Επίπεδα APC-R σε ασθενείς με μεταμόσχευση ήπατος

Transcript

1 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΑΣ Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Γενικό Νοσοκομείο Αθηνών Ιπποκράτειο ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Επίπεδα APC-R σε ασθενείς με μεταμόσχευση ήπατος THESIS APC-R levels in patients who have undergone liver transplantation ΟΝΟΜΑΤΑ ΦΟΙΤΗΤΩΝ/NAMES OF STUDENTS Ουέρκνεχ Σέλαμ Workneh Selam ΟΝΟΜΑΤΑ ΕΙΣΗΓΗΤΗ κ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΝΤΑ/NAMES OF SUPERVISORS Κ. Παύλου Έφη Mrs. Pavlou Efi ΑΘΗΝΑ/ATHENS

2 2

3 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 6 ABSTRACT Ήπαρ Βασικά ανατομικά στοιχεία ήπατος Βασικές λειτουργίες ήπατος Αναγέννηση ήπατος Παθολογία του ήπατος Μεταμόσχευση ήπατος Αιμόσταση Πρωτογενής αιμόσταση Δευτερογενής αιμόσταση ή Πήξη του αίματος Καταρράκτης της πήξης Ενδογενής οδός Εξωγενής οδός Κοινή οδός Κυτταρικό μοντέλο της πήξης Ρυθμιστικοί και αντισταθμιστικοί μηχανισμοί της πήξης Αντιθρομβίνη Αναστολέας της οδού του ιστικού παράγοντα Πρωτεΐνες C και S Ινωδόλυση Ενεργοποιητές του πλασμινογόνου Αναστολείς του ινωδολυτικού μηχανισμού Πρωτεΐνη C Ενεργοποίηση και δράση της πρωτεΐνης C Παράγοντας V Leiden και αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνης C Πειραματικό μέρος Σκοπός Υλικά και μέθοδοι Αναλώσιμα υλικά Αντιδραστήρια Λήψη και προετοιμασία δειγμάτων Αποτελέσματα

5 4.4.1 Δείγμα Δείγμα Δείγμα Συμπεράσματα-Συζήτηση Παράρτημα Βιβλιογραφία

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Οι ηπατοπαθείς και οι ασθενείς με μεταμόσχευση ήπατος είναι επιρρεπής στο να αναπτύξουν ανωμαλίες στη πήξη του αίματος, καθώς όλες οι πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε αυτήν τη διαδικασία, παράγονται στο ήπαρ. Η πρωτεΐνη C αποτελεί φυσικό ανασταλτή και ρυθμιστή της πήξης. Στην ενεργοποιημένη της μορφή αποδομεί τον παράγοντα V και σταματά τη προπηκτική του δράση. Ορισμένες μεταλλάξεις του παράγοντα V δεν επιτρέπουν την αποικοδόμηση του (αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C) και οδηγούν σε θρομβωτικά επεισόδια. Η πιό συχνή μετάλλαξη είναι ο παράγοντας V Leiden. ΜΕΘΟΔΟΙ: Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν 8 δείγματα ασθενών οι οποίοι είχαν προηγουμένως υποβληθεί σε μεταμόσχευση ήπατος. Πραγματοποιήθηκε έλεγχος αντίστασης στη ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C (APCR) και μοριακός έλεγχος για τον παράγοντα V Leiden. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η πλειοψηφία των αποτελεσμάτων εμφάνισε συμφωνία τόσο μεταξύ των 2 ελέγχων που πραγματοποήθηκαν όσο και με τη διεθνή βιβλιογραφία. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον όμως είχαν 3 περιπτώσεις που εμφάνιζαν παθολογική APCR χωρίς κάποια προφανή μετάλλαξη που να τη δικαιολογεί. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας δεν μπορεί να διεξαχθεί ένα ασφαλές συμπέρασμα για το ποιά άλλη αιτία μπορεί να είναι υπεύθυνη για την εμφάνιση APCR σε ασθενείς με μεταμόσχευση ήπατος. Κρίνεται σκόπιμη η περαιτέρω εργαστηριακή διερεύνηση και η πραγματοποίηση ερευνών με μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων καθώς και η μελέτη επιπλέον παραγόντων που ίσως να επηρεάζονται κατα τη μεταμόσχευση. 6

7 ABSTRACT BACKROUND: Patients with liver disease and patients who have undergone liver transplantation are more prone to develop blood coagulation anomalies. That is due to the fact that all the proteins involved in the blood coagulation mechanism are produced in the liver. Protein C is a natural inhibitor and regulator of the coagulation process. In its activated form, protein C degrades coagulation factor V and stops its pro-coagulant effect. Certain mutation of factor V don t allow its degradation (activated protein C resistance), thus resulting in thrombotic episodes. The most common mutation of this kind is factor V Leiden. METHODS: In this research 8 samples, from patients who have undergone liver transplantation, were analyzed. The samples were subjected to an activated protein C resistance test and they were also tested for the factor V Leiden mutation. RESULTS: The majority of the results were in correlation, both between the two different tests performed and between the existing literature. But 3 samples had particularly interesting results, as they were exhibiting a pathological APCR result but no mutation to justify it. CONCLUSIONS: Based on the results of this research, a solid conclusion cannot be reached about what other cause could be underlying under the activated protein C resistance in liver transplanted patients. The conduction of further research is suggested with a greater number of samples and the testing of other factors that could be affected by a liver transplantation. 7

8 1 Ήπαρ 1.1 Βασικά ανατομικά στοιχεία ήπατος Το ήπαρ είναι βοηθητικό όργανο της πέψης. Βρίσκεται στην άνω δεξιά κοιλία, κάτω από το διάφραγμα, και αποτελεί το μεγαλύτερο όργανο του ανθρώπινου σώματος με βάρος περίπου 1,5 kg. Η δομή του αποτελείται από δύο κύριος λοβούς, τον μεγαλύτερο δεξιό λοβό και τον μικρότερο αριστερό λοβό. Ο κάθε λοβός αποτελείται από τμήματα. Οι δύο λοβοί χωρίζονται μεταξύ τους από τον δρεπανοειδές σύνδεσμο, ο οποίος βοηθά στην πρόσδεση του ήπατος στο διάφραγμα. Το όργανο καλύπτεται ολόκληρο από μια λεπτή στερεή κάψα συνδετικού ιστού, την κάψα του Glisson. Στη πύλη του ήπατος εισέρχονται τα αιμοφόρα αγγεία και λεμφαγγεία και εξέρχονται οι ηπατικοί πόροι. Η κάψα συνοδεύει τις κυριότερες διακλαδώσεις αυτών των αγγείων εκπέμποντας προεκβολές (έλυτρα του Glisson) που περιβάλλουν τα ανατομικά στοιχεία της πύλης. Η αιμάτωση του ήπατος πραγματοποιείτε μέσω της πυλαίας φλέβας και της ηπατικής αρτηρίας. Το 70% του αίματος προέρχεται από τη πυλαία και πρόκειται για μερικώς οξυγονωμένο αίμα που μεταφέρει θρεπτικά συστατικά κ ορμόνες από τον πεπτικό σωλήνα. Το υπόλοιπο 30% είναι οξυγονωμένο αρτηριακό αίμα. (1) (2) 8

9 Εικόνα 1 Η ανατομία του ήπατος 1.2 Βασικές λειτουργίες ήπατος Η σημαντικότερη και ζωτικής σημασίας λειτουργία του ήπατος είναι η αποθήκευση και ο μεταβολισμός θρεπτικών ουσιών όπως σάκχαρα, λιπίδια, πρωτεΐνες και βιταμίνες. Παράλληλα μεταβολίζει ενδογενείς ουσίες (οιστρογόνα, χολερυθρίνη κ.α.) και είναι υπεύθυνο για την βιο-μετατροπή ξενοβιοτικών ουσιών, ρυπογόνων και φαρμάκων προκειμένου να ακολουθήσει η αποβολή του από τον οργανισμό με τα ούρα. Εκτός από τον μεταβολισμό ουσιών, το ήπαρ είναι υπεύθυνο και την σύνθεση μερικών. Συνθέτει όλες τις πρωτεΐνες του πλάσματος (έκτος από τις ανοσοσφαιρίνες). Παράγει ορισμένα ένζυμα, όλους τους παράγοντες πήξης καθώς και όλους τους ινωδολυτικούς παράγοντες. 9

10 Άλλες λειτουργίες του ήπατος είναι η αιμοποιητική λειτουργία κατά την εμβρυική ζωή, η αποθήκευση ουσιών (π.χ.: γλυκογόνο, ιχνοστοιχεία), η κάθαρση αντιγόνων κ.α. (1) 1.3 Αναγέννηση ήπατος Το ήπαρ έχει την μοναδική ικανότητα να ανασυνθέτει τμήματά του, που έχουν αφαιρεθεί, ώστε να συνεχίσει να λειτουργεί φυσιολογικά. Έως και το 80% της ηπατικής λειτουργίας μπορεί να διατηρηθεί μετά από την αφαίρεση ενός μεγάλου τμήματος του ήπατος. Η διαδικασία της αναγέννησης διαρκεί αρκετούς μήνες έως ότου αντικατασταθεί πλήρως ο ηπατικός ιστός που έλειπε. Η χρονική διάρκεια της διαδικασίας αυτής εξαρτάται από την ηλικία και την διατροφή του ατόμου, την ύπαρξη ηπατικής βλάβης καθώς και από το μέγεθος του αφαιρεθέντος τμήματος (3) (4) 1.4 Παθολογία του ήπατος Οι ηπατοπάθειες μπορεί να είναι ποικίλης αιτιολογίας. Ανεξάρτητα του παράγοντα που προκάλεσε τη βλάβη στο ήπαρ όλες οι ηπατοπάθειες έχουν παρόμοια εξέλιξη. Στα κλασικά συμπτώματα περιλαμβάνονται: ίκτερος, ναυτία, εμετός, φαγούρα, πρησμένα κάτω άκρα και σκουρόχρωμα ούρα. Με την εξέλιξη της νόσου συνήθως εμφανίζεται κίρρωση η οποία αντιπροσωπεύει το τελικό ιστολογικό μονοπάτι μιας πληθώρας χρόνιων ηπατοπαθειών (5). Κληρονομούμενες ηπατοπάθειες, όπως η αιμοχρωμάτωση (6), νόσος του Wilson (7), η πρωτοπαθής χολική κίρρωση (8), η πρωτοπαθής σκληρυντικής χολαγγειίτιδα (9) Οξείες ιογενείς ηπατίτιδες: αναφέρονται στην φλεγμονή του ήπατος που οφείλεται σε ιούς. Ο όρος ιογενής ηπατίτιδα μπορεί να αναφέρεται είτε στην κλινική νόσο, είτε στα ιστολογικά ευρήματα που σχετίζονται με αυτήν. Η κλινική κατάσταση της οξείας λοίμωξης από ιό της ηπατίτιδας μπορεί να ποικίλλει από ασυμπτωματική νόσο, αυτοπεριοριζόμενη συμπτωματική νόσο μέχρι κεραυνοβόλο ηπατική ανεπάρκεια (10). Οι ιοί που προκαλούν 10

11 συχνότερα οξείες ιογενείς ηπατίτιδες είναι ο ιός της ηπατίτιδας Α (ΗΑV), ο ιός της ηπατίτιδας Β (ΗΒV) και ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV). Ενήλικες με ηπατίτιδα Α ή Β εμφανίζουν συνήθως συμπτώματα, ενώ ασθενείς με οξεία ηπατίτιδα C μπορεί είτε να εμφανίσουν, ή όχι συμπτώματα. Επίσης, προκαλούν σπάνια ιογενή ηπατίτιδα ο κυτταρομεγαλοϊός (CMV) και ο ιός Epstein-Barr (EBV) (11). Χρόνια ιογενής ηπατίτιδα Β: η πιθανότητα εμφάνισης της χρόνιας λοίμωξης της ηπατίτιδας Β σχετίζεται με την ηλικία, που εκτέθηκε το άτομο στον ιό. Συγκεκριμένα το 90% των βρεφών που θα εκτεθούν στον ΗΒV θα αναπτύξουν χρόνια ηπατίτιδα Β, έως και 50% των παιδιών ηλικίας 1 έως 5 που εκτέθηκαν στον ΗΒV θα αναπτύξουν χρόνια ηπατίτιδα Β, ενώ το 5 με 10% των ενηλίκων που μολύνθηκαν από τον ΗΒV θα αναπτύξουν χρόνια λοίμωξη (12). Οι ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β έχουν μη φυσιολογικές ιστοχημικές εξετάσεις ήπατος και αιματολογικές εξετάσεις που επιβεβαιώνουν την ενεργό αντιγραφή και φλεγμονώδη ή ινωτική λειτουργία του ΗΒV. Το 20% των ασθενών με θετικό αυστραλιανό αντιγόνο (HBsAg) θα αναπτύξουν κίρρωση ή ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ) (13). Η ενσωμάτωση του ΗΒV στο γονιδίωμα του ηπατοκυττάρου μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση των ογκογονιδίων ή στην αναστολή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (14). Χρόνια ιογενής ηπατίτιδα C: ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV) μπορεί να προκαλέσει οξεία και χρόνια λοίμωξη. Περίπου 15 με 45% των μολυσμένων ατόμων θα εξαφανήσουν αυτόματα τον ιό μέσα σε έξι μήνες χωρίς να λάβουν θεραπεία. Το υπόλοιπο 55 με 85% των ατόμων θα αναπτύξουν χρόνια HCV λοίμωξη. Ο κίνδυνος εμφάνισης κίρρωσης στους ασθενείς αυτούς είναι 15 με 30% σε 20 χρόνια. Αυτοάνοση ηπατίτιδα. Xαρακτηρίζεται από συνεχιζόμενη φλεγμονή και νέκρωση των ηπατοκυττάρων και έχει την τάση να εξελίσσεται σε κίρρωση. Η ακριβής αιτιολογία της είναι άγνωστη αλλά η παθογένεση της περιλαμβάνει τον συνδυασμό της γενετικής προδιάθεσης και των 11

12 περιβαλλοντικών ερεθισμάτων (15). Η γενετική προδιάθεση μπορεί να σχετίζεται με διάφορες βλάβες στον ανοσολογικό έλεγχο της αυτοαντιδραστικότητας (16). Ένας περιβαλλοντικός παράγοντας διεγείρει την ανοσολογική απάντηση έναντι ηπατικών αντιγόνων, με αποτέλεσμα την φλεγμονή και νέκρωση των ηπατοκυττάρων, την ίνωση και τελικά την κίρρωση (17). Μη αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος (non alcoholic fatty liver disease, NAFLD). Η επικράτηση της σχετίζεται με την δραματική αύξηση της παχυσαρκίας και του διαβήτη (18). Πλέον, η NAFLD αναγνωρίζεται ως η αιτιολογία πολλών περιστατικών που είχαν προηγουμένως χαρακτηριστεί ως κρυπτογενής κίρρωση (19). Αλκοολική ηπατοπάθεια (alcoholic liver disease, ALD): το εύρος των βλαβών του ήπατος που σχετίζονται με το αλκοόλ ποικίλλουν από απλή στεάτωση μέχρι κίρρωση του ήπατος. Αυτά δεν αποτελούν απαραίτητα ξεχωριστά στάδια εξέλιξης της νόσου, αλλά πολλαπλά στάδια τα οποία μπορεί να βρίσκονται ταυτόχρονα σε ένα άτομο (20). Τα στάδια αυτά κατηγοριοποιούνται σε τρία ιστολογικά στάδια της αλκοολικής ηπατοπάθειας: απλή στεάτωση ή λιπώδες ήπαρ, αλκοολική ηπατίτιδα και χρόνια ηπατίτιδα με ηπατική ίνωση και κίρρωση (21). Το λιπώδες ήπαρ εμφανίζεται στο 90% των ατόμων που καταναλώνουν περισσότερα από 60 g/ημέρα αλκοόλ (22), αλλά μπορεί να εμφανιστεί και σε άτομα που καταναλώνουν λιγότερη ποσότητα (23). Η ποσότητα της αλκοόλης που καταναλώνεται είναι ο σημαντικότερος παράγοντας κινδύνου για την εμφάνιση της ALD (24). Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, εμφανίζεται ως επί τω πλείστων σε ασθενείς με υποκείμενη χρόνια ηπατοπάθεια και κίρρωση (25). Οξεία ηπατική ανεπάρκεια: είναι μια σπάνια κατάσταση η οποία οδηγεί σε ταχύτατη αλλοίωση της λειτουργίας του ήπατος. Εκδηλώνεται με διαταραχές στη πήξη και εγκεφαλοπάθεια μέσα σε σύντομο χρονικό 12

13 διάστημα (από 1 έως 4 εβδομάδες) σε προηγουμένως υγιείς ανθρώπους (26). Κίρρωση: ορίζεται ιστολογικά ως μια διάχυτη ηπατική διαδικασία, που χαρακτηρίζεται από ίνωση και αντικατάσταση του ηπατικού ιστού από επουλωτικό, συνδετικό, σκληρό ιστό (27). Εκτός από την ίνωση, περιλαμβάνονται και άλλες επιπλοκές στην κίρρωση, όπως πυλαία υπέρταση, ασκίτης, ηπατονεφρικο σύνδρομο, ηπατική εγκεφαλοπάθεια και διαταραχές της πήξης. Η αιτιολογία της κίρρωσης διαφέρει γεωγραφικά, με τον αλκοολισμό την χρόνια ηπατίτιδα C και την NAFLD, να είναι οι πιο κοινές αιτίες κίρρωσης του ήπατος στις δυτικές χώρες (28). Αντίθετα η χρόνια ηπατίτιδα Β είναι η πιο κοινή αιτία στην Ασία και την περιοχή του Ειρηνικού Ωκεανού (29). Η κίρρωση του ήπατος μπορεί να οφείλεται και σε άλλες καταστάσεις, όπως διάφορες συγγενείς διαταραχές (αιμοχρωμάτωση, νόσος του Wilson, η πρωτοπαθής χολική κίρρωση, η πρωτοπαθής σκληρυντικής χολαγγειίτιδα και η αυτοάνοση ηπατίτιδα. 1.5 Μεταμόσχευση ήπατος Στις περισσότερες περιπτώσεις η ηπατική ανεπάρκεια μπορεί να αντιμετωπιστεί συντηρητικά με φάρμακα και σωστή δίαιτα. Όμως σε τελικού σταδίου ηπατική ανεπάρκεια η μόνη λύση είναι η μεταμόσχευση. Η πρώτη μεταμόσχευση ήπατος διενεργήθηκε το 1963 στο Ντένβερ από τον Thomas Starlz (30). Έως το 1967 το προσδόκιμο ζωής των μεταμοσχευμένων ασθενών ήταν 1 χρόνος. Σήμερα το 83% αυτών των ασθενών ξεπερνούν τον 1 χρόνο ζωής, μετά την επέμβαση (31) Η ορθοτοπική μεταμόσχευση περιγράφει την αφαίρεση του ασθενούς ήπατος και τοποθέτηση του μοσχεύματος στην αντίστοιχη ανατομική θέση. Το νέο ήπαρ συνδέεται με 4 αναστομώσεις σε αιμοφόρα αγγεία (στην υπερηπατική κοιλιακή φλέβα, ενδοηπατική κοιλιακή φλέβα, πυλαία φλέβα και στην ηπατική αρτηρία) και 1 αναστόμωση στο χοληδοφόρο πόρο. (32). Στην ετεροτοπική μεταμόσχευση το 13

14 μόσχευμα τοποθετείτε σε άλλη ανατομική θέση (συνηθέστερα στη ρίζα του μεσεντερίου) (33). Τα μοσχεύματα προέρχονται εγκεφαλικά νεκρούς δότες. Η μεταμόσχευση προγραμματίζεται το ταχύτερο δυνατό μετα την αναγγελία του εγκεφαλικού θανάτου. Η έλλειψη όμως μοσχευμάτων οδήγησε τους γιατρούς να αναπτύξουν τη μέθοδο μεταμόσχευσης ενός μέρους του ήπατος από ζωντανό δότη. Λόγω της μεγάλης αναγεννητικής ικανότητας του ήπατος αυτό δημιουργείτε ξανά στον ζωντανό δότη μέσα σε 4 έως 6 εβδομάδες. Το μόσχευμα αναπτύσσετε σταδιακά στον ασθενή και μπορεί ενδεχομένως να φτάσει και κανονικό μέγεθος (34), (35). Οι 2 πιο συνήθεις επιπλοκές που προκύπτουν απο τη μεταμόσχευση είναι η επιμόλυνση και η απόρριψη του μοσχεύματος. Παρα τις εξετάσεις συμβατότητας που προηγούνται ο μέσος ασθενής εμφανίζει 1 ή 2 επεισόδια απόρριψης. Παράλληλα λόγω τον ανοσοκατασταλτικών που χορηγούνται στον μεταμοσχευμένο ασθενή, αυξάνεται η πιθανότητα λοιμώξεων κάθως και η πιθανότητα εμφάνισης καρκίνου. Άλλες πιθανές επιπλοκές ή παρενέργειες της φαρμακευτικής αγωγής που ακολουθεί την μεταμόσχευση είναι η οστεοπόρωση, διαβήτης, υπέρταση και υψηλή χοληστερίνη (32). Κριτήρια για τη κατάταξη των ασθενών στις λίστες αναμονής μοσχεύματος, πέρα από την οξύτητα της ασθένειας, αποτελούν η ηλικία του ασθενούς και η γενική φυσική του κατάσταση, ενώ αντενδείξεις αποτελούν ο μεταστατικός καρκίνος και η κατάχρηση αλκοόλ και ουσιών. 14

15 2 Αιμόσταση Η αιμόσταση είναι μια περίπλοκη λειτουργία του οργανισμού που ως σκοπό έχει να εμποδίσει την απώλεια αίματος από ένα τραυματισμένο αγγείο αλλά και να διατηρεί την ομαλή ροή του αίματος στα αγγεία. Περιλαμβάνει ένα σύνολο περίπλοκων βιοχημικών μηχανισμών που αλληλοεπιδρούν μεταξύ τους. Συμμετέχουν πάρα πολλές ουσίες οι οποίες πρέπει να βρίσκονται σε ισορροπία, διαφορετικά εμφανίζονται αιμορραγικά σύνδρομα ή θρομβώσεις. Για περιγραφικούς λόγους η αιμόσταση χωρίζεται σε 3 φάσεις: Πρωτογενής αιμόσταση: σύσπαση του αγγείου και δημιουργία του πρωτογενούς αιμοπεταλιακού θρόμβου. Δευτερογενής αιμόσταση ή Πήξη: δημιουργία πλέγματος ινώδους που σταθεροποιεί τον θρόμβο. Ινωδόλυση: λύση του θρόμβου και αποκατάσταση των βλαβών. 2.1 Πρωτογενής αιμόσταση Η πρωτογενής αιμόσταση λαμβάνει χώρα άμεσα μετά τον τραυματισμό του αγγείου. Αρχικά το αγγείο συσπάτε μέσω νευρικών ερεθισμάτων λόγω πόνου αλλά και από την απελευθέρωση αγγειοσυσπαστικών ουσιών (σεροτονίνη, αδρεναλίνη, α2-θρομβοξάνη, και διφωσφορική αδενοσίνη ή ADP) από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια (36). Έτσι, επιτυγχάνεται ελάττωση της διαμέτρου του αγγείου και κατά συνέπεια μείωση της ροής του αίματος. Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων πραγματοποιείτε με την έκθεση υπενδοθηλιακών ουσιών όπως τα μικροϊνίδια, η λαμινίνη και το κολλαγόνο. Οι παράγοντες αυτοί οδηγούν στην προσκόλληση τους στο σημείο της βλάβης. Ένα σημαντικός παράγοντας που επιτρέπει την προσκόλληση των αιμοπεταλίων είναι ο παράγοντας von Willebrand (vwf) του υπενδοθηλίου (37). Ο vwf σχηματίζει μια γέφυρα προσκόλλησης μεταξύ του κολλαγόνου, που υπό κανονικές συνθήκες βρίσκετε στο υπενδοθήλιο, και της γλυκοπρωτεΐνης επιφανείας Ib (GPIb) των αιμοπεταλίων. 15

16 Με την προσκόλληση τα αιμοπετάλια αλλάζουν σχήμα και αποκτούν προεκβολές ώστε να αυξηθεί όσο το δυνατόν περισσότερο η εξωτερική τους επιφάνεια. Ταυτόχρονα απελευθερώνουν τα κοκκία τους. Περιέχουν δύο ειδών κοκκία: τα άλφα κοκκία και τα πυκνά (dense) κοκκία. Τα άλφα κοκκία περιέχουν πολλές πρωτεΐνες, όπως το ινωδογόνο, ο vwf, η θρομβοσπονδίνη και η P-σελεκτίνη. Τα πυκνά κοκκία περιέχουν ADP, ιονισμένο ασβέστιο, ισταμίνη και σεροτονίνη (38) (39). Αυτές οι ουσίες συμβάλλουν στην ενεργοποίηση και συσσώρευση και άλλων αιμοπεταλίων. H GPIb και ο υποδοχέας GPIIb/Ia παίζουν ρόλο γέφυρας σύνδεσης μεταξύ των αιμοπεταλίων και συμμετέχουν στην δημιουργία ενός πρωτογενούς αιμοστατικού θρόμβου (40). Αυτός ο θρόμβος σταματά προς στιγμήν την απώλεια αίματος αλλά είναι ασταθής. Εικόνα 2 Σχηματική αναπαράσταση της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων και πως αυτή οδηγεί στον σχηματισμό του αιμοπεταλιακού θρόμβου [23] 2.2 Δευτερογενής αιμόσταση ή Πήξη του αίματος Η διαδικασία της πήξης έχει ως στόχο την μετατροπή του ινωδογόνου, μια διαλυτή πρωτεΐνη του πλάσματος, σε ινώδες, μια μορφή που μπορεί να πολυμεριστεί ώστε να σχηματιστεί το αδιάλυτο και στερεό ινώδες το οποίο θα ενισχύσει τον 16

17 πρωτογενή αιμοστατικό θρόμβο. Περιγράφεται από ένα καταρράκτη αντιδράσεων που ενεργοποιούν διαδοχικά τους παράγοντες πήξης. Εκτός από τους παράγοντες πήξης σημαντικό ρόλο παίζουν και τα φωσφολιπίδια του αίματος που προέρχονται από τα αιμοπετάλια και τους ιστούς. Δημιουργούν μια αρνητικά φορτισμένη επιφάνεια πάνω στην οποία πραγματοποιούνται όλες οι ενζυμικές αντιδράσεις του μηχανισμού της πήξης. (41) Καταρράκτης της πήξης Οι παράγοντες πήξης είναι οι κύριοι συντελεστές του πηκτικού μηχανισμού. Η πλειοψηφία τους είναι ανενεργά ζυμογόνα ένζυμα, δηλαδή πρόδρομες μορφές πρωτεολυτικών ενζύμων. Συμβολίζονται με λατινικούς αριθμούς από το Ι έως το ΧΙΙΙ. Η αρίθμηση έγινε με τη σειρά ανακάλυψης του και όχι από την σειρά συμμετοχής τους στον καταρράκτη. (41) Πηκτικός Παράγοντας Ονομασία FΙ Ινωδογόνο FΙΙ Προθρομβίνη FΙΙΙ Ιστικός παράγοντας (Θρομβοπλαστίνη) FΙV Ιόντα ασβεστίου FV Προαξελερίνη FVΙΙ Προκονβερτίνη FVIII Αντιαιμοροφιλικός παράγοντας Α FΙX Αντιαιμοροφιλικός παράγοντας Β (παράγοντας Christmas) FX Προθρομβινάση (παράγοντας Stuart) FΧΙ Προγενέστερη θρομβοπλαστίνη πλάσματος FΧΙΙ Παράγοντας Hageman FΧΙΙΙ Παράγοντας 17 σταθεροποίησης του

18 ινώδους Πίνακας 1 Ονομασία Παραγόντων Πήξης Δεν υπάρχει παράγοντας VI. Στην θέση του είναι ο ενεργοποιημένος παράγοντας V (αξελερίνη). Οι παράγοντες Ι και ΙΙ (ινωδογόνο και προθρομβίνη αντίστοιχα) είναι οι μόνοι που αναφέρονται με το όνομα τους. Όλοι οι παράγοντες συνθέτονται στα ηπατικά κύτταρα (με εξαίρεση τον FVΙΙΙ) και κυκλοφορούν στο πλάσμα στην αδρανή τους μορφή σαν προένζυμα (με εξαίρεση τον FIII που εμφανίζεται σε περίπτωση ιστικής βλάβης). Κάθε προένζυμο πρέπει να ενεργοποιηθεί, δηλαδή να σπάσει το μόριο του ώστε να βγει στην επιφάνεια το δραστικό του κέντρο που φυσιολογικά είναι κρυμμένο. Οι ενεργοποιημένοι παράγοντες υποδηλώνονται με ένα γράμμα a (activated) δίπλα τους, π.χ.: FXa. Η διαδικασία της πήξης περιγράφεται μέσω 2 οδών: της ενδογενούς και της εξωγενούς. Και οι 2 οδοί έχουν ως στόχο την ενεργοποίηση του FΧ. Στη συνέχεια ενώνονται (κοινή οδός) και οδηγούν στον σχηματισμό του αδιάλυτου ινώδους Ενδογενής οδός Στην αρχική φάση της ενδογενούς οδού συμμετέχουν αρκετές πρωτεΐνες του πλάσματος, όπως ο παράγοντας ΧΙΙ (FΧΙΙ, παράγοντας Hageman), η προκαλλικρεΐνη (παράγοντας Fletcher) και το κινινογόνο υψηλού μοριακού βάρους (high molecular weight kininogen, HMWK [παράγοντας Fitzgerald]), οι οποίες ενεργοποιούνται όταν έρχονται σε επαφή με αρνητικά φορτισμένες επιφάνειες (42) (43). Ο παράγοντας ΧΙΙ μόλις έρθει σε επαφή με τις αρνητικά φορτισμένες υπενδοθηλιακές στοιβάδες αλλάζει στερεοδομή και αυτό-ενεργοποιείτε. Ο FΧΙΙa σε συνδυασμό με το HMWK, ενεργοποιεί τον FΧΙ, ο οποίος μετά ενεργοποιεί τον FΙΧ με την παρουσία ιόντων ασβεστίου (FIV) Ο FΙΧa μαζί με τον FVIIIa σχηματίζουν το σύμπλοκο ενδογενή Χ-αση, που οδηγεί στον σχηματισμό του FΧa. Ο FVIII ενεργοποιείται από τον FΧ και την θρομβίνη (44) (45). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την σταδιακή αύξηση της ενεργοποίησης του FVIII όσο σχηματίζεται FΧa και 18

19 θρομβίνη. Η θρομβίνη, επίσης αυξάνει την παραγωγή του FΙΧa δια μέσου της ενεργοποίησης του FΧΙ (46) (47) (48) Εξωγενής οδός Η εξωγενής οδός ενεργοποιείτε όταν εκτίθεται στην κυκλοφορία ο ιστικός παράγοντας (tissue factor TF). Ο TF είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που δρα ως υποδοχέας και συμπαράγοντας του παράγοντα VII (49) (50) και είναι ο κύριος ενεργοποιητής του καταρράκτη της πήξης. Παίζει καθοριστικό ρόλο στην αιμοστατική απάντηση της αγγειακής βλάβης (51) [52] και εκφράζεται σε μεγάλα επίπεδα ώστε να περιορίζει την αιμορραγία ζωτικών οργάνων/ιστών όπως ο εγκέφαλος, η καρδιά, οι πνεύμονες, οι νεφροί και ο πλακούντας (52) (53). Μόλις ο TF έρθει σε επαφή με τον FVII, με τον οποίο εμφανίζει υψηλή συγγένεια, τον ενεργοποιεί και σχηματίζουν ένα ισχυρό σύμπλοκό. Το σύμπλοκό FVIIa/TF (εξωγενής Χ-αση) καταλύει την ενεργοποίηση του FΧ σε FΧa (44) (54) (55) και του FΙΧ σε και FΙΧa (56) (57). Στην συνέχεια ο FΙΧa μαζί με τον συμπαράγοντά του FVIIΙa (ενδογενής Χ-αση) επίσης ενεργοποιούν τον FΧ (παράκαμψη του Josso) (41) (54) Κοινή οδός Μετά την ενεργοποίηση του FΧ, απελευθερώνεται από τα άλφα κοκκία των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων ο παράγοντας V, ο οποίος ενεργοποιείται από την θρομβίνη. Ο ενεργοποιημένος πλέον FV (FVa) δεσμεύει τον FΧa (58) (59). Ο FV που βρίσκεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων φαίνεται να είναι πιο σημαντικός στον σχηματισμό του σύμπλοκό της προθρομβινάσης σε σχέση με τον κυκλοφορούντα FV (60). Το σύμπλοκό προθρομβινάσης (FVa, FXa, ιόντα ασβεστίου και φωσφολιπίδια) καταλύει την μετατροπή προθρομβίνης (FII) σε θρομβίνη (FIIa) (61) (62). Η θρομβίνη στοχεύει στο μόριο του ινωδογόνου, από το οποίο αποσπά τα καρβοξυτελικά άκρα των 2 ινωδοπεπτιδίων Αα και Ββ, δίνοντας του τέτοια μορφή ώστε να πολυμεριστεί. (41) Τα παραγόμενα μονομερή ινώδους πολυμερίζονται και δημιουργούς έναν ασταθή θρόμβο. Ο ενεργοποιημένος παράγοντας ΧΙΙΙ (FΧΙΙΙa) επικαλύπτει σταυρωτά (crosslink) το δίκτυο της ινικής και το σταθεροποιεί (63). 19

20 Εικόνα 3 Σχηματικη απεικόνιση του καταρράκτη τησ πήξης. Στο κόκκινο πλαίσιο φαίνεται η ενδογενής οδός, στο πράσινο πλαίσιο η εξωγενής και στο πορτοκαλί πλαίσιο η κοινή οδός Κυτταρικό μοντέλο της πήξης Τα τελευταία χρόνια, ένα νέο μοντέλο πήξης έχει περιγραφεί και είναι αποδεκτό από τους περισσότερους ερευνητές, σύμφωνα με το οποίο η διαδικασία της πήξης συντελείται σε τρεις αλληλοεπικαλυπτόμενες φάσεις,(έναρξη- ενίσχυση- εξάπλωση). Αυτές οι φάσεις συμβαίνουν στην κυτταρική μεμβράνη διαφόρων κυττάρων, τα οποία παρέχουν ως υπόστρωμα αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια και στα οποία συνδέονται τα προπηκτικά συμπλέγματα των πρωτεϊνών της πήξης (εξωγενής Χ-αση, ενδογενής Χ-αση και το σύμπλοκό προθρομβινάσης). Το ερέθισμα έναρξης της πήξης είναι ο ιστικός παράγοντας ο οποίος, μαζί με τον VIIa, ενεργοποιούν τόσο τον παράγοντα ΙΧ, όσο και το σύμπλοκο προθρομβινάσης πάνω στα ΑΜΠ, και καταλύει τη μετατροπή μικρών ποσοτήτων προθρομβίνης σε θρομβίνη.η προαγωγή της πήξης ενισχύεται περαιτέρω από μηχανισμούς θετικής 20

21 ανάδρασης. Συγκεκριμένα, οι μικρές αυτές ποσότητες θρομβίνης είναι ικανές να ενεργοποιήσουν αναδραστικά: (α) τα αιμοπετάλια, (β) τον FVIII με αποτέλεσμα αυτός να αποσυνδέεται από τον παράγοντα von Willebrand (vwf) με τον οποίο κυκλοφορεί ως σύμπλεγμα, (γ) τον παράγοντα V, οποίος εκκρίνεται από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια) και (δ) τον παράγοντα XI. Επιπλέον, τα αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια, στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων, προσφέρουν το έδαφος για τον ενεργοποιημένο από τη θρομβίνη FIXa να σχηματίσει σύμπλεγμα με το συμπαράγοντά του FVIIIa (σύμπλεγμα τενάσης). Το σύμπλεγμα αυτό έχει τη δυνατότητα να μετατρέπει μεγαλύτερες ποσότητες FX σε FXa να ενεργοποιεί το σύμπλοκο προθρομβινάσης, και άρα να προωθεί τη δημιουργία μεγαλύτερων ποσοτήτων θρομβίνης. (64) (65) 21

22 Εικόνα 4 Σχηματική απεικόνιση των φάσεων του κυτταρικού μοντέλου της πήξης. 2.3 Ρυθμιστικοί και αντισταθμιστικοί μηχανισμοί της πήξης Ο πηκτικός μηχανισμός είναι μια ταχεία διαδικασία η οποία θα ήταν καταστροφική εάν δεν περιοριζόταν μετά την επίσχεση της αιμορραγίας. Μπορεί να οδηγήσει σε θρόμβωση, αγγειακή φλεγμονή ή ιστική βλάβη. Ο περιορισμός αυτός επιτυγχάνεται κυρίως: με τη ροή του αίματος στα αγγεία, που απομακρύνει τους ενεργοποιημένους παράγοντες και τους οδηγεί στο ήπαρ όπου θα αποικοδομηθούν. 22

23 με τους φυσικούς αναστολείς της πήξης, οι οποίοι ελέγχουν τη δράση των ενεργοποιημένων παραγόντων και αιμοπεταλίων (66) Αντιθρομβίνη Η αντιθρομβίνη (ΑΤ) είναι ο κυριότερος εκπρόσωπος των ανασταλτών των παραγόντων πήξης. Πρόκειται για μια γλυκοπρωτεΐνη που συντίθεται στο ήπαρ και στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Απενεργοποιεί τα περισσότερα ένζυμα του καταρράκτη της πήξης, ειδικά την θρομβίνη, τον ενεργοποιημένο παράγοντα Χ και IX, καθώς και τον ΧΙΙa και ΧΙa, σχηματίζοντας ισομοριακά μη αναστρέψιμα σύμπλοκα (67). Η θρομβίνη και ο ενεργοποιημένος FX ενεργοποιούν την ΑΤ, η οποία στην συνέχεια στρέφεται εναντίον τους. Η δράση της ενισχύεται σημαντικά από την ηπαρίνη. Η ηπαρίνη έχει ειδικό σημείο πρόσδεσης πάνω στο μόριο της ΑΤ. Η πρόσδεση αυτή προκαλεί δομική αλλαγή στην ΑΤ που επιταχύνει την διαδικασία απενεργοποίησης κατά 1000 με 4000 φορές (67) (68) Αναστολέας της οδού του ιστικού παράγοντα Ο αναστολέας της οδού του ιστικού παράγοντα (tissue factor pathway inhibitor ή TFPI) συντίθεται στο αγγειακό ενδοθήλιο και κυκλοφορεί στο πλάσμα, αλλά σε πολύ μικρή συγκέντρωση σε σχέση με την ΑΤ (69). Ο TFPI αναστέλλει την ενεργοποίηση του παράγοντα Χ με δύο τρόπους: α) αναστέλλει άμεσα τον FΧa και β) σχηματίζει σύμπλοκό με τον FΧa, και το σύμπλοκό αυτό αναστέλλει τον TF/FVIIa με αποτέλεσμα να μπλοκάρεται ο εναρκτήριος μηχανισμός της εξωγενούς οδού (70) (71) (72) Πρωτεΐνες C και S Πρόκειται για γλυκοπρωτεΐνης που συντίθενται στο ήπαρ, παρουσία της βιταμίνης Κ. Η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C αδρανοποιεί τους παράγοντες Va και VIIIa. (βλ. Kεφ:3 Πρωτεΐνη C) 23

24 Η πρωτεΐνη S δρα ως συμπαράγοντας την ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C. Εκτός από τα ηπατοκύτταρα παράγεται και στα ενδοθηλιακά κύτταρα [85]. Στο αίμα κυκλοφορεί με 2 μορφές: είτε ελεύθερη οπού και έχει ενεργή αντιπηκτική δράση (40%), είτε συνδεδεμένη στο σύμπλοκό C4b του συμπληρώματος όπου είναι αδρανής (60%). 2.4 Ινωδόλυση Παράλληλα με την δημιουργία του θρόμβου δραστηριοποιείτε και το ινωδολυτικό σύστημα, ένα σύνολο ενζύμων και αναστολέων που αποτελούν αμυντικό μηχανισμό κατά της θρόμβωσης. Ο κυριότερος εκπρόσωπος αυτού του συστήματος είναι η πλασμίνη. Αυτή κυκλοφορεί στο αίμα ως ανενεργό ένζυμο, το πλασμινογόνο. Η ενεργοποίηση του γίνετε μέσα στη κυκλοφορία ή άμεσα στον ίδιο τον θρόμβο, όπου έχουν ενσωματωθεί το πλασμινογόνο και οι ενεργοποιητές του. Η πλασμίνη έχει ευρεία ειδικότητα υποστρώματος και, σε αντίθεση με το ινώδες, αποσχίζει το ινωδογόνο και μια πληθώρα πρωτεϊνών του πλάσματος και παραγόντων της πήξης (73). Η πλασμίνη αποκόπτει το πολυμερισμένο ινικό πλέγμα σε πολλαπλά σημεία και απελευθερώνει τα προϊόντα αποδόμησης του ινώδους (fibrin degradation products, FDPs). Από τα κυριότερα FDPs είναι τα διμερή του ινώδους (D-dimers), τα οποία αποτελούνται από δύο D περιοχές γειτονικών μονομερών του ινώδους τα οποία έχουν συνδεθεί σταυρωτά από τον ενεργοποιημένο παράγοντα XIII Ενεργοποιητές του πλασμινογόνου Ο κυριότερος ενεργοποιητής του πλασμινογόνου είναι ο ιστικός ενεργοποιητής (tpa). Το μόριο tpa είναι ένζυμο των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η απελευθέρωση του μορίου αυτού διεγείρεται από διάφορες ουσίες, όπως η θρομβίνη, η σεροτονίνη, η βραδυκινίνη, οι κυτοκίνες και η επινεφρίνη (74) (75). Το πλασμινογόνο δεσμεύει το ινώδες και τον tpa και το σύμπλοκο αυτό οδηγεί στην μετατροπή του προενζύμου πλασμινογόνο στην ενεργή πρωτεολυτική πλασμίνη (76) (77). 24

25 Η ουροκινάση (upa) είναι ο δεύτερος φυσιολογικός ενεργοποιητής του πλασμινογόνου. Παράγεται στα νεφρικά κύτταρα και βρίσκεται σε υψηλά επίπεδα στα ούρα. Ενώ το tpa είναι σχεδόν εξ ολοκλήρου υπεύθυνο για την έναρξη της ενδοαγγειακής ινωδόλυσης, η ουροκινάση είναι ο κύριος ενεργοποιητής της εξωγγειακής ινωδόλυσης. Άλλοι πλασματικοί ενεργοποιητές του πλασμνογόνου αποτελούν οι ενεργοποιημένοι παράγοντες ΧΙ και ΧΙΙΙ, το το κινινογόνο υψηλού μοριακού βάρους (HMWK) και η καλλικρεΐνη. (41) Αναστολείς του ινωδολυτικού μηχανισμού Οι αναστολείς του ινωδολυτικού μηχανισμού ταξινομούνται σε 2 ομάδες: αναστολείς της ενεργοποίησης του πλασμινογόνου ή αδρανοποιητές της ενεργοποιημένης μορφής του ενζύμου, της πλασμίνης. Στην πρώτη ομάδα κατατάσσονται οι ανασταλτές του πλασμινογόνου 1 και 2 (ΡΑΙ-1 και ΡΑΙ-2 αντίστοιχα). Ο PAI-1 παράγεται από ενδοθηλιακά κύτταρα και αιμοπετάλια, τα οποία ρυθμίζουν την απελευθέρωσή του κατά την ινωδόλυση, και αδρανοποιεί τον tpa. Ο ΡΑΙ-2 παράγεται στα λευκά αιμοσφαίρια και τον πλακούντα. Είναι λιγότερο αποτελεσματικός σε σύγκριση με τον ΡΑΙ-1 καθώς αδρανοποιεί κυρίως την ουρακινάση και δευτερευόντως τον tpa (78). Κύριος ανασταλτής της πλασμίνης θεωρείτε η α 2 -αντιπλασμίνη, που παράγετε στο ήπαρ και βρίσκετε εντός των αιμοπεταλίων. Όταν απελευθερώνεται στη κυκλοφορία πλασμίνη απενεργοποιείτε ταχύτατα από την α 2 -αντιπλασμίνη με στοιχειομετρική σχέση 1:1. Ωστόσο επειδή η α 2 -αντιπλασμίνη βρίσκετε σε χαμηλότερα επίπεδα στη κυκλοφορία από ότι το πλασμινογόνο, αυτή μπορεί να εξαφανιστεί ενώ η πλασμίνη θα συνεχίσει να παράγεται. (79) 25

26 3 Πρωτεΐνη C Η πρωτεΐνη C ή αλλιώς αυτοπροθρομβίνη ΙΙΑ (80) παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της πήξης. Η ενεργοποιημένη μορφή της πρωτεΐνης (activated protein C ή APC) αναστέλει κυρίως τη δράση των FVa και FVIIIa αποδομώντας τους. Κωδικοποιείτε από το γονίδιο PROC στο χρωμόσωμα 2. Κυκλοφορεί φυσιολογικά στο πλάσμα και αποτελείτε από 2 πολυπεπτιδικές αλυσίδες, μια ελαφριά και μια βαρία αλυσίδα, οι οποίες ενώνονται με έναν δισουλφιδικό δεσμό (81) 3.1 Ενεργοποίηση και δράση της πρωτεΐνης C Η δράση της πρωτεΐνης C ενεργοποιείτε από το σύμπλοκό θρομβίνης και θρομβομοντουλίνης (ΤΜ), μιας μεμβρανικής πρωτεΐνης στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων (82). Το σύμπλοκο αυτό ενισχύει την ενεργοποίηση της πρωτεινης φορές ενώ ταυτόχρονα σταματά τη πηκτική δράση της θρομβίνης (83). Η πρόσδεση της θρομβίνης στην ΤΜ επάγει μια αλλαγή στην δομή της θρομβίνη, η οποία της αλλάζει την ειδικότητα υποστρώματος. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η θρομβίνη να αποκτά την ικανότητα να ενεργοποιεί την πρωτεΐνη C και να μην επάγει πλέον την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων ή την αποκοπή του ινωδογόνου (84) (85) (86). Η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης C από το σύμπλοκο θρομβίνης/τμ ενισχύεται από τον ενδοθηλιακό υποδοχέα της πρωτεΐνης C (87) (88). Η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C (APC), σε συνεργασία με την πρωτεΐνη S απενεργοποιεί τους παράγοντες Va και VIIIa πρωτεολύοντάς τους πάνω σε φωσφολιπιδικές επιφάνειες (89) (90) (91) (92). Στον FVa προσδένεται σε 3 σημεία (Arg306, Arg506, Arg679) ενώ στον FVIIIa σε 2 σημεία (Arg336 και Arg562) (93) 3.2 Παράγοντας V Leiden και αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνης C. Ο παράγοντας V Leiden (FVL) προκύπτει από μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο του FV που μεταβιβάζεται με επικρατή αυτοσωμικό χαρακτηρα (94). Στο 26

27 νουκλεοτίδιο 1691 η γουανίνη αντικαθίσταται από αδενίνη. Αυτή η αλλαγή οδηγεί στην αλλαγή του αμινοξέος 506 από αργινίνη σε γλουταμίνη (95). Φυσιολογικά η Arg506 αποτελεί σημείο πρόσδεσης της APC για την αποδόμηση του FVa. Η παραπάνω μετάλλαξη οδηγεί στην δημιουργία ενός μορίου (FV Q506 ή FV Leiden) που καθιστά αδύνατη αυτήν την σύνδεση. Κατά συνέπεια ο FV παραμένει ενεργοποιημένος και να οδηγεί σε υπερ-παραγωγή θρομβίνης και ινώδους. (96) (97). O FVL εμφανίζεται στο 4-5% του γενικού πληθυσμού που εμφανίζει θρομβοφιλία (98) και είναι ο πιο μελετημένος παράγοντας που την προκαλεί. Στους καυκάσιους της Ευρώπης και της Βορείου Αμερικής είναι η πιο συχνή κληρονομική θρομβοφιλία (94). 27

28 4 Πειραματικό μέρος 4.1 Σκοπός Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας είναι ο έλεγχος της αντίστασης στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C (activated protein C resistance ή APCR) σε ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε μεταμόσχευση ήπατος και ο μοριακός έλεγχος του FV Leiden. 4.2 Υλικά και μέθοδοι Τα δείγματα συλλέχθηκαν κατά τη περίοδο Μάιος-Ιούνιος του 2015 από τα εξωτερικά ιατρεία του ΓΝΑ Ιπποκράτειο, στα οποία στη συνέχεα πραγματοποιήθηκαν οι εξετάσεις του screening της πήξης (PT-INR, aptt, FIB) και αποθηκεύτηκαν στις κατάλληλες συνθήκες έως ότου πραγματοποιηθεί ο έλεγχος της APCR και ο μοριακός έλεγχος Αναλώσιμα υλικά Γυάλινο σιλικοναρισμένο φιαλίδιο κενού με αντιπηκτικό sodium citrate (3,2%) των 4,5 ml. Πλαστικό φιαλίδιο κενού με αντιπηκτικό K3EDTA (7,2%) των 4 ml. BD Vacutainer Push Button Collection set με διάμετρο βελόνας 21 g. Πλαστικές πιπέτες Pasteur των 3 ml. U bottom push cap tubes των 1,4 ml. Διάτρητα TPE capcluster. Epedrof tubes των 2 ml Αντιδραστήρια STA-Staclot APC-R reagent 1: FV deficient plasma STA-Staclot APC-R reagent 2: Venom STA-Staclot APC-R reagent 3: activated protein C STA-Staclot APC-R reagent 4: Control N STA-Staclot APC-R reagent 5: control P STA - Owren-Koller 28

29 AB Analitica primer mix AB Analitica denaturation solution AB Analitica amplification mix AB Analitica thermostable Taq DNA polimerase AB Analitica nitrocellulose strips 4.3 Λήψη και προετοιμασία δειγμάτων Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας εξετάστηκαν 8 δείγματα ασθενών που είχαν υποβληθεί σε μεταμόσχευση ήπατος. Κανένας εκ των ασθενών δεν έπασχε απο ηπατίτιδα και το μόσχευμα λειτούργουσε κανονικά. Η διαδικασία της λήψης των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε στα εξωτερικά ιατρεία καθώς και στην Αιμοδοσία-Αιμόσταση του ΓΝΑ Ιπποκράτειου. Από τον κάθε ασθενή συλλέχθηκαν 2 σωληνάρια πήξης και 1 σωληνάριο ολικού αίματος. Η αιμοληψία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συγκεκριμένου σετ πεταλούδας (push button vacutainer) και η λήξη του αίματος στα σωληνάρια πραγματοποιήθηκε με λυτή περίδεση. Εντός μισής ώρας από την συλλογή τους, τα δείγματα οδηγήθηκαν στο εργαστήριο. Το σωληνάριο ολικού αίματος χρησιμοποιήθηκε για τη πραγματοποίηση γενικής εξέτασης αίματος και μετέπειτα το δείγμα αποθηκεύτηκε σε βαθιά κατάψυξη έως ότου πραγματοποιηθεί ο μοριακός έλεγχος. Τα σωληνάρια της πήξης φυγοκεντρήθηκαν στις στροφές το λεπτό για 15 λεπτά στους 20 ο C. Μετά τη φυγοκέντρηση έγινε δεξαμενοποίηση του πλάσματος των 2 σωληνάριων κάθε ασθενούς, σε ειδικό γυάλινο σωληνάριο (RIA), από εκεί καταμερίστηκε σε pushcap tubes με την χρήση πιπέτας. Τα pushcap tubes σφραγίστηκαν με τα ειδικά πώματά τους (διάτρητα TPE Capclusters). Έπειτα, τα δείγματα φυλάσσονταν σε βαθιά κατάψυξη, στους -80 ο C, έως ότου γίνει ο έλεγχος της APCR. Οι παράγοντες της πήξης δεν ενεργοποιούνται σε τόσο χαμηλές θερμοκρασίες. Το δείγμα του κάθε ασθενούς συλλέχθηκε από την βαθιά κατάψυξη και τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο, θερμοκρασίας 37ο C. Ύστερα τα δείγματα, τα 29

30 οποία είχαν ξεπαγώσει, τοποθετήθηκαν σε ειδικά Eppendorf και εισήλθαν στον αναλυτή. Η μέτρηση της APCR έγινε στον αυτόματο αναλυτή Sta-R της Stago με τη χρήση του κιτ STA-Staclot APC-R. Η αρχή της ανίχνευσης της APCR βασίζετε σε μια μη φυσιολογική επιμήκυνση του χρόνου πήξης του πλάσματος που εξετάζεται υπό τη παρουσία πρωτεΐνης C και σε ασβεστούχο μέσο. Στο σύστημα που χρησιμοποιήθηκε η πήξη του αραιωμένου δείγματος πραγματοποιείτε υπό τη παρουσία πλάσματος με έλλειψη του FV και δηλητηρίου Crotalus viridi helleri (κροταλίας). Το δηλητήριο αυτό δρώντας ως ενεργοποιητής του FX, ενεργοποιεί τη πήξη σε αυτό το επίπεδο και καταργεί την αλληλεπίδραση των παραγόντων που βρίσκονται αντινοηματικά. Η επιμήκυνση του χρόνου πήξης ενός φυσιολογικού πλάσματος υπό την παρουσία πρωτεΐνης C προκύπτει από την ικανότητα της πρωτεΐνης που βρίσκετε στο STA-Staclot APC-R reagent 3: activated protein C να αδρανοποιεί τον FVa του πλάσματος που εξετάστηκε. Για τον μοριακό έλεγχο του FV Leiden, τα δείγματα ολικού αίματος συλλέχθηκαν από την βαθία κατάψυξη και ήρθαν σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια αναμείχθηκαν με τα απαραίτητα αντιδραστήρια στις κατάλληλες συγκεντρώσεις και εισάχθηκαν στον θερμικό κυκλοποιητή οπού ακολούθησε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction-PCR). Στην PCR, με τη χρήση κατάλληλων ανιχνευτών (primers) μπορεί να ανιχνευθεί μια μετάλλαξη και πραγματοποιείτε αντιγραφή της προς διερεύνησης περιοχής. Έτσι διευκολύνεται η αναγνώριση της. Έπειτα με περιοριστικά ένζυμα και ηλεκτροφόρηση αποκόβεται το γονίδιο που μας ενδιαφέρει και τα θραύσματα που προκύπτουν απομονώνονται σε γέλη αγαρόζης. 30

31 4.4 Αποτελέσματα Παρακάτω παρατίθονται τα αποτελέσματα της APCR και του μοριακού ελέγχου του FV Leiden. Κωδικός δείγματος APCR (limits: sec) , ,2 FV Leiden Αρνητικό Αρνητικό Αρνητικό Αρνητικό Αρνητικό Αρνητικό Αρνητικό Ετεροζυγώτης Τα αποτελέσματα των 2 διαφορετικών εξετάσεων για τα δείγματα 1 έως 5 είχαν συνάφεια, καθώς υπάρχει άμεση συσχέτιση μεταξύ τους. Ιδιαιτερότητα παρουσίασαν τα δείγματα 6, 7 και 8 και μελετήθηκε περαιτέρω το ιστορικό των αντίστοιχων ασθενών Δείγμα 6 Γυναίκα υποβλήθηκε σε έλεγχο θρομβοφιλίας προερχόμενη απο καρδιολογική κλινική. Ο έλεγχος για την APCR πραγματοποιήθηκε 3 φορές με όλα τα αποτελέσματα να είναι παθολογικά (91.3, 91 και 86.9). Ο μοριακός έλεγχος για το FV Leiden έδωσε αρνητικό αποτέλεσμα. Η συγκεκριμένη ασθενής υποβλήθηκε και σε άλλους μοριακούς ελέγχους μεταλλάξεων του FV όπως FV Cambridge, FV Hong Kong και FV Liverpool οι οποίοι έδωσαν φυσιολογικά αποτελέσματα Δείγμα 7 Άνδρας υποβλήθηκε σε έλεγχο θρομβοφιλίας μετά απο μεταμόσχευση ήπατος λόγω κρυψιγενούς κίρρωσης. Βρέθηκε παθολογική APCR (91) και ο έλεγχος για τον FV Leiden ήταν αρνητικός. Σε επανεξέταση της APCR αυτή βρέθηκε και πάλι παθολογική (89 και 86). Ιδιαίτερή λεπτομέρεια στον συγκέκριμένο ασθενή αποτελεί το γεγονός οτι σε παλιότερο έλεγχο θρομβοφιλίας, πριν υποβληθεί στην μεταμόσχευση, η APCR ήταν φυσιολογική Δείγμα 8 Άνδρας υποβλήθηκε σε έλεγχο θρομβοφιλίας για να εξεταστεί το οικογενείακο ιστορικό του υιού του. Ο υιός μετά απο χειρουργείο εμφάνισε θρομβωτικά επεισόδεια και υποβλήθηκε σε θρομβοφιλικό έλεγχο. Εμφάνισε παθολογική APCR (82.8) και ο μοριακός έλεγχος έδειξε οτι ήταν ετεροζυγώτης για το γονίδιο του FV Leiden. Έπειτε κλήθηκε το στενό οικογενειακό του περιβάλλον για να υποβληθεί στις αντίστοιχες εξετάσεις. 31

32 Ο πάτερας του παραπάνω ασθενούς, απο τον οποίο προέρχεται το δείγμα 8, είχε φυσιολογική APCR (228.2) και ήταν επίσης ετεροζυγώτης για τον FV Leiden. Τα παραπάνω ασύμφωνα αποτελέσματα θεωρήθηκαν εργαστηριακό λάθος και οι εξετάσεις επαναλήφθηκαν άλλες 2 φορές χωρίς όμως να αλλάξουν τα αποτελέσματα (APCR 203,3 και 184,7). Αφότου επαναλήφθηκαν οι εξετάσεις και διερευνήθηκε περαιτέρω το ιστορικό του βρέθηκε οτι ο συγκεκριμένος ασθενής είχε υποβληθεί σε μεταμόσχευση ήπατος. 5 Συμπεράσματα-Συζήτηση Στην παρούσα εργασία ελέγχθηκε η αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτείνη C και πραγματοποιήθηκε μοριακός έλεγχος για την ανίχνευση της μετάλλαξης FV Leiden. Λόγω της αλληλένδετης σχέσης μεταξυ της APC και του FV τα αποτελέσματα των 2 εξετάσεων οφείλουν να συμβαδίζουν. Δηλαδή με την εμφάνιση παθολογικής APCR, αυτή δικαιολογείτε συνήθως απο κάποια μετάλλαξη στον FV. Η συνηθέστερη είναι ο FV Leiden και για αυτο επιλεχθηκε για να εξεταστεί. Στην πλειοψηφία των δείγμάτων τα αποτελέσματα των 2 εξετάσεων εμφάνιζαν συνάφεια. Για τις 3 ιδιαίτερες περιπτώσεις που εξετάστηκαν, η υπάρχουσα βιβλιογραφία δεν δίνει εξήγηση για αυτο το φαινόμενο. Ενδεχομένως η APCR να επηρεάζεται υπόγεια και απο κάποιον άλλον παράγοντα ή/και απο την μεταμόσχευση ήπατος. Γι αυτό το λόγω κρίνεται σκόπιμο να διενεργηθούν περαιτέρω έρευνες σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων, ώστε να υπάρχει μια ολοκληρωμένη εικόνα για την καλύτερη και ασφαλέστερη διεξαγωγή ενός συμπεράσματος. 32

33 Παράρτημα Εικόνα 1: Sited at Εικόνα 2: Ewelina M. Golebiewska and Alastair W. Poole. Platelet secretion: From haemostasis to wound healing and beyond. Blood Rev May; 29(3): Εικόνα 3: Sited at Εικόνα 4: Ferguson JJ, Waly HM, Wilson JM.Fundamentals of coagulation and glycoprotein IIb/IIIa receptor inhibition. Eur Heart J Apr; 19 Suppl D:D

34 Βιβλιογραφία 1. Σταύρος, Πλέσσας Τ. Φυσιολογία του ανθρώπου. Αθήνα : Φάρμακον-Τύπος, Juza RM, Pauli EM. Clinical and surgical anatomy of the liver: a review for clinicians. Clin Anat. 2014, Jul 27(5): Gilgenkrantz H, Collin de l'hortet A. New insights into liver regeneration. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2011, Oct; 35(10): Mao SA, Glorioso JM, Nyberg SL. Liver regeneration. Transl Res , Apr; 163(4): Melato M, Mucli E. Something new in liver cirrhosis epidemiology. Lancet. 1989, 2: Olynyk JK, Trinder D, Ramm GA, Britton RS, Bacon BR. Hereditary hemochromatosis in the post-hfe era.. Hepatology , 48: D., Dowling. Screening for Wilson s disease in acute liver failure: a comparison of currently available diagnostic tests.. Hepatology. 2009, 50: Selmi C, Bowlus CL, Gershwin ME, Coppel RL. Primary biliary cirrhosis. Lancet. 2011, 377: van Os E, van den Broek WW, Mulder PG, ter Borg PC, Bruijn JA, van Buuren HR. Depression in patients with primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis. J Hepatol. 2007, 46: Wasley A, Grytdal S, Gallagher K. Surveillance for acute viral hepatitis-united States MMWR Surveill Summ. 2008, Mar 21; 57(2): Gupta E, Ballani N, Kumar M, Sarin SK. Role of non-hepatotropic viruses in acute sporadic viral hepatitis and acute-on-chronic liver failure in adults. Indian J Gastroenterol. 2015, 34(6): Shimakawa Y, Yan HJ, Tsuchiya N, Bottomley C, Hall AJ. Association of early age at establishment of chronic hepatitis B infection with persistent viral replication, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma: a systematic review.. PLoS One. 2013, 8(7): e Sundaram V, Kowdley K. Management of chronic hepatitis B infection. BMJ. 2015, 351: h E., Tabor. The role of tumor suppressor genes in the development of hepatocellular carcinoma. In: Okuda K, Tabor E, eds. Liver Cancer. New York, NY: Churchill Livingstone EL., 184. Krawitt. Autoimmune hepatitis: classification, heterogeneity, and treatment. Am J Med. 1994, 96(1A):23S-26S. 34

35 16. Obermayer-Straub P, Strassburg CP, Manns MP. Autoimmune hepatitis.. J Hepatol. 2000, 32(1 Suppl): Tenca A, Färkkilä M, Jalanko H, Vapalahti K, Arola J, Jaakkola T, Penagini R, Vapalahti O, Kolho KL. Environmental Risk Factors of Pediatric-Onset Primary Sclerosing Cholangitis and Autoimmune Hepatitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2016, 62(3): Vuppalanchi R, Chalasani N. Nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis: Selected practical issues in their evaluation and management.. Hepatology. 2009, 49(1): Clark JM, Diehl AM. Nonalcoholic fatty liver disease: an underrecognized cause of cryptogenic cirrhosis.. JAMA. 2003, 289(22): JH., Lefkowitch. Morphology of alcoholic liver disease. Clin Liver Dis. 2005, 9: MacSween RN, Burt AD. Histologic spectrum of alcoholic liver disease. Semin Liver Dis. 1986, 6: DW., Crabb. Pathogenesis of alcoholic liver disease: newer mechanisms of injury. Keio J Med. 1999, 48: Lieber CS, Jones DP, Decarli LM. Effects of prolonged ethanol intake: production of fatty liver despite adequate diets.. J Clin Invest. 1965, 44: Savolainen VT, Liesto K, Mannikko A et al. Alcohol consumption and alcoholic liver disease: evidence of a threshold level of effects of ethanol.. Alcohol Clin Exp Res. 1993, 17: HB, El-Serag. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 2012, May; 142(6): O'Grady, J. Acute liver failure. Postgrad Med J. Μάρτιος 2005, 81(953): , σσ Bataller R, Brenner DA. Liver fibrosis. J Clin Invest. 2005, 115(2): Naveau S, Perlemuter G, Balian A. Epidemiology and natural history of cirrhosis.. Rev Prat. 2005, 55: Liaw YF, Leung N, Kao JH, Piratvisuth T, Gane E, Han KH, Guan R, Lau GK, Locarnini S. Asian-Pacific consensus statement on the management of chronic hepatitis B: a 2008 update.. Hepatol Int. 2008, 2: Giuseppe Mazza, Paolo De Coppi, Paul Gissen, Massimo Pinzani. Hepatic regenerative medicine. Journal Of Hepatology. 2015, 63,(2); al, Rene Adam et. Evolution of liver transplantation in Europe: Report of the European Liver Transplant Registry. Liver Transplantation. 2003, Τόμ. 9, 12, Program, The Toronto Hospital Multi Organ Transplant. Liver Transplant Manual. 35

36 33. Bijan Eghtesad, Zakiyah Kadry, John Fung. Technical considerations in liver transplantation: What a hepatologist needs to know (and every surgeon should practice). 2005, Τόμ. 11, 8, Campsen J1, Blei AT, Emond JC, Everhart JE, Freise CE, Lok AS, Saab S, Wisniewski KA, Trotter JF. Outcomes of living donor liver transplantation for acute liver failure: The adultto-adult living donor liver transplant cohort study. Liver Transplantation. 2008, 14(9): Ghobrial RM1, Freise CE, Trotter JF, Tong L, Ojo AO, Fair JH, Fisher RA, Emond JC, Koffron AJ, Pruett TL,. Donor morbidity after living donation for liver transplantation. Gastroenterology. 2008, 135(2): Furie B, Furie BC. Mechanisms of thrombus formation. N Engl J Med. 2008, 359(9): KJ., Clemetson. Platelet GPIb-V-IX complex. Thromb Haemost. 1997, 78(1): Poole., Ewelina M. Golebiewska and Alastair W. Platelet secretion: From haemostasis to wound healing and beyond.. Blood Rev , 29(3): Kroll MH, Schafer AI. Biochemical mechanisms of platelet activation.. Blood , 74(4): Coller BS, Shattil SJ. The GPIIb/IIIa (integrin alphaiibbeta3) odyssey: a technology-driven saga of a receptor with twists turns and even a bend.. Blood. 2008, 112(8): Ελένη, Βαγδατλή. Εργαστηριακή Αιματολογία. Νεοπλασίες του Αίματος. Αιμόσταση. Έλεγχος Ποιότητας. Αθήνα : Αθανασίου Αλτιντζή, Lämmle B, Wuillemin WA, Huber I, et al. Thromboembolism and bleeding tendency in congenital factor XII deficiency-a study on 74 subjects from 14 Swiss families.. Thromb Haemost. 1991, 65: Colman RW, Bagdasarian A, Talamo RC, et al. Williams trait. Human kininogen deficiency with diminished levels of plasminogen proactivator and prekallikrein associated with abnormalities of the Hageman factor-dependent pathways. J Clin Invest. 1975, 56: Butenas S, van 't Veer C, Mann KG. Evaluation of the initiation phase of blood coagulation using ultrasensitive assays for serine proteases.. J Biol Chem. 1997, 272(34): Pittman DD, Kaufman RJ. Proteolytic requirements for thrombin activation of antihemophilic factor (factor VIII).. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988, 85(8): Sun Y, Gailani D. Identification of a factor IX binding site on the third apple domain of activated factor XI. J Biol Chem. 1996, 271: Naito K, Fujikawa K. Activation of human blood coagulation factor XI independent of factor XII. Factor XI is activated by thrombin and factor XIa in the presence of negatively charged surfaces. J Biol Chem. 1991, 266(12):

37 48. von dem Borne PA, Meijers JC, Bouma BN. Feedback activation of factor XI by thrombin in plasma results in additional formation of thrombin that protects fibrin clots from fibrinolysis. Blood. 1995, 86(8): E., Bächli. History of tissue factor.. Br J Haematol. 2000, 110: JH., Morrissey. Tissue factor: an enzyme cofactor and a true receptor.. Thromb Haemost. 2001, 86(1): Tilley R, Mackman N. Tissue factor in hemostasis and thrombosis.. Semin Thromb Hemost. 2006, 32: N., Mackman. Tissue-specific hemostasis in mice.. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005, 25: Pawlinski R, Fernandes A, Kehrle B, Pedersen B, Parry G, Erlich J, et al. Tissue factor deficiency causes cardiac fibrosis and left ventricular dysfunction.. Proc Natl Acad Sci U S A , 99: Jesty J, Spencer AK, Nemerson Y. The mechanism of activation of factor X. Kinetic control of alternative pathways leading to the formation of activated factor X.. J Biol Chem. 1974, 249(17): Baugh RJ, Krishnaswamy S. Role of the activation peptide domain in human factor X activation by the extrinsic Xase complex.. J Biol Chem. 1996, 271(27): Osterud B, Rapaport SI. Activation of factor IX by the reaction product of tissue factor and factor VII: additional pathway for initiating blood coagulation.. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977, 74(12): Morrison SA, Jesty J. Tissue factor-dependent activation of tritium-labeled factor IX and factor X in human plasma.. Blood. 1984, 63(6): Mann KG, Krishnaswamy S, Lawson JH. Surface-dependent hemostasis.. Semin Hematol , 29: Mann KG, Nesheim ME, Hibbard LS, Tracy PB. The role of factor V in the assembly of the prothrombinase complex.. Ann N Y Acad Sci , 370: Nicolaes GA, Dahlbäck B. Factor V and thrombotic disease: description of a janus-faced protein.. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002, 22(4): Kane WH, Lindhout MJ, Jackson CM, Majerus PW. Factor Va-dependent binding of factor Xa to human platelets.. J Biol Chem , 255: Tracy PB, Eide LL, Mann KG. Human prothrombinase complex assembly and function on isolated peripheral blood cell populations.. J BiolChem , 260: Pisano JJ, Finlayson JS, Peyton MP. Cross-link in fibrin polymerized by factor 13: epsilon-(gamma-glutamyl)lysine. Science. 1968, 160: Amaral A, Opal SM, Vincent JL. Coagulation in sepsis. Intensive Care Med. 2004, 30: