ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΣΧΕ ΙΑΣΜΟΥ ΦΑΡΜΑΚΩΝ

Transcript

1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΣΧΕ ΙΑΣΜΟΥ ΕΘΝΙΚΟ Ι ΡΥΜΑ ΕΡΕΥΝΩΝ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ & ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ

2 3 ο εργαστήριο Φασµατοσκοπία MR στη ιαµορφωτική Ανάλυση Φασµατοσκοπία MR Εύρεση περιοριστικών αποστάσεων Χρήση περιοριστικών αποστάσεων 2

3 Οµαδοποίηση ενεργειακά ελαχιστοποιηµένων δοµών. Ελαχιστοποίηση Ενέργειας (Energy Minimization) Αλγόριθµοι Απότοµης Κατάδυσης (steepest descent) ΣυζυγούςΒαθµίδας (conjugate gradient) Powell ewton-raphson ιαµορφωτική Ανάλυση (Conformational Search) Αλγόριθµοι Προσοµοίωσης (Simulation Algorithms) Μοριακή υναµική (Molecular Dynamics) Αλγόριθµοι Συστηµατικής Αναζήτησης Εξονυχιστική αναζήτηση (Grid Scan) Αλγόριθµοι Στοχαστικής Αναζήτησης Τυχαία ειγµατοληψία (Random Sampling) Υπερπήδησηφραγµού Boltzmann (Boltzmann Jump) Monte Carlo ιαµορφώσεις χαµηλής ενέργειας που ικανοποιούν τα πειραµατικά ROE. Πιθανότερη βιοδραστική διαµόρφωση. 2 φασµατοσκοπία ΠΜΣ (ROESY) Πειραµατικά δεδοµένα για τις ενδοµοριακές αποστάσεις (Distance Geometry) Υπερθέσεις µε γνωστές διαµορφώσεις βιοδραστικών µορίων 3

4 Α) Φασµατοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού MR uclear Magnetic Resonance Spectroscopy Φαινόµενο κατά το οποίο οι πυρήνες ατόµων µε αυτοστροφορµή (σπιν) υπό την επίδραση ισχυρού στατικού µαγνητικού πεδίου, όταν ακτινοβολούνται διεγείρονται και κατά την αποδιέγερσή τους δίνουν σήµα. 4

5 Τι είναι Spin Θεµελιώδηςιδιότηταόπως τοηλεκτρικόφορτίοήηµάζα. Είναι πολλαπλάσια του 1/2 και µπορεί να είναι είτε + ή -. Πυρήνες µε Spin Ταπυρηνικάσωµατίδιαόπωςκαιταηλεκτρόνια, κινούνταισετροχιακά. Ότανοαριθµόςτωνπρωτονίωνήνετρονίωνείναιίσοςµε 2, 8, 20, 28, 50, 82, και 126, τα τροχιακά είναι συµπληρωµένα. Επειδή έχουν σπιν, όπως και τα ηλεκτρόνια, όταν γεµίζουν τα τροχιακά αυτά συζευγνύονται. Σχεδόν όλα τα στοιχεία του περιοδικού πίνακα έχουν ένα ισότοπο µε µη µηδενικό πυρηνικό σπιν. Η φασµατοσκοπία MR µπορεί να εφαρµοστεί σε ισότοπα τωνοποίωνηφυσικήτουαφθονίαείναιαρκετάµεγάληγιαναείναι ανιχνεύσιµη. Στον πυρηνικό µαγνητικό συντονισµό, µόνο τα ασύζευκτα πυρηνικά spins παίζουνρόλο. = ηλεκτρόνιο = νετρόνιο = πρωτόνιο 5

6 Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισµός Πυρηνικός: Ανίχνευση πυρήνων µε σπιν. Μαγνητικός: Λήψη φασµάτων εντός µαγνητικού πεδίου. Συντονισµός: Οι πυρήνες διεγείρονται µε την εκποµπή υψίσυχνων παλµών προς το δείγµα και κατά την αποδιέγερση λαµβάνεται το σήµα. 6

7 Πυρήνας Ασύζευκτα πρωτόνια Ασύζευκτα νετρόνια et Spin (MHz/T) 1 H 1 0 1/ H P 1 0 1/ a 1 2 3/ C 0 1 1/ F 1 0 1/

8 Επίπεδα ενέργειας Το σπιν ενός πρωτονίου το κάνει να συµπεριφέρεται ως µικρός µαγνήτης (δίπολο). Τοποθετείται σε εξωτερικό ισχυρό µαγνητικό πεδίο. Το δίπολο προσανατολίζεται σε σχέση µε το εξωτερικό πεδίο. Παράλληλα = χαµηλής ενέργειας διευθέτηση (-S--S) Αντιπαράλληλα = υψηλήςενέργειαςδιευθέτηση (--S-S). 8

9 Ιδιότητες του Spin Εντός µαγνητικού πεδίου έντασης B, ένα σωµατίδιο µε spin µπορεί να απορροφήσει φωτόνιο σε συγκεκριµένη συχνότητα ν. Η συχνότητα εξαρτάται απότογυροµαγνητικόλόγο, γ τουσωµατιδίου. ν=γ B Γιατουδρογόνο, γ = MHz / T. 9

10 Μεταβάσεις Το σωµατίδιο (πρωτόνιο) µπορεί να µεταβεί από τη στάθµη της χαµηλότερης ενέργειας σε αυτή της υψηλότερης µε την απορρόφηση φωτονίου. Η ενέργεια του φωτονίου πρέπει να ταιριάζει ακριβώς στην ενεργειακή διαφορά µεταξύ των δύο καταστάσεων. Η ενέργεια E, ενός φωτονίου σχετίζεται µε τη συχνότητα, ν, και την σταθερά του Planck (h = 6.626x10-34 J s). E = h ν Στο MR (MRI), το µέγεθος ν καλείται και συχνότητα συντονισµού ή συχνότητα Larmor. 10

11 Μαθηµατικά πίσω από την φασµατοσκοπία MR Εκθετικές συναρτήσεις Τριγωνοµετρικές συναρτήσεις Παράγωγοι και Ολοκληρώµατα Τελεστές Μήτρες Μιγαδικοί αριθµοί Μετασχηµατισµοί Fourier (φάσµα συνάρτησης χρόνου φάσµα συνάρτησης συχνότητας). 11

12 12

13 Ισχυρό Μαγνητικό Πεδίο 13

14 14

15 15

16 16

17 17

18 Βασικές παράµετροι Χηµική µετατόπιση δ (Chemical shift) Σταθερά σύζευξης J (J coupling) 18

19 Χηµική µετατόπιση δ Η συχνότητα στην οποία συντονίζεται κάθε πυρήνας και µετράται αναφορικά µε τη συχνότητα συντονισµού µιας ένωσης προτύπου. Εκφράζεται σε µονάδες δ ppm (parts per million) σε σχέση µε την κορυφή απορρόφησης των πρωτονίων του TMS (δ=0). Χηµική µετατόπιση δ = ν i / ν 0 (ν i : συχνότητα συντονισµού του πυρήνα, ν 0 : συχνότητα του οργάνου) 19

20 Παράδειγµα Συγκεκριµένο πρωτόνιο οργανικού µορίου συντονίζεται σε συχνότητα 120 Hz σε φασµατογράφο 60 ΜΗz. Ποια είναι η χηµική του µετατόπιση; Λύση ν i = 120 Ηz, ν 0 = Hz, δ=120/ = 2 ppm Το ίδιο πρωτόνιο σε φασµατογράφο 100 ΜHz συντονίζεται σε συχνότητα 200 Hz. Η χηµική µετατόπιση θα είναι δ= 200/ = 2 ppm Η χηµική µετατόπιση είναι ανεξάρτητη του οργάνου που χρησιµοποιείται. 20

21 Χηµική Μετατόπιση Όλοι οι ενεργοί πυρήνες ενός δείγµατος δε συντονίζονται στην ίδια συχνότητα. Η ένταση του µαγνητικού πεδίου φτάνει διαφοροποιηµένη σε κάθε πυρήνα. Τα ηλεκτρόνια σθένους κάποιων ατόµων περιστρέφοντα µε τη φορά του εφαρµοζόµενου πεδίου. Στους πυρήνες των ατόµων που διευθετούνται αντίθετα στο εφαρµοζόµενο πεδίο η περιστροφήτουςπροκαλείέναµικρότερηςέντασηςµαγνητικόπεδίο. Το µαγνητικό πεδίο που «αισθάνεται» ο κάθε πυρήνας (the effective field) είναι τελικώς µικρότεροαπότοεφαρµοζόµενοµαγνητικόπεδίο. ΗέντασητουµικρότερουπεδίουΒ 1 =σβ 0 (σ: σταθεράθωράκισης/προάσπισης). Ηέντασηπουδέχεταιέναςενεργόςπυρήνας:Β=Β 0 -Β 1 B = Bo (1-σ) 21

22 Παράγοντες που επηρεάζουν τη χηµική µετατόπιση. ιαµαγνητική θωράκιση Συντονισµός σε Β=Β 0 +Β 1 ~ ηλεκτρονιακή πυκνότητα Μαγνητική ανισοτροπία ~Χηµικών δεσµών Επαγωγικά ρεύµατα προς ορισµένες διευθύνσεις. ιαµαγνητικό ρεύµα θωράκιση Παραµαγνητικό ρεύµα - αποθωράκιση Ένωση (CH 3 ) 4 -Si CH 3 -J CH 3 -Br CH 3 -Cl CH 3 -F δ (ppm) 0,0 2,16 2,65 3,10 4,26 C = C 22

23 Aσθενέστερο πεδίο Μεγάλες τιµές ppm Αποθωράκιση Υψηλότερο πεδίο Μικρές τιµές ppm Θωράκιση Κλίµακα φάσµατος MR δ (ppm) 23

24 24

25 Σταθερά σύζευξης J Σύζευξη των σπιν των πρωτονίων, στην οποία οφείλεται η πολλαπλότητα των κορυφών. Xαρακτηρίζεται από τη σταθερά σύζευξης J, η οποία ορίζεται ως η απόσταση µεταξύ των υποκορυφών που συνιστούν µια πολλαπλή κορυφή και µετράται σε µονάδες συχνότητας Ηz. Πολλαπλή κορυφή = διαφετικοί συντονισµοί του ίδιου πρωτονίου λόγω ύπαρξης των γειτονικών. π.χ. για το 1 Η Υπολογίζεται το πλήθος των υδρογόνων που συνδέονται στους γειτονικούς άνθρακες 25

26 X Y X C C Y B 0 +B 1 δ Η 1 δ Η 2 H 1 H 2 B 0 2 πιθανοί προσανατολισµοί B 0 -B 1 26

27 X Y X C C H 3 H 1 H 3 ' υνατοί προσανατολισµοί Και τα δύο παράλληλα στο Β 0 Η 3 παράλληλα Η 3 αντιπαράλληλα στο Β 0 Η 3 αντιπαράλληλα - Η 3 παράλληλα στο Β 0 Και τα δύο αντιπαράλληλα στο Β 0 27

28 Κανόνες σύζευξης Αν πυρήνας µε σπιν ½ συζευγνύεται µε n ισοδύναµους γειτονικούς πυρήνες, η κορυφή συντονισµού του σχάζεται σε n+1 υποκορυφές. Οι εντάσεις των κορυφών προσδιορίζονται στατιστικά και είναι ανάλογες µε τους συντελεστές της διωνυµικής εξίσωσης (Τρίγωνο Pascal)

29 ίδυµησύζευξη (geminal) 2 J εξαρτάταιαπότηντιµήτηςγωνίαςη-c-η. Αυτό κυµαίνεται µεταξύ 0-20 Ηz για γωνίες µεταξύ Γειτονικήσύζευξη (vicinal=vic) 3 J η σταθερά σύζευξης µεταξύ δύο γειτονικών ατόµων υδρογόνου Η' και Η εξαρτάται από τη δίεδρη γωνία φ, η οποία σχηµατίζεται από τα επίπεδα Η'C'C και C'C Η Εξίσωση Karplus Bristov J HH = 8,5-συν 2 φ-0,28 0<φ<90 J HH = 9,5-συν2φ-0,28 90<φ<180 Σταθ. Σύζευξης ίεδρη ιαµόρφωση 29

30 30

31 Β) Προσοµοίωση φασµάτων MR 31

32 υσκολίες στα φάσµατα MR -Κορυφές που δεν ακολουθούν τους κανόνες πρώτης τάξης. ύσκολη πρόβλεψη πολλαπλότητας ύσκολη αποτίµηση µορίου --Επικαλυπτόµενες κορυφές υσκολία υπολογισµού της σταθεράς σύζευξης 32

33 13,14,16,17 irbesartan a 6 6b 3 4 6c 5 2 O H H 2 O , 6a,6b,6c DMSO-H

34 6a H 6' H H 6 6a' H H6b' H6b H 6c' H6c O 6,6a,6a,6b,6b,6c H ,6c

35

36 36

37 Αρωµατική περιοχή φάσµατος 13,14,16, a 6 6b 3 4 6c 5 2 O Πειραµατικό Φάσµα Προσοµοιωµένο Φάσµα H 25 Κυκλοπεντανικός δακτύλιος 6,6c,6a,6a,6b,6b,6c,6c 6a 6b 6,6c 6 6c 6 6a 6c 6b 37

38 Άτοµο Χηµική µετατόπιση δ(ppm) 0,79 1,25 1,46 Σταθερά σύζευξης J (Hz) J 9-10 =7 J 8-9 =7 J 7-8 =7 Άτοµ ο 6,6c Χηµική µετατόπιση δ(ppm) 1,65 Σταθερά σύζευξης J (Hz) J 6-6 =0,06, J 6-6a =9,65, J 6-6a =2,19, J 6-6b =5,55 J 6-6b =5,55, J 6-6c =3,20, J 6-6c =0,30 6,6a,6b,6c ,28 4,67 - J 11-13/17 =0,5 6 6c 1,80 1,80 J 6-6a =6,91, J 6-6a =7,43, J 6-6b =9,65 J 6-6b =5,55, J 6-6c =5,55, J 6-6c =3,20 J 6c -6c =0,06 13,14,16,1 7 7,08 J ορθο =J µετα = J παρα =1 6a 1,83 J 6a-6a =11,35, J 6a-6b =2,19, J 6a-6b =9,65 J 6a-6c =5,55, J 6a-6c =5, ,53 7,57 J 19-14/16 =-0,3 J =8,49 6a 1,84 J 6a -6b =6,91, J 6a -6b =2,19 J 6a -6c =9,65, J 6a -6c =5, ,65 J =0,12 J =7,96 6b 1,85 J 6b -6b =11,35, J 6b -6c =7,43, J 6b -6c =9, ,67 J =1,28 J =8,49 J =8 6b 1,84 J 6b-6c =6,91, J 6b-6c =2,19 38

39 Οµαδοποίηση ενεργειακά ελαχιστοποιηµένων δοµών. Ελαχιστοποίηση Ενέργειας (Energy Minimization) Αλγόριθµοι Απότοµης Κατάδυσης (steepest descent) ΣυζυγούςΒαθµίδας (conjugate gradient) Powell ewton-raphson ιαµορφωτική Ανάλυση (Conformational Search) Αλγόριθµοι Προσοµοίωσης (Simulation Algorithms) Μοριακή υναµική (Molecular Dynamics) Αλγόριθµοι Συστηµατικής Αναζήτησης Εξονυχιστική αναζήτηση (Grid Scan) Αλγόριθµοι Στοχαστικής Αναζήτησης Τυχαία ειγµατοληψία (Random Sampling) Υπερπήδησηφραγµού Boltzmann (Boltzmann Jump) Monte Carlo ιαµορφώσεις χαµηλής ενέργειας που ικανοποιούν τα πειραµατικά ROE. Πιθανότερη βιοδραστική διαµόρφωση. 2 φασµατοσκοπία ΠΜΣ (ROESY) Πειραµατικά δεδοµένα για τις ενδοµοριακές αποστάσεις (Distance Geometry) Υπερθέσεις µε γνωστές διαµορφώσεις βιοδραστικών µορίων 39

40 Φάσµατα MR 1D ( 1 H, 13 C,..) 2D (οµοπυρηνικά, ετεροπυρηνικά) 40

41 Φάσµατα 2 διαστάσεων 41

42 ιαδικασία.. Ταυτοποίησητουφάσµατος 1 Η MR (και κατά συνέπεια της δοµής ενός µορίου) µε χρήση δισδιάστατων COSY, OESY. Εύρεση ενδοµοριακών περιοριστικών αποστάσεων από το δισδιάστατο φάσµα MR OESY. Εφαρµογή τους στη ιαµορφωτική Ανάλυση 42

43 Ποια είναι η συνεισφορά του MR στη ιαµορφωτική Ανάλυση; Μεταβολή στην ένταση απορρόφησης ενός πρωτονίου όταν ακτινοβολείται γειτονικό ή πλησίον ευρισκόµενο πρωτόνιο. 43

44 Υπολογισµόςενδοµοριακώναποστάσεων απότονοεsyφάσµα όπου: r απόσταση µεταξύ των πυρήνων Α και Χ. τc χρόνος συσχετισµού περιστροφής του µορίου (correlation time). α) Ο µέσος όγκος κανονικοποιείται ως προς τον αριθµό των πρωτονίων που πιθανότατασυµµετέχουνστονoeσήµα. β) Επιλέγεται ο όγκος αναφοράς ο οποίος αντιστοιχεί σε δεδοµένη απόσταση αναφοράς. Η επιλογή βασίζεται στη διαχωριστικότητα και στην παρουσίαχαµηλούεπιπέδουθορύβουώστετονoeίχνοςναείναιευκρινές. Με αυτόν τον τρόπο δεν επιδέχεται αµφιβολία ότι ο όγκος που µετρήθηκε αφορούσε σαφώς σήµα και δεν περιελάµβανε θόρυβο. Συνήθως επιλέγεται το ΝOE σήµα µεταξύ δύο διαδοχικών αρωµατικών πρωτονίων, των οποίων η απόσταση αναφοράς είναι 2,46Ǻ. γ) Υπολογίζεται ηαπόσταση (R) γιαταυπόλοιπασήµατανoeβάσητης σχέσης : V R= R 6 REF V REF 44

45 Ένα ολοκληρωµένο παράδειγµα 45

46 1 H eprosartan 18 HOOC Β 26 - CH 3 SO 3 14, , H Α COOH 5 S Γ DMSO-H 8 9 COOH

47 dqf cosy 18 HOOC CH 3 SO - 3 F 1 (ppm) 14/16, / /16, / COOH 2 5 S /17-14/ F 2 (ppm) ,5 47

48 18 HOOC CH 3 SO Αλειφατική περιοχή φάσµατος COOH 2 5 S Πειραµατικό Φάσµα 7 DMSO 8 9 Προσoµοιωµένο Φάσµα gmr Cherwell Scientific 48

49 18 HOOC CH 3 SO Αρωµατική περιοχή φάσµατος COOH 2 5 S Πειραµατικό Φάσµα Προσoµοιωµένο Φάσµα 49

50 13 C 18 HOOC CH 3 SO / / COOH 23 S

51 hsqc 14/16, / F 2 (ppm)

52 hmbc 18 HOOC CH 3 SO - 3 ppm 20 14/16, / H19,C H7,C9 H7,C8 26 H8,C10 H8,C9 H8,C H9,C10 H10,C9 H9,C7 H9,C8 H10,C /16, / COOH S H13/17,C11 H11,C13/17 H11,C5 H11,C12 H11,C2 H21,C19 H21,C23 H21,C20 H21,C22 H7,C2 H8,C2 H4,C5 H14/16,C14/16 H14/16,C12 H4,C2 H19,C4 H19,C20 H25,C23 H25,C22 H24,C25 H23,C25 H23,C24 H13/17,C13/17 H13/17,C14/16 H24,C22 H23,C H21,C6 H14/16,C18 H19,C6 8 6, ppm

53 /17 roesy HOOC CH 3 SO /16,4 F (ppm) COOH S /16, / / F 2 (ppm) ,5 53

54 Άτοµα Απόσταση Αξιολόγηση 18 HOOC CH 3 SO ,9 Å 2,8 Å 2,7 Å Καθορίζει την προσέγγιση της βουτυλοµάδας µε το µεθυλένιο 11 Καθορίζειτηντιµήτηςδίεδρηςγωνίατ 4 µεταξύ µεθυλενίου 19 και του ιµιδαζολίου COOH S ,6 Å Καθορίζειτηνπροσέγγισητουµεθυλενίου 11 µετοµεθυλένιο /17 3,5 Å Καθορίζειτηνπροσέγγισητουµεθυλενίου 7 της βουτυλοµάδας µε το φαινυλικό δακτύλιο 54

55 Υπολογιστική Χηµεία - ΠΜΣ Τυχαίαδειγµατοληψία (Random sampling) Άλµα Boltzmann (Boltzmann jump) οµές µε τη χαµηλότερη ενέργεια που ικανοποιούν τις περιοριστικές αποστάσεις RΟΕ 2000δοµέςενεργειακά ελαχιστοποιηµένες Κατηγοριοποίηση των ενεργειακά χαµηλότερων δοµών Τελικές δοµές Μοριακή υναµική µεχρήσητων RΟΕ Περιορισµών. Υπέρθεση µε losartan Πιθανή βιοδραστική διαµόρφωση 55

56 Αποτελέσµατα Τυχαίας δειγµατοληψίας 1 η Κατηγορία 2 η Κατηγορία 3 η Κατηγορία 4 η Κατηγορία 56

57 ιαµορφωτικά εναντιοµερή 57

58 Μοριακή υναµική Μ1 Μ2 Μ3 58

59 Υπέρθεση µε το losartan losartan losartan 59

60 Πιθανή Βιοδραστική ιαµόρφωση Structure Elucidation and Conformational Properties of Eprosartan a non peptide Angiotensin II AT 1 antagonist. Panagiotis Zoumpoulakis, Simona Golic Grdadolnik, John Matsoukas and Thomas Mavromoustakos. J. Pharm. Biom. Analysis, In press

61 Θεωρητικό υπόβαθρο Μοριακής Βάσης της υπέρτασης ΑΤ 1 Ανταγωνιστές Cl OH HOOC O H Losartan COOH S Eprosartan H Irbesartan CH 3 CH 3 H 3 C O CH CH 3 H COOH EtO COOCH(Me)O O O H 3 C CH 3 C OH O H 3 C C O C H 2 O O O HOOC H Telmisartan Valsartan Candesartan cilexetil Olmesartan medoxomil H H 61