PRAKTIKUM IZ FIZIOLOGIJE BILJA

Transcript

1 PRAKTIKUM IZ FIZIOLOGIJE BILJA Poljoprivredni fakultet u Osijeku, Miroslav Lisjak, dipl. inž. Marija Špoljarević, prof. Dejan Agić, prof. dr.sc. Luka Andrić

2 SADRŽAJ 1. METABOLIZAM BILJAKA 1.1. Određivanje kloroplastnih pigmenata A Spektrofotometrijsko određivanje koncentracije pigmenata po Holmu i Wetstteinu B Razdvajanje pigmenata kromatografijom na papiru Određivanje intenziteta fotosinteze kemijskom metodom Mjerenje intenziteta disanja protočnom metodom Izolacija proteina iz biljnog materijala Određivanje koncentracije proteina A Određivanje koncentracije proteina Lowry metodom Sadržaj ukupnih kiselina u voću Određivanje sadržaja reducirajućih šećera u plodovima Spektroskopsko određivanje ukupnih antocijanina po metodi ekstrakcije uz različit ph FIZIOLOGIJA MINERALNE ISHRANE BILJAKA 2.1. Razaranje i analiza elementarnog sastava biljne tvari Određivanje koncentracije fosfora u suhoj tvari biljaka Određivanje koncentracije dušika u biljnom materijalu Određivanje sadržaja nitrata u svježem povrću Određivanje aktivnosti nitrat reduktaze FIZIOLOGIJA RASTA I RAZVOJA 3.1. Život rezanog cvijeća u vazi Mjerenje površine lista Nastijska gibanja A Termonastije B Fotonastije Klijavost i vigor sjemena A Standardna klijavost i energija klijanja sjemena B Cold test C Električni konduktivitet sjemena D Zdravstveno stanje sjemena Analiza rasta biljaka Utvrđivanje alelopatskih odnosa u klijanju FIZIOLOGIJA STRESA KOD BILJAKA 4.1. Određivanje deficita difuznog pritiska (DDP) Određivanje evapotranspiracije lista Određivanje sadržaja prolina Određivanje sadržaja vitamina C Zaštitno djelovanje šećera pri niskim temperaturama Aktivnost enzima katalaze

3 1. METABOLIZAM BILJAKA 1.1. ODREĐIVANJE KLOROPLASTNIH PIGMENATA Uvod u vježbu Osnovna uloga kloroplastnih pigmenata, posebno klorofila, je apsorpcija svjetlosne energije koja se zatim procesima fotosinteze transformira u kemijsku energiju. Pigmenti fotoreceptori su obično obojeni, kompleksni organski spojevi čije se optičke osobine zasnivaju na kemijskoj strukturi njihovih molekula. Apsorpcija vidljivog dijela spektra, a s tim u vezi i boja pigmenata, zavisi o prisustvu sistema konjugiranih dvostrukih veza u njihovim molekulama: -C=C-, -C=N-, -N=N-, -N=O-, -C=S-. U fotosintetskom aparatu viših biljaka najznačajniji su klorofili i karotenoidi. Dosada poznati klorofili su -a, -b, -c, -d i -e, a više biljke sadrže klorofil -a (C 55 H 72 O 5 N 4 Mg) i klorofil -b (C 55 H 70 O 6 N 4 Mg) koji se nalaze u tilakoidima kloroplasta (slika 1). Klorofili su esteri dikarbonske kiseline klorofilina i alkohola fitola. Osnovna građevna jedinica je porfirinski prsten u čijem je središtu atom Mg vezan na N četiriju pirolovih prstena s dvije kovalentne i dvije koordinatne veze. Na porfirinsku jezgru vezan je fitolni rep bogat CH 3 skupinama, slika 1. Porfirinska jezgra je hidrofilna a fitolni rep je hidrofoban i lipofilan. Pri osvjetljavanju klorofila dolazi do ekscitiranja elektrona i stvaranja transportnog lanca elektrona kojim se usvojena svjetlosna energija prenosi do određenih akceptora koji dalje omogućuju korištenje te energije u tamnoj fazi fotosinteze. Modrozeleni klorofil a i žutozeleni klorofil b apsorbiraju vidljivi dio spektra i imaju maksimume apsorpcije u crvenom ( nm) i plavom ( nm) dijelu spektra. Njihov kvantitativni odnos u većine biljaka je otprilike 3:1. Karotenoidi (provitamini A) su narančasto-žuti pigmenti koji su po kemijskoj strukturi derivati izoprena (8 izoprenskih jedinica), a mogu biti aciklični, monociklični i Slika 1. Strukturna formula klorofila a i klorofila b; biciklični. Dijele se na karotene i prostorni izgled klorofila b (gore desno) ksantofile. Karoteni su žutonarančaste boje, a ksantofili imaju kisik u hidroksiketo- ili metoksi- grupi i žute su boje. Najpoznatiji karoteni su β-karoten (slika 2.) i likopen. Poznati ksantofili su: lutein, neoksantin, astaksantin, violaksantin i zeaksantin. Uloga im je dvostruka: prijenos energije na klorofil čime se proširuje spektar apsorpcije svjetlosti i zaštita fotolabilnog fotosintetskog aparata od oksidativne destrukcije. 1

4 Slika 2. Strukturna formula β karotena ( preuzeto s ) 2

5 1.1.A SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PIGMENATA PO HOLMU I WETSTTEINU Cilj Odrediti koncentraciju kloroplastnih pigmenata (klorofila a, klorofila b, ukupnih klorofila -a, - b i karotenoida) u acetonskom ekstraktu biljnog materijala te preračunati koncentracije na mg/g svježe tvari. Materijal pribor i oprema: vaga, tarionik i tučak, guč br. 3 ili 4, vakuum pumpa na vodeni mlaz, vakuum boca, epruvete na stalcima, odmjerna tikvica od 25 ml, spektrofotometar, bušač za čepove poznatog promjera (prema potrebi), žlica, škare, menzura od 10 ml biljni materijal: listovi veće površine (0,1 g svježe tvari lista ili narezani listovi odgovarajuće površine) reagensi: aceton; magnezijev karbonat (MgCO 3 ); kvarcni pijesak Način izvođenja vježbe Postupak ekstrakcije i određivanja pigmenata treba izvoditi brzo, u zamračenim uvjetima ili uz difuznu svjetlost zbog fotosenzibilnosti pigmenata. Odvaže se uzorak lista mase 0,1 g ili 0,2 g i prenese u tarionik (mogu se koristiti i kružni isječci poznate površine). Na uzorak se dodaje oko pola žličice kvarcnog pijeska, malo praha MgCO 3 (na vrh noža) radi neutralizacije kiselosti i 10-ak ml acetona. Smjesa lista i dodanih kemikalija izmacerira se tučkom u tarioniku, te se macerat kvantitativno prenosi acetonom na guč postavljen na epruvetu umetnutu u vakuum bocu. Nakon što se macerat profiltrira vakuum pumpom uz ispiranje guča acetonom, filtrat se kvantitativno prenosi u odmjernu tikvicu od 25 ml, koja se nadopunjuje do oznake acetonom. Spektrofotometrom (slika 3) se očitava transmisija u dobivenom filtratu na 662, 644 i 440 nm koristeći aceton kao slijepu probu (transmisija (T) = 100). Slika 3. Spektrofotometar (lijevo); Put kretanja zrake svijetlosti od emisijske lampe preko zrcala i uzorka do detektora (desno) 3

6 Očitana transmisija (T) preračunava se u apsorpciju (A) po jednadžbi: A = 2 - logt Dobivene vrijednosti apsorpcije (A 662, A 644 i A 440 ) uvrštavaju se u Holm-Wetstteinove jednadžbe za izračunavanje koncentracije pigmenata u mg/dm 3 : klorofil a = 9,784 A 662 0,990 A 644 [mg/dm 3 ] klorofil b = 21,426 A 644 4,65 A 662 [mg/dm 3 ] klorofil a+b = 5,134 A ,436 A 644 [mg/dm 3 ] karotenoidi = 4,695 A 440 0,268 (klorofil a+b) [mg/dm 3 ] Brojevi u jednadžbama su molarni apsorpcijski koeficijenti po Holmu i Wetstteinu. Formula za izračun koncentracije pigmenata na mg/g svježe tvari lista (SvT): c1 v r c = m c [mg/g] - masena koncentracija pigmenta izražena u miligramima po gramu svježe tvari lista c 1 [mg/dm 3 ] - masena koncentracija pigmenta izražena u miligramima po decimetru kubnom v [ml] - volumen filtrata (tj. odmjerne tikvice) izražen u mililitrima = 25 ml r - razrjeđenje filtrata m [mg] - odvaga uzorka izražena u miligramima = 100 mg Zbog značajnosti koncentracije i odnosa pojedinih pigmenata, računa se odnos klorofila a i klorofila b, te odnos njihovog zbroja i karotenoida. Vrijednosti treba upisati u tablicu. Rezultati Dobivene vrijednosti koncentracije pigmenata i omjeri kl a/b i kl/kar kl a kl b kl a+b kar koncentracija omjeri u mg/dm 3 pigmenata koncentracija u mg/g SvT kl a/b kl/kar 4

7 1.1.B RAZDVAJANJE PIGMENATA KROMATOGRAFIJOM NA PAPIRU Uvod u vježbu Metoda odjeljivanja zasnovana na različitoj distribuciji smjese tvari koju razdvajamo između mobilne faze (otapala) i neke stacionarne faze fronta nazivamo kromatografija. Ovisno o dvije faze između kojih dolazi do raspodjele smjese tvari koju razdjeljujemo kromatografija može biti na stupcu, kromatografija na papiru, tankoslojna y kromatografija, plinska kromatografija Kromatografija na papiru zasniva se na razdiobi x tvari koju razdjeljujemo (npr. ekstrakt pigmenata) između otapala kao tekuće mobilne faze (npr. smjesa petroletera, acetona i n-propanola) i stacionarne faze krutog adsorbensa (npr. papir). start Kod ovakve kromatografije otapalo se uspinje Slika 4. Kromatografija na papiru uz papir zbog kapilarnih sila samog papira, prenoseći bolje topljive tvari iz smjese dalje od starta. Slabije topljive tvari u smjesi otapalo će sporije otopiti te samim time i prenijeti kraći dio puta. Teško topive tvari će s otapalom prevaliti najmanji dio puta. Mjesto na koje nanosimo uzorak naziva se start, a fronta je mjesto najveće udaljenosti mobilne faze tj. otapala od starta (slika 4). Brzina prolaska tvari po pločici proporcionalan je prevaljenom putu. O brzini prelaska tvari možemo zaključiti iz omjera prijeđenog puta tvari od starta (x) i udaljenosti fronte od starta (y); R= x/y. Cilj Vizualno određivanje pigmenata na kromatografskom papiru. Izračunati R za svaki pigment uočen na kromatografskom papiru nakon razvijanja. Materijal pribor i oprema: kromatografski papir Whatman br.1, mikropipeta, fen, kolona za razdvajanje biljni materijal: acetonski ekstrakt pigmenata (1 g svježe tvari lista ili 25 ml ekstrakta (vidi u vježbi 1.1.A.)) reagensi: otapalo-razdvajač (sastoji se od petroletera, acetona i n-propanola u omjeru 90:10:0,45) Način izvođenja vježbe Razdvajanje pigmenata izvodi se uzlaznom kromatografskom tehnikom na kromatografskom papiru pomoću otapala koje služi kao razdvajač pigmenata. Kromatografski papir se izreže u trake širine 3-5 cm u smjeru valjanja papira. Na donjem kraju trake grafitnom olovkom se označi startna linija (3 cm od donjeg ruba trake) i startno mjesto (jedno startno mjesto u sredini startne linije ili dva startna mjesta na istoj liniji s razmakom 2 cm). Na startno mjesto (ili mjesta) mikropipetom se nanosi 0,1-0,2 ml ekstrakta pigmenata, ali postupno uz sušenje mrlje fenom tako da mrlja ne bude šira od 10 mm. U kolonu za razdvajanje usipa se otapalorazdvajač tako da visina otapala u koloni bude oko 1 cm. Traka kromatografskog papira s nanešenim ekstraktom uroni se donjim rubom u otapalo, a gornji kraj trake učvrsti se pomoću čepa i ostavi stajati minuta na sobnoj temperaturi. Tijekom navedenog vremena otapalorazdvajač se uzdiže po kromatografskoj traci i sobom 5

8 nosi pigmente koji se razdvajaju i ostaju grupirani na 4 različite razine od dna kolone. Redoslijed pigmenata od vrha do dna kromatografske trake je slijedeći (slika 5): 1. karoteni narančaste boje, 2. ksantofili žute boje, 3. klorofil a zatvoreno-zelene boje, 4. klorofil b žuto-zelene boje. Navedeno razdvajanje pigmenata može se obaviti i na kružnom kromatografskom papiru (φ 150 mm) tako da se ekstrakt pigmenata nanese u središte papira, a zatim se od ruba do središta kruga izreže traka širine 1 cm koja će poslužiti za uranjanje u otapalo-razvijač. Otapalo se usipa u Petrijevu zdjelicu nešto manjeg promjera od kromatografskog papira, u otapalo se uroni vrh izrezane trake kružnog papira koji se položi na Petrijevu zdjelicu i poklopi se s drugom zdjelicom istog promjera. Nakon razdvajanja pigmenti će opisivati oko središta papira 4 kružnice (ili elipse) različitih boja. Najmanja će biti kružnica klorofila b, a najveća kružnica karotena. Potrebno je izračunati R za svaki pojedini pigment razdijeljen na kromatografskom papiru. Rezultati karoten ksantofil klorofil a klorofil b linija nanošenja Slika 5. Redoslijed pigmenata razdvojenih kromatografijom na papiru 6

9 1.2. ODREĐIVANJE INTENZITETA FOTOSINTEZE KEMIJSKOM METODOM Uvod u vježbu Gledano sa kemijskog aspekta fotosinteza predstavlja niz reakcija oksidacije i redukcije u kojima se pomoću svjetlosne energije iz niskomolekularnih organskih spojeva (vode i ugljikovog(iv) oksida) u zelenima biljkama sintetizira organska tvar (ugljikohidrati), iz koje se kasnijim procesima resinteze sintetiziraju ostali organski spojevi. Pojednostavljeno, reakcija procesa fotosinteze može se prikazati sljedećom jednadžbom: svjetlost nco 2 + nh 2 O (CH 2 O)n + no 2 Prema tome, kemijska metoda određivanja intenziteta fotosinteze zasniva se na određivanju asimilirane količine ugljika u određenom vremenskom intervalu. Metoda se temelji na razaranju organske tvari biljke jakim oksidansom do CO 2 pri čemu je utrošak oksidacijskog sredstva mjera za određivanje količine ugljika. Razlika u količini ugljika između dva mjerenja tijekom određenog vremenskog intervala preračunava se u intenzitet fotosinteze izražen u mg CO 2 /dm 2 /h. Cilj Određivanje intenziteta fotosinteze analizom asimilirane količine ugljika po lisnoj površini u jedinici vremena. Materijal pribor i oprema: vaga, 2 Erlenmeyer tikvice od 100 ml, 2 staklena lijevka (φ 6 cm), čaše od 500 ml, bireta, pipeta od 10 ml, magnetna miješalica, električno kuhalo, kružni bušači biljni materijal: biljka u punoj fotosintetskoj aktivnosti reagensi: 0,067 M kalijev dikromat (K 2 Cr 2 O 7 ) u conc. sulfatnu kiselinu (H 2 SO 4 ); smjesa conc. sulfatne kiseline (H 2 SO 4 ) i fosfatna kiselina (H 3 PO 4 ) u omjeru 1:1; difenilamin indikator; Mohrova sol (0,1 M FeSO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 6H 2 O); srebrov(ii) sulfat (Ag 2 SO 4 ) Način izvođenja vježbe Izbuše se kružni isječci lista fotosintetski aktivne biljke (4 isječka φ 8-10 mm) i prenesu u Erlenmeyer tikvicu od 100 ml. Pipetom se dodaje 10 ml 0,067 M K 2 Cr 2 O 7 i na vrh noža Ag 2 SO 4. Kao slijepu probu u drugu Erlenmeyer tikvicu bez biljnog materijala dodaje se 10 ml 0,067 M K 2 Cr 2 O 7 i na vrh noža Ag 2 SO 4. Tikvice se zatvore staklenim lijevcima ili zračnim hladilom, te istovremeno zagrijavaju sve tikvice s uzorcima (ili slijepom probom) do ključanja i ostave se da ključaju 5 minuta (istovremeno zagrijavanje neophodno je zbog termičke nestabilnosti K 2 Cr 2 O 7 ). Nakon hlađenja, sadržaj iz tikvica se kvantitativno prenosi u čaše od 500 ml sa ml destilirane vode. U svaku čašu dodaje se 2 ml smjese sumporne i fosforne kiseline, te kapi difenilamin indikatora. Potom se titrira sa 0,1 M Mohrovom soli do prelaska ljubičaste boje u zelenu. Ljubičasta boja obično je vidljiva malo prije točke ekvivalencije, pa se preporučuje titrirati iznad izvora svjetlosti. Zapiše se utrošak Mohrove soli u titraciji, ako je utrošak Mohrove soli u titraciji slijepe probe manji od 20 ml, analizu treba 7

10 ponoviti s manjom količinom organske tvari jer je premalo oksidansa u prethodno izvršenoj analizi. Formula za izračun intenziteta fotosinteze: [ ] X mgc/dm (a b) 0,3 = S 2 a [ml] - utrošak Mohrove soli za titraciju slijepe probe b [ml] - utrošak Mohrove soli za titraciju uzorka 0,3 - faktor preračunavanja za odgovarajuću količinu ugljika faktor za preračunavanje cm 2 u dm 2 S [cm 2 ] - površina isječaka lista uzetih za analizu 100 Za preračunavanje rezultata intenziteta u mg CO 2 /dm 2 množi se s faktorom 44/12, što predstavlja omjer molarne mase CO 2 i atomske mase ugljika. Rezultati 8

11 1.3. MJERENJE INTENZITETA DISANJA PROTOČNOM METODOM Uvod u vježbu Svaka živa, aktivna stanica kontinuirano diše usvajajući kisik i oslobađajući ugljikov(iv) oksid u jednakim količinama. Disanje se može opisati kao proces oksidacije i redukcije organske tvari u kojem se supstrat oksidira do ugljikovog(iv) oksida, a kisik reducira do vode uz oslobađanje kemijske energije. Energija se pohranjuje u energetski bogate spojeve poput ATP, NADH, NADPH, FADH 2 i kao toplinska energija koja se u manjem postotku zadržava u biljci te stimulira stanične procese a u većem postotku oslobađa u atmosferu ili tlo. Kao supstrat za disanje može poslužiti škrob, saharoza i drugi šećeri, lipidi, organske kiseline i iznimno proteini. Uobičajeno disanje u kome se oksidira glukoza predstavlja se jednadžbom: C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O kj Stoga se protočna metoda mjerenja intenziteta disanja zasniva na određivanju oslobođenog ugljikovog(iv) oksida u određenom vremenskom intervalu. Cilj Utvrđivanje intenziteta disanja analizom oslobođenog CO 2 po jedinici mase supstrata u određenom vremenskom intervalu. Materijal pribor i oprema: vaga, električna vakuum crpka, staklena i gumena crijeva, 3 tikvice od 1000 ml sa čepovima, Erlenmeyer tikvica od 200 ml, pipeta od 10 ml, titrator biljni materijal: klijanci (soje, kukuruza, suncokreta, graha) ili svježa tvar lista reagensi: 40% natrijev hidroksid (NaOH); 0.5 M kalijev hidroksid (KOH); 100 g uzorka; 0.1 M kloridne kiseline (HCl); fenolftalein; metiloranž Način izvođenja vježbe zrak s CO 2 zrak bez CO 2 zrak s CO 2 zrak bez CO 2 CO 2 izdvojen disanjem zrak s CO2 crpka 1. plinska ispiralica komora 2. plinska ispiralica Slika 6. Shematski prikaz aparature potrebne za pokus mjerenja intenziteta disanja protočnom metodom Aparatura potrebna za mjerenje intenziteta disanja spoji se kao što prikazuje slika 6. Potrebno je utvrditi da li plinska ispiralica s NaOH dobro pročišćava zrak od CO 2. Dovodna cijev u obje plinske ispiralice mora se uroniti u otopinu (40 % NaOH u prvoj, a predložak s 100 ml 0.5 M 9

12 KOH u drugoj plinskoj ispiralici). Za određivanje intenziteta disanja se u komoru (srednja posuda) stavi 100 g svježe naklijalog sjemena (ili svježe tvari lista), komora se zamrači ako se ispituje fotosintetski aktivni dio biljke. Zrak se provlači kroz cijelu aparaturu pomoću vakuuma kojeg stvara crpka i bilježi se trajanje pokusa (1 sat). Pri tome se odvija slijedeća reakcija: 2KOH + CO 2 K 2 CO 3 + H 2 O Pošto u zraku nema dovoljno CO 2 za potpunu neutralizaciju KOH, u predlošku nakon pokusa preostane i dio KOH. Reakcija neutralizacije je u ekvivalentnim količinama pa je za 10 ml 0.5 M KOH potrebno utrošiti 50 ml 0.1 M HCl. Utrošak HCl za titraciju nakon provedenog pokusa će biti manji jer je jedan dio KOH neutraliziran vezivanjem CO 2. Nastali K 2 CO 3 je dvobazna sol za čiju neutralizaciju se također utroši određena količina HCl-a pa je postupak pri titraciji slijedeći: Odpipetira se 20 ml predloška iz druge plinske ispiralice, dodaje nekoliko kapi indikatora fenolftaleina (otopina postaje ljubičasta, ph između 8,2 i 9,8) i titrirati s 0,1 M HCl dok se otopina ne obezboji. Zabilježi se utrošak HCl. Pri opisanoj titraciji se odvija neutralizacija preostalog KOH a istovremeno prevođenje K 2 CO 3 u KHCO 3. KOH + HCl KCl + H 2 O K 2 CO 3 + HCl KHCO 3 + KCl Obezbojenom predlošku se doda nekoliko kapi metiloranža, indikacija ph između 3,1 i 4,4; (otopina postaje narančasto-žuta) i nastavi titracija s HCl do točke neutralizacije (prelazak boje otopine u ružičastu) te se zabilježi utrošak 0,1 M HCl. Formula za izračunavanje disanja: KHCO 3 + HCl KCl + H 2 O X[mg CO 2 /h/kg] = a 2 (vp/vt) 2,2 (1000/m) a [ml] - utrošak 0.1 M HCl u drugoj titraciji 2 - utrošak HCl iz druge titracije množi se s 2 jer je to pola reakcije neutralizacije nastalog K 2 CO 3, pa se ukupna reakcija može prikazati jednadžbom: K 2 CO 3 + 2HCl CO 2 + H 2 O + 2KCl vp[ml] - volumen predloška 0.5 M KOH prije početka pokusa (100mL) vt[ml] - volumen predloška odpipetiran za titraciju (20 ml) 2,2-1 ml 0.1 M HCl veže 2,2 mg CO 2 budući da je HCl jednobazna, a H 2 CO 3 dvobazna kiselina, vrijedi: 1 dm 3 1 M HCl se iskoristi za dobivanje 0.5 M CO 2 = 22 g CO 2 1 cm 3 (ml) 0.1 M HCl se iskoristi za dobivanje 0.05 mm CO 2 = 2.2 mg CO za preračunavanje g u 1 kg m[g] - početna masa biljne tvari (100 g) 10

13 Rezultati 11

14 1.4. IZOLACIJA PROTEINA IZ BILJNOG MATERIJALA Uvod u vježbu Pored celuloze proteini čine glavne strukturne polimere biljnih stanica i tkiva. Unatoč velikoj raznovrsnosti količina proteina u biljnim tkivima relativno je niska, što predstavlja dodatni izazov pri njihovoj izolaciji. Pojam izolacije obuhvaća sve radnje kojima se koristimo prigodom prevođenja proteina iz njihova prirodnog okružja u otopinu. Kemijske metode kojima se uobičajeno koristimo za izolaciju organskih tvari ne mogu se primijeniti pri izolaciji proteina jer su oni osjetljivi na toplinu, kiseline, lužine, organska otapala i zračenje. Iako je era proteomike donijela veća poboljšanja u pogledu primjene tehnika i metoda u izolaciji proteina, još nije moguće preporučiti jedinstvenu metodu kojom bi se izvršila izolacija svih proteina. Prigodom izbora metode za izolaciju proteina iz biljnog tkiva susrećemo se s određenim problemima koje svakako moramo uzeti u obzir, a neki su od njih navedeni u daljnjem tekstu. Biljne stanice sadrže krutu staničnu stjenku pa je prvi korak u izolaciji razbijanje biljnog materijala radi izdvajanja staničnog sadržaja. To se uglavnom postiže mehaničkim postupcima kojima se biljno tkivo usitnjava korištenjem različitih miksera, mješača ili rezača. Čest je postupak da se svježe biljno tkivo prelije tekućim dušikom i usitni trenjem u tarioniku. Pri usitnjavanju i homogeniziranju uzorka također se može upotrijebiti kvarcni pijesak ili drugo abrazivno sredstvo. Kako se pri mehaničkom razbijanju uzorka razvija toplina, cjelokupan se postupak uglavnom izvodi pri temperaturama između 0 i +4 C kako bi se spriječila denaturacija proteina. Sljedeći postupak u izolaciji jest ekstrakcija proteina usitnjenog uzorka korištenjem pogodnog ekstrakcijskog pufera. Pri izboru pufera treba obratiti posebnu pozornost na vrstu proteina i svrhu zbog koje se izolacija vrši (npr. određivanje koncentracije proteina, pročišćavanje proteina i sl.). Dobar ekstrakcijski pufer trebao bi također biti primjenjiv s obzirom na različitu prisutnost velikog broja sekundarnih staničnih metabolita kako između biljnih tkiva (list, stabljika, korijen, sjeme i plod) tako i između različitih biljnih vrsta. Općenito se za pripremu sirovog ekstrakta biljnih proteina može upotrijebiti fosfatni ili Tris pufer određene ph vrijednosti i ionske jakosti. Zbog prisutnosti uglavnom serinskih proteaza u uzorku biljnoga tkiva, puferu se dodaje fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF) koji inhibira njihovu aktivnost, čime se sprječava razgradnja proteina. Dodatak polivinilpolipirolidona (PVPP) ekstrakcijskom puferu također se često koristi za sprječavanje interakcije velikog broja fenolnih i polifenolnih spojeva s proteinima i time štiti njihova nativna struktura. U posljednjem koraku izolacije proteina, homogenat se najčešće centrifugira radi odvajanja netopljivih dijelova stanica od otopine. Supernatant dobiven centrifugiranjem predstavlja sirovi ekstrakt proteina i služi za daljnju analizu i obradu. Cilj Upoznati se s biokemijskim metodama izolacije proteina. Prirediti sirovi ekstrakt proteina iz biljnog materijala. 12

15 Materijal pribor i oprema: vaga, tarionik, posuda s ledom, stakleni lijevak, pipeta od 5 ml, škare, analitička vaga kiveta za centrifugiranje, centrifuga, biljni materijal, kvarcni pijesak biljni materijal: list biljke reagensi: PBS pufer (Phosphate buffer saline): priređuje se otapanjem 800 mg NaCl, 20 mg KCl, 140 mg Na 2 HPO 4 i 24 mg KH 2 PO 4 u 0,1 L dh 2 O. Prije upotrebe podesiti puferu ph vrijednost na 7,4. Način izvođenja vježbe Priprema sirovog ekstrakta biljnih proteina: Odvagati 2 g biljnog materijala, škarama ga usitniti na manje komade i prenijeti u tarionik (hlađen na ledu). Usitnjeni materijal homogenizirati u tarioniku uz dodatak kvarcnoga pijeska i 2 ml hladnoga ekstrakcijskog pufera (pufer dodavati u 3 porcije, a zadnjom isprati tarionik). Ovako pripremljen homogenat kvantitativno preliti u praznu kivetu za centrifugiranje i centrifugirati pri 5.000xg, 15 minuta na 4 C. Dobiveni supernatant (sirovi ekstrakt) pažljivo dekantirati u čistu epruvetu i koristiti za određivanje koncentracije proteina Lowry metodom. *PBS (Phosphate buffer saline) Pitanja 1. U koje svrhe koristimo izolaciju proteina? 2. Kada je važno izolaciju proteina obavljati pri niskim temperaturama? 3. Koja je uloga ekstrakcijskog pufera pri izolaciji proteina? 4. O čemu ovisi izbor ph vrijednost ekstrakcijskog pufera? 5. Kako bi ste u nedostatku centrifuge odvojili netopivi dio homogenata od otopine? 13

16 1.5. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA Uvod u vježbu Postoji više metoda i postupaka za određivanje koncentracije proteina, a izbor metode može ovisiti o vrsti materijala i količini uzorka te koncentraciji proteina u uzorku. Najčešće korištene metode za određivanje koncentracije proteina u sirovom nepročišćenom ekstraktu jesu Biuret metoda, Lowry metoda i Bradford metoda. Određivanje koncentracije proteina ovim metodama temelji se na vezanju specifičnoga bojenog reagensa na molekulu proteina. Pritom dolazi do pomaka apsorpcijskoga maksimuma boje vezanog reagensa u odnosu na apsorpcijski maksimum boje nevezanog reagensa. Intenzitet nastale boje pod određenim uvjetima slijedi Lambert-Beerov zakon te je proporcionalan koncentraciji proteina. Kod navedenih kolorimetrijskih metoda koncentracija proteina ovisna je o broju i sastavu aminokiselina, te ovakva mjerenja zahtijevaju primjenu standarda. Kao standard koristi se protein koji je po sastavu jednak ili sličan proteinu koji se analizira. Biuret metoda: Ovom se metodom prvenstveno dokazuje prisutnost peptidne veze. Naziv je dobila po kondenzacijskom produktu dviju molekula uree - biuretu, koji također daje pozitivnu reakciju. Metoda se temelji na osobini peptidne veze da u alkalnoj otopini tvori kompleks s ionima Cu 2+, slika 7. Nastali je kompleks ljubičaste boje s apsorpcijskim maksimumom pri 540 nm. Osim što je točna i vrlo ponovljiva, glavna je prednost ove metode u tome što je manje osjetljiva na vrstu proteina koji se određuje. Metoda je prikladna za analizu otopina proteina u koncentracijama između 1,0 i 10 mg/ml. Lowry metoda: Metoda kombinira reakciju bakrovih iona s peptidnim vezama u alkalnoj otopini (Biuret metoda) i reakciju redukcije Folin-Ciocalteau reagensa (smjesa molibdata i volframata) s fenolnom skupinom tirozina i triptofana dajuću plavo-ljubičasto obojenje. Koncentracija se proteina određuje pri valnoj duljini od 750 nm, kada se Slika 7. Kompleks peptidnih veza i iona Cu 2+ postiže maksimum apsorpcije reduciranog oblika Folin-Ciocalteau reagensa. Ova je metoda osjetljivija u odnosu na prethodnu, a prikladna je za određivanje proteina u koncentracijama između 0,01 i 1,0 mg/ml. Bradford metoda: Ova se metoda često koristi zbog jednostavne priprema reagensa, brzog razvijanja boje i niskoga praga osjetljivosti. Pokazala se osobito praktičnom prigodom određivanja koncentracije proteina u sadržaju određene stanične frakcije kao i pri procjeni količine proteina potrebne za gel elektroforezu. Metoda se temelji na pomaku apsorpcijskoga maksimuma slobodne boje Coomassie Brilliant Blue G-250 (slika 8) valne duljine 465 nm na 595 nm prilikom njezina vezanja na protein. Donji prag osjetljivosti ove metode iznosi 0,5 µg/ml proteina. 14

17 Slika 8. Strukturna formula Coomassie Brilliant Blue G

18 1.5.A ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA LOWRY METODOM Cilj Upoznati se s kolorimetrijskom metodom određivanja koncentracije proteina Lowry metodom, načinom izrade i uporabom baždarnoga dijagrama. Prirediti standardni niz otopina, izraditi baždarni dijagram i odrediti koncentraciju proteina. Materijal pribor i oprema: 7 odmjernih tikvica od 100 ml, 8 epruveta, pipete od 1, 5, 10 i 20 ml, stakleni lijevak, kolorimetar ili spektrofotometar biljni materijal: list biljke reagensi: Reagens A: 2% Na 2 CO 3 u 0,1 mol/l NaOH; Reagens B: 0,5% CuSO 4 x 5H 2 O u 1% K Na-tartaratu 1 ; Alkalni reagens : priprema se miješanjem 50 ml reagensa A s 1mL reagensa B 2 ; Folin-Ciocalteu reagens : kupovni reagens razrijediti destiliranom vodom u omjeru 1:1; Standardna otopina albumina goveđeg seruma (BSA) koncentracije 0,2 mg/ml; Sirovi ekstrakt proteina iz biljnog materijala (razrijeđen s dh 2 O u omjeru 1:100) Način izvođenja vježbe Potrebno je pripremiti sedam odmjernih tikvica od 100 ml i označiti ih: S 0, S 5, S 10, S 20, S 40, S 60 i S 100. Za pripremu razrjeđenja standardne otopine BSA potrebno je odpipetirati količine navedene u tablici 1. Tablica 1. Priprema standarda otopine BSA Oznaka odmjerne tikvice S o S 5 S 10 S 20 S 40 S 60 S 100 ml BSA (0,2 mg ml -1 ) ml dh 2 O Koncentracija BSA mg ml -1 Potrebno je izračunati koncentracije BSA u svakom pojedinom standardu i podatke upisati u posljednji red tablice. Za pripremu standardnog niza priprema se osam čistih epruveta te ih se označi: S 0, S 5, S 10, S 20, S 40, S 60, S 100 i U. Iz svake odmjerne tikvice (oznaka S 0, S 5, S 10, S 20, S 40, S 60 i S 100 ), pipetira se po 1 ml otopine i dodaje u pripadnu epruvetu (oznaka S 0, S 5, S 10, S 20, S 40, S 60 i S 100 ). Usporedno s pripremom standardnog niza, iz odmjerne tikvice uzorka pipetira se 1 ml otopine i dodaje u praznu epruvetu s oznakom U. U svaku epruvetu potom dodaje se 5 ml alkalnog reagensa, sadržaj se promućka i smjesa ostavi 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon 15 minuta u svaku epruvetu dodaje se 0,5 ml Folin-Ciocalteau reagensa, smjesa se dobro promućka i ostavi 15 min. na sobnoj temperaturi kako bi se razvila boja 3. Nakon razvijanja boje na kolorimetru (uz korištenje crvenog filtra) ili spektrofotometru (λ 750 nm) očitava se vrijednost apsorbancije za sadržaj svake epruvete standardnog niza i uzorka. Za baždarenje uređaja upotrjebljava se slijepa proba (epruveta s oznakom S 0 ). 16

19 Rezultati Na osnovi dobivenih vrijednosti apsorbancije uzoraka standardnog niza i poznatih koncentracija BSA izraditi baždarni dijagram s pravcem. Vrijednost ekstinkcije uzorka (epruvetu s oznakom U) ucrtati na koordinatu baždarnoga dijagrama te preko baždarnoga pravca očitati koncentraciju proteina u uzorku. Izračunati ukupnu količinu proteina u biljnom ekstraktu i rezultat izraziti u mg proteina po gramu svježega biljnog materijala. Pitanja: 1. Na temelju kojeg zakona se vrši kolorimetrijsko određivanje koncentracije proteina? 2. Zašto kolorimetrijsko mjerenje koncentracije proteina zahtjeva upotrebu standarda? 3. Što je standardni niz? 4. Zašto se u našem slučaju sirovi ekstrakt razrjeđuje prije mjerenja koncentracije proteina? 5. Što bi ste učinili sa sirovim ekstraktom ukoliko ima nisku (kolorimetrijski nemjerljivu) koncentraciju proteina? 1 Pripremiti svježu otopinu reagensa B 2 Otopinu alkalnog reagensa pripremiti neposredno prije pipetiranja. 3 Kiseli Folin-Ciocalteau reagens je nestabilan u jako lužnatoj otopini (alkalni reagens) te se mora brzo dodati i dobro promućkati. 17

20 1.6. SADRŽAJ UKUPNIH KISELINA U VOĆU Uvod u vježbu U pokazatelje kakvoće voća (plodova) ubraja se i ukupan sadržaj kiselina. Kiselost voćnih plodova čine organske kiseline kao što su limunska ili jabučna. One se nalaze u voćnom soku kao slobodne ili u obliku soli. Određivanje kiselosti se vrši titracijom s otopinom NaOH, uz fenolftalein kao indikator. Cilj Utvrditi sadržaj ukupnih kiselina u plodu voća. Materijal pribor i oprema: pribor za maceraciju tkiva (keramički tarionik s tučkom, mikser ili sl.) 1 Erlenmeyerova (EM) tikvica s brušenim grlom od 250 ml, 1 Erlenmeyerova (EM) tikvica s neubrušenim grlom od 250 ml, 1 odmjerna tikvica od 250 ml, stakleni lijevak za filtriranje, filter-papir, bireta ili titrator, vodena kupelj, magnetna miješalica i stirer, povratno hladilo, pipeta od ml, menzura do 250 ml, odmjerne tikvice od 250 ml, vaga biljni materijal: uzorci svježeg ili zamrznutog ploda voća (jabuke, jagode, grožđe i dr.) reagensi: 0,1 M otopina natrijavog hidroksida (NaOH) poznatog faktora (točne koncentracije), fenolftalein Način izvođenja vježbe Odvagati 25 g usitnjenog i homogeniziranog uzorka ploda u EM tikvicu s brušenim grlom od 250 ml, dodati 150 ml destilirane vode. Sadržaj miješati na magnetnoj miješalici dok tekućina ne bude homogena. Tikvicu spojiti s povratnim hladilom i zagrijavati na vodenoj kupelji 30 min. Ohlađeno kvantitativno prenijeti u odmjernu tikvicu od 250 ml, te nadopuniti s dest. vodom do oznake i promućkati. Filtrirati kroz naborani filter-papir u EM tikvicu od 250 ml. Ovisno o očekivanoj kiselosti odpipetirati ml u odgovarajuću EM tikvicu i titrirati s 0,1 M NaOH poznatog faktora, uz fenolftalein kao indikator, do pojave svijetlo ružičaste boje u trajanju od najmanje 30 sek. Volumen NaOH utrošenog za titraciju se zabilježi, te se izračuna sadržaj ukupnih kiselina. Ukupne kiseline (kiselost, mmol/100 g ploda) = (250/m) * V 1 * C * (100/V 0 ) V 0 [ml] - volumen uzorka V 1 [ml] - volumen NaOH utrošen za titraciju C [mol/l] - točna koncentracija otopine NaOH m [g]- odvagana masa ploda za analizu 18

21 Rezultati Literatura Generalić, I., Skroza, D., Katalinić, V. (2009.): Skripta za vježbe iz kolegija: Kemija mediteranskog voća i tehnologija prerade. Zavod za prehrambenu tehnologiju i biotehnologiju, Kemijsko-tehnološki fakultet Sveučilišta u Splitu. Str

22 1.7. ODREĐIVANJE SADRŽAJA REDUCIRAJUĆIH ŠEĆERA U PLODOVIMA Uvod u vježbu Saharoza je disaharid čijom hidrolizom (inverzijom) nastaje jedna molekula glukoze i jedna molekula fruktoze, koje se zajedničkim imenom nazivaju invertni šećeri. Saharoza u svojoj molekuli nema slobodnu aldehidnu grupu, te kao takva ne može reducirati Fehlingovu otopinu, na čemu se zasniva metoda određivanja šećera. Reducirajući šećeri su svi šećeri, koji imaju keto ili aldehidnu funkcionalne skupine, kao što su glukoza i fruktoza te pentoze. Cilj Utvrditi sadržaj reducirajućih šećera u plodu voća. Materijal pribor i oprema: pribor za maceraciju tkiva (keramički tarionik s tučkom, mikser ili sl.), vodena kupelj, magnetna miješalica i stirer, kuhalo, bireta ili titrator, vaga, odmjerne tikvice 200 ml, 3 Erlenmeyerove (EM) tikvice od 250, 300 i 500 ml, povratno hladilo, stakleni lijevak, naborani filter-papir, odgovarajuće pipete, vaga, staklene kuglice biljni materijal: uzorci svježeg ili zamrznutog ploda voća (jabuke, jagode, grožđe i dr.) reagensi: 3 M otopina sulfatne kiseline (H 2 SO 4 ); 0,1 i 1 M otopina natrijevog hidroksida (NaOH); 0,1 M otopina kloridne kiseline (HCl); Luffov reagens, otopine Carrez I i Carrez II; 0,1 M otopina natrijeva tiosulfata (Na 2 S 2 O 3 ) ; 0,1% otopina škroba; 30% otopina kalijevog jodida (KJ); 30% otopina fenolftaleina; kalcijev karbonat (CaCO 3 ) Način izvođenja vježbe Odvagati 10 g usitnjenog i homogeniziranog uzorka ploda u EM tikvicu od 250 ml, dodati 100 ml destilirane vode, promiješati i grijati na vodenoj kupelji min. Ohlađeno kvantitativno prenijeti u odmjernu tikvicu od 200 ml, dodati 1-2 g CaCO 3, 5 ml Carrez I i 5 ml Carrez II, nadopuniti s dh 2 O do oznake i promućkati. Ostaviti da se istaloži nakon čega filtrirati u suhu EM tikvicu od 300 ml. U EM tikvicu od 500 ml odpipetirati 25 ml Luffove otopine, 10 ml prethodno dobivenog filtrata uzorka i 15 ml dest. vode. Dodati staklene kuglice i zagrijavati direktno na plamenu do vrenja, nakon čega kuhati 10 min uz povratno hladilo, na azbestnoj mrežici. Ohladiti pod vodenim mlazom, dodati 10 ml otopine KJ i oprezno 25 ml otopine H 2 SO 4. Nakon toga titrirati s Na 2 S 2 O 3 dok boja ne postane žuta. Dodati nekoliko ml otopine škroba i nastaviti titraciju do potpunog nestanka plave boje. Paralelno treba raditi slijepu probu, s 25 ml dest. vode umjesto filtrata iz plodova uzetih za analizu. Volumen Na 2 S 2 O 3 utrošenog za titraciju zabilježiti, te izračunati sadržaj reducirajućih šećera. Sadržaj reducirajućih šećera (prirodnog inverta) = X * 100 / mg uzorka u alikvotu X [mg] - miligrami prirodnog inverta, očitani iz tablice 2, prema razlici utroška Na 2 S 2 O 3 između slijepe probe i uzorka mg uzorka u alikvotu (ako se izvaže 10 g uzorka i razrijedi na 200 ml otopine te se uzme 10 ml alikvota) 20

23 Rezultati Tablica 2. Vrijednosti prema Luff-Schoorlovom reagensu: 0,1 mol/l (Na 2 S 2 O 3 ) ml Glukoza, fruktoza, invertni šećeri C 6 H 12 O 6 (X)mg razlika 1 2,4 2 4,8 2,4 3 7,2 2,4 4 9,7 2,5 5 12,2 2,5 6 14,7 2,5 7 17,2 2,5 8 19,8 2,6 9 22,4 2, ,0 2, ,6 2, ,3 2, ,0 2, ,7 2, ,5 2, ,3 2, ,2 2, ,1 2, ,0 2, ,0 3, ,0 3, ,1 3, ,2 3,1 Literatura bnim_sirupima_nn_174_04.doc 21

24 1.8. SPEKTROSKOPSKO ODREĐIVANJE UKUPNIH ANTOCIJANINA PO METODI EKSTRAKCIJE UZ RAZLIČIT ph Uvod u vježbu Crveno-ljubičasta boja biljnog tkiva (listovi, plodovi, peteljke, latice, korijen) kod različitih vrsta voća, povrća, cvijeća i ratarskih usjeva potječe uglavnom od grupe vodotopljivih flavonoidnih spojeva antocijanina, akumuliranih u vakuolama stanica, slika 9. Slika 9. Specifično antocijansko obojenje listova, plodova i latica različitih biljnih vrsta Svojstvo obojenosti u velikoj mjeri utječe na prihvatljivost biljnih proizvoda od strane potrošača i njihovu tržišnu vrijednost. Također, potencijalna zdravstveno-promotivna svojstva antocijanina poput zaštite od slobodnih radikala, dakle njihova antioksidacijska svojstva, čine ih sve interesantnijim biljnim funkcionalnim komponentama. Akumulacija antocijanina u vegetativnim dijelovima biljaka je često pokazatelj reakcije biljke na stres uvjetovan okolišnim činiteljima, poput nedostatka dušika i fosfora. Sinteza antocijanina u biljkama polazi od fenilalanina te je poznato više od 550 antocijanina (2006. godina). Analiza sastava antocijanina nije moguća bez HPLC i MS tehnike, dok se njihov ukupan sadržaj može odrediti spektrofotometrijski na 510 nm te izraziti kao mg cijanidin-3-glukozid klorida u kg svježe mase biljnog tkiva. Metoda se temelji na strukturalnoj razlici antocijanina pri različitoj ph vrijednosti medija (pri ph 1,0 su obojeni, pri ph 4,5 bezbojni), uslijed čega pokazuju različitu apsorpciju svjetlosti valne duljine 510 nm. 22

25 Materijal pribor i oprema: vaga, tekući dušik s priborom za maceraciju (keramički tarionik s tučkom), vortex, centrifuga s hlađenjem, spektrofotometar sa staklenim kivetama, analitička vaga, odgovarajuće pipete i odmjerne tikvice, plastične epruvete od 15 ml s čepom biljni materijal: uzorci svježeg ili zamrznutog biljnog tkiva (list, latice, plod i dr.) reagensi: pufer I: ph 1,0 (10 ml po uzorku; 125 ml 0,2 M KCl i 375 ml 0,2 M HCl); pufer II: ph 4,5 (10 ml po uzorku; 400 ml 1 M CH 3 COONa, 240 ml 1 M HCl i 360 ml deionizirane H 2 O) Način izvođenja vježbe Nekoliko grama biljnog tkiva (3-5 g) se tekućim dušikom macerira do finog praha, nakon čega se odmah odvaže po 0,5 g u posebno označene dvije plastične epruvete od 15 ml. U jednu se dodaje 10 ml pufera I a u drugu isti volumen pufera II. Nakon homogenizacije vorteksiranjem (10-tak sekundi), obje suspenzije se centrifugiraju dva puta po 15 minuta na 5000 G pri 4 o C. Supernatanti se koriste za mjerenje apsorpcije na 510 nm, koristeći čiste pufere kao slijepe probe. Formula za izračun ukupnog sadržaja antocijanina: ANT (mg/kg svježe mase) = (A ph 1,0 - A ph 4,5 ) x (484,8/24 825) x ANT[mg/kg] - sadržaj antocijanina u mg po kg svježe mase biljnog tkiva A ph 1,0 apsorpcija u uzorku s puferom I A ph 4,5 apsorpcija u uzorku s puferom II 484,8 molekularna masa cijanidin-3-glukozid klorida molarni apsorpcijski koeficijent cijanidin-3-glukozid klorida faktor za preračunavanje na mg/kg svježe mase Rezultati Literatura Lee, J., Durst, R.W., Wrolstad, R.E., Barnes, K.W., Eisele, T., Giusti, M.M., Haché, J., Hofsommer, H., Koswig, S., Krueger, D.A., Kupina, S., Martin, S.K., Martinsen, B.K., Miller, T.C., Paquette, F., Ryabkova, A., Skrede, G., Trenn, U., Wightman, J.D. (2005): Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by the ph differential method: Collaborative study. Journal of AOAC International, Vol. 88(5): R. Lo Scalzo, A. Genna, F. Branca, M. Chedin and H. Chassaigne (2008): Anthocyanin composition of cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis) and cabbage (B. oleracea L. var. capitata) and its stability in relation to thermal treatments. Food Chemistry, Vol. 107(1):

26 2. FIZIOLOGIJA MINERALNE ISHRANE BILJAKA 2.1. RAZARANJE I ANALIZA ELEMENTARNOG SASTAVA BILJNE TVARI Uvod u vježbu Mineralne tvari (biogeni mineralni elementi: P, K, Ca, Mg, S, Fe, Cu, Zn, Mn, B...) čine mali dio ukupne suhe tvari biljke, svega oko 3%. Stupaju u različite fiziološke procese poput osmoregulacije, aktivacije pojedinih enzima, biološke katalize, prenošenje elektrona Zbog toga su vrlo velikog fiziološkog i praktičnog značenja za biljku. Temelj kemijske analize mineralnog sastava biljne tvari čini priprema osnovne otopine uzorka (oksidacijom biljne tvari razaranjem ili spaljivanjem) i određivanja koncentracije elemenata u osnovnoj otopini. Zbog različitih koncentracija može se posebno pripremati osnovna otopina za analizu različitih elemenata (mikroelementi: Fe, Zn, Mn, Cu i toksični elementi: Hg, Pb, Cd, As kojih ima u vrlo malim količinama s obzirom na zastupljenost mineralnih makroelemenata: P, K, Ca ). Postoji više različitih načina razaranja biljne tvari, koji se primjenjuju ovisno o elementima koje će biti analizirani, vrsti biljnog materijala i dostupnosti opreme. Cilj Odrediti sadržaj mineralnih elemenata biljne ishrane. Materijal pribor i oprema: vaga, kivete za razaranje (staklene za razaranje na bloku, teflonske za razaranje u mikrovalnoj peći), stakleni lijevci, odmjerne tikvice od 100 ili 50 ml, filter-papir, 2 staklene pipete od 25 ml i propipeta (za razaranje na bloku), automatska pipeta od 10 ml (za razaranje u mikrovalnoj peći), boca špricalica, plastične bočice od 100 ml biljni materijal: osušeni samljeveni uzorak biljne tvari bilo kojeg dijela biljke reagensi: za suho spaljivanje: conc. nitratna kiselina (HNO 3 ); ekstrakcijska smjesa (0.05 M HCl M H 2 SO 4 ) za mokro spaljivanje na bloku: conc. vodikov peroksid (H 2 O 2 ), smjesa za razaranje (4% HClO 4 u H 2 SO 4 ) za razaranje u mikrovalnoj peći: conc. vodikov peroksid (H 2 O 2 ), conc. nitratna kiselina (HNO 3 ) 24

27 Način izvođenja vježbi Suho spaljivanje: 1.0 g suhe biljne tvari zagrijava se 4 sata na 500 C u peći za žarenje (slika 10), te se ohladi. U odmjernu tikvicu se doda 1 ml conc. HNO 3, zatim se u istu tikvicu ekstrakcijskom smjesom (0.05 M HCl M H 2 SO 4 ) prenosi pepeo i istom smjesom dopuni do 100 ml. Mokro spaljivanje: Na 1.0 g suhe biljne tvari doda se 5 ml conc. HNO 3 i 2 ml conc. H 2 SO 4 te se zagrijava iznad plamenika do prestanka stvaranja bijele pare. Ohlađeni uzorak se u odmjernoj tikvici nadopuni do 100 ml smjesom kiselina (0.05 M HCl M H 2 SO 4 ). Slika 10. Peć za žarenje Mokro spaljivanje (II. metoda): Na 1 do 2 g suhe biljne tvari doda se 5 ml smjese za razaranje (4% HClO 4 u H 2 SO 4 ). Nakon toga uzorak se prelije sa 10 ml conc. H 2 O 2 i stavi na blok za razaranje. Uzorak sa smjesom kiselina i vodikovim peroksidom se zagrijava na bloku za razaranje (slika 11) pri temperaturi od C oko sat vremena (ovisno o vrsti razaranog biljnog materijala) do gubitka boje i potpunog razbistravanja. Ako uzorak nakon razaranja bude i dalje mutan prema potrebi se dodaje od 5-10 ml vodikovog peroksida i razara još dodatnih min. Ohlađeni uzorak se kvantitativno prenosi u odmjernu tikvicu od 25, 50 ili 100 ml ispirući Slika 11. Blok za razaranje deioniziranom vodom te se nadopuni istom vodom do oznake. Prilikom suhog spaljivanja mogućnost kontaminacije uzorka je veća kao i stvaranje teže topivih oksida željeza i mangana tijekom žarenja, stoga valja dati prednost metodi mokrog spaljivanja. Ako se iz matične otopine žele daljnjim analizama odrediti elementi u tragovima ili teški metali tada je prikladnije raditi po metodi razaranja mikrovalovima, jer se neki elementi, poput selena, prilikom razaranja na bloku gube isparavanjem već pri temperaturama od oko 200 C. 25

28 Razaranje mikrovalovima: U teflonske kivete odvaže se 1 g suhe biljne tvari, te prelije sa 8-10 ml koncentrirane HNO 3 i 2-4 ml koncentriranog H 2 O 2. Kivete se hermetički zatvore i umetnu u za njih predviđeno kružno postolje koje se postavi u mikrovalnu peć (slika 12). Biljni materijal se razara pod tlakom od 180 psi u trajanju od 20 min. Ohlađeni uzorak se kvantitativno uz ispiranje deioniziranom vodom prelijeva u odmjerne tikvice od 25, 50 ili 100 ml i nadopuni vodom (dh2o) do oznake. Slika 12. Mikrovalna peć za razaranje Određivanje koncentracije mineralnih elemenata AAS-om i ICPS-om: Koncentracije mineralnih elemenata u osnovnoj otopini određuju se apsorpcijskom i/ili emisijskom tehnikom pomoću AAS-a (atomskog apsorpcijskog spektrofotometra; slika 13) ili emisijskom tehnikom pomoću ICPS-a (plazme; slika 14). Za mjerenje je potrebno pripremiti koncentracijski niz standardnih otopina poznatih koncentracija elemenata koje želimo analizirati, te njima kalibrirati AAS ili ICPS. Rezultati koje očitavamo s AAS-a ili ICPS-a izraženi su u µg/ml ili mg/l (prijašnje oznake ppm) i označavaju koncentraciju ispitivanog elementa u osnovnoj otopini. Očitane vrijednosti koncentracije analiziranih elemenata nakon mjerenja, preračunavaju se u koncentraciju elemenata u µg/g ili g/kg suhe tvari biljke. Slika 13. AAS analizator - atomski adsorpcijski spektrofotometar Slika 14. ICPS analizator plazma 26

29 Formula za izračunavanje koncentracije mineralnih elemenata u analiziranom uzorku biljne tvari: X [ µ g / g] = c v m X[µg/g] - koncentracija ispitivanog elementa u uzorku suhe tvari biljke c [µg/ml] - masena koncentracija ispitivane otopine uzorka (očitanje s AAS-a) v [ml]- volumen osnovne otopine m [g] - odvaga suhe tvari biljke za analizu Rezultati 27

30 2.2. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE FOSFORA U SUHOJ TVARI BILJAKA Uvod u vježbu Biljke usvajaju fosfor iz tla najvećim dijelom kao jednovalentni fosfatni anion (H 2 PO 4 - ; dihidrogen fosfat) ili dvovalentni anion (HPO 4 2- ; hidrogen fosfat). Za razliku od dušika i sumpora, fosfor ne podliježe redukciji u biljkama već ostaje u obliku fosfata u slobodnom obliku ili organski vezan u esterima. Fosfat je lako pokretljiv u biljnom organizmu, esencijalan je dio fosfatiziranih šećera koji sudjeluju kao metaboliti u procesima fotosinteze, disanja i drugih metaboličkih procesa, u sastavu je nukleotida koji čine DNA i RNA te fosfolipida u sastavu biomembrana. Nezamjenjiva uloga ovog makroelementa je u brojnim transformacijama tvari i energije u stanici, gdje sudjeluje u obliku spojeva bogatih energijom poput ATP i sl. Određivanje koncentracije fosfora se u načelu vrši spektrofotometrijski, na temelju specifične apsorpcije svjetlosti (725 nm) u plavo obojenom fosfor-molibdatskom kompleksu. Cilj Odrediti koncentraciju fosfora u suhoj tvari biljnog materijala, prethodno razorenog uz pomoć smjese kiselina i vodikovog peroksida. Materijal pribor: spektrofotometar sa staklenim kivetama, odmjerne tikvice od 100 ml, odgovarajuće pipete (1-10, 5 i 10 ml) biljni materijal: suha tvar biljaka (nadzemni dijelovi ili korijen) dobivena sušenjem na 105 o C ili matična otopina uzorka biljne tvari razorena mokrim postupkom (pogledaj vježbu 2.1.) reagensi: 5% amonijev molibdat (5 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 x 4H 2 O se otopi u 80 ml destilirane vode, doda 2,8 ml koncentrirane sulfatne kiseline i dopuni do 100 ml destiliranom vodom); 11% natrij sulfit (Na 2 SO 3 ); 0,5% hidrokinon; osnovni standard za fosfor (0,4394 g KH 2 PO 4 se otopi u 1 L destilirane vode. Način izvođenja vježbe Priredi se serija standardnih otopina poznate koncentracije fosfora tako da se u odmjerne tikvice od 100 ml prenese 0, 1, 2, 3, 4, 5 i 6 ml osnovnog standarda (koncentracija 0-6 µg P/mL). Od matične otopine uzorka u kojem se određuje koncentracija fosfora pipetom se prenese 10 ml u odmjernu tikvicu od 100 ml. U sve tikvice (standardi i uzorci) doda se oko 50 ml destilirane vode, 5 ml amonijevog molibdata, po 1 ml natrijevog sulfita i hidrokinona i dopuni destiliranom vodom do 100 ml. Tikvice se začepe i promućkaju te ostave da se razvije boja tijekom 1 h u mraku. Nakon toga se spektrofotometrom mjeri apsorpcija na 725 nm te pomoću kalibracijskog dijagrama ili kompjuterskog programa za izračun koncentracije na temelju serije standarda, izračuna koncentracija fosfora u µg/ml otopine, odnosno preračunavanjem na odvagu suhe tvari uzorka uzetu za dobivanje matične otopine, u % na suhu tvar analiziranog biljnog materijala. 28

31 Postotak fosfora treba prema sljedećoj jednadžbi: % P= ( c *( )) * 10 v m c [µg/ml] - koncentracija P v [ml] - alikvot matične otopine (10 ml) m [g] - odvaga suhe tvari uzorka u 100 ml matične otopine Rezultati 29

32 2.3. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE DUŠIKA U BILJNOM MATERIJALU Uvod u vježbu Aparat za određivanje koncentracije (slika 15) dušika sastoji se od dvije međusobno povezane jedinice: destilacijske jedinice i titratora. Određivanje koncentracije dušika temelji se na istiskivanju dušika u obliku amonijaka (NH 3 ) iz uzorka jakom bazom u predložak kiselinom poznate koncentracije i ph vrijednosti. Natrijev hidroksid istikuje dušik iz uzorka u obliku amonijaka (NH 3 ), u plinovitom stanju. Prolazom kroz hladilo plinoviti oblik amonijaka prelazi u tekući, te kaplje u predložnu čašicu u kojoj se Slika 15. Aparatura za određivanje sadržaja dušika. A) 30% NaOH; B) deh 2 O; C) 2% H 3 BO 3 ; D) kiveta sa uzorkom; E) predložak; F) hladilo; G) titrator sa ph sondom nalazi borna kiselina. U reakciji borne kiseline i amonijaka nastaje njihova kompleksna sol, a ph vrijednost raste. ph vrijednost ne smije porasti preko 7 jer bi se u protivnom amonijak gubio isparavanjem. Generiranjem vodene pare, uzorak ključa otprilike 4-5 min. te titrator počinje sa titracijom otopine u predlošku s 0,25 M sulfatnom kiselinom (H 2 SO 4 ). Sulfatna kiselina je jaka kiselina koja istiskuje borne anione iz kompleksne soli amonijaka i borata, te nastaje sol amonij sulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ). Ovom reakcijom hidronijevi ioni borne kiseline postaju ponovo slobodni u otopini predloška i svojom aktivnošću spuštaju ph vrijednost do 4,6 (početna ph vrijednost borne kiseline). Vrijednost postotka dušika određuje se prema utrošku kiseline za titraciju po formuli koja je unesena u memoriju titratora. Cilj Odrediti postotak dušika u matičnoj otopini razorenog biljnog tkiva. Materijal pribor destilacijska jedinica, titrator sa ph metrom, automatska pipeta od 10 ml, tips reagensi matična otopina prethodno razorenog biljnog tkiva; 30% natrijav hidroksid (NaOH); 2% borna kiselina (H 3 BO 3 ) ph 4,6 ; 0,25M sulfatna kiselina (H 2 SO 4 ) Način izvođenja vježbe Potrebno je pripremiti matičnu otopinu razorenog biljnog tkiva kojeg želimo upotrijebiti kao uzorak za određivanje koncentracije dušika (vidi vježbu 2.1.). Destilacijska jedinica i titrator se uključe, te otvori voda za hlađenje. Sonda titratora za mjerenje ph uroni se u spremnik sa 30 F A B C D E G sa

33 2%-tnom bornom kiselinom i izmjeri se ph vrijednost. Ako ph vrijednost odstupa od 4,6 potrebno ju je podići ili spustiti dodavanjem 1M NaOH ili 1M HCl automatskom pipetom u spremnik s bornom kiselinom. Nakon toga ph sonda se uranja u predložnu čašicu. U kivetu za uzorak odpipetira se 10 ml matične otopine, te se ona pažljivo postavi u nosač na aparaturi za destilaciju. Na destilacijskoj jedinici pritisne se tipka start a na upravljaču jedinice za titraciju tipka MEAS/HOLD/8, sada se na zaslonu titratora mogu pratiti promjene ph vrijednosti. Nakon završetka titracije potrebno je zabilježiti volumen utrošene 0,25 M H 2 SO 4. Postotak dušika u uzorku računa se po formuli: ( ) 7 * V * v % N = m * 10 V [ml] - volumen utrošene 0,25 M H 2 SO 4 za titraciju otopine iz predloška do ph 4,6 v [ml] - alikvot matične otopine (10 ml) m [g] - odvaga suhe tvari uzorka u 100 ml matične otopine 7 - faktor za preračunavanje količine vezanog N na 0,25M H 2 SO 4 (1mL 0,25 M H 2 SO 4 veže 7 mg N) Postotak dušika pomnožen s 5,7 (za pšenicu) ili s 6,25 (u prosjeku) daje približnu koncentraciju sirovih proteina. Rezultati 31

34 2.4. ODREĐIVANJE SADRŽAJA NITRATA U SVJEŽEM POVRĆU Uvod u vježbu Sadržaj nitrata (NO 3 - ) i nitrita (NO 2 - ) u poljoprivrednim proizvodima je značajan pokazatelj kvaliteta proizvoda, koji može posredno utjecati na zdravlje ljudi. Prehranom čovjek unese više nitrata nego nitrita ali se djelovanjem bakterija u probavnom sustavu nitrati reduciraju u nitrite. Nitriti su štetniji za zdravlja čovjeka od nitrata. Prekomjerna razina nitrita u organizmu može izazvati methemoglobinemiju, bolest u kojem hemoglobin prelazi u methemoglobin koji ne može vezati kisik i time ga prenositi u tkiva te time može rezultirati smrću. Drugi problem prekomjerne razine nitrita u organizmu je što u reakciji s sekundarnim i tercijarnim aminima u kiselom mediju želuca nastaju kancerogeni nitrozamini. Glavni izvor unosa nitrata u organizam predstavljaju pitka voda i namirnice biljnog porijekla, a u manjim količinama mogu se pronaći u suhomesnatim proizvodima. Nitiriti se putem povrća i voća unose u manjim količinama, iznimka su oštećeno povrće, loše uskladišteno ili uskladišteno na duže vrijeme, ukiseljeno i fermentirano povrće. Prema odredbama FAO i WHO od godine potvrđen je dozvoljeni dnevni unos nitrata u organizam odraslog čovjeka te iznosi do 3.7 mg/kg/danu što je ekvivalent 222 mg/danu za čovjeka teškog 60 kg a nitrita do 0.07 mg/kg/danu. U dnevni unos treba računati nitrate u hrani i u vodi. Sadržaj nitrata u pitkoj vodi od strane WHO ograničen je na 50 mg/l. Akumulacija nitrata u biljci je posljedica prekomjernog usvajanja nitrata iz tla ili neadekvatne redukcije u biljci (redukcija do amonijaka i sinteza aminokiselina). Naročito je primijećena intenzivna akumulacija nitrata u lisnatom povrću, koje se često konzumira svježe, bez termičke obrade. Povrće poput salate, špinata, kelja i celera se smatra pravim akumulatorima dušika. U području umjerene klime gdje se povrće uzgaja u uvjetima niskog intenziteta svjetlosti razina nitrata u biljci može biti povećana jer je proces redukcije nitrata u nitrite u biljci povezan s procesom fotosinteze. Špinat posijan zimi a ubran ljeti (naročito u vrijeme sušnog perioda) sadrži više nitrata od špinata posijanog ljeti koji se ubire tijekom jeseni i zime. Na obiteljskim gospodarstvima često se prekomjerno gnoji mineralnim ili organskim gnojivima koja u svom sastavu sadrže dušik, kao i prilikom uzgoja povrća u staklenicima, a to može rezultirati višim sadržajem nitrata u povrću i voću od dozvoljenog. Kontrola sadržaja nitrata u biljnim proizvodima sustavno se provodi u razvijenim zemljama svijeta, te postoje utvrđene smjernice za nadzor kvaliteta poljoprivrednih proizvoda u EU. Slika 16. Reflectoquant nitratni test i testne trake Najjednostavnija analitička metoda za utvrđivanje sadržaja nitrata u biljnom materijalu je određivanje pomoću Reflectoquant nitratnog testa i testnih trakica za nitrate, slika 16. Testne trakice imaju dvije reakcijske zone koje sadrže reagense za redukciju nitrata do nitrita i reakciju nitrita s Griess-ovim reagensom. U reakciji nitrata s reagensima testne trakice nitrati se reduciraju u nitrite a oni reagiraju s Griess-ovim reagensom gdje kao produkt nastaje azospoj crvenkaste boje određenog intenziteta. Intenzitet boje razmjeran je početnoj koncentraciji nitrata, koju instrument određuje kolorimetrijski. 32

35 Cilj Odrediti koncentraciju nitrata u otopini nitrata pomoću instrumenta Reflectoquant. Materijal pribor i oprema: odmjerna tikvica, laboratorijska čaša od 100 ml, Reflectoquant instrument, testne trakice za mjerenje nitrata, stakleni lijevak, Erlenmeyerova tikvica od 250 ml, grijače tijelo - električni rešo, lonac, vodena kupelj, filter-papir, vaga, tučak i tarionik biljni materijal: krumpir ili neki drugi biljni materijal naveden u tablici reagensi: otopina nitrata, deionizirana voda Način izvođenja vježbe Potrebno je homogenizirati oko 0,5 kg povrća. U skladu s tablicom 3 se odvaže određena količina homogeniziranog biljnog materijala te se kvantitativno prenese u Erlenmeyerovu tikvicu od 250 ml uz dodatak destilirane vode ili deionizirane vode prema zapisu u tablici 1. Tikvica s biljnim materijalom se petnaest minuta zagrijava u kipućoj vodenoj kupelji. Na otvor tikvice treba staviti mali stakleni lijevak ili zračno hladilo kako bi se pare kondenzirale i slijevale nazad u tikvicu. Ohlađeni uzorak se filtrira kroz naborani filter-papir u odmjernu tikvicu odgovarajućeg volumena i dopuni deioniziranom vodom. Dio filtrata se presipa u čistu i suhu laboratorijsku čašu. Tablica 3. Odnosi volumena vode i biljnog materijala pri pripravi otopine za mjerenje nitrata instrumentom Reflectoquant Vrsta povrća Odvaga Dodatak vode Konačni volumen Faktor [g] [ml] [ml] brokula salata endivija salata glavatica krastavac mrkva paprika radič rajčica kupus krumpir Prije mjerenja koncentracije nitrata potrebno je kalibrirati instrument Reflectoquant. Kada je instrument kalibriran treba pritisnuti tipku START i istovremeno uroniti testnu traku u filtrat u laboratorijskoj čaši. Nakon 2 sekunde testna traka se izvadi iz filtrata a višak tekućine se odstrani povlačeći traku preko ruba čaše. Nakon isteka 55 sekundi, od trenutka pritiska tipke START, instrument daje zvučni signal tada je potrebno uložiti traku na odgovarajuće mjesto u aparat. Zvučni signal se čuje 5 sekundi nakon kojih aparat mjeri koncentraciju nitrata. Na digitalnom zaslonu automatski se pojavljuje vrijednost koncentracije nitrata u mg/l filtrata. Dobivenu vrijednost potrebno je pomnožiti s faktorom preračunavanja iz tablice 3. kako bi dobili vrijednosti nitrata u mg/kg biljne mase. 33

36 Rezultati Sadržaj nitrata u je. 34

37 2.5. ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI NITRAT REDUKTAZE Uvod u vježbu Nitrat reduktaza je enzim koji katalizira redukciju nitratnog oblika dušika. Biljke dušik usvajaju tijekom cijele vegetacije, kao NO 3 - i NH 4 + iz tla. Ovi anorganski (mineralni) oblici dušika se razlikuju po svom fiziološkom djelovanju. Nitratni oblik nije toksičan za stanicu te se može nakupljati u vakuoli, ali da bi se mogao iskoristiti za sintezu dušičnih organskih spojeva, mora se reducirati do amonijačnog oblika. Usvojeni amonijačni oblik se ne može nakupljati u biljci jer djeluje toksično te se direktno ugrađuje u organsku tvar, najčešće aminacijom organskih kiselina pri čemu nastaju aminokiseline i slijedi sinteza proteina. Redukcija nitrata odvija se u više stupnjeva od kojih je prvi redukcija do nitrita NO 2 -, koju katalizira nitrat reduktaza u korijenu ili nadzemnim dijelovima biljke i to u citoplazmi. Zatim slijedi daljnja redukcija u kloroplastima (nitrit reduktaza). Proces nitratne redukcije zahtijeva visok utrošak energije jer se oksidacijski broj dušika mijenja od +5 do 3. Visoka aktivnost ovog enzima javlja se u mladom lišću i može poslužiti za prognozu prinosa i utvrđivanju potrebe za prihranom dušikom. Cilj Određivanje aktivnosti enzima nitrat reduktaze u svježem uzorku lišća. Materijal pribor i oprema: epruvete, termostat, pipete, odmjerne tikvice od 25 ml, spektrofotometar biljni materijal: svježi uzorak lišća reagensi: inkubacijski medij (otopine kalij dihidrogenfosfat i nitrat, n-propanol u omjeru 3:0,8:1,2), sulfanilna kiselina; α-naftilen amid; natrij nitrat Način izvođenja vježbe 10 cm 2 lisne površine ili 1 g svježe mase lista se potopi u epruvetu s 10 ml inkubacijskog medija i stavi na inkubaciju u termostat na 36 o C oko min. Nakon inkubacije epruveta s uzorkom se izvadi iz termostata, doda se 3 ml otopine sulfanilne kiseline za blokiranje djelovanja enzima i 2 ml α-naftilen amida koji s nastalim nitritima stvara kompleks ružičaste boje. Intenzitet boje ovisi o koncentraciji nitrita u otopini pa se ona utvrđuje spektrofotometrijski na 536 nm uz seriju standardnih otopina poznate koncentracije. Pomoću njihove koncentracije i očitanja na skali spektrofotometra konstruira se kalibracijski dijagram na kojem se očitava nepoznata koncentracija nitrita u uzorku. Dobivena vrijednost koncentracije nitrita u µg NO 2 /ml otopine množi se s koeficijentom 15 zbog preračunavanja na ukupni volumen otopine u epruveti s uzorkom lista i preračuna na 24 h, ovisno o trajanju inkubacije. 35

38 Konačna aktivnost enzima izražava se kao koncentracija nastalog NO 2 po gramu svježe tvari u 24 sata. X[µg NO 2 /g/24 h]= c(no 2 )*15*24 X[µg NO 2 /g/24 h] - aktivnost nitrat reduktaze c(no 2 ) [µg NO 2 /ml] - koncentracija NO koeficijent za preračunavanje na razrjeđenje od 15 ml (ukupni volumen otopine u epruveti) 24 - koeficijent za preračunavanje na 24 sata (ako je inkubacija trajala 1 sat) Rezultati U svježem uzorku aktivnost nitrat reduktaze je 36

39 3. FIZIOLOGIJA RASTA I RAZVOJA 3.1. ŽIVOT REZANOG CVIJEĆA U VAZI Uvod u vježbu Rezano cvijeće ima određene karakteristike koje su važne uzgajivačima i trgovcima. Karakteristike poput boje, oblika, veličine i mirisa određene vrste cvijeća određuju vizualni i mirisni dojam cvijeta. Osim navedenih karakteristika dobro je znati koliki je vremenski period života cvijeta od trenutka njegova ubiranja do trenutka njegova venuća. Vremenski period života cvijeta može se produžiti pravilnim rukovanjem i smanjivanjem mogućih stresnih uvjeta nakon branja, tijekom transporta i prilikom skladištenja. Fiziološki procesi unutar cvijeta utječu na njegovu dugovječnost. Temperatura i dobra opskrbljenost vodom su vanjski čimbenici koje možemo kontrolirati a koji utječu na fiziološke procese cvijeta. Povišenjem temperature utječemo na intenzitet transpiracije i brzinu otvaranja pupova ali smanjujemo život rezanog cvijeća u vazi. Cilj Utvrditi utjecaj vanjskih čimbenika na duljinu života rezanog cvijeća te odrediti vremenski period otvaranja pupova od trenutka njihova ubiranja do njihova venuća. Materijal pribor i oprema: škare za obrezivanje, plastična posuda napunjena vodom iz slavine, traka za izoliranje ili samoljepljivi papirići, flomaster, staklenke s probušenim poklopcem na pet mjesta, ljepljiva traka i škare za papir, menzura od 500 ml, laboratorijska čaša od 250 ml, pomična mjerka ili ravnalo, papirnati ručnici, komora za klijanje biljaka biljni materijal: rezani vrhovi cvjetovi ruže određene sorte Prilikom odabira cvjetova potrebno je odabrati jednako razvijene pupoljke koje nakon rezanja treba uroniti u vodu i što prije transportirati u laboratorij. Za ovu vježbu dobro je koristiti cvijeće koje ima krupan i zrakasto simetričan cvijet koji ne raste u cvatovima (ruže, karanfili, tulipani, gerberi, božuri, hibiskusi, dalije itd.). reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Staklenke napuniti s 500 ml vodovodne vode. Obilježiti cvjetove trakom za izoliranje ili samoljepljivim papirićima te flomasterom napisati oznake od 1 do 15 K (kontrolirani uvjeti) i od 1 do 15 N (nekontrolirani uvjeti). Kroz poklopac svake staklenke provući 5 stabljika tako da prilikom stavljanja u staklenku dodiruju dno a lišće ispod poklopca potrebno je ukloniti. Kako bi se spriječio ulazak mjehurića zraka u ksilem škarama za obrezivanje treba odrezati oko 1 cm od reza na stabljici. Mjehurići zraka bi onemogućili apsorpciju Slika 17. Postavljeni pokus 37

40 i daljnji transport vode u biljci što bi uzrokovalo venuće biljnog materijala. Stabljike odrezati ispod površine vode u posudi napunjenom vodom iz slavine. Biljni materijal sa poklopcem premjestiti u staklenku s odmjerenim volumenom vode i staklenku dobro zatvoriti. Pukotine između poklopca i stabljike kroz koje bi mogla isparavati voda te mjesto navoja staklenke i poklopca dobro oblijepiti ljepljivom trakom (slika 17). Pomičnom mjerkom ili ravnalom izmjeriti najveći i najmanji promjer pupoljka cvijeta a rezultate zabilježiti kao srednju vrijednost minimalnog i maksimalnog promjera pupoljka (slika 18). Tri ponavljanja (repeticije) odnosno tri staklenke u kojima se nalaze cvjetovi obilježeni od 1 do 15 K staviti u komoru za klijanje biljaka u vremenskom periodu od tjedan dana pri kontroliranim uvjetima (na temperaturu od 15 C, bez svjetla). Slika 19. Gerberi u vazi nakon nekoliko dana izloženi nekontroliranim uvjetima Slika18. Mjerenje promjera cvijeta Tri ponavljanja obilježena oznakama od 1 do 15 N ostaviti tijekom tjedan dana pri sobnim nekontroliranim uvjetima gdje temperatura oscilira a jačina i trajanje osvjetljenja variraju. Nakon tjedan dana izmjeriti i izračunati srednju vrijednost promjera svih cvjetova koji su sada značajnije većeg promjera. Potrebno je donijeti zaključak usporedbom rezultata dobivenih prilikom samog postavljanja vježbe i rezultata dobivenih nakon određenog vremenskog perioda. Tijekom tjedan dana biljke su nastavile proces transpiracije te se volumen vode iz staklenke smanjio. Kako bi se odredio intenzitet transpiracije potrebno je izmjeriti volumen vode koji je preostao u staklenci nakon određenog vremenskog perioda te izračunati koliki volumen vode je utrošilo 5 cvjetova procesom transpiracije. Intenzitet transpiracije = V U V 1 V U [ml] - ukupni volumen H 2 O V 1 [ml] - volumen H 2 O nakon određenog vremena Usporedbom rezultata može se donijeti zaključak o intenzitetu transpiracije pri kontroliranim i nekontroliranim uvjetima. Ako se pokus ostavi duže od tjedan dana potrebno je promatrati promjene na cvjetovima do početka smanjivanja promjera cvjetova zbog venuća ocvijeća ili do vremena venuća cvjetne stapke prilikom kojeg se ona savije (slika19.). Prema potrebi treba dodati vodu u staklenke a količinu dodanog volumena zabilježiti i zbrojiti s prethodnim ukupnim volumenom. 38

41 Rezultati 1. N 2. N 3. N 4. N 5. N 6. N 7. N 8. N 9. N 10. N 11. N 12. N 13. N 14. N 15. N Promjer cvijeta Volumen vode Ø 1 [cm] Ø 2 [cm] Ø 2 Ø 1 [cm] V 1 [ml] V 2 [ml] V T [ml] 1. K 2. K 3. K 4. K 5. K 6. K 7. K 8. K 9. K 10. K 11. K 12. K 13. K 14. K 15. K Promjer cvijeta Volumen vode Ø 1 [cm] Ø 2 [cm] Ø 2 Ø 1 [cm] V 1 [ml] V 2 [ml] V T [ml] Ø 1 [cm] početni promjer pupa (cm) Ø 2 [cm] promjer cvijeta nakon određenog vremenskog perioda (cm) V 1 [ml] početni volumen vode u staklenci (ml) V 2 [ml] izmjereni volumen vode nakon određenog vremenskog perioda (ml) V T [ml] volumen vode utrošen u procesom transpiracije (ml) 39

42 3.2. MJERENJE POVRŠINE LISTA Uvod u vježbu Dovoljna količina vode u biljci osigurava normalne fiziološke procese a time i njen kvalitetan rast i razvoj. Biljka vodu iz zemlje preuzima korijenom pomoću procesa transpiracije i korijenovog tlaka koji provode vodu kroz ksilem prema nadzemnim organima biljke. Transpiracijom biljka izlučuje vodu u obliku vodene pare sa površine nadzemnih organa te time čini najveću pokretačku silu protoka vode. Lišće biljke su najznačajniji transpiracijski organi o čijoj površini ovisi i količina transpirirane vode. O ukupnoj površini biomase lišća ovisi i proces fotosinteze. Cilj Utvrditi površinu lisne biomase biljnog materijala. Materijal pribor i oprema: vaga, metar, škare, nekoliko papira A4 formata, olovka biljni materijal: listovi ruže ili gerbera (može i neki drugi biljni materijal) reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Papir A4 formata potrebno je izvagati, izmjeriti njegovu dužinu i širinu te izračunati njegovu površinu. P [cm 2 ] = a * b Sa jedne biljke se odvoje svi listovi pazeći da ostanu cjeloviti. Važno je obratiti pažnju na anatomske karakteristike lista jer listovi mogu biti jednostavni, sastavljeni i razdijeljeni. Svi listovi se poslože na izvagani papir za koji nam je poznata površina. Svaki list se obcrta prema rubovima što vjerodostojnije. Ako svi listovi jedne biljke nisu stali na jedan papir ostatak listova stavi se na novi papir poznate mase i površine. Izrežu se likovi lišća s papira. Treba paziti da se ne pomiješaju likovi koji su bili nacrtani na jednom papiru s likovima koji su bili nacrtani na drugom papiru. Likovi lišća s prvog papira se izvažu te se izračuna njihova površina. P L površina lista P P površina papira m L masa lista m P masa papira P L [cm 2 ] = P P * m L / m P Izrezani likovi s drugog papira se izvažu i izračuna se njihova površina. Površine likova listova s jednog i drugog papira se zbroje. 40

43 Rezultati Ovu tablicu treba upotpuniti rezultatima dobivenim iz biljnog materijala korištenog u vježbi Život rezanog cvijeća u vazi. Površina lista [cm 2 ] Ukupno [cm 2 ] Srednja vrijednost Površina lista [cm 2 ] Ukupno [cm 2 ] [cm 2 ] 1. N 1. K 2. N 2. K 3. N 3. K 4. N 4. K 5. N 5. K 6. N 6. K 7. N 7. K 8. N 8. K 9. N 9. K 10. N 10. K 11. N 11. K 12. N 12. K 13. N 13. K 14. N 14. K 15. N 15. K N biljke postavljene u nekontroliranim uvjetima K biljke postavljene u kontroliranim uvjetima Srednja vrijednost [cm 2 ] Problemski zadaci 1. U sedam dana biljka koja ima lisnu površinu od 5 dm 2 transpiracijom izgubi 250 ml vode. Izračunaj koliko će vode biljka transpirirati preko površine lista od 1 dm 2? 41

44 3.3. NASTIJSKA GIBANJA Uvod u vježbu Nastijska gibanja ili nastije su gibanja biljnih organa određena njihovom građom a pokrenuta podražajem iz okoline koji biljci služi samo kao signal. Ako su nastije uvjetovane promjenama temperature zovemo ih termonastije, ako su uvjetovane promjenama intenziteta svjetlosti zovemo ih fotonastije (slika 20). Poznate su još i kemonastije kod kojih su gibanja uvjetovana kemijskim podražajem, seizmonastije kod kojih su gibanja uzrokovana mehaničkim podražajima, tigmonastije kod kojih su gibanja uvjetovana trenjem biljke o čvrstu podlogu itd. Nastijska gibanja rjeđe su rezultat nejednolikog rasta suprotnih strana organa a češće promjenama turgora koje su reverzibilne. Termonastije su uočljive kod cvjetova mnogih biljaka koji se otvaraju tijekom dana kada je temperatura zraka povišena a zatvaraju se kada je temperatura zraka snižena. Šafrani i tulipani listove ocvjećja mogu otvarati i zatvarati i nekoliko puta tijekom dana ovisno o temperaturnim prilikama a promjene se kod njih očituju već nakon nekoliko minuta. Različite biljne vrste različito su osjetljive na promjene temperature npr. cvjetovi tulipana reagiraju na razliku u temperaturi od 1-3 C a cvjetovi šafrana reagiraju na razliku u temperaturi već od 0,2-0,5 C. Gibanje listova ocvjećja moguće je uočiti i prilikom promjena u intenzitetu osvjetljenja. Većina biljnih vrsta otvara cvjetove ili listove prilikom jačeg intenziteta svjetlosti a zatvara prilikom slabijeg. Neke biljne vrste se očituju i obrnutim gibanjem svojih organa u odnosu na intenzitet svjetlosti. Slika 20. fotonastijska gibanja listova kiselice (Oxalis acetosella) (slike preuzete: ) 42

45 3.3.A TERMONASTIJE Cilj Uočiti i dokazati gibanje organa biljnog materijala u odnosu na temperaturu kao vanjski faktor utjecaja. Materijal pribor i oprema: vaza ili lonac za cvijeće sa zemljom, pomična mjerka, komora za klijanje cvijeća, hladnjak biljni materijal: cvjetovi tulipana (Tulipa sp.), cvjetovi šafrana (Crocus sp.) reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Biljni materijal korišten za ove vježbe može biti u loncima za cvijeće sa zemljom ili u vazi s vodom. Kako bi promatrali termonastije nekoliko biljaka treba staviti u prostoriju u kojoj je temperatura zraka oko 20 C, a nekoliko biljaka iste vrste treba staviti u prostoriju u kojoj je temperatura zraka oko 5 C. U nemogućnosti postavljanja pokusa u prostorije s odgovarajućom razlikom u temperaturi biljke se mogu staviti i u komoru za klijanje biljaka na 20 -tak C i u hladnjak na 5 C. Kada se biljke prilagode uvjetima treba ih zamijeniti na slijedeći način. Biljke iz prostora s temperaturom zraka 20 C prenijeti u prostor s temperatura zraka 5 C a biljke koje su bile na 5 C prenijeti u prostor s temperaturom zraka 20 C. Nakon nekog vremena biljke će reagirati a pomaci u gibanju organa će se lako uočiti vizualnim pregledom. Brzina otvaranja cvijeta odnosno cvata ovisi o biljnom materijalu. Pomičnom mjerkom se može izmjeriti promjer cvijeta, na način opisan u vježbi vase life, prije i nakon nastalih promjena. Rezultate i zaključak zapisati. Rezultati i zaključak 43

46 3.3.B FOTONASTIJE Cilj Uočiti i dokazati gibanje organa biljnog materijala u odnosu na svijetlost kao vanjski faktor utjecaja. Materijal pribor i oprema: vaza ili lonac za cvijeće sa zemljom, veća kartonska kutija ili komora za klijanje biljaka, pomična mjerka biljni materijal: cvjetovi tulipana (Tulipa sp.), cvatovi maslačka (Taraxacum officinale), cvatovi tratinčice (Bellis perenis), cvatovi nevena (Calendula sp.), listovi kiselice (Oxalis acotesella) reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Biljni materijal korišten za ove vježbe može biti u loncima za cvijeće sa zemljom ili u vazi s vodom. Kako bi promatrali fotonastije jednu biljku izložimo direktnom svjetlu a drugu iste vrste zamračimo ili je stavimo u komoru za klijanje biljaka pri čemu treba paziti kako bi obje biljke bile izložene jednakoj temperaturi i vlažnosti zraka. Nakon 1 do 2 sata biljke će reagirati na promjenu intenziteta svjetlosti. Pomičnom mjerkom se može izmjeriti promjer cvijeta, na način opisan u vježbi vase life, prije i nakon nastalih promjena. Rezultate i zaključak zapisati. Rezultati i zaključak: 44

47 Problemski zadaci: 1. Grašak je biljka za koju je karakteristično penjanje uz čvrstu podlogu pomoću vitica. Razmisli i zaključi kako se zove takvo nastijsko gibanje? 2. Poznato je kako stidljiva mimoza (Mimosa pudica) prilikom mehaničkih podražaja listova (npr. dodir rukom) skuplja svoje liske. Skupljanje liski se odvija vrlo brzo no faza potpunog oporavka traje 30-tak minuta. Razmisli i zaključi kako se zove takvo nastijsko gibanje? 45

48 3.4. KLIJAVOST I VIGOR SJEMENA 3.4.A STANDARDNA KLIJAVOST I ENERGIJA KLIJANJA SJEMENA Uvod u vježbu Standardna klijavost i energija klijanja prihvaćeni su kao glavni pokazatelji fiziološke kvalitete sjemena. Neizostavni su parametri za određivanje norme sjetve u cilju postizanja željenog sklopa biljaka u polju te su kao takvi naišli na široku primjenu u praksi. Najveća vrijednost ovih testova upravo je u preciznom predviđanju nicanja biljaka u polju, a podudarnost ovih parametara s poljskim nicanjem je neupitna. Ovi parametri usko su vezani i s potencijalnim prinosom, uglavnom preko ostvarenog sklopa biljaka u polju, ali i značajnim utjecajem na rani porast biljaka (više je vezan uz energiju klijanja). Standardna klijavost predstavlja broj normalnih klijanaca prema ukupnom broju sjemenki stavljenih na naklijavanje. Ispitivanje se obavlja na radnom uzorku jedne partije sjemena u laboratorijskim uvjetima. U okviru ovoga testa utvrđuje se i energija klijanja kao informativni podatak, a razlika u odnosu na standardni test klijavosti je u vremenu naklijavanja koje je kraće, pa se u okviru istoga testa prvo utvrđuje energija klijanja, a zatim standardna klijavost. Oba pokazatelja predstavljaju broj normalnih klijanaca građenih na način da nije ugrožen rast i razvoj mlade biljke što se, ovisno o biljnoj vrsti, odnosi na njezine osnovne dijelove (korijenov sustav, izdanak, kotiledone i koleoptilu). Uvjeti za ispitivanje standardne klijavosti i energije klijanja pojedinih ratarskih kultura značajno se razlikuju, tablica 4. Tablica 4. Uvjeti za ispitivanje standardne klijavosti i energije klijanja pojedinih ratarskih kultura Biljna vrsta Veličina partije sjemena (kg) Masa prosječnog uzorka (g) Masa radnog uzorka (g) Temperatura C (stalna ili izmjenjiva) Period za ocjenu energije klijanja (dani) Period za ocjenu standardne klijavosti (dani) Minimalna klijavost (%) Glycine max (L.) ; Merr. Helianthus annuus L ;25; Hordeum vulgare L Medicago sativa L Triticum aestivum Zea mays L ; 25;

49 Cilj Odrediti klijavost sjemena dvije različite sorte graha. Materijal pribor i oprema: kalupi za cvjetne nasade, boca špricalica, filter-papir, gumica za zimnicu, plastična čaša, laboratorijska čaša, flomaster, elastični metar, crna vreća za smeće, vaga, komora za klijanje biljaka biljni materijal: sjeme graha dvije sorte (pri izboru sorte graha dobro je izabrati jednu sortu niskog rasta a drugu visokog rasta) reagensi: destilirana voda Način izvođenja vježbe Prije vježbe potrebno je izbrojati i izvagati 100 sjemenki graha od svake sorte. Nekoliko sati prije vježbi sjeme je potrebno potopiti u vodu kako bi se potaklo njegovo klijanje. Nakon što je sjeme absorbiralo dovoljnu količinu vode višak je potrebno isipati a sjemenke složiti na arak filter-papira. Ovisno o sorti koju smo izabrali sjemenke mogu biti različite veličine te u skladu s tim na arak treba složiti 20 do 50 sjemenki graha. Arak filter-papira treba postaviti horizontalno te ga podijeliti na tri jednaka dijela po dužoj stranici. Jedna trećina filter-papira se presavije po dužini. Sjemenke graha se slože u jednom redu na sredinu dva sloja filter-papira (slika 21). Sjemenke neka budu jednako okrenute kako bi klice neometano mogle klijati jedna pokraj druge. Kako bi osigurali dovoljnu količinu vlage potrebne za klijanje sjemena pomoću boce špricalice filter-papir se natopi vodom. Pri tome je potrebno pripaziti kako se ne bi nasipalo suviše vode. Nakon toga se preostala jedna trećina filter-papira presavije preko sjemenki graha. Tako složen filter-papir se čvrsto zarola od jednog kraja prema drugom poput štrudle a smotuljak dodatno učvrsti gumicom za zimnicu. Smotuljak okomito treba postaviti u kalup za nasađivanje cvijeća (slika 21). Prilikom postavljanja smotuljaka u kalup neka smotuljci budu orijentirani otvorom prema gore kako bi sjemenke prilikom rasta mogle proklijati izvan filter-papira. Smotuljke je potrebno obilježiti kako bi znali koja sorta graha je u kojem smotuljku. Ako nije pristupačna klima komora sa mogućom regulacijom vlage (fitotron), svi smotuljci se zajedno s kalupom stave u neprozirnu vreću za smeće kako bi gubitak vode bio sveden na Slika 21. Postavljanje testa za ispitivanje klijavosti standardnom metodom na filter-papiru minimalnu količinu. Sjeme graha se stavlja u komoru za klijanje biljaka na 20 C u periodu od tjedan dana. Nakon tjedan dana napravi se analiza rasta. Prebroji se koliko sjemenki graha je proklijalo a koliko nije te se izračuna postotak klijavosti za svaku sortu graha. Elastičnim metrom izmjeri se koliko su dugačke klice svake proklijale sjemenke i izračuna srednju vrijednost klijanaca za svaku sortu. Noktom se pažljivo odvoje kotiledoni od hipokotila te se hipokotili izvažu za svaku sortu graha posebno. Izračuna se prosječna masa klijanaca. 47

50 Usporedbom dobivenih rezultata može se zaključiti koja sorta graha ima bolje kvalitete sjemena. Energija klijanja i klijavost utvrđuju se brojanjem normalnih klijanaca nakon perioda predviđenog za naklijavanje (slika 22). Za razliku od normalnih klijanaca, klijanci za koje se ocijeni da nemaju sposobnost razvitka u normalnu biljku ne uračunavaju se u postotak klijavosti. Takvi klijanci su oštećeni (nedostaje ili je oštećena neka od osnovnih struktura), deformirani (na jednoj ili više osnovnih struktura prisutan je deformitet) ili istruli. U postotak klijavosti također se ne uračunava niti mrtvo sjeme koje ne pokazuje znakove razvoja klice, prazno sjeme te sjeme oštećeno napadom kukaca. Prilikom prvog, a i ostalih ocijenjivanja izdvajaju se normalni klijanci, a nedovoljno razvijeni i deformirani klijanci, kao i neklijavo sjeme, ostavljaju se do kraja ispitivanja klijavosti. Rezultat se izražava u %, a suma postotaka normalnih i deformiranih klijanaca te neklijavog sjemena mora biti 100. Pri tome partija sjemena koja je namijenjena za distribuciju mora zadovoljiti propisanu minimalnu klijavost (tablica 4). Rezultati Slika 22. Utvrđivanje klijavosti sjemena graha (lijevo) i soje (desno) standardnom metodom na filter-papiru Ukupno 1 sorta graha 2 sorta graha % NEP. d hip [mm] m [g] % NEP. d hip [mm] m [g] % NEP. postotak neproklijalih sjemenki graha d hip [mm] srednja vrijednost dužine klica sjemenki graha izražena u milimetrima m [g] srednja vrijednost mase klijanaca graha izražena u gramima 48

51 Problemski zadaci 1. Izračunaj koliko grama sjemena treba posaditi na 10 m 2 ako želimo da nam proklija 200 biljaka? Pri računanju uvrsti podatke dobivene iz postavljenog pokusa. 49

52 3.4.B COLD TEST Uvod u vježbu Za podrobniju ocjenu kvalitete sjemena uz test standardne klijavosti i energije klijanja preporučuje se provesti i druge testove vigora sjemena od kojih posebnu važnost ima cold test. Ovaj test ima osobiti značaj kod analize partija sjemena s graničnim vrijednostima standardne klijavosti i energije klijanja, dulje skladištenih partija sjemena, osobito ako je skladištenje bilo neuvjetno, te partija sjemena loših fizikalnih pokazatelja i narušenog zdravstvenog stanja. Nadalje, cold test ima veliku važnost ukoliko se prakticiraju rani rokovi sjetve kada postoji velika opasnost od redukcije sklopa biljaka (hladno tlo saturirano vlagom, prisutnost patogena, produljen period od sjetve do nicanja) jer će tada, u odnosu na ostale testove vigora sjemena, cold test dati najbolju procjenu poljskog nicanja. Generalno se može reći da partije sjemena s većim vrijednostima cold testa u pravilu ostvaruju bolje poljsko nicanje, osobito u lošijim uvjetima u polju. Cilj Odrediti postotak klijavosti sjemena ratarskog usjeva, po dale opisanoj metodi cold testa Materijal pribor i oprema: rolani filter-papir, plastične vrećice, klima komora, tlo i pijesak u omjeru 1:1 biljni materijal: sjeme kukuruza ili soje reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Pripremi se podloga za sjetvu uzimanjem prosječnog uzorka tla s table na kojoj je prethodne godine uzgajana testirana kultura. Uzorak tla se osuši, usitni i prosije, kako bi se postigla fina mrvičasta struktura. Tako pripremljen uzorak tla pomiješa se s pijeskom u omjeru 1:1. Postupak naklijavanja je sljedeći: prethodno navlaženi filter-papir stavi se na hlađenje (10 C) 24 h prije sjetve, kao i pripremljena smjesa pijeska i tla. Na navlaženi i ohlađeni filter-papir rasporedi se sjeme koje se zatim pospe sa 100 g smjese pijeska i tla. Radni uzorak čini 4x50 sjemenki, sjemenke se iz uzorka uzimaju nasumce i raspoređuju na podlogu za klijanje. Filter-papir se zatim preklopi i dodatno navlaži s onoliko vode koliko mogu upiti papir i podloga. Slika 23. Cold test sjemena soje po modificiranoj «Rolled towel» metodi 50

53 Posijani uzorak zamota se u tuljak, stavi u plastičnu vrećicu i vertikalno odloži u termostat na temperaturu 10 C, bez utjecaja svjetla. Potom slijedi naklijavanje na temperaturi 25 C u trajanju od 5 dana, također bez prisutnosti svjetla. Konačno očitavanje klijavosti slijedi nakon ukupno 12 dana (slika 23). Ovoj metodi, uz moguće modifikacije, podliježu slijedeće kulture: kukuruz, soja, grašak i suncokret. Kao i kod testa standardne klijavosti, i cold test se utvrđuje brojanjem normalnih klijanaca nakon perioda predviđenog za naklijavanje i izražava se u %. Za razliku od normalnih klijanaca, klijanci za koje se ocijeni da nemaju sposobnost razvitka u normalnu biljku ne uračunavaju se u postotak klijavosti (oštećeni, deformirani i istruli klijanci te mrtvo sjeme). Rezultati 51

54 3.4.C ELEKTRIČNI KONDUKTIVITET SJEMENA Uvod u vježbu Gubitak vigora sjemena uvelike je vezan uz stanje staničnih memebrana i sjemenjače, a povećanjem propusnosti navedenih struktura redovito dolazi do opadanja vigora sjemena. Upravo na ovim činjenicama utemeljena je metoda testiranja vigora sjemena putem utvrđivanja električnog konduktiviteta sjemena kojim se mjeri intenzitet ispiranja elektrolita iz biljnog tkiva tijekom namakanja sjemena u vodi. U osnovi, vrijednost električnog konduktiviteta predstavlja stupanj provodljivosti otopine u kojoj je sjeme namakano i bit će veći ukoliko tijekom namakanja otpuštanje elektrolita bude veće. Nadalje, intenzivnije otpuštanje elektrolita tijekom namakanja veće je što je propusnost sjemenjače i staničnih membrana veća pa otuda pad vigora sjemena redovito prati porast električnog konduktiviteta sjemena. Ovdje treba naglasiti i činjenicu da što je sjeme nižeg vigora, ima nižu klijavost, energiju klijanja i cold test, dok mu je električni konduktivitet u porastu, pa je korelacija konduktiviteta sjemena s ostalim laboratorijskim pokazateljima, kao i s poljskim nicanjem, redovito negativna. Cilj: Odrediti promjene električnog konduktiviteta sjemena soje u fazi imbibicije kroz određeni vremenski period. Materijal pribor i oprema: konduktometar, plastične čašice biljni materijal: sjeme bilo kojeg ratarskog usjeva reagensi: destilirana voda Način izvođenja vježbe Radni uzorak čini 4x50 sjemenki koje se prethodno izvažu, a zatim stavljaju na namakanje u Erlenmeyerove tikvice u 250 ml deionizirane vode. Voda je temperirana na 20 C, a uzorci se zatim odlažu u termostat na istu temperaturu od 20 C u trajanju od 24 h. isteku vremena predviđenog za namakanje sjemena obavlja se mjerenje električnog konduktiviteta. Neposredno prije mjerenja pripremljeni uzorak lagano se miješa u trajanju od sekundi, a zatim se Slika 24. Utvrđivanje električnog konduktiviteta sjemena soje konduktometrom izvrši mjerenje (slika 24) i očitaju dobivene vrijednosti. Ova metoda razvila se na grašku, primjenjuje se na ostalim krupnozrnim leguminozama, ali i na kukuruzu, pšenici i nekim drugim kulturama. Po 52

55 Rezultati i zaključak Očitane vrijednosti s konduktometra (µscm -1 ) odnose se na ukupnu masu namakanog uzorka (50 sjemenki). Stoga se utvrđena vrijednost preračuna na masu od 1 g sjemena i izrazi u µscm - 1 g -1. Dobiveni rezultati ocjenjuju se prema skali za krupnozrne leguminoze (Powell i Matthews, 1981., tablica 5). Tablica 5. Skala za ocjenu vrijednosti električnog konduktiviteta za krupnozrne leguminoze Električni konduktivitet (µscm -1 g -1 ) Ocjena kvalitete sjemena i preporuka za sjetvu <25 sjeme prikladno i za ranu sjetvu sjeme može biti prikladno za ranu sjetvu, ali uz određeni rizik sjeme nije prikladno za ranu sjetvu i nepovoljne uvjete >43 sjeme neprikladno za sjetvu 53

56 3.4.D ZDRAVSTVENO STANJE SJEMENA Uvod u vježbu Važan činitelj vigora sjemena je i njegovo zdravstveno stanje. Naime, sjeme može biti zaraženo velikim brojem gljivica, bakterija i virusa, a uslijed infekcije patogenima može značajno opasti vigor sjemena. Brojni radovi potvrđuju negativnu korelaciju između intenziteta zaraze sjemena pojedinim patogenima i vigora, pa se generalno može reći da se vigor sjemena proporcionalno smanjuje s povećanjem intenziteta zaraze. Većina uzročnika bolesti prenosi se sjemenom pa korištenje zdravog sjemenskog materijala ima važno mjesto i u prevenciji i smanjivanju pojavnosti bolesti. Osim toga, veća zaraženost sjemena uzročnicima bolesti utvrđenim zdravstvenom kontrolom upućuje na potrebu tretiranja sjemena. U konačnici, partije sjemena lošijeg zdravstvenog stanja neće ostvariti željene sklopove biljaka u polju, bolesni klijanci oslabit će i zaostati rastom i razvojem, a sve to negativno će se odraziti na prinos. Stoga treba izdvojiti nekoliko aspekata koji daju veliku važnost provedbi zdravstvene analize sjemena. Kao prvo, zdravstvenu analizu treba uvažiti kao nadopunu ostalim testovima vigora sjemena i boljem uvidu u stvarno stanje pojedine partije sjemena. Zatim treba navesti rizik koji sa sobom nosi sjetva zaraženim sjemenom - od prorjeđivanja sklopa, stagnacije usjeva, razvoja bolesti u polju, smanjenja prinosa i komercijalne vrijednosti usjeva uopće. Nadalje, rezultati ispitivanja zdravstvenog stanja sjemena mogu ukazati na nužnost provođenja tretiranja sjemena u cilju iskorjenjivanja patogena koji se prenose sjemenom ili smanjenja opasnosti od prijenosa zaraze. Posebnu važnost ima zdravstvena analiza uvezenih partija sjemena zbog mogućeg unosa novih patogena i opasnosti za domaću proizvodnju. Ispitivanje zdravstvenog stanja sjemena provodi se primjenom različitih metoda, a odnosi se na utvrđivanje prisutnosti uzročnika bolesti (gljivice, bakterije i virusi i ostale), parazitskih nematoda i kukaca, ali i štetnih fizioloških stanja. Metode zdravstvene analize sjemena mogu se podijeliti na dvije osnovne skupine ovisno o tome prethodi li im proces inkubacije: 1. Metode ocjenjivanja zdravstvenog stanja bez inkubacije Ove metode ne daju podatke o vijabilnosti patogena. a) Metoda pregleda naturalnog sjemena Metoda se svodi na vizualni pregled uzorka uz moguću upotrebu stereo-mikroskopa. Tako se vizualnim pregledom sjemenjače utvrđuje prisutnost plamenjače na sjemenu soje (Peronospora manshurica (Naum) Syd. Ex Gaum). Pregled sjemena na plamenjaču provodi se na netretiranom sjemenu, radni uzorak čini 4x50 sjemenki, a konačan rezultat izražava se u postotku sjemena zahvačenog plamenjačom. Nadalje se, metodom vizualnog pregleda, mogu utvrditi promjene boje i oštećenja sjemena, prisutnost sklerocija, cisti nematoda, kukaca i grinja. b) Metoda ispiranja sjemena Metoda ispiranja sjemena koristi se za analizu sjemena strnih žita i trava na prisutnost patogena Tilletia spp. Radni uzorak (50 g sjemena za strna žita) stavlja se u tikvicu i prelije sa 70 ml destilirane vode uz dodatak 2 kapi tekućeg deterdženta za pranje suđa. Tikvica se začepi i mućka u trajanju od 10 minuta (ručno ili na automatskoj mućkalici). 10 ml suspenzije dobivene mućkanjem centrifugira se 4 minute na 2400 okretaja. Odlije se tekućina iznad taloga i dodaje destilirana voda do 2 ml, te napravi suspenzija taloga. Iz svake kivete mikroskopira se najmanje 4 kapi. Prisutne hlamidospore izbroje se korištenjem hemacitometra. 54

57 Broj spora u gramu sjemena se izračunava po formuli: X N V = W N - prosječan broj spora u kvadratu hemacitometra (ukupan zabilježeni broj/8) V [ml] - volumen suspenzije (2 ml) W [g]- masa sjemena volumen tekućine u kvadratu hemacitometra. c) Metoda pregleda embrija Ova metoda koristi se na sjemenu ječma za određivanje zaraze prašnom snijeti (Ustilago nuda). Radni uzorak mase grama tretiranog ili netretiranog sjemena podijeli se na dva ponavljanja. Ekstrakcija i čišćenje embrija obavlja se tako da se radni uzorak stavi u jednu litru svježe pripremljene 5%-tne vodene otopine natrijeve lužine (NaOH) i drži 24 sata na 20 C. Nakon toga cijeli se uzorak premjesti u prikladni kontejner i ispere u toploj vodi, da se odvoje embriji, koji izlaze kroz smekšani perikarp. Embriji se izdvoje pomoću sita s otvorima promjera 1 mm. Zatim se embriji premjeste u mješavinu jednakog omjera glicerola i vode, gdje se odvajaju od eventualnih ostataka sjemena. Dodatno čišćenje embrija obavlja se u digestoru tako da se embriji premjeste u laboratorijsku posudu u kojoj se nalazi 75 ml čistog svježe pripravljenog laktofenola. Embriji se u laktofenolu drže 30 sekundi, pri točki ključanja. Na kraju se embriji premjeste u svježi, lagano zagrijani glicerol, kako bi se obavio pregled. Pregledava se 1000 embrija iz svakog ponavljanja pod povećanjem puta, s prikladnim osvjetljenjem (odozdo). Traži se karakterističan zlatno-smeđi micelij gljivice Ustilago nuda. Rezultat pregleda izražava se u % zaraženog sjemena. 2. Metode ocjenjivanja zdravstvenog stanja nakon inkubacije Nakon razdoblja inkubacije radni se uzorak ispituje na prisutnost uzročnika bolesti, simptome razvoja bolesti, prisutnost štetnika i štetnih fizioloških stanja na ili u sjemenu te na klijancima. Može se odrediti površinska ili dubinska zaraza. a) Metoda na filter-papiru Radni uzorak od 400 sjemenki rasporedi se u Petrijeve zdjelice (po 10 zrna u jednoj Petrijevoj zdjelici). Petrijeve zdjelice prethodno su obložene Slika 25. Utvrđivenje zdravstvenog stanja sjemena soje po metodi na filter-papiru 55

58 navlaženim filter-papirom, na koji se sjemenke rasporede tako da je njihova međusobna udaljenost najmanje 2 cm. Tako posijano sjeme odlaže se u termostat na inkubaciju. Inkubacija za netretirano sjeme traje 10 dana, a 14 dana za tretirano sjeme pri temperaturi od 20 C, uz izmjenično osvjetljenje (12 sati osvjetljenja u spektru od 320 do 420 nm, 12 sati u tami). Nakon inkubacije slijedi determinacija i utvrđivanje postotka zaraze sjemena. Metoda se primjenjuje na sjemenu soje (Slika 25), sucokreta i jarog graška. b) Metoda izmrzavanja Metoda izmrzavanja predstavlja modificiranu metodu na filter-papiru, a primjenjuje se na sjemenu ozime pšenice i ozimog ječma. Modifikacija se odnosi na temperaturu inkubacije. Naime, prilikom inkubacije sjeme se prvo stavlja u komoru za naklijavanje na 20 C kroz 24 sata, zatim sljedećih 24 sata u zamrzivaču na -20 C. Nakon toga Petrijevke sa sjemenom drže se u komori za naklijavanje na 20 C do kraja inkubacije (osim kod determinacije gljive Microdochium nivale gdje temperatura u komori za naklijavanje mora biti C). c) Metoda na hranjivoj podlozi Metoda na hranjivoj podlozi koristi se za utvrđivanje zaraze sjemena pšenice sa smeđom pjegavosti pljevica, gljivicom Leptosphaeria (Stagonospora) nodorum (syn. Septoria nodorum). Prije stavljanja radnog uzorka (400 sjemenki) na hranjivu podlogu obavlja se predtretman (dezinfekcija) u 1%-tnoj otopini natrijeva hipoklorita. Kao hranjiva podloga obično se koristi krumpir-dekstroza agar (PDA) ili malc agar, u koji se kod pripreme dodaje 100 ppm streptomicin sulfata. Hranjiva podloga izlijeva se u petrijive zdjelice promjera 9 cm. Kod stavljanja sjemenki u Petrijeve zdjelice razmak treba biti najmanje 2 cm. Nakon toga se Petrijeve zdjelice sa sjemenkama stavljaju na inkubaciju 7 dana na 20 C u mraku. Nakon 7 dana golim okom se određuje broj sjemenki s karakterističnim kolonijama, spororastućeg, gustog bijelog ili kremastog micelija, koje često prekrivaju cijelo sjeme. Rezultat analize izražava se u % zaraženog sjemena. d) Predtretman (prethodna obrada) Pojedine gljivice (npr. Rhizopus spp.) brzo se šire na filter-papiru, mogu prorasti zdravu biljku ili se razvijati s patogenom na zaraženom sjemenu. Na taj način ugrožavaju sam ishod analize jer mogu maskirati konačan rezultat. Iz tog je razloga za pojedine metode poželjno izvršiti predtretman koji se odnosi na bilo kakav fizikalni ili kemijski tretman radnog uzorka proveden u laboratorijskim uvjetima. Tako se u slučaju potrebe za površinskom dezinfekcijom sjemena može provesti predtretman natrijevim hipokloritom namakanjem sjemena u trajanju od 10 minuta u otopini natrij hipoklorita koja sadrži 1 volumni % aktivnog klora. Rezultati Rezultati zdravstvene analize prikazuju se kao postotak zaraženih sjemenki ili kao broj organizama po težini ispitanog uzorka. Pri tome je nužno rabiti znanstvena imena uzročnika bolesti, naznačiti metodu zdravstvene analize koja je korištena, uključujući i podtretman, ako je proveden. 56

59 3.5. ANALIZA RASTA BILJAKA Uvod u vježbu Visokoproduktivni uzgoj biljaka zahtjeva postizanje optimalnih uvjeta prilikom rasta i razvoja biljaka. Temperatura, osvjetljenje i dovoljna količina vode važni su faktori koji utječu na dobivanje zdrave i snažne biljke s dobro razvijenom lisnom površinom i dobrim prirastom. Kvalitetna gnojidba također ima značajan učinak na povećanje poljoprivrednog uroda i priroda. Cilj Naučiti modele analize rasta biljaka te na primjerima utvrditi naučeno. RELATIVNA BRZINA RASTA (R) Relativna analiza rasta ili njenih pojedinih organa u određenom vremenskom razdoblju izražava se kao prirast u jedinici suhe tvari: dw R = 1 W dt W dw dt = ukupna masa suhe tvari biljke = prirast mase suhe tvari = vremenski interval Primjer: Nakon 100 dana vegetacije prosječna masa suhe tvari korijena šećerne repe iznosi 50 g, a nakon 180 dana 100 g. Kakva je relativna brzina rasta u ispitivanom razdoblju od 80 dana? 1 50g R = = 0,00625g / dan dana NETO ASIMILACIJA (E) Vrijednost čistog efekta asimilacije izračunava se na slijedeći način: 1 dw E = A dt Neto asimilacija (E) je prirast suhe tvari izražen na jedinicu veličine koja pokazuje aktivnost fotosintetičkog aparata biljke (površina lišća, ukupni i proteinski dušik u lišću, količina klorofila a i sl.). Zavisnost između A (asimilacijska površina) i W (suha tvar biljke) može biti linearna ili kvadratna. Kod linearnog oblika zavisnosti jednadžba se raščlani prema Wiliamsu: 57

60 E = dw (ln A2 ln A1 ) da dt Kod kvadratnog oblika zavisnost jednadžbi glasi: E = 2 ( A dw + A ) 2 1 dt Primjer: Nakon 60 dana vegetacije prosječna površina lišća jedne repe je 22 dm2 uz masu suhe tvari od 25 g. Nakon 30 dana lisna površina bila je 34 dm2, a masa suhe tvari 60 g. Kolika je prosječna neto asimilacija uz pretpostavku linearne zavisnosti između lisne površine i suhe tvari biljke? (60 25) (ln34 ln 22) E = = 0,04g / dan / dm (34 22) (90 60) 2 PRODUKTIVNOST (C) Veličina prirasta ili produktivnost izražava se prema jednadžbi: dw C= dt P dw = razlika između dva uzastopna mjerenja produktivnosti (primarne prinos ili biomase kod utvrđivanja prirasta populacije) P = površina tla na koju se produktivnost odnosi Primjer: Na 10 ha utvrđen je biološki prinos šećera šećerne repe 6,5 t/ha nakon 160 dana vegetacije, a 20 dana kasnije 8,1 t/ha. Kolika je produktivnost usjeva? 8,1 6,5 C = = 0,008t / ha / dan ( ) 10 PROPORCIONALNA LISNA POVRŠINA (lisnatost, F) Proporcionalna lisna površina je omjer lisne površine i ukupne mase suhe tvari. F = Ovaj pokazatelj je relativna mjera fotosintetičke aktivnosti lišća i značajan je za utvrđivanje razlika između pojedinih sorti i biljnih vrsta. Zavisi od doba vegetacije. 58 A W

61 LISNA POKROVNOST (LAI) Lisna pokrovnost (LAI) je omjer između lisne površine populacije i površine tla kojoj ona pripada. Optimalna vrijednost LAI ima vrlo značajnu ulogu u produktivnosti biljaka. Teorijski optimum LAI je onda kada i najniži listovi dobivaju toliko svjetla da je omjer između fotosinteze i disanja veći od 1 (iznad kompenzacijske točke). Razlike između sorata mogu većim dijelom potjecati upravo od razlika u LAI jer je produktivnost fitocenoza (C) umnožak prosječne lisne pokrovnosti i čistog efekta asimilacije (E): C = L Optimalna veličina LAI za poljoprivredne vrste je između 3 i 5, a za travne fitocenoze 7 do 10 i zavisi uglavnom od vertikalne strukture fitocenoze. Integralna površina (LAD) je mjerilo sposobnosti biljaka da održe stvorenu lisnu površinu, što podrazumijeva i regeneraciju izgubljenog lišća. LAD se može brojčano iskazati kao površina ispod krivulje lisne površine u razdoblju vegetacije. Primjer: Jedna biljka pšenice ima razvijenih 5 listova prosječne površine 10, 12, 17, 25 i 32 cm 2. Koliki je LAI ako je sklop usjeva 700 biljaka/m 2? = = = = = Σ = cm 2 = 6,72 m 2 /m 2 tla E FOTOSINTETIČKI POTENCIJAL (FP) Veličina fotosintetičkog potencijala povezana je s otpornošću sorata prema nepovoljnim uvjetima. Prinos zrna pšenice stvara se uglavnom fotosintetičkom aktivnošću asimilacijskih organa u drugoj polovini vegetacije, zbog čega je naročito značajna veličina FP u razdoblju poslije klasanja. ( A FP= 2 A 2 1 ) dt( m 2 dan ) 59

62 ŽETVENI INDEKS (ŽI) Žetveni indeks (ŽI) je postotni udjel poljoprivrednog prinosa (urod) u ukupnoj biomasi (poljoprivredni prinos ili prirod). ŽI = Pp 100 Bp [%] Primjer: Ako je biološki prinos biljke (Bp) 4,502 g a prinos zrna (Pp) je 2,001 g koliki je udjel uroda u prinosu biljke? Biološki prinos biljke = 4,395 g (Bp) Prinos zrna biljke = 1,893 g (Pp) 2, ŽI = 4,502 [%] 60

63 3.6. UTVRĐIVANJE ALELOPATSKIH ODNOSA U KLIJANJU Uvod u vježbu Alelopatiju predstavljaju međusobni odnosi između biljnih vrsta koji se uspostavljaju putem specifičnih kemijskih supstanci koje biljke sintetiziraju i izlučuju u okolinu. Ova pojava se javlja između različitih biljnih vrsta divljih i kulturnih biljaka, a također postoji i u odnosu prema mikroorganizmima, a može se javiti u svim fazama razvoja biljnog organizma. Djelovanje sintetiziranih kemijskih supstanci se odražava na karakter i intenzitet fiziološkobiokemijskih procesa u biljkama, kao što su klijanje, rast, minerqalna ishrana, fotosinteza i disanje. Postojanje alelopatski odnosi u fazi klijanja sjemena se utvrđuje se izračunavanjem postotka isklijalih sjemenki različitih biljnih vrsta bez prisustva drugih sjemenki i u kombinacijama sa sjemenkama jedne ili dvije druge biljne vrste. Cilj Utvrditi postojanje alelopatskih odnosa u fazi klijanja sjemena između različitih biljnih vrsta. Materijal pribor i oprema: Petrijeve zdjelice, filter-papir, folija za konzerviranje, klima komora biljni materijal: sjeme: kukuruza, suncokreta, soje, graha, pšenice, ječma, zobi, raži reagensi: 0,1%-tni HgCl 2 - otopina za ispiranje sjemena (1 g HgCl 2 otopa se u 2,5 ml koncentrirane HCl i nadopuni destiliranom vodom do 1000 ml); 1%-tna otopina AgNO 3 -reagens za kontrolu uspješnosti ispiranja (1 g AgNO 3 otopiti u 60-ak ml destilirane vode, dodati 1-2 kapi dušične kiseline i nadopuniti vodom do 100 ml). Način izvođenja vježbe Prije postavljanja pokusa potrebno je obaviti dezinfekciju sjemena kako bi se uklonila epifitna mikroflora koja može biti specifična za pojedinu vrstu sjemena, te na kraju utjecati na postotak klijavosti, što ne bi bio realan pokazatelj alelopatskih odnosa između biljaka. Dezinfekcija se vrši potapanjem sjemna 3-5 minuta u 0,1 % otopinu HgCl 2. Nakon dezinfekcije sjeme se ispire destiliranom vodom. U destiliranu vodu kojom je sjeme isprano dodaje se nekoliko kapi 1 % otopine AgNO 3, kako bi provjerili uspješnost ispiranja. Ako se voda zamuti, potrebno je ponoviti ispiranje sve dok voda nakon dodavanja AgNO 3 ne ostane bistra. Sjeme se na klijanje postavlja u Petrijeve zdjelice istih dimenzija ili u filter papir. Za pokus se koristi sjeme tri različite biljne vrste, ali sličnih dimenzija sjemena, npr.: 1. kukuruz, suncokret, soja 2. kukuruz, suncokret, grah 3. pšenica, ječam, zob 4. pšenica, ječam, raž 5. konoplja, grahorica, rotkvica 6. ljulj, gorušica, lucerna. 61

64 Na Petrijeve zdjelice postavi se filter papir i navlaži destiliranom vodom te se na papir ravnomjerno rasporedi 50 sjemenki po slijedećoj shemi: sjemenki biljne vrste broj 1 (npr. pšenica) sjemenki biljne vrste broj 2 (npr. ječam) sjemenki biljne vrste broj 3 (npr. zob) sjemenki biljne vrste broj 1 i 25 sjemenki biljne vrste broj 2 (pšenica i ječam) sjemenki biljne vrste broj 1 i 25 sjemenki biljne vrste broj 3 (pšenica i zob) sjemenki biljne vrste broj 2 i 25 sjemenki biljne vrste broj 3 (ječam i zob) 7. po 17 sjemenki svake od tri ispitivane biljne vrste (pšenica, ječam i zob) Sjemenke se prekriju drugim filter papirom koji se također navlaži destiliranom vodom, zdjelice se prekriju zaštitnom foliju i postave na 25 C u klima komoru. Ako se sjemenke postavljaju na filter papir veličine A3 formata, papir je potrebno navlažiti i smotati u "rolu" te također postaviti na 25 C u klima komoru. Postotak klijanja sjemenki evidentira se svaki dan nakon početka klijanja, do sedmog dana klijanja, te se alelopatski odnosi utvrđuju kao razlika u postotku klijanja sjemena u jednovrsnim, dvojnim i trojnim uzorcima. Biljke se mogu uzgajati u istim kombinacijama 15 dana, te se utvrđuju alelopatski odnosi preko razlika u masi svježe ili suhe tvari razvijenih biljaka. Rezultati Radi utvrđivanja alelopatije pri klijanju postavljen je pokus sa sjemenjem pšenice, ječma i zobi. Nakon 7 dana broj proklijalih sjemenki bio je slijedeći: pšenica ječam zob posuda ukupno % razlika ukupno % razlika ukupno % razlika 1,2,3 40/50 10/50 35/ /25 3/ /25 10/25 6 1/25 15/25 7 6/17 3/17 0/17 U tablicu je potrebno upisati postotke klijavosti, te razlike u postotku klijavosti između sjemena pojedinih biljnih vrsta. 62

65 4. FIZIOLOGIJA STRESA KOD BILJAKA 4.1. ODREĐIVANJE DEFICITA DIFUZNOG PRITISKA (DDP) Uvod u vježbu Određivanje sile usvajanja vode (DDP) tkiva ili čitavih organa biljke obavlja se pronalaženjem otopine čiji osmotski pritisak odgovara ispitivanom uzorku te u njemu ne dolazi do usvajanja odnosno izdvajanja vode. Praktično mjerenje DDP uz pomoć refraktometra (slika 26) vrši se prema promjeni težine ili volumena biljnog tkiva kao i promjene koncentracije otopine u koju je tkivo potopljeno. Izotonične otopine su otopine čiji je osmotski potencijal, odnosno koncentracija otopljenih tvari jednaka onoj u stanicama biljnog tkiva. Otopine koje imaju manji osmotski potencijal, odnosno koncentraciju otopljenih tvari u odnosu na stanice biljnog tkiva su hipotonične i u njima dolazi do povećanja koncentracije otopljenih tvari uslijed prelaska vode u ispitivano tkivo koje povećava svoj volumen. Otopine s većom početnom koncentracijom zbog svog većeg osmotskog potencijala izvlače vodu iz stanica tkiva (plazmoliza), te pri tome smanjuju svoju koncentraciju (sadržaj suhe tvari im se smanjuje) a volumen tkiva se smanjuje. Takve otopine nazivaju se hipertonične. Slika 26. Refraktometar Cilj Odrediti silu usvajanja vode biljnog materijala pomoću refraktometra. Materijal pribor i oprema: 10 kemijskih epruveta, nož, metalna žlica, 5 odmjernih tikvica od 50 ml, stalak za epruvete, pipeta od 10 ml, milimetarski papir, ravnalo, sat, vaga, refraktometar biljni materijal: gomolj krumpira reagensi: destilirana voda; otopine saharoze od 0,2 do 1 mol/dm 3 Način izvođenja vježbe Priredi se niz otopina saharoze od 0,2 do 1,0 mol/dm 3 i prenese po 10 ml u dva niza epruveta. U jedan niz otopina se potope komadići ispitivanog biljnog tkiva (podjednakog broja i veličine). U otopinama bez biljnog tkiva se odredi refraktometrom refrakcijski indeks ili % suhe tvari. Nakon 30 minuta utvrđuje se koncentracija otopina saharoze u kojima je bilo biljno tkivo. Otopina u kojoj nema promjene koncentracije (% suhe tvari) ima osmotsku vrijednost jednaku osmotskoj vrijednosti biljnog tkiva. U slučaju da se ta vrijednost nalazi između dvije 63

66 molarne koncentracije saharoze, tražena koncentracija se izračuna interpolacijom uz pomoć kalibracijskog dijagrama. Na apscisu koordinatnog sustava se nanosi koncentracija saharoze (0,2-1,0 M) a na ordinatu % suhe tvari otopine. Unošenjem podataka za otopine bez biljnog tkiva i povezivanjem dobivenih točaka dobije se pravac broj 1, a podaci za otopine s biljnim tkivom daju pravac broj 2. Iz sjecišta ovih pravaca se spuštanjem okomice na apscisu očitava koncentracija (c) izotonične otopine saharoze. DDP se računa prema izrazu: DDP = R T i c R [kpa dm3k -1 mol -1 ] - opća plinska konstanta (8,314 kpa dm3k -1 mol -1 ; 8,314 JK -1 mol -1 ) T [K]- apsolutna temperatura (K = C) c [mol dm -3 ] - koncentracija izotonične otopine saharoze i - izotonični koeficijent Van t Hoffa (za neelektrolite = 1, za elektrolite > 1, npr. za NaCl i KCl = 1,5) 1. primjer rezultata analize, konstrukcije dijagrama i izračunavanja DDP: br. koncentracija saharoze [mol/dm 3 ] % ST u otopinama bez biljnog tkiva (očitanje refraktometrom) % ST 30 min. nakon potapanja biljnog tkiva u otopine (očitanje refraktometrom) 1. 0,2 6,3 6,8 2. 0,4 12,6 12,0 3. 0,6 18,4 17,3 4. 0,8 24,3 22,4 5. 1,0 30,0 26,9 Na grafikonu je prikazan pravac % ST u seriji otopina saharoze bez biljnog tkiva (crveni pravac) i pravac % ST 30 min. nakon uranjanja biljnog tkiva u seriju otopina saharoze (plavi pravac). Spuštanje okomice na X os iz sjecišta navedenih pravaca daje koncentraciju izotonične otopine (0,285 mol/dm 3 ). Sve otopine saharoze s nižim početnim koncentracijama saharoze (lijevo od sjecišta: samo otopina 0,2 mol/dm 3 ) su hipotonične i u njima je došlo do povećanja koncentracije nakon potapanja tkiva u otopinu, a desno od sjecišta su otopine s višom početnom nego konačnom koncentracijom (hipertonične otopine) i u njima je došlo do pada koncentracije nakon potapanja biljnog tkiva zbog izlaska vode iz tkiva u okolnu otopinu. 64

67 35 % ST hipotonična otopina izotonična otopina hipertonične otopine 5 0 0,2 0,285 0,4 0,6 0,8 1,0 (c) otopina saharoze nakon 3/4 h Izračunavanje DDP za tkivo gomolja krumpira (temperatura pri analizi je bila 18 C): DDP = - 8,314 [kpa dm 3 K -1 mol -1 ] 291[K] 1 0,285 [mol dm -3 ]= - 689,5 kpa 2. primjer rezultata analize, konstrukcije dijagrama i izračunavanja DDP: br. koncentracija saharoze [mol/dm 3 ] % ST u otopinama bez biljnog tkiva (očitanje refraktometrom) % ST 30 min. nakon potapanja biljnog tkiva u otopine (očitanje refraktometrom) 1. 0,2 6,3 7,6 2. 0,4 12,6 12,8 3. 0,6 18,4 18,0 4. 0,8 24,3 23,2 5. 1,0 30,0 28,4 Na grafikonu je prikazan pravac % ST u seriji otopina saharoze bez biljnog tkiva (crveni pravac) i pravac % ST 30 min. nakon uranjanja biljnog tkiva u seriju otopina saharoze (plavi pravac). Spuštanje okomice na X os iz sjecišta navedenih pravaca daje koncentraciju izotonične otopine (0,47 mol/dm 3 ). Sve otopine saharoze s nižim početnim koncentracijama saharoze (lijevo od sjecišta: otopine 0,2 i 0,4 mol/dm 3 ) su hipotonične i u njima je došlo do povećanja koncentracije nakon potapanja tkiva u otopinu, a desno od sjecišta su otopine s višom početnom nego konačnom koncentracijom (hipertonične otopine) i u njima je došlo do pada koncentracije nakon potapanja biljnog tkiva zbog izlaska vode iz tkiva u okolnu otopinu. 65

68 % ST hipotonične otopine izotonična otopina hipertonične otopine 5 0 0,47 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 (c) otopina saharoze nakon 1/2 h Izračunavanje DDP za tkivo gomolja krumpira (temperatura pri analizi je bila 18 C): DDP = - 8,314 [kpa dm 3 K -1 mol -1 ] 291[K] 1 0,47 [mol dm -3 ] = ,1 kpa 66

69 Rezultati br. koncentracija saharoze [mol/dm 3 ] 1. 0,2 2. 0,4 3. 0,6 4. 0,8 5. 1,0 % ST u otopinama bez biljnog tkiva % ST 30 min. nakon potapanja biljnog tkiva u otopine 67

70 4.2. ODREĐIVANJE EVAPOTRANSPIRACIJE LISTA Uvod u vježbu Gubitak vode iz zeljastih biljnih dijelova značajno ovisi o temperaturi sredine i uvjetima osvjetljenosti. Voda u obliku vodene pare izlazi iz lista najvećim dijelom kroz puči (stomatalna transpiracija), ali i evaporacijom s površine, nakon prolaska kroz kutikulu. Ovisno o kemijskom sastavu kutikule, biljne vrste se značajno razlikuju po intenzitetu gubitka vode evaporacijom (kutikularna transpiracija). Cilj Utvrditi prosječni gubitak vode iz lista zeljastih biljaka u određenom vremenskom periodu. Materijal pribor i oprema: laboratorijska vaga, klima komora biljni materijal: list neke zeljaste bijke (salata, kupus), list bršljana Način izvođenja vježbe Vaganjem se utvrdi svježa masa lista, slika 27. List se izloži djelovanju različitih temperaturnih tretmana (15, 25, 30 o C), kao i utjecaju svijetlosti, odnosno mraka. Nakon određenog perioda (npr. 2 h), ponovnim vaganjem utvrdi se razlika u masi lista, koja predstavlja gubitak vode evapotranspiracijom. Evapotranspiracija se izrazi kao postotna razlika u masi lista. Rezultati List zeljaste biljke Početna masa lista na 15 o C, u mraku: Konačna masa lista nakon 2 h: g Intenzitet evapotranspiracije: % g Početna masa lista na 25 o C, na svjetlu: Konačna masa lista: g Intenzitet evapotranspiracije: % List bršljana Početna masa lista na 15 o C, u mraku: Konačna masa lista nakon 2 h: g Intenzitet evapotranspiracije: % g g Slika 27. Vaganje lista Početna masa lista na 25 o C, na svjetlu: Konačna masa lista: g Intenzitet evapotranspiracije: % g 68

71 Zbog čega se javlja razlika u intenzitetu evapotranspiracije lista zeljaste biljke i bršljana? 69

72 4.3. ODREĐIVANJE SADRŽAJA PROLINA Uvod u vježbu Jedna od najčešćih reakcija živih organizama na vodni deficit je stvaranje i akumulacija osmotski aktivnih neutralnih organskih spojeva kao što su šećeri i neke aminokiseline (prolin; slika 28). Povećanje koncentracije osmolita omogućuje da se iz vanjske sredine usvoji dodatna količina vode a osim toga kompatibilni osmoliti stabiliziraju strukturu proteina. stoga ovakvi spojevi imaju važnu ulogu u adaptaciji citoplazme na različite vrste stresa. Prolin štiti membrane i proteine od štetnog djelovanja visokih koncentracija anorganskih iona i temperaturnih ekstrema. Akumulira se u citoplazmi gdje u stresnim uvjetima može činiti i više od 80% slobodnih aminokiselina, s koncentracijom i do 200 mm, čime značajno doprinosi osmotskoj regulaciji citoplazme. Otpornost genotipova prema stresnim uvjetima može se ocijeniti prema sposobnosti akumulacije slobodnog prolina. Cilj Odrediti sadržaj aminokiseline prolin u biljnom materijalu. Slika 28. Strukturna formula prolina (preuzeto s ile:(s)-prolin.png ) Materijal pribor i oprema: tarionik, tučak, špatula, staklene epruvete, plastične epruvete sa čepovima, lijevci, filter-papir Whatman br. 2, posuda za inkubaciju na kupelji ili sušionik za suhu inkubaciju biljni materijal: 0,5 g biljnog tkiva reagensi: sulfosalicilna kiselina; ninhidrin reagens; kvarcni pijesak; toluen; osnovni standard prolina Način izvođenja vježbe Ekstrakcija prolina iz stanica vrši se pomoću sulfosalicilne kiseline, slijedi reakcija s ninhidrinom, koji s amino i imino grupama aminokiselina daje crvenkasto obojenje čiji intenzitet ovisi o koncentraciji prolina se mjeri spektrofotometrijski na 520 nm nakon odvajanja prolin-ninhidrin kompleksa (Ruheman's purple) toluenom, slika 29. ninhidrin aminokiselina Ruheman's purple Slika 29. Prikaz nastanka kompleksa Ruhenan s purple koji daje specifično crvenkasto obojenje, spajanjem ninhidrina i aminokiselina 70

73 0,5 g biljnog materijala se homogenizira s 10 ml sulfosalicilne kiseline uz dodatak kvarcnog pijeska (na vrh noža) i profiltrira kroz filter papir Whatman br 2 u staklenu epruvetu. Otpipetira se 2 ml filtrata u plastičnu epruvetu i doda 2 ml ninhidrin reagensa i 2mL ledene octene kiseline. Inkubacija se vrši na C 1 h, te se nakon inkubacije reakcija prekida prenošenjem epruveta na led. Ekstrahirati prolin dodavanjem po 4 ml toluena, uz vorteksiranje s. Nakon što se epruvete zagriju na sobnu temperaturu i odvoji toluenski sloj, automatskom pipetom se pipetira toluenski sloj s ekstrahiranim prolinom u kivetu za spektrofotometar. Mjeri se transmisija na 520 nm uz podešavanje 0 čistim toluenom a 100% transmisije s a standardom 0. Standardi se rade paralelno sa uzorcima, dodavanjem ninhidrina i octene kiseline. Radni standardi: - u 6 epruveta otpipetira se: ml razr. osn. standarda ml dest. vode konc: µg prolina /2 ml Formula za preračuna sadržaja prolina na svježu tvar biljke: Sadržaj prolina ( µ g/gs SvT) 5* X = odvaga uzorka u g X [µg prolina/2 ml] - conc. prolina s kalibracijskog dijagrama (conc. standarda µg prolina/2 ml) 5 - razrjeđenje pri ekstrakciji (1 g uzorka u 10 ml sulfosalicilne kiseline, od toga 2 ml uzeto za određivanje) Rezultati 71

74 4.4. ODREĐIVANJE SADRŽAJA VITAMINA C Uvod u vježbu Askorbinska kiselina (C vitamin) se nalazi u različitim tkivima biljaka. Predstavlja značajan reducens I poznato je da štiti klorofile od oksidativne fotodestrukcije kisikom koji se oslobađa fotolizom vode. Također sudjeluje u zaštiti stanica od oksidacijskog stresa uzrokovanog prisustvom slobodnih kisiskovih radikala. U prisustvu enzima oksidaze askorbinske kiseline dolazi do oksidacije AK u DHAK (dehidroaskorbinsku kiselinu), stoga se ekstrakcija AK iz tkiva vrši pomoću metafosforne kiseline, koja inaktivira prisutnu oksidazu u stanicama. Cilj Odrediti koncentraciju C vitamina (askorbinske kiseline) u biljnom materijalu Materijal pribor i oprema: digitalni titrator, tarionik, tučak, lijevci, filter-papir, Erlenmeyer tikvica 200 ml biljni materijal: plod paprike reagensi: DCIP (2,6-diklorofenol-indofenol); AK (askorbinska kiselina); metafosforna kiselina Način izvođenja vježbe Reagens DCIP (2,6-diklorofenol-indofenol) ima plavu boju u alkalnoj a ružičastu u kiseloj sredini. AK ga reducira u bezbojni oblik pri čemu se sama oksidira do DHAK (dehidroaskorbinska kiselina; slika 30). Prema tome, 1 ml otopine askorbinske kiseline (AK) titrira se sa DCIP (diklorofenolindofenol). Pri titraciji ružičasta boja treba ostati 15 s. 1 g tkiva izmacerirati s metafosfornom kiselinom, profiltrirati i 5 ml ekstrakta titrirati s DCIP. Kada se pri titraciji AK ekstrahirane iz biljnog tkiva metafosfornom kiselinom dodaje DCIP, AK se prevodi u DHAK (slika 30), a otopina ostaje bezbojna sve dok se ne potroši sva količina AK u uzorku. Daljnjim dodavanjem DCIP otopina ostaje ružičasta što označava kraj titracije. Količina utrošenog DCIP preračunava se na mg AK/100 g uzorka. Slika 30. Strukturne formule askorbinske kiseline (lijevo) i dehidroaskorbinske kiseline (desno) 72

75 faktor DCIP = 4mgAK ml DCIP Izračun sadržaja vitamina C se dobije prema sljedećoj jednadžbi: Sadržaj C vit (mg AK/100 g uzorka) = mg AK u alikvotu x Faktor DCIP x 2 x 100 Rezultati 73

76 4.5. ZAŠTITNO DJELOVANJE ŠEĆERA PRI NISKIM TEMPERATURAMA Uvod u vježbu Na temperaturama ispod 0 C životna aktivnost je jako umanjena te prestaje na oko -10 C. Međutim, neke biljke bez većih posljedica na kasniji rast i razvoj mogu prezimiti i puno niže temperature zraka. Dugotrajno djelovanje niskih temperatura, ili naglo spuštanje temperatura ispod 0 C imaju za posljedicu narušavanje vodnog režima biljke, narušavanje staničnih fizioloških procesa, narušavanje proteinsko pigmentskih struktura, a mogu se pojaviti i mehanička oštećenja membrana kristalićima leda. Biljni organizam koji nepripremljen ulazi u hladan period tokom rasta, često zbog navedenih posljedica smrzavanja odumire ili se narušavanje fiziološko-biokemijskih procesa odražava na kasnije etape rasta i razvoja. Građa protoplazme narušava se djelovanjem niskih temperatura te iz staničnog soka obojenih biljnih tkiva izlaze pigmenti, koji specifično bojaju otopinu u koju je biljno tkivo potopljeno. Cilj Dokazati da šećeri štite stanicu od pucanja membrana biljnog tkiva izloženog djelovanju niskih temperatura. Materijal pribor i oprema: skalpel, epruvete, gumeni čepovi, tikvice od 100 ml, pinceta biljni materijal: list crvenog kupusa ili lisna drška cikle reagensi: 0,5 M i 1 M otopina saharoze; smjesa za hlađenje (led u koji se dodaje 33g NaCl na 100 g leda ili 59 g NaNO 3 na 100 g leda) Način izvođenja vježbe Pripremi se 100 ml 1 M i 0.5 M otopine saharoze. Skalpelom ili žiletom se odreže površinski sloj stanica lista crvenog kupusa ili lisne drške cikle, (oko 25 mm 2 ). Bitno je da sloj odrezanih stanica bude što tanji. Priređeni preparati stave se u tri epruvete napunjene s 8 ml destilirane vode, odnosno 0.5 M ili 1.0 M otopinom saharoze i zatvore čepovima. Sadržaj otopine u epruvetama zamrzava se pomoću smjese za hlađenje na temperaturi oko -20 C. Nakon 20-ak minuta zamrzavanja, epruvete se stave u posudu s vodom gdje se otapa zaleđeni sadržaj epruveta. Preparati se vade iz otopine (ili se otopina filtrira kroz filter papir) i promatraju morfološke promjene stanica i promjene u boji tkiva i otopine. 74

77 Rezultati i zaključak Detaljno opiši morfološke i fiziološke promjene koje su se dogodile na ispitivanim uzorcima uslijed izloženosti niskim temperaturama tj. smrzavanju. Potrebno je zaključiti preko kojih se staničnih fizioloških procesa, a koji se odnose na usvajanje i otpuštanje vode, manifestira zaštitna uloga šećer 75

78 4.6. AKTIVNOST ENZIMA KATALAZE Uvod u vježbu Katalaza (EC , H 2 O 2 :H 2 O 2 oksidoreduktaza) je enzim pronađen u biljkama, životinjama i aerobnim mikroorganizmima gdje katalizira brzu razgradnju vodikova peroksida. Unutar stanice katalaze ima dosta u peroksisomima i katalitički je vrlo aktivna. Biljne su katalaze tetramerni enzimi, molekulske mase od 54 do 59 kda te sadrže hem kao prostetičku skupinu. Ovaj enzim pokazuje dvojnu katalitičku aktivnost, katalaznu i peroksidaznu. Pri katalaznoj aktivnosti enzim katalizira razgradnju vodikova peroksid na vodu i kisik: 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 dok pri peroksidaznoj aktivnosti enzim katalizira oksidaciju supstrata (metanol, etanol, formaldehid, nitrit ili elementarna živa) pri čemu nastaje voda: supstrat + 2H 2 O 2 oksidirani supstrat + 2H 2 O Velika važnost brze katalize vodikova peroksida potrebna je stoga jer je on snažan i jako reaktivan oksidans koji može oštetiti biološke molekule i time uzrokovati metaboličke poremećaje. Vodikov peroksid nastaje kao produkt u mnogim reakcijama procesa fotosinteze i staničnog disanja (slika 31), a javlja se i kao produkt djelovanja oksidaza kao što su primjerice glukoza oksidaza, NADPH oksidaza i razne aminokiselinske oksidaze. Slika 31. Glavni izvori vodikova peroksida tijekom fotosinteze u C3 biljkama. CLK, ciklus limunske kiseline; SOD, superoksid dismutaza; PSI, fotosustav I; PSII, fotosustav II. ( Preuzeto iz I. Ślesak et al. ref ) 76