بررسی تاثیر عصاره هیدروالکلی گل قاصدك بر روي روند تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی

Transcript

1 مقاله پژوهشی مجله سلول و بافت (علمی - پژوهشی) جلد 5 شماره 4 زمستان بررسی تاثیر عصاره هیدروالکلی گل قاصدك بر روي روند تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی علیرضا عبدانی پور Ph.D. * سیده مهسا خاتمی M.Sc. محسن سقا Ph.D. فرشید سلیمی ننه کران Ph.D. 1 1 داوود نقی زاده M.Sc. رضا بنابی M.Sc. 1- دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل دانشکده پزشکی آزمایشگاه سلولهاي بنیادي اردبیل ایران 2- دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان اردبیل ایران 3- دانشگاه علوم پزشکی اردبیل دانشکده پزشکی گروه علوم تشریحی و پاتولوژي آزمایشگاه تحقیقاتی جنین شناسی و سلولهاي بنیادي * پست الکترونیک نویسنده مسي ول: abdani.anatomy@yahoo.com تاریخ دریافت: 1392/8/28 تاریخ پذیرش: 1393/10/24 چکیده هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر عصاره هیدروالکلی گل قاصدك vulgare) (Cirsium بر روي تکثیر و رشد سلولهاي بنیادي عصبی موش صحرایی در شرایط آزمایشگاهی vitro) (In میباشد. مواد و روشها: سلولهاي بنیادي عصبی از هیپوکمپ مغز نوزاد موش صحرایی استخراج شد. بهمنظور تعیین بهترین غلظت سلولها بهمدت 48 ساعت با غلظتهاي و 1000 میکروگرم بهازاي هر میلیلیتر محیط کشت تیمار شدند و میزان تکثیر سلولی با روش MTT بررسی گردید. همچنین میزان بیان ژن Sox2 در سلولهاي بنیادي عصبی تیمار شده با روش Real-time PCR بررسی گردید. نتایج: نتایج بهدست آمده در این مطالعه نشان داد که در حضور عصاره گل قاصدك تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی و بیان ژن Sox2 بهطور معنیداري نسبت به گروه کنترل افزایش یافت. نتیجه گیري: با توجه به تاثیر عصاره گل قاصدك بر روي روند تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی استفاده از این عصاره گیاهی میتواند جهت مقاصد کلینیکی بهمنظور درمان برخی از بیماريهاي سیستم عصبی از جمله ایسکمی مغزي و ضایعات نخاعی مفید باشد. واژگان کلیدي: تکثیر سلولی گل قاصدك سلولهاي بنیادي عصبی 385

2 بررسی تاثیر عصاره هیدروالکلی گل قاصدك بر روي روند... مقدمه بیشترین مکان حضور سلولهاي بنیادي عصبی در نواحی ساب ونتریکولار میباشد (1). سلولهاي بنیادي عصبی توانایی تبدیل به اکثر سلولهاي تخصص یافته مغزي را دارا می باشند و در بیماريهاي سیستم عصبی این سلولها قادرند به نقاط آسیب دیده مهاجرت کرده و در ترمیم شرکت کنند (2). این سلولها بعد از تولد با حفظ توانایی خود تجدیدي میتوانند در عملکردهایی مانند یادگیري حافظه و پاسخ به آسیب تاثیرگذار باشد (3). استفاده از ظرفیت طبیعی بدن براي بازسازي و ترمیم یکی از اصول مهمی است که دانش سلولهاي بنیادي براي درمان بیماريها دنبال مینماید (4). سلولهاي عصبی بعد از تولد مراحل پایانی تمایز خود را طی میکنند و توانایی خود تجدیدي را ندارند. بنابراین حضور سلولهایی که نورونزایی میکنند در درمان ضایعات سیستم عصبی داراي اهمیت ویژهاي خواهد بود (5). یکی از مهمترین مساي ل در سلول درمانی استفاده از یک محرك مناسب براي افزایش سرعت تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی در شرایط In vitro میباشد. ژن Sox2 بهمیزان زیادي در نورواپیتلیوم سیستم عصبی در حال تکوین بیان میشود. بر اساس مطالعات انجام شده این ژن در حفظ و تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی نقش بسیار مهمی ایفا مینماید (6). گیاه سیرسیوم ولگار Cirsium vulgare که در زبان فارسی به قاصدك و در زبان انگلیسی به Spear Thistle شناخته میشود در مناطق مختلفی از اروپا غرب آسیا و شمال غرب آفریقا یافت میگردد. تمام بخشهاي این گیاه بهویژه ریشه آن بهعنوان دارو مورد استفاده قرار میگیرد. این گیاه بهعنوان ضد تهوع ضد رماتیسم ضد درد ضد التهاب و آنتی اکسیدانت مورد استفاده قرار میگیرد (7 و 8). بیشتر بررسیهاي انجام شده در رابطه با گیاهان متعلق به رده Cirsium مربوط به گیاه Cirsium japonicum میباشد. مطالعات انجام شده روي این گیاه نشاندهنده وجود فعالیت آنتیاکسیدانتی ضدسرطانی (9) و ضد دیابتی (10) در این گیاه میباشد. تاکنون هیچگونه مطالعهاي درباره اثر گیاه قاصدك بر روي سلولهاي بنیادي عصبی صورت نگرفته است. در این مطالعه براي اولین بار تاثیر عصاره هیدروالکلی گل این گیاه بر روي تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی و بیان ژن Sox2 مورد بررسی قرار گرفته است. مواد و روشها تهیه عصاره هیدروالکلی گل گیاه گل قاصدك: عصاره Cirsium vulgare بهروش سوکسله تهیه و اثر غلظته يا مختلف آن بر روي رشد و تکثیر سلولی بنیادي عصبی( NSCs ) مورد بررسی قرار گرفت. براي این منظور گیاه مورد نظر از اطراف شهر اردبیل درخرداد ماه خشک جمع آوري و در سایه و جریان هوا و توسط آسیاب پودر شدند. از پودر تهیه شده براي عصاره گیري بهروش سوکسله استفاده شد. بدینصورت که 100 گرم از پودر آماده در کارتوشهایی که از کاغذ صافی معمولی با اندازه مناسب تهیه شده بود ریخته شد. سپس کارتوشها را درون دستگاه سوکسله قرار داده و تقریبا بهمیزان 300 میلیلیتر مخلوط متانول و آب مقطر بهعنوان حلال به آن اضافه گردید. عصاره گیري بهمدت 12 ساعت ادامه یافت. عصاره بهدست آمده به ظرفهاي شیشهاي منتقل شده و بهمدت 24 ساعت بدون درپوش در آون 50 درجه نگهداري شد تا حلال باقی مانده تا حد امکان تبخیر شود.سپس عصاره تهیه شده براي آزمایشهاي بعدي در یخچال نگهداري شد. جداسازي سلولهاي بنیادي عصبی: براي جداسازي سلولهاي بنیادي عصبی از نوزاد موش صحرایی نژاد Sprague استفاده گردید. مراقبت و نگهداري از موشها مطابق با آیین نامه مصوب کار با حیوانات آزمایشگاهی تصویب شده در دانشگاه تربیت مدرس تهران انجام گردید. بعد از بیهوشی کامل بخش هیپوکامپ از دو نیمکره مغز جدا شده و پس از له کردن مکانیکی بهمیزان دو برابر بافت از آنزیمهاي Accutase و کلاژناز براي مدت 30 دقیقه در دماي 37 درجه سانتیگراد بهمنظور هضم آنزیمی استفاده گردید. در مرحله بعدي بهمنظور خنثی کردن آنزیمها از سرم (Fetal bovine serum) FBS استفاده شد. سپس سوسپانسیون حاصله از فیلتر مش نایلونی 70 میکرومتري ( (Falcon عبور داده شد و بهمدت 10 دقیقه در 3000 دور سانتریفوژ گردید. رسوب سلولی بهدست آمده با محیط کشت DMEM/F12 حاوي فاکتورهاي رشد Epidermal BFGF human recombinant(millipore) B-27 supplement (GIBCO) GrowthFactor(sigma) پنی سیلین-استرپتومایسین (سیگما) یک درصد بههمراه 3 درصد سرم FBS در انکوباتور با دماي 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO 2 کشت داده شد. محیط کشت سلولها پس از 24 ساعت تعویض شد و سلولهاي بنیادي عصبی که به کف فلاسک 386

3 بررسی تاثیر عصاره هیدروالکلی گل قاصدك بر روي روند... چسبیده بودند پس از رسیدن به تراکم 70 تا 80 درصد با استفاده از تریپسین از کف فلاسک جدا و با نسبت 1 به 2 پاساژ داده شدند. در این مطالعه از سلولهاي پاساژ سوم استفاده گردید. جهت تایید هویت سلولهاي بنیادي عصبی از آنتیبادي نستین و روش ایمونوسیتوشیمی استفاده شد. به این ترتیب که سلولها توسط پارافرمالدهید 4 درصد در دماي اتاق و براي نیمساعت فیکس شدند و پس از فیکساسیون و شستشو توسط triton- با (Phosphate buffered saline) PBS 0/3100X/PBS درصد نفوذ پذیر شدند و سپس براي مدت یک ساعت با 10 سرم ضد بز در PBS انکوبه میگردند. پس از شستشو سلولها توسط آنتیبادي اولیه براي مدت 12 ساعت در یخچال با دماي 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از شستشوي کامل توسط PBS با آنتیبادي ثانویه کونژوگه به (Isothiocyanate Fluorescein) FITC انکوبه و پس از 2 ساعت سلولها با PBS شسته شده و توسط میکروسکوپ فلورسانس اینورت مشاهده شدند. هستهها نیز مانند قبل با اتیدیوم بروماید رنگآمیزي شدند. تیمار سلولهاي بنیادي عصبی با عصاره Cirsium :vulgare سلولهاي بنیادي عصبی ایزوله شده از هیپوکمپ نوزاد موش صحرایی در یک گروه کنترل و پنج گروه تیمار شده با عصاره مورد نظر در پلیت هاي 96 خانه با غلظتهاي و 1000 میکروگرم بر میلیلیتر بهمدت 48 ساعت تیمار و مورد مطالعه قرار گرفتند. تیمار سلولها در محیط کشت سلولهاي بنیادي عصبی و فاقد سرم انجام شد. به منظور بررسیهاي آماري دقیق 5 تکرار در نظر گرفته شد. آزمون :MTT براي ارزیابی میزان تکثیر از روش 4,5)-3) Dimethylthiazol-2-Yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) MTT استفاده گردید. پس از 48 ساعت تیمار با عصاره هیدروالکلی گل گیاه قاصدك محیط کشت سلولها با 20 میکرولیتر محلول MTT (سیگما) با غلظت 5 میلیگرم بهازاي هر میلیلیتر که بهصورت تازه تهیه شده بود تعویض شد. بعد از 4 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد محلول روي سلولها به آهستگی حذف شد و کریستالهاي فورمازون ایجاد شده در اثر واکنش با MTT در 100 میکرولیتر DMSO حل شد. پس از چند دقیقه انکوباسیون در دماي اتاق و حل شدن کامل کریستالها جذب در 570 نانومتر توسط دستگاه الایزا (BioTek) محاسبه شد. :Real-time PCR براي بررسی مقایسهاي بیان ژن Sox2 و ژن β-2m بهعنوان کنترل داخلی در گروه کنترل و سلولهاي تیمار شده با 800 میکرو گرم بر میلیلیتر عصاره گل قاصدك از تکنیک Real-time PCR استفاده شد. براي این منظور سلولها در پاساژ سوم براي آزمون انتخاب شدند. در این تکنیک استخراج Pure link RNA کل از سلولها با استفاده از کیت RNA ) Invitrogen mini kit ( و دستورات شرکت سازنده انجام گرفت و با استفاده از آنزیم کپی برداري معکوس به cdna تبدیل شد. در مطالعه حاضر جهت ساخت cdna از پرایمر Revert aid H Minus-First موجود در کیت oligo dt Strand cdna Synthesis, K1632 مربوط به شرکت Fermentas استفاده شده است و مطابق با دستور شرکت سازنده mrna به cdna تبدیل شد. 500 نانوگرم cdna براي تعیین کمیت بیان mrna ژن Sox2 استفاده شد. تمامی پرایمرها در جدول شماره یک طبقه بندي شدهاند. واکنشهاي PCR در حجم 25 میکرولیتر (Sybergreen) و در 40 چرخه توسط دستگاه cycler) (Applied Biosystem انجام گردید آنالیز نسبی در سطح mrna با روش Pfaff1 و با استفاده از فرمول ΔCT)) نمونه هدف) ΔCT) کالیبره کننده)) = ΔΔCT انجام شد. ΔCT عبارت است از CT ژن هدف (یا کالیبراتور) که از CT ژن خانهزاد کسر شده است. این عدد بازگو میکند که تیمار ما موجب افزایش چند برابري ساخت mrna هدف شده است (10). Gene Sox2 Accession no. NM_ جدول 1: توالی پرایمرهاي مورد استفاده در Real-time PCR Sense 5 3 TGCCTCTTTAAGACTAGGGCTG Anti-sense 5 3 CTGGCGGAGAATAGTTGGGG Size (bp) 197 B2M NM_ CCCAACTTCCTCAACTGCTACG TTACATGTCTCGGTCCCAGGTG

4 بررسی تاثیر عصاره هیدروالکلی گل قاصدك بر روي روند... کف پلیت چسبیدهاند در روز دوم و سوم به مرور از حجم کلونی کاسته شد و سلولها کم کم پخش شدند و این در حالی بود که همچنان سلولها قدرت تقسیم داشتند به این ترتیب تا حدودي ظاهر سلولها ویژگیهاي یک سلول شبه عصبی را بهدست آوردند که قدرت تقسیم داشتند. سلولهاي بنیادي عصبی بعد از 7 روز کاملا فلاسک را پر کردند و نمایی کشیده و دوکی شکل با زواي د سیتوپلاسمی به خود گرفتند (شکل A 1 وB ). این سلولها قدرت تکثیر داشتند که براي اثبات عصبی بودن سلولهاي NSCs و تعیین خلوص آنها در پاساژ سوم از آنتیبادي Nestin استفاده گردید. در سلولهایی که پروتي ین مربوطه وجود داشت بهدلیل استفاده از آنتیبادي ثانویه کنژوکه به FITC سیتوپلاسمشان سبز رنگ دیده شد. براي تعیین آنالیز آماري: آنالیز آماري با استفاده از نرم افزار SPSS 15.0 انجام گردید و تمامی دادهها بهصورت Mean ± SEM اراي ه شد. مقایسه آماري بین گروهها با استفاده از Tukey's post hoc test انجام شد و 0/05> P معنیدار در نظر گرفته شد. نتایج نتایج حاصل از کشت سلولهاي بنیادي عصبی سلولها وقتی در محیط مناسب کشت سلول بنیادي عصبی قرار گرفتند زواي د و استطالههایی در سلول ایجاد گردید که گاهی چند برابر جسم سلولی مشاهده شد و با سلولهاي جانبی ارتباط برقرار نمود هستهها کشیدهتر بهنظر میرسید و سلولها دوکیتر شده و در حالیکه مرز بین سلولها منظمتر و مشخصتر دیده شد. در روز اول ابتدا این سلولها بهصورت کلونی بودند که به درصد سلولهاي مثبت هسته سلولها توسط اتیدیوم بروماید قرمز رنگ شدند (شکل C 1 و D). میانگین درصد سلولهاي مثبت براي پروتي ین نستین ±0 46/ 95/12 ارزیابی شد. شکل 1: سلولهاي بنیادي عصبی. ( A سلولهاي بنیادي عصبی را پس از یک روز نشان میدهد که بهصورت کلونیهاي چسبیده به کف پلیت دیده میشود. ( B سلولهاي بنیادي عصبی را پس از یک هفته روز نشان میدهد. این سلولها کف فلاسک را پر کرده و حالت کشیده و دوکی شکل میباشند. C و D) ایمونوسیتوشیمی از سلولهاي بنیادي عصبی بهترتیب فاز کنتراست و فلورسنت. رنگ سبز نشاندهنده آنتیبادي نستین و رنگ قرمز اتیدیوم بروماید میباشد. بزرگنمایی

5 بررسی تاثیر عصاره هیدروالکلی گل قاصدك بر روي روند... نتایج MTT مورفولوژي سلولهاي بنیادي عصبی پس از تیمار با عصاره گیاهی تغییري نداشت. نتایج تست MTT نشاندهنده افزایش تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی در گروه تیمار شده نسبت به گروه کنترل بود (شکل 2). سلولهاي تیمار شده با غلظت 800 میکروگرم (0/37±0/01) بالاترین میانگین رشد را نشان داد که نسبت به گروه کنترل (0/24±0/07) اختلاف معنیداري را نشان میدهد (0/05> P). نتایج بهدست آمده نشان میدهد که افزایش سرعت تکثیر در سلولهاي بنیادي عصبی به غلظت عصاره موجود در محیط کشت دارد. غلظتهاي بالاي 800 میکروگرم براي سلولها توکسیک محسوب میشوند و کاهش تعداد سلول بهدلیل مرگ سلولها میباشد. شکل :A) 2 نمودار مقایسه آماري سلولهاي بنیادي عصبی در غلطتهاي مختلف با روش A) :MTT نمودار نشاندهنده وجود اختلاف معنیدار میان گروه کنترل و سلولهاي بنیادي عصبی تیمار شده با غلطت 800 میکروگرم بر میلیلیتر میباشد. بعد از تیمار با غلظت 800 میکروگرم بر میلیلیتر عصاره گل قاصدك. خطاي معیار( SEM ) <0/05).(P بزرگنمایی.200 وC B) میکروگرافهاي سلولهاي بنیادي عصبی قبل و نشاندهنده وجود اختلاف معنیدار با گروه کنترل نتایج حاصل از Real time PCR بیان کمی mrna ژن مربوط به رشد و تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی که با غلظت 800 میکروگرم در میلیلیتر و زمان 48 ساعت تیمار شده بودند با روش RT- Quantitative real-time PCR بررسی شد. الگوي بیان کمی ژن Sox2 در شکل 3 نشان داده شده است. در این مطالعه با استفاده از روش آستانه نسبی (مقایسه نسبی) مقدار دادههاي توسط ژن B2M نرمالایز شد و با استفاده از فرمول 2 ΔΔCT (طبق مقاله Pfaffle و همکارانش) افزایش ساخت mrna محاسبه شد. نتایج نشان داد که میزان کمی mrna مربوط به این ژن در سلولهاي تیمار شده با عصاره گل قاصدك (0/73±0/07) نسبت به نمونه کنترل یا تیمار نشده (0/43±0/03) افزایش داشت (شکل 3 ). 389

6 و 3 بررسی تاثیر عصاره هیدروالکلی گل قاصدك بر روي روند... شکل 3: نمودار مقایسه نسبی بیان ژن Sox2 نرمالایز شده با ژن B2M در سلولهاي بنیادي عصبی با بهترین غلظت عصاره گل قاصدك (800 میکروگرم در میلیلیتر) براي مدت 48 ساعت. بحث نتایج حاصل از این مطالعه نشاندهنده تاثیر افزایش دهنده عصاره هیدروالکلی گل قاصدك در روند تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی میباشد. همچنین افزایش بیان ژن Sox2 در سلولهاي بنیادي عصبی تاییدي بر نتایج MTT میباشد. استراتژي سلول درمانی در بیماريهاي مخرب سیستم عصبی توسط لیندوال و همکارانش (11) مطرح شد. هم اکنون سلولهاي بنیادي (سوماتیک) بهعنوان منبع قابل دسترس و مناسب براي سلول درمانی محسوب میشوند. این سلولها در بیشتر بافتهاي در بالغین حضور دارند (12). هرمن و همکارانش (2) بهمنظور تایید هویت سلولهاي بنیادي عصبی ایجاد شده نشان دادند که سلولهاي بنیادي عصبی میتوانند نسبت به نشانگر عصبی نستین واکنش مثبت نشان دهند. نتایج بهدست آمده در این مطالعه که بر روي سلولهاي بنیادي عصبی مشتق از هیپوکمپ مغز نوزاد موش صحرایی انجام شد تاییدي بر کار هرمن و همکارانش (2) بود. سلولهاي بنیادي عصبی داراي ظرفیت خود تکثیري و تمایز به سلولهاي عصبی آستروسیت و الیگودندروسیت هستند ( 13 و 14 و 15). در حال حاضر استفاده از عصارههاي گیاهی در درمان بسیاري از بیماري گسترش یافته است. در طب سنتی از عصاره گیاه گل قاصدك بهمنظور ضدتهوع ضد درد و ضدالتهاب استفاده میشود (16). با اینحال در رابطه با اثر این گیاه روي سلولهاي بنیادي هیچگونه مطالعهاي صورت نگرفته است. بیشتر بررسیهاي انجام شده در رابطه با گیاهان متعلق به رده Cirsium مربوط به گیاه Cirsium japonicum میباشد. این گیاه بهعنوان داروي ضد دیابت (17) ضد اضطراب (18) آنتی اکسیدانت و ضدسرطان (19) معرفی شده است. همچنین گزارش شده است که استفاده از عصاره این گیاه جذب گلوکز را در سلولهاي بدن افزایش میدهد (20). مطالعهاي دیگر نشان دهنده تاثیر عصاره متانولی گیاه بر روي مهار رشد و القا آپوپتوزیس در سلولهاي سرطانی پستان میباشد (21). همچنین مطالعات نشان میدهد که عصاره متانولی این گیاه تاثیر قابل توجهی بر روي چرخه دو رده سلولی K562 و سلوله يا Jurkat ندارد (22). با توجه به بررسیهاي انجام شده این تحقیق اولین مطالعه بر روي تاثیر عصاره گل قاصدك در تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی میباشد. نتایج بهدست آمده نشان میدهد که تیمار سلولهاي بنیادي عصبی با غلظت 800 میکروگرم بر میلیلیتر باعث افزایش معنیدار در رشد و تکثیر این سلولها میشود. مطالعات انجام شده توسط محققین نشان داده است که عصاره گل قاصدك داراي خاصیت ضدالتهابی میباشد ) 16). بنابراین با توجه به نتایج بهدست آمده از این تحقیق و با در نظر گرفتن خاصیت ضدالتهابی میتوان به تاثیرات مثبت استفاده از این گیاه در درمان بیماريهاي مخرب سیستم عصبی از قبیل آسیبهاي نخاعی بهویژه در فاز اولیه امیدوار بود. 390

7 Extracts from Leaves of Cirsium japonicum. J. Appl. Biol. Chem. 2008; 51(4), Yin J, Heo SI, Wang MH. Antioxidant and antidiabetic activities of extracts from Cirsium japonicum roots. Nutr Res Pract. 2008; 2(4): Lindvall O, Björklund A. Cell replacement therapy: helping the brain to repair itself. NeuroRx. 2004; 1(4): Dazzi F, Ramasamy R, Glennie S, Jones SP, et al. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis. Blood Rev. 2006; 20(3): Li L, Xie T. Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 2005; 21: Bai L, Caplan A, Lennon D, Miller RH. Human mesenchymal stem cells signals regulate neural stem cell fate. Neurochem Res. 2007; 32(2): Cao Q, Benton RL, Whittemore SR. Stem cell repair of central nervous system injury. J Neurosci Res. 2002; 68: Alvarez-Buylla A, Lim DA. For the long run: maintaining germinal niches in the adult brain. Neuron. 2004; 4; 41(5): Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2011; 61(2): Felling RJ, Snyder MJ, Romanko MJ, Rothstein RP, et al. Neural stem/progenitor cells participatient heregenerative response toperinatalhypoxia/ischemia. J. Neurosci. 2006; 26: Daadi MM, Hu S, Klausner J, Li Z, et al. Imaging neural stem cell graft-induced structural repairin stroke. CellTransplant. 2013; 41: Sommer L, Rao M. Neural stem cells and regulation of cell number. Prog.Neurobiol. 2002; 66(1): Kim DY, Kang SH, Ghil SH. Cirsium japonicum extract induces apoptosis and anti-proliferation in the human breast cancer cell line MCF-7. Mol Med Rep. 2010; 3(3): Amirghofran Z, Bahmani M, Azadmehr A, Javidnia K. Anticancer effects of various Iranian native medicinal plants on human tumor cell lines. Neoplasma. 2006; 53(5): Cirsium vulgare نتیجه گیري با توجه به نتایج به دست آمده عصاره گیاه میتواند ماده موثري براي افزایش تکثیر سلولهاي بنیادي عصبی در محیط In vitro باشد. تشکر و قدردانی این تحقیق در آزمایشگاه سلولهاي بنیادي دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل انجام شده است. لذا لازم میدانیم از حمایتهاي بیدریغ جناب آقاي دکتر سید سعید هاشمین (معاون پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل) نهایت تقدیر و سپاس را داشته باشیم. منابع 1. Bonilla S, Silva A, Valdes L, Geijo E, et al. Functional neural stem cells derived from adult bone marrow. Neuroscience. 2005; 133(1): Hermann A, Gastl R, Liebau S, Popa MO, et al. Efficient generation of neural stem cell-like cells from adult human bone marrow stromal cells. J Cell Sci. 2004; 117(19): Tamm C, Duckworth J, Hermanson O, Ceccatelli S. High susceptibility of neural stem cells to methylmercury toxicity: effects on cell survival and neuronal differentiation. J Neurochem. 2006; 97: Serakinci N, Keith WN. Therapeutic potential of adult stem cells. Eur J Cancer. 2006; 42(9): Gregg CT, Shingo T, Weiss S. Neural stem cells of the mammalian forebrain. Symp Soc Exp Biol. 2001; (53): Episkopou V. SOX2 functions in adult neural stem cells. Trends Neurosci. 2005; 28(5): Nazaruk J. Antioxidant activity and total phenolic content in Cirsium five species from northeast region of Poland. Fitoterapia. 2008; 79(3): Nazaruk J, Czechowska SK, Markiewicz R, Borawska MH. Polyphenolic compounds and in vitro anti-microbial and antioxidant activity of aqueous extracts from leaves of some Cirsium species. Nat Prod Res. 2008; 22(18): Yu Yin, Seong-Il H, Myeong-HW. Antioxidant and Anticancer Activities of Methanol and Water 391

8 Journal of Cell & Tissue (JCT) Winter 2015; 5(4): Original Article Investigating the effect of Cirsium vulgare hydroethanolic extract on neural stem cells proliferation Abdanipour AR, Ph.D. 1 *, Khatami SM, M.Sc. 2, Sagha M, Ph.D. 3, Salimi Nanehkaran F, Ph.D. 1, Naghizadeh D, MSc. 1, Bonabi R, MSc Department of Medical Science, Stem Cells Research Laboratory, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, Iran. 2. Young Researchers and Elite Club, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, Iran 3. Department. of Medical Science, Stem Cells and Embryology Research Laboratory, Anatomical Group, Ardabil University, Ardabil, Iran. * corresponding author: abdani.anatomy@yahoo.com Received: 19 Nov Accepted: 14 Jan Abstract Aim: In vitro investigation of hydroethanolic extraction of Cirsium vulgare on growth rates of neonate rat neural stem cells. Material and Methods: Neural stem cells were isolated from hippocampus of neonatal rat brain. To determine optimal concentration of Cirsium vulgare extraction, isolated neural stem cells were treated with 200, 400, 600, 800 and 1000 µg/ml for 48 h and then cells proliferation rate were evaluated by MTT assay. In addition Sox2 mrna expression in neural stem cells was evaluated using quantitative real-time PCR. Results: The results of this study showed that the Cirsium vulgare extract caused significant increase in cell proliferative activity and Sox2 mrna expression when compared with the control group. Conclusion: with respect to the effect of Cirsium vulgare extract on the proliferation rate of neural stem cells, the use of hydroethanolic extraction of Cirsium vulgare can be used for clinical purposes to treat some of the neurodegenerative disorders such as ischemic stroke and spinal cord injury. Key words: Cell proliferation, Cirsium vulgare, Neural stem cells 350 Journal of Cell & Tissue, Winter 2015, 5(4)