεων. Στο παρακάτω παράδειγµα βλέπουµε ορισµένες διασταυρώσεις µεταξύ ατόµων της δρυός Quercus robur µε γνωστό γενότυπο στον ενζυµικό γονιδιακό τόπο PGI-B. Και στις 6 περιπτώσεις, ελέγχθηκε η υπόθεση της κληρονόµησης ενός γονιδίου µε συγκυριαρχία. Σε όλες τις περιπτώσεις η υπόθεση δεν διαψεύστηκε. Ο γονιδιακός τόπος PGI-B µπορεί πλέον να χρησιµοποιηθεί σαν γονιδιακός δείκτης. 67

14 Εισαγωγή στη δασική γενετική Γενότυπος Θηλυκού γονέα Γενότυπος αρσενικού γονέα Αναµενόµενη αναλογία Πραγµατική αναλογία Β5Β5 Β2Β6 1/1 21/24 ns Β5Β5 Β2Β6 1/1 15/14 ns Β5Β5 Β2Β6 1/1 15/12 ns Β5Β5 Β2Β5 1/1 14/16 ns Β2Β3 Β2Β3 1/2/1 33/61/46 ns Β5Β5 Β2Β5 1/1 14/24 ns Αντίστοιχα µε το παραπάνω, παραθέτουµε ακόµα ένα παράδειγµα ανάλυσης κληρονοµικότητας ενός µοριακού δείκτη (RFLPs) µε τεχνητή διασταύρωση σε υβρίδια καρυδιάς (Junglans hindsii x Junglans regia). Ένας αριθµός γονιδιακών τόπων ελέγχθηκε. Οι αναλογίες των αποτελεσµάτων στους απογόνους συγκρίθηκαν µε τις αναµενόµενες. Οι γονιδιακοί τόποι που δεν έδωσαν σηµαντικές διαφορές χρησιµοποιούνται πλέον ως γονιδιακοί δείκτες. χ 2 Γονιδιακός Ένζυµο Αναµενόµενη Πραγµατική τόπος περιορισµού αναλογία αναλογία χ 2 fp01 EcoRV 1/1 37/26 ns fp02 HindIII 1/1 22/41 s fp03 HindIII 1/1 37/25 ns fp04 HindIII 1/1 30/32 ns fp06a XbaI 1/1 30/33 ns fp06b XbaI 1/1 33/30 ns ιαχωρισµός στο ενδοσπέρµιο των κωνοφόρων Η ανάπτυξη του µεγαγαµετόφυτου (ενδοσπερµίου) στα κωνοφόρα διαφέρει από αυτήν των αγγειόσπερµων. Ο θρεπτικός ιστός που περιβάλλει το έµβρυο στο σπόρο των κωνοφόρων είναι απλοειδής και εκφράζει γενετικά το θηλυκό γαµέτη. Έτσι είναι αναµενόµενο, ένας ετεροζυγωτός γενότυπος να έχει δύο διαφορετικά αλληλόµορφα στα ενδοσπέρµια των σπόρων του. Λόγω της αρχής του διαχωρισµού, η πιθανότητα ενός γαµέτη να περιέχει ένα από τα δύο αλληλόµορφα είναι ½. Για γονιδιακούς τόπους, που θέλουµε να εφαρµόσουµε ανάλυση κληρονοµικότητας, φτάνει να αποδείξουµε ότι ισχύει αυτή η αναλογία στα ενδοσπέρµια ενός ετεροζυγωτού δέντρου σπορέα. ίνεται ένα παράδειγµα ανάλυσης κληρονοµικότητας του τροπικού πεύκου Pinus merkusii. Γονιδιακός τόπος Γενότυπος δέντρου σπορέα N Παρατηρήσεις διαχωρισµού χ 2 ως προς 1:1 LAP-A A 0 A A 0 : 64 A 1 : 71 0,36 ns LAP-B B 1 B 2 20 B 1 : 11 B 2 : 9 0,20 ns GOT-C C 1 C 2 20 C 1 : 8 C 2 : 12 0,79 ns GDH-A A 1 A 3 20 A 1 : 7 A 3 : 13 1,78 ns FDH-A A 2 A 3 20 A 2 : 9 A 3 : 11 0,20 ns MDH-A A 1 A 2 21 A 1 : 9 A 2 : 12 0,42 ns SKDH-A A 0 A A 0 : 69 A 1 : 66 0,07 ns 6-PGDH-A A 1 A 2 20 A 1 : 8 A 2 : 12 0,79 ns PGM-A A 1 A 2 38 A 1 : 13 A 2 : 25 3,81 ns ιαχωρισµός στους απογόνους δέντρων, που προέρχονται από ελεύθερη γονιµοποίηση Σε περιπτώσεις που είναι δύσκολο ή αδύνατο να κάνουµε τεχνητές διασταυρώσεις δηλαδή στα περισσότερα δασικά φυτά µπορεί να βρει εφαρµογή µία άλλη έµµεση µέθοδος, που στηρίζεται στην παρακάτω παραδοχή: σε ένα γονιδιακό τόπο, οι απόγονοι ενός ετεροζυγωτού δέντρου A x A y 68

15 Γονιδιακοί δείκτες (όπου x και y διαφορετικά αλληλόµορφα και z κάθε αλληλόµορφο διαφορετικό των x και y) έχουν τις παρακάτω ιδιότητες: Α) το άθροισµα όλων των οµοζυγωτών απογόνων ισούται µε το άθροισµα των ετεροζυγωτών που περιέχουν τα αλληλόµορφα του δέντρου σπορέα, δηλαδή P(xx) + P(yy) = P(xy) και Β) το άθροισµα των ετεροζυγωτών απογόνων µε ένα µόνο αλληλόµορφο του σπορέα ισούται µε το άθροισµα όλων των ετεροζυγωτών απογόνων που περιέχουν το άλλο αλληλόµορφο του σπορέα, δηλαδή: P(xz) = P(yz). Στην παραπάνω εικόνα βλέπουµε ένα gel µε την ανάλυση κληρονοµικότητας του µεσογειακού κυπαρισσιού, µε τη µέθοδο αυτή. Το ζυµόγραµµα αριστερά είναι αυτό του ετεροζυγωτού σπορέα και τα υπόλοιπα 18 των απογόνων του. Αναµένεται να ισχύει για τους απογόνους: Ρ(Β1Β1) + Ρ(Β2Β2) = Ρ(Β1Β2). Η πραγµατική αναλογία είναι οµοζυγωτοί απόγονοι µε 9 ετεροζυγωτούς, οπότε δεχόµαστε το συγκεκριµένο ένζυµο σαν γονιδιακό δείκτη. Σηµασία των γονιδιακών δεικτών Η παρουσίαση των γονιδιακών δεικτών έγινε στο µάθηµα αυτό επειδή αυτοί χρησιµοποιούνται για τη γενετική έρευνα ανάµεσα σε πολλούς οργανισµούς των δασικών ειδών. Η αντίληψη του τρόπου λειτουργίας τους και των ιδιοτήτων που αυτοί έχουν καθορίζει πολλές φορές την καταλληλότητά τους για ένα πείραµα. Πρέπει να τονίσουµε ότι κανείς γονιδιακός δείκτης δεν είναι «πανάκεια» για τη διεξαγωγή επιστηµονικής έρευνας στη Γενετική. Κατά καιρούς εµφανίζονται νέες τεχνικές που σε πολλά σηµεία µπορεί να εκτοπίζουν τις παλιές, αλλά καµία από αυτές τις τεχνικές δεν είναι κατάλληλη για όλες τις έρευνες. Είναι επίσης χρήσιµο να αντιληφθούµε ότι παρά τη χρηστικότητα ενός γονιδιακού δείκτη, αυτός δεν πρέπει να χρησιµοποιείται σε έναν οργανισµό πριν την ανάλυση κληρονοµικότητας που θα τον «πιστοποιήσει», όσο προφανές κι αν είναι αρχικά ότι η έκφρασή του ελέγχεται από ένα γονίδιο. Σε πολλές περιπτώσεις τα εργαστηριακά αποτελέσµατα επηρεάζονται από τυχαίους και περιβαλλοντικούς µη γενετικούς παράγοντες και µπορεί να οδηγήσουν σε παραπλανητικά συµπεράσµατα. Στο σηµείο αυτό αναφέρουµε ορισµένες χρήσεις των γονιδιακών δεικτών, που θα συζητηθούν στο επόµενο κεφάλαιο: Ταυτοποίηση κλώνων, Ταυτοποίηση υβριδίων, Ταυτοποίηση γενετικά τροποποιηµένων φυτών, Μέτρηση γενετικής ποικιλότητας µέσα σε πληθυσµούς και µεταξύ αυτών, Ανάλυση αναπαραγωγικού συστήµατος και µεταναστεύσεων (ροή γονιδίων), Αξιολόγηση διαχειριστικών µέτρων και προγραµµάτων βελτίωσης και προστασίας, Αναγνώριση «γονιδιακών τόπων ποσοτικών χαρακτήρων» (QTLs). Οι γονιδιακοί δείκτες είναι µέθοδοι που µπορούν να χρησιµοποιηθούν στη γενετική για τη σύνδεση µεταξύ φαινότυπου και γενότυπου και για την περιγραφή της γενετικής ποικιλότητας. Για το λόγο αυτό, η σηµασία τους είναι πολύ µεγάλη. 69