1 Απο την πρωτεΐνη στο πρωτεινωµα στις µοριακες µηχανες. Τασος Οικονόµου

Transcript

1 1 Απο την πρωτεΐνη στο πρωτεινωµα στις µοριακες µηχανες Τασος Οικονόµου

2 Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο πρωτεινωµικό διαδίκτυο 4. Πως µελετάµε πρωτεινες? 5. Πως µελετάµε διαπρωτεινικές επαφές?

3 Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο πρωτεινωµικό διαδίκτυο 4. Πως µελετάµε πρωτεινες? 5. Πως µελετάµε διαπρωτεινικές επαφές?

4 H xηµεία της ζωής είναι χηµεία πολυµερών

5 4 γευσεις βιολογικων µακροµοριων ΑΤΑΞΙΑ ΑΤΟΜΑ Ν, Ο, C, S, P, H... (ΜΙΚΡΟ)ΜΟΡΙΑ Σάκχαρα Λιπαρά οξέα Νουκλεοτίδια Αµινοξέα ΜΑΚΡΟΜΟΡΙΑ Πολυσακχαρίτες Λιπίδια DNA, RNA Πρωτεΐνες ΜΑΚΡΟΜΟΡΙΑΚΑ ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΤΑΞΗ (οργάνωση δοµών) µη πληροφοριακά πληροφοριακά

6 Τι δουλειές εκτελούν οι ΠPΩTEINEΣ? 1. Kατάλυση κυτταρικής χηµείας 2. Pύθµιση κυτταρικής χηµείας 3. οµικά στοιχεία κύτταρου

7 οµη αµινοξεων

8 οµή αµινοξέων-οι 22 οµαδες R +σεληνοκυστεινη +πυρολυσινη

9 Πεπτιδικος δεσµος

10 οµή πρωτεινών (πρωτοταγης) NH2-Ala-Leu-Arg-Phe-Gly-Asp-Asp- Glu-Arg-Met etc cooh Πεπτιδικος δεσµος

11 οµή πρωτεινών (δευτεροταγης) α-ελικα/α-ελικα

12 οµή πρωτεινών (δευτεροταγης) β-πτυχωτο φυλλο/β-sheet

13 οµή πρωτεινών (τριτοταγης)

14 οµή πρωτεινών (τεταρτοταγης)

15 Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο πρωτεινωµικό διαδίκτυο 4. Πως µελετάµε πρωτεινες? 5. Πως µελετάµε διαπρωτεινικές επαφές?

16 Tι είναι το κύτταρο? Γιαννης Χηµικοπουλος Xµµµµ. ένα σακκουλάκι µε οργανικά χηµικά

17 Tι είναι το κύτταρο? Γιαννης Χηµικοπουλος Xµµµµ. ένα σακκουλάκι µε οργανικά χηµικά Μαρια Εντροπιδου Xµµµµ. µία εντροπική µηχανή ενέργεια ζωή θερµότητα

18 ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΥΛΟΣ Xηµεία - H 2 O - 4 πολυµερή Tι είναι το κύτταρο? DNA RNA Πολυπεπτίδια Πολυσακχαρίτες Σύνθετα Λιπίδια Πόσα? (% dry weight) µονοµερή - διάφορα (στοιχεία, προσθετικές οµάδες κλπ) } 4

19 ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΥΛΟΣ Tι είναι το κύτταρο? Kαθορ ισµένη χηµ ικά οντότητα µε ποσοτικά ορ ισµένο περ ιεχόµενο

20 ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΥΛΟΣ Tι είναι το κύτταρο? Kαθορ ισµένη χηµ ικά οντότητα µε ποσοτικά ορ ισµένο περ ιεχόµενο Mπαµµµ!!!!! H B ιολογ ία µετατρέπετα ι σε πραγµατική σκληρη επιστηµη

21 Πως δουλεύει το κύτταρο? ηµήτρης Γενετικάκης Xµµµµ....είναι γεµάτο γονίδια...τα γονίδια "δίνουν" πρωτείνες

22 Πως δουλεύει το κύτταρο? ηµήτρης Γενετικάκης Xµµµµ....είναι γεµάτο γονίδια Mάκης Bιοχηµικάκης Xµµµµ....είναι γεµάτο πρωτείνες...τα γονίδια "δίνουν" πρωτείνες...οι πρωτείνες καταλύουν χηµικές αντιδράσεις, ρυθµίζουν και δηµιουργούν δοµές

23 Mycoplasma genitalium 482 γονίδια 440 πρωτείνες + 42 δοµικά RNA

24 M. genitalium Γονίδιο 1 mrna 1 Πολυπεπτίδιο 1 Πρωτο+ δευτεροταγής δοµή Τριτοταγής δοµή-aναδίπλωση Τροποποιήσεις Υποκυτταρική στόχευση Tεταρτοταγής δοµή ενέργεια ζωή θερµότητα

25 θερµότητα M. genitalium Γονίδιο 1 mrna 1 Πολυπεπτίδιο 1 Γονίδιο 2 mrna 2 Πολυπεπτίδιο 2 Γονίδιο 3 mrna 3 Πολυπεπτίδιο 3 Πρωτο+ δευτεροταγής δοµή Τριτοταγής δοµή-aναδίπλωση τροποποιήσεις Υποκυτταρική στόχευση Mοριακή Mηχανή ή Πολυµερικό Eνζυµο Tεταρτοταγής δοµή Tεταρτοταγής δοµή ενέργεια ζωή

26 Mycoplasma genitalium 482 γονίδια 440 πρωτείνες + 42 δοµικά RNA <100 µοριακές Mηχανές π.χ. - µαστίγιο ~50 υποµ. - ριβόσωµα ~50 υποµ. - F1ATPase ~8 υποµ. - DNApol ~10 υποµ. - SecTranslocase ~9

27 Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο πρωτεινωµικό διαδίκτυο 4. Πως µελετάµε πρωτεινες? 5. Πως µελετάµε διαπρωτεινικές επαφές?

28 Λίγες πρωτείνες δρουν κατά µόνας π.χ. Υδρολάσες µικρών µορίων

29 Οι περισσότερες πρωτείνες ζούν σε αλληλεπίδραση µε άλλες π.χ. RNA πολυµεράσες, ριβόσωµα, µοριακές µηχανές

30 Tι είναι το κύτταρο? Molecular Crowding mg/ml πολυπεπτιδια

31 Molecular Crowding Tι είναι το κύτταρο? ενα Interactome

32 Η βιολογική πολυπλοκότητα πατά πάνω στην πρωτεινική πολυπλοκότητα

33 - Σε σχεση µε το γονιδιωµα το πρωτεινωµα ειναι πολυ πιο δυναµικο - Πρωτεινικη πολυπλοκοτητα>>γονιδιακη πολυπλοκοτητα

34 Τι ειναι το κύτταρο?..ένα εργοστάσ ιο δυναµ ικών µορ ιακών µηχανών που αλληλεπ ιδρούν Για να το κατανοήσω πρέπει να αποκτήσω πλήρη γνώση: 1. των ξεχωριστών ~100 µοριακών µηχανών (...το µονοπάτι της φώτισης..) 2. των επιδράσεων µεταξύ των µοριακών µηχανών 3. της κινητικής της δράσης των µοριακών µηχανών.

35 Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο πρωτεινωµικό διαδίκτυο 4. Πως µελετάµε πρωτεινες? 5. Πως µελετάµε διαπρωτεινικές επαφές?

36 Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces...

37 Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια

38 Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση

39 Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση 3. ιαπρωτεινικές επαφές

40 Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση 3. ιαπρωτεινικές επαφές 4. Κρίσιµα αµινοξέα

41 Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση 3. ιαπρωτεινικές επαφές 4. Κρίσιµα αµινοξέα 5. ευτερογενείς µετατροπές

42 Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση 3. ιαπρωτεινικές επαφές 4. Κρίσιµα αµινοξέα 5. ευτερογενείς µετατροπές 6. Στερεοδιατακτική δυναµική

43 Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση 3. ιαπρωτεινικές επαφές 4. Κρίσιµα αµινοξέα 5. ευτερογενείς µετατροπές 6. Στερεοδιατακτική δυναµική ZEN

44 Εργαλειοθήκη Πρωτεινικης Αναλυσης

45 Εργαλειοθήκη Πρωτεινικης Αναλυσης 1. Ενζυµολογια 2. Κρυσταλλογραφια 3. NMR 4. Μοριακη γενετικη 5. Βιοφυσικες/Φυσικοχηµικες µεθοδοι

46 Bιοφυσικές Mέθοδοι Xαρακτηρισµού µακροµορίων

47 Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο πρωτεινωµικό διαδίκτυο 4. Πως µελετάµε πρωτεινες? 5. Πως µελετάµε διαπρωτεινικές επαφές?

48 Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες οµαδόν...4 easy pieces Ποιος δεσµεύεται µε ποιόν 2. Που δεσµεύεται ο κάθε εταίρος 3. Βιοφυσική της δέσµευσης 4. Λειτουργικές επιπτώσεις ZEN

49 Εργαλειοθήκη ιαπρωτεινικων Επιδρασεων

50 Ποιός δεσµεύεται µε ποιόν 2 εταίροι Γενετική 1. Yeast 2-hybrid 2. Genetics (extragenic suppressors, multi-copy suppresion, synthetic phenotype) 3. Phage display Βιοχηµεία 1. Co-purification/Co-fractionation/Co-sedimentation/Co-purification 2. Far-western 3. Size-exclusion chromatography 4. Native PAGE 5. Rate zonal centrifugation 6. Chemical cross-linking 7. Protease footprinting 8. Peptide scans 9. Enzymatic assays

51 Yeast 2-hybrid

52 Genetic suppression

53 Dominance

54 Phage Display

55 Ποιός δεσµεύεται µε ποιόν 2 εταίροι Βιοχηµεία 1. Co-purification/Co-fractionation/Co-sedimentation/ Co-purification 2. Far-western 3. Size-exclusion chromatography 4. Native PAGE 5. Rate zonal centrifugation 6. Chemical cross-linking 7. Protease footprinting 8. Peptide scans 9. Enzymatic assays

56 Affinity Chromatography

57 Chemical cross-linking

58 Ποιός δεσµεύεται µε ποιόν 2 εταίροι Βιοφυσική 1. Κρυσταλλογραφία 2. NMR 3. Aναλυτική Υπερφυγοκέντριση- Sedimentation Equilibrium 4. Light Scattering 5. Surface Plasmon Resonance and other biosensors 6. Fluorescence (e.g. FRET) 7. Circular dichroism 8. Isothermal Titration Calorimetry 9. Mass spectrometry

59 Isothermal Titration Calorimetry -Affinity -Stoichiometry -Thermodynamics

60 Μελετη του Interactome

61 Ποιός δεσµεύεται µε ποιόν n εταίροι 1. Yeast 2-hybrid 2. Protein microarrays 3. Multidimensional chromatography 4. Protein tagging+ms

62 Πολυπεπτιδικος διαχωρισµος πολλαπλων διαστασεων

63 ισδιαστατη αποµονωση πολυπεπτιδιων

64 Πολύτιµες πληροφορίες από πρωτεινωµατικη αναλυση - Σχετικές συγκεντρώσεις πολυπεπτιδιων στο κύτταρο - Kινητική έκφρασης - ιαπρωτεινικές επαφές (ταυτόχρονες και εν παραλλήλω) - Mετα-µεταφραστικές τροποιήσεις