םואיטורפה הסמ תייפוקסורטקפס

Transcript

1 שיעור 3: אמרנו שאפשר לדעת את 20 החומצות האמיניות הראשונות בחלבון (דגרדציית אדמן-,(Edman אבל אם רוצים למפות חלבון ארוך יותר צריך לפרק את החלבון באמצעים פרוטיאוליטיים למקטעים קטנים יותר. עושים זאת בעיקר באמצעות שימוש בכל מיני אנזימים שונים, בניסויים מקבילים. מפעילים על המקטעים את דגרדציית אדמונד, ואחר כך מחברים את הפאזל. נשתמש בדוגמא שלהלן: צריך גם להתייחס למיקום הקשר הדיסולפידי. במקטע T3 T2, יש ציסטאינים, על מנת לדעת אם יש קשר דיסולפידי חושפים את החלבון לטריפסינים גם מבלי לחזר את הקשר הדיסלופידי ומשווים בין כמות המקטעים המתקבלת בשני המקרים. שיטה זו כבר לא משמשת לאנאליזה של חלבונים- היום קל יותר לפענח את הגנום, ולקבל את סדר הקודונים לחלבון. אם כי,חשוב לזכור ששיטה זו לא תמיד מעידה על השינויים שהחלבון עובר בצאתו מהריבוזום. הפרוטיאום- הוא כינוי לככל החלבונים שנמצאים בתא. דרך חדשה נוספת לקבוע את רצפי החומצות האמיניות היא באמצעות ספקטרוסקופיית מסה. במהלך הניסוי השרשרת הפוליפפטידית עוברת ביקוע לרדיקאלים חופשיים. לכל חלקיק שעבר ביקוע יש תכונות ידועות, באמצעותם ניתן לזהות בדיוק רב את החלבון. גם בשיטה זו צריך לבקע את החלבון באמצעות אנזימים, אבל יתרונה בכך שאפשר להשתמש בה לקביעת התמרות ושינויים בומצות האמיניות. כאשר נקבעו רצפים של חלבונים שממלאים את אותה פעילות- כמו ציטוכרום C מאורגניזמים שונים, ניתן לראות שלד שזהה בכולם. אלו הם חומצות אמינוית אינווריאנטיות. החומצות

2 האמיניות שיכולות להשתנות בדרך כלל מתחלפות במשהו דומה (ארומאטיות), אבל יש גם ח"א שהן שונות באופיין הכימי. מספר ההבדלים יכול גם לשמש לקביעת הקרבה האבולוציונית. חלבונים הם למעשה מבנים תלת מימדיים שמוכבים מאלפי קשרים קוולנטיים. אם היתה יכולת סיבוב חופשי סביבם- מספר הקונפורמציות היה אינסופי. המבנה התלת מימדי הוא זה שקובע את פעילות החלבון, ולמרות שהוא מורכב מאד- הוא בדרך כלל עשוי ממקטעים מוכרים, שניתן לנתח אותם. חומר לבוחן ביום ראשון: קיצורים של ח"א, ומבנה. לא צריך לדעת,pK צריך לדעת קשר דיסולפידי וקשר פפטידי pi או משקל מולקולרי מבנה של חלבון מסווג ב- 4 רמות שונות: מבנה ראשוני- רצף חומצות האמיניות והמיקום של קשרים דיסולפידיים. מבנה שניוני- השרשרת הפוליפפטידית ספציפית לקונפורמציה ייחודית, ולכן המבנה המרחבי שלהם ייחודי. מבנה שלישוני- המבנה התלת מימדי של פוליפפטיד אחד. שרשרת כזו יכולה להיות פעילה במקרים רבים. האזורים ההידרופוביים פונים כלפי הליבה וההידרופיליים פוים החוצה. מבנה רבעיוני- הארגון בין תתי יחידות של חלבון. דוגמא לכך היא ההמוגלובין. בין רמות מבנים אלו יש תתי רמות. בין המבנה השניוני לשלישוני יש -domains שהם מקטעים שיכולים לפעול לבד ולהתקפל לבד, כמו שרשראות ה- F של נוגדנים שמסתובבים לבד, מבלי להיות משוייכים לנוגדן. כשמסתכלים על מבנים שניונים ושלישוניים מסתכלים על 2 משפחות שונות: יש חלבונים סיביים- בד"כ לא מסיסים, שרשראות ארוכות של ח"א. חלבונים גלובולריים- הם מסיסים ויכולים להכיל מספר אלמנטים שניוניים. 2 חומצות אמיניות מתחברות בקשר אמידי (או פפטידי). הוא יוצר קשר עם 2 קשרים קוולנטיים. ריצ'רד קאוטי וטאולוס גילו עובדות מעניינות לגבי הקשר הפפטידי- הם גילו שהקשר C-N בקשר פפטידי הוא קצר יותר מקשר C-N סטנדרטי. הם גילו גם שקשר C=O הוא ארוך יותר מקשר דומה סטנדרטי. שה הוביל אותם למחשבה שיש רזוננס במערכת. הרזוננס גורם לפולאריות מסוימת, כמו גם למומנט דיפול. מאחר שקשר C-N הוא לא קשר בודד אבל גם לא כפול זאת אומרת שאין לו סיבוב חופשי- ולכן החומצות האמיניות מחוברות כעין משטחים. כל פחמני ה- α הם בטראנס זה לזה. הזוויות בין המשטחים הן דהידרליות (=מוגדרות על ידי 4 נקודות, ולא על ידי 3 כמו כל זווית סטנדרטית). הזוויות מוגדרות על ידי או. לכל פחמן אלפא יש 2 זוויות דהידרליות. טווח הזוויות הוא מאפס עד 180. הזוויות מקבלות זווית אפס כאשר 2 המשטחים הצמודים נמצאים על אותו מישור. ניתן ליצור גרף של שמבטא את היחס בין הזוויות- עקומה כזו נקראת גרף רמשנדראן. יש מגבלות בזוויות הסיבוב בגלל הפרעות סטריות. בעקומה האזורים הכהים הם המותרים. פאולין וקורי שיערו שלקשרי מימן יש תפקיד חשוב בייצוב של חלבונים. הם גילו מרווחים חוזרים במרחקים של 5.4 אנגסטרום. הם שיחוק עם זה, ובסוף הגיעולמסקנה שהמבנה הוא מבנה סלילי, סביב ציר אחד, מיוצב על ידי קשרי מימן. סיבוב אחד של ה- α-helix אורכו 5.4 Å או 5.6 שיירים. עקרון היד הימנית- כיוון הסיבוב היא כיוון כיווץ יד ימין כשהאגודל פונה מעלה. כאשר יש חומצות אמיניות הידרופוביות או ארומאטיות גדולות הם יכולות להפריע ליצירה.

3 מאידך, כאשר יש לנו חומצות אמיניות במטענים מנוגדים הם מייצבים את ה-.α-helix המבנה הוא פולארי במידה מסוימת N' הוא דלתא +, וC ' הוא דלתא -. כאשר יהיו ח"א טעונות שלילי בקצה ה- N הוא ימנע היווצרות הליקס. גם גליצין לא נמצא במבני הליקס- הוא קטן מדי. גם הפרולין (ברוב המקרים) לא נמצאת שם- כי בפרולין אין מימן על ה- N שחיוני ליצירה של קשרי המימן. במעט המולקולות שבהם יש פרולין יש כיפוף מסוים. ישנם הורמונים שיש בהם צבר של 4 הליקסים, כמו.GH בהליקסים האלו רואים שכל השיירים שמופנים לתוך הצבר הם הידרופוביים, והשאר פולאריים. התכונה הזו- שצד אחד של ההליקס בעל אופי אחד, והצד השני עם אופי אחר נקראת אמפיפאתיות. משטחי β בנויים מגדילים פוליפפטידיים שמקושרים בקשרי מימן לגדלים אחרים. בניגוד למשטחים, שבהם השיירים פונים לתוך הסליל, כאן השיירים פונים לשני צידי הגדיל בצורה מתחלפת. יש 2 סוגים של משטחי β- הסוג הראשון נקרא אנטי מקבילי. קשרי המימן בנויים זוגות זוגות שמופרדים על ידי שיירים אחרים. למשטחים אלו יש יכולת פיתול מסויימת. הסוג השני הוא משטח פרללי- כל השרשראות הפוליפפטידיות שבונות את המשטח מתקדמות לאותו כיוון. המשטחים והסלילים מחוברים אחת ל השניה באמצעות -loops שרשראות פפטידים חסרי צורה ייחודית (שבדרך כלל יכולים לקבל מספר תצורות. כיוון השרשרת הפוליפפטידית קובע אם המשטחים הם פרלליים או אנטיפרלליים. בין 2 גדילי β אנטיפרלליים יש "סיבוב".turn יש 2 סוגי סיבוב, שמוגדרים על ידי 4 שיירים- שיש ביניהם קשרי מימן. מסיבוב יש היפוך של הקשר הפפיטדי- ניתן להבחין במימן שפונה לכיוון השני. משום כך יש בסיבובים רבים גליצין (בגגל גודלו) או פרולין (בגלל יכולתו לשמור על מבנה יציב). חומצות אמינו בדרך כלל נמצאים בקונפורמציית,trans למרות זאת- הפרולין יכול לקבל את 2 הצורות- גם cis וגם trans כדי לאפשר את שינוי הכיוון של השרשרת הפוליפפטידית. חילקנו את החלבונים לסיביים וגלובולריים. התפקיד של החלבונים הסיביים היא להקנות לאיברים מסוימים קשיחות וגמישות. נדגים זאת עם α-caroten וקולגן. חלבונים אלו אינם מסיסות במים משום שהחומצות האמיניות ההידרופוביות פונות כלפי חוץ. ה- α-caroten נמצא בשיער, בציפרניים וכיו"ב. הקולגן הוא גמיש יותר ונמצא בעיניים, באפידרמיס, וברקמות חיבור כמו גידים. היחידה הבסיסית של α-caroten בנויה מ 2 שרשראות α-helix מ. - 2 הפילמניטם האלו בנויים בין השיירים ההידרופוביים יש גם ציסטאינים- שמחזיקים את המערך במקומו. אפשר באמצעות חומר מחזר ומחמצן לשבור את הקשרים, לעצב אותו מחדש ולבנות אותו שוב. קולגן בנוי מ- helix לפי עקרון היד השמאלית, עם gly-x-pro או gly-x-hyp (הידרוקסיפרולין). היחידה הבסיסית הבאה היא שלושה הליקסים המלופפים אחד סביב השני לפי עקרון היה הימנית. יחידות אלו בונות כלי דם, עור גידים וכיו"ב. בקולגן יש קשר קוולנטי לא שכיח שנותן את הקשיחות וגמישות למערך כולו. לקרטין ולקולגן יש חשיבות רבה. ישנם פגמים גנטיים שגורמים לשיבושים בייצור הקרטין, אם התינוקות נולדים חיים יש להם בעיות במפרקים, בפרקים ויש להם עיוותים שלדיים חמורים. בקולגן יש, כאמור, 2 חומצות אמינו חריגות- הידרוליזין והידרופרולין, שמיוצרים בגוף. אחת המחלות האלו היא צפדינה.(skerby) היא מתאפיינת בהשחרה של העור, בנשירה של שיניים, ציפרניים וכיו"ב. במאה ה- 18 מתו יותר ממליון מלחים או חיילים ממחלה מוזרה זו. מה שגרם למחלה היא דיאטה נטולת ויטמין C, שהיא חומצה שיונקים לא מסוגלים לייצר בכוחות עצמם. החומצה האסקורבת עושה את ההידרוקסילציה על הפרולין והליזין. גילוי הויטמין וההבנה שתזונה טובה יותר מונעת את המחלה גרמה לחיסול הצבים באיי הגלאפאגוס- כי הם לא אוכלים הרבה ובשר טרי הוא עשיר בויטמין C.

4 ניקח דוגמא אחרת- BSA גלובולארי שמורכב מ- 2 שרשראות. אילו היה רק בקונפורמצית β היא באורך 200Å. האינטראקציות בין 2 סוגי השרשראות השרשראות מייצבות ומקצרות אותו. מצב זה מכונה קריסה הידרופובית. פריצת הדרך הראשונה בהבנת המבנה השלישוני של חלבונים באה מפתרון המבנה של המיוגלובין על ידי דיפרקציה בקרני X. העבודה נעשתה בסוף שנות ה- 50. המיוגלובין בגודל 16.7 קילודלטון, באורך 153 ח"א. יש לה תת-יחידה של.heme היא בנויה מטבעת פורפורינית שבמרכזה ברזל. התפקיד של המיוגלובין הוא לאגור חמצן. הוא נמצא בשרירים ומקבל חמצן. אנחנו נמצא ריכוזי מיוגלובין גבוהים ביונים ימיים. לכן השרירים שלהם הם חומים (ולא אדומים). המיוגלובין מכיל 8 מקטעי -helix הקצר ביותר בן 20 ח"א. ביניהם יש כיפופים. הוא אינו מכיל סלילים. יותר מ- 70% מהמיוגלובין מכיל שיירי.α-helix באמצעות קרינת רנטגן ניתן לזהות כל מולקולה במרחב. קבוצת ה- heme תחובה בתוך חריץ מיוחד בחלבון. כל החומצות האמיניות ההידרופוביות (חוץ מ- 2) פונות לתוך ליבת החלבון- וכל השאר הידרופיליות. בתוך המבנה יש מקום רק ל- 2 מולקולות מים. גילוי המבנה של המיוגלובין אישר את התחזיות של פאולין וקורי שהציעו את המבנה. קבוצת ה- heme היא שכבה פלנארית (שטוחה). הברזל קשור בקשר קואורדינטיבי (לא קוולנטי ולא מימני). כאשר פוענחו יותר ויותר מבנית תלת מימדיים הבינו שהמבנים של החלבונים מגוונים ונקבעים על ידי רצף החומצות האמיניות. ניתן לראות שלחלבונים שניוניים יש מבנים שונים. המבנה התלת מימדי מכתיב את היעילות של החלבון ואת הפונקציה שלו. אפשר להרוס את המבנה השלישוני או הרביעיוני באמצעות דנטורציה. יש דנטורציה הפיכה (כמו ביצה), ויש לא הפיכה. דנטורציות הפיכות ניתן להשיג על ידי שינוי קל בטמפרטורה, שינוי חד ב-,pH בממסים אורגאניים (ניתן להפר את האיזון בין השרשראות). כאשר מסירים את הגורמים המפריעים מתקבל, ברוב המקרים, רנטורציה. הדוגמה הטובה ביותר שהוכיחה שהמבנה הראשוני מכיל "קוד" שלא פוענח המכיל את אופן קיפול החלבון ניתן באופן הבא: לקחו חלבון קטן, שיש לו 8 אתרים שצריכים להיקשר זה לזה, הוא שם אותו בחומר מחזר, וכשהסירו את החמר המחזר כל החומרים הדי-סולפידים חזרו למקומם המדויק למרות שהיו כ- 100 אפשרויות שונות ליצירה מחודשת של קשרים.

5 לא כל החלבונים שיוצאים מהריבוזום מתקפלים בקלות. חלקם צריכים סיוע כדי להגיע לקיפול הנכון. השיירים בחומצות האמיניות האינווריאנטיות חשובות לקיפול הנכון. על מנת לזהות אם חומצות חשובות או לא עושים.site directed mutagenesis מחליפים רצף של קודון אחד לקודון אחר ובודקים את השפעת השינוי. חומצות חשובות הם כאלו שמשתתפות בתהליך ההיצמדות לקולטן (הורמון גדילה, לדוגמה). בודקים את קבוע הקישור לקולטן, וכך ממפים את החשיבות של כל שייר. חלבונים נוצרים על פני הריבוזום תוך פחות מ- 5 שניות באופן מושלם (כולל הייצור והקיפול). אם יש לחלבון 100 חומצות אמינו- יש לו אפשרויות חיבור. לו היינו מנסים אותם בז האחר זה זיה היא אורך אחת התיאוריות לגבי סדר קיפול החלבון מדבר על קיפול היררכי- כשאזור מסונטז, מגיעים מקטעים אחרים ונוצרים המבנים השניוניים. תיזה נוספת מדברת על חלבון קריסה הידרופובית- שהחלבון נמצא במצב "גולמי" globule).(molten היום מאמינים שזה שילוב של כמה אלמנטים. את הבניה אפשר לתאר כמשפך אנרגטי ששואף לאנרגיה הנמוכה ביותר- בהתחלה יש אפשרויות רבות- כשהוא בוחר בהתחלה את המבנים היציבים ביותר ואח"כ מס' האפשרויות פוחת. הזכרנו חלבונים שנקראים "שפרונים" שממסכים את האזורים ההידרופוביים בחלבון ומסייעים בבניתו (שהמים לא יפריעו). מגוון התפקידים שממלאים החלבונים הוא עצום- הורמונים, נוגדנים, וכיו"ב. אנחנו צריכים לדעת את המבנה התלת-מימדי שלו כדי לעמוד על תפקיד החלבון. זה יכול לסייע זיהוי מולקולות דומות (פיתוח תרופות או חלבון סינתטי) וללמד אותנו על אופן הקיפול של חלבונים. יש 2 שיטות לפיתרון המבנה- (15%) NMR ודיפרקציה בקרני (85%). X לכל שיטה יש את היתרונות והחסרונות שלה. דיפרקציה בקרני X פשוטה יותר ונגישה יותר, ולכן פפולארית יותר. דיפרקציה בקרני X היא שיטה קריסטלוגרפית קלאסית, שיסודותיה לא השתנתה הרבה מאז פותחה לראשונה. השיטות הביוכימיות התפתחו כך שניתן להפיק חלבון נקי יותר, ציוד הקרינה השתפר וכיום משתמשים בגלאים אלקטרוניים מהירים וטכנולוגיות המיחשוב מאפשרים כיום את ביצוע החישובים. מאקרו מולקולות הם בגודל של ( Å אנגסטרום= מטר). בגדלים כאלו לא ניתן להשתמש בטכנולוגיות אופטיות (האור הנראה הוא בתחום,nm ואורך של קשר כימי הוא בטווח של.(1.5nm טווח התדרים המתאים ביותר הוא תחום קרינת הרנטגן. עם זה יש כמה בעיות- אין עדשה שיכולה למקד את הגלים האלו, ולמרות שידוע שמולקולות אכן מסיטות את הקרינה, רוב הקרינה לא עוברת דרך המולקולה, והוא מהווה "רעש". כדי לפתור את זה משתמשים בגביש, שהוא מחזורי, וכך ניתן להתגבר על הרעש. בגביש הפיזור של של קרני X נעשה על ידי ענני האלקטרונים (ולא על ידי הגרעינים). גבישים יכולים לקבל מספר צורות- בהתאם למבנה הפנימי של המולקולה. גם טכנולוגיות גידול הגבישים השתפרו מאז שפותחה שיטה זו. כשמוסיפים חומר לתמיסה מגיע שלב שבו היא רוויה- וחומר לא יכול להתמוסס עוד. אפשר לשנות את נקודות הרויה באמצעות שינויים מבוקרים (טמפ', ויברציות קוליות, חלל וכיו"ב). גבישים נוצרים בנקודה שנקראת "נקודת על-רוויה"- שבה תמיסה מכילה יותר משהיא יכולה לשאת- ואז נוצרים גרעיני הגיבוש. מציאת הנקודה היא נסיונים, וכדי שהתהליך יהיה אוטומאטי ומדויק משתמשים ברובוטים. יש כמה דרכים להגיע למצב של על רויה. אם ניקח כוס מי מלח ונעמיד אותה באזור חם ויבש המים יתנדפו וריכוז החומר יעלה. על מנת לגרום לנידוף מבוקר אנחנו משתמשים בעקרון שנקרא vapor diffusion שאומר שאם יש לנו מערכת סגורה שבה 2 כוסות אחד בריכוז 0.1M והשניה בריכוז 0.05M, אם נשאיר אותה מספיק זמן תתרחש דיפוזיה של החומרים הנדיפים (במקרה זה- המים). אנחנו מניחים טיפה של חלבון באזור יבש ובסופו של דבר המים מתנדפים. מקור קרינת הרנגן- היא מנורת קרני X: כששמים מנורה בשדה מגנטי ליד האנודה אלקטרונים מתחילים לנוע, והם עולים ברמה שלהם ויורדים ברמה שלהם. כאשר רמת האנרגיה מגיעה לרף מסוים נפלטים אורכי גל באורך גל ספציפי (תואם קרינת ס). לכל מתכת יש ערך סף שם יפגעו בה היא תשחרר קרינת X. המתכת הפופולארית ביותר היא נחושת. שיטה זו מאוד לא יעילה מבחינה אנרגניטת (רוב האנרגיה הופכת לחום), וכדי לקבל ניצולת טובה יותר משתמשים באנודה שזזה (וכך מקבלים סיבולת טובה יותר לחום).

6 על מנת לקבל עוצמה גבוהה עוד יותר אפשר להשתמש במאיץ חלקיקים. במאיץ חלקיקים נפלטת קרינה באופן משיק למעגל, ואנרגיית הקרינה פונקציונלית למהירות. היתרון הגדול הוא שאפשר להגיע לעוצמות קרינה בררך ב- 30 סדרי גודל יותר מאשר במעבדה (סדר גודל הוא פקטור של 10). יש גם יכולת שליטה באורך הגל. הניסוי מבוצע באותו אופן בכל מקום בעולם (רק מקור הקרינה משתנה). על נייר הצילום מתקבלים נקודות בעוצמות שונות ובפיזור שונה. ככל שהרזולוציה גבוהה יותר- יש יותר נקודות על הנייר, אפשר להגיע למבנה מדויק יותר. למרות זאת- עדיין חסרים לנו פרטי מידע חשובים- כמו אינטראקציות עם חלבונים אחרים וכיו"ב. ההמוגלובין היא דוגמא טובה להראות שההמבנה הרבעיוני נקבע בהתאם למבנה השלישוני. לא כל תת-יחידה זהה לשכנתה. יש 4 תת-יחידות שונות, כששניים מהם שונות מעט:אלפא מכילה 141 חומצות אנמינו, והביטא מכילה 146 חומצות אמינו. היא דומה למיוגלובין-יש רצפים דומים ואפילו זהים. המבנה של ההמוגלובין התגלה בסוף שנות ה- 50. קוטר כל תת-יחידה בערך 55Å. אין חפיפה בין השרשראות. קבוצת ה- heme יושבת בכיס שמאוד דומה לזה של המיוגלובין, גם היא מבוססת על היסטדין. מרבית האינטראקציות הם בין 2 סוגי שרשראות שונים- אלפא עם ביטא וכו'.

7 ניתן לראות שהחמצן לא נקשר באפיניות טובה להמוגלובין (בשלבים הראשונים), במיוחד ביחס למיוגלובין- שניתן לראות שמקבלת חמצן מיד. במעבר בין מצב נאוקסי (עם חמצן) למצב דיאוקסי (נטול חמצן) נשברים קשרים קוולנטיים. חמצן משרה שינוי על המולקולה שגורם לו להימשך ליותר חמצן (שיתוף פעולה). העליה באפיניות של ההמוגלובין (כשהוא עולה- רק אחרי שהאזור רווי חמצן) היא בערך פי 500. יש 2 מצבים להמוגלובין- (tense) T כאשר הוא עם חמצן, ו- (relaxed) R כאשר הוא נטול חמצן. המעבר בין מצב R למצב T כרוך בשבירה של קשרים הידרופוביים וקשרי מימן. מהרגע שהחמצן הראשון נקשר למולקולה- השינוי "משודר" לתת היחידות הארגון הרבעוני משתנה) והוא מאפשר ליחידות האחרות לקשור חמצן באפיניות גדולה יותר. שיתוף פעולה כזה נקרא "קואפרטיביות חיובית. הרצאת אורח- ד"ר דבי שליו- הישומים של NMRבקביעת מבנה חלבונים: NMR היא שיטה שבה מסתכלים על הפעילות של החלבון בסביבה של שדה אלקטרומגנטי חזק. ניתן להסתכל על מאקרומולקולות, על DNA וכיו"ב. המולקולות מרחפות בתמיסה, וכך ניתן גם לשלוט על כל התנאים שלה. המידע המופק יכול ללמדנו על המבנה של המולקולה, על האינטראקציות שלה, ואפילו על הקינטיקה שלה. השדה המגנטי יכול להיות חזק אפילו פי 30 מהשדה של כדור הארץ. הפרוטונים בגרעין משרים שדה מגנטי (כיוון שיש להם מטען חשמלי), באופן טבעי- הם נעים באקראי (עם השפעת השדה המגנטי של כדוה"א). אולם, כאשר הם נמצאים בשדה אלמ"ג חזק- הספין של המולקולות מתיישר. בהרצאה היום נעסוק בפחמימנים ולכן נדון רק בפרוטונים שהם מימנים. המימנים מסתדרים במרחב, בהתאם לכל חומצה אמינית (כי הם מסתדרים כדי "להגן" על הגרעין מפני השדה המגנטי). המולקולה האורגאנית הראשונה שנחקרה באמצעות NMR היא.Ethyl Benzene קבוצת החוקרים זכתה בפרס נובל על הישגם להבחין בין הקשרים השונים. אמנם, השימוש ב- NMR החל בשנות ה- 70, אולם עם הזמן נחקרו בשיטה זו מולקולות יותר ויותר גדולות. הייחוד של ה- NMR היא הרגישות שלה. בשיטה זו ניתן להבחין ב"טביעת אצבע" ייחודית למימנים של כל חומצה אמינית, ולכן ניתן לעשות אנליזה לכל. הדיוק הוא כה רב (לכל מולקולה (לכל המימנים ולכל הגרעינים) יש תחום תגובה) עד שניתן אפילו להשתמש בהם לזיהוי איזוטופים רדיואקטיביים. כאמור, בביולוגיה משתמשים בחקר האינטראקציות של מימן, שמנותחות בכמה שלבים. בשלב ראשון זיהוי המולקולה מתבצע על ידי אפיון הקשרים -קביעת המקום של כל מימן במרחב. בשלב הבא קובעים את האינטראקציות של המימן עם מימנים אחרים. בשלב זה (המכונה (NOSEY ניתן לאפיין מבנים שניוניים ושלישוניים של החלבון. כדי לקבל דיוק טוב ניתן לאפיין אותם מכיוונים שונים (הפרדה דו-מימדית), וניתן גם לאפיין את האינטראקציות שבינם לבין גרעינים אחרים (חנקנים, לדוגמא). NMR "מצלם" את המולקולה בפרק זמן של כמה מאיות השניה. גם כשהמימנים נעים- הם מוחזקים בתחום מצומצם על ידי קשרי הואן-דר-ואלס (שלד המולקולה) [למימנים יש ספין אחר משאר הגרעינים]. אפשר למצוא הרבה אילוצי מרחק בין מימנים- ומציאתם נעשית באמצעות מחשב. ישנה משפחה שלמה של מולקולות שעונות לקריקטירונים האלו- וכולן מייצגות נאמנה את הקונפורמציות השונות שבהן המולקולה יכולה להיות. בפרסומים המדעיים, בגלל שיאן יכולת להציג אנימציות, נהוג להלביש את כל הקונפורמציות האפשריות אחד על השני, וכך ניתן לראות את "עמוד השדרה". המדד ליציבות היא סטיית התקן (σ). ניתן גם לבדוק באופן זה את הקשר שבין הסובסטראט (או הרצפטור) לחלבון. בזמן הקישור ההיסטים הכימיים זזו- ולכן ניתן להסתכל על כל אחד בו זמנית ואז על תערובת של שניהם ביחד (יש קיבעוןמסוים בזמן הקישור). בזמן הקישור גם הקינטיקה שלהם משתנה, וגם באופן זה ניתן לראות אם הם מקיימות אינטראקציות. לאחר הקישור ניתן להשוות את מיקומי ה"פיקים" למקום בו הם היו קודם, וכך ניתן למפות את השינויים שעוברים עליו. כאשר בדקו המוגלובין תאי, ביחס להמוגלובין מתאים שרוסקו, גילו שהאפיניות של ההמוגלובין שבתאים לחמצן נמוכה ממה שמתקבל במבחנה. ב נמצאה מולקולה קטנה BPG (biphospoglycerate) שמעכבת כ- 27% ממהמוגלובין. היא נקשרת בין ארבעת תתי-היחידות של ההמוגלובין. ל- BPG יש קבוצות זרחן שמעכבות את שינוי הקונפורמציה הדרוש למעבר משלב T למצב R. כשהשינוי כן מתרחש, אז מבנה ההמוגלובין משתנה ואז ה- BPG משתחרר, ולא מעכב יותר. בהמוגלובין עוברי יחידות β הן שונות, ונקראות γ. יחידות אלו לא יכולות להיקשר ל-,BPG ולכן האפיניות שלו גבוהה מזו של המוגלובין בוגר. גילו גם שההמוגלובין הבוגר יכול לעבור דיסוציאציה לתת-היחידות (להיפרד אחת מהשניה). גילו שתתי היחידות, בפני עצמן, יש להן אפיניות דומה לזו של מיוגלובין. גילו גם שכאשר לוקחים 4 יחידות β, אפשר ליצור מערכת רבעונית (טטרמר), דמויית המוגלובין. למערכת זו אין קואפרטיביות, כמו ההמוגלובין הרגיל.

8 הוכחה לכך שיש שינוי קונפורמציה בהמוגלובין קיבלו גם בניסוי הבא: כשנחשפו גבישים של מיוגלובין לחמצן לא קרה שום דבר, אבל כשגבישים של המוגלובין נחשפו לחמצן הם נשברו. בהמשך גם הצליחו למדוד את הסטיה- שהיא בגודל של 7Å. אם מסתכלים על מערכות של α 1 β 1 α 2 β 2 גילו שהמיוגלובין מסודר כמו מספריים. השינוי בין מצב דאוקסי למצב האוקסי של ההמוגלובין מתבטא בסיבוב של כ- 15 o סביב מוקד הסיבוב. במצב הדיאוקסי קישור הברזל הוא לא פלנארי- הברזל בולט מתוך הטבעת שבה הוא נמצא בסדר גודל של 0.4Å, אבל כאשר הברזל נקשר לחמצן הברזל נמשך לתוך הטבעת. הברזל קשור להיסטדין- שקשור למערכת,α-helix שנחשבת למערכת קשיחה (יחסית). השינוי הזה גורם לשבירה של אינטראקציות יוניות שגורם לשינוי הקונפורמציה המשמעותי. ההתמוססות של פד"ח ) 2,CO פחמן דו חמצני) בדם מתווכת על ידי אנזים שנקרא carbonic - משום שהיא לא טובה. ההתמוססות של פד"ח בדם מלווה בהיווצרות היון.HCO 3,anhidrase היווצרות היון הזה מלווה בירידה ב-.pH זה גורם לשינויים בקשרים ההידרוסטטיים של ההומגלובין, שמייצבות אותו במצב דיאוקסי (T), ולכן החמצן משתחרר. כאשר ההמוגלובין מגיע לרקמות, ההיסטדינים שהשתנו עוברות דה-פרוטונציה והמבנה משתחרר חזרה למצב שמאפשר קישור חמצן. המוגלובין יכול להיקשר להמון מולקולות שונות- ציאנידים, פחמן חד חמצני וכיו"ב. גם CO 2 נקשר להמוגלובין. אתר הקישור הוא הקצה ה- N טרמינילי. הפד"ח והקצה הופכים לקבוצת.carbamino בריאות הקרבמאט הופך להיות לא יציב (בגלל המטען השלילי), ומשתחרר. הועלו כל מיני השערות בנוגע למנגנון המעבר ממצב דה-אוקסי למצב אוקסי. אחת התיאוריות היא בגישת הכל או לא כלום. או שכל היחידות במצב T או שכולם במצב R. גישה אחרת סוברת שיכולים להיות מצבים מעורבים, ושיווי משקל בין צורות האוקסי, הדה-אוקסי, ה- R וה- T.

9 אנמיה חרמשית היא פועל יוצא של מוטציה אחת.Glu6Val(β) חומצה הידרופילית מוחךפת בהידרופובית. המוטציה גורמת לכך שמתקבל (הטטרמר) המוגלובין S במקום המוגלובין A. יחידות S מקיימות ביניהן קשרים, ולכן מתקבלים שרשראות של המוגלובינים. כאשר המוגלובין S נקשר לחמצן הוא הופך להיות לא פעיל ושוקע בתא. המחלה פרחה במיוחד באפריקה, משום שהיא מונעת הידבקות במלאריה. אנזימים מטרתן לקטלז ריאקציות בתאים. אנזימים ידועים בספציפיות שלהם, וביכולתם לזרז ריאקציות בתנאים פיזיולוגיים. ישנם גם זרזים על בסיס,RNA אולם לא נעסוק בהם במסגרת זו. האנזימים מורידים את רף האנרגיה הדרוש ליצירה או פירוק של קשרים כימיים. המולקולה שנקשרת לאתר הפעיל של האנזים, ועליה מתרחש הריאקציה נקרא סובסטראט. הסובסטראט יכול להיות גם חלבון. במהלך הקישור נוצר קומפלקס אנזים-סובסטראט. אנזימים מקטלזים (בד"כ) תגובה כימית אחת, ספציפית. לעיתים אנזימים יכולים לבצע ריאקציות דומות- אנזימים פרוטאולייים, לדוגמה, יכולים לפרק סוגים שונים של קשרים. ניתן גם לאפיין את רמת הספציפיות של האנזים: פפסין יכול לפרק כל קשר פפטידי, בעוד תרומבין מפרק רק קשרים בין ארגינין ליצין. יש בקרה על יצירת האנזים, כך שהוא נוצר בכמות שצריך. כשמדברים על אנזימים צריך להתייחס ל- 2 פרמטרים: קצב היראקציה ושיווי משקל. לכל חומר יש אנרגיה בסיסית שאגורה בו. לסובסטראט יש אנרגיה ברמה אחת, ולתוצר יש ברמה אחרת. כאשר האנרגיה של התוצר נמוך מזה של התוצר שיווי המשקל יטה לכיוון התוצר. על מנת להביא את הסובטראט לרמת אנרגיה נמוכה יותר, יש צורך לשקיע רמה מסוימת של אנרגיה כדי להגיע למצב המעבר. אנרגיה זו היא אנרגיית האקטיבציה. אנזים מוריד באופן משמעותי את אנרגיית האקטיבציה, על ידי יצירה של תנאים מאד נוחים. כאשר הריאקציה מורכבת ממספר שלבים, הריאקציה תתרחש בקצב של השלב האיטי ביותר. קינטיקה אנזימטית האתר הפעיל של האנזים מורכב ממספר מועט (יחסית) של מספר חומצות אמיניות (שלא בהכרח קרובות אחת לשניה). הסובסטראט נקשר לאנזים באמצעות קשרים חלשים, ובאפיניות לא גבוהה. האתר הפעיל נמצא (בד"כ) בבקע כך שהריאקציה תתרחש שם. הספציפיות של האנזים גבוהה. פישר העלה השערה שהאתר הפעיל של האנזים מותאמת בצורה מושלמת לתפקודו. השערה זו, שהחזיקה מעמד עשרות שנים, אבל כיום אנחנו יודעים שהיא לא מדויקת. אם האנזים היה מותאם בצורה מושלמת לסובסטראט- לא יהיה שינוי באנרגיית האקטיבציה של הריאקציה. התיאוריה המודרנית טוענת שהאתר הפעיל של האנזים מותאם בצורה מיטבית למצב המעבר, וגם מותאם, במידת מה, לסובסטראט. אפשרות נוספת מתארת תהליך מורכב עוד יותר- האנזים מותאם לסובסטראט, וכשהוא נקשר אליו הוא עובר שינוי מושרה על מנת להתאים למצב המעבר. ב מיכאליס ומנטן פישטו את הקינטיקה האנזימטית. הם הדגישו את החשובות של הקומפלקס אנזים סובסטראט. הם הניחו שיש מנגנון ריאקציה ברור: הם מניחים שהריאקציה ES E+P הולכת רק בכיוון אחד. הנחה נוספת היא "קירוב המצב העמיד"- בזמן שהריאקציה מתרחשת ריכוז הקומפלקס אנזים-סובסטראט לא משתנה. דהיינו 1- K= K. 1 הם לקחו את היחס שבין קבועי הקצב של הפירוק לבין קצב היצירה. ריכוז האנזים בכל נקודת זמן שווה להפרש שבין ריכוז האנזים ההתחלתי לריכוז האנזים שמקיים סובסטראט.

10 כאשר ריכוז הסובסטראט שווה ל- K- m מהירות הריאקציה היא מחצית מה-,Vmax ולכן אחת ההגדרות של Km היא ריכוז הסובסטראט שבו חצי מהאתרים של האנזים "תפוסים". למעשה, כשעושים ניסיון עם אנזימים, קשה מאד לאפיין את הנתונים האלו. ולכן- על מנת לפשט את החישובים שלנו משתמשים בעקומת Lineweaver-Burk כאשר ציר ה- X הוא [S]/1 וציר y הוא V/1. החיתוך עם ציר y הוא,-1/Km ועם ציר V/1. max x.kcat לא תמיד מייצג נאמנה ריאקציות מורכבות מעט יותר, ולכן המציאו את Km קבוע הדיסוסיאציה היא המנה שבין קצב היצירה וקצב הפירוק של האנזים והסובסטראט בכיוון הריאקציה. ככל שהערכים נמוכים יותר זה מראה על קישור חזק יותר של האנזים לסובסטראט. קבוע הספציפיות הוא המדד האמיתי ליעילות האנזים. ניתן לחקור גם את מצב המעבר, באמצעות חקירת האנזים. אחד הדרכים לחקור זאת היא באמצעות אנאלוגיים למצב המעבר. אנאלוגים כאלו יכולים להיות מעכבים, ולשמש גם כטיפול תרופתי. אחד היישומים הם נוגדנים. נוגדנים קטליטיים נוצרו באמצעות הכנסת גורם זר לגוף חי. הגוף הזר יכול להיות אנאלוג למצב המעבר. מאחר והאתר הפעיל דומה למצב המעבר הם ייצרו קומפלקס עם נוגדנים קיימים. לגוף יש יכולת לעכב ריאקציות אנזימטיות. מנגנון העיכוב, יכול ללמד לפעמים על מנגנון האנזים. עיכוב יכול להיות הפיך ולא הפיך. דוגמה מציונת לעיכוב בלתי הפיך- אורגנוזרחנים קושרים מולקולת,serine ופוגע באציטל-כולין-אסטראז בצורה בלתי הפיכה. הגוף בדרך כלל לא מייצר מעכבים כאלו. המעניינים יותר הם המעכבים ההפיכים- עם אפינות נמוכה יותר כך שש להם יכולת דיסוציאציה של הקומפלקס. גם כאן יש שני סוגים: מעכב יכול להיות תחרותי- כלומר להיות בעל צורה דומה לזו של הסובסטראט, והוא יכול להיקשר לאתר הפעיל של האנזים במקום הסובסטראט. המשמעויות הקינטיות הן שה- V max לא משתנה. ה- -Km עולה; בנוכחות מעכב נצטרך הרבה יותר סובסטראט כדי שסטטיסטית ייקשר לאנזים הסובסטראט ולא המעכב. מעכבים מורכבים יותר הם מעכבים תחרותיים. מעכב כזה נקשר לאנזים באתר לא פעיל. גם מסוג זה יש 2 סוגים: - uncompetitive המעכב הזה נקשר אך ורק לקומפלקס אנזים-סובסטראט. כאשר האנזים לא בקשר עם הסובסטראט המעכב לא נקשר אליהם. מעכב מסוג non- -competative סבוכה יותר. ההשלכות הקינטיות במצבים אלו הן לא פשוטות. החלק מהם משתנה רק ה- ובחלקן שני הפרמטרים ישתנו.,V max עיכוב אנזימים אינטראקציה בין אנזים לסביבה ח~ ב מדען בריטי בשם אלכסנדר פלמינג לקה בהצטננות והזליף מעט מהנזלת שלו לצלחת פטרי. הוא גילה שבמקומות אלו לא גדלו חיידקים. הוא חקר את המנגנון והבין שיש שם אנזים (ליזוזים) ששובר את ממברנת התא. היום ידוע שהליזוזים נמצא בכמויות רבות בביצים, מסיבה זו. המשך המחקר העלה שהאנזים נמצא גם בדמעות, אולם הוא לא משפיע על כל סוגי החיידקים. זה לא הפריע לו יותר מדי, כיוון שכמה שנים לאחר מכן הוא גילה את הפניצילין. דופן התא של הבקטריות שהאנזים משפיע עליהם, מורכב משרשראות של סוכרים שנקראים NAM ו-.NAG הם מחוברים בקשר גליקוזידי 1C של NAM ל- 4C של.NAG ישנם גם אפשרויות לקשרים אחרים. הליזוזים שובר את הקשר הגליקוזידי שתיארנו. ה- NAM מכיל מתמיר גדול הרבה יותר מה-.NAG הליזוזים הוא אנזים קטן יחסית (129 "א, 36Å~). זה החלבון הראשון שניתחו אותו מבחינה תלת-מימדית. למרות זאת, לא הצליחו להבין מיד את אופן פעולתו, ואפילו לא זיהו את האתר הפעיל שלו.על מנת לזהות את האתר הפעיל השמתמשו במעכבים תחרותיים. הזכרנו כבר שאנזימים פרוטיאוליטיים יכולים לעיתים לפעול על חומרים דומים. הליזוזים אמור לעבוד על,poly(NAM-NAG) אבל יכול גם לעבוד על.poly(NAM) המעכב הראשון שהשתמשו

11 בו נקרא.tri-NAG גילו שה- tri-nag נקשרים בתחילת התעלה של הליזוזים, ושם מגיעים רק עד למחציתה. האינטראקציות הן גם הידרופוביות וגם פולאריות. על מנת לעמוד על המנגנון האנזימטי השתמשו בסימולציית מחשב, שתיכנתו בה מולוקלת סוכר בת 6 סוכרים. ניתן לראות שכשמדובר בחד או דו סוכר הריאקציה מאד איטית, אבל מסתבר שהמהירות המקסימלית היא ב-.Vmax על ידי התאמות כאלו ראו גם שבעמדה 3 לא יכול להיות.NAM ובעמדה 4 צריך להיות סוכר מעוות. מנגנון מחקר נוסף הסתכל על שרשרת באורך 6 סוכרים של.NAM-NAG הוא חייב לשבור קשר בין NAG ל-,NAM ולא הפוך. ה- polynag הוא, במקרה כיטין. באמצעות איזוטופים רדיואקטיביים אפשר לסמן בדיוק רב את מיקום השבירה של הקשר- אחד מהסוכרים תמיד מקבל את האיזוטופ הרדיוקטיבי. לאחר שגילו את זה הלכו לחקור את החומצות האמיניות שנמצאות באזור הפעיל בחלבון. הריאקציה האופטימלית שבה מתרחשת שבירת הקשר היא ב-.ph=5.5 במצב זה הגלוטאמאט נמצא במצב,protonated באזור הידרופובי, שזה מצב מאד לא רצוי. לעומתו האספרטאט נמצא במצב לא-טעון באזור הידרופובי. בשלב ראשון- הגלוטאמאט נותן את הפרוטון לקשר הגליקוזידי. בשלב שני- סוכר D (שהוא קשור לחמצן ונושא מטען חיובי- אוקסיקרבוניום), מקבל קבוצת הידרוקסיל מהמים. סוכר נמצא, בקונפורמציית כיסא במצב רגיל. אבל בקישור לאנזים המצב היציב שלו הוא דווקא במצב חצי-כיסא. לסיכום- הליזוזים שובר שרשרת סוכרים באורך 6 ל- 2 תתי קבוצות: אחת בת 2 סוכרים והשניה בת 4 סוכרים. כשלסוכר D יש מבנה ייחודי תלת מימדי. ניתן לסנתז אנאלוג למצב המעבר (חומר דומה, שיהיו לו את אותם תנאים), עם רזוננס באותו מקום, ובאותה קונפורמציה- וגילו שהאפיניות שלו לאנזים עולה פי האנזים יציב בטווח ph מסוים, בהתאם למצב הפרוטונציה של החומצות האמיניות. ה- NAM לא יכול להיות בעמדה C. נסיונות נוספים עשו מודיפיקציות כימיות של,Asp 52 וראו שהם מליחים להשבית את פעילות החלבון. במשך שנים רבות התווכחו על המנגנון. הליזוזים שייך למשפחת הגליקוזידאזות. בגליקוזאדות רבים נוצר קשר קוולנטי במנגנון S, N 2 וב הצליחו להתאים גם לליזוזים מנגנון מסוג S, N 2 במקום המנגנון בסגנון S N 1 שתיארנו. לאחר שעשו מוטציות לגלוטאמט מנגנון ה- S N 2 הוא המקובל היום. אנזים אחר שנתמקד בו הוא קרבוקסיפפטידאז A. האנזים הזה קשור לאבץ +2.Zn הוא חלבון פרוטיאוליטי ששובר את החומצה האמינית האחרונה בקצה הקרבוקסילי, אם הוא ארומאטי או הידרופובי גדול. המבנה שלו התגלה ב- 1967, ואורכו עם גודל של כ- 50Å, מורכב גם ממשטחי β וגם מסלילי α. ליד יון האבץ נמצא כיס הידרופובי גדול שמכיל את השייר האחרון של השרשרת הפוליפפטידית, וכך נוח לאתר הפעיל של האנזים לעבוד עליו (כשהשייר בתוך הכיס). מאחר שהכיס הידרופובי יש לו נטיה להיקשר לחומצות אמיניות הידרופביות. הקופורמציה של החלבון משתנה מאד כשהוא נקשר לחלבון. כאשר הסובסטראט נקשר, תוך כדי השינויים הקונפורמטיביים המים שנמצאים באתר הפעיל, נדחקים החוצה, והסובסטראט מחליף אותם. השינוי הקונפורמטיבי תוך כדי הקישור לסובסטראט מאפשר התאמה של החלבון למספר רב של סובסטראטים. האבץ עושה אקטיבציה של מולקולת מים בנוכחות חומצה אמינית. האבץ, בנוכחות חומצה גלוטאמית 270 גורם להרחקה של הפרוטון וההידרוקסיל- והוא הופך להיות נוקלאופיל.

12 דודי אנגלברג רוב עולם החי מורכב מסוכרים (ולא חלבונים). סוכרים הפחמימות מוגדרות כאלדהידים וקטונים שמכילים הידרוקסילים. הגדרה זו לא מונעת שיהיו קשורים אליו גם קבוצות נוספות- כמו זרחן או קבוצות חנקניות. מקור השם carbohydrates הוא במיום של פחמנים- כלומר: כל פחמן קשור למולקולת מים. באלדהיד הקבוצה הפעילה היא הקבוצה הקרבונילית. הסוכרים הבסיסיים ביותר הם טריוזות- בעלי 3 סוכרים. הקטון המוכר ביותר, שהוא קצר מ- 3 פחמנים הוא אצטון. להידרוקסי אצטון יש חלק מהתכונות של סוכרים, אך היא עדיין לא סוכר. לעומתם- די-הידרוקסי אצטון (אצטון שקשור לשני קבוצות הידרוקסיל) הוא הסוכר הבסיסי ביותר. סוכרים מסיסים במים. בנוסף לקשרי המימן שיכולים ליצור הקבוצות ההידרוקסיליות, הקשר הקרבונילי הוא פולארי וגם זה מסייע למסיסות של הפחמן. חומרים אלו לא מסיסים בשומנים ובממסים אורגאניים. תכונות המסיסות מאפשרים למולקולות להגיע לתאים, ולהישאר בתוכם (או להיות נעוצים במעטפת התאית). לכל הסוכרים פחמן או פחמנים כיראליים, ולכן יש לו הרבה קונפורמציות. אנזימים ספציפיים לקונפורמר מסוים, ולכן כשמזהים סוכר צריך להתייחס לאיזומר הספציפי. יוצא הדופן היחיד הוא ה- ketotriose או dihydroxyacetone שאינו כיראלי. כאשר יש n פחמנים כיראליים יש 2 n סטריאואיזומרים. בסוכרים אין הסתעפויות, ואורך מרבית הסוכרים נמצא בין 3-6 פחמנים. הקונפיגורציה D או L נקבעת לפי ההידרוקסיל בפחמן הכיראלי הכי רחוק מהקרבוניל. אם הם מימין הם D. בהזדמנות זו ראוי לציין את הסוכרים החשובים: ריבוז- סוכר על בסיס 5 פחמנים. גלוקוז, מנוז, פרוקטוז- סוכר הפירות (קטון). ריאקציות של סוכרים אם נוסיף לסוכרים חומרים מחזרים Fe(III) או Cu(II) היא יכולה להתקיף את המטען החיובי החלקי שעל החמצן הקרבונילי ומתקבל חומצה קרבוקסילית. על בסיס זה עובדת בדיקת סוכר בדם. ריאקציה חשובה נוספת היא התגובה עם כהלים- ההידרוקסיל של הכוהל תוקף את הפחמן, ונוצר המיאצטל.(hemiacetal) התגובה יכולה גם להמשיך ליצירת.acetal בתגובה זו שרשראות הסוכר מגיבות עם עצמם hemiacetal) (intra-molecular ויוצרות טבעות. הקרבוניל משתתף גם בחימצון וגם בסיפוח, אולם אלו פחות חשובים לענייננו. כאמור, סגירת שרשרת הסוכר יוצרת פחמן כיראלי חדש, ולכן יכולים להיות 2 אפשרויות סגירה, שנקראות פשוט α ו- β. האיזומרים האופטיים השונים נקראים אנומרים. הפחמן נקרא הפחמן האנומרי. ישנם אנזימים יכולים לזהות את 2 הצורות, וישנם כאלו שמזהים רק אנומר אחד. 2 הצורות הציקליות וצורת השרשרת נמצאים בשיווי משקל. בתהליך שנקרא מוּ טרוטציה- הטבעות עוברות מצורה לצורה. 2/3 מהסוכרים נמצאות בקונפיגורציית β. אפימרים- הם סוכרים ששונים אחד מהשני רק בפחמן כיראלי אחד. כדי לזהות סוכרים מוסיפים להם חומרים מחזרים, שהופכים אותם לחומצה קרבוקסילית. כשמוסיפים את החומר המחזר (שעובד רק על צורת השרשרת) שיווי המשקל גורם לפירוק הטבעות ולכן הריאקציה היא ישירה. התרכובת של המחמצן והחומצה (המלח) יכול לגרום לריאקצית צבע או לשינוי בליעה שניתן למדידה. החומר למבחן הראשון: נוסחאת גלוקוז (שרשרת וטבעת), פרוקטוז (כנ"ל), גליצראלדהיד, די-הידרוקסיאצטון, גלוקוז- 6 -פוספאט, סוכרוז, לקטוז, פירובאט.

13 עד עכשיו דיברנו על סוכרים מונומריים. בסוכרים מונומריים אין הסתעפויות. אבל יש גם פולימרים- סוכרים שמחוברים אחת לשניה. סוכרים נמצאים בדרך כלל בקונפוגורציית כיסא. מתמירים שאינם הידרוקסילים יכולים להשפיע על המבנה. עיוותים נפוצים של טבעות סוכריות, נמצאים בסוכרים בעלי 5 סוכרים. מעוותים כאלו נמצאים במולקולות.RNA מתמירים יכולים להיות גם אנאורגאניים- כמו קבוצת פוספאט. דוגמא לזה זה גלוקוז- 6 -פוספאט (פוספאט מותמר על פחמן 6). ייצור הדיאוקסיריבוז הוא קשה כי הסוכרים "רוצים" קבוצות הידרוקסיל. הוצאת קבוצת ההידרוקסיל מעמדה 2 בדיאוקסיריבוז הופכת אותה לחריגה, וליציבה במיוחד. גלוקוזאמין מופיע הרבה במעטפות של חיידקים. לרשימת הסוכרים המונומריים המיוחדים ראה שקף 29 מצגת סוכרים [גירסאת 2005], עם הקיצורים שלהם. הייחוד שלהם מתבטא בכימיה שלהם, והם קיימים בטבע בכמות עצומה. תהליך היצירה של פוליסכרידים זהה ליצירה של אצטל, בין פחמן 1 במולקולה אחת לפחמן 4 במולקולה אחרת. הקשר הגליקוזידי שנוצא לא מאפשר לסוכר שקשור דרך פחמן 1 לחזור לצורת השרשרת. הקשר הגליקוזידי מתפרק אך ורק בחום ובתנאי ph חומציים (כמו בקיבה, לדוגמא). 2 מונוסכרידים מחוברים יחד נקראים דה-סכריד. דוגמאות לסוכרים כאלו הם לקטוז, סוכרוז, טרהלוז. פוליסכרידים- הם רצף ארוך של סוכרים שמחוברים בקשר גליקוזידי. הם דומים למולקולות,DNA אולם לסוכרים אין סדר ספציפי, ולכן הם יכולים להגיע לאורכים גדולים ומשקלים מולקולריים מפחידים. יכולים להיות הומוסכרידים- רצף של שרשראות זהות. נציין כמה פוליסכרידים חשובים: עמילוז (אלו קונפיגורציות של פחמן α לעמילן יש סיבוב של o 180 סביב פחמנים 4 1, שיכול ליצור.coil הסליל עוזר לאריזה), צלולוזה (תאית, אלו קונפיגורציות של שרשראות β, ובגלל זה התכונות שללו שונות לחלוטין). קשר α1,4 הוא ניתן לפירוק בקלות על ייד אנזימים, לעומתו קשר β1,4 נחשב לאחד היציבים בטבע, ומאוד קשה לפירוק. למרות שהסוכרים הם מקור האנרגיה העיקרי לפעילות ביולוגית, הם לא משמשים באופן ישיר לייצורו. כלומר תוספת של סוכר למערכת אנזימטית לא תזרז את הריאקציה. מקורות האנרגיה הישירים של התאים הם ATP ו-.NADH כל פעילות ביולוגית דורשת אנרגיה. ישנן מולקולות רבות שניתן לייצר מהן ATP ו-.NADH אבל אפילו טורפים, שניזונים רק מחלבונים משתמשים בגלוקוז כמקור ארגיה. ATP שייכת למשפחת הנוקלאוטידים (המקור שלו מהגרעין). הריבוז (הסוכר של הגרעין) הוא הבסיס עליו יושבים פוספאטים. הפוספאטים נמצאים במצב אנהידריד (יש שלושה פוספאטים בשרשרת). אנהידריד הוא יציב מאד, ובעל אנרגיה רבה- הפוספאטים טעונים שלילית. במעבר למצב יציב יותר הפוספאטים משתחררים (יש כוחות דחיה ביניהם בגלל המטען השלילי). מולקולות אחרות שיכולות לספק אנרגיה לתהליכים אנזימטיים הם קרובי משפחה של ATP כמו UTP,GTP וכיו"ב. בתאים יש ריכוז קבוע של,ATP ברמות של,μM כאשר בכל סוג תא הכמות שונה, בהתאם לתפקודו (תאי שריר יש יותר). NADH הרבה יותר מורכב מ-.ATP החלק הפעיל בו היא טבעת ניקוטין-אמיד, שיכול לקבל ולאבד אלקטרונים בקלות. למרות זאת- כל המולקולה חשובה- אם ניקח רק טבעת ניקוטין-אמיד הוא לא יקבל אלקטרונים. יש NADH חופשי בתאים, והיא יכולה גם לשבת באנזימים בתור אתר פעיל, כחלק אינטגרלי מהאנזים. גם לו יש קרובי משפחה. עיקר הייצור מתרחש במיטוכונדריה, ושם עיקר השימוש בו. רמות ה- NAD+ מאד נמוך בתא, במיוחד במחזור נשימה אירובי, מכיוון שכשהוא במצב המחומצן שלו הוא מפסיק את תהליך הנשימה האירובית. מקורות אנרגיה,ATP) (NADH

14 מולקולות גלוקוז יכולה לעבור כמה שינויים: היא יכולה להפוך לגליקוגן וללכת לאחסון. היא יכולה להתחמצן במסלול פנטוז-פוספאט או במסלול גליקוליזה. בחלק זה נעסוק רק בגליקוליזה. פירובאט היא הקטו-חומצה של אלאנין. בכל הייצורים החיים, גם אלו שניזונים רק מחומצות אמינו מתרחשים כל התהליכים כאלו. כלומר טורפים מייצרים גלוקוז מחומצות האמינו וכך מעבירים אותו לתאים, שם הוא יכול להישמר כגליקוגן. לא ברור למה האבולוציה שימרה את כל התהליכים האלו בצורה כה אדוקה- האנזימים והקנטיקה שלהם דומים מאד בין כל הייצורים החיים. מולקולות טעונות לא עוברות ממברנות ביולוגיות, ומולקולות הידרופיליות עוברות ממברנות ביולוגיות בכמות זניחה. אמנם הגלוקוז לא פולארי, אבל הוא הידרופלי. איך הוא נכנס לתאים? Transporters הם מולקולות helix שבגרעין כשהשיירים ההידרופיליות פונות פנימה וההידרופוביות החוצה. הוא יושב בממברנה ומאפשר מעבר גלוקוז. גליקוליזה תהליך הגליקוליזה מורכב מ- 10 ריאקציות בסך הכל, כאשר ניתן לחלק אותם ל- 2 תתי- קטיגוריות: 5 הראשונות ו- 5 האחרונות. הגליקוליזה הוא מסלול ביוכימי, שמתחיל בגלוקוז ומסתיים בפירובאט. בשלב ראשון הגלוקוז עובר זירחון מקבל קבוצה פוספורית. הפוספאט טוען את הגלוקוז במטען חשמלי (כך שהוא לא יוצא מהתא). הפוספאט נשאר איתו לאורך כל שלבי הגליקוליזה (המקום היחידי שבו הפוספאט מפורק מהסוכר הוא בכבד). בשלב השני הגלוקוז הופך לפרוקטוז. בשלב שלישי הפרוקטוז עובר עוד זירחון ובשלב הבא הוא- נשבר ל- 2 מולקולות עם שלושה פחמנים. אחד מהם גליצראלדהיד- 3 -פוספאט והשני דהידרוקסי-אצטון-פוספאט. אלו הם שלבי ההכנה- עד עכשיו השקענו אנרגיה, ולא קיבלנו כלום. בשלב החמישי הדהידרוקסי-אטצון גם הופך לגליצראלדהיד- 3 -פוספאט. בתום השלב הזה הדהידרוקסי-אטצון כבר לא משחק תפקיד. כמובן שגם שלב זה מלווה בהשקעת אנרגיה. בשלב השישי הגליצראלדהיד- 3 -פוספאט מתחמצן (ע"י דה-הידרוגנאז) ובמהלכו NAD הופך ל-.ATP בשלב השביעי 2 פוספאטים ממולקולות הגליצראלדהיד עובדות ל-.NADH בסך הכל (בתהליך הגליקוליזה) עבור 2 המולדולות של הגליצראלדהיד- 3 -פוספאט שמשתתפים בתהליך מקבלים חזרה 2 מולקולות NADH ו- 4 מולקולות.ATP יש מסלול מטאבוליטי של הפקת אנרגיה שבו מחמצנים חזרה את הפירובאט- יוצרים חומצה קלטית על ידי לקיחת האלקטרונים מה- NADH והפיכתו שוב ל-.NAD+ זה קורה בתנאים אנאירוביים (חיידקים, שרירים וכיו"ב). יש גם תסיסה אלכהולית. ונשימה אירובית- שהיא הדובדבן שבקצפת- בו מקבלים בין 36 ל- 38 מולקולות.ATP הריאקציה הראשונה היא זירחון. זה מתבצע על ידי הקסוקינאז. הוא יודע לזרחן כל סוכר עם 6 פחמנים בעמדה 6. יש מסםר סוגים של אנזימים כאלו, בעלי אותה פעילות אך תכונות שונות

15 (לדוגמא- בכבד ה- Km של אנזים כזה גבוה יותר מה- Km של אנזים סטנדרטי. אנזים שמזאחן חומר נקרא קינאז. הגלוקוז הופך לפרוקטוז באמצעות פתיחת השרשרת שלו ושינוי קונפוגורציה. האנזים phosphofructokinase-1 מזרחן את הפרוקטוז. ברגע שהפרוקטוז מקבל את הזרחן השני הוא מחוייב לתהליך- אין מסלול ביוכימי אחר שהוא יכול ללכת בו, משלב זה והלאה.