Charge The ph in which the above form is dominant

Transcript

1 1 פתרון תרגיל 1 # )1 בכל חומצות האמינו, למעט גליצין, פחמן אלפא הינו אסימטרי )קיראלי(. אלנין 6.01 = pi ליזין 9.74 = pi חומצה גלוטמית 3.22 = pi )2 ph Charge )3 ) The ph in which the above form is dominant ph = ,

2 2 5( התופעה שלקבוצות ה- -amino בליזין וארגינין יש pka גבוה יותר מאשר לקבוצות ה- α-amino יכולה להיות מוסברת עפ"י עקרון הפרדת מטענים. שני מטענים מנוגדים על אותו פחמן זהו מצב לא יציב ולכן קבוצת האלפא אמינו תיטה למסור את הפרוטון שלה )מטען( מהר יותר מקבוצת האפסילון אמינו. ph ph כל חומצה אמינית שאין לה שייר R שעובר דה-פרוטונציה מכיוון שנין לראות רק שתי נק' pka שאופייניות לקצה האמיני והקרבוקסילי. היסטידין- ח.א. בעלת שייר R שמאבד פרוטון ב- ph=6.0 ולכן ניתן לראות בעקומה שלוש נקודות.pKa ) Equivalent OH - Equivalent OH - 9( בפפטיד הבא: O H O NH3 + C CH NH C CH 3 CH NH COO - CH NH C CH NH C CH CH2OH O CH 2 O CH 3 CH CH 3 CH 3 OH ph א( ה- N טרמנלי ב( ה- C טרמינלי ג( הקבוצות הצדדיות R בפפטיד ד( Charge 0 0-2

3 3 מה ה- 10( pi של הפפטידים הבאים: Lys-Gly-Ala-Gly pi = 9.74 Lys-Gly-Ala-Glu pi = 6.6 Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly pi = המטען של הפפטיד האחרון ב- ph11 הוא: ( אספירין: מכיוון שחומרים טעונים עוברים את הממברנה הליפידית לאט יותר מחומרים בלתי טעונים ניראה באיזה סביבה יעבר ה- OH שעל גבי האספירין דה-פרוטונציה. לפי ה- pka של אספירין (3.5) ניראה שבמעי (ph=6) האספירין יהיה במצב המיונן שלו ואילו בקיבה שם ה- ph=1.5 המולקולה תהיה עדיין בלתי מיוננת ולכן הספיגה תהיה יותר מהירה בקיבה. ph באיזה ph12 ואילו ב- ph7 הוא בעל מבנה אקראי. 12. הסבר מדוע פולילזין יוצר סליל אלפא ב- יוצר פוליגלוטמאט יוצר סליל? תשובה: פוליליזין יוצר סליל אלפא ב- ph=12 בגלל שקבוצות ה- R שלו עברו דה-פרוטונציה כעת אין ph=7 אליהן מטען חיובי ולכן הן אינן דוחות אחת את השניה מה שמאפשר את ייצוב ההליקס. ב- קבוצת ה- R של הליזין מיוננת במטען חיובי ולכן קב' ה- R דוחות אחת את השניה )דחייה אלקטרוסטטית( מה שמערער את יציבות ההליקס ומפרקו למבנה אקראי. )בפוליגלוטמאט הרעיון דומה רק שהנתונים של שייר ה- R שונים( 13. חלבון מורכב מ- 584 חומצות אמיניות המימד הארוך ביותר בחלבון הוא 13 nm מה המספר המכסימלי של חומצות אמיניות שיכיל סליל אלפא בחלבון זה? אילו החלבון היה מורכב מגדיל ביטא אחד, מה היה האורך המכסימלי של החלבון? * ראה פיתרון בכיתה

4 א) ב) ג) ד) הפפטיד: Met(1)-Leu(2)-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Ala-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu יוצר מבנה -helix ונקשר לחלבון X הטעון במטען שלילי חזק. החומצות האמיניות של הפפטיד הקושרות את החלבון X הן )המספר בסוגריים מסמל את המספר של החומצה האמינית בפפטיד כאשר החומצה האמינית בקצה האמינו טירמינלי היא מספר 1(: א( (9) -Arg.Lys (12)-Arg (5)-Arg (16) ב( (9) -Arg.Met (1)- Lys (12)-Arg (5)-Arg (16) ג( (2) (9)-Leu.Ile (8) -Arg (5)-Arg (16) -Arg ד( Arg(5)-Gln(6)-Ser(7)-Ile(8)-Arg(9)-Phe(10)-Phe(11). ה( כל התשובות לא נכונות. * ראה פיתרון במצגת 15. הפפטיד הבא : Met(1)-Lys-Ile -Leu- Arg-Glu-Leu-Arg-Arg-Phe-Phe-Lys-Ser-Lys-Thr-Arg-Leu יכול להיקשר לחלבון טעון שלילית. החומצות האמיניות המשתתפות בקשר הנכון הן: Met (1)-Lys (12)-Arg (5)- Arg (16)-Arg (9)-Lys (2)- Lys (14) Met (1)- Lys (12)- Arg (5)- Arg (16)- Arg (9)- Lys (2) Leu (4)-Phe (11)-Leu (7)-Ile (3)-Phe (10)-Leu (17) Phe (11)-Leu (4)-Thr (15)-Arg (8)-Met (1)-Lys (12)-Arg (5) ) ) ) ) תשובה: ראה איור בעמוד הבא.

5 5 NH 3 + Arg (8) Met (1) Lys (12) Thr (15) Arg (5) Leu (4) Arg (16) Phe (11) Arg (9) Leu (18) Lys (2) Leu (7) Ser (13) Lys (14) Glu (6) Ile (3) Leu (17) Phe (10) לפי התרשים התשובה הנכונה ביותר היא תשובה )ב(.

6 ph האיזואלקטרי. 6 )16 חלבון? חלבון נמצא ב- איך משפיעה הוספת ריכוז מלח נמוך או גבוה על המסיסות של תשובה: הוספת מלח בריכוז נמוך לא תשפיע על מסיסות החלבון או יותר נכון "תעזור" לו להשאר מסיס. אולם הוספת ריכוז מלח גבוה יתבצע תהליך של out" "salting ז"א החלבון ישקע. מה יהיו שיקוליך בבחירת גרגירי שרף לג'ל פילטרציה לעמודה כדי להפריד בין: יוני מלח לחלבון. גרגירי שרף שהחלבון לא יכול לעבור דרכם והמלח כן. א( חלבון שמשקלו המולקולרי 5000 לבין חלבון שמשקלו 100,000. לאיזה צורך ב( יידרש נפח בופר גדול יותר, להוצאת החלבון הגדול או הקטן. יידרש נפח אילוציה גדול יותר להוצאת החלבון הקטן )בהנחה ששני החלבונים דומים בצורתם ונודדים לפי משקלם המולקולרי בלבד( )17 18( האם ניתן להשתמש בשיטת הדיאליזה להפרדת חלבונים שונים המצויים בתמיסה? תשובה: כן. צריך רק ממברנה שעבירה לחלבונים הקטנים מהחלבון אותו אנו רוצים לנקות. 19( נתונה תערובת 3 פפטידים על מחליף אניונים: Gly-al-Asp Lys-Asp-Gln Asp-Glu-Gln ההפרדה ב-.pH7 מהו סדר יציאתם מן העמודה )מי לא יקשר, ומי יצא בריכוז מלח גבוה או נמוך(. * ראה פתרון במצגת..pH 20( נתונה תמיסה ובה שני חלבונים: מיוגלובין שה- PI שלו הוא 7.0, ציטוכרום C שה- PI שלו הוא כיצד תפריד בין החלבונים ובאיזה תשובה: קולונת מחליף יונים. במקרה זה נוכל לעבוד ב ph=8.5 ולהשתמש או במחליף אניונים או במחליף קטיונים תלוי איזה חלבון יותר חשוב לנו שיקשר לקולונה. ניתן לעבוד ב- ph יותר נמוך ( 6 ומטה ) ואז להשתמש במחליף קטיונים ולהוריד את החלבונים בריכוזי מלח שונים או ההפך להטעין על הקולונה ב- ph גבוה ולהשתמש במחליף אניונים.

7 הטבלה מציגה את המוביליות היחסית של מס' חלבונים באלקטרופורזה ב- SDS : 7 )21 חלבון משקל מולקולרי )דלטון( נ דידה יחסית ,200 myoglobin ,300 trypsin ,000 aldolase ,000 fumarase ,000 carbonic anhydrase המוביליות היחסית של החלבון creatine kinase ב- SDS אלקטרופורזה היא. 0.6 המשקל המולקולרי של החלבון נקבע באולטרה צנטריפוגה אנליטית ונמצא 80,000. מה תוכל להסיק לגבי החלבון. * ראה פיתרון במצגת התרגול שאלה 22 א. הידרוליזה נותנת לנו את הרכב חומצות האמינו ולכן הפוליפפטיד הנ"ל מכיל 9 חומצות אמינו Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Trp+Pro ב. מריאקצית סנגר לא קיבלנו תשובה סופית לגבי החומצה האמינו הראשונה. ח. אמינו ראשונה תהיה Ala או.Lys Ala/Lys ג. קרבוקסיפפטידאז A אינו מוריד את חומצות האמינו Arg,Pro ו-.Lys מכיוון שהוא לא משחרר אף חומצה ניתן להסיק כי החומצה האחרונה בפוליפפטיד היא אחת מהשלושה. ד. ציאנוגן ברומיד מבקע רק אחרי.Met לפי ב' הפפטיד הקצר יותר שמכיל Trp,Pro ו- Ser לא יכול להיות בקצה האמינו טרמינלי של הפוליפפטיד ולכן יהיה בקצה הקרבוקסילי. ולכן Met תהיה החומצה הרביעית מהקצה הקרבוקסילי. ומ-ג' ניתן לומר כי החומצה האחרונה היא.Pro Ala/Lys Met Pro ה. כימוטריפסין מבקע רק אחרי ח. אמינו ארומטיות.

8 8 הפפטיד שמכיל רק Ser ו- Pro חייב להיות בקצה הקרבוקסילי ומכאן ש- Ser היא הח. האמינו שנייה מהסוף. הפפטיד שמכיל Met ו- Trp מלמד אותנו על מיקומה של Trp כשלישית מהקצה הקרבוקסילי. הפפטיד השלישי שהתקבל יכול ללמד אותנו על מיקומה של Phe הארומטית חמישית מהקצה האמינו טרמינלי. Ala/Lys Phe Met Trp Ser Pro ו. טריפסין מבקע רק אחרי Lys ו-.Arg אם Lys היתה החומצה הראשונה בפוליפפטיד, מטריפסין היינו מקבלים רק שני פפטידים, מכיוון שקיבלנו שלושה פפטידים אחרי ביקוע עם טריפסין נוכל להסיק כי Ala היא החומצה הראשונה. מכיוון ש- Ala מתקבלת בפפטיד עם,Arg נסיק כי Arg היא החומצה השניה. על מנת שנקבל את הפפטיד השני Ser צריכה להיות החומצה השלישית ו- Lys הרביעית. Ala Arg Ser Lys Phe Met Trp Ser Pro רצף הפוליפפטיד הוא: שאלה 24 1( רצף הפפטיד המקורי הוא: Pro Ile Arg Glu Gly Phe Ala al Lys Ala Met al Ala 2( על מנת לחשב את מטען הפפטיד ב- ph 6 נתייחס ל- pka ים השונים בפפטיד. NH 3+ Pro Ile Arg Glu Gly Phe Ala al Lys Ala Met al Ala COOH ב- ph 6 מטען הפפטיד הוא 1+.

9 א) ב) 9 26( ציין את כוון הנדידה באלקטרופורזה בלי נוכחות SDS )לכוון הקטודה, אנודה, או סטטי( ב.pH6.5 של הפפטידים הבאים: Lys-Gly-Ala-Gly ) Glu-Gly-Ala-Glu ) לאיזה כוון ינדדו הפפטידים בנוכחות.SDS תשובה: פפטיד א' יינדוד ללא SDS ב- ph=6.5 לכיוון האלקטרודה השלילית )קטודה( פפטיד ב' יינדוד ללא SDS ב- ph=6.5 לכיוון האלקטרודה החיובית )אנודה( בנוכחות SDS ינדדו שני הפפטידים לכיוון האלקטרודה החיובית. שאלה 27 המשקל המולקולרי של החלבון X נמדד במספר שיטות, והתקבל: השיטה ג'ל פילטרציה אולטרה צנטריפוגה אנליטית אלקטופורזה עם מרקפטואתנול ו- SDS המשקל המולקולרי שהתקבל 120,000 Da 44,000 Da 22,000 Da כיצד נוכל להסביר את ההבדלים שהתקבלו בג'ל פילטרציה ובאולטרה צנטריפוגה אנליטית? שניהם נותנים מידע לגבי המשקל המולקולרי של החלבון הנטיבי, אך המידע שמתקבל בג'ל פילטרציה הוא תלוי עקומת כיול הערכת המשקל המולקולרי מג'ל פילטרציה תהיה נכונה עבור חלבונים גלובולריים, עבור חלבונים שאינם גלובולריים תתקבל תוצאה שתסטה מהמשקל המולקולרי האמיתי. )28 הברזל מהווה 0.346% ממשקל המוגלובין הומני. אם נתון שהמשקל המולקולרי של החלבון הוא 64,000 דלטון, אם תניח שברזל אחד נקשר לשרשרת פוליפפטדית אחת, מה תוכל להסיק לגבי מספר השרשראות בהמגלובין הומני. ב( מדען בודד המוגלובין מסרטני ים. מצא כי אחוז הברזל בחלבון הינו כשקבע את המשקל המולקולרי של החלבון באלקטרופורזה בנוכחות -mercaptoethanol ו- SDS מצא כי המשקל המולקולרי של החלבון הוא

10 באולטרה צנטריפוגה אנליטית נקבע שהמשקל המולקולרי של החלבון הוא 32,000 דלטון. הסק לגבי מבנה החלבון. 382,000 דלטון. 10 * ראה פיתרון במצגת התרגול 29. בדיקת החלבון שנוקה: - באלקטרופורזה בנוכחות β-mercaptoethanol ו- SDS התקבלו שני פסים בעלי משקל מולקולרי 20,000Da ו-.40,000Da מאחר שהאלקטרופורזה נעשתה בנוכחות β-mercaptoethanol שמפרק קשרים דיסולפידים ו- SDS שמפרק קשרים חלשים אין באפשרותינו לדעת אם מדובר על חלבון אחד שמורכב מכמה תת- יחידות או בשני חלבונים שונים בעלי אותו.pI - באלקטרופורזה בנוכחות SDS ללא β-mercaptoethanol התקבל פס יחיד. המסקנה שמדובר על חלבון נקי שמורכב מכמה תת יחידות. - באולטרא-צנטריפוגה אנליטית נמצא שהחלבון במשקל.80,000Da לכן ניתן להסיק שהחלבון מורכב מ- 3 תת יחידות:.20,000Da ושתי יחידות 40,000Da 30( באיזה שיטה היית משתמש להפריד תמיסה המכילה מיטוכונדריה, ליזוזומים וחלבון. סירכוז )צטנטריפוגה( בגרדיאנט סוכרוז. פרקצונציה. 31( באיזה שיטות היית מפריד מלח NaCl וחלבון בעל משקל מולקולרי דלטון. ג'ל פילטרציה דיאליזה שאלות: האם אנזים זה מתנהג נמדדו מהירויות יצירת התוצר ( 0( של אנזים מסוים בריכוזי סובסטרט שונים. 32( אם כן )או לא( איזה הסבר יש לתופעה? לפי מיכאליס מנטן? [S] mm 0 mmol/min * נפתר בכיתה נא לעיין במצגת התרגול

11 11 B ומאנוז לתרכובת C. בשתי הריאקציות אנזים אחד מקטלז את הריאקציה שבה נהפך גלוקוז לתרכובת 33( נתונה טבלה של ריכוז הסובסטרט כנגד 0 מה תוכל להסיק לגבי, Km,max וקבוע 2+k>>>> 1-k. הדיסוסיאציה של שתי התרכובות עם האנזים. [S] M 0 mmol/min 0 mmol/min 1 x x x x x אם נתון שבתערובת הריאקציה יש 2 mmol אנזים מה ה turn over number של האנזים. * נפתר בכיתה נא לעיין במצגת התרגול 34( נמצא שהחומר TLCK מעכב את הפעילות של פרוטאזה X. נלקחו דוגמאות שמכילות 14 מ"ג X וטופלו ב- TLCK בריכוזים שונים. כמות הסובסטרט שעוברים ביקוע בדקה נמדדה )טבלה(. הניסיון בוצע בריכוז סובסטרט פי 40 מה- Km של האנזים. *לקרוא בחומר המצורף באתר. מיקרומול TLCK קשור ל- X מיקרומול של סובסטרט שעבר ביקוע בדקה )I( TLCK הנו : א( מעכב תחרותי של X. ב( מעכב לא תחרותי של X. ג( מעכב לא הפיך של X. ד( כל התשובות לא נכונות

12 12 )II( המשקל המולקולרי של השרשרת הפוליפפטידית של X הינו: א( 8235 דלטון. ב( דלטון. ג( דלטון. ד( דלטון. )III ה- Turnover number של X הנו: א( -1 min. 9.5 ב( -1 min ג( -1 min 9500 ד( כל התשובות לא נכונות. * לפתרון המלא נא עיין במצגת התרגול 35( ביוכימאי בודד אנזים פרוטאליטי X. ב- SDS אלקטרופורזה החלבון נותן פס יחיד. נלקחו 0.6 גרם מ- X ונמדדה המהירות ההתחלתית של הריאקציה האנזימתית )בריכוז סובסטרט קבוע( כאשר הוספו כמויות שונות של החומר: )DIPPF( Diisopropylphosphofluoride H F H H C O P O C H דלטון. ענה על 0 (mmol/min) H O H באולטראצנטריפוגה אנליטית נמצא שהמשקל המולקולרי של האנזים הוא השאלות שמופיעות אחרי הטבלה. DIPPF (micromol) bound to enzyme

13 13 I( החומצה האמינית הפעילה באתר הפעיל היא: א( ב( ג( ד( ה( אלאנין. גליצין. סרין. ציסטאין. כל התשובות לא נכונות. )II המשקל המולקולרי של השרשרת הפוליפפטידית של החלבון: א( דלטון. ב( דלטון. ג( דלטון. ד( דלטון. ה( כל התשובות לא נכונות. משקל המולקולרי של שרשרת פוליפפטידית בחלבון הוא: 100,000 Da )III מספר התת יחידות בחלבון הנו: א( ב( ג( ד( ה( תת יחידה אחת. שתי תת יחידות. שלוש תת יחידות. ארבע תת יחידות. כל התשובות לא נכונות. DIPPF הינו: )I מעכב תחרותי של האנזים. א( מעכב לא הפיך של האנזים. ב( מעכב אל תחרותי. ג( מעכב לא תחרותי. ד( ה( כל התשובות לא נכונות.

14 14 36( לא נלמד החומר של צנטריפוגה אנליטית. נבדקה פעילות אנזים כפונקציה של הזמן בשתי טמפרטורות שונות. התוצאות מסוכמות בטבלה: )37 S (mmolar) o min -1 (30 o C) o min -1 (42 o C) 0 ה לא נמדד לא נמדד לא נמדד Km של האנזים ב- 42 o C )במלימולר( הוא: שווה ל- Km ב 30 מעלות. א( 42 מעלות. Km עשוי להיות Km של האנזים ב- ב( ג( 1 ד( אין מספיק נתונים להעריך את ה- אין מספיק תלוי טמפרטורה ולכן יש להיזהר ולא להשליך נתונים מניסויים בטמפ' שונות. o של 42. ο C ישנו נתון אחד בלבד לגבי Km של האנזים ב- נתונים להעריך את ה- האנזים ב- 42. ο C כדי לשרטט גרף 1/o כפונקציה של S/1 שממנו נחשב את Km )נקודת o כך שתהינה שתי -1/Km ) צריך לפחות עוד נתון של החיתוך עם ציר ה- X שווה ל- נקודות. 38( אצטיל טירוזין אתיל אסטר (ATEE) הודגר עם מצוי מכנפי נשר במשך שעה בבופר ב- ph 8.0 ב- 37. בדיקה הוכיחה שכ- 20% מה- ATEE נעלם, והופיע אצטיל טירוזין במקומו. איזה ביקורת נדרשות בכדי להוכיח שהראקציה היתה הידרוליזה מקוטלזת ע"י אנזים. תשובה: נדגיר ATEE באותו הבופר ובאותה טמפ' אך ללא מיצוי כנפי הנשר ונמדוד את אחוז ההיעלמו של ATEE לאחר שעה. במידה ואחוז ההיעלמות יהיה נמוך יותר אז נדע כי במיצוי כנפי הנשר ישנו רכיב המזרז את פירוק.ATEE כעת כל טיפול שנעשה למיצוי שיהרוס את החלבונים שבו יהווה אינדיקציה טובה לכך שהיתה פעילות אנזימטית. למשל: ביצוע הניסוי עם מיצוי כנפי נשרים מורתח ובדיקת קיום הקטליזה, הורדה או העלאה

15 15 דרסטית של ה- ph גם יכולה לפגוע בפעילות אנזימטית ולכן גם היא יכולה להוות אינדיקציה לקיומו של אנזים בקטליזה. 39( בוצעה סידרת ניסויים בריכוזי סובסטרט שונים ונקבע max כיצד תקבע את הפעילות הספציפית של האנזים שנבדק בניסויים אלה? כיצד תקבע את?Turnover number ראה מצגת תרגול Turnover.6x10-6 M ואילו של אנזים שני 5x10-3 M לסובסטרט שלו הוא A של אנזים Km )40 number של A הוא 100 לשניה ואילו של 0.5 B לשניה. לפי נתונים אלו ענה על השאלות הבאות: א( האם הזיקה של אנזים A לסובסטרט שלו גדולה מהזיקה של אנזים B לסובסטרט שלו? לפי איזה ערך תקבע זאת? תשובה: זיקה=אפיניות. מכיוון שאין אנו יודעים האם בריאקציות הנ"ל 1- k>>> k 2 אין אנו יכולים להשתמש ב- Km כמדד לאפיניות. אם נניח שהמצב הוא 1- k>>> k 2 בשתי האנזימים נוכל לאמר שאנזים B יותר אפיני לסובסטרט שלו. ב( לפי המספרים המחזוריים של שני אנזימים אלה, איזה אנזים הוא בעל פעילות גבוהה יותר? תשובה: אנזים A פעיל יותר כי הוא מקטלז יותר מולקולות סובסטרט בדקה. ג( האם האמור בסעיף ב' מנוגד לאמור בסעיף א'? תשובה: אין סתירה בין שני הסעיפים כי ייתכן מצב בו אנזים יהיה אפיני ביותר לסובסטרט ודווקא משום כך הקטליזה תהיה יותר איטית כי האנזים והסובסטרט קשורים חזק. כמו כן אין אנו יודעים מה תפקידם של האנזימים במסגרת התא וכיצד משפיעים עליהם התנאים בתא. נמצא שבתנאים מסוימים נוצרת כמות X של תוצר בחמש הדקות הראשונות של ראקציה אנזימטית. 41( הצע לפחות שלושה הסברים שונים לתופעה זו, כמות התוצר שנוצרה בעשר דקות ראשונות היא רק פי 1.8. הצע דרכים לבחון כל הסבר. תשובה: הסברים אפשריים עברנו את השלב הלינארי של הריאקציה האנזימטית - התוצר מעכב את אנזים - ריכוז הסובסטרט בתמיסה ירד ולכן הסיכוי שמולקולת אנזים תפגוש מולקולת סובסטרט - הינו קטן יותר ולכן קצב הריאקציה קטן.

16 1/i נמצאה אותה פעילות אנזימטית במצוי אוזן ולשון של כבשים, אך הועלתה השאלה האם האנזימים בשני 16 )42 האברים אכן זהים? נערכה סידרת ניסויים כאשר בתנאים זהים הוספו 0.1 מ"ל של המצויים השונים לתערובת ריאקציה בנפח כולל של 1 מ"ל בריכוזים שונים של סובסטרט: ריכוז סובסטרט (mm) מיקרו מולים שעוברים ריאקציה בדקה אחת לשון אוזן אילו תכונות של האנזים ניתנות לקביעה מהנתונים, ובאיזו מידה ניתן להסיק לגבי הזהות, או חוסר הזהות של האנזימים בשני האברים? 51 שאלה מס' Ear Tongue 1 max Km -2 1/[S] כפי שניתן לראות מהגרף ניתן למצוא את max ו- Km של כל אחד מהאנזימים אולם לא ניתן להשוות בניהם מאחר ואין אנו יודעים מה כמות האנזים בכל אחת מהרקמות הנ"ל

17 o 1/o 17 43( נמצאו שני חומרים A ו- B המעכבים את הפעילות של האנזים גלוטמט דהידרוגנז. המהירות ההתחלתית של הראקציה האנזימטית נקבעה כפונקציה של רכוז הגלוטמט,בנוכחות אנזים והקואנזים,NAD ובתנאים שונים: 1. ללא מעכב. 2. בנוכחות 40 mm של המעכב A. 3. בנוכחות 3 mm של המעכב B. התוצאות מובאות להלן. ע"י שימוש באנליזה גרפית קבע: א( ב( ג( ד( האם A ו- B מעכבים תחרותיים או בלתי תחרותיים? מהם ערכי Km ו-.max הקבוע ki עבור B, במידת האפשר. מה ניתן להסיק לגבי צורת האינטראקציה של A ו- B עם האנזים. מעכב A מעכב B ריכוז סובסטרט, ללא מעכב גלוטמט (mm) ללא מעכב מעכב B y = 17.68x מעכב A y = x מעכב B מעכב A 6 4 ללא מעכב y = x [S] /[S]

18 18 תשובות: א. ב. מעכב B תחרותי ואילו מעכב A הינו לא תחרותי לפי משוואות הישר של הגרף: No Inhibitor B Inhibitor inhibitior A Km 2.55mM 8.813mM 2.19mM max ג. השיפוע של הגרף עם מעכב B שווה ל- αkm/max )שקף 29 במצגת הרצאה 8 של יואל הירש( Km ולכן 68 : max 17. max כעת נציב את הערכים של Km ונחלץ את אלפא )יש להציב את ה- Km של ו- הריאקציה ללא המעכב!!!!( 3.744=α. אנו יודעים ש- α=1+[i]/ki )במעכב תחרותי(. נתון לנו בשאלה ריכוזו של המעכב ולכן נוכל לחשב את ערכו של :Ki [ I] 1 Ki 3mM Ki Ki mM ד. מכיוון שמצאנו כי מעכב B תחרותי ומעכב A אינו תחרותי, כאשר בדקנו את השפעתם בנוכחות ריכוזים עולים של גלוטמאט, ניתן להסיק כי מעכב B עובר אינטראקציה עם האנזים באתר קושר הגלוטמאט ואילו המעכב A נקשר לאנזים באתר אחר. ייתכן, כי במידה ובדיקת השפעת המעכבים היתה נעשית בריכוז קבוע של גלוטמאט וריכוזים עולים של הקואנזים +,NAD היה מתקבל כי מעכב B אינו תחרותי ואילו מעכב A הוא התחרותי תוצאה כזו היתה מלמדת אותנו כי מעכב A עובר אינטראקציה עם האנזים באתר קושר הקואנזים +.NAD בריאקציה אנזימטית התקבלו הנתונים הבאים: 45( Substrate (M) elocity (nmolxlit -1 xmin -1 ) 6.25 x x x x x

19 הערך max ו-?Km 19 א( ב( מהו כאשר S [S} =2.5 x 10-5 [S] = 5.0 x 10-5 ג( מהו ב- [S] = 5.0 x 10-5 כאשר ריכוז האנזים מוכפל? -1.00E E E y = x + 1E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E-02 max=1*10-7 mol*lit -1 *min -1 [S] =2.5 x 10-5 o = 4.28*10-8 [S] = 5.0 x 10-5 o =5.995*10-8 תשובות: א. ניתן להוציא את max ו- Km מהגרף הלינארי - Km=3.3399*10-5 M ב. נציב בנוסחת מיכאליס-מנטן ונקבל: ג. מכיוון שהמהירות היא לינארית ביחס לכמות האנזים ) total (Kcat=max/E לכן המהירות תגדל פי שתיים כאשר נוסיף כמות כפולה של אנזים.

20 מהי הפעילות היחסית ודרגת העיכוב הנגרמת על-ידי מעכב תחרותי כאשר 20 )46 0 I K max m K m S S S S max [S] = Km [I] = Ki K m 1 K S I max I S תשובה: 55 שאלה מס' a ( relative activity ) S S S 1 1 S K I 2 3 m S 2 S 3 S I max 1 K max K m I S S S I K I S Km K m Km 1 K S I I S נתון: i ( a inhibition level ) ( במיקרואורגניזם מצוי אנזים העושה הידרוליזה לגלוקוז - 6 פוספט.(G-6-P) קביעת קצב יצירת גלוקוז. נמצאו הפרמטרים הבאים המדידה נעשית על ידי Km= 6.7 x 10-4 M; max =300 nmol.lit -1.min -1 G-6-P 1x10-5 M GAL-6- sulfate הוא מעכב תחרותי של האנזים. GAL-6- sulfate בריכוזי עבור מהו ו- glucose P K m max I S nmol litermin I Gal 6 S K I K m M.GAL-6-S M 1 K 9 M min M S I max I M S Ki glucose 9 M min P i nmol litermin M min 110 M 1 K I.1.5 nmol.lit -1.min -1 M 9 M min 5 M M 2 x 10-5 M המהירות הייתה תשובה: 56 שאלה מס'

21 21 שאלה 48 S max mol / min. A mol / min* mg mg 0.5 1*10 mg א. TN n max m max M w 0.5*10 6 1*10 gr mol / min gr mol min ב. שאלה 49 שימו לב שהפעילות נמדדה עבור דוגמא של 10l מהנפח הכללי. 3 totaleuafter 0.65 *10 yeild *100 totaleubefor 0.14 *5*10 % 3 *100 90% א. EU *10 S.A. after mg Deg. of Purification S.A. EU befor 0.14*5*10 mg 1600 ב. 3 פרק ד שאלות: 50( חלבון טרנסממברנלי חוצה את הממברנה 8 פעמים. המשקל המולקולרי של החלבון הנו 25,960 דלתון. איזה אחוז מהחומצות האמיניות של החלבון נמצא בתוך הממברנה. הנח: עובי ממברנה 3. nm הנח כי משקל מולקולרי ממוצע של חומצה אמינית 110 דלתון. )רמז בחלבון קיים רק מבנה של (-helix. א( 30% ב( 50.5% ג( 67.8% ד( 87.6% ה( 45%. מספר החמצות האמיניות בחלבון זה= 236 מספר החומצות האמיניות במממברנה =160 מחלקים את המספר השני בראשון ומתקבל )ג(.

22 כ) 22 51( הרצפטור של ההורמון אפינפרין )64000( הוא חלבון שחוצה את הממברנה 7 פעמים. האם חלבון באורך שלו יכול לחצות את הממברנה 7 פעמים? איזה הנחה צריך להניח למקרה זה? )הנח משקל מולקולרי ממוצע של חומצה אמינית 110(. - a.a 20 לכל חצייה בחלבון זה 581 ח.אמינו, 64000Da/110Da / a.a= ~581a.a אם נניח מבנה אלפא הליקס, לחציית ממברנה 7 פעמים צריך יותר מ- 140 a.a של הממברנה(. חלבון זה ארוך יותר ולכן יוכל לחצות את הממברנה 7 פעמים. )53 איזה מהפפטידים הבאים הוא המתאים ביותר להיות טרנס ממברנלי: לפתור ללא עריכת חישובים 52( הפפטיד הבא הוא סגמנט טרנס ממברנלי מחלבון ממברנה אינטגרלי. איך תסביר את האורך הרב של הפפטיד יחסית לדרישה של חצית הממברנה? בסגמנט הזה יש 4 חומצות אמינית טעונות איך תסביר ממצא זה? Al-Gln-Leu-Ala-His-His-Phe-Ser-Glu-Pro-Glu-Ile-Thr-Leu-Ile-Ile-Phe-Gly-al-Met- Ala-Gly-al-Ile-Gly-Thr-Ile-Leu-Leu-Ile-Ser-Tyr-Gly-Ile ראה את הספר POB עמוד 374 דוגמא שנלמדה בכיתה. א( Trp-Ile-Trp-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Ala-Leu-Met-Gly-Leu-Gly-Thr-Leu-Tyr-Phe- Leu-al ב( Met-Thr-Leu-Gly-Tyr-Gly-Leu-Leu-Met-Ser-Leu-Tyr-Met-Pro-Gly-Thr-Phe-Ala-Ile-Ala- Phe בפפטיד זה קיימת פרולין אשר שוברת מבנה של אלפא-הליקס. ג( al-thr-leu-ala-gly-al-ile-phe-gly-leu-leu-tyr-thr-phe פפטיד זה קצר מידי.

23 23 )54 האם הפפטיד הבא יכול להיות טרנס ממברנלי: Leu-Gly-Phe-Ser-Ile-Gly-Phe-Ala-Tyr-Gly-Cys-Gly-Leu-Leu-Phe-Ala-Ala-His-Gly-Ala- בצע חישוב לפי סקאלות ההידרופוביות שלDoolittle &. Kyte Thr נחשב את ממוצע ההידרופוביות של ח.אמינו בפפטיד הנ"ל לפי הסקלה של Kyte &Doolittle, לפי הערכים הנתונים בטבלה של ח. האמינו, = 26 26/21a.a=1.238 הפפטיד יכול להיות ממברנלי שכן הערך הממוצע לח.אמינו לפי סקלת ההידרופוביות של Kyte &Doolittle גבוה מ ( בהרבה מקרים נמצאים בכניסה וביציאה של הלקס טרנס ממברנלי מהממברנה החומצות האמיניות Arg ו Lys הסבר תופעה זו. Lys ו- Arg הן חומצות אמינו בעלות מטען חיובי ב- ph פיזיולוגי, לכן יוכלו לעבור אינטראקציה עם הראשים הפולריים הטעונים שלילית של הפוספוליפיד שבונה את הממברנה וע"י כך לייצב את המבנה ואת האינטראקציה עם הממברנה. פרק ה שאלות: 56( רק 3% מפעילות אנסולין שעבר דנטורציה על ידי אוריה ומרקבטואתנול חוזר להיות פעיל לאחר סילוק האוריה ומרקפטו האתנול. ריבונוקליאז )4 קשרי ) S_S חוזר לפעילות כמעט מלאה לאחר טיפול דומה. הסבר את ההבדלים בין שני המקרים. תשובה: במקרה של ריבונוקליאז קשרי ה- S-S נמצאים בתוך המולקולה )אנטראמוליקולריים(- המורכבת משרשרת אחת- לכן התהליך יכול להתרחש ספונטאנית. באינסולין קשרי ה- S-S נמצאים בין שתי שרשראות שונות קשה לשתי השרשראות למצוא אחת את השנייה באוריינטציה הנכונה במבחנה- לכן קיפול ספונטאני איננו אפשרי.

24 24 )57 חלבון X המורכב מארבע תת יחידות עבר דנטורציה עם 6 M אוריה. לאחר מיהול מהיר של של תמיסת החלבון בתוך בופר ללא אוריה נעשה מעקב אחר הופעת הדימר והטטראמר ופעילות האנזים. מה תוכל להסיק לגבי הצורה הפעילה של האנזים? 1/100 Time (min) %Monomer %Dimer Tetramer Activity זמן האפס הוא רגע תחילת המיהול א( הצורה הפעילה של החלבון הינה רק הדימר. ב( הצורה הפעילה של החלבון הינה רק הטטראמר. ג( הדימר פעיל אבל גם הטטראמר פעיל. ד( הדימר פעיל אבל גם הטרימר פעיל. פעילות מקסימלית מתקבלת כאשר הדימר מגיע למקסימום אבל הוא ממשיכה גם כשיש טטראמר. 58( כאשר החלבון X מהשאלה הקודמת )לאחר הטיפול באוריה( נמהל לתוך תמיסה המכילה את הצ'פרון GroEL בלבד לא נתגלתה כל פעילות של החלבון X גם לאחר 80 דקות. ההסבר לתופעה הזו: א( GroEL גרם לפירוקו של החלבון. X. ב( GroEL קשר את X והעבירו ל LON שפרק אותו. ג( GroEL האט את קצב ריאקצית הקיפול. ד( GroEL קשר את החלבון X אבל לא שיחרר אותו.

25 חלבוני heat shock כדוגמת GroEL 25 )59 א( ב( ג( ד( חשובים לתא החיידק רק במצב של עקת חום. לא חשובים לתפקוד החיידק וקיימים בתא רק לקפל חלבוני בקטריופאג' חשובים לחיידק בכל תנאי. כל התשובות לא נכונות. איזה משפט מתאר את המצב בו מתקיף בקטריופאג חיידק שמייצר GroEL פגום: 60( הבקטריופאג לא מצליח לחדור לתוך החיידק. א( ב( הדנ"א של הבקטריופאג לא מיוצר בתוך החיידק. חלבוני הבקטריופאג מיוצרים בתוך החיידק אבל לא בונים את מעטפת הבקטריופאג. ג( חלבוני הבקטריופאג לא מיוצרים בתוך החיידק. ד(