Kυτταρική$Bιολογία$ ΔIAΛEΞΗ(6! (21!&!23/3/2012)! ΣΥΝΘΕΣΗ,(ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗ,( ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ(&(ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ( ΤΩΝ(ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ(

Transcript

1 Kυτταρική$Bιολογία$ ΔIAΛEΞΗ(6! (21!&!23/3/2012)! ΣΥΝΘΕΣΗ,(ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗ,( ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ(&(ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ( ΤΩΝ(ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ(

2 ( Τα(κύρια(σημεία(της(σημερινής( διάλεξης(είναι(τα(παρακάτω:( Aποκωδικοποίηση(του(mRNA,(γενετικός(κώδικας,(( κωδικόνιαlαντικωδικόνια(&(το(μεταφορικό(rna (( (( ΡιβοσωμάτιοLο(χώρος(αποκωδικοποίησης.(( Ριβοσωμικά(RNA(&(βιοσύνθεση(ριβοσωματίων. (( Η(Διαδικασία(και(η(Ρύθμιση(της(Μετάφρασης ( (( Συνοδοί(Πρωτείνες(και(Αναδίπλωση(Πρωτεϊνών( ΜεταLμεταφραστικές(τροποποιήσεις(&(αποδόμηση( Πρωτεϊνών(!

3 Το(βασικό(δόγμα(της(μοριακής(βιολογίας( Γονιδιακή(έκφραση( Mεταγραφή! Aγγελιαφόρο!RNA! (mrna)! Kωδικόνιο! Mετάφραση! Πρωτεΐνη! (πολυπεπτιδική! αλυσίδα)!

4 Πως(επιτυγχάνεται(η(μεταφορά( της(γενετικής(πληροφορίας(από( τα(νουκλεϊνικά(οξέα(στις(πρωτεΐνες;( 1. Τα!αμινοξέα!έχουν!τελείως!διαφορετική!σύσταση!από!το!mRNA.!Πως! λοιπόν!θα!μπορέσουν!να!συνταχθούν!με!το!mrna!κατά!τη!μετάφραση! για!να!γίνει!η!αποκωδικοποίηση;! 2. Πως!είναι!δυνατόν!μια!αλληλουχία!τεσσάρων!βάσεων!να!κωδικοποιεί!20! αμινοξέα;!ποιος!είναι!ο!κώδικας;! 3. Πως! έσπασε!ο!κώδικας;!

5 Ο(γενετικός(κώδικας(

6 Για(τη(μετατροπή(της(γενετικής(πληροφορίας( (αλληλουχία(νουκλεοτιδικών(βάσεων)( (σε(πρωτεΐνες( (αλληλουχία(αμινοξέων)( απαιτείται(ένα(ενδιάμεσο(μόριο(! ΤΟ!!ΜΕΤΑΦΟΡΙΚΟ!RNA!(tRNA)!

7 Η(δομή(του(μεταφορικού(RNA((tRNA)(

8 Η(εκλεκτικότητα(της(μετάφρασης(απαιτεί(τη( μεσολάβηση(δύο(μορίων(προσαρμογής( αμινοξύ! (τρυπτοφάνη)! δεσμός!υψηλής! ενέργειας! συνθετάση! (τρυπτοφάνυλο! trna!συνθετάση)! Σύνδεση!του! αμινοξέως!στο!rna! το!!trna!συνδέεται!στο! κωδικόνιο!του!στο!mrna! ζευγάρωμα! βάσεων! ΚΑΘΑΡΟ(ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ:(Η(ΕΠΙΛΟΓΗ(ΤΟΥ(ΑΜΙΝΟΞΕΩΣ( ΚΑΘΟΡΙΖΕΤΑΙ(ΑΠΟ(ΤΟ(ΚΩΔΙΚΟΝΙΟ(ΤΟΥ(

9 Πλαίσια(ανάγνωσης(στην(πρωτεϊνοσύνθεση(

10 Το(ριβοσωμάτιο( RNA! RNA! RNA! RNA! ~49!πρωτεΐνες!+!3!μόρια!RNA! ~33!πρωτεΐνες!+!1!μόριο!RNA! Μεγάλη!υπομονάδα! Μικρή!υπομονάδα! MW!=! ! Μεγάλη! υπομονάδα! Μικρή! υπομονάδα! ~82!πρωτεΐνες!! +!4!μόρια!RNA! Ολοκληρωμένο!ριβοσωμάτιο! MW!=! !

11 Θέσεις(σύνδεσης(tRNA(στο(ριβοσωμάτιο( Θέση!Ε! Θέση!P! Θέση!Α! Θέση!πρόσδεσης! mrna! Μεγάλη! ριβοσωμική! υπομονάδα! Μικρή! ριβοσωμική! υπομονάδα!

12 συντιθέμενη!ολυπεπτιδική!αλυσίδα! Η(διαδικασία(της(επιμήκυνσης(

13 Η(έναρξη(της(μετάφρασης( RNA! καλύπτρα! εναρκτήριο!trna! μικρή!υπομονάδα!μαζί!με! παράγοντες!έναρξης!(δεν! δείχνονται!στο!σχήμα)! σύνδεση!mrna! mrna! το!σύμπλοκο!μικρής! υπομονάδας/ εναρκτήριου!trna! ψάχνει!το!πρώτο!aug! του!mrna!! Απομάκρυνση!των! παραγόντων!έναρξης! Σύνδεση!της!μεγάλης! ροβοσωμικής! υπομονάδας! Σύνδεση! αμινοακυλοltrna! (Βήμα!1)! Σχηματισμός!πρώτου! πεπτιδικού!δεσμού! (Βήμα!2)!

14 Ειδικές(αλληλουχίες(βάσεων(( στα(προκαρυωτικά(mrna(καθορίζουν(( τα(σημεία(έναρξης(της(μετάφρασης( Θέσεις!πρόσδεσης!ριβοσωματίου! Πρωτεΐνη!Α! Πρωτεΐνη!Β! Πρωτεΐνη!Γ!

15 Το(τέλος(της(μετάφρασης( Πρόσδεση! παράγοντα! απελευθέρωσης! ΤΕΡΜΑΤΙΣΜΟΣ!

16 Το(πολυριβοσωμάτιο:(ένα(mRNA(που( μεταφράζεται(ταυτόχρονα(από(πολλά( ριβοσωμάτια( Κωδικόνιο! τερματισμού! Εναρκτήριο! κωδικόνιο! Αγγελιοφόρο!RNA!(mRNA)! Πολυπεπτιδική! αλυσίδα!

17 Οι(νεοσυντιθέμενες(πρωτεΐνες(χρειάζονται( συνοδούςxπρωτεΐνες(για(να(αναδιπλωθούν( σωστά( αναδιπλωμένη πρωτεΐνη! Συνοδός! πρωτεΐνη! (σαπερόνη)! Απελευθέρωση! ολοκληρωμένου! πολυπεπτιδίου!

18 H(πληροφορία(για(την(αναδίπλωση(μιας( πρωτεΐνης(βρίσκεται(μέσα(στην(ίδια(τη( πρωτοταγή(της(δομή( H!δομή!της!Pιβονουκλεάσης!I! (RNαση!I,!124!αμινοξέα),! σταθεροποιείται!από! τέσσερις!ενδομοριακούς! δισουλφιδικούς!δεσμούς!(oι! μπλέ!κύκλοι=!μόρια!του! αμινοξέος!κυστεΐνη!που! συμμετέχουν!στους! δισουλφιδικούς!δεσμούς).! δισουλφιδικοί!δεσμοί Αναδιπλωμένη!RNαση!I! Θέρμανση!μιάς!πρωτεΐνης! (RNαση!I)!παρουσία! αναγωγικού!παράγοντα,! που!διασπά!τους! δισουλφιδικούς!δεσμούς,! καταστρέφει!τη!δομή!της! πρωτεΐνης,!μετουσιώνοντας! την.! Μετουσιωμένη!RNαση!I! Eάν!η!μετουσιωμένη! RNαση!I!επανέλθει!στις! κανονικές!συνθήκες!θα! ανακτήσει!την!κανονική! της!διαμόρφωση.! Αναδιπλωμένη!RNαση!I!

19 ΓΙΑΤΙ(ΕΙΝΑΙ(ΤΟΣΟ(ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΕΣ(ΟΙ( ΣΥΝΟΔΟΙLΠΡΩΤΕΪΝΕΣ(ΣΤΗΝ( ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗ(ΤΩΝ(ΝΕΟΣΥΝΤΙΘΕΜΕΝΩΝ( ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ;(

20 Το(πρόβλημα(του(συνωστισμού(των( μακρομορίων( <0.1 mg/ml in(vitro( κυτταρόπλασμα(e.(coli( ~340 mg/ml Ellis and Hartl (1996) FASEB J. 10:20-26 ριβόσωμα! πρωτεΐνες! συνοδόςlπρωτεΐνη! νουκλεϊνικά!οξέα! Άλλα!μακρομόρια!

21 Αναδίπλωση(ή(συσσωμάτωση;( Σωστές!αλληλεπιδράσεις! μεταξύ!των!πλευρικών! αλυσίδων!της!πρωτεΐνης! Λάθος!αλληλεπιδράσεις! μεταξύ!πλευρικών!αλυσίδων! διαφορετικών!πρωτεϊνών!

22 ΕΠΟΜΕΝΩΣ( Ο(ρόλος(των(συνοδώνLπρωτεϊνών(ή( πρωτεϊνών(της(θερμικής(καταπόνησης( (HeatLshock(proteins,(HSPs)( ΕΙΝΑΙ:(

23 Οι(συνοδοίXπρωτεΐνες(εμπλέκονται(στην( αναδίπλωση(των(πρωτεϊνών( Eμποδίζουν(τα(υδρόφοβα( τμήματα(των(πρωτεϊνών(να( έρθουν(σε(επαφή(με(άλλα( υδρόφοβα(μόρια( ΚΑΝΟΝΙΚΟ!ΜΟΝΟΠΑΤΙ! ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ! ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΟ!ΜΟΝΟΠΑΤΙ! ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ! ΑΝΕΠΑΝΩΡΘΩΤΑ! (ΚΑΤΑΣΤΡΟΦΙΚΑ)! ΛΑΘΗ! Βοηθούν(στη(σωστή( αναδίπλωση( λιωμένο! σφαιρίδιο! Eπάγονται(από(έκθεση(των( κυττάρων(σε(υψηλές( θερμοκρασίες( Oι(δύο(κύριες(ομάδες(των( συνοδώνlπρωτεϊνών(αυτών( είναι(οι(hsp70(και(οι(hsp60! Ορθά! αναδιπλωl μένη! πρωτεΐνη! συνοδοί! πρωτεΐνες! συνοδοί! πρωτεΐνες! πρωτεάσες/ αποικοδόμηση!

24 Οι(πρωτεΐνες(μοριακοίXσυνοδοί(βοηθούν( στη(πρωτεϊνική(αναδίπλωση( Αποσυσσωμάτωση! J K T F 3' 5' ClpB0 GrpE0 ATP ADP J K ATP Μερικώς αναδιπλωμένη πρωτεΐνη GrpE Αναδίπλωση! ADP Αναδιπλωμένη πρωτεΐνη ADP IbpA/B ATP Αναδίπλωση! Κατακράτηση! Hsp31" GroEL GroES Hsp33"

25 Συνοδοί(πρωτεΐνες(εμπλέκονται(στη( μεταφορά(σε(μεμβρανικά(οργανίδια( (Το( παράδειγμα(του(μιτοχονδρίου( Πολυπεπτιδική!αλυσίδα! Κυτταροπλασματική!συνοδός! πρωτεΐνη! Μιτοχονδριακή!συνοδός! πρωτεΐνη! Αναδιπλωμένη! πρωτεΐνη! Μιτοχόνδριο!

26 Η(είσοδος(των(πρωτεϊνών(στο(ΕΔ(γίνεται( ταυτόχρονα(με(τη(μετάφραση( σηματοδοτική!αλληλουχία! Σωματίδιο!αναγνώρισης!σήματος!(ΣΑΣ)! κυτταρόπλασμα( αυλός(του(εδ( Υποδοχέας! του!σασ! σύμπλοκο!μεταφοράς!sec61! (=κανάλι!μετατόπισης)! σηματοδοτική! πεπτιδάση!!2000!by!geoffrey!m.! Cooper!

27 ΣυνοδοίXπρωτεΐνες(αναδιπλώνουν(αλλά(και( συγκρατούν(τις(πρωτεΐνες(στον(αυλό(του(εδ( Αυλός του ΕΔ 2000 by Geoffrey M. Cooper

28 Συνοδοί(πρωτεΐνες(εμπλέκονται(και(στον( ποιοτικό(έλεγχο(των(πρωτεϊνών(του(εδ( EΔ! Λάθος! αναδιπλωμένη! πρωτείνη! Σωστά!αναδιπλωμένη! πρωτείνη! Συνοδός! πρωτείνη! Eκβλαστάνον! κυστίδιο!μεταφοράς!

29 Ρύθμιση(της(πρωτεϊνικής(αναδίπλωσης(στο(ΕΔ( μεταφορά!έξω! από!το!εδ! Ουβικιτινωση!! πρωτεασωμική! αποικοδόμηση! Προϊόντα! αποικοδόμησης! Golgi! ριβοσωμάτιο! λάθος!αναδίπλωση! κυστίδιο! Είσοδος! στο!εδ! Μετατροπή!&! αναδίπλωση! Ορθή! αναδίπλωση! ΕΔ( CM!Dobson,! Protein!folding!and!misfolding,!Nature,!426,!884l890!(2003)! Πολλές!νεοσυντιθέμενες!πρωτεΐνες! μεταφέρονται!στο!εδ!όπου!και!αποκτούν!τις! ανώτερες!δομές!τους!με!τη!βοήθεια!συνοδώνl πρωτεϊνών!ή!άλλων!παραγόντων!που!προάγουν! την!πρωτεϊνική!αναδίπλωση.! Οι!σωστά!αναδιπλωμένες!πρωτεΐνες! μεταφέρονται!κατόπιν!στη!συσκευή!golgi!και! στη!συνέχεια!κατευθύνονται!(με!κυστιδιακή! μεταφορά)!στο!σωστό!μεμβρανικό!οργανίδιο!ή! στον!εξωκυττάριο!χώρο.! Πρωτεΐνες!που!δεν!έχουν!αναδιπλωθεί!σωστά! ανιχνεύονται!από!τους!μηχανισμούς!ποιοτικού! ελέγχου!της!πρωτεϊνικής!αναδίπλωσης!και! ανακατευθύνονται!με!διαφορετικό!μηχανισμό! (unfolded!protein!response,!απόκριση!σε!μη! αναδιπλωμένες!πρωτεΐνες).!ο!μηχανισμός!αυτός! οδηγεί!στην!ουβικιτίνωση!των!λάθος! αναδιπλωμένων!πρωτεϊνών!και!στην! αποικοδόμηση!τους!από!τα!πρωτεασωμάτια.!

30 Μετά(τη(σύνθεση(τους(πολλές(πρωτεΐνες( συνδέονται(μη(ομοιοπολικά(με(μικρά(μόρια( Ρετινάλη( Αίμη(

31 Η(φωσφορυλίωση(των(πρωτεϊνών(είναι(μία( από(τις(σημαντικότερες(ομοιοπολικές( τροποποιήσεις(! Η!φωσφορυλίωση!των!πρωτεϊνών! έχει!ως!αποτέλεσμα!την!μεταβολή! των!φυσικοχημικών!τους!ιδιοτήτων! και!κατα!συνέπεια!της!δομής!τους.!! Οι!παραπάνω!δομικές!αλλαγές! μπορεί!να!επηρεάσουν!την! ενεργότητα!της!πρωτεΐνης!ή/και!τις! αλληλεπιδράσεις!της!με!άλλα! Πλευρική! αλυσίδα! σερίνης! Κινάση! πρωτεϊνών! Φωσφατάση! πρωτεϊνών! Κινάση! βιομόρια.! ΑΝΕΝΕΡΓΟ( φωσφατάση! ΕΝΕΡΓΟ( Κινάση! ΕΝΕΡΓΟ( ΑΝΕΝΕΡΓΟ( φωσφατάση!

32 Η(φωσφορυλίωση(των(πυρηνικών(λαμινών( οδηγεί(σε(αποσυναρμολόγηση( του(πυρηνικού(υμένα( Σύντηξη!των! κυστιδίων!του! πυρηνικού!φακέλου! Πυρηνικός!πόρος! λαμίνες! εσωτερική!πυρηνική! μεμβράνη! εξωτερική!πυρηνική! μεμβράνη! Πυρηνικός! φάκελλος! Φωσφορυλίωση! των!λαμινών! ΜΕΣΟΦΑΣΙΚΟΣ!ΠΥΡΗΝΑΣ! χρωματίδη! χρωμόσωμα! κυστίδιο!πυρηνικού! φακέλου! ΤΕΛΟΦΑΣΗ! Αποφωσφορυλίωση! των!λαμινών! φωσφορυλιωμένες! λαμίνες! ΠΡΟΦΑΣΗ!

33 Σύνδεση(υδατανθρακικών(αλυσίδων(στις( γλυκοπρωτεΐνες( ΝLΔεσμός( Ασπαραγίνη! Νlακετυλογλυκοζαμίνη! συνδεδεμένη!με! ασπαραγίνη! ΟLΔεσμός( Σερίνη! Νlακετυλογαλακτοζαμίνη! συνδεδεμένη!με!σερίνη!

34 Σύνδεση(πρωτεϊνών(με(μεμβρανικά( γλυκολιπίδια( κυτταρόπλασμα! Αλυσίδες!λιπαρών!οξέων! αιθανολαμίνη! ολιγοσακχαρίτης! Αυλός! ενδοπλασματικού! δικτύου!

35 Ωρίμανση(πρωτεϊνών(με(μερική(πρωτεόλυση( και(με(σχηματισμό(δισουλφιδικών(δεσμών( ΠρεLπροϊνσουλίνη( Οσχηματισμός(των( δισουλφιδικών(δεσμών( απαιτεί(οξειδωτικό( περιβάλλον(και(επιταχύνεται( από(εξειδικευμένα(ένζυμα( (π.χ.(την(ισομεράση(των( δισουλφιδικών(δεσμών,(pdi)( Σηματοδοτική! αλληλουχία! Αποκοπή!σηματοδοτικής!αλληλουχίας! Σχηματισμός!δισουλφιδικών!δεσμών! Ενδιάμεσο!(συνδετικό)! πολυπεπτίδιο! Αποκοπή!συνδετικού! πολυπεπτιδίου! προϊνσουλίνη( ϊνσουλίνη(

36 Πολλά(οργανίδια(και(πρωτεΐνες( αποδομούνται(στα(λυσοσωμάτια( βακτήριο! φαγόσωμα! φαγοκυττάρωση! Kυτταρική! Mεμβράνη! Πρώιμο!ενδόσωμα! ενδοκυττάρωση! Όψιμο! ενδοσωμάτιο! Λυσοσωμάτιο! Eνδοπλασματικό! δίκτυο! Mιτοχόνδριο! αυτοφαγοσωμάτιο! αυτοφαγία!

37 Η(αποδόμηση(των(πρωτεϊνών(των( ευκαρυωτών(επιτελείται(κυρίως(στα( πρωτεοσωμάτια( Μηχανισμός! εισόδου! εξαρτώμενος! από!την! ουβικιτίνη! Πρωτεΐνη!που! προορίζεται!για! αποικοδόμηση! πεπτίδια! Πρωτεολυτική! μηχανή!

38 Αποδόμηση(ευκαρυωτικών(πρωτεϊνών( στα(πρωτεοσωμάτια(

39 Οι(λιγάσες(της(ουβικιτίνης(«μαρκάρουν»(τις( πρωτεΐνες(για(αποικοδόμηση( ουβικιτίνη! Πρωτεΐνη! στόχος! Πολυουβικιτίνωση! Πρωτεάσωμα! πεπτίδιο!

40 Ο(μηχανισμός(της(ουβικιτίνωσης( Ε1(ενεργοποιητής(της(ουβικιτίνης( Ε2(μεταφορέας(της( ουβικιτίνης( Ε3(λιγάση(της( ουβικιτίνης( Πρωτεϊνικά( υποστρώματα( ουβικιτίνη! Ενεργοποίηση( Εξειδικευμένη( ουβικιτίνωση( Αναγνώριση( υποστρώματος(

41 ( Σας(Ευχαριστώ(για(την( Προσοχή(σας(