ییاناد دنوادخ مان هب

Transcript

1 به نام خداند دانایی

2 ریان برنتنی کشت دسترالعملها رشها Embryo Culture (Methods and Protocols) نیسندگان گری پل بی تماس ساین جیسن اسمیت دی مترجمین کهرام حمید دکتر داچی داداشپر نید دکتر شمسی هلیا ب

3 (Wilhelm Roux 4981) مترجمین پیشگفتار ". میشد علت آن علت باره در جدید پرسشهای طرح به منجر تنها تازهای علت هر کشف " میالدی 2142 سال پایان در Springer انتشارات تسط Embryo Culture Methods and Protocols کتاب انگلیسی نسخه )گرایش دامی علم زیستشناسی دامپزشکی پزشکی علم گرههای دانشجیان اساتید برای کتاب این رسید. انتشار به ارزیابی ریان برنتنی تلید محریت با تحقیقات اجرای راهاندازی منظر به کامل مرجعی عنان به مثل( تلید فیزیلژی زمینههای از یکی پستانداران ریان برنتنی تلید میآید. حساب به آزمایشگاهی شرایط در شده تلید ریانهای کیفی کمی آغازین رزهای در ریان متابلیکی نیازهای شناخت بررسی فیزیلژیک مسیرهای کشف راستای در کاربی مطالعاتی پایه مفاهیم درک راستای در رشد ربه نیاز به تجه با میآید. حساب به انسان در کمبارری مشکالت رفع به کمک تشکیل جامعترین از یکی پیشر کتاب آزمایشگاهی شرایط در ریان تلید استاندا رشهای از آگاهی ریان برنتنی تلیدات میباشد. زمینه این در مراجع اشتباه مشاهده درصرت است خاهشمند عزیز دانشجیان اساتید از لذا میباشد کتاب این ترجمه الین عنان به حاضر ترجمه نمایید. ارسال ایمیل آدرس به را خد نظر م اصالحات امالیی غلط تایپی آمادهسازی از مراحلی در که محمدیان طاهره خانم سرکار صناعی بتل خانم سرکار زحمات از که میدانیم اجب برخد درپایان نمایم. تشکر داشتهاند مشارکت حاضر کتاب پاییز 4931 ج

4 فهرست فصل تاریخچه محیطه یا کشت گامت ریان...4 فصل استفاده از مدله یا حیانی تسعه کشت ریان انسان: جندگان...48 فصل کارب مدله یا حیانی برای تسعه کشت ریان انسان: گنه حیانات اهلی...22 فصل کارب مدله یا حیانی برای کشت ریان انسان: پرایمتها غیر از انسان فصل ترکیب محیط کشت: نمک اسمالریته...33 فصل اجی محیط کشت: منبع انرژی متابلیسم...01 فصل اج محیط کشت: اسیدهای آمینه همستازی سلل...91 فصل اجی محیط کشت: درشت ملکلها رشد ریان...82 فصل اج محیط کشت: آنتی اکسیدانها/کیالت کنندهها عملک سللی فصل اج محیط کشت: ph بافرها فصل ترکیب محیطه یا کشت: فاکترهای رشد فصل سیستمه یا کشت: سیستم کشت تک مرحلهای فصل سیستمه یا کشت: سیستم کشت پیدرپی فصل سیستمه یا کشت: سامانه همکشتی ریان فصل سیستمه یا کشت: کشت با فشار کم اکسیژن فصل سیستم کشت: تراکم ریان فصل سیستمهای کشت: کیفیت ها فصل سیستمه یا کشت: الیه رغن معدنی د

5 فصل سیستمه یا کشت: عامل محیطی فیزیلژیی مثر بر مفقیت رشه یا درمان نابارری انسان فصل محیطه یا کشت: مایع پیا محیطه یا کشت ریان )میکرفلئیدها( فصل مقایسات محیط کشت ریان انسان فصل سیستمه یا کشت:کشت ریان دقلیی همسان فصل کشت برنت ین ریان ا یپ ژنتیک ه

6 عاید مادی حاصل از فرش کتاب حاضر به نیابت از مرحم مهندس کرش صفیه خاهد شد. به مراکز خیریه اهدا رحش قرین رحمت الهی

7 فصل 4 تاریخچه محیطهای کشت گامت ریان الین محیط کشت بافت نزدیک به 431 سال پیش تسط Ludwig Ringer تلید شد. این محیط کشت محلل نمکی سادهای بد که برپایه اجی سرم خن بنا نهاده شده بد. نسل دم محیطهای کشت بیش از یک قرن بعد در دهه 4801 میالدی با هدف تقلید نمدن از شرایط فیزیلژی دستگاه تلیدمثل مجد ماده فرمله شدند. در دهه 4881 رش Simplex Optimization به منظر طراحی نسل سم محیطهای کشت م استفاده قرار گرفت با استفاده از این رش تا حددی فرمالسینهای قدیمی اصل الیه تسعه یافته نادیده گرفته شد. همزمان با تکامل تلید محیطهای کشت برای مطالعه لقاح فرایند تکین ریان دانشمندان صنعتگران بیش از پیش با لزم کنترل محیطهای کشت آشنا شدند. در همین راستا احدهای تحقیقاتی تلیدی به ساخت تسعه تجهیت م نیاز در زمینه تلیدات برنتنی ریان از جمله میکرسکپ 4 معکس انکباتر ظرف کشت ظرف پالستیکی استریل هد المینار تلید سیستمهای فیلتراسین ها پاختند. (HEPA 2 ( 4-4. مقدمه الین محیط کشت بافت تسط Ludwig Ringer نزدیک به 431 سال پیش تلید ساخته شد. این محیط شامل یک محلل نمکی ساده میشد که برپایه اجی شیمیایی مجد درسرم خن بنا نهاده شده بد. در همان سالهای ابتدایی تلید محیط کشت مذکر دانش بشری پیرامن بیشیمی متابلیسم در پستانداران انسان به یژه در م اسمالریته ph دما ربه پیشرفت بد. این دانش باعث ایجاد زمینهای جهت اعمال تغییرات در محللهای نمکی م استفاده در کشت بافت سلل شد. نسل دم محیطهای کشت نزدیک به 4 قرن پیش تلید شدند. در دهه 4801 میالدی تالش دانشمندان در راستای تلید محیط- های کشتی بد که به نعی تقلید کننده شرایط درنتنی بده است به نعی شبیه سازی محیط مجد در دستگاه تلید مثلی 3 را در نظر داشتند )فرضیه ای که در این زمینه هماره م نظر بده است با نام "بازگشت به طبیعت" شناخته میشد(. نسل سم محیطهای کشت به منظر ارتقای بازده رشد در شرایط برنتنی طراحی تلید شدند. در این راستا تا حددی فرمالسین اصل پایهریزی شده ای که تا آن زمان ارایه شده بد نادیده گرفته شدند. به منظر فرمله نمدن این محیطهای کشت جدید عملک هر یک از اجی مجد در محیط کشت را به صرت جداگانه به اسطه استفاده از ریه Simplex Optimization م بررسی قرار میدادند. Optimization Simplex سیستمی است که 21 سال پیش در آزمایشگاه John Biggers در دانشگاه هارا ایجاد شده است. همزمان با تسعه تلید محیطهای کشت برای مطالعه لقاح فرایند تکین ریان دانشمندان صنعتگران بیش از پیش با لزم کنترل محیطهای کشت آشنا شدند. در همین راستا احدهای تحقیقاتی تلیدی به ساخت تسعه تجهیت م نیاز در زمینه تلیدات برنتنی ریان از جمله میکرسکپ معکس انکباتر ظرف کشت ظرف پالستیکی استریل هد المینار تلید سیستمهای فیلتراسین ها ( 1 (HEPA پاختند. در این فصل به بررسی تاریخچه کشت ریان سللهای جنسی در 3 سرفصل مج به شرح زیر میپازیم: 4( تسعه محیطهای کشت 2( مطالعه شرایط فیزیلژی 3( تسعه تلید ابرآالت مخصص مطالعات ریان شناسی. Inverted microscope High Efficiency Particulate Air Back to Nature High Efficiency Particulate Air 4

8 2-4. رند تکاملی محیطهای کشت محلل نمکی Ringer محللهای مشتق شده از آن سیدنی رینگر Ringer) (Sydney فارماکلژیست اهل بریتانیا که در دانشگاه لندن مشغل به مطالعه تحقیقات بد محللی نمکی بر پایه اجی مجد در سرم خن را تلید فرمله نمد. هدف ا مطالعه ضربان قلب قرباغه در شرایط برنتنی بد )4 2(. این محلل ساده نمکی از کلرید سدیم (NaCl) کلراید پتاسیم (KCl) کلراید کلسیم ) 2 (CaCl غلظت کمی از بیکربنات سدیم ) 3 (NaHCO معادل 2/0 میلی مل تشکیل شده بد. محلل رینگر در حقیقت به عنان محللی مشتق از محلل ساخته شده در سال 4921 تسط Carl Ludwig شناخته میشد. محلل ساخته شده تسط Carl Ludwig به منظر 3 تسعه مدلی جهت تزریق مدام محلل مذکر به اندامهای بدن با هدف حفظ عملک آنها طراحی شده بد. افزدن اتفاقی آب لله کشی شهر لندن به محیط Carl تسط دستیار Ringer به طر اعجاب انگیزی منجر به حفظ ضربان طبیعی قلب قرباغه شد. این حادثه در نهایت منجر به پیشرفت برجستهای در تلید محللهای تزریقی شد. مادهای که در آب للهکشی شهر جد داشت در محلل نمکی رینگر جد نداشت کلراید کلسیم بد. 23 سال بعد محلل رینگر به سیله Locke Rosenheim م بازنگری قرار گرفت )3( این تغییر با افزدن 44/4 میلیمل گلکز به منظر مطالعه ضربان قلب خرگش در شرایط برن- تنی به انجام رسید. این محلل با نام محلل رینگر-الک شناخته میشد. دارساز آمریکایی با نام Maurice Tyrode برای مطالعه رده خرگش با افزدن فسفات سدیم کلراید منیزیم افیش غلظت بیکربنات سدیم به مقدار 44/8 میلی مل محللی جدید را تلید نمد )1(. Kerbs Henseleit گلکز را از این محلل خارج نمدند مقدار بیکربنات سدیم را به 23 میلی مل رساندند. هدف آنها از این تغییرات مطالعهی متابلیسم نیترژن در بافت بدن رت بد. این غلظت بیکربنات سدیم در محلل (KRB) Krebs-Ringer-Bicarbonate چیزی بد که به طر معمل به همراه %3 دی اکسید کربن در بیشتر محیطهای کشت به منظر تاثیر بر ph فیزیلژی استفاده میشد محیطهای کشت ریان برپایه محلل Krebs-Ringer-Bicarbonate John Hammond الین سرپرست احد جدید تلیدمثل حیانی در مرکز تحقیقاتی کمبریج در سال 4818 در انگلستان بد )2(. ا الین شخصی بد که مرحله کلیاژ ریان مش را در شرایط برنتنی مشاهده نمد همچنین مفق به مشاهده تکمیل رند تکین ریان 9 سللی مش به مرحله بالستسیست شد. همچنین ا الین فی بد که مفق به مشاهده رند هچ شدن بالستسیست در شرایط برنتنی شد. به دلیل مطالعاتی که در دهه 4831 میالدی به همراه تعدادی ریانشناس عالقهمند به مطالعه سیستم کشت برنتنی انجام داد اینکه به عنان الین افرادی بدند که تانستند به مشاهده مطالعه رند تکین بالفاصله بعد از رد اسپرم به اسیت تا انتهای تکین ریان در مرحله پیش از النه گزینی بپازند John Hammond به عنان پدر علم کشت ریان شناخته میشد. برنامه کلی شامل مدلسازی تکین ریان پیش از النهگزینی در شرایط برنتنی بد اگرچه برخی دانشمندان پیشنهاد داده بدند که کشت ریان تا حصل مفقیت در ادامه کشت رشد برنتنی ریان آنقدر 2 ادامه یابد که حتی بتانند تکامل ریان را نیز مشاهده نمایند. John Hammond از محللی که حای کلراید سدیم کلراید پتاسیم کلراید کلسیم کلراید منیزیم مقداری گلکز بد برای کشت ریان استفاده نمد. ا به این محلل مقدار %3 سفیده تخممرغ نیز اضافه نمد. ریانها شسته شدند از بدن مشها خارج شدند در یک لله مخصص آزمایشگاه خنشناسی مهر 0 مم شدند در شرایط گازی اتمسفر به مدت 19 ساعت کشت داده شدند. با تجه به شرایط نگهداری ذکر شده تنها تعداد کمی از این ریانها که در مرحله 9 سللی جمعآری شده بدند مفق به سپری نمدن فرایند تکین در شرایط برنتنی شدند. John Hammond نشان داد که گلکز به عنان یکی از ماد الزم ضرری برای متراکم شدن ریان تکین آنها به سمت Perfusion model for organs Fetus sealed 2

9 مرحله بالستسیست میباشد. به نظر میرسد که ا الین فی است که استفاده از لله آزمایش برای کشت ریان را به طر رسمی منتشر نمد. در سال 4832 Whitten Wesley از استرالیا نشان داد که با استفاده از محلل KRB غنی سازی شده با 3/33 میلی- مل گلکز پنیسیلین استرپتمایسین سرم آلبمین گای بیش از %81 از ریانهای مش در مرحله 9 سللی تانایی تسعه رسیدن به مرحله بالستسیست را دارا میباشند )0(. McLaren Biggers الین افرادی بدند که نشان دادند چنین بالستسیستهایی بعد از انتقال به رحم مادران پذیرنده تانایی ایجاد تلد ند را خاهند داشت )9(. این الین قدم درمسیر لقاح 9 برنتنی بد. سپس Whitten با افزدن الکتات به فرمالسین محیط کشت ساخته شدهاش در سال 4832 مفق به کشت ریان مش از مرحله 2 سللی تا رسیدن به بالستسیست شد )8(. اما ا نتانست به مفقیت مشابهی در م کشت ریانهای 41 8 مش از مرحله سلل تخم دست یابد. این مشاهده منجر به کشفی با نام تقف تکین در مرحله 2 سللی در ریانهای مش شد. Hammond Whitten هر د از لله آزمایشگاهی که حای کمتر از 4 میلیلیتر محیط کشت بد برای کشت ریانها استفاده نمدند. قبل از این د دانشمند Pincus از فالسک Carrel با حجم 2 تا 41 میلیلیتر محیط کشت استفاده نمده بد )41(. درخالل آن سالها مطالعه تحقیق در زمینه انجام لقاح برنتنی به شدت در حال انجام بد. در سال Thibault 4833 لقاح برنتنی سلل تخم خرگش را مشاهده نمد )44( الین تلد بچه خرگش زنده به سیله Chang در بنیاد Worcester 44 در سال 4832 به قع پیست )42( اما محیط کشت تعریف شدهای برای کشت ریان به منظر انجام IVF در آن رزها استفاده نشده بد در مجمعه مقاالت بینظیری Ralph Brinster نشان داد که ماد حامل انرژی مانند فسفئنلپیرات پیرات الکتات اگلاستات به جز گلکز تانایی حمایت از تکین ریان مش از مرحله 2 سللی به مرحله 9 سللی را دارا است این درحالی است که ا نشان داد گلکز تانایی حمایت از تکین ریان از مرحله 9 سللی تا مرحله بالستسیست را دارا می- باشد )43(. بر پایه این یافتهها Brinster محیط کشت تلید شده تسط Whitten را از طریق کاهش مین غلظت کلسیم افزدن 1/20 میلیمل پیرات دستکاری نمد محیط کشت BMOC2 را تلید نمد این محیط کشت تانایی حمایت از رند تکین ریان 2 سللی مش تا مرحله بالستسیست با بازده باال را از خد نشان داد )41(. در مطالعات بعدی Whittingham محیط کشت تلید شده تسط Brinster را به اسطه کاهش غلظت الکتات افیش غلظت پیرات دستکاری نمد مفق به تلید محیط کشت M42 شد. محیط کشت Brinster M42 به عنان پیشرفتهای برجستهای در زمینه کشت ریان به حساب آمده به طر گستهای تسط ریانشناسان تجربی م استفاده قرار میگرفت. تغییر تبدیالت کچکی نیز بعدها در این محیطها صرت گرفت که منجر به مفقیتهای قابل تجهی شد )42(. اما به جز سیههای درگه یا غیر همخن م ش این محیطهای کشت کشت تانایی غلبه بر تقف تکین ریان در مرحله 2 سللی را نداشتند. این تقف تکین در ریانهای همستر )2 سللی( گا )42-9 سللی( خک )9-1 سللی( مشاهده میشد. همچنین یک تقف نسبی در رند تکین ریان انسان در مرحله 1 تا 9 سللی نیز مشاهده میشد. تمامی این تقفها تقریبا همزمان با شرع بیان ژنم ریان میباشد )مرجع شماره 40 مطالعه شد(. سرانجام مشکل تقف تکین ریان مش در مرحله 2 سللی تسط Chatot همکاران مرتفع شد )49( این اتفاق به اسطه تلید محیط کشتی با نام (CZB) Chatot-Ziomek-Bavister که در حقیقت نسخه ارتقا یافته محیط کشت BMOC2 فاقد In vitro fertilization (IVF) Zygote -cell block Defined embryo culture media phoenolpyruvate pyruvate lactate Oxaloacetate hybrid outbred 9

10 گلکز غنی سازی شده با 4 میلیمل گلتامین 1/4 میلیمل EDTA بد. این مفقیت منجر به باشتی منفی گلکز شد که بیان مینمد گلکز به عنان یک ممانعت کننده تکین ریان به حساب میآید. در م محیط کشت ریان برپایه محتایات مایع ایداکت رحم بیشتر محیط های کشت م استفاده در کشت ریان در مراحل پیش از النه گزینی برپایه محللهای ساده نمکی است. 49 راهکار جایگزین برای تلید محیطهای کشت از مفهم بازگشت به طبیعت الهام میگی. براساس این اصل فرمالسین محیطهای کشت برپایه ترکیبات مجد در مایع ایداکت رحم براساس غلظتهای این ماد در این محیطها تنظیم میشد. 48 این محیطهای کشت شامل SOF )مایع ایداکت سنتز شده ( که برپایه مایع ایداکت گسفند ساخته شده )48(; B2 که 21 براساس مایع ایداکت گا رحم فرمله شده )21(; HTF )مایع ایداکت انسان ( بر اساس ترکیب مجد در مایع ایداکت 24 انسان فرمله شده )24(; MFT )مایع ایداکت مش ( بر اساس محتایات مجد در ایداکت مش فرمله شده است می- باشند )22(. تفات در ترکیبات مجد در مایعات ایداکت رحم همچنین تغییر فعال تی های متابلیکی ریان در خالل رزهای آغازین تکین باعث شد که Gardner Lane پیشنهاد کنند که "به منظر بهینهسازی تکین ریان پستانداران در شرایط 22 کشت برنتنی محیطهای کشت پیدرپی میتانند نیازهای ربه تغییر ریان درحال تکامل را فراهم نمایند") 23 (. اگرچه این نتیجه گیری انجام شده تسط این د دانشمند منطقی به نظر میرسد نیاز به محیط کشت پیدرپی به یژه ریک "بازگشت به طبیعت" در حال حاضر به طر جدی به چالش کشیده شده است زیرا این ریک به شدت ابسته به تجزیه تحلیل دقیق اجی تشکیل دهنده مایع ایداکت رحم میباشد. چنین تجزیه تحلیلهایی در م مایع ایداکت رحم دارای نقاط ضعف زیادی میباشد از جمله مای که در ادامه تضیح داده میشد. ال اینکه همانطر که تسط Summers Biggers مطرح شده است محتای مایع ایداکت رحم به شدت متغیر است به دلیل تفات در رشهای نمنه گیری این تغییر به شدت بیشتری به چشم میآید )21(. دم اندازهگیریها فقط 23 منعکس کننده ترکیب کلی مایع ایداکت رحم میباشد در نتیجه ترکیب ریزمحیطهایی که ریان در آن درحال زندگی است را نمیتان بدست آ. سم اینکه برخی مایعات زیستی مانند پالسمای منی بسیار پیچیده بده که باعث میشد تفسیر عملک آنها بسیار سخت پیچیده شد. چهارم شرایط محیطی-فیزیکی که ریان در شرایط درنتنی تجربه مینماید کامال با 21 آنچه در شرایط برنتنی با آن ماجه میشد متفات میباشد. به جز در ما بیماریها ذخیره زیادی از مایعات دستگاه تناسلی فراهم نمیباشد. ریان با یک الیه بسیار نازک از مایع مجد در ایداکت احاطه شده در تماس نزدیک با بافتهای مادر می- باشد; این مسئله باعث تبادل سریع ماد مغذی گازها ماد ید عامل تاثیرگذار بین ریان مادر میشد. درمقابل ریان در شرایط برنتنی در مجمعهای بزرگ از مایع که در آن محتای ماد غذایی دایم در حال کاهش ماد ید به طر مدام در حال تلید است احاطه شده است. اضح است که استرس اعمال شده به ریان در شرایط برنتنی بسیار متفاتتر از آن چیزی است که ریان در شرایط درنتنی با آن ماجه میشد در نتیجه محیطهای کشت باید به گنهای فرمله طراحی شند که بهترین شرایط تکین برای ریان فراهم شد. Back to nature synthetic oviductal fluid Human tubal fluid Mouse tubal fluid Sequential media microenvironment Pathological 1

11 طراحی محیط کشت با استفاده از رش Simplex Optimization طی یک تحل بنیادی از رشهای سنتی طراحی محیط کشت ریان Lawitts Biggers ربه استفاده از اصلی با نام simplex optimization در طراحی محیط های کشت آند آنها به سیله این رش تانستند بهترین غلظت برای هر ماده 23 مجد در محیط کشت را شناسایی نمایند )23 22(. این د نفر ریه تلید "محیط کشت تلید کننده " را برپایه محیطهای M42 CZB که حای KCl NaCl فسفات پتاسیم ) 1 (KH 2 PO سلفات منیزیم ) 1 (MgSO الکتات پیرات گلکز 22 سرم آلبمین گای (BSA) اتیلندیآمیناترترااستیکاسید (EDTA) گلتامین بد آغاز نمدند. 41 محیط کشت آزمایشی آزمایشی دیگر از محیط کشت تلید کننده این د محقق حاصل شد هرکدام از این 41 محیط کشت حای یکی از اجی افزده شده مذکر با غلظت بسیار باال بد. در نهایت این 44 محیط کشت تشکیل دهنده START simplex شدند. چهار چرخه از ریه simplex optimization نشان داد که غلظتهای باالی NaCl پیرات KH 2 PO 1 گلکز برای تکین ریان مش مضر میباشد )23(. 42 سیکل دیگر از ریه simplex optimization منجر به فرمالسین محیط کشتی با نام محیط کشت (SOM) Simplex Optimization 20 شد که با غلظت پایین NaCl مشخص میشد تانایی غلبه بر تقف تکین ریان مش در مرحله 2 سللی را داشت )22(. در مطالعات بعدی مشخص شد که تکین بالستسیست با افیش غلظت KCl از 1/23 به 2/3 میلیمل بد مییابد در نتیجه نام این نسخه از محیط کشت را KSOM گذاشتند )20(. جالب این بد که مشخص شد گلکز مجد در محیط کشت KSOM هیچ تاثیر مهاری بر تکین ریان مش ندا حتی در زمانی که غلظت- های به نسبت باالی این ماده مصرف شده باشد )29(. تکین ریان با افزدن اسیدهای آمینه به محیط کشت KSOM مین بیشتری ارتقا یافت این محیط کشت با نام KSOM-AA شناخته میشد )34-28(. اخیرا Biggers همکاران Summers همکاران نشان دادند که تکین ریان مش با افزدن گلیسین-آالنین به محیط کشت در مقایسه با افزدن گلتامین یا گلتامین-آالنین بد چشمگیری را نشان میدهد )32 33(. عاله بر مطالعات زیادی که رری ریانهای مش صرت 29 پذیرفته است KSOM با یا بدن اسیدهای آمینه قدرت حمایت از تکین ریانهای گا )31( خرگش )33( میمن رسس )32( خک )30( رت )39( انسان )38( را دارا میباشد. برای جزییات بیشتر مطالعه سیعتر ری تاریخچه تکامل محیطهای کشت ریان به مرجعهای ) ( مراجعه نمایید فیزیلژی کشت ریان تاریخچه تکامل محیطهای کشت در پستانداران به شدت با کشف اصل پایه فیزیلژی محیط پیرامن درن بافت- های پستانداران حفظ همستاز سللی درشرایط درنتنی مرتبط است. چهار عامل اساسی در ارتباط با محیطهای کشت باید در نظر گرفته شد: الف( حفظ دما ب( تنظیم ph ج( تنظیم حجم سلل اسمالریته د( تاثیر آلدگیهای محیطی آلدگی- های باکتریایی قارچی. سنجش دستکاری این عامل نه تنها برای تحل علم ریانشناسی تجربی مهم است بلکه به منظر مطالعات کلی در زمینه کشت سلل بافتها نیز حایز اهمیت میباشد. به طر معمل این م اخیر )کشت سلل( بده است که باعث پیشرفت در زمینه تلید محیطهای کشت شده است در سالهای اخیر با پیشرفت انجام لقاح برنتنی تاثیر این شاخه از علم بسیار برجستهتر از زمینه کشت سلل بده است حفظ دما دما سنجهای ابتدایی که ترمسکپ نامیده میشدند در زمانهای بسیار قدیم شناخته شده بدند اما این دماسنجها فاقد هرگنه درجه بندی بدند. بنابراین اندازهگیری دما تقریبا به صرت کلی انجام میشد تا زمانی که گالیهل )4383( مفق به تلید generating medium Ethylenediaminetetraacetic acid Simplex Optimization Medium (SOM) Rhesus monkey 5

12 دماسنجی با بهره گیری از خاصیت انقباض انبساط ها در یک حباب شیشهای شد که آب را در یک سیلندر به باال پایین حرکت میداد. گالیله از معدد دانشمندانی بد که عالقه زکات استعداد زیادی از خد برز میداد. به عنان یک فیلسف هرگز از تکنلژی ریگان نبد درحالی که مفهم تکنلژی اصال به جد نیامده بد. دماسنج گالی ه ل در حقیقت کپی همان چیزی است که هم اکنن به فرش میرسد این دستآ فقط یکی از اختراعات تکنلژی ا به حساب میآید. الین نفری که برای نخستین بار برای دماسنج معیار مشخصی تعریف ک Santorio Santorio بد. همچنین ا الین فی بد که در سال 4242 از دماسنج برای اندازهگیری دمای بدن انسان استفاده نمد. پیشگامان ریانشناسی فرض میکند که در شرایط درنتنی سللهای جنسی در شرایطی باهم برخ مینمایند که تحت تاثیر دمایی مشابه با دمای هسته مرکزی بدن میباشد در نتیجه منطقی به نظر میرسید که این دما را برای تنظیم دمای انکباسین در شرایط برنتنی ترجیح دهند. حفظ دما به عنان یکی از مهمترین عامل در شرایط کشت برنتنی در نظر گرفته میشد. اما شاهد دیگری جد دا که پیشنهاد مینماید که استفاده از دمای مرکزی بدن برای کشت ریان پستانداران بر اساس تفسیر غلط شرایط مجد در لله تناسلی ممکن است که به عنان یک خطای معنی دار به حساب آید. با احتساب این که پستانداران خنگرم هستند میتان اینگنه معنی ک که آنها قادر هستند که دمای درنی بدن خد را تا حدد به نسبت زیادی ثابت نگهدارند. در شرایط برنتنی با در نظر گرفتن جداشدن قسمتی از بافت یا سللی از بدن مثال ریان پستانداران به تغییرات دمای بیرنی در شرایط برنتنی همانند مجدات خنس عمل می نماید. مجدات خنس به اسطه یکی از سه مکانیسم اکتترمی پیکیلترمی برادیمتابلیسم دمای بدن خد را تنظیم مینمایند. اکتترمی به معنای تنظیم دمای بدن به اسطه محیط پیرامنی پیکیلترمی به معنی تنظیم دمای بدن با دمای بیرنی برادیمتابلیسم به معنی تغییر همسی نرخ متابلیسم با تغییرات دمای محیط پیرامن میباشد. در سی مقابل مجدات خنگرم از فرایندهای همرفت تشعشع تبخیر در پراکندن دمای بدن خد استفاده مینمایند. زمانی که دمای محیط خارجی نسان میکند ریان تانایی تنظیم هماهنگ نمدن خد با تغییرات شرایط دمایی را ندا زیرا این مکانیسمها در ریان تعریف نشدهاند. بنابراین میتان بیان نمد که ریانها به اسطه مکانیسم برادیمتابلیسم سعی در تنظیم دمای خد در ماجه با تغییرات دمای محیط خاهند داشت همانند آنچه که در مجدات خنس اتفاق میافتد. افیش در دمای محیطی می- تاند منجر به افیش متابلیسم ریان شده متعاقبا کاهش در دمای پیرامنی میتاند منجر به کاهش نرخ متابلیسم ریان شد. به طر نسبی میتان بیان نمد که ریانها در مقایسه با سایر گنههای سللی انرژی بیشتری مصرف مینمایند; اما آیا باشت ماد مغذی تسط ریانهایی که در شرایط برنتنی رشد مینمایند نسبت به ریانهایی که در شرایط درنتنی درن لله تناسلی رشد مینمایند متفات میباشد مشخص شده است که تحمل دمایی بین ریانهای گنههای مختلف چهارپایان متفات میباشد )13( این نکته باعث پیشنهاد تنع ژنتیکی در برابر تنظیم دما تسط ریان میشد. مشخص شده است که در گا تفاتهای ژنتیکی میتاند به عنان یکی از مهمترین عامل منجر به ایجاد مقامت در ریان دربرابر آسیبهای حاصل از استرس گرمایی به حساب آید در نهایت منجر به نجات ریان از ضعیت ایجاد شده در پی استرس گرمایی شد. ریانشناسان معمال تمامی دسترزیها فعالیتهای صرت گرفته در آزمایشگاه ری ریانهای مش را در دمای اتاق انجام میدهند. حفظ دمای بدن به طر جدی سرسختانه در زمان انجام دسترزیهای م نیاز در آزمایشگاه ری ریانهای مش از جمله انجام عمل پیپت کن دسترزیهای میکرسکپی در حقیقت منجر به کاهش تانایی تکین ریان میشد. اما این مشاهدات به نسبت جدید بده مطالعاتی که به صرت تجربی ری استفاده از دمای بهینه به منظر کارکن در شرایط آزمایشگاهی با ریان متمرکز شده باشند به نعی نظهر میباشند. تشکر یژه برای کارهای انجام شده تسط Henry Leese باید در نظر ectothermy poikilothermy bradymetabolism conduction convection piprtting micromanipulation 6

13 3 32 گرفت که فشار تمرکز کار خد را بر پایه "فرضیه ریان بیتفات " قرار داده بد. این تئری کنجکاانه به نعی بیان میک که ریان زنده پیای پستانداران متابلیسم ساکنتری نسبت به ریانهایی که در یکی از مراحل تکین متقف میشند دارا هستند )11(. متعاقبا این نکته که ریانهای زنده مقدار کمتری اکسیژن ماد مغذی را در مقابل ریانهای آسیب دیده م مصرف قرار میدهند م بحث قرار گرفت. زیرا مشخصا ریانهای زنده نیازی به مصرف زیاد انرژی جهت ترمیم فعالیتهای آسیب دیده سللی ندا. در مقابل ریانهایی با قدرت زندهمانی کمتر به نظر میرسد که بیشتر متحمل آسیبهای سللی آسیبهای ا شده به DNA میشند در نتیجه این آسیبها منجر به افیش نیاز به فرایندهای انرژیخاه ترمیمی یا آغاز 30 رند مرگ برنامه ریزی شده سلل میشد. چنین فعالیتهایی نیازمند افیش باشت ماد مغذی میباشد که منعکس کننده افیش نرخ متابلیسم میباشد. جالب تجه این نکته است که فرایندی مشابه این اتفاقات ذکر شده در ریان پستاندارارن قابل 39 مشاهده در قسمت نک مریستمی ریشه گیاهان میباشد که با نام سللهای تمایز نیافته ابتدایی شناخته میشند. در مرکز ناحیه راسی مریستم ریشه بین ناحیه کامبیم کالهک ریشه ناحیهای جد دا که فعالیت میتیک سللها در آن ناحیه به 14 شدت کاهش یافته است به این ناحیه "منطقه ساکن " میگیند که به ضح مشخص شده است که فعالیت متابلیکی آن کاهش یافته است )13(. اسپرماتزا در ناحیهای از بدن تشکیل میشد که دمای آن حداقل 4 تا 2 درجه سانتیگراد پایینتر از دمای هسته مرکزی بدن است. استرس گرمایی )به عنان افیش در دما تعریف شده است( به عنان عاملی مختل کننده برای رند اسپرماتژنز شناخته میشد. جالب تجه است که فلیکلهای تخمدانی نیز هماره در دمایی حداقل 2 درجه پایینتر از دمای بدن حضر دارند )12(. به عاله لله فالپ دارای یک سیستم تنظیم دمای پیچیده میباشد به طر کلی خنکتر از دمای هسته مرکزی بدن است. درخرگش تفات دمایی بین دمای هسته مرکزی بدن با ناحیه ایستمس آمپال به ترتیب 2 4/ درجه سانتیگراد پایینتر گرش شده است. Leese همکاران )10( ادعا نمدهاند که کاهش دما در ناحیه ایستمس ممکن است ایفاگر نقش در نگهداشتن اسپرم در ضعیت غیرفعال قبل از قع فعال شدن اسپرم انجام لقاح در ناحیه آمپال باشد. پیشنهاد شده است که اسپرم نسبت به این شیب دمایی حساس بده این شیب دمایی منجر به تسهیل عبر اسپرمها از ناحیه ذخیره آنها به ناحیه لقاح میشد )19(. تاکنن هیچ مطالعهای در م دما شیب دمایی در لله فالپ انسان گرش نشده است اما میتان فرض نمد که اندازههای دمایی دامنهها مشابه آنچیزی باشد که در سایرگنهها جد دا. بنابراین به نظر میرسد که به طر معمل گامتهای انسان در دمایی در حدد 4 تا 3 درجه سانتیگراد پایینتر از دمای هسته مرکزی بدن قرار دارند. همچنین ادعا شده است که دما لله فالپ در زمان تخمک ریزی بعد از آن بازهم پایینتر میآید. آیا این ما منجر به کمتر شدن فعالیت متابلیکی گامتها ریان در مرحله کلیاژ میشد برخی دادهها به نظر میرسد که بحث ایجاد شده تسط Leese را تایید حمایت میکنند. این داده شامل مطالعاتی هستند که نشان دادهاند کشت ریان در شرایط برن تنی با در نظر داشتن دمای 30 درجه سانتیگراد مختل شده این دما به نعی به عنان عامل استرس عمل مینماید. این نکته اقعا قابل تجه است که چگنه چرا کارهای کمی در زمینه تحقیقات پیرامن کشت دسترزی ریانهای پستانداران در دمایی پایینتر از دمای هسته مرکزی بدن تاکنن به انجام رسیده است. ریانهای بیشتر پستانداران م استفاده در ریههای آزمایشگاهی در دمای معمل 30 درجه سانتیگراد به مدتی که ریانها در محیط کشت قرار داده میشند نگهداری شدهاند. تنها استثنا در این م گا میباشد ریان گا در دمای 39 تا 38 درجه سانتیگراد نگهداری میشد. اضح است که حامیان فلسفه "بازگشت به 12 طبیعت " در علم ریانشناسی تجربی به بازنگری این عامل مهم مثر در ریه کشت برنتنی ریان بپازند. Quiet embryo hypothesis apoptosis meristem cambium cap quiescent Back to nature 7

14 بهینهسازی تنظیم ph در خن آب ج ریان در زیستشناسی شیمی ph به عنان غلظت ین هیدرژن در نظر گرفته میشد به عنان مقیاسی برای سنجش مین اسیدی یا بازی بدن یک محلل استفاده میشد. آب خالص در دمای 23 درجه سانتیگراد با ph معادل 0 به عنان یک محلل خنثی در نظر گرفته میشد. زمانی که ph به مقادیر کمتر از 0 برسد محلل اسیدی زمانی که به باالی 0 برسد محلل به عنان محللی بازی یا قلیایی تعریف میشد. ایده ph برای الین بار تسط یک شیمیدان با نام Danish در سال 4818 معرفی استفاده شد )18(. زمانی که ا سرپرست آزمایشگاه Calsberg در کپنهاگ دانمارک بد. این جنبه اساسی بنیادی فیزیلژی در ااسط صده 4911 میالدی به عنان یکی از نتایج غیرمستقیم مطالعات J.C. Jacobsen مسس Carlsberg Brewery که بنیانگذار آزمایشگاه Carlsberg با هدف پیشرفت در زمینه بیشیمی مرتبط با تخمیر بد به حساب میآید! شاید خد ا هم مقدار کمی نسبت به اهمیت آغاز این ایده نین تاثیر شگرف آن در بسیاری از زمینههای بیلژی پزشکی آگاه بد. استفاده پیشرفته از عالمت ph بعد از مشخص شدن ابستگی پتانسیل الکتریکی سللها به فعالیت آنها تا ابستگی آن به غلظت ین هیدرژن آغاز شد. در یک محلل ph یک تقریب است نه اینکه معادل p(h) باشد لگاریتم منفی غلظت ین هیدرژن حل شده ( + H) به نعی بیانگر ph است; مقدار پایین ph بیانگر فراانی ین هیدرژن است درحالی که مقدار باالی ph نشان دهنده غلظتهای پایین ین هیدرژن میباشد. این لگاریتم منفی با تعداد عدد اعشاری بعد از عدد صحیح تطبیق دا. بنابراین زمانی که ریانشناسان قصد تعریف نمدن ph بهینه برای افیش بازده کلینیکی را دارند تغییر به اندازه 1/4 بین دامنه 0/4 0/1 در نظر گرفته میشد. کی ماده بازی باید در یک محیط آبکی حل شد تا منجر به باالرفتن ph محیط شد. این اتفاق باعث خنثی شدن ینهای هیدرژن میشد. ph خن به گنهای تنظیم میشد که در محدده 0/13-0/33 حفظ شد در نتیجه میتان بیان نمد که ph خن تا حدد اندکی قلیایی میباشد. ینهای هیدرژن متمایل به برقراری تقابل با دیگر ماد مجد در یک محلل هستند که در نتیجه میتانند پتانسیل الکتریکی خانده شده تسط دستگاه ph سنج را تحت تاثیر قرار دهند اصلی که ریانشناسان به شدت با آن آشنا میباشند. به عنان نتیجهگیری میتان بیان نمد که phمیتاند به اسطه قدرت ینی ماد در یک محلل تحت تاثیر قرار گی در نتیجه محیطهای کشت ریان نیاز به تنظیمات متفاتی برای مقدار ph دارند. بدن پستانداران دارای مکانیسمهای متفاتی هستند که به اسطه آنها از انحرافات ph به خارج از محدده عملکی بهینه خن بدن جلگیری به عمل میآرند. این مکانیسمها شامل اسیدکربنیک-بیکربنات-دی اکسیدکربن )31( سیستم بافری فسفات میباشد البته پرتئینها نیز دارای تاثیرات بافری میباشند. سیستم بافری خن به جزییات تسط Lawrence Henderson در سال )34( 4819 شرح داده شد. ا معادلهای را پیشنهاد نمد که در آن از بافر اسیدکربنیک به عنان بافر محلل استفاده شده بد. Hasselbalch بعدها دباره این فرمل را به صرت لگاریتمی بیان نمد که در نهایت منجر به تلید فرمل Henderson-Hasselbalch شد. مفهم سیستم بافری بیکربنات برای تمام ریانشناسان مفهمی کامال آشنا میباشد. این سیستم در حقیقت مثرترین پیاترین سیستم بافری فیزیلژی در پستانداران میباشد. در این سیستم دی اکسید کربن ( 2 )CO با آب ترکیب شده منجر به تلید اسیدکربنیک میشد ( CO H( این اسید متعاقبا به ین هیدرژن بیکربنات ( 3 - )HCO تجزیه میشد. این ریه در سیستم خنی فیزیلژی حیانات بسیار مهم اساسی میباشد. این سیستم مدیریت کننده بسیاری از عدم تعادلهای رخ داده مقدار اسید بازی است که ممکن است به اسطه فرایندهای نرمال غیر نرمال فیزیلژی تلید شند. این سیستم همچنین مدیریت دی اکسیدکربن را نیز تحت تاثیر قرار میدهد که در اقع محصل ید تنفس سللی میباشد. ریه پیای درگیر در حفظ ثبات این سیستم بافری مطابق اصل Le Chatelier فرمل مشهر زیر عمل میکند: CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 HCO 3 + H + اصل تعریف شده تسط Le Chatelier که یک قانن کیفی میباشد بیان میکند که یک سیستم شیمیایی در شرایط تعادل دچار تغییر میشد. سیستم شیمیایی متعادلی دچار تغییر شده به اسطه این تغییر مسیر اکنش شیمیایی در جهت جبران تغییر ا عمل میشد تا مقدار اصلی تغییر را به کمترین حد خد برساند. هر نع برهم خگی تعادل یک سیستم شیمیایی به 8

15 اسطه تغییر مسیر جهت اکنش شیمیایی جبران میشد. برای مثال اگر فی قصد اسیدی نمدن خن را به اسطه آد نمدن مقدار زیادی ین هیدرژن را داشته باشد برخی از آن ینهای هیدرژن با ین بیکربنات مزدج شده اسید کربنیک تلید میکند که در نهایت منجر به افیش خالص بسیار کچکی در مقدار اسیدیته خن میشد. در صرت عدم حضر این سیستم بافری انتظار تغییر زیادی در مین اسیدیته خن میرد. این سیستم بافری یک تنظیم کننده قدرتمند برای اسیدیته خن است که با سیستم جبران تنفسی به شدت مرتبط میباشد که در آن تغییرات تنفس تعدیل کننده مین CO 2 مجد در گش خن میباشد. د مطالعه مرری بسیار عالی اخیرا در زمینه ارتباط بین ph تاثیر آن ری تکین ریان در سالهای اخیر به انجام رسیده است )33 31(. مشابه با مطالعات انجام شده در زمینه پیایی دما در شرایط کشت برنتنی در 43 سال اخیر تجه کمی به تاثیر فیزیلژی تغییرات ph در رند ریانشناسی معطف بده است. بررسی مشکافانهای در این زمینه که اغلب م غفلت اقع شده است در فصل 41 این کتاب ارایه خاهد شد تنظیم حجم سللی اسمالریته ) ( Rene du Trochet پیر ) ( Lazzaro Spallanzani در سال 4921 چارچب اصلی تئری سللی در پی آن کشف پدیده اسمز که به معنی عبر آب از عرض یک غشای بیلژیکی بد را بنا نهاد. ا سیلهای با نام اسممتر ار طراحی نمد. این سیله شامل یک غشای جدا کننده د محفظه مج بد محفظه پایینی به سمت منبع ذخیرهای که با آب خالص به عنان مبنا پر میشد راه داشته محفظه باالیی از یک لله شیشهای حای مایع م آزمایش بد تشکیل میشد. بیشترین سطحی که در ستن شیشهای ایجاد میشد نشان دهنده فشار اسمزی بد. این اکتشاف اختراع بزرگ منجر به شناخت یکی از اصل فیزیکی شد که تا پیش از این ناشناخته بد با عنان اسمالریته شناخته میشد. اسمالریته حفظ ثبات در حجم سلل به طر گسته در فصل 3 با عنان "اجی محیط کشت: نمک اسملیتها" م بحث قرار گرفته است. اسمالریته مقدار فشاری است که به اسطه ماد حل شنده در فاز مایع از عرض یک غشای نیمهتراا اعمال میشد منجر به عبر آزدانه آب از عرض غشای مذکر شده درحالی که این غشای اجازه عبر جابهجایی به ماد حل شده در فاز مایع را نمیدهد. اسمالریته به تعداد اجی ماده حل شنده مجد در فاز مایع بستگی داشته اما هیچ ارتباطی با ذات نع ماده حل 13 شنده ندا. اگر د محلل حای غلظتهای یکسانی از ذرات حل شنده باشند به این دمحلل محللهای ایزاسمتیک میگیند. اگر یکی از محللهای مذکر دارای غلظتهای باالتری از ذرات حل شنده باشند در مقایسه با محلل دم که 11 محلل ضعیفتر است هایپراسمتیک میباشد. برعکس چناچه محللی در مقایسه با محلل دیگر دارای غلظتهای کمتری 13 از ذرات حل شنده باشد در مقایسه با محلل قیتر به عنان محلل هایپاسمتیک شناخته میشد. اگرچه اسماللیته به احد اندازهگیری دیگری اشاره دا لی تفات آن با اسمالریته بسیار جزیی بده این د احد قابل جایگزینی با یکدیگر 12 هستند. دامنه نرمال استاندا اسمالریته پالسمای خن انسان در حدد mosm میباشد. این اندازه به نعی هدایت کننده ریانشناسان کلینیکی به منظر تصمیم گیری برای مقدار اسمالریته بهینه برای محیطهای کشت ریان انسان بده است. بهینه سازی تجربی محیطهای کشت در طی 31 سال اخیر شامل کاهش مین اسمالریته افزدن اسیدهای آمینه به این محیطها به منظر تنظیم حجم سلل بده است. شرایطی که از تانایی ریان در کنترل حجم سللی ممانعت به عمل آ ممکن است منجر به تقف تکامل تکین ریان شد. در یک مطالعه مرری Baltz )12( Tartia نشان دادهاند که حفظ حجم سللی در شرایط برنتنی یکی از عامل کلیدی در تکین تکامل ریان به صرت طبیعی میباشد. تمایل به مطالعه مفهم اسمالریته در اایل دهه 4881 میالدی با تلید محیطهای کشت CZB SOM ربه افیش نمد. هر د این محیطهای کشت به طر یژه دارای اجی کامال مشابهی با محیطهای کشت تجربیتر مانند M42 میباشند. در مقایسه با isoosmotic hyperosmotic hypoosmotic milliosmolar 3

16 محیطهای کشت ابتدایی مانند M42 تنها د م به این محیطهای کشت افزده شد: اسیدآمینه گلتامین ماده کیالت کننده- ای با نام.EDTA جالب این بد که ه محیط کشت CZB SOM دارای اسمالریتههای پایینتری در مقایسه با محیط- های کشت الیه هستند مقدار اسمالریته محیطهای کشت ابتدایی در حد 281 mosm تنظیم شده است. اسمالریته SOM در حد 231 mosm اسمالریته محیط کشت CZB در حد 203 mosm تنظیم شده است. این کاهش در اندازه اسمالریته از 10 نظر فیزیلژیی به شدت معنی دار تاثیر گذار میباشد فعال شدن خدبهخدی سللهای تخم بالغ شده مش )خارج سازی 19 گیچه قطبی دم با تشکیل پیش هسته ماده( که به اسطه رقیق سازی محیط کشت M42 یا محیطهای کشت مشابه با آب با نرخ رقیقسازی 41 درصد که منجر به اسمالریته نزدیک به 221 mosm میشد شاهدی بر این ادعا میباشد )33(. اسمالریته کاهش یافته یکی از یژگی های ضرری محیطهای کشت بد که در نهایت مفق به غلبه بر مشکل تقف تکین ریان در مراحل الیه کلیاژ شد. بقا ریانها در شرایطی که مقدار اسمالریته در زمان کشت ریان به شدت باال میباشد شاید به دلیل غیاب برخی اسیدهای آمینه باشد که میتانند ریان را از آسیبهای احتمالی ایجاد شده به اسطه مقدار باالی NaCl محافظت نمایند. تاثیر چرک شدن سلل در ریانی که در معرض استرس فشار اسمزی باال قرار گرفته است ممکن است که به عنان یکی از دغدغههای ریانشناسی کلینیکی در نظر گرفته شده باشد به گنهای که نسل دم محیطهای کشت لقاح برن- تنی با کاهش در مقدار اسمالریته ماجه شدهاند )در مرجع شماره )12( بررسی شده است( تاثیر آلدگی محیطی عفنت آلدگیهای باکتریایی در محیط کشت سمیت ماد تجهیت استفاده شده در ریه کشت تلید برنتنی ریان که در تماس نزدیک با ریان گامتها میباشند تقریبا به صرت درهای در تمام آزمایشگاههای لقاح برنتنی به قع میپیندد. این اتفاق معمال در محیطهای تحقیقاتی رخ میدهد که تدابیر پیشگیری کننده از جمله قرار دادن فیلتر کربن فعال م تجه قرار نمیگی. ریانی که در شرایط برنتنی درحال رشد است فاقد سیستم دفاعی که در بدن یک مجد کامل مشغل به فعالیت است میباشد. قرار دادن ریان در معرض ماد مضر مجد در شرایط محیطی میتاند منجر به برز آسیب در رند تکین ریان شد. ریانها فاقد پست میباشند در نتیجه تانایی کنترل نمدن آلدگیهای مجد در ها را ندارند همچنین 18 فاقد ریه به منظر فیلتر نمدن ریزمجدات ماد ارگانیک ) 31 (VOC هستند همچنین فاقد کبد کلیه بده در نتیجه تانایی سمزدایی را ندارند. در نتیجه این مسئلیت به عهده طراحان آزمایشگاهها میباشد که مشکالت ممکن را پیش بینی نمده اقدامات پیشگیرانه برای جلگیری از قع این مشکالت را به عمل آرند. آنتی بیتیکها به منظر جلگیری از قع آلدگی- های باکتریایی م استفاده قرار میگیرند. استفاده از کیالت کنندهها از جمله EDTA نشان داده است که منجر به ارتقا تکین 34 ریانها میشد شاید این عمل را به اسطه حذف کاتین فلت سنگین در نتیجه کاهش تلید گنه اکسیژن فعال به انجام برساند )30(. حذف VOC با استفاده از سیستم مرکزی مستقل از جمله خط لله گاز که با فیلترهای پرشده از ماد اکسید کننده یا کربن فعال مشغل به حذف VOC هستند معمال میتاند در ارتقا تلید ریان مثر اقع شد. البته این سیستمها بیشتر در کلینیکها م استفاده قرار گرفته به ندرت در آزمایشگاههای تحقیقاتی م استفاده قرار میگی )39(. اغلب تصر میشد که فیلترهای HEPA تانایی حذف VOCها را داشته همانطر که تانایی حذف ذرات را دارا میباشد اما اندازه منافذ فیلتر HEPA بسیار بزرگتر از اندازه ملکلهای VOC میباشد. حذف VOC به عنان یکی از اجی تعیین کننده در کنترل کیفی آزمایشگاهها تنها نزدیک به 43 سال است که م تجه قرار گرفته است البته به دلیل مشکالت اقتصادی هنز اسباب م نیاز 32 برای انجام مطالعات اساسی جدید در این زمینه را محدد نمده است. مشخص شده است که آکرلین که یکی از فراانترین egg Polar body microorgansim Volatile organic compound Reactive oxygen species acrolin 41

17 33 نع از آلدهیدهای مجد در دد سیگار آسفالت میباشد میتانند به طر جدی از ادامه رند تکین ریان مش انسان ممانعت به عمل آرند )38(. همچنین مشخص شده است که در شرایط مشخصی فیلتراسین ها به اسطه کربن فعال میتاند منجر به بد بازده تکین ریان شد )21(. افیش بهرهری چشمگیری در محیطهای کشت در سال 4832 حاصل شد زمانی که Whitten استفاده از آنتیبیتیکها در محیط کشت را مرسم نمد) 0 (. این مرحله مهم به همراه معرفی رشهای استریل در خالل دسترزی گامتها ریانها منجر به کاهش نرخ قع آلدگی در کشت برنتنی شد به گنهای که حتی قتی آلدگی در شرایط لقاح برنتنی در انسان رخ میداد بی شک منشا آن ریزمجدات حاضر در پالسمای منی بیماران آلده بد. سمیت اقعی آنتیبیتیکها در کشت برنتنی ریان هنز به خبی مشخص نشده است اگرچه تعداد کمی مطالعه به بحث در م باندیشی در استفاده از این ماد پاختهاند. در مطالعهای Magli همکاران )24( نشان دادند که کاهش غلظت آنتیبیتیکها در زمان انجام لقاح برنتنی در انسان منجر به افیش نرخ کلیاژ نشده است; اما زمانی که به طر کامل پنیسیلین استرپتمایسین از محیط کشت حذف شد تکین ریان به طر چشمگیری افیش یافت. در مطالعهای که در م ریان همستر انجام پذیرفت مشخص شد که استفاده همزمان از پنیسیلین استرپتمایسین منجر به تقف رند تکین ریان میشد )22(. اخیرا در مطالعهای نشان داده شدهاست که حذف پنیسیلسن استرپتمایسین از محیط کشت ریان مش منجر به کاهش نرخ آپپتزیس افیش یکپارچگی کرماتین شده است )23(. هر سه تیم تحقیقاتی مذکر حامی استفاده از تکنیکهای استریل به عنان جایگزینی برای آنتیبیتیکها میباشند. اما این گرشات فقط اثرات مضر استفاده از پنیسیلسن استرپتمایسین را نشان دادهاند که به همین دلیل نمیتان به طر کلی این نتیجهگیری را برای تمام آنتیبیتیکها در نظر گرفت. جنتامایسین یکی از آنتیبیتیکهای رایجی میباشد که در محیطهای کشت ریان م استفاده قرار میگی براساس دانش ما با در نظر داشتن مقدار استفاده معادل 41 µg/ml تاکنن اثر منفی بر تکین ریان برای آن گرش نشده است. به طر اساسی بهترین راه این است که ریانها را در شرایط عاری از آنتیبیتیک کشت نماییم اما در عمل این اتفاق تصیه ناپذیر است زیرا امکان انتقال باکتریها از مایع منی مایع فلیکلی آلدگیهای اتفاقی ایجاد شده در آزمایشگاه هماره جد دا تسعه پیشرفت ابرآالت مخصص ریان شناسی محفظهها در ااخر دهه 4811 میالدی Hammond الین نفری بد که فرایند کلیاژ هچ شدن بالستسیست بعد از کشت ریان در ظرف بسیار کچک که معال شامل للههای آزمایشگاهی بدند را مشاهده نمد )2(. ا به منظر کشت ریانها از 2-4 میلیلیتر محلل نمکی که با %3 سفیده تخممرغ غنی شده بد در شرایط گازی مجد در اتمسفر استفاده نمد. ریانها بعد از گذشت 2 رز م ارزیابی قرار میگرفتند. زمانی که ا از ریانهای 2 سللی مش استفاده مینمد برخی از این ریانها به مرحله 1 سللی تسعه مییافتند لی به مراحل بعدی تکین نایل نمیآمدند. ریانه یا رسیده به ااخر مرحله 1 سللی 9 31 سللی به مرحله بالستسیست تکین مییافتند حتی برخی از آنها از زناپلسیدا نیز خارج میشدند. لله آزمایشگاهی برای انجام رند لقاح برنتنی کشت ریان به منظر طی نمدن مراحل تکین به سیله برخی محققان کلینیکی الیه م استفاده قرار میگرفت. با اینکه گرههایی در استرالیا ارپا تا دهه 4881 میالدی از للهای آزمایشگاهی به این منظر استفاده می- 33 کند اما بعد از ترجیح دادن ظرف کشت به این منظر کشت ریان در زیر الیهای از رغن معدنی در کلینیک Hall در سال 4892 کارب للهآزمایشگاهی به طر سیعی به دست فرامشی سپه شد. فالسک Carrel به ندرت در کشت سلل تخم پستانداران م استفاده قرار میگرفت شاید معرفترین فی که از این سیله استفاده مینمد Pincus بده باشد )41(. این ظرف کشت به دلیل نام مخترع آن Alexis Carrel نامگذاری شد )21(. مزیت این ظرف در حجم کم آن که معادل 2-41 میلیلیتر بد همچنین امکان پرنمدن آن با گاز سپس مهر مم نمدن بد. Mintz یک بطری شیشهای که کارکن با آن tarmac Zona pellucida Petri dishe 44

18 بسیار سخت بد را طراحی نمد که در انکباترهای استاندا آزمایشگاهی قرار داده میشد. بطری م نظر به طر افقی قرار داده میشد در کف خد محلل بافر بیکربنات جای داده بد تا بتاند رطبت م نیاز را تامین نماید. ظرف ری یک صفحه کچک برای تمام مدت کشت قرار میگرفت خشککن یکی از جالبترین محلهای ذخیره ریان که به سیله پیشتان کشت ریان لقاح برنتنی م استفاده قرار می- گرفت دستگاه خشک کن بد. الین دستگاه خشک کن آزمایشگاهی از شیشه ساخته شده بد احدی قابل مهر مم شدن بد که معمال حای ماده جاذب رطبت بد به منظر حفاظت از مادی که به رطبت حساس بدند استفاده میشد. استفاده معمل از این خشک کنها برای حفظ ماد شیمیایی از گزند رطبت بد. ریان Leslie Brown دیگر ریانهای بدست آمده از بیماران درمان شده تسط Steptoe Edwards در Oldham )انگلستان( در دهه 01 میالدی در ظرف کشت یا للههایی که در خشک کنهای شیشهای که قطع صل میشد فاقد ماده جاذب رطبت بد نگهداری کشت میشدند. ظرف کشت ریانها ری صفحات استیل متحرک که چندین سانتیمتر از کف خشک کن فاصله داشتند قرار داده میشد )22(. سطح پشاننده به سیله گریس استفاده شده در کیم با کمترین مقدار سمیت مهر مم میشد. بعد از مهر مم نمدن خشککن با های حای %3 دی اکسید کربن پر میشد اگرچه مخلط گاز کم اکسیژن نیز م استفاده قرار میگرفت. شیر قطع صل خشک کن بالفاصله بعد از بستن درپش آن باز میشد تا های منبسط شده آد شد این فرایند به اصطالح تحت عنان "آرغ 30 زدن " شناخته میشد. عدم مفقیت در خرج گاز اضافی منجر به لغزیدن پشش خشک کن یا خرج گاز از دست دان مخلط گاز م نظر ایجاد تغییرات مضر در مین ph محیط میشد. از سی دیگر خرج زیاد از حد گاز به اسطه عمل آرغ زدن یا انجام آن به کرات منجر به افیش در مین ph میشد. در آمریکای شمالی برخی برنامههای لقاح برنتنی همچنان از این نع از رش کشت استفاده مینمایند )20(. هر زمانی که درب این خشک کنها گشده میشد خشک کن در معرض رطبت های اتمسفر قرار میگرفت. حفظ رطبت در زمانی که ریان بدن استفاده از رغن معدنی کشت میشد یکی از دغدغههای بزرگ کشت ریان میباشد. اما با استفاده از رغن معدنی رطبت به سرعت از بین نخاهد رفت پیپت پاستر معملترین سیلهای که در ریانشناسی تجربی م استفاده قرار میگی به نظر میرسد که پیپت پاستر یا سایل مشتق شده از آن باشد. این سایل اصال از للههای شیشهای کشیده شده به اندازهای که باریکترین قطر از آن بدست آید تلید میشند. پیپتهای شیشهای قبل از Louis Pasteur اختراع شده بد اما ا با معرفی نسخه جدیدی از آنها این سیله را معرف نمد که همچنان نیز م استفاده قرار میگی. به طر کلی میتان بیان نمد که تمام پیپتهای بهکار رفته در دسترزی جا- بهجایی ریزدسترزی ریان در آزمایشگاههای ریانشناسی به نعی از مشتقات پیپت پاستر میباشند. اگرچه استفاده از ریه پیپت نمدن به طر سیعی در ریانشناسی کلینیکی م استفاده قرار میگی دسترالعمل ثابتی به منظر انجام ریه پیپت نمدن مجد نیست نتایج مطالعات کلینیکی هنز به طر کامل جامع به انتشار نرسیده است. مطالعهای تسط Taylor همکاران )29( در بررسی تاثیر قطر نک پیپت در زمان لخت نمدن اسیتها به انجام رسیده است که نشان دهنده تغییر در مکان گیچه قطبی در ما استفاده از پیپت نازک بده است. Xie همکاران )28( نشان دادند که ژنهای شاخص مربط به استرس در ریانهای مش در اثر الگهای متفات پیپتینگ بیان میشند. Dessicator burping 42

19 پتری دیش پتریدیشها به عنان مکان مطلب برای رشد ریان در شرایط کشت برنتنی قبل از مقصد نهایی آنها که رحم یا تانک ازت مایع میباشد در نظر گرفته میشند. در حال حاضر در بیش از %88/8 از آزمایشگاههای ART از پتریدیشها استفاده میشد. تخمین زده میشد که بیش از 411 میلین پتریدیش تاکنن در آزمایشگاههای لقاح برنتنی م استفاده قرار گرفته است. علیرغم استفاده سیع از این ظرفها حتی در زمینههای تخصصی مانند کشت سللی بافتها میکرب شناسی مطالعات ریانشناسی پیش کلینیکی از 423 سال پیش تاکنن کمترین تغییرات در آن اعمال شده است. اما جنبههای فیزیکی کشت ریان در نهایت م بازنگری قرار گرفته است. یکی از زمینههای م عالقه خرج از سیستم کشت ثابت مانند آنچهکه در 39 کشت با استفاده از پتریدیش قابل انجام میباشد به سمت استفاده از سیستم ریزمحیطها میباشد )01( که به طر گستهتری تری در ادامه این کتاب م بررسی قرار میگی. گزینه دیگر که هم اکنن به اسطه بسیاری از کارخانهها رنمایی شده است شامل ارتقای کیفیت تقیت نقاط ضعف پتریدیشهای طراحی گذشته میباشد. این تغییرات شامل فراهم نمدن امکان قرار دادن ریانها درمکان های از پیش تعیین شده که منجر به بد ثبات دمایی افیش امنیت بد قابلیت مشاهده ریانها رشد ریانها به صرت گرهی است درحالی که امکان یابی بررسی انفرادی آنها را نیز فراهم میآ. طراحی تلید پتری- دیشها در ااخر قرن نزده تسعه یافت زیرا نیاز بخش مطالعات اکسن به داشتن ظرفی جهت کشت میکرارگانیسمها ری یک سطح جامد نسبت به کشت آنها در محیط آبکی مطلبتر مینمد. دانشمند پزشک مشهر آلمانی که جایزه نبل را نیز دریافت نمده بد به عنان استاد باکتریشناسی شناخته میشد Robert Koch )در سال 4813( الین نفری بد که پیشنهاد دهنده جایگزین ساختن فاز مایعی که در کشت باکتریها به طر معمل استفاده میشد با یک سطح جامد را مطرح نمد. مشکل در اینجا بد که دستیار دکتر کخ در استفاده از فالسکهای شیشهای با مشکل ماجه بد. نام دستیار کخ Julius Richard ) ( Petri بد. رزی در سال 4990 ا تصمیم گرفت که فالسک شیشهای را از سط به د نیم تقسیم کند فقط قسمت کف آن را که شامل محیط کشت جامد بد م استفاده قرار دهد. از یک سرپش شیشهای بزرگتر که ری آن قرار میگرفت نیز برای پشاندن قسمت حای کشت استفاده نمد به این ترتیب الین پتریدیش "دیده به جهان گشد". از نظر تقدم زمانی پتری الین کسی نبد که این سیله را اختراع نمده بد. حداقل 3 نفر دیگر نیز ادعا نمدند که 3 سال قبل از پتری این ظرف کشت را ابداع نمده بدند. مخترعین این ظرف را به طر مستقل از یکدیگر تلید نمده بدند اما فقط آقای پتری بد که از کار کن در معرفترین آزمایشگاه تجربی میکرب شناسی زمان خد بهره میب. شهرت سرپرست آزمایشگاهی که ا در آن کار میک باعث شد که نام ا بلند آازه شد در تمام آزمایشگاههای زیستشناسی در دنیا نام ا م استفاده قرار بگی! ظرف کشت مذکر ال تسط شیشه ساخته شد. در ااسط دهه 4821 میالدی فناری مدلسازی به اسطه تزریق ماد پلیمری به مین قابل تجهی تسعه یافته بد بنابراین امکان ساخت تلید ظرف پتری از پالستیک شفاف استریل پلی- 38 استرین فراهم شد. به هرری ظرف پتری ساخته شده از پالستیک کامال مشابه با الین ظرف پتری شیشهای بد. این ظرف بسیار بزرگ ضخیم حجیم بدند. زن آنها تقریبا دبرابر بیشتر از زن ظرف پتری معمل که در آزمایشگاههای امرزه مصرف میشند بد. اجرامی که قصد مشاهده آنها در زیر میکرسکپهای معکس قدیمی را داشتند به دلیل ضخیم بدن این ظرف نمیتانستند به دقت با ضح کامل مشاهده نمایند. بزرگترین مزیت این ظرف هزینه بسیار پایین تلید آنها بد مقامت آنها نیز در مقابل ظرف شیشهای که به آسانی میشکستند نیز بسیار حایز اهمیت بد. در ااسط دهه 4801 میالدی این مزیت در کاهش هزینه تلید ظرف پالستیکی پتری به دلیل گران شدن ماد الیه تلید شده بر پایه نفت نیز رنگ باخت قیمت تمام شده برای تلید ظرف پتری پالستیک به شدت افیش یافت. فشار تقاضای مشتریان باعث شد که کارخانهجات تلید این ظرف به فکر کم کن سایز ظرف زن آنها بیفتند تا بتانند هزینه تمام شده تلید را کاهش دهند. در ااسط دهه 4891 میالدی تسعه ب شتی ر در فراری ماد خام فهم بهتر از رشهای تزریق پالستیک این امکان را برای اکثر کارخانهها microfluidics Polystyrene plastic 49

20 فراهم نمد که بتانند زن این ظرف پتری را بین 43 تا 40 گرم برسانند. این ظرف پتری جدید نازک به نسبت بدن تغییر باقیماند اگرچه ظرف کشت مخصص به منظر انجام مطالعات ریانشناسی کلینیکی امکان مشاهده بهتر کاهش زمان الزم 21 برای انجام تنظیمات جهت شرع آزمایش را فراهم مینماید )04 02( تغییرات اخیر در ظرف کشت لقاح برنتنی یکی از مهمترین اقدامات به سمت کشت ریان به شیهای که هم اکنن م استفاده قرار میگی به اسطه مطالعات انفرادی دانشمندی با نام Ralph Brinster تسعه یافت. در سال 4823 ا مفق به کشت ریان مش تا مرحله بالستسیست شد )43(. ا تصمیم گرفت پا را فراتر نهاده به اسطه کشت "باز" حفاظت از محیط کشت با استفاده از سیال شفاف غلیظ که بتاند ر ی محیط کشت قرار بگی از تبخیر تغییر محیط کشت جلگیری به عمل آ این کار را به سرانجام برساند. به این منظر ا از رغن پارافین استفاده نمد. این سیستم از رشی که کخ با استفاده از کشت ری سطح جامد استفاده مینمد منجر به اختراع تلید ظرف پتری شده بد فاصله گرفت. میای الیه رغنی که در این رش استفاده میشد بیشمار به نظر میرسید. این الیه رغنی از ایجاد آلدگیهای میکربی جلگیری به عمل میآ اجازه میداد که رند لقاح برنتنی رشد ریان در شرایطی به نسبت آسدهتر به قع به پیندد. با این رش امکان مشاهده ریانها گامتها برای مدت طالنی بدن نگرانی از تبخیر شدن محیط کشت یا آلد شدن آن به سادگی فراهم میشد. همچنین این رش امکان مطالعه مقادیر اندک متابلیتهای آد شده یا جذب شده به اسطه سللها را فراهم میآ. همچنین این رش امکان دسترزیهای میکرسکپی مانند ICSI 24 را نیز فراهم نمد. ظرفیت گرمایی باالی رغن همچنین در حفظ دما در مقعی که ظرف کشت برای برای انجام ارزیابیها از انکباتر خارج شده در محیط آزمایشگاه قرار میگی نیز به محققین کمک میکند. برآ شده است که درحدد %81 از آزمایشگاهها کلینیکهای لقاح برنتنی با در نظر داشتن تغییرات بسیار جزیی از رشی که ابتدا تسط Bavister ابداع شد استفاده مینمایند )43(. تغییرات حاضر در این رش برخی ما اساسی مجد در این رش را بیان مینماید: سمیت رغن نسانات آن که در هر بسته نسبت به بسته دیگر متفات است. مسئله تفات در کیفیت محتای هر بسته از رغن معدنی کماکان جد دا لی میتان این مشکل را با پیششستشی رغن با آب یا محیط کشت به منظر حذف عامل سمی به اجرا درآ. همچنین گازدهی رغن پیش از استفاده با %2- %3 2 CO میتاند مفید اقع شد منجر به ایجاد تعادل در رغن شد در غیر این صرت ظرف کشت میبایست قبل از استفاده به خبی به تعادل برسد میکرسکپ معکس اگر اختراع میکرسکپ معکس تسط J.L. Smith در سال 4932 در دانشگاه Tulane در لییزیانا )03( به قع نمی- پیست یقینا پیشرفت تسعه ریانشناسی تجربی کلینیکی بسیار آهستهتر از آن چیزی پیش میرفت که االن به آن رسیده- ایم. میکرسکپ معکس نعی میکرسکپ مرکب میباشد که منبع نری کندانسر آن در مکانی معکس با آنچه در میکرسکپهای معمل قرار داشت تعبیه شده بد )منبع نری کاندنسر درباالی صفحه میکرسکپ قرار دا( نر به سمت پایین نشانه گرفته شده است. نمنه م مطالعه برجک عدسیها در زیر صفحه قرار دادن نمنه تعبیه شده به سمت باال نشانه گرفته شدهاند. این نع مقعیت سازی تجهیت امکان مطالعه بافتهای ته نشین شده سللهای زنده که در ته ظرف کشت قرار گرفتهاند را فراهم میآ. میکرسکپ معکس در دسترزیهای میکرسکپی نیز به کار میرد جایی که فضای مجد در قسمت باالیی نمنه به منظر کارکن برای دستکاریهای ظریف م نظر تعبیه ابر میکرسکپی نیاز است. تسعه تکامل شرایط کشت سللهای جنسی ریانها بدن تلید این نع از میکرسکپ امکانپذیر نمیشد هم Setup Intracytoplasmic Sperm Injection Inveryed Microscope 41

21 اکنن یژگیهای استاندای ری این نع از میکرسکپها در آزمایشگاههای ریانشناسی با لنزها دربینها ابر نری پیچیده تجهیز شده است خالصه از منظر تاریخی مشخص شده است که تمام جنبههای سیستمهای کشت محیطهای کشت قابلیت بد بیشتر را دارا میباشند. اگرچه محیطهای کشت ابرآالت شرایط محیط پیرامنی به مقدار برجستهای در طل 31 سال اخیر پیشرفت حاصل نمده است این بد ممکن است بیشتر به دلیل نتایج حاصل از استاندا نمدن کنترل کیفی باشد تا طراحیهای جدید. بین دانشمندان علم پایه کلینیکی تفاهمی جد دا که ارتقای بیشتر ریه تنظیم ph بد اسمالریته دما به عنان نیازهای اساسی این زمینه باید م تجه قرار گیرند این مسئله باید منجر به کاهش استرس احتماال کاهش نرخ متابلیسم ریانها شد. این تغییرات فقط به اسطه تحقیقات هدفمند با استفاده از حیانات مختلف مدلهای کلینیکی مختلف تسهیل خاهد شد. منابع 4. Ringer S (4992) Concerning the influence exerted by each of the constituents of the blood on the contraction of the ventricle. J Physiol Lond 3: Ringer S (4993) A further contribution regarding the influence exerted of the different constituents of the blood on the contraction of the heart. J Physiol (Lond) 1: Locke FS, Rosenheim O (4810) Contributions to the physiology of the isolated heart. The consumption of dextrose by mammalian cardiac muscle. J Physiol 32: Tyrode MV (4841) The mode of action of some purgative salts. Arch Int Pharmacodyn Ther 21: Krebs A, Henseleit K (4832) Untersuchungen über die Harnstoffbildung im tierköper. Z Phys Chem 241: Hammond J Jr (4818) Recovery and culture of tubal mouse ova. Nature 423:29 0. Whitten WK (4832) Culture of tubal ova. Nature 400:82 9. McLaren A, Biggers JD (4839) Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature 492: Whitten WK (4830) Culture of tubal ova. Nature 408: Pincus G, Enzmann EV (4831) Can mammalian eggs undergo normal development in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 21: Thibault C, Dauzier L, Wintenberger S (4831) Etude cytologique de la fecondation in vitro de l oeuf de la lapine. C R Seances Soc Biol Fil 419: Chang MC (4838) Fertilization of rabbit ova in vitro. Nature 491(Suppl 0): Brinster RL (4823) A method for in vitro cultivation of mouse ova from two-cell to blastocyst. Exp Cell Res 32: Brinster RL (4829) In vitro culture of mammalian embryos. J Anim Sci 20(Suppl 4): Whittingham DG (4804) Culture of mouse ova. J Reprod Fertil Suppl 41: Hoppe PC, Pitts S (4803) Fertilization in vitro and development of mouse ova. Biol Reprod 9: Rieger D (4882) Relationships between energy metabolis m and development of early mammalian embryos. Theriogenology 30: Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD, Lewis JL, Torres I (4898) An improved culture medium supports development of randombred 4-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 92: Tervit HR, Whittingham DG, Rowson LEA (4802) Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J Reprod Fertil 31:

22 21. Ménézo Y (4802) Milieu synthétique pour la survie et la maturation des gamètes et pour la culture de l oeuf fécondé. Comptes Rendus Acad Sci Paris 292 Serie D: Quinn P, Warnes GM, Kerin JF, Kirby C (4891) Culture factors in relation to the success of human in vitro fertilization and embryo transfer. Fertil Steril 14: Gardner DK, Leese HJ (4881) Concentrations of nutrients in mouse oviduct fl uid and their effects on embryo development and metabolism in vitro. J Reprod Fertil 99: Gardner DK, Lane M (2112) Development of viable mammalian embryos in vitro : evolution of sequential media. In: Cibelli JB, Lanza RP, Campbell KHS, West MD (eds) Principles of cloning. Academic, Amsterdam, pp Summers MC, Biggers JD (2113) Chemically defined media and the culture of mammalian preimplantation embryos: historical perspective and current issues. Hum Reprod Update 8: Lawitts JA, Biggers JD (4884) Optimization of mouse embryo culture media using simplex methods. J Reprod Fertil 84: Lawitts JA, Biggers JD (4882) Joint effects of sodium chloride, glutamine, and glucose in mouse preimplantation embryo culture media. Mol Reprod Dev 34: Erbach GT, Lawitts JA, Papaioannou VE, Biggers JD (4881) Differential growth of themouse preimplantation embryo in chemically defined media. Biol Reprod 31: Summers MC, Bhatnagar PR, Lawitts JA, Biggers JD (4883) Fertilization in vitro of mouse ova from inbred and outbred strains: complete preimplantation embryo development in glucose-supplemented KSOM. Biol Reprod 33: Ho Y, Wigglesworth K, Eppig JJ, Schultz RM (4883) Preimplantation development of mouse embryos in KSOM: augmentation by amino acids and analysis of gene expression. Mol Reprod Dev 14: Summers MC, McGinnis LK, Lawitts JA, Raf fi n M, Biggers JD (2111) IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Hum Reprod 43: Biggers JD, McGinnis LK, Raf fi n M (2111) Amino acids and preimplantation development of the mouse in protein-free potassium simplex optimized medium. Biol Reprod 23: Biggers JD, McGinnis LK, Lawitts JA (2111) Enhanced effect of glycyl- l -glutamine on mouse preimplantation embryos in vitro. Reprod Biomed Online 8: Summers MC, McGinnis LK, Lawitts JA, Biggers JD (2113) Mouse embryo development following IVF in media containing either l -glutamine or glycyl- l -glutamine. Hum Reprod 21: Liu Z, Foote RH (4883) Development of bovine embryos in KSOM with added superoxide dismutase and taurine and with five and twenty percent O 2. Biol Reprod 33: Liu Z, Foote RH, Simkin ME (4882) Effect of amino acids and alpha-amanitin on the development of rabbit embryos in modi fi ed proteinfree KSOM with HEPES. Mol Reprod Dev 13: Weston AM, Wolf DP (4882) Differential preimplantation development of rhesus monkey embryos in serum-supplemented media. Mol Reprod Dev 11: Machaty Z, Day BN, Prather RS (4889) Development of early porcine embryos in vitro and in vivo. Biol Reprod 38: Zhou Y, Galat V, Garton R, Taborn G, Niwa K, Iannaccone P (2113) Two-phase chemically de fi ned culture system for preimplantation rat embryos. Genesis 32: Biggers JD, Racowsky C (2112) The development of fertilized human ova to the blastocyst stage in KSOM (AA) medium: is a two-step protocol necessary? Reprod Biomed Online 3: Biggers JD (4889) Reflections on the culture of the preimplantation embryo. Int J Dev Biol 12: Hammer RE (4889) Egg culture: the foundation. Int J Dev Biol 12: Baltz JM, Tartia AP (2141) Cell volume regulation in oocytes and early embryos: connecting physiology to successful culture media. Hum Reprod Update 42: Hernandez-Ceron J, Chase CC Jr, Hansen PJ (2111) Differences in heat tolerance between preimplantation embryos from Brahman, Romosinuano, and Angus breeds. J Dairy Sci 90:

23 11. Leese HJ (2112) Quiet please, do not disturb: a hypothesis of embryo metabolis m and viability. Bioessays 21: Clowes FAL (4832) Localization of nucleic acid synthesis in root meristems. J Exp Bot 0: Grinsted J, Kjer JJ, Blendstrup K, Pedersen JF (4893) Is low temperature of the follicular fluid prior to ovulation necessary for normal oocyte development? Fertil Steril 13: Leese HJ, Baumann CG, Brison DR, McEvoy TG, Sturmey RG (2119) Metabolism of the viable mammalian embryo: quietness revisited. Mol Hum Reprod 41: Bahat A, Tur-Kaspa I, Gakamsky A, Giojalas LC, Breitbart H, Eisenbach M (2113) Thermotaxis of mammalian sperm cells: a potential navigation mechanism in the female genital tract. Nat Med 8: Sörenson SPL (4818) Enzymstudien. II. Über die Messung und die Bedeutung der Wasserstof fi onkonzentration bei enzymatischen prozessen. Biochem Z 24: Delory GE, King EJ (4813) A sodium carbonate- bicarbonate buffer for alkaline phosphatases. Biochem J 38: Henderson LJ (4819) Concerning the relationship between the strength of acids and their capacity to preserve neutrality. Am J Physiol 24: Hasselbalch KA (4840) Die Berechnung der Wasserstoffzahl des Blutes aus der freien und gebundenen Kohlensäure desselben, und die Sauerstoffbindung des Blutes als Funktion der Wasserstoffzahl. Biochemische Zeitschrift 09: (From Wikepedia) 33. Pool TB (2111) Optimizing ph in clinical embryology. Clin Embryologist 0: Swain JE (2141) Optimizing the culture environment in the IVF laboratory: impact of ph and buffer capacity on gamete and embryo quality. Reprod Biomed Online 24: Kaufman MH, Surani MA (4801) The effect of osmolarity on mouse parthenogenesis. J Embryol Exp Morphol 34: Van Winkle LJ, Haghighat N, Campione AL (4881) Glycine protects preimplantation mouse conceptuses from a detrimental effect on development of the inorganic ions in oviductal fl uid. J Exp Zool 233: Olson SE, Seidel GE Jr (2111) Reduced oxygen tension and EDTA improve bovine zygote development in a chemically de fi ned medium. J Anim Sci 09: Cohen J, Gilligan A, Esposito W, Schimmel T, Dale B (4880) Ambient air and its potential effects on conception in vitro. Hum Reprod 42: Hall J, Gilligan A, Schimmel T, Cecchi M, Cohen J (4889) The origin, effects and control of air pollution in laboratories used for human embryo culture. Hum Reprod 43(Suppl 1): Merton JS, Vermeulen ZL, Otter T, Mullaart E, de Ruigh L, Hasler JF (2110) Carbonactivated gas fi ltration during in vitro culture increased pregnancy rate following transfer of in vitro -produced bovine embryos. Theriogenology 20: Magli MC, Gianaroli L, Fiorentino A, Ferraretti AP, Fortini D, Panzella S (4882) Improved cleavage rate of human embryos cultured in antibiotic-free medium. Hum Reprod 44: Zhou H, McKiernan SH, Ji W, Bavister BD (2111) Effect of antibiotics on development in vitro of hamster pronucleate ova. Theriogenology 31: Liu J, Tang S, Xu W, Wang Y, Yin B, Zhang Y (2144) Detrimental effects of antibiotics on mouse embryos in chromatin integrity, apoptosis and expression of zygotically activated genes. Zygote 48: Carrel A (4842) On the permanent life of tissues outside of the organism. J Exp Med 43: Mintz B (4821) Synthetic processes and early development in the mammalian egg. J Exp Zool 430: Edwards RG, Steptoe PC, Purdy JM (4891) Establishing full-term human pregnancies using cleaving embryos grown in vitro. Br J Obstet Gynaecol 90: Reed ML, Hamic A, Thompson DJ, Caperton CL (2118) Continuous uninterrupted single medium culture without mediu m renewal versus sequential media culture : a sibling emb ryo study. Fertil Steril 82:

24 29. Taylor TH, Chang CC, Elliott T, Colturato LF, Kort HI, Nagy ZP (2119) Effect of denuding on polar body position in in-vitro matured oocytes. Reprod Biomed Online 40: Xie Y, Wang F, Puscheck EE, Rappolee DA (2110) Pipetting causes shear stress and elevation of phosphorylated stress-activated protein kinase/jun kinase in preimp lantation embryos. Mol Reprod Dev 01: Suh RS, Phadke N, Ohl DA, Takayama S, Smith GD (2113) Rethinking gamete/embryo isolation and culture with micro fl uidics. Hum Reprod Update 8: Rieger D, Schimmel T, Cohen J, Cecchi M (2110) Comparison of GPS and standard dishes for embryo culture: set-up and observation times, and embryo development. In: 41th world congress on in vitro fertilization & the 3rd world congress on in vitro maturation, Montreal, QC, Canada, pp (Abstr. P4212) 02. Ebner T, Shebl O, Moser M, Mayer RB, Arzt W, Tews G (2141) Group culture of human zygotes is superior to individual culture in terms of blastulation, implantation and life birth. Reprod Bio med Online 24: Smith J (4932) The inverted microscope a new form of microscope. Am J Sci Arts 41:

25 فصل 2 استفاده از مدلهای حیانی تسعه کشت ریان انسان: جندگان در مدت زمان سال گذشته پیشرفتهای حاصل شده در کشت کلینیکی ریان انسان به اسطه تحقیقاتی که ری ریانهای حاصل از جندگان گنههای اهلی حیانات بده است جمعآری شده است. مش به عنان گنهای ابتدایی در ارتقای یافتههای مرتبط با کشت ریان به حساب میآید. معیارهای متعددی در آغاز نمدن یک آزمایش درخالل انجام آن به 23 کار گرفته میشد همچنین عامل متعددی به عنان معیار نقطه پایانی آزمایش فراهم کننده شدتها تفاسیر نتایج با قدرت یا پیچیدگیهای مختلف نقش آفرین میباشند. بحث بررسی غیر جامع پیرامن این معیارها با تاکید در طراحی آزمایش به منظر بدست آن بیشترین قدرت در تفسیر نتایج در آزمایش جهت تعیین نمدن برتری ضعف یا یکسان بدن شرایط کشت ریان مش نسبت به گره کنترل ارایه میشد. همچنین دادههایی که در اینجا ارایه شدهاند نشان دهنده ضعف ذاتی در بیش- تفسیر نمدن یافتههای حاصل از دادههای بین آزمایشهای مختلف در مقایسهها احتیاط در تبدیل نتایج م انتظار از کشت ریان گنه مش به گنه انسان میباشند. در نهایت "ماد رشها یادداشتها" به بحث پیرامن مراحل مهم م استفاده قرار گرفته در کار با ریان مش به عنان یک سیله زیست-سنجی فارغ از اینکه آیا این ما با تمرکز بر کنترل کیفی یا در بد شرایط کشت به کار میرد یا خیر میپازد مقدمه از ااسط تا ااخر دهه 4831 میالدی سه گره تحقیقاتی مستقل گرشهای شاخص برجستهای از تانایی باررسازی اسیت جندگان )4( کشت ریان جندگان )3-4( تلید نتاج طبیعی از این ریانهای کشت شده )4 2( ارایه دادند. این 21 کارهای تحقیقاتی در زمانی انجام گرفت که محیطهای کشت تعریف شده شیمیایی جانشین اجداد خد محیطهای کشت 23 زیستی که حای مایعات زیستی با ترکیبات شیمیایی ناشناس بدند شده بد. محیطهای کشت تعریف شده برای کشت ریان 22 محللهایی هستند که از آب به همراه اجیی با ترکیبات شناخته شده غلظتهای مشخص از ریز محیط طبیعی که ریان در زمان تکین از مرحله ابتدایی بعد از لقاح تا رسیدن به مرحله بالستسیست با آن ربر میشد قابل بازتلید برای دفعات مکرر میباشند حداقل به طر نسبی تلید میشند. استفاده از محیطهای کشت تعریف شده شیمیایی در کشت ریان فراهم آرنده میای بیشماری در سالهای بین 4831 تا 4801 به سمت فهم نیازهای ملزم جهت تکین ریان در مراحل پیش از النه- گزینی ریان پستانداران بده است. اگرچه از محدده این مطالعه مرری خارج است لی بحثی شیا مفصل از نظر ریداد نگاری پیش از این ارایه شده است )1(. کارهای تحقیقاتی الیه انجام شده در زمینه تکین برنتنی ریان مش درحالی انجام 20 شد که الزم بد با مشکل تقف تکین در مرحله 2 سللی دست پنجه نرم میکند )3(. درحالی که محققین تانایی کشت ریان 2 سللی مش تا رسیدن آن به مرحله بالستسیست را داشتند اما این امکان برای کشت ریان 4 سللی تا مرحله بالستسیست امکانپذیر نبد. این مسئله به نعی مبین نقش ایداکت در فراهم نمدن ریزمحیط بسیار اختصاصی بیهمتایی بد که برای حمایت از تانایی تکین یگت تا مرحله بالستسیست الزم میباشد. در حمایت از این فرضیه آزمایشهایی با استفاده از کشت بافت ایداکت به انجام رسید که تانایی غلبه بر مشکل تقف تکین در مرحله 2 سللی رسیدن به مرحله بالستسیست را از خد نشان میداد )3(. مطالعات بیشتر در این زمینه نشان داد که این تقف تکین به نعی ابسته به سیه مش میباشد )2( افزدن گلتامین / یا EDTA به محیط کشت میتانست منجر به غلبه بر این مشکل شد )0 9(. End point Defined media Biological media microenvironment -cell block 43

26 درحالی که پیشرفتهایی در زمینه اجی مجد در محیطهای کشت ریان تانست باعث غلبه بر مشکل تقف سللی شد این مطالعات در دهه میالدی به نکتهای اشاره مینمد که محیط کشت ریان پستانداران در مراحل پیش از النه- گزینی متعادل نیستند در حقیقت فاقد ترکیب بهینه برای حمایت از تکین ریانها میباشند. این نکته منجر به شکلگیری سنگ بنای تحقیقاتی شد که تسط دکتر John Brigger به انجام رسید این آزمایشها به عنان بخشی از برنامه تحقیقاتی 29 انجمن ملی در لقاح برنتنی گنههایی غیر از انسان بررسی تکامل این ریانها درمراحل پیش از النه گزینی بد که تسط 28 مسسه ملی سالمت کدکان تکامل انسان در سالهای حمایت مالی میشد. دکتر Biggers با کارب رش متناب بهینهسازی ساده شده مفق به تلید محیط کشت بهینهای شده که برای کشت ریان مش در مراحل پیش از النه- گزینی م استفاده قرار میگرفت. این محیط با نام SOM سپس با نام KSOM شناخته شد. نسخه مشابهی از محیط کشت برای کشت ریان انسان م استفاده قرار گرفت )8(. پیش بینی اینکه آیا این محیط کشت اقعا محیطی مناسب برای کشت ریان انسان میباشد یا خیر بسیار سخت است. بسیاری از محیطهای کشت دیگری نیز برای ریان انسان تلید شد که تانایی حمایت از تکین ریان مش را داشت. بدن درنظر گرفتن اینکه از سیستم مدل کشت ریان مش که تانایی تکین ریان مش تا مرحله بالستسیست را دا به منظر بهینهسازی محیط کشت برای کشت ریان انسان استفاده شد یا اینکه به چشم شاخصی برای کنترل کیفی آزمایشگاه کلینیک تلید ریان انسان به آن نگاه شد )41( بسیار مهم است که تاثیر ترکیبی سیه مش همخن غیر همخن بدن محیط کشت را بتانیم شناسایی کنیم )44 42(. بیشتر کارخانههای تلید کننده محیط 02 کشت ریان انسان همچنین آزمایشگاههای لقاح برنتنی کشت ریان از ریان مش به منظر رشی برای سنجش )MEA( کنترل کیفی آزمایش سمشناسی نیز به منظر شناسایی نقصانه یا محیط کشت اجی آن سایل ریههای آزمایشگاهی استفاده میکنند )43-43(. بازده لقاح برنتنی ریان مش MEA به اسطه استفاده از سیههای متفات مش مانند CF4-hybrids, CBA/B2-F4 hybrids, C30BL2-F4/F2 hybrids, B2C3/D2F4-hybrids به طر چشمگیری متفات میباشد )44 40( این م یکی از مهمترین مسایلی است که به خصص در زمانی که محقق نیاز به جمع- بندی در خصص بهترین ریه کشت برنتنی ریان بر اساس گرشهای مختلف دا باید در نظر داشته باشد. فاکتر ابتدایی دیگر که باید در استفاده از MEA به منظر تسعه یا آزمدن محیط کشت کنترل کیفی آزمنهای سمیت سنجی در نظر گرفته شد مرحله آغازین تکین ریان است که در آن کشت یا در معرض قرار دادن ریان آغاز میشد. در مطالعهای که تسط Quinn همکاران به انجام رسیده است پیشنهاد شده است که ریان مش در مرحله 4 سللی در برابر سنجش کنترل کیفی سیستم کشت بسیار حساستر از ریان مش در مرحله 2 سللی است. به عاله این نیسندگان همچنین پیشنهاد نمده- اند که باید سنجش نرخ بالستسیستهایی که کامال هچ میشند را نیز م ارزیابی قرار داد )در ادامه بیشتر بحث میشد(. ریان ابتدایی در مقایسه با ریان در مرحله 2 سللی از جهات مختلف حساستر بده درگیر کمبدهای شدیدتری میباشد. در مقایسه شرایط غیر بهینه به یژه از لحاظ ph اسمالریته )49( همچنین تاثیر درصد اکسیژن در مخلط گاز م استفاده نیز حساسیت ریانهای 2 سللی نسبت به ریانها الیه کمتر میباشد )48(. به عاله گرش شده است که ریانهایی که فاقد الیه زناپلسیدا میباشند در مقابل شرایط نامناسب در مقایسه با ریانهایی که زناپلسیدا در آنها دست نخه آسیب ندیده باقی مانده است از خد اکنش بیشتری نشان میدهند به نعی حساستر میباشند )21(. این گرشات همانند سایر گرشات نشاندهنده اهمیت ماد آغازین حساسیت MEA به فاکترهای مجد در رش سنجش م نظر میباشد. همانطر که در باال اشاره شده انتخاب نقطه پایانی سنجش تکین ریان هم میتاند به طر معنی داری تفسیر نتایج را تحت تاثیر قرار دهد. نرخ تکین ریان به عنان پیشرفت مرحله تکامل ریان از نقطه A به نقطه B در یک بازه زمانی مشخص محاسبه می- شد. بنابراین رای تیمارهای مقایسهای اعمال شده منشا ریانهای بدست آمده از نظر اینکه متعلق به چه سیهای باشد National Cooperative Program on Non-Human In Vitro Fertilization National Institute of Child Health and HumanDevelopment inbreeding outcrossing Mouse embryo assay (MEA) 21

27 اینکه این سیهها همخن ناهمخن هستند آغاز شدن مرحله تکین مدت زمان کشت ریان دسته بندی استفاده شده در ارزیابی ریان نیز از اهمیت یژهای برخار است. چنین دسته بندیهایی شامل تکین کامل بالستسیست / یا نرخ بالستسیستهایی که به عنان بالستسیستهای الیه کامل تسعه یافته در حال هچ شدن یا کامال هچ شده میباشد. همچنین میتان به عنان یکی دیگر از معیارهای ارزیابی کل سللهای یک بالستسیست را نیز م شمارش قرار داد ) ( اینکار با تفکیک نمدن پراکنش سللهای بالستسیست به د بخش مجمعه سللهای درنی (ICM) سللهای ترفکتدرم به اسطه رنگآمیزی افتراقی )23( امکانپذیر میباشد. همچنین پیشنهاد شده است که صرف رسیدن به مرحله بالستسیست نمیتاند به عنان شاخصی جهت ارزیابی رش کشت یا هرگنه تغییر یا تیمار اعمال شده در رند کشت ریان م اعتماد اقع شد بلکه بهترین معیار در حقیقت نرخ النه گزینی تسعه ریان بعد از انتقال جایگزین شدن در رحم تبدیل آن به ریان در نظر گرفته میشد )22 21(. در نهایت از دیگر نقاط نهایی م ارزیابی که فراهم کننده جزییات پیرامن سیستم کشت م آزمن اقع شده میباشد شامل بیان ژنها )23( متابلیسم )22 20( بیان ژنهای )29 imprinte 28( میشد. مستقل از اینکه کدام یک از نقاط پایانی برای ارزیابی ریان م استفاده قرار میگی محقق باید در نظر داشته باشد که احتیاط الزم در م مقایسات داخلآزمایشات در نظر گرفته شده است. اگر محققی به منابع علمی مراجعه نماید درمی- یابد که گرشات بسیار اندکی جد دا که تمام معیارهایی را که قبال ذکر شده است کامال ثابت نگهداشته تنها یکی از ما را م تغییر قرار دهد. به همین دلیل اجب میباشد که تحقیقات در زمینه محیطهای کشت سیستمها یا پلتفرمها شامل مقایسات با استانداهای طالیی بین آزمایشها به درستی انجام کنترل شد )22( ماد در محتای این مطالعه مرری زیست سنجی به اسطه استفاده از ریان مش در ارزیابی محیطهای کشت تغییر تبدیلها در سیستمهای کشت به منظر شناسایی ماد سمی یا کیفیت نامناسب ماد م استفاده در ریه کشت برنتنی ریان م استفاده قرار گرفته است. این رش سنجش به عنان راهی به منظر کنترل کیفی شرایط کشت استفاده شده در آزمایشگاه- های کشت ریان انسان م استفاده قرار میگی. در ادامه ماد مدر نیاز رشه یا به کار رفته نکات مهم به منظر شفاف- سازی در نحه بهکارگیری این رش زیست سنجی ارایه شده است. همانطر که در همه ما دیگر نیز صادق است رش ارایه شده در اینجا فقط یکی از چندین رش مجد برای انجام این ریه زیست سنجی میباشد )31( ماد شیمایی / محیطها 4( 01 PMSG 2( 03 hcg 3( محیطی که بتاند ph پایداری را در شرایط مجد در فضای باز حفظ نماید )محیطهای 02 جمع آری محیط بافری هیپس محیط کشت بافری.)MOPS این محیطها معمال حای منبع پرتئینی یا دیگر ماد 00 رکنشگر میباشد 1( محیطی که بتاند ph پایداری را در شرایط مجد در انکباتر حفظ نماید )محیط کشت محیط بافری شده با بیکربنات(. این محیطها معمال حای منبع پرتئینی یا دیگر ماد رکنشگر میباشد. ممکن است ترجیح داده شد که این محیط های کشت با یک الیه رغن معدنی که به منظر کشت ریان پستانداران م ارزیابی قرار گرفته است استفاده شد ه( منبع پرتئینی )سرم آلبمین گای سرم آلبمین انسانی یا دیگر زیست ملکلهایی که یژگی رکنشگری را برای محیط کشت فراهم نمایند(. Inner cell mass (ICM) Pregnant mare serum gonadotropin Human chorionic gonadotropin HEPES-buffered surfactant 24

28 تجهیت 4( پتریدیش یکبار مصرف 33 میلیمتری دارای رتبه کشت سللی 2( سرنگ سزن برای تزریق به مشها )معمال از سرنگ تبرکلین 4cm 3 با سزن سایز 23 G استفاده میشد( 3( تجهیت الزم به منظر کالبد شکافی )قیچی پنس قیچی iris پنس ظریف ساعت سازی( 1( سزن تزریق زیر جلدی 31 G به طر 4 اینچ سرنگ 4cm 3 به منظر شستشی ایداکتها 3( پیپت ظریف به منظر جابهجایی ریانهای مش سایل آزمایشگاهی 4( میکرسکپ تشریح با صفحه حرارتی )30 درجهسانتیگراد( 2( صفحه حرارتی )30 درجهسانتیگراد( 3( انکباتر CO 2 ( با دمای 30 درجهسانتیگراد 3% CO 2 در شرایط گازی اتمسفر یا هر مین دیگر از CO 2 که بتاند به کمک سیستم بافری مجد در محیط کشت ph را در دامنه 0/23-0/33 حفظ نماید. یا استفاده از انکباتری که مقدار اکسیژن را در سطح %0-3 CO 2 %3 به همراه %81-99 گاز نیترژن نگهدا تصیه میشد( حیانات مشهای نر ماده نسل ال از سیه C: 3 B 2 به منظر MEA م تصیه هستند )31(. این سیه از مشها به دلیل پاسخ دهی به نسبت ثابت به گنادترپین با منشا خارجی آسان بدن دسترزی بازده قابل پیشبینی ثابت در نرخ تکامل برنتنی ریان م تصیه هستند. همانطر که پیشتر ذکر شده است سیههای متفات / یا سیههای تالقی شده ممکن است برای اهداف اختصاصی طراحی شده برای آزمایشهای خاص مناسبتر باشد رشها 4( تمامی مشها میبایست در شرایطی نگهداری شند که 42 ساعت رشنایی 42 ساعت تاریکی را رنه تجربه نمایند غذای استاندا آزمایشگاهی آب را بدن هیچگنه محددیتی در اختیار داشته باشند. مشهای ماده را میتان به صرت گرهی نگهداری نمد. تا 3 مش ماده را میتان در هر قفس به همراه هم نگهداری نمد. مشهای نر را باید به صرت انفرادی نگهداری ک )یادداشت 4 را مشاهده نمایید(. 2( به منظر فراهم نمدن محلل ذخیره هرمن گنادترپین 09 خشک شده منجمد را با آب دبار تقطیر یا محلل نمکی حل نمده به غلظت 411 IU/ml رسانده میشد )یادداشت 2 را مشاهده نمایید(. 3( مشهای ماده را بدن در نظر گرفتن مرحله چرخه فحلی انتخاب نمده م تزریق قرار میدهیم. مش- 08 های ماده باید با 3-41 IU از هرمن PMSG م تزریق قرار بگیرند این تزریق به صرت درن بطنی بین ساعت 3 2 بعد از ظهر انجام میگی. 19 ساعت بعد از تزریق PMSG مشهای ماده باید تسط 3-41 IU از هرمن hcg م تزریق قرار بگیرند این تزریق نیز باید به صرت درن بطنی باشد. )یادداشت 3 را مشاهده نمایید(. 1 (در زمان جفتگیری باید مشهای ماده را به قفس مشهای نر منتقل نمایید این کار نباید در جهت عکس انجام شد. 4 یا 2 مش ماده را به قفس حامل مش نر که بارری آن تایید شده است منتقل نمایید )یادداشت 1 را مشاهده نمایید(. 3( رز قبل از جمع آری ریانها محیطهای کشت جمع آری را آماده نمدهاند. ظرف کشت حای محیط میبایست حداقل 41 ساعت قبل از استفاده در انکباتر CO 2 قرار داده شد تا به تعادل برسد. 2( برای بدست آن ریانهای 4 2 سللی به ترتیب مشهای ماده میبایست 21 یا 32 ساعت بعد از تزریق hcg با عمل قطع نخاع قربانی شند. رش جمع آری ریانهای 4 2 سللی قبال به اسطه Hogan همکاران شرح داده شده است )34(. 0( اریانس معنی داری از نظر نرخ بارری تانایی تکین در مشها قابل انتظار است. به همین منظر تمام ریانها یا سللهای تخم بدست آمده از یک مش ماده باید تجمیع شده به طر مسای به تمامی گره- lyophilized intraperitoneally 22

29 های تیماری اختصاص یابد )یادداشت 3 را مشاهده نمایید(. 9( ریانهای مش باید به کمک میکرسکپ تشریح مشاهده شند این کار میبایست ری یک صفحه گرم حرارتی بعد از گذشت 21 ساعت از کشت ریان به انجام برسد )یادداشت 2 0 را مشاهده نمایید(. 8( با در نظر داشتن سیههای مش پیشنهاد شده در باال نرخ رسیدن ریانهای 2 سللی به مرحله بالستسیست هچ شده یا در حال هچ باید بیشتر از %03 باشد. اگر این نرخ پایینتر از %03 باشد سیستم شرایط کشت به عنان سیستم نامناسب در نظر گرفته میشد. تخم 4 سللی مدت زمان بیشتری برای رسیدن به مرحله هچ شدن نیاز دارند که با تجه به استانداهای ذکر شده مدت زمان م نیاز در حدد 82 ساعت میباشد..2-2 یادداشتها 4. تمام مشها باید حداقل یک هفته قبل از تزریق گنادترپین به محیط زندگیشان منتقل شده با آن تطبیق داده شده باشند. 2. محلل ذخیره هرمنی باید در اندازههایی تهیه شد که برای یکبار انجماد-یخگشایی در نهایت تزریق مناسب باشند. نباید گنادترپینها را دباره منجمد نمد. تمام هرمنی که بعد از یخگشایی مصرف نشده است را در ریخته استفاده مجدد نشد. الیکتهای گنادترپین را در دمای 91- درجه سانتیگراد ری بخار نیترژن یا درن نیترژن مایع نگهداری نمایید. گنادترپینها را در فریزر 21- یا فریزهای بدن برفک نگهداری نکنید. الیکتهای تلید شده از هرمن را فیلتر نکنید. 3. بالفاصله بعد از تزریق hcg مشهای ماده را ا قفس مشهای نر کنید. 1. فقط از حیاناتی استفاده نمایید که از نظر جنسی بالغ شده باشند )سن 2-9 هفته(; از مشهای ماده باالی 3 ماه سن مشهای نر باالی 9 ماه سن استفاده نشد. 3. برای کاهش اریانس ریانهای مش منجمدشده-یخگشایی شده میتانند برای استفاده در MEA استفاده شند. 2. احتیاط الزم برای کاهش زمان تماس ریان با شرایط محیط پیرامن در زمان بررسیهای ریان در نظر گرفته شد. قانن کلی در این زمینه بیان میکند که زمان خارج بدن ریان از انکباتر نباید بیشتر از 2 دقیقه باشد. تغییر در ph محیط کشت میتاند منجر به تخریب رند تکین ریان شد. به همین منظر پیشنهاد شده است که ریانها فقط در زمان پایان آزمایش م مطالعه قرار بگی. برای مثال 82 ساعت بعد از کشت تخم تک سللی یا با گذشت 02 ساعت بعد از کشت ریان 2 سللی. این انتخاب میتاند بسیار سدمند باشد اما حفظ رند ثابت در حین انجام آزمایش بین آزمایشهای مختلف نیز از اهمیت زیادی در انجام مقایسات برخار است. 0. ارزیابی ریانها در مقاطع زمانی ابتدایی یا با در نظر گرفتن فاصله زمانی کمتر از 21 ساعت ممکن است در سنجش نرخ تکین ریان به عنان یکی از معیارهای اضافه شده برای سنجش بازده سیستم مفید اقع شد. منابع 4. Chang M (4838) Fertilization of rabbit ova in vitro. Nature 483: McLaren A, Biggers J (4839) Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early embryos. Nature 492: Whitten W (4832) Culture of tubal mouse ova. Nature 400:82 1. Biggers J (4889) Re fl ections on the culture of the preimplantation embryo. Int J Dev Biol 12: Biggers J, Gwatkin B, Brinster R (4822) The development of mouse embryos in organ cultures of fallopian tubes on a chemically de fi ned medium. Nature 481: Whitten W, Biggers J (4829) Complete development in vitro of the pre-implantation stages of the mouse in a simple chemically defined medium. J Reprod Fertil 40: Chatot C, Ziomek C, Bavister B, Lewis J, Torres I (4898) An improved culture medium supports development of random-bred 4-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 92:

30 9. Abramczuk J, Solter D, Koprowski H (4800) The bene fi cial effect of EDTA on development of mouse one-cell embryos in chemically de fi ned medium. Dev Biol 24: Biggers J, Racowsky C (2112) The development of fertilized human ova to the blastocyst stage in KSOM(AA) medium: is a two-step protocol necessary? Reprod Biomed Online 3: Leibo S (4881) Ova and embryos for quality control in reproductive biology. Theriogenology 33: Dandekar P, Glass R (4890) Development of mouse embryos in vitro is affected by strain and culture medium. Gamete Res 40: Punt-van der Zalm J, Hendriks J, Westphal J, Kremer J, Teerenstra S, Wetzels A (2118) Toxicity testing of human assisted reproduction devices using the mouse embryo assay. Reprod Biomed Online 49: Wood C, Trounson A (4892) In vitro fertilization and embryo transfer. In: Bonnar J (ed) Recent advances in obstetrics and gynaecology. Chruchill Livingstone, Edinburgh, pp Ackerman S, Swanson R, Stokes G, Veeck L (4891) Culture of mouse preimplantation embryos as a quality control assay for human in vitro fertilization. Gamete Res 8: Quinn P, Warnes G, Kerin J, Kirby C (4891) Culture factors in relation to the success of human in vitro fertilization and embryo transfer. Fertil Steril 14: Rawlins R, Bassuray R, Binor Z, Rana N, Henig I, Radwanska E, Dmowski W (4893) Biological assay of culture media for human in vitro fertilization (IVF): differential effects of mouse strain and media. In : 14st Annual Meeting Americal Fertility Society, Chicago 40. Summers M, Bhatnagar P, Lawitts J, Biggers J (4883) Fertilizaton in vitro of mouse ova from inbred and outbred strains: complete preimplantation embryo development in blucosesupplemented KSOM. Biol Reprod 33: Davidson A, Vermesh M, Lobo R, Paulson R (4899) Mouse embryo culture as quality control for human in vitro fertilization: the onecell versus the two-cell model. Fertil Steril 18: Pabon J Jr, Findley W, Gibbons W (4898) The toxic effect of short exposures to the atmospheric oxygen concentration on early mouse embryonic development. Fertil Steril 34: Fleming T, Pratt H, Braude P (4890) The use of mouse preimplantation embryos for quality control of culture reagents in human in vitro fertilization programs: a cautionary note. Fertil Steril 10: Ebert K, Hammer R, Papaioannou V (4893) A simple method for counting nuclei in the preimplantation mouse embryo. Experientia 14: Heo Y, Cabrera L, Bormann C, Shah C, Takayama S, Smith G (2141) Dynamic microfunnel culture enhances mouse embryo development and pregnancy rates. Hum Reprod 23: Du F, Sung L, Tian X, Yang X (2112) Differential cytoplast requirement for embryonic and somatic cell nuclear transfer in cattle. Mol Reprod Dev 23: Arny M, Nachtigal L, Quagliarello J (4890) The effect of preimplantation culture conditions on murine embryo implantation and fetal development. Fertil Steril 19: Lane M, Gardner D (2113) Ammonium induces aberrant blastocyst differentiation, metabolism, ph regulation, gene expression and subsequently alters fetal development in the mouse. Biol Reprod 28: Biggers J, Whittingahm D, Donahue R (4820) The pattern of energy metabolism in the mouse oocyte and zygote. Proc Natl Acad Sci USA 39: Hardy K, Hooper M, Handyside A, Rutherford A, Winston R, Leese H (4898) Non-invasive measurement of glucose and pyruvate uptake by individual human oocytes and preimplantation embryos. Hum Reprod 1: Doherty A, Mann M, Tremblay K, Bartolomei M, Schultz R (2111) Differential effects of culture on imprinted H48 expression in the preimplantation mouse embryo4. Biol Reprod 22: Fernandez-Gonzalez R, Moreira P, Bilbao A, Jimenez A, Perez-Crespo M, Ramirez M, De Fonseca F, Pintado B, Gutierrez-Adan A (2111) Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mrna expression of imprinting genes, development, and behavior. Proc Natl Acad Sci USA 414: Gerrity M (4899) Mouse embryo culture bioassay. In: Wolf D, Bavister B, Gerrity M, Kopf GS (eds) In vitro fertilization and embryo transfer. A manual of basic techniques. Plenum, New York, NY, pp

31 34. Hogan B, Beddington R, Costantini F, Lacy E (4881) Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, NY 25

32 فصل 3 کارب مدلهای حیانی برای تسعه کشت ریان انسان: گنه حیانات اهلی اگرچه ریان مش به طر سیعی به عنان مدل حیانی برای مطالعه ابعاد مختلف کشت ریان انسان در مرحله پیش از النه گزینی م استفاده قرار میگی اما به نظر میرسد که استفاده از سایر مدلهای حیانی نزدیکتر به انسان برای تایید مطالعات ری مدلهای حیانی استفاده از آن در مدل انسانی معتبرتر باشد. اینجا به بررسی میا معایب استفاده از گنههای اهلی حیانات به عنان مدل در مطالعات تکمیلی برای تسعه بد کشت برنتنی ریان انسان پاخته خاهد شد. فرایند کشت برنتنی ریان همانطر که در گنههای مختلف از جمله گا گسفند بز خک شرح داده شده م مقایسه قرار گرفته است مقدمه به دلیل محددیتهای اخالقی مجد پیرامن انجام آزمایشات ری ریانهای انسان الزم به نظر میرسد که از مدل- های حیانی برای مطالعه مراحل ابتدایی تکین ریان همچنین تکامل رشهای آزماشگاهی به منظر پیشب ارتقای دانش پایه کاربهای کلینیکی بهره جست. هیچ گنه شک تیدی جد ندا که استفاده از مدلهای حیانی به مقدار قابل تجهی منجر به پیشرفت دانستهها فهم ما از علم پایه ریان شناسی رخدادهای تکین ریان در مراحل الیه پیش از النه گزینی شده است. در حقیقت پیشرفتهای حاصل شده در تلید محیط کشت لقاح برنتنی همستر به طر مستقیم منجر به انجام الین لقاح برنتنی در ریان انسان شد )4(. به هرحال محددیتهایی در م استفاده از مدلهای حیانی جد دا در این م میتان بیان داشت که مدلسازی عملک های پیچیده بیلژی مانند رند تکین ریان به خصص قتی که این رند احتماال تسط عامل محیط پیرامن تحت تاثیر قرار گرفته یا باعث پیچیدگی تفسیر تغییرات میشد بسیار مشکل خاهد بد. علیرغم این پیچیدگیها بحثهای زیادی پیرامن کارب حیانات اهلی مختلف به عنان مدلهایی برای مطالعه کشت ریان انسان جد دا. تا کنن هیچ اتفاق نظری پیرامن اینکه کدام مدل حیانی مناسبترین است بدست نیامده است زیرا هر مدل حیانی دارای مشابهتها تفاتها در مقایسه با عملک دستگاه تلید مثل انسان میباشد. به طر کلی ارتباط نزدیکتر فیزیلژی منجر به اعتبار کارب بیشتر نتایج بدست آمده از مدلهای حیانی در زمینه پزشکی انسان میشد استفاده از 91 تبارشناسی در انتخاب نع مدل حیانی به منظر نتیجه گیری برای استفاده در مطالعات انسانی میتاند مفید اقع شد )2(. 94 برای کشت ریان عامل فیزیلژی از جمله زمان شرع رشد فلیکلی تعداد فلیکلهای تخمکریزی که زمانبندی بلغ اسیت قع لقاح زمان بندی انتقال از ابستگی به ژنم مادر به سی فعال شدن ژنم ریان زمان الزم برای تشکیل بالستسیست از ریان هچ شدن ریان ایجاد ارتباط با بافتهای مادری تشخیص آبستنی نع النهگزینی همگی به عنان عامل مهمی هستند که باید در م انتخاب مدل حیانی مناسب برای مطالعه تکین ریان انسان در مراحل الیه تکین در نظر گرفته میشند متناسب بدن گنههای اهلی به عنان مدل برای ریان انسان مدلهای حیانات اهلی دارای بسیاری از میای برجسته مشخصی برای شبیهسازی تکین ریان انسان میباشند. در بسیاری از ما به دلیل کارب زیاد این پستاندارارن در کشارزی دانستههای ما درباره فیزیلژی دستگاه تلید مثلی این پستاندارارن بسیار زیاد میباشد. به عاله به دلیل اینکه این پستانداران به عنان مهرههای اساسی زنجیره غذایی استفاده می- شند اندام تناسلی این مجدات به مقدار فراان با قیمت بسیار پایین در دسترس میباشند. چن ماد به دست آمده پس از phylogeny follicular recruitment 26

33 کشتار دام را در این ما میتان م استفاده قرار داد تعداد زیادی ریان در شرایط برنتنی را با قیمت بسیار پایین با استفاده از ماد بدست آمده از کشتارگاه میتان تلید نمد. اگر ریانهای تلید شده در شرایط درنتنی نیاز باشد هر د نع رش جراحی غیر جراحی برای جمع آری ریان به خبی تسعه تکامل یافته است این پیشرفت نیز به دلیل ارزشمندی این 92 گنهها در کشارزی میباشد. بسیاری از بدجهها در دانشگاهها به نگهداری گلههای گنههای اهلی اختصاص داده شده است به طر یژه نگهداری گا شیری گا گشتی خک همچنین اسب گسفند به مقدار کمتری بز با اهداف کشارزی پزشکی م تجه میباشد. عملیات تلیدی معمال با تمایل به مشارکت در پرژههای تحقیقاتی به انجام میرسد. به طر کلی دسترسی به تعداد زیادی از حیانات اهلی به عنان حقیقتی مهم به عنان مدل حیانی مناسب میتاند به نسبت مفید باشد. یکی دیگر از محصالت جانبی اهلیسازی این گنه حیانات این است که گنههای اهلی با استفاده از تجهیت معمل قابلیت مدیریت دستکاری شدن به آسانی از خد نشان میدهند. نهایتا طل عمر بسیاری از این حیانات متعلق به گنههای اهلی در مقایسه با جندگان بسیار شبیهتر به انسان میباشد که شاید اهمیت بیشتر آن زمانی مطرح شد که نیاز به مطالعه تاثیر سن مجد در کیفیت قابلیت زندهمانی ریان گامتها احساس شد. به هرحال بخشی از تعیین کنندهترین اطالعات که باید ارزیابی شد شامل این نکته است که آیا ریان حیانات اهلی تانایی آگاهسازی ما در م رند تکین برنتنی ریان انسان را دارا میباشند یا خیر آیا ریان حیانات اهلی به مین کافی ارایه کننده شرایط ریان انسان در کلینیکهای لقاح برنتنی خاهند بد آیا ما میتانیم یافتههای حاصل از ریان حیانات اهلی در آزمایشگاههای تحقیقاتی را به صرت کاربی در کلینیکهای لقاح برنتنی انسان مرتبط سازیم به کار ببریم حتی یافتههایی که در ریه کشت برنتنی ریان حیانات اهلی برزدهنده اثرات بسیار مهم بزرگ هستند قبل از کارب در کلینیک- های لقاح برنتنی انسان میبایست به اسطه انجام آزمایشهای تصادفی م ارزیابی قرار بگیرند. این به دلیل نقش مهم تاثیرگذار هر نع دستکاری در شرایط برنتنی بر ری سالمت آینده نتاجی است که از آن ریان به جد خاهد آمد. طراحی اجرای درست آزمایشهای انجام شده با استفاده از مدلهای حیانی از اهمیت یژهای برخار میباشد که با ایجاد شرایط به نسبت تصادفی تعداد مناسب نمنههای انتخاب شده آنالیز آماری صحیح تفسیر نتایج بدن هیچ گنه تمایل انحراف برای تبدیل آنها به ریههای کلینیکی )2 3( انجام میشد. همچنین ما باید به ارزیابی این مسئله که آیا تمایز تفات ذاتی بین ریانهای بدست آمده از مدلهای حیانی ریانهای انسان که با آنها در کلینیکهای نابارری سرکار داریم جد دا یا خیر بپازیم. برای مثال بیشتر حیانات اهلی که ما با آنها کار میکنیم نابارر نمیباشند به معنی نابارری که ما در انسان تعریف کهایم. این تفات فقط محدد به مدل حیانات اهلی نمیشد. برای کاربی نمدن در ریانشناسی انسانی به صرتی که هم اکنن م استفاده قرار میگی شرایط ایدهآل تلید برنتنی ریان انسان باید با استفاده از اسیتهایی که در شرایط درنتنی با استفاده از مقادیر زیادی گنادترپین به منظر بیشتحریک نمدن رشد فلیکلها تلید شده از بدن ف خارج میشد انجام بگی. اما به دلیل فراهم بدن منبع اسیت حاصل از تخمدانهای بدست آمده از کشتارگاه ریه تلید برنتنی ریان با استفاده از گنه حیانات اهلی در این مرحله متفات از انسان میباشد. این اسیتها از فلیکلهایی که در مراحل 93 مختلف فرایند فلیکل سازی هستند جمعآری شده شاید ذاتا از بسیاری جهات از جمله سایز فلیکل متفات از فلیکل- های آماده تخمکریزی بعد از درمان با هرمنها بیش تحریک رشد فلیکلها در انسان باشد در نتیجه انتظار بر این است که کیفیت ریانهای به دست آمده از این د ریه کامال متفات باشد. اما با جد چنین محددیتهایی مهم است که به خاطر داشته باشیم چنین ریانهایی که با ریه تلید ریان از گنههای اهلی بدست میآیند تانایی تلید نتاج سالم را دارا میباشند )1(. دام ها باید در مراحل ابتدایی تا پایانی سن تلید مثلی خد باشند اما تلیدات کشارزی زمانی بهینه میباشند که از دامهای جان استفاده شد. در مقایسه با استفاده از مشهای همخن یا د رگه که به طر معمل در تحقیقات ریان شناسی استفاده میشد به کار گیری حیانات اهلی به عنان مدل مطالعاتی دارای میای خاصی میباشد که یکی از این میا شامل ناهمخن grants folliculogenesis 27

34 بدن هترژنس بدن این حیانات از نظر ژنتیکی بده ( به استثنای گاهای شیری( که به نعی منعکس کننده شرایط ژنتیکی در جامعه انسانی میباشد. اما این تشابه منجر به برز تغییرات زیادی میشد که ممکن است تفسیر نتایج بدست آمده را بسیار مشکل پیچیده نماید. در مقابل یکسانی باالی ژنتیکی مجد در مشهای همخن/درگه این امکان را برای محقق فراهم میکند که آزمایش را به گنهای طراحی اجرا نماید که کمترین اریانس در نتایج آن به جد آید اگرچه چنین نتایجی لزما قابلیت تعمیم داده شدن به جمعیت ناهمگن انسان را ندا. استفاده از گنه حیانات اهلی به عنان مدل برای مطالعات انسانی همچنین دارای نقص بزرگی از نظر کمبد اطالعات در زمینه تالییابی کل ژنم این مجدات در مقایسه با انسان مش میباشد. این نقصان یکی از معایب استفاده از حیانات اهلی به عنان مدل برای مطالعات انسانی محسب شده به 91 خصص قتی که هدف مطالعه بیان ژن در ریان با ریک استفاده از رشهای میکراری PCR کمی باشد. به هرحال این خال به سرعت در حال از بین رفتن میباشد. به عاله اگرچه دسترزی ژنتیکی در مش بسیار ساده آسان شده است انتقال هسته تکنیکهای سللهای بنیادی در حیانات اهلی به سرعت در حال پیشرفت میباشد که باعث ایجاد امکان دسترزیهای ژنتیکی شامل استفاده از رشهای ترانسژن نمدن حیانات از کار انداختن ژن فعال نمدن یک ژن شده است )3 2(. یکی از نقصهای ابتدایی استفاده از حیانات اهلی به عنان مدل مطالعاتی این نکته است که یافتههای حاصل از کشت برنتنی ریان برای انسان در درجه ال به تلد نتاج سالم زنده اهمیت میدهد. درحالی که متاسفانه استفاده سیع از این خرجی به عنان یکی از فاکترهای م مطالعه در حیانات اهلی به دلیل هزینههای باالی این گنه مطالعات هنز به خبی گسترش نیافته است. نهایتا به منظر به کار بن نتایج حاصل از مطالعات انجام شده به اسطه استفاده از مدلهای حیانات اهلی در لقاح برنتنی ریان انسان گرش نمدن انتشار نتایج تحقیقات مشابه با آنچه در آزمایشهای کلینیکی رخ میدهد میتاند برای محققین در کلینیکها آزمایشگاهها مفید اقع شد )3(. در م انتخاب هر یک از گنههای اهلی به عنان مدل تحقیقاتی برای رسیدن به حقایق مربط به کشت تکین ریان انسان در شرایط برنتنی میتان میا مضرات فیزیلژی مشخصی را به نفع یا به ضرر هریک از گنهها م بحث بررسی قرار داد. برای مثال گا اسب را میتان به عنان بهترین مدل گنههای اهلی نام ب. دلیل ارجحیت این د گنه تخمکریزی انفرادی در هر دره جنسی مشابه با انسان میباشد درحالی که گسفند بز در هر دره جنسی 3-4 فلیکل خک تا 21 فلیکل در هر دره جنسی آد میکنند. به هرحال زمانبندی انتقال از ابستگی به ژنم مادر به سی فعال شدن 90 ژنم ریان در اسب خک انسان مشابه بده )در مرحله 1 سللی( اما این اتفاق در گا بز گسفند در چرخه بعدی سلل یعنی مرحله 9 سللی به قع میپیندد )0(. در مقابل MZT در مش کمی سریعتر به قع میپیندد زمانبندی قع MZT در مش به گنهای است که در مرحله 2 سللی به انجام میرسد. بنابراین به نظر میرسد که در این م حیانات اهلی بیشتر با انسان مرتبط میباشند )9(. هیچ گنهای از حیانات اهلی از نظر زمانبندی تشکیل بالستسیست کامال مشابه با انسان نمیباشد اگرچه ریان خک به عنان گزینه نزدیک به انسان در نظر گرفته میشد. در انسان بالستسیست در رز )421 3 ساعت( بعد از کشت تشکیل میشد درحالی که در خک این زمان به 2 رز در نشخارکنندگان این زمان به حدد 0 رز )431 ساعت( می- رسد. تکین ریانهای مش در مرحله پیش از النهگزینی به مقدار قابل تجهی سریعتر میباشد به طری که تشکیل بالستکل را میتان بعد از گذشت 01 ساعت کشت در ریان مش مشاهده نمد ریانهای مش به طر معمل برای 1 رز کشت داده میشند )0(. به عنان بهترین مثال برای بحث بررسی پیری تلید مثلی انسان میتان از اسب به عنان مدل حیانی استفاده نمد زیرا اسب مانند انسان تک تخمکریزی کننده بده دارای آناتمی مشابه دارای فاز فلیکلی طالنی مدت میباشد همچنین طل عمر اسب نیز تا حددی در مقایسه با دیگر گنههای اهلی نزدیکتر به انسان میباشد )8(. بهعاله 99 چن اسب به عنان حیان همراه برای انسان محسب میشد نه حیانی که به عنان تلید کننده فراههای مصرفی microarray knockout Knock-in Maternal to Zygote Transition (MZT) companion 28

35 انسان در نظر گرفته میشد این امکان که یک اسب پیر به منظر انجام آزمایش بهتان یافت از احتمال یافتن یک گا پیر بیشتر میباشد. به هر ری به دلیل عدم کشتار اسب در کشتارگاهها در ایالت متحده آمریکا جمعآری اسیت لزما میبایست به اسطه استفاده از سنگرافی انجام شد ریه استاندا لقاح برنتنی برای اسب بسیار مشکل پیچیده بده سرعت ریه تکین ریان در مراحل پیش از النه گزینی نیز بسیار طالنی منحصر به ف میباشد )بیش از 4111 سلل بعد از گذشت 0 رز(. زمانی که تعیین گنه مدل حیانی به منظر مطالعه کشت ریان انسان از دید متابلیسم ریان مطرح میشد مقله متابلیسم به عنان مضعی تعیین کننده رخ مینماید به این دلیل که متابلیسم میتاند تعیین کننده تاثیر گذاری هر نع پیشرفت در تلید محیطهای کشت در نظر گرفته شد. ریانهای بدست آمده از گنههای مختلف به نسبت دارای نیازهای متابلیکی متفات میباشند. درحال حاضر دانش ما در این زمینه در رابطه با اکثر گنههای اهلی در مقایسه با ریان انسان بیشتر است دلیل این پیشرفت زیاد به ماهیت تهاجمی رشهای سنجش تعیین نیازهای متابلیک ریان باز میگد. تقریبا ثابت شده است که ریانهای اکثر گنههایی که تاکنن م مطالعه قرار گرفتهاند دارای متابلیسم پایینی برای گلکز به اسطه چرخه گلیکلیز مسیر پنتزفسفات در طل مراحل ابتدایی کلیاژ میباشند این ریانها برای تلید انرژی )ATP( بیشتر به رند فسفریالسین اکسیداتی با تکیه بر مصرف پیرات ابسته میباشند )41-48(. تنها استثنا در م این قانن کلی مربط به ریان خک میباشد که مقادیر زیادی گلکز در مراحل ابتدایی کلیاژ مصرف مینماید )24 21(. همزمان با رسیدن ریان به مرحله متراکم شدن تشکیل بالستکل مشارکت گلیکلیز باشت گلکز از محیط کشت افیش مییابد )22 48(. زمان انتقال از مرحله ابستگی به پیرات به مرحله ابستگی به گلکز بین گنههای مختلف متفات میباشد این تفات به نعی منعکس کننده درجه تسعه بالستسیست / یا طل مدت دره پیش از النه گزینی ریان میباشد. در این م ریان انسان حد اسط بین ریان مش ریان حیانات اهلی قرار گرفته است )48(. درباره مقدار اسیدهای چرب با منشا درند اسیت ریان گنههای حیانات اهلی دارای مقادیر بیشتری از این اسیدهای چرب در مقایسه با مش میباشند از نظر ریختشناسی ریان انسان از نظر شفافیت سیتپالسم بسیار مشابه ریان مش است. فراانی نسبی اسیدهای چرب خاص نیز باید م تجه قرار بگی 3 اسید چرب پالمتیک الئیک استئاریک به عنان فراانترین اسیدهای چرب در اسیت انسان گا خک گسفند شناخته شدهاند )21 23(. اینکه چه ارتباطی بین محتای درندی اسیدهای چرب با متابلیسم تلید انرژی جد دا هنز نامشخص است اگرچه شاهد زیادی جد دا که پیشنهاد مینماید انسان مش گنههای اهلی در زمان تکین پیش از النه گزینی به اسیدهای چرب به عنان منبع انرژی نیازمند میباشند )23-20(. نهایتا با در نظر داشتن ل سای خاص یا مکانیسمی در ریان فرایندهای خاص فیزیلژی در ریان انسان در مراحل تکین پیش از النه گزینی به اسطه استفاده از مدلهای مختلف حیانی به بهترین صرت ممکن مطالعه بررسی شده است. 98 این مکانیسمها یا ساالت میتاند در م اجی محیط کشت بیان ژن عملک پرتئین تنظیم پتانسیل احیا تسعه بالستسیست یا مجمعهای از دیگر عامل فیزیلژی باشند که استفاده از مدل حیانات اهلی به عنان مدل حیانی مرتبطتر با انسان در مقایسه با مش همچنین به عنان مدل حیانی مقرن به صرفه از نظر هزینه در مقایسه با پرایمتهای غیر از انسان برای مطالعه بر ری ریان انسان کاربهای کلینیکی در نظر گرفته شند. اگرچه تا به امرز تبادل نظر در م بهترین تحقیقات پایهای صرت گرفته است اما مدلهای حیانی نتانستهاند به عنان مدلهای بسیار مفید به منظر شبیه سازیهای پزشکی برای مطالعات انسانی در نظر گرفته شند )2( بهاسطه انتخاب با دقت بهترین مناسبترین مدل حیانی برای پاسخ دادن به هرگنه سال همچنین مشاهده راهنماهای آزمایشی سختگیرانه ما امیدار هستیم که به بهترین کاربری ممکن دست پیدا کنیم. همانند همیشه برای ممانعت از تعمیم دادن بیش از حد بین گنههای مختلف که به عنان مدل در نظر گرفته شدهاند دقت کافی باید در نظر گرفته شد. ممکن است که نیاز به تغییر انتظاراتی که سطح دانش امرزی ما را در م تکین ریان در گنه های مختلف تشکیل داده است احساس شد باید بپذریم که ممکن است ما هرگز به استنتاج دقیق از مدلهای حیانی به redox 23

36 سی انسان دست نخاهیم یافت اما میتانیم شاهد خبی برای مکانیسمهای هدف یا رشهایی که در نهایت به اسطه آزمایشهای کلینیکی در تنظیم کن لقاح برنتنی ریان انسان استفاده میشد دست یابیم ماد محیط کشت تمام غلظتهای ارایه شده بر اساس میلیمل مقادیری هستند که در محلل م استفاده نهایی جد دا. آب استفاده شده برای تمام محیطهای کشت دارای مقامت 49/2 mω با TOC کمتر از 31 ppb میباشد. تمامی ماد یکبار مصرف ظرف پالستیکی استریل از کمپانی BD Falcon تهیه شده در غیراین صرت نع برند آنها اشاره خاهد شد. فیلتراسین نهایی تمام محللهای ذخیره تهیه شده همچنین آمادهسازی محللهای کاری به منظر حفظ شرایط عاری از آلدگی با استفاده از رش- های استریل زیر هد المینار یا کابینتهای ایمن از نظر بیلژیکی تهیه شدهاند. تمام ظرف شیشهای استفاده شده در تهیه محللها برای کاربری تلید ریان اختصاص یافتهاند با اجاق در دمای 421 درجه سانتیگراد برای 1 ساعت استریل شدهاند. 84 بعد از استفاده ظرف شیشهای بالفاصله شسته شده بعد 0 مرتبه با آب RO 81 آبکشی شده 0 مرتبه با آب بیش خالص شسته شده بعد کامال خشک شده قبل از استریل نمدن مجدد با رق آلمینیمی پشانده میشند مایع ایداکتی سنتز شده 411 میلیلیتر محلل ذخیره شده SOF را با 03 میلیلیتر گلکز ذخیره شده 91 میلیلیتر محلل ذخیره HEPES 41 میلیلیتر اسیدهای آمینه غیرضرری فاقد گلتامین Biomedicals) (NEAA,,411x MEM; MP 21 میلیلیتر اسیدآمینه ضرری فاقد گلتامین Biomedicals) (EAA, 31x, MEM; MP 1/332 گرم 1/132 گرم سدیم پیرات 1/2013 گرم L-.fraction V BSA 1/2402 گرم آالنین-گلتامین 4 میلیلیتر جنتامایسین 4 گرم (MP Biomedicals, LLC) lactate امکان تعیض نمدن Fraction V BSA با 1/4 گرم الکل پلی ینیل (PVA) جایگزین شد تا SOF-HEPES-PVA ساخته شد به این ترتیب یک محیط کشت کامال تعریف شده تلید خاهد شد. حجم محلل را با استفاده از آب بیش خالص به 4111 میلی لیتر برسانید ph را در نقطه 0/33 تنظیم کنید سپس محلل را فیلتر نمده )قطر منافذ فیلتر 1/22 میکرمتر(. محلل را در دمای 1 درجه سانتیگراد برای مدت 4 ماه نگهداری نمایید )یادداشت شماره 4 را مشاهده نمایید(. محللهای ذخیره الزم برای تلید این محیط کشت عبارتند از: الف( محلل ذخیره پایه.SOF 39/201 گرم 3/311 NaCl گرم KCl 4/22 گرم KH 2 PO 1 1/882 گرم MgCl 2 2H 2 O 4/984 گرم CaCl 2 2/04 گرم.L-Lactate در 4111 میلی لیتر آب بیش خالص تهیه در ظرف 4 لیتری فیلتر شد )قطر منافذ فیلتر 1222 میکرمتر( در دمای 1 درجه سانتیگراد نگهداری شده در مدت 4 ماه مصرف شد. ب( محلل ذخیره گلکز. 3/2 گرم گلکز. در 4111 میلی لیتر آب بیش خالص حل شده فیلتر شده در دمای 1 درجه سانتیگراد برای مدت 4 ماه نگهداری شد. ج( محلل ذخیره.HEPES 3/839 گرم HEPES 1/48 گرم فنل قرمز در 4111 میلی لیتر آب بیش خالص محل شده با فیلتر 1/22 میکرمتری فیلتر شده در دمای 1 درجه سانتیگراد نگهداری شده در مدت 3 ماه مصرف شد محیط کشت مایع ایداکت سنتز شده تغییر یافته )28 29( محیط کشت تغییر یافته SOF در د نسخه تلید میشد. مرحله 4 2 برای کشت ریان در مرحله ابتدای کلیاژ بالستسیست به ترتیب در نظر گرفته شده است. مرحله : میکرلیتر آب بیش خالص 311 میکرلیتر SOF پایه به آین Reverse osmosis ultrapure 91

37 آب اضافه شد 311 میکرلیتر بیکربنات 311 میکرلیتر گلکز 31 میکرلیتر از هرکدام از محللهای پیرات آالنین گلتامین تائرین EAA NEAA EDTA 1/11 گرم BSA کریستتا نیز به آن افزده شد. این محلل را به حجم 3 میلی لیتر برسانید فیلتر نمایید )1/22 میکرمتر(. محللهای ذخیره م نیاز برای این محیط کشت در زیر ارایه شده است: 4.محلل ذخیره SOF پایه. قسمت قبل را مشاهده نمایید. 2.محیطهای ذخیره مکمل. هر محلل ذخیره باید به تنهایی با استفاده از 41 میلی لیتر آب بیش خالص تهیه شد. نیازی به فیلتر نمدن نیست. در دمای 1 درجه سانتیگراد نگهداری شد. الف( بیکربنات. 1/24 گرم NaHCO 3 4 هفته مدت زمان مصرف دا. ب(گلکز. 1/120 گرم گلکز 4 ماه مدت زمان مصرف دا. ج( پیرات. 1/1321 گرم سدیم پیرات 4 هفته مدت زمان مصرف. د( آالنین-گلتامین. 1/2402 گرم آالنین-گلتامین 4 هفته مدت زمان مصرف دا. ه( تائرین. 1/1423 گرم تائرین 4 ماه مدت زمان مصرف دا. ی(.EDTA 1/128 گرم EDTA 4 ماه مدت زمان مصرف دا محیط کشت )31( NCSU23 برای تلید 41 میلیلیتر محلل ذخیره NCSU32 1/11 گرم BSA کریستتا افزده شد سپس فیلتر شد )1/22 میکرمتر( )یادداشت 2 را مشاهده نمایید(. محللهای ذخیره م نیاز برای تلید این محیط کشت عبارتند از: الف( محلل ذخیره.NCSU23 1/233 گرم NaCl 1/1332 گرم KCl 1/1422 گرم KH 2 PO 1 1/1498 گرم CaCl 2 1/1281 گرم 1/2412 گرم MgSO 1 0H 2 O NaHCO 3 1/1240 گرم آالنین-گلتامین 1/114 گرم فنل قرمز در 411 میلی لیتر آب فق خالص حل شده فیلتر شد )1/22 میکرمتر(. در دمای 1 درجه سانتیگراد نگهداری شده در مدت 4 ماه مصرف شد رشها کشت برنتنی ریان گا بز گسفند خک در مرحله پیش از النه گزینی 4( ریان تک سللی باید بالفاصله در محیط کشت قرار داده شد چه بعد از بازیافت آن از درن بدن مادر در صرتی که لقاح درن تنی باشد چه در زمان مشخصی بعد از لقاح برنتنی )یادداشت 3-3 را مشاهده نمایید(. 2( قبل از انتقال به قطره- های کشت ریانها را 3 مرتبه در محیط کشت شستش نمایید. 3( شرایط انکباتر برای کشت ریان 39/0 درجه سانتیگراد به همراه %2 CO 2 %3 O 2 در یک محیط حای رطبت باید حفظ شد به جز در م ریان خک که باید در %2 CO 2 O 2 % 41 کشت داده شد. به طر معمل 41 ریان در هر قطره کشت 31µL پشانده شده با رغن معدنی کشت داده میشند )یادداشت شماره 9-2 را مشاهده نمایید(. در مقابل ریان انسان مش به طر معمل در در قطرههای 21µL در دمای 30 درجه سانتیگراد به همراه در نظر داشتن شرایط گازی %2 CO 2 %3 O 2 کشت داده میشند. 1( محیط کشت د مرحلهای )مرحله کلیاژ بالستسیست( به طر معمل برای گا گسفند بز استفاده میشد )یادداشت شماره 8 41 را مشاهده نمایید(. اگر از محیط کشت 2 مرحلهای استفاده میشد ریانهای کلی شده را بعداز گذشت 02 ساعت به محیط کشت مرحله 2 منتقل نمایید )گا گسفند بز( قبل از قرار دادن ریانها در محیط کشت مرحله 2 برای کشت نهایی باید 3 مرتبه ریانها با استفاده از محیط کشت مرحله دم شستش شند. در این زمان میبایست ریانها م ارزیابی داده باری برای نرخ کلیاژ قرار بگیرند این رک باری شامل شمارش تعداد ریان کلی شده که به قطره کشت مرحله 2 منتقل شده تعداد ریانهای 94

38 کلی نشده که برای ادامه کشت منتقل نخاهد شد باشد. 3( بعد از گذشت 429 از کشت )02 ساعت کشت در محیط مرحله 4 82 ساعت کشت در محیط کشت مرحله 2 برای گا گسفند بز( ریانها را از نظر تسعه تکامل بالستسیست درجه بندی کنید. اینکه هر ریان به چه مرحلهای رسیده است باید ثبت شد. ریانهای خک معمال در محیط کشت 4 مرحلهای کشت داده میشند بعد از گذشت 411 ساعت کشت م ارزیابی قرار میگیرند. ریانهایی که به مرحله مرالی متراکم شده یا بالستسیست میرسند باید رتبندی شند. ریان حیانات اهلی معمال از 4 تا 1 رتبه بندی میشند این درجه بندی بر اساس سیستم رتبه بندیSociety International Embryo Transfer انجام میشد )یادداشت شماره 44 را مشاهده نمایید(. 2( بعد از ارزیابی ریانها را میتان به منظر هر نع سرنشتی م استفاده قرار داد شامل انتقال به رحم حیان ماده پذیرنده اما این تنها گزینه نمیباشد رنگ آمیزی برای شمارش تعداد سللهای ICM ترفکتدرم به منظر بررسی غیر مستقیم کیفیت ریان یا منجمد نمدن سریع آنها به منظر بررسی ارزیابی بیان ژن یادداشتها 4- در زمان افیش حجم فیلتر نمدن SOF-HEPES با BSA حبابها میتانند مشکل ساز شند. اجازه دهید که BSA کامل به آرامی حل شد. محلل را به آرامی از کنار دیاره فالسک مدرج به داخل فالسک تخلیه نمایید. 2- تمام محیطهای کشت با استفاده از غشای PVDF تهیه شده از کارخانه Millipore بایستی فیلتر شند این فیلترها کمترین تمایل برای اتصال به پرتئین را دارا میباشد. همه محصلها از نظر سمیت برای ریان م آزمن قرار گرفته اند. ما برخالف سایر آزمایشگاهها که 2 میلیلیتر الیه محلل فیلتر شده که با استفاده از فیلترهای سرنگی تصفیه میشند را به منظر حذف ماد سمی احتمالی متصل به غشای فیلتر در نمیریزیم مدت زمانی )ساعت بعد از لقاح ) که ریانها بعد از لقاح به ظرف کشت منتقل میشند بین گنههای مختلف متفات میباشد: 49 hpi برای گا 2 hpi برای خک hpi برای بز 21 hpi برای گسفند. 1- تمام کارها باید با استفاده از میکرسکپ دارای صفحه گرم یا در نزدیکی منبع گرما انجام شد. 3- اگر ریانهای IVF شده از گا گسفند یا بز بدست آمدهاند الزم است که تمام ریانها قبل از انتقال به قطره 83 کشت عاری از باقیمانده سللهای کملس شند. در خک معمال اسیتها قبل از لقاح عاری از کملس میشند. این عمل معمال با استفاده از رتکس نمدن ریانها در 411 µl بافر HEPES به همراه 4 µl هیالرنیداز )غلظت نهاییw/v 1/14% U/mL یا 1/4( mg/ml برای مدت نزدیک به 2/3 دقیقه انجام میشد. نع محیط کشتی که برای فرایند بلغ برنتنی اسیتها استفاده شده است ممکن است در مدت زمان الزم برای عاری نمدن ریانها از سللهای کملس مثر اقع شد محیطهای بلغی که حای سرم میباشند معمال نیازمند مدت زمان طالنیتری برای رتکس کن عاری شدن اسیتها از کملس میباشند چن در این حالت سللهای کملس به شدت تسعه یافته چسبناک میشند. اگر سلل کملسی ری ریانی که به قطره کشت منتقل میشد باقی بماند ممکن است تشکیل دهنده کشت تک الیه سلل کملس را باعث شند. اگر اجازه تشکیل این تک الیه سللی داده شد امکان برقرار نمدن شرایط کشت کنترل شده جد نخاهد داشت. همچنین به منظر حذف سللهای کملس میتان از محلل هیالرنیداز به همراه عملیات پیپت نمدن چه با پیپت شیشهای چه با پیپتهای پالستیکی که به صرت تجاری مجد هستند استفاده نمد قطر نک پیپت باید از قطر زناپلسیدا کمی بزرگتر باشد. در این رش ریانها به سرعت به داخل پیپت کشیده شده با همان ریتم سریع از پیپت خارج میشد با تکرار این عمل تمام کملسها از زناپلسیدا جدا میشند. اما برای تعداد ریان زیاد این امر منجر به افیش زمان انتظار ریانها خاهد شد که مطلب نمیباشد. hours post insemination (hpi) denuded 92

39 2- محیط کشت ریان را میتان در آزمایشگاه تلید نمد یا به صرت اماده تهیه نمد. نمنههایی از محیطهای 81 کشت آماده برای خک شامل( 23 NCSU23 (North Carolina State University محیط کشت ریان خک برای گا گا گسفند بز محیطهای کشت مجمعه G مایع ایداکت سنتز شده (SOF) CR4aa یا KSOMaa به طر معمل م استفاده قرار میگیرند. بیشتر این محیطهای کشت از شرکتهایی که فراهم کننده نیازهای آزمایشگاهی گا انسان را فراهم میآرند قابل تهیه است. 0- رغنی که برای پشاندن قطره لقاح استفاده میشد یکی از اجی حساس تعیین کننده است که در سیستم کنترل کیفی آزمایشگاه باید م بررسی قرار گی. رغنهای معدنی استریل آزمده شده برای کشت ریان یا رغن پارافین به طر تجاری در دسترس قرار دارند. رغن باید در دمای بین 2 تا 9 درجه سانتیگراد نگهداری شد با رشهای استریل م استفاده قراربگی. ممکن است رغن م شستش قرار بگی این کار به منظر اطمینان از عدم حضر هرگنه ماده سمی انجام میشد رش اجرای ان به این صرت میباشد که رغن را با D-PBS مخلط نمده اجازه میدهیم که رغن این محلل در دفاز از هم جدا شند. الیکت های م استفاده از رغن باید ظرف با در نیمه باز در انکباتر قرار داده شد تا زمان الزم برای رسیدن به تعادل بعد از قرار دادن آن برر قطرات کشت به حداقل برسد. 9- ظرف م استفاده در کشت باید حداقل 1 ساعت قبل از استفاده آماده شده برای برقراری تعادل در انکباتر نگهداری شد. زمان خارج از انکباتر بدن ظرف کشت به منظر قرار دادن ریانها در قطرات کشت باید تا حد ممکن به کمترین زمان کاهش یابد. 8- ریانها در هنگام شستش انتقال به قطرات کشت باید به گنهای منتقل شند که کمترین مقدار محیط کشت را بین محیط شستش محیط کشت منتقل نماید. 41- برخی از ریههای آزمایشگاهی در مرحله دم کشت %41 ریان را گا را به محیط کشت اضافه میکنند تا نرخ تکین بالستسیتها افیش یابد. 44- مراحل رتبه بندی ریانهای حاصل از گنههای حیانات چهارپا در دسترالعمل IETS به آدرس زیر ارایه شده است.( منابع 4. Bavister BD (2112) How animal embryo research led to the fi rst documented human IVF. RBM Online 1(4): Wall RJ, Shani M (2119) Are animal models as good as we think? Theriogenology 28: van der Worp HB, Howells DW, Sena ES, Porritt MJ, Rewell S, O Collins V, CMacleod MR (2141) Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med 0:e Lonergan P, Fair T (2119) In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology 28: Keefer CL (2119) Lessons learned from nuclear transfer (cloning). Theriogenology 28: Prather RS, Shen M, Dai Y (2119) Genetically modi fi ed pigs for medicine and agriculture. Biotech Genet Eng Rev 23: Menezo YJR, Herubel F (2112) Mouse and bovine models for human IVF. RBM Online 1: Betteridge KJ, Rieger D (4883) Embryo transfer and related techniques in domestic animals, and their implications for human medicine. Hum Reprod 9: Carnevale EM (2119) The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology 28:23 31 Porcine Zygote Medium (PZM) 99

40 41. Biggers JD, Whittingham DG, Donahue RP (4820) The pattern of energy metabolis m in the mouse oocyte and zygote. PNAS 39: Leese HJ, Barton AM (4891) Pyruvate and glucose uptake by mouse ova and preimplantation embryos. J Reprod Fertil 02: Rieger D, Loskutoff NM, Betteridge KJ (4882) Developmentally related changes in the uptake and metabolism of glucose, glutamine and pyruvate by cattle embryos produced in vitro. Reprod Fertil Dev 1: Rieger D, Loskutoff NM, Betteridge KJ (4882) Developmentally related changes in the metabolis m of glucose and glutamine by cattle embryos produced and co-cultured in vitro. J Reprod Fertil 83: Kim JH, Funahashi H, Niwa K, Okuda K (4883) Glucose requirement at different developmental stages of in vitro fertilized bovine embryos cultured in semi defined medium. Theriogenology 38: Gardner DK, Lane M, Batt P (4883) Uptake and metabolis m of pyruvate and glucose by individual sheep preattachment embryos developed in vivo. Mol Reprod Dev 32: Hardy K, Hooper MA, Handyside AH, Rutherford AJ, Winston RM, Leese HJ (4898) Non-invasive measurement of glucose and pyruvate uptake by individual human oocytes and preimplantation embryos. Hum Reprod 1: Conaghan J, Handyside AH, Winston RM, Leese HJ (4883) Effects of pyruvate and glucose on the development of human preimplantation embryos in vitro. J Reprod Fertil 88: Bavister BD (4883) Cu lture of preimp lantation embryos: facts and artifacts. Hu m Reprod Update 4: Leese HJ, Conaghan J, Martin KL, Hardy K (4883) Early human embryo metabolis m. Bioessays 43: Swain JE, Bormann CL, Clark SG, Walters EM, Wheeler MB, Krisher RL (2112) Use of energy substrates by various stage preimplantation pig embryos produced in vivo and in vitro. Reproduction 423: Gandhi AP, Lane M, Gardner DK, Krisher RL (2114) Substrate utilization in porcine embryos cultured in NCSU23 and G422/G222 sequential culture media. Mol Reprod Dev 39: Harvey AJ, Kind KL, Thompson JG (2112) REDOX regulation of early embryo development. Reproduction 423: Matorras R, Ruiz JI, Mendoza R, Ruiz N, Sanjurjo P, Rodriguez-Escudero FJ (4889) Fatty acid composition of fertilization-failed human oocytes. Hum Reprod 43: McEvoy TG, Coull GD, Broadbent PJ, Hutchinson JS, Speake BK (2111) Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil 449: Sturmey RG, Reis A, Leese HJ, McEvoy TG (2118) Role of fatty acids in energy provision during oocyte maturation and early embryo development. Reprod Dom Anim 11(3): Dunning KR, Cashman K, Russell DL, Thompson JG, Norman RJ, Robker RL (2141) Beta-oxidation is essential for mouse oocyte developmental competence and early embryo development. Biol Reprod 93: Haggarty P, Wood M, Ferguson E, Hoad G, Srikantharajah A, Milne E, Hamilton M, Bhattacharya S (2112) Fatty acid metabolism in human preimplantation embryos. Hum Reprod 24: Gandhi AP, Lane M, Gardner DK, Krisher RL (2111) A single medium supports development of bovine embryos throughout maturation, fertilization and culture. Hum Reprod 43: Tervit HR, Whittingham DG, Rowson LEA (4802) Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J Reprod Fertil 31: Petters RM, Wells KD (4883) Culture of pig embryos. J Reprod Fertil 19:

41 ( ( فصل 1 کارب مدلهای حیانی برای کشت ریان انسان: پرایمتها غیر از انسان.2-1 پرایمته یا غیرانسان نزدیکترین خیشاندان به انسان بده بنابراین از دیدگاه تکاملی نزدیکترین عمدههای انسان به حساب میآیند. درحالی که دانش بینش عمیق حیرتآری به اسطه مطالعات انجام شده ری جندگان دیگر سیستمها در این زمینه به دست آمده است اینکه چگنه میتان بدن استفاده بهینه از پرایمتهای غیرانسان این مکانیسمها یافتهها را در کلینیکهای انسانی م استفاده قرار دهیم ریایی غیرممکن به نظر میرسد. امرزه بهشکرانه استفاده از رش- های غیرتهاجمی امکان مطالعه پرایمتهای غیرانسان بدن در خطر افتادن خد مجد فراهم شده است. قابل پیش بینی است که کار کن با پرایمتها در قرن 24 ادامه یابد تا امکان حرکت ربه جل در زمینههای پزشکی تلید مثل بازتانی فراهم شد مقدمه همزمان با اینکه در حال آماده شدن برای برپایی جشن اهدای جایزه نبل سال 2141 در زمینه فیزیلژی پزشکی به پرفسر Robert.G Edwards برای تسعه لقاح برنتنی در انسان بدیم همچنین دریافتیم که بهینه سازیهای بیشتری نیز در رند لقاح برنتنی کلینیکی با تحقیقات مرتبط ری گامتهای بدست آمده از انسان پرایمتهای شبیه انسان قابل دسترس خاهد بد. کارب بالقه این تحقیقات بیشمار است. دامنه این کاربها شامل انتقال انفرادی ریان کاهش استفاده از رشهای 83 تحریک تخمدان همچنین ایجاد بینش در زمینه پزشکی بازتانی اپیژنتیک برای بیماریها میباشد. این فصل زمینهای اساسی برای محققین عالقمند رد به این زمینه مهم پیا را فراهم میآ. ماد پرتکلهای تحریک تخمکریزی بازیافت اسیت رشهای لقاح برنتنی برای میمن " "Rhesus بابن در اینجا ارایه شده است در اینجا نتیجه تحقیقات صرت گرفته در بیش از 11 سال اخیر با ریک استفاده از پرایمتها غیرانسان را ارایه خاهیم داد )4-22( پرایمتهای غیرانسان پرایمتهای غیرانسان باید عاری از بیماریها بده همچنین در سن مناسب از نظر تلید مثل قرار داشته )3 تا 40 سال 89 سن( از فرشندگان معتبر یا مراکز تحقیقاتی مانند مرکز ملی تحقیقات ملی پرایمت کمپانیهای دارسازی یا دانشگاهها خریداری شند )یادداشت شماره 4 را مشاهده نمایید( هرمنها ماد زیر به منظر تحریک بابنهای ماده میمنهای Rhesus الزم میباشد: 4( آنالگ هرمن آد کننده گنادترپین (GnRH) از جمله Pharmaceuticals, Sicor( Leuprolide Acetate )2 Irvine, CA هرمن نترکیب محرک رشد فلیکل MA( )3 r-fsh; Gonal-F; Serono, Randolph, هرمن Regeneration medicine Macaca mulatta Baboon (Papio anubis) National Primate Research Centers 95

42 ( ( ( نترکیب لتئینه کننده Serono( 1( r-hlh; Luveris هرمن نترکیب گنادترپین جفت Serono) (r-hcg; Ovidrel; یا ترکیبات مشابه )مرر شده در مقاله ) 20 (( 3( هرمنها را مطابق دسترالعمل کارخانه با استفاده از رقیق کننده مربط بازسازی نمده در دمای 1 درجهسانتیگراد تا زمان مصرف نگهداری نمایید. هرمنها را به صرت تازه در رز تزریق آماده نمده تا بهترین فعالیت آن در شرایط بهینه انجام شد )یادداشت 2 را مشاهده نمایید( تجهیت جراحی 4( ماده بیهشی Ketamine hydrochloride 2( گیره م 3( لله Cuffed endotracheal 1( ماشین بیهشی 3( گاز isoflurance با کیفیت مناسب برای کاربهای پزشکی 2( بتادین ملحفه استریل مخصص جراحی 0( گاز دی اکسیدکربن %3 با کیفیت مناسب جهت کارب در مصارف پزشکی 9( تجهیت الپاراسکپی شامل مانیتر فیبرنری منبع نر دربین تجهیت دمنده ها با لله کشی مناسب 8( پمپ مکش با لله کشی مناسب 41( برقرای اتصال مناسب بین پمپ مکش لله 43 cm 3 با حفظ شرایط استریل جهت جمع آری اسیتها 44( بلک گرم کننده با دمای 30 درجهسانتیگراد برای گرم نگداشتن لله جمع کننده اسیتها 42( کانال یکبار مصرف 43( ابرآالت استاندا جراحی شامل ترکار گیره 414 محافظ دندان قیچی خمیده پنس استاندا چاق تیغ جراحی 41( مجمعه بخیه زدن استاندا 43( پتی گرم کننده حای الیه آب گرم 42( تمامی تجهیتی را که میتان با اتکال استریل نمد باید با این رش پاکسازی ک. تجهیتی را که نمیتان با استفاده از اتکال استریل نمد با استفاده از گاز اکسید اتلین %411 باید استریل ک. این ریه باید 02 ساعت قبل از انجام عمل جراحی به انجام برسد دستگاه سنگرافی مجهز به پراب ترانسدیسر مناسب جهت مشاهده تخمدانها تجهیت بازیافت اسپرم 412 4( صندلی مهار )تلیدات پرایمتها 2( Immokalee, Florida دستگاه تحریک انل الکتریکی ;8-S (Model MA) Grass Instruments, Quincy, با الکترد آلمینیمی )فقط برای.)Rhesus گزینه جایگزین پراب رکتال مخصص دستگاه تحریک الکتریکی انل )قطر 2 سانتیمتر(است که در بسیاری از شرکتهای تامین کننده تجهیت پزشکی یافت میشد )برای بابنهای نر 3( Rhesus ماده بیهشی Ketamine hydrochloride 1( بشر شیشهای استریل شده cm 3 کیت خالص سازی اسپرم Sage In-Vitro Fertilization, Inc., Trumbull, CT( PureCeption 2( اسالید همسایتمتر جهت شمارش اسپرمها 0( میکرسکپ معکس با بزرگنمایی,1X,41X 21X )یادداشت شماره 3 را مشاهده نمایید( جمع آری اسیت تجهیت جمع آری دسته بندی 4( لپ مخصص تشریح با بزرگنمایی 23X 2( پیپت با قطر 423 میکرن جهت جداسازی کلسهای چسبیده 3( سرنگ 411 میکرلیتری همیلتن با سر pulled Unopette برای انتقال اسیتها 1( ظرف کشت بافت 33 میلیمتری 3( ظرف کشت بافت 21 میلیمتری 2( رغن معدنی 0( انکباتر انتقال با دمای 30 درجه سانتیگراد 9( سیستم فیلتراسین.EM Con محیطهای کشت محیط کشت تایرد-الکتات (TL) 413 میبایست آماده شد )3 9(. (441 mm NaCl, 2/1 mm CaCl 2.2H 2 O, 3/2 mm KCl, 1/3 mm MgCl 2.2H 2 O, 1/1 mm NaH 2 PO 1. H 2 O, 44/1 mm lactic acid (sodium salt; 21%, w/w, syrup), 23 mm NaHCO 3, 1/2 mm sodium pyruvate, 3 mm Cannula trocar Toothed (traumatic) grasper forceps Electroejaculator Tyrode s-lactate 96

43 glucose, 31 µg/ml gentamicine, 4 mg/ml phenol red 411 ), TL-HEPES (441 mm NaCl, 2/1 mm CaCl 2.2H 2 O, 3/2 mm KCl, 1/3 mm MgCl 2.2H 2 O, 1/1 mm NaH 2 PO 1. H 2 O, 44/1 mm lactic acid (sodium salt; 21%, w/w, syrup), 2 mm NaHCO 3, 41mM 1-(2-hydroxyethyl)-4-piperazine ethan sulfonic acid (HEPES), 1/2 mm sodium pyruvate, 3 mm glucose, 31 µg/ml gentamicine, 4 mg/ml phenol red) 412 هپارین سایر ماد شیمیایی 413 )4 هیالرنیداز )2 3 (کافئین N2 2 -O-dibutyryladenosine 3 :3 cyclic monophosphate )1 (dbcamp) 3( سرم آلبمین گای fraction V سرم آلبمین فاقد اسید چرب تجهیت لقاح برنتنی تزریق درن سیتپالسمی اسپرم 4- میکرسکپ معکس که با سیستم اپتیکی (HCM) Hoffman Modulation Contrast یا سیستم مشابه مجهز شده است بزرگنمایی عدسی شیی م استفاده عبارت است از 2-,1X.,41X 21X HCM صفحه تلید کننده حرارت قابل 410 کنترل Shizuoka-Ken,Japan) 3.(Tokai-HT, - سیستم دسترزی میکرنی د تایی به منظر نسب سزن نگهداری اسیت ریزتزریق اسپرم. 1- دستگاه ریزتزریق کننده به منظر نگهداری کنترل شده اسیت تزریق اسپرم به سیله پیپت. 3 -میکرپیپتها VA) (Humagen, Charlottesville, به منظر نگهداری اسیت:( µm (O.D. 411 µm; I.D. 21 تزریق 419 اسپرم µm).(o.d. 2-0 µm; I.D ظرف استیرل FC mm; Fluorinert پلی ینیل پیرلیدن %41.(PVP) 9- محیط کشت.TALP-HEPES 8- رغن معدنی. 41- شعله سزنی از سزن شماره 49 G متصل شده به منبع گاز تشکیل شده است تلید میشد رشها تحریک هرمنی برند پرایمتهای غیرانسان مثالی از شیه تحریک تخمدانهای rhesus با استفاده از هرمن با منشا خارجی در جدل 4-1 ارایه شده است )28(. 418 آغاز این درمان هرمنی با مشاهده عالئم شرع چرخه قاعدگی )رز 4( در نظر گرفته میشد حیانهای ماده در قفس مهار کننده به آرامی بیحرکت شده در ساعت 0 صبح به اسطه تزریق زیر جلدی (sub-q) یک دز از آگنیست هرمن آدکننده گنادترپین (GnRH) دریافت میکنند )1/3 میلیگرم بر هر کیلگرم از زن بدن( این امر به منظر جلگیری از سرژ درندی LH در مادههایی میباشد که در چرخه هستند )31(. جدل راهکارهای تحریک تخمدان بابن میمن Rhesus آگنیست GnRH تزریق شده ریه تجیز گنادترپین پس از پرید 231µg زیرجلدی یکبار در رز 4 231µg زیرجلدی یکبار در رز 2 231µg زیرجلدی یکبار در رز 3 231µg زیرجلدی یکبار در رز 1 سزن سایز 23 G درن عضله FSH 21 IU )رنه د تزریق 31 احدی ) سزن سایز 23 G درن عضله FSH 21 IU )رنه د تزریق 31 احدی ) FSH 21 IU )رنه د تزریق 31 احدی ) سزن سایز 23 G درن عضله FSH 21 IU )رنه د تزریق 31 احدی ) سزن سایز 23 G درن عضله شاخص ph Hyaluronidase Heparin micromanipulators Polyvinylpyrrolidone menses 97

44 سزن سایز 23 G درن عضله FSH 21 IU )رنه د تزریق 31 احدی ) سزن سایز 23 G درن عضله FSH 21 IU )رنه د تزریق 31 احدی ) 231µg زیرجلدی یکبار در رز 3 231µg زیرجلدی یکبار در رز 2 231µg زیرجلدی یکبار در رز 0 231µg زیرجلدی یکبار در رز 9 FSH 21IU LH21IU )دبار در رز ) سزن سایز 23 G درن عضله FSH 21IU LH21IU )دبار در رز ) سزن سایز 23 G درن عضله سزن سایز 23 G درن عضله FSH 21IU LH21IU )دبار در رز ) 231µg زیرجلدی یکبار در رز 8 231µg زیرجلدی یکبار در رز 41 سزن سایز 23 G درن عضله r-hcg IU )یک تزریق صبح ) تزریق زیرجلدی آگنیست GnRH در هر صبح انجام میشد این عمل برای مدت 41 رز چرخه تحریک تکرار میشد. 441 به صرت همزمان در رز 4 هرمن نترکیب FSH انسانی به مین دز 31 IU به صرت عضالنی به منظر تحریک رشد 444 فلیکلها تجیز تزریق میشد. در حدد 42 ساعت بعد در رز ال دز دم هرمن نترکیب FSH انسانی به مقدار IU 31 به صرت عضالنی تزریق میشد. این برنامه هرمنی تزریق r-hfsh برای 3 رز دیگر با فاصل 42 ساعت یکبار انجام میشد. تاحد ممکن باید سعی شد که این ریه ثابت باشد. با آغاز رز 0 یک دز ترکیبی از r-hfsh هرمن نترکیب لتئینه کننده انسانی )r-hlh( به صرت عضالنی دبار در رز به مدت 3 رز انجام میشد. ممکن است که سنگرافی در رز 0 بعد از تحریک انجام شد تا به نعی ثابت شد که تعداد زیادی فلیکل 3-1 میلیمتری در هر تخمدان حضر دا. این امر نشانگر پاسخ بهینه کافی فلیکلی است. اگر حضر فلیکلها تایید نشد تحریک بیشتر م استفاده قرار نمیگی. در رز 41 بعد از برقرار شدن چرخه تحریک مفق یک تزریق احد از هرمن نترکیب گنادترپین جفت انسان r-hcg به مقدار 4111IU به منظر بلغ اسیتها تخمکریزی انجام میشد. معمال آسپیره نمدن فلیکلهای ایجاد شده در تخمدان ساعت بعد از تجیز r-hcg انجام خاهد شد. ما معمال در صرت فراهم بدن حیانات ماده رنه 2 حیان را تحریک مینماییم )یادداشت شماره 3 را مشاهده نمایید( آسپیره نمدن اسیتها. 21 ساعت پیش از آسپیره نمدن تخمدانها محیط کشت کامل TALP را آماده نمده )9 3(. مقدار 1/3 mm سدیم پیرات 442 )از محلل ذخیره 411( mm 211 mg از BSA Fraction V را به 31 ml محلل ذخیره TL بیافیید. اجازه بدهید که BSA به مدت 3 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد بدن هم زدن به طر کامل در محیط حل شد. همزمان با تهیه TALP کامل 1-2 ظرف کشت تلقیح را آماده نمایید. ال از یک ماژیک پایدار به منظر کشیدن خطط متقاطع در کف ظرف استفاده نمایید با این خطط باید ظرف کشت به 1 ناحیه کامال مسای تقسیم شد )44(. µl 81 از محیط کشت TALP کامل استریل را به داخل هر یک از این چهار قسمت انتقال دهید. همچنین میبایست یک قطره نیز در مرکز ظرف قرار داده شد )در کل 3 قطره( به سرعت ری این قطرات را با رغن معدنی گرم بپشانید. هر یک از ظرفها با برچسبی که نع محیط کشت تاریخ را مشخص مینماید نشان- گذاری نمده سپس این ظرفها را برای مدت حداقل 42 ساعت قبل از استفاده به داخل انکباتر حای %3 2 O 2 %3 CO %81 ها به منظر برقرار شدن تعادل ph قرار دهید. برای آماده سازی ظرفه یا کشت پس از لقاح ظرفهای 1 چاهکی استریل را با 311 µl از محیط کشت TALP کامل که با 311 µl رغن معدنی استریل گرم پشانده شده است پر نمایید. همانند آنچه که پیشتر بیان شد این ظرفها نیز باید نامگذاری شد. تمام محیط کشت TALP باقیمانده را به منظر برقراری تعادل ph در انکباتر قرار داده به صرتی که درب آن نیماز باشد. به منظر جلگیری از تغییرات مضر در ph محیط محیط TALP لقاح ظرفهای کشت به جز برای مدت بسیار کتاه )کمتر از 3 دقیقه( نباید خارج از انکباتر نگهداری شند )یادداشت شماره 2 را مشاده نمایید(. r-hfsh recruitment stock 98

45 پیش از آسپیره نمدن تخمدانها پیش از آغاز عمل جراحی مقدار 411 ml از محیط کامل TALP-HEPES را با افزدن BSA 111 mg 1/3 mm سدیم پیرات به محلل ذخیره TL-HEPES آماده نمایید. بعد از حل شدن BSA به طر کامل محیط استریل را با استفاده از برج فیلتراسین با قطر 1/22 µm فیلتر نمایید. محیط TALP-HEPES را میتان در حمام آب گرم 30 درجهسانتیگراد به مدت حداکثر 2 ساعت انکبه نمد. درست پیش از آغاز عمل جراحی 21 ml از محیط کامل TALP-HEPES باشته مقدار 3 IU/ml هپارین به آن افزده (TALP-HEPES-HEP) این امر به منظر جلگیری از لخته شدن خن در لله استفاده شده برای جمع آری محتای آسپیره شده انجام میشد. 4 ml از محیط TALP-HEPES-HEP را به للههای 43 cm 3 افزده آنها را در انکباتر قابل حمل نقل در دمای 30 درجهسانتیگراد نگهداری نمایید. 41 ml باقیمانده TALP- HEPES-HEP را بهمنظر شستشی سیستم لله کشی دستگاه آسپیره کننده قبل در هنگام جراحی استفاده نمایید. در حدد 41 دقیقه قبل از زمان م انتظار رسیدن اسیتهای آسپیره شده به آزمایشگاه مقدار 31 ml از محیط TALP-HEPES گرم شده را با افزدن 2/1 mg/ml آنزیم هیالرنیداز آماده نمایید )TALP-HEPES-Hyal( این محلل به منظر کمک نمدن به رند جداسازی سللهای کملس از اسیتهای آسپیره شده م استفاده قرار میگی. محلل TALP-HEPES- Hyal را با فیلتر سرنگی 1/22µm فیلتر نمایید در حمام آب گرم با دمای 30 درجهسانتیگراد نگهداری نمایید آسپیره نمدن فلیکلها 34( ) حیانات مادهی تحریک شده برای مدت 42 ساعت پیش از عمل جراحی از آب غذا محرم میشند. حیانات ماده با یک تزریق عضالنی با داری کتامین mg/kg( 41( بیهش میشند. سپس مهای ناحیه شکمی حیانات مادهتراشیده شده به سرعت برای جراحی آماده میشند. به سیله لله Cuffed لله گذاری در نای حیانات مذکر انجام میشد. سپس آنژیکت G 22 در سیاهرگ ساعد یا saphenous مجد ثابت میشد. ادامه رند بیهشی با استفاده از گاز isoflurane تبخیر شده در 443 اکسیژن %411 که به سیله لله نایی به مجد منتقل میشد بهانجام میرسد. حیانات ماده در مقعیت Trendelenburg به میز جراحی منتقل میشند. پست شکم با استفاده از بتادین شستش استریل میشد. سپس یک ملحفه استریل ری حیان انداخته میشد. محطه شکمی با استفاده از گاز دیاکسیدکربن با کیفیت م نظر برای استفادههای پزشکی با فشار mmhg 43 با ا نمدن سزن Verres به مقدار تقریبی 4-3 سانتیمتر از ناحیه باالیی ناف با گاز ها دهی میشد. بعد از باشتن سزن Verres تلسکپ مربط به الپاراسکپی 41 mm یا 3 از همان مکان ا محطه شکمی شده یک کانالی اضافی 3 mm در بخش راست شکمی ناحیه Paralumbar نیز قرار داده میشد. یک جفت پنس گیرهای به منظر بیتحرک نمدن تخمدانهای مشاده شده نیز از ناحیه سراخ شده ا میشد. یک سزن کتا آسپیره نمدن مرب با قطر )9( 22G به سیستم لله کشی متصل به پمپ مکش با د منفذ به منظر اتصال به لله 43 cm 3 محتای TALP-HEPES-HEP متصل میشد. سزن سیستم لله کشی با استفاده از TALP-HEPES استریل پیش از ا شدن به محطه شکمی از طریق منفذ ایجاد شده تسط کانال قبل از رد سزن به فلیکلهای تخمدانی حای اسیت شستش میشد. تعداد زیادی فلیکل با استفاده از مکش مدام با فشار تقریبی mmhg به داخل لله جمع آری خن حای 4 ml از محیط IU/mL /TALP-HEPES 3 هپارین که در دمای 30 درجهسانتیگراد بر ری بلک گرم نگهداری میشد تخلیه میشد. للههای جمعآری با استفاده از انکباتر سیار که دمای 30 درجهسانتیگراد را فراهم میکند به منظر بازیافت اسیتها بررسی پس از آسپیره شدن از تخمدانها به آزمایشگاههای مشخص شده برای پرایمتها منتقل میشند. به منظر کامل شدن ریه جراحی حفره شکمی با استفاده از محلل گرم نمکی به منظر پاکسازی محطه شکمی از لختههای خن شستش میشد. تمامی بریدگیهای ایجاد endotracheal tube 93

46 شده در رند جراحی با نخ بخیه مصنعی قابل جذب بسته میشد. تجهیت الپاراسکپی خارج میشند سراخهای کچک در 441 دیاره بدن با استفاده از مجمعه بخیه 1-3 vicryl با در نظر داشتن الگی بخیه درهم تنیده مسدد میشند )یادداشت شماره 0 را مشاهده نمایید( جمع آری اسپرم بابن ها میمنهای رسس نر که بارری آنها تایید شده است برای جمع آری نمنه اسپرم م استفاده قرار می- گیرند ) ( برای میمنهای رسس که به طر مناسب با صندلی آمزش داده شدهاند )یاد داشت شماره را مشاهده نمایید( به طر معمل میتان با استفاده از محرک انل الکتریکی penil band انل را القا نمد ) (. تحریک با استفاده از محرک 3-S Grass که به یک الکترد یکبار مصرف ساخته شده از فیل معملی آلمینیمی به ابعاد 4 2 سانتیمتر که در نزدیکی قاعده پنیس قرار داده میشد القا میشد. پالسهای فعالسازی 21 هرتزی برای مدت 21 ms برای بیشنه دفعات به مین 3 بار با در نظر گرفتن زمان استراحت 2-4 دقیقه بین هر پالس اعمال میشد )43(. انل تلید شده در بشر 31 cm 3 جمعآری شده بالفاصله به منظر انجام آنالیزها بررسی منی به آزمایشگاه منتقل میشد. برای بابنها نمنههای منی با استفاده از پراب رکتال جمعآری میشد )30 21( بعد از اعمال کن بیهشی به اسطه استفاده از کتامین برای آرام کن نرها تحریک الکتریکی انل با استفاده از تجهیت کلینیکی متصل شده به پراب 2 سانتیمتری صل شده به د الکترد به طل 33 mm به انجام میرسد. یک پراب مجهز به دماسنج به طر همزمان درحال مشاهده کنترل گرمای تلید شده است تا از برز صدمات احتمالی حاصل از جریان الکتریکی اعمال شده جلگیری به عمل آید. پراب با استفاده از ژل KY 442 لغزنده شده به داخل مقعد ا میشد پرستات / غدد زمینهای با تحریک الکتریکی القا شده با پالسهای ریتم دار با استفاده از لتاژ ثابت که از 0/3 لت بیشتر نمیشد م تحریک قرار میگیرند. چرخه این تحریک تا 3 چرخه با در نظر داشتن 4 دقیقه استراحت بین تحریکها تکرار میشد. نمنههای منی در بشر 31 cm 3 جمعآری شده بالفاصله برای آنالیز به آزمایشگاه منتقل میشد آنالیز نمنههای اسپرم بعد از آبگنه کن محتای انل شده که به صرت لخته درآمده است منی مایع با استفاده از میکرپیپت 4111 µl استریل باشته شده به لله فالکن 43 ml که دارای محیط شستشی گرادیان دار منقطع با یژگی (v/v) 91:11 منتقل میشد. به منظر جداسازی اسپرمهای زنده از اسپرمهای مه ناتان محلل اسپرم برای مدت 3 دقیقه در سانتریفیژ با در 231g در دمای اتاق قرار داده میشد. بعد از اعمال سانتریفیژ الیه باالیی گرادیان غلظت با پیپت 3 ml باشته شده در ریخته میشد. در حدد 41 ml از محیط TALP-HEPES کامل گرم به پالک اسپرم افزده میشد. سپس لله 3 مرتبه به آرامی سر--ته میشد تا محتای مجد در آن دباره معلق شند. محلل حای اسپرم در دمای اتاق با در 211g به مدت 3 دقیقه سانتریفیژ میشد مایع ریی با استفاده از پیپت سرلژیک 41 ml خارج میشد پالک نهایی اسپرم در 4 ml از محیط TALP-HEPES کامل گرم معلق میشد. شمارش اسپرمها با استفاده از الم همسایتمتر بهمنظر تخمین غلظت نمنه اسپرم انجام میشد. بهمنظر انجام شمارش اسپرم با استفاده از الم همسایتمتر مقدار 41 µl از محلل اسپرم را به 481µl آب مقطر اضافه میکنیم اینکار بهمنظر بیحرکت کن اسپرمهایی که فعاالنه در حال شنا کن هستند انجام میشد مخلط حاصل را به آهستگی درهم میآمیزیم. مقدار 41 µl از این محلل را به هر د طرف الم همسایتمتر افزده ری آن را با استفاده المل میپشانیم. بعد از گذشت 4 دقیقه الین خانه الم را با استفاده از میکرسکپ معکس به کمک عدسی شیی Hoffman Modulation contrast (HMC) 21X بهمنظر شمارش اسپرمها م ارزیابی قرار میدهیم. تمام اسپرمهای سالم mattress pattern electroejaculation KY Jelly 11

47 دستنخه در هر 3 مربع مجد را که با کچکترین الگ مدرج شده است م شمارش قرار میدهیم. این عملیات برای خانه مدرج قرار گرفته در منطقه مقابل در طرف مقابل الم همسایتمتر عینا تکرار میشد. از د شمارش انجام شده میانگین گیری انجام میشد. عدد به دست آمده شمار اسپرمها به میلین در هر میلیلیتر میباشد. ریختشناسی تحرک اسپرمها با استفاده از 41 µl از اسپرمهای درحال شنا کن در TALP-HEPES قرار دادن این مقدار بری الم تمیز پشاندن آن با المل به مساحت 22 mm 2 تعیین میشد. بالفاصله اناع تحرک ربه جلی اسپرم با استفاده از عدسی شیی 41X HMC م ارزیابی قرار میگی. حداقل 3 تا 9 منطقه م مشاهده قرار میگی این ناحی باید بیش از 31 اسپرم را در برگرفته باشند تا بتانیم حرکت ر به جل خطی اسپرمها را تخمین بررسی کنیم. اگر نمنه کمتر از %31 اسپرم متحرک داشت به طر معمل حذف می- شد. ریخت شناسی نیز با داده باری از 41 منطقه ری اسالید شمارش 41 تا 21 اسپرم در هر منطقه زیر عدسی شیی 21X HMC م بررسی انجام قرار میگی. یادداشت باری با تجه به تعداد اسپرمهایی که دم خمیده دم فر خه سرهای به هم چسبیده یا حضر قطره سیتپالسمی سر دم جدا شده ترم غیر طبیعی یا سر بد شکل یا دم ناقص دارند انجام میشد )دم کتاه قطعه میانی ضخیم دم پهن(. اگر نقصهای یاد شده در بیش از %31 از اسپرمها مشاهده شد نمنه حذف میشد. اسپرمهای شسته رقیق شده در محیط TALP-HEPES برای کمتر از 1 ساعت در دمای اتاق نگهداری میشد )یادداشت شماره 9 را مشاهده نمایید( آنالیز اسیتهای آسپیره شده بهمحض رسیدن به آزمایشگاه لله محتای ماد آسپیره شده به کمک 3 ml از محیط TALPS-HEPES گرم حای 2 mg/ml آنزیم هیالرنیداز (TALPS-HEPES-Hyal) رقیق میشد. درحالی که انکباسین برای مدت 3 تا 1 دقیقه انجام میگی سیستم فیلتر EM Con را آماده نمایید. آمادهسازی این سیستم با استفاده از اتصال لله به ناحیه زیری فیلتر محکم پیچاندن اتصال این د قطعه انجام میشد. فیلتر با استفاده از 3 ml محلل TALPS-HEPES-Hyal شسته میشد به مدت 2 تا 3 دقیقه محلل ریخته شده در سیستم فیلتر را میچرخانیم سپس محلل را خارج نمده به داخل فالسک دهان گشاد 4 لیتری استریل منتقل مینماییم. بعد از تخلیه دباره سیستم فیلتر را محکم مینماییم. بعد تمام محتای آسپیره رقیق شده را که از حیانات ماده بدست آمده است با هم ترکیب که در قسمت باالی فیلتر تخلیه نمده به آرامی میچرخانیم سپس خرجی را باز که تا تمام محیط خارج شد. به سرعت ml از محلل گرم TALPS-HEPES-Hyal ری فیلتر ریخته به آرامی میچرخانیم سپس خرجی را باز مینماییم تا محیط خارج شد. این کار را یک بار دیگر انجام میدهیم. بعد از آخرین مرحله شستش در حدد 3-41 ml محلل گرم TALPS-HEPES به سیستم فیلتر افزده به آرامی میچرخانیم سپس به سرعت محتای سیستم فیلتر را به داخل سه ظرف پتری 21 mm که پشت آنها با قلم نشانگذاری مدرج شده است تخلیه میشد. یکبار دیگر فیلتر را شستش داده به داخل ظرف پتری مدرج شده تخلیه نمایید. به سرعت محتای تخلیه شده در ظرف پتری را با استفاده از لپ با منبع نری مناسب به منظر تعیین مقعیت باشت اسیتها با استفاده از پیپت شیشهای که قطر دهانه آن از قطر اسیتها بیشتر است م بررسی ارزیابی قرار میدهیم. اسیتها را به ظرف پتری 33 mm محتای محلل گرم TALP-HEPES که بر ری صفحه گرم با دمای 30 درجه سانتیگراد قرار دا منتقل مینماییم. بعد از جمعآری تمام اسیتها هر اسیتی که به کلسها متصل میباشد را با استفاده از عمل پیپتینگ )2 تا 1 اسیت به طر همزمان( از کملس جدا مینماییم. به محض اینکه تمام اسیتها لخت شدند با استفاده از سرنگ Hamilton اسیتها را به ظرف پتری دیگر که دارای قطر 33 mm میباشد منتقل نمده زیر لپ م بررسی قرار میدهیم. اسیتها را به چهار گره 440 تقسیم میکنیم: 4( اسیتهای نابالغ که دارای زیکل یا (GV) قابل مشاهده میباشند 2( اسیتهای بالغ که نه GV قابل مشاهده دارند نه الین جسم قطبی آنها مشخص است 3( اسیتهایی که بهطر کامل بالغ شدهاند جسم قطبیشان کامال به فضای پیش یتلین ا شده است 1( اسیتهای آترتیک با اکئلهای بزرگ سیتپالسم تیره بسیار متراکم در Germinal vesicle (GV) 14

48 مرکز اسیت یا اسیتهای بدشکل تجزیه شده. تمام اسیتهایی که باید بالغ شند را در محیط کشت TALP در انکباتر با دمای 30 درجه سانتیگراد که دارای شرایط گازی %3 دی اکسید کربن- %3 اکسیژن- 81% نیترژن میباشد قرار میدهیم )41 اسیت در هر قطره کشت قرار میدهیم(. ظرف کشت محتای محیط TALP رز قبل از کشت باید آماده شده باشد. تکامل اسیتها برای مدت چند ساعت م بررسی قرار داده میشند تا خرج الین جسم قطبی را بتان تشخیص داد )به سرعت برای 31 تا 13 دقیقه اسیتها را بررسی نمایید تا خرج جسم قطبی را بررسی نماییم(. تمام اسیتهای بالغ شده را که دارای الین جسم قطبی میباشد به ظرف حای TALP که از نظر شرایط گازی متعادل شده است منتقل مینماییم تا لقاح در زمان کمتر از 1 ساعت به انجام برسد )یادداشت 8 را مشاهده نمایید( لقاح برنتنی ابتدا محلل بیشفعالسازی اسپرم برای میمن رسس را با افزدن 2 mg کافئین dbcamp 3 mg به 4 ml محیط TALP متعادل شده در شرایط گازی تعیین شده آماده نمایید ) (. محلل را با چرخش آهسته به خبی مخلط نمده سپس با استفاده از فیلتر سرنگی محلل مذکر فیلتر شده در دمای 30 درجه سانتیگراد در انکباتر 3 گازه )81-3-3( برای مدت کمتر از 31 دقیقه انکبه میشد. غلظت مخلط اسپرم در لله آزمایشگاهی 43 ml محتای TALP به 41 2 sperm/ml 21 رسانده میشد. برای انجام این کار تعداد متسط اسپرم شمارش شده )میلین بر لیتر( که تسط الم همسایتمتر تعیین شده است را به عدد 21 تقسیم نمده تا غلظت نهایی TALP بر اساس میلیلیتر برای افزدن به اسپرم مشخص شد. برای مثال اگر تعداد اسپرمهای شمارش شده 201 million/ml باشد با تقسیم نمدن این عدد به 21 به عدد 43/3 ml دست مییابیم. چن حجم نهایی م نظر ما 4 ml میباشد فقط 42/3 ml از محلل TALP را برای افزدن به اسپرم جهت رسیدن به غلظت نهایی 41 2 sperm/ml 21 را به اسپرم میافییم. محلل اسپرم تنظیم شده را برای مدت 4 ساعت در دمای 30 درجه سانتیگراد انکبه مینماییم. با استفاده از صفحه لقاح محتای 81 µl از TALP به تعادل رسیده در شرایط گازی % مقدار 41 µl از محلل بیش فعالسازی دارای کافئین dbcamp را مستقیما به قطرههای لقاح بیافیید. به آهستگی ظرف لقاح چرخانده شد تا ماد افزده شده به محیط لقاح باهم مخلط شند البته باید در نظر داشت که از سرریز شدن محیط کشت از کف ظرف ممانعت شد. 3 تا 41 اسیت بالغ شده که در مرحله متافاز 2 متقف شده است را به قطره لقاح منتقل نمده بالفاصله مقدار 4 µl از محلل معلق اسپرم با غلظت 41 2 sperm/ml 21 را به قطرههای لقاح افزده به آهستگی قطره را چرخانده تا همه ماد به خبی مخلط شند. ظرف کشت را در دمای 30 درجه سانتیگراد در انکباتر قرار داده مدت 449 کشت ساعت را در نظر بگیرید. بعد از انکباسین مفقیت لقاح را ارزیابی نمایید. با استفاده از پیپت برهنه کننده با سر TALP استریل به آهستگی با مالیمت اسپرمهای اضافه را از تمام اسیتها جدا که اسیتها را به محلل 423 µm تازه که در شرایط گازی به تعادل رسیده است منتقل نمایید. یگتهای با د پیش هسته د جسم قطبی را شمارش نمده تعداد استهایی که هیچ نشانهای از پیش هستههای نر ماده از خد نشان نمیدهند را به عنان اسیتهایی که مفق به لقاح نشدهاند در نظر گرفته تعداد اسیتهایی که فقط یک پیش هسته دارند را به عنان اسیتهایی در نظر می- 448 گیریم که با فرایند پارتنژنز بارر شدهادن میگیریم. باشند 421 اسیتهایی که بیش از د پیش هسته دارند را به عنان پلی اسپرمی در نظر نرخ لقاح نرمال عبارت است از تقسیم تعداد کل اسیتهایی که دارای د پیش هسته به عاله د جسم قطبی می- به تعداد کل اسیتهایی که م استفاده برای لقاح قرار گرفتهاند )یادداشت 41 را مشاهده نمایید(. Stripper pipette parthenogenotes polyspermy 12

49 ICSI.0-1 ICSI با استفاده از میکرسکپ معکس با در نظر داشتن فاصله محیط کاری زیاد به منظر جایگزینی میکرنیدلها کار با ظرف کشت به انجام میرسد ) ( عدسی شیی استفاده شده برای ICSI باید Hoffman (HMC) modulation contrast با بزرگنمایی 41X 1X 21X )یا معادل این یژگیها( باشد. ابتدا میکرمنیپالتر هیدرلیک را با استفاده از بست مناسب بر ری میکرسکپ معکس نصب نمده نگهدارنده سزن استیل را به هر یک از طرفین دستگاه نسب نمایید. حال سرنگهای Hamilton را به صرت نیمه از آب یا رغن معدنی پر نمده )یکی برای ثابت نگهداشتن اسیت; دیگری برای انتقال اسپرم( مقدار کمی از مایع را از انتهای سرنگ خارج نمایید )به این منظر که از ایجاد حباب در سرنگ ممانعت شد(. سپس سرنگ همیلتن پرشده را بر ری نگهدارندههای سرنگ سار نمده پیستن را به متر متصل نمایید. در مرحله بعد لله اتصاالت را بهنگهدارندههای سزن متصل نمده هر د نگهدارنده سیستم للهای را با رغن آب پر نمایید همچنین باید در نظر داشت که از ایجاد حباب در هر یک از د انتهای سیستم جلگیری بهعمل آید. این عملیات را برای هر د س انجام دهید. در نهایت خط لله را به هر یک از سرنگهای Hamilton سار شده ری نگهدارندههای سرنگ متصل نمایید. این مجمعه در حال حاضر برای پر کن سزنها آماده است. پیپت نگهدارانده را خارج که با استفاده از شعله سزنی سزن را به شکل حرف انگلیسی Z خم که در نتیجه امکان انجام مانر در اطراف کندانسر میکرسکپ 424 فراهم میشد. عملی مشابه با آنچه که ذکر شد را با سزن ریز تزریق با یه خمش 31 کتاه با نک تیز انجام دهید. به منظر حصل اطمینان از اینکه پیپت ریزتزریق اسپ رم در زمان خم کن پیپت در مقعیت صحیح قرار گرفته است ابتدا یک نشانه ری پیپت ریزتزریق ایجاد نمایید )نشان دهنده جه خمیده( به گنهای که با یه 81 درجه از شما در باشد سپس الین خمش را ایجاد نمایید. پیپت ریزتزریق را به پشت چرخانده به گنهای که نسبت به شما یه 81 درجه داشته باشد سپس دمین خمش Z شکل را ایجاد نمایید. هر د نگهدارنده پیپت ریز تزریق را از پشت با FC-01 Fluorinert پر نمده تا به کنترل نمدن مایعات پیپت ظریف کمک نماید. سپس پیپتهای ظریف را ری نگهدارندهها سار نمایید. سزنها را در داخل محلل TALP-HEPES ا نمده سزنها را به گنهای قرار دهید که جهت گیری آنها به سمت مرکز میکرسکپ باشد. سپس سرنگ را چرخانده تا تمام حبابها از نک پیپتظریف خارج شد. حرکت محیط کشت را در هر د نگهدارنده پیپت ریزتزریق به سمت باال پایین آزمده تا اطمینان حاصل نمایید که انتقال ظریف به سمت داخل بیرن سزن با کنترل آسان امکانپذیر باشد. حرکت مایع به محض چرخاندن عملگر سرنگ باید سریع باشد. محیطmeniscus Fluorinert را باید در تمام مدت کار مشاهده نمد. تزریق اسپرم باید در دمای 30 درجه سانتیگراد انجام شد. ال ظرف تزریق را آماده نمده این ظرف باید از د ریزقطره با حجم 411µl از محلل TALP-HEPES که درکنار هم قرار گرفته ری سرپش ظرف کشت بافت 411mm به همراه قطره سم که حای %41 PVP در محلل گرم TALP-HEPES میباشد تشکیل شده باشد. تمام این قطرهها باید تسط رغن معدنی شفاف پشانده شد )40(. الین قطره محیط برای ریزتزریق اسیتها استفاده میشد قطره دم برای شستش سطح خارجی نک پیپت ریزتزریق اسپرم پیش از رد آن به قطره اسیت میباشد. PVP برای رقیق سازی محلل اسپرم sperm/ml) 41 4) 2 به منظر آهسته کن سرعت ربه جل اسپرمات استفاده میشد بنابراین افزدن PVP به محیط گرفتن اسپرم با پیپت ظریف تصیه میشد. ریه تزریق اسپرم به این ترتیب است: ال پیپت را به سمت خارج از محدده دید حرکت دهید نک پیپت ریزتزریق را به قطره PVP ا نمایید. مقدار کمی از PVP )بدن اسپرم( را به داخل سر پیپت بکشید )خمیدگی در محدده دید باشد(. در این مرحله یک اسپرم متحرک با ظاهر مناسب از طریق آسپیره نمدن اسپرم از ناحیه دم از قطره حای اسپرم- PVP به داخل سزن ریزتزریق بکشید. نک پیپت ریز تزریق را به داخل قطره مرکزی ا نمده بخش خارجی پیپت ریزتزریق اسپرم را شستش دهید. در این زمان پیپت نگهدارنده را به محدده دید ا نمایید. درحال حاضر هر د پیپت ظریف را به محلی درست در زیر اسیتهای بارر نشده در قطره کشت ال ا کنید از پیپت نگهدارنده به منظر بی- حرکت کن یکی از اسیتها که دارای جسم قطبی در مقعیت ساعت 42 یا 2 میباشد استفاده نمایید. این مقعیتها ساعت Microinjection needle 19

50 42 2 سزن ریز تزریق را از دمین دک تقسیم میز با فاصله نگهداشته از ایجاد آسیب به این ساختار حیاتی جلگیری به عمل میآ. حال به آهستگی سزن ریزتزریق را از زناپلسیدا عباده به داخل سیتپالسم با حرکت ادامه دار ربهجل ا نمایید. در زمانی که نک سزن در نزدیک مرکز سیتپالسم قرار گرفت غشای پالسمایی اسیت با آسپیره نمدن آهسته سیتپالسم سراخ میشد کار را با کشیدن ربه عقب عملگر سرنگ کامل نمایید مقدار کمی از سیتپالسم در نک پیپت ریز تزریق قابل مشاهده است. سپس به آهستگی سیتپالسم اسیت مجد در پیپت ریزتزریق را در داخل اسیت آد نمایید. مشاهده حضر تک اسپرماتزا در داخل سیتپالسم اسیت حصل اطمینان از عدم خرج اسپرم از سراخ ایجاد شده در غشای سیتپالسمی اسیت از اهمیت فق العادی برخار است. این مسئله به اسطه استفاده از عدسی شیی 21X HMC تایید حضر تک اسپرم در سیتپالسم اسیت به اتمام میرسد. اسیت تزریق شده را در قسمت باالی قطره قرار داده بهگنهای که از اسیتهای باررنشده در باشد تمام مراحل قبل رابرای سایر اسیتها انجام دهید تا زمانی که تمام اسیتها با یک اسپرم بارر شند )یادداشت شماره 44 را مشاهده نمایید(. بارر شدن اسیتها به اسطه استفاده از رش 42 ICSI تا 43 ساعت بعد از تزریق با مشاهده خرج دمین جسم قطبی با مشاهده تشکیل د پیش هسته در سیتپالسم اسیت م تایید قرار میگی. یگتها در محیط TALP متعادل شده در انکباتر تا مرحله 2 سللی کشت داده میشند. بعد از کامل شدن الین تقسیم کلیاژ )21 تا 29 ساعت بعد از تزریق( ریان 2 سللی را میتان در محیط کشت پیشرفته با سللهای تغذیه کننده یا بدن این سللها تا مراحل نهایی پیش از النه گزینی کشت داد )22 9( )شکلهای را مشاهده نمایید(. شکل 4-1. تکین ریان بابن زمان بندی آن بعد از تزریق داخل سیتپالسمی اسپرم.(ICSI) ریان حاصل از ICSI بابن در شرایط برنتنی از مرحله 4 سللی تا مرحله بالستسیست تسعه یافته رشد مینماید مرحله بالستسیت تسعه یافته زمانی است که ریانها را میتان برای جداسازی سللهای ICM بدست آن سللهای بنیادی ریانی استفاده ک در نظر میگیریم. (a) اسیت لقاح یافته در مرحله حضر 2 پیش هسته با د جسم قطبی )نک پیکان(; (b) ریان 2 سللی; (c) ریان 1 سللی; (d) ریان 9 سللی; (e) ریان 42 سللی; (f) مرال; (g) بالستسیت الیه با حفره بالستکل کچک; (h) بالستسیت کامال تسعه یافته با تده سلل داخلی ICM )پیکان(. در زیر تصایر زمان بندی به ساعت رز برای مراحل مختلف تکین در شرایط برنتنی در بابن به تصیر کشیده شده است. خط مقیاس در (a) 21 µm )چاپ مجدد با کسب مجز از Sage Publications از Simerly همکاران )23((. 11

51 شکل 2-1. جداسازی سللهای بنیادی ریانی از بابن BabESC-1 BabESC-43 a) & (b. بالستسیتهای بابن تلید شده از ریانهای حاصل از ICSI که برای 8 رز در شرایط برنتنی کشت شده است )پیکانها: تده سللی داخلی برجسته(. (d C) & رز 9 بعد از کشت سللهای ICM نشان دهنده تسعه سریع هر د الین سللی nascent در ظرف کشت است. (f e) & رشد کلنی مشاهده شده بعد از الین پاساژمکانیکی رز 49 تا 48 بعد از کشت g) & (h.icm هر د الین سللی بابن که کلن شدهاند نشان دهنده یژگیهای ظاهری تعریف شده برای سللهای بنیادی ریانی هستند شامل نسبت باال هسته به سیتپالسم سللهایی که به شدت در کنار هم قرار گرفتهاند با هستکهای مشخص مرزهای مجی کلنیها. (j i) & کلنیهای BabESC به ترتیب در رز بعد از کشت. ستن سمت چپ:.BabESC-1 ستن سمت راست.BabESC-43 خط مقیاس c) & (j 21; µm عدسی شیئ 411X میکرسکپ معکس )چاپ مجدد با کسب مجز از Elsevier Limited از Simerly همکاران )2118( بنیان نهادن شناسایی سللهای بنیادی ریانی بابن: مدل قدیمیپرایمتها برای تحقیقات بازتانی پیند. 2: )Stem Cell J 9-1. یادداشتها 4- بابن میمن رسس ماده باید سنی بیشتر از 3 سال داشته باشند همچنین باید اطالعات دقیق رنه چرخه قاعدگی آنها حداقل برای 2 ماه ثبت شده باشد تا اطمینان حاصل شد که چرخه قاعدگی نرمال دارند )چرخه قاعدگی رسس 29 رز )10(; بابن 33±3 رز )19 0((. رسس بابنهای نر نیز باید باالی 3 سال سن داشته باشند همچنین بارری آنها باید مشخص ثابت شده باشد )نتاج بارر تلید که باشند(. پیش از هرگنه تحریک هرمنی سالمت حیانات باید تسط دامپزشک م اطمینان تایید شد. همچنین آزمنهای عممی سالمت از جمله شمارش سللهای خنی فراسنجههای شیمیایی مجد در خن ساختار دستگاه تناسلی از طریق معاینه میبایست بررسی شند. حیاناتی که بیماریهایی مانند Cercopithecine herpes virus یا (SRV) Simian Retrovirus Type D باید از چرخه کاری کنار گذاشته شند )18(. میمنهای رسس بابنها به طر معمل در شرایط بسته نگهداری میشند. دمای محیطی کنترل شده )20 درجهسانتیگراد( چرخه نری )42:42 نر-تاریکی( آب تمیز به صرت نامحدد دراختیارشان قرار داده میشد همچنین اندازه قفس نیز باید مناسب باشد. برای بابنها به منظر حفظ رفتار اجتماعی امکان نگهداری بابن ماده با یک نر ازکتمی شده جد دا )23(. تصمیم نگهداری حیانات به صرت گرهی یا انفرادی به عهده کمیته اخالق رفاه نگهداری حیانات است. میمنهای رسس با رفتار اجتماعی مناسب را میتان به صرت انفرادی یا زج در قفس نگهداری نمد اما بابنهایی را که بیشتر عادت به زندگی اجتماعی داشتهاند در صرتی که بخاهیم به صرت انفرادی نگهداری کنیم میبایست حداقل برای 3 ماه از گله جدا نگهداری نمد. بابنهای نر که برای گرفتن نمنه اسپرم به کار میرند میبایست برای یک مدت کتاه )حداقل 2 هفته( به صرت 15

52 انفرادی در قفس نگهداری شند. این امر باید قبل از تعیض با نر دیگر انجام شد تا از برز استرس تاثیر منفی آن بر کیفیت اسپرم جلگیری به عمل آید. برای تمام مادههایی که بهصرت انفرادی در قفس نگهداری میشند نشانههای استرس مانند آغشته کن بدن محیط پیرامن با مدفع کندن مها رفتار پرخاشگرانه در میان سایر مادهها قابل مشاهده است. اگر سرگرمی بیشتر با اسباب بازی آینه یا سایل کند کا در اختیارشان قرار گرفت لی همچنان عالئم استرس جد داشته هیچ کاهشی در این عالیم استرس مشاهده نشد حیانات ماده میبایست به شرایط نگهداری دسته جمعی بازگند. در نگهداری انفرادی حیانات باید در نظر داشت که هماره حیانات در تمام اقات بتانند حیانات قفسهای مجار را مشاهده نمایند همچنین حیانات مجارشان هماره باید ثابت باشند تا از برز استرس تاثیر آن در چرخه طبیعی فحلی جلگیری شد. شکل 3-1. از ریان رسس تا سلل بنیادی ریانی. (a) بالستسیست پرایمت غیرانسان باید کامال تسعه یافته باشد با ICM مج برجسته پیش از استفاده برای جداسازی سللهای بنیادی ریانی. (b) بعد از افزدن complement سللهای ترفکتدرم تجزیه میشند بالستسیست فرریخته خاهد شد. ترفکتدرم تجزیه شده با اتصال بسیار گسستنی با ICM در اتصال است. (c) ICM جدا شده کشت داده شده ری سللهای تغذیه کننده ریانی مش. (d) پاساژ الیه nhpes برای پاساژ دادن باید سللهای به شدت یکپارچه با هستکهای مشخص در اختیار داشته باشیم. )چاپ مجدد با کسب مجز از John Wiley & Sons, Inc از Navara همکاران.))2110( 2- استفاده از هرمن نترکیب انسانی به عنان یک محددیت کلی در تعداد دفعاتی که میتان از یک حیان ماده به اسطه تحریک هرمنی اسیت استحصال نمد به حساب میآید. به طر معمل بیشینه تحریک 3-2 تحریک بهای هر پرایمت غیرانسان ماده قبل از تلید آنتیبادی بر ضد این هرمنها در فراخانی اسیتها امکانپذیر است. اگر هرمن نترکیب م استفاده قرار نگی فقط یک تحریک ممکن است بدست آید )34 20( برای جمعآری اسپرم میمنهای رسس به اسطه استفاده از penile band تحریک کننده الکتریکی انل الزم 422 است که نرها به طر کامل به اسطه رش pole-and-collar آمزش داده شده باشند تا حیانات نر نشستن بر ری صندلی مهار کننده را بپذیرند. این رش آمزش یک رند مرحله به مرحله شامل بستن شل قالده در گن برای اتصال به میله مهار کننده را طی میکند. عادتپذیری برای بستن قالده ممکن است چند هفته به طل بیانجامد. در مرحله بعد نرها باید برای پذیرش اتصال قالده به میله مهار آمزش داده شند. همچنین میبایست بیامزند که در این حال به سمت صندلی حرکت که در جایگاه مربط مستقر شند. این ریه میتاند طالنی شده البته همه نرها نمیتاند کاندیدای نشستن ری صندلی شند. با این جد تقریبا بهخبی پذیرفته شده است که جمعآری نمنه منی با استفاده از تحریک الکتریکی انل به اسطه penile band دارای برتری در مقابل جمعآری من ی با استفاده از پراب مقعدی میباشد )31 43(. بابنهای نر که درشت هیکل بده به آسانی برای نشستن ری صندلی آمزش داده نمیشند ممکن است به دیگر حیانات یا افراد درگیر در کار با حیانات آسیب بزنند بهتر است که با یک بیهشی سطحی با استفاده از تحریک الکتریکی با پراب مقعدی نمنه منی را جمعآری ک. 1- در صرتی که امکان تهیه ماد شیمیایی محللهای نمکی قندها از شرکتهایی که تاییدیه ماد را صادر می- نمایند فراهم شد بهتر است که از این شرکتها خرید شد تا امکان تکامل برنتنی ریان مش را فراهم آ. برای لقاح BSA باید از نع فاقد اسید چرب Fraction V باشد. بهتر است که سدیم پیرات را از محلل دخیره شده 411mM باشته رقیق نماییم تا از برز اشتباه در زن نمدن مقادیر اندک پدر جلگیری شد. ph محلل TALP-HEPES را چک نمده بین میله قالده 16

53 0/2-0/1 تنظیم نمایید. تنظیم نمدن ph با افزدن 4 HCl نرمال یا هیدرکسید سدیم امکان پذیر است. ph محلل TALP ذخیره شده را میتان در انکباتر حای %3 دیاکسیدکربن بهتعادل رساند بعد از آن نباید دباره تنظیم شد. برای هر د محیط اسمالریته باید بررسی شد )محدده قابل قبل: (. mosm اسمالریتهای که کمی باالتر از این محدده باشد را میتان با استفاده از رش Boatman اصالح نمد )44(. در نهایت TL TL-HEPES را فیلتر نمده. فیلتراسین با استفاده از فیلتر 1/22 µm باید انجام شد. دمای 1 درجه سانتیگراد برای ذخیره نمد محیطهای فیلتر شده دمای تصیه شده میباشد. محلل ذخیره تلید شده برای استفاده به مدت 2 هفته مناسب میباشد. 3- تغییررنگ پست ناحیه Perineal در زمان چرخه فحلی طبیعی به عنان یک رش ارزیابی غیر تهاجمی برای بابن- های ماده در نظر گرفته میشد )32 4( همچنین اریانس زیادی در مقابل برنامه تحریک که در بابنها میمنهای رسس به طر یکسان به کار میرند جد دا ) ( برنامه تحریک کننده جایگزین استفاده از یک دز 21IU از r-hfsh r-hlh به همراه استفاده یک بار در رز از antideمیباشد )23(. بدن در نظر داشتن اینکه چه رژیمی برای تحریک استفاده شده است پاسخ بابنها به تحریک تسط همنهای نترکیب انسانی بسیار متغیر می- باشد. تعداد زیادی اسیت نا بالغ آسپیره شده در این رش به دست میآید )22 23(. همچنین بابنها نیازمند دزهای باالتری از ) IU( hcg در مقایسه با میمنهای رسس میباشند )23(. در دمین سمین تحریک با هرمنهای نترکیب انسانی برای بابنها میمنهای رسس بهطر کلی تعداد کمتری اسیت اسیت بالغ تلید جمعآری میشد. به نظر میرسد که دلیل این اتفاق پاسخ سیستم ایمنی بدن این حیانات به دارهای انسانی باشد )20(. حتی حیانات ماده دار نگرفته که شرایط سالمتی کامل را دارا میباشند از چرخه طبیعی برخار بده در محیط پایدار با شرایط ایدهآل نگهداری میشند میتانند پاسخهای ضعیفی به هرمنهای نترکیب انسانی با منشا برندی از خد برز دهند نرخ عدم مفقیت میتاند تا %33 باال رد )20(. تصیه میشد که سطح استرادیل سرم را رنه بررسی نمد. همچنین تعداد اندازه فلیکلها با سنگرافی باید بررسی شد. به هر ری محددیت قت کارشناسان به همراه تعداد دفعات مجاز برای بیهش نمدن یک حیان میتاند به عنان محددیتهای اینگنه اندازهگیریها قلمداد شد. باید به یاد داشت که مداخله دسترزی مکرر حیانات می- تاند منجر به برز استرس در حیانات شد )اسیر کن در قفس ا کن حیانات آرام کن )مهار کن( انتقال به محیط جدید غیره(. این استرس میتاند در پاسخ به تحریک مثر اقع شد. 2- رغن معدنی استفاده شده برای پشاندن قطرههای محیط کشت میتاند با داشتن برخی ماد سمی باعث ایجاد آسیب در گامتها اختالل در لقاح اسیت شد. بهترین نع رغن معدنی را میتان از مجمعههایی تهیه نمد که برای کلینیکهای انسانی ماد الیه را تهیه مینمایند زیرا این شرکتها تمامی م اد را در محیط کشت ریان آزمدهاند. رغن معدنی را زیر هد اشعه UV نگهداری نکید زیرا این کار میتاند منجر به تجزیه رغن معدنی به مادی شد که باعث تجزیه شدن اسیت یگت میشد. رغن معدنی را در محل خشک خنک به در از منبع نر نگهداری نمایید. تصیه میشد که بسته- های جدید رغن معدنی را قبل از آغاز آزمایش با استفاده از ریان مش م آزمن قرار دهید از تانایی آن در حمایت از تکین ریان تا مرحله بالستسیست مطمئن شید. 0- به یادداشته باشید زمان آسپیره نمدن اسیت در بابنها )32-32 ساعت بعد از تزریق )hcg طالنیتر از زمان گرش شده برای رسس )21-31 ساعت بعد از تزریق )hcg است. حداقل 1 نفر نیری متخصص در هنگام الپاراسکپی پیرایمتهای غیرانسان نیاز است یک متخصص بیهشی د نفر متخصص الپاراسکپی یک دستیار ابرآالت برای بازکن سرهم کن تجهیت الپاراسکپی. متخصص بیهشی باید رند بیهشی مین اشباع اکسیژن نرخ تنفس سطح دیاکسید- کربن نرخ ریتم ضربان قلب دمای بدن را چک کند. پتی گرم در تمام مدت عمل جراحی باید ری حیان باشد تا از حفظ دمای بدن در رند جراحی اطمینان حاصل شد. دامپزشک ارشد دستیارش عمل آسپیره نمدن اسیت را تقسیم مینمایند یکی از این د دربین گیره کنترل کننده الپاراسکپ را در کنترل گرفته دیگری تمرکز خد را بر ری سزن آسپیره کننده تخمدان قرار میدهد. ظایف نفر چهارم شامل بازکن بستههای استریل متصل نمدن سیستم لله به پمپ مکش اتصال 17

54 دربین الپاراسکپ به صفحه نمایش نگهداری للهها تعیض آنها در خالل آسپیره نمدن فلیکلها میباشد. تمام حیانات ماده بعد از عمل جراحی به دقت م مشاهده کنترل قرار میگیرند بعد از آنکه عالئم حیاتی به سطح قابل قبل بازگشت به قفس خد بازگانده میشند. مسکنهای متفاتی را میتان پیش پس از عمل جراحی برای کاهش د ناراحتی حیان استفاده نمد. همچنین آنتیبیتیکها پیش از عمل جراحی در خالل عمل جراحی بعد از عمل جراحی در صرت لزم استفاده میشند. تمام دارهای تجیز شده مسکنها مصرف شده برای هر حیان باید ثبت شد. 9- اگر امکانپذیر باشد بهتر است که 2 تا 3 حیان نر آماده جایگزین شدن برای اسپرم گیری داشته باشیم. زیرا تمام انلهای بدست آمده قابل استفاده در آزمایشگاه نیستند. این نکته به خصص زمانی که از پراب مقعدی برای تحریک انل استفاده میشد که معمال سایز نمنه به دست آمده کم میباشد برخی ماقع مقداری ادرار به طر ناخاسته در زمان انل ا منی میشد که باعث مرگ میر اسپرم نمنههای میشد ضرری میباشد. همچنین بهترین کار این است که نمنههای اسپرم به عنان الین کار در ال صبح قبل از آسپیره کن اسیتها جمع آری شد در نتیجه امکان شستش شمارش تحرک ریخت شناسی اسپرمها قبل از رسیدن اسیتها فراهم میشد. درحالی که از قبل اسپرمها آنالیز جمعآی شدهاند با این رش اسیتها پیر نخاهند شد. 8- دقت داشته باشید که اجازه ندهید تمام محیط از باالی فیلتر EM Con خارج شد. هماره اجازه دهید که 2-3 ml از مایع در باالی فیلتر EM Con باقیبماند زیرا در غیر این صرت امکان از بین رفتن اسیتها جد دا. از آنجا که محتای آسپیره شده از تخمدان معمال خنی است فیلتراسین منجر به افیش ضح مایع آسپیره شده میشد درحالی که محتای را نگه میدا به این ترتیب فیلتر نمدن مایع آسپیره شده به تشخیص اسیتها در ظرفهای کشت کمک میکند. در نتیجه نمنهها به سرعت قابل مشاهده شده جستج میشد )کمتر از 43 دقیقه با آمزش( کاهش زمان نگهداری اسیت در دمای اتاق مین اکسیژن مجد دراتمسفر منجر به ارتقای نتایج بدست آمده خاهد شد. بالغ سازی اسیتهای مرحله جرمینال 423 زیکل رسس بابن که از تخمدانهای تحریک نشده بدست آمده باشند مفقیت آمیز نخاهد بد. درحالی که بلغ اسیتهای GV بعد از تحریک تخمدان همچنان در سطحی پایینتر از مین مطلب برای لقاح کشت دراز مدت است )31(. اسیتهای بالغی که در ساعات الیه بعد از کشت برنتنی الین جسم قطبی را خارج ننمدهاند به طر معمل نرخ پایینتری از لقاح تکامل ریان را در مقایسه با اسیتهایی که به طر کامل بالغ شدهاند از خد نشان میدهند )33(. 41- ریه لقاح برنتنی در بابن ریه مفقیت آمیزی نیست شاید دلیل این امر مربط به مسئله بیشفعال سازی اسپرم باشد )32 21(. 11 در حال حاضر در بابنها ریه ICSI ریهای است که برای لقاح برنتنی ریه ترجیح داده شده است که با نرخ ثابت باالی لقاح منجر به تلد نتاج سالم میشد )23(. تشخیص زدهنگام یگت لقاح یافته طبیعی از باقی ریانها در صرتی که انتقال ریان با کیفیت در مرحله پایانی تکین پیش از النه گزینی در نهایت تلد نتاج سالم م نظر باشد میای بسیاری را در برخاهد داشت. یگتهای فعال شده که 3 4 یا تعداد بیشتری پیش هسته را دارا میباشند میتاند به تعداد 4 تا 2 دفعه تقسیم شند در نتیجه تشخیص تعیین ریانهایی که از نظر کرمزمی دچار نقص اشکال هستند را مشکل میسازد. برای دسته بندی یگتها ابتدا یگتها را به قطرات 411 µl از محلل TALP-HEPES که ری آنها با رغن معدنی پشانده شده است منتقل نمده در زیر میکرسکپ معکس با بزرگنمایی 21X به بررسی آنها بپازید. تمام اسیتهای بارر نشده )بارر نشده( یا یگتهایی با 3 4 یا بیشتر پیشهسته قابل مشاهده در سیتپالسم به همراه تمام یگتهای تحلیل رفته را خارج نمایید. اسیتهای طبیعی که دارای 2 پیشهسته هستند را میتانید به محلل تازه TALP که در انکباتر % به تعادل رسیده است منتقل نمایید تا مراحل تکین طبیعی را طی نماید. 44- به طر معمل تقریبا به طر همزمان میتان 3 تا 9 اسیت را از طریق ICSI بارر نمد. این امر کمک میکند که از قرار گرفتن بیش ا ز حد اسیتها در نسانات دمایی در شرایط گازی مجد در اتمسفر جلگیری شد. جنبایی اسپرمهای بدست آمده از نمنههای مختلف متفات میباشد. برخی ماقع اسپرمهایی که بسیار فعاالنه در محلل PVP شنا میکنند را ابتدا GV (Germinal Vesicul) 18

55 به سیله سزن تزریق بیحرکت نمایید. بیحرکت سازی اسپرم به این ترتیب انجام میشد که پیش از باشتن اسپرماتزا پیپت را در ناحیه میانی آکسنم با سرعت حرکت داده تا تحرک آن از بین برد. ضرری است که فقط یک اسپرم به داخل اسیت تزریق شد تا از برز پلیاسپرمی ممانعت شد. بنابراین بسیار با اهمیت میباشد که تعداد اسپرمهای باشته شده در پیپت ریزتزریق را شمارش نمده اطمینان حاصل نمد که یک اسپرم باشته شده است همچنین انتقال اسپرم به داخل سیتپالسم اسیت را باید مشاهده نمد. محلل PVP باید به صرت رنه تازه در همان رز انجام ICSI تهیه شد در پایان رز در ریخته شد. سزنهای تزریق را قبل از رسیدن اسیت اسپرم به آزمایشگاه در رز آسپیره نمدن آماده کنیم تا از برز تاخیر در لقاح ممانعت شد. از آنجا که مکان دمین دک تقسیم میز برپایه مکان دمین جسم قطبی به دقت قابل تشخیص نیست )29( برخی محققان ترجیح در استفاده از Pol-Scope دارند تا بتانند به طر پیا از دک تقسیم میزی در اسیت زنده تصیر باری نمایند تا از مکان دمین دک تقسیم میز اطمینان حاصل نمایند. این سیله از عدسی شیی circular polarization از متعلقات ریز للههای anisotropic برای نشان دادن دک تقسیم میزی شفاف در برابر سیتپالسم تاریک استفاده مینماید.)30-38( 4. Hendrickx AG, Kraemer DC (4829) Preimplantation stages of baboon embryos (Papio sp.). Anat Rec 422: Hendrickx AG (4804) Embryology of the baboon. The University of Chicago Press, Chicago, IL 3. Hendricks RD, Sawyer M (4803) Embryology of the macaque monkey. In: Bourne GH (ed) The rhesus monkey. Academic, New York, NY, pp Dierschke DJ, Clark JR (4802) Laparoscopy in Macaca mulatta : specialized equipment employed and initial observations. J Med Primatol 3: Bavister BD, Yanagimachi R (4800) The effects of sperm extracts and energy sources on the motility and acrosome reaction of hamster spermatozoa in vitro. Biol Reprod 42: Pope CE, Pope VZ, Beck LR (4892) Development of baboon preimplantation embryos to post implantation stages in vitro. Biol Reprod 20: Shaikh A, Shaikh S, Celaya C, Goldzieher J (4892) Ovulation pattern in successive cycles in the baboon. Primates 23: Bavister BD, Boatman DE, Leibfried L, Loose M, Vernon MW (4893) Fertilization and cleavage of rhesus monkey oocytes in vitro. Biol Reprod 29: Bavister BD, Boatman DE, Collins K, Dierschke DJ, Eisele SG (4891) Birth of rhesus monkey infant after in vitro fertilization and nonsurgical embryo transfer. Proc Natl Acad Sci USA 94: Clayton O, Keuhl TJ (4891) The fi rst successful in vitro fertilization and embryo transfer in a nonhuman primate. Theriogenology 24:229 (abstract) 44. Boatman DE (4890) In vitro growth of nonhuman primates pre- and peri-implantation embryos. Plenum, New York, NY 42. Wolf DP, Vandevoort CA, Meyer-Haas GR, Zelinski-Wooten MB, Hess DL, Baughman WL, Stouffer RL (4898) In vitro fertilization and embryo transfer in the rhesus monkey. Biol Reprod 14: Lanzendorf SE, Gliessman PM, Archibong AE, Alexander M, Wolf DP (4881) Collection and quality of rhesus monkey semen. Mol Reprod Dev 23: VandeVoort CA, Tarantal AF (4884) The macaque model for in vitro fertilization: superovulation techniques and ultrasound-guided follicular aspiration. J Med Primatol 21: Zelinski-Wooten MB, Hutchison JS, Hess DL, Wolf DP, Stouffer RL (4883) Follicle stimulating hormone alone supports follicle growth and oocyte development in gonadotrophin- releasing hormone antagonist-treated monkeys. Hum Reprod 41: Stevens VC (4880) Some reproductive studies in the baboon. Hum Reprod Update 3: منابع 13

56 40. Hewitson L, Takahashi D, Dominko T, Simerly C, Schatten G (4889) Fertilization and embryo development to blastocysts after intracytoplasmic sperm injection in the rhesus monkey. Hum Reprod 43: Hewitson L, Schatten G (2112) The use of primates as models for assisted reproduction. Reprod Biomed Online 3: Hewitson L, Martinovich C, Simerly C, Takahashi D, Schatten G (2112) Rhesus offspring produced by intracytoplasmic injection of testicular sperm and elongated spermatids. Fertil Steril 00: D Hooghe TM, Spiessens C, Chai DC, Mwethera PG, Makokha AO, Mwenda JM (2111) Ovarian stimulation, egg aspiration, in vitro fertilization and embryo transfer in the baboon ( Papio anubis ): a pilot project at the Institute of Primate Research, Nairobi, Kenya. Gynecol Obstet Invest 30: Wolf DP (2111) Assisted reproductive technologies in rhesus macaques. Reprod Biol Endocrinol 2: Honore EK, Tardif SD (2118) Reproductive biology of baboons. In: VandeBerg JF (ed) The baboon in biomedical research. Springer, New York, NY 23. Nyachieo A, Spiessens C, Chai DC, Mwenda JM, D Hooghe TM (2118) Menstrual cycle synchronization, ovarian stimulation, and in vitro fertilization in olive baboons ( Papio anubis ): a prospective randomized study. Fertil Steril 84: Nyachieo A, Spiessens C, Mwenda JM, Debrock S, D Hooghe TM (2118) Improving ovarian stimulat ion protocols for IVF in baboons: lessons from hu mans and rhesus monkeys. Anim Reprod Sci 441: Simerly CR, Castro CA, Jacoby E, Grund K, Turpin J, McFarland D, Champagne J, Jimenez JB Jr, Frost P, Bauer C, Hewitson L, Schatten G (2141) Assisted Reproductive Technologies (ART) with baboons generate live offspring: a nonhuman primate model for ART and reproductive sciences. Reprod Sci 40: Chang TC, Eddy CA, Ying Y, Liu YG, Holden AE, Brzyski RG, Schenken RS (2144) Ovarian stimulation, in vitro fertilization, and effects of culture conditions on baboon preimplantation embryo development. Fertil Steril 83: Stouffer RL, Zelinski-Wooten MB (2111) Overriding follicle selection in controlled ovarian stimulation protocols: quality vs quantity. Reprod Biol Endocrinol 2: Hewitson L, Dominko T, Takahashi D, Martinovich C, Ramalho-Santos J, Sutovsky P, Fanton J, Jacob D, Monteith D, Neuringer M, Battaglia D, Simerly C, Schatten G (4888) Unique checkpoints during the fi rst cell cycle of fertilization after intracytoplasmic sperm injection in rhesus monkeys. Nat Med 3: VandeVoort CA, Baughman WL, Stouffer RL (4898) Comparison of different regimens of human gonadotropins for superovulation of rhesus monkeys: ovulatory response and subsequent luteal functions. J In Vitro Fertil Embryo Transfer 2: Davenport AT, Lees CJ, Green HL, Grant KA (2113) Long-acting depot formulation of luprolide acetate as a method of hypothalamic down regulation for controlled ovarian hyperstimulation and oocyte production in Macaca fascicularis. Biol Reprod 29: Tarantal AF (4881) Interventional ultrasound in pregnant macaques : embryonic/fetal applications. J Med Primatol 48: Mastroianni L Jr, Manson WA Jr (4823) Collection of monkey semen by electroejaculation. Proc Soc Exp Biol Med 442: Amboka JN, Mwethera PG (2113) Characterization of semen from olive baboons. J Med Primatol 32: VandeVoort CA (2111) High quality sperm for nonhuman primate ART: production and assessment. Reprod Biol Endocrinol 2: Sanchez-Partida LG, Simerly CR, Ramalho- Santos J (2119) Freeze-dried primate sperm retains early reproductive potential after intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 98: Wolf DP (2118) Arti fi cial insemination and the assisted reproductive technologies in non -human primates. Theriogenology 04:

57 30. Cseh S, Chan PJ, Corselli J, Bailey LL (2111) Electroejaculated baboon ( Papio anubis ) sperm requires a higher dosage of pentoxifylline to enhance motility. J Assist Reprod Genet 40: Boatman DE, Bavister BD (4891) Stimulation of rhesus monkey sperm capacitation by cyclic nucleotide mediators. J Reprod Fertil 04: VandeVoort CA, Tollner TL, Overstreet JW (4881) Separate effects of caffeine and dbcamp on macaque sperm motility and interaction with the zona pellucida. Mol Reprod Dev 30: Nyachieo A, Spiessens C, Chai DC, Kiulia NM, Mwenda JM, D Hooghe TM (2141) Separate and combined effects of caffeine and dbcamp on olive baboon ( Papio anubis ) sperm. J Med Primatol 38: Hewitson LC, Simerly CR, Tengowski MW, Sutovsky P, Navara CS, Haavisto AJ, Schatten G (4882) Microtubule and chromatin configurations during rhesus intracytoplasmic sperm injection: successes and failures. Biol Reprod 33: Nusser KD, Mitalipov S, Widmann A, Gerami- Naini B, Yeoman RR, Wolf DP (2114) Developmental competence of oocytes after ICSI in the rhesus monkey. Hum Reprod 42: Ng SC, Martelli P, Liow SL, Herbert S, Oh SH (2112) Intracytoplasmic injection of frozenthawed epididymal spermatozoa in a nonhuman primate model, the cynomolgus monkey ( Macaca fascicularis ). Theriogenology 39: Hewitson L, Simerly CR, Schatten G (2113) ICSI, male pronuclear remodeling and cell cycle checkpoints. Adv Exp Med Biol 349: Wolf DP, Thormahlen S, Ramsey C, Yeoman RR, Fanton J, Mitalipov S (2111) Use of assisted reproductive technologies in the propagation of rhesus macaque offspring. Biol Reprod 04: Yeoman RR, Mitalipov S, Gerami-Naini B, Nusser KD, Wolf DP (2113) Low temperature storage of rhesus monkey spermatozoa and fertility evaluation by intracytoplasmic injection. Theriogenology 23: Slayden OD, Brenner RM (2112) A critical period of progesterone withdrawal precedes menstruation in macaques. Reprod Biol Endocrinol 1(Suppl 4):S2 19. VandeBerg JF, W illiams-blangero S, Tardif SD (2119) The baboon in biomedical research series: developments in primatology: progress and prospects. Springer, New York, NY 18. Schroder M, Fisk SK, Lerche NW (2111) Eradication of simian retrovirus type D from a colony of cynomolgus, rhesus, and stumptailed macaques by using serial testing and removal. Contemp Top Lab Anim Sci 38: Bavister BD, Dees C, Schultz RD (4892) Refractoriness of rhesus monkeys to repeated ovarian stimulation by exogenous gonadotropins is caused by nonprecipitating antibodies. Am J Reprod Immunol Microbiol 44: Bavister BD (2111) ARTs in action in nonhuman primates: symposium summary advances and remaining issues. Reprod Biol Endocrinol 2: Zuckerman S, Parkes A (4832) The social life of monkeys and apes. In: Proc Zool Soc, Kegan Paul, Trench, Trubner and Company, London, pp XII, Nyachieo A, Spiessens C, Chai DC, Debrock S, Mwenda JM, d Hooghe TM (2144) Randomized comparison of different ovarian stimulation regimens for assisted reproductive technology in baboons ( Papio anubis ). Fertil Steril 83: de Prada JK, Hill DL, Chaf fi n CL, VandeVoort CA (2118) Nuclear maturation and structural components of nonhuman primate cumulusoocyte complexes during in vivo and in vitro maturation. Fertil Steril 84: Dupont C, Bavister BD, Armant DR, Brenner CA (2118) Rhesus macaque embryos derived from MI oocytes maturing after retrieval display high rates of chromosomal anomalies. Hum Reprod 21: Fourie FR, Snyman E, van der Merwe JV, Grace A (4890) Primate in vitro fertilization research: preliminary results on the folliculogenic effects of three different ovulatory induction agents on the chacma baboon, Papio ursinus. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol 90: Keefe D, Liu L, Wang W, Silva C (2113) Imaging meiotic spindles by polarization light micros copy: principles and applications to IVF. Reprod Biomed Online 0:

58 39. Montag M, van der Ven H (2119) Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reprod Biomed Online 40: Shen Y, Betzendahl I, Tinneberg HR, Eichenlaub-Ritter U (2119) Enhanced polarizing microscopy as a new tool in aneuploidy research in oocytes. Mutat Res 234:434 52

59 فصل 3 ترکیب محیط کشت: نمک اسمالریته نمکها از اجی اصلی محیطهای کشت ریان میباشند. این نمکها در محیطهای آبی به ینهای معدنی مرتبط تفکیک میشند. تمام محیطهای کشت ریان از 2 ین معدنی ثابت تشکیل شده است: 2- Na +, K +,Cl -,Ca 22,Mg 22, SO1 البته اغلب این محیطهای کشت حای -2 PO1 نیز میباشند. ترکیب نمکهایی که برای ساخت محیطهای کشت ریان استفاده میشند میتانند مشابه ترکیب مجد در محلل نمکی کالسیک باشند. از جمله این محللهای نمکی ساده میتان به محلل 421 بیکربنات-کربس-رینگر اشاره نمد. این محلل نمکی در نیمه ال قرن بیستم به منظر کشت سللهای بدنی در شرایط برنتنی تلید شد م استفاده قرار گرفت. غلظت نمکها ینهای معدنی در محیط کشت Whitten که استفاده از آن برای الین بار منجربه تلید مفقیت آمیز ریان مش شد دقیقا مشابه محیط کشت KRB میباشد. این محیط کشت به مدت یک دهه تقریبا دست نخه باقی ماند. همچنین ترکیب غلظت ینهای مجد در محیط کشت M42 که در دهه 4801 میالدی فرمالسین تلید شد کامال مشابه با ترکیب ینی مجد در محیط کشت Whitten میباشد. در مطالعات ابتدایی 423 کشت ریانهای انسان با استفاده از محیطهای کشت تعریف نشده که مخصص کشت سللهای سماتیک میباشند انجام میشد. از جمله این محیطهای کشت تعریف نشده میتان به محیط Earle s Ham s که با سرم غنیسازی میشند اشاره نمد. در ااسط دهه 4891 میالدی این محیطهای کشت تعریف نشده دچار تغییراتی شدند. به این ترتیب محیط کشت تعریف شدهای که به طر اختصاصی برای کشت ریانهای انسان م استفاده قرار میگرفت تلید شد این محیط کشت تعریف شده با نام Quinn s HTF شناخته میشد. ترکیب ینهای معدنی محیط کشت Quinn s HTF کامال مشابه ترکیب مجد در محیط کشت M42 Whitten s میباشد. تمامی محیطهای کشت یاد شده در کلینیکهای بارری نابارری همچنین در آزمایشگاههای تحقیقاتی برای تلید ریان م استفاده قرار میگرفتند اما اغلب ریانهای کشت داده شده در این نع از محیطهای کشت دچار تقف تکین رشد در مراحل ابتدایی زندگی خد پیش از انتقال میشدند. این تقفهای رشد تکین در مش در مرحله 2 سللی در م ریانهای انسان در مرحله 1 تا 9 سللی به قع میپیست. با آغاز سالهای پایانی دهه 4891 میالدی تحلی در تلید محیطهای کشت مربط به ریان مش رخ داد که منجر به کاهش در نرخ تقف تکین ریان مش در مرحله 2 سللی شد. این محیطهای کشت از جمله CZB KSOM دارای اسمالریته بسیار کمتری در مقایسه با محیطهای کشت قدیمی بدند. پایینتر بدن اسالریته به دلیل کاهش در غلظت ینهای معدنی به کار رفته در این محیطه یا کشت میباشد. عمال کاهش در اسالریته کاهش در غلظت ینهای معدنی محیطهای کشت که منجر به افیش نرخ تکامل ریان در دره پیش از النهگزینی شد نشان داد که عامل کلیدی مجد در محیط کشت که منجر به برز تقف در رند تکامل ریان میشده است دارای چه ماهیتی میباشد. قدم تکمیلی بعد در راستای ارتقای کیفی محیطهای کشت ریان شامل افزدن اسیدهای آمینه به فرمالسین محیطهای کشت مربط به ریان انسان مش بد. حداقل بخشی از فاید استفاده از این 422 محیطهای کشت ارتقا یافته که منجر به افیش نرخ تکین ریان عبر از مرحله تقف سللی در مرحله کلیاژ میشد مربط به حضر مکانیسمی میباشد که در جهت تنظیم حجم سلل دخیل بده ابسته به تجمع اسیدهای آمینه به عنان اسملیتهای ارگانیک در درن سلل میباشد. در حقیقت این اسیدهای آمینه یک پشتیبانی اسمتیک درن سللی را برای ریانها فراهم میآرند. این اسیدهای آمینه به یژه گلیسین جایگزین بخشی از ینهای معدنی درن سللی میشند که در صرت عدم حضر اسیدهای آمینه )گلیسین( این ینها میبایست جهت حفظ اندازه سلل در درن ریانها تجمع مییافتند. این تجمع ینی به منظر حفظ حجم سلل میتاند باعث برز آثار مخرب در نهایت تقف تکین تکامل ریان در مراحل Krebs-Ringer Bicarbonate (KRB) Undefined medium cleavage 59

60 قبل از النه گزینی شد. بنابراین سطح بهینه نمکها اسمالریته محتای اسیدهای آمینه بهکار رفته در محیطهای کشت از یکدیگر مستقل نمیباشند بلکه بهشدت با یکدیگر تقابل اثر دارند. تقابل اثر مذکر بین اجی اسملیت محیط کشت به دلیل نقش این ماد در تنظیم حجم سلل میباشد. در غیاب اجی اسملیت ارگانیک که تسط ریان قابل استفاده باشد ریانها تنها درصرت کاهش اسمالریته محیط کشت غلظت نمکها در محیط کشت میتانند تسعه تکامل یابند. اما در زمانی که اسملیتهای ارگانیک از جمله اسیدهای آمینه در محیط کشت حضر داشته باشند ریانها در محیطهای کشت با اسمالریته باال که قابل مقایسه با اسمالریته مایع مجد در ایداکت میباشند هم قادر به رشد خاهند بد مقدمه نمک ها در محیط کشت ریان انسان اکثریت غریب به اتفاق ماد محلل در محیطهای کشت ریان از ینهای معدنی حاصل از نمکها تشکیل شده است. تمامی محیطهای کشت ریان انسان که به صرت تجاری تلید عرضه میشند دارای 2 ین - Cl Na + SO1-2 Mg 22 Ca 22 + K میباشند. این 2 ترکیب در اقع پایه محیطهای کشت ریان مش میباشند که در اایل دهه 4831 میالدی تسعه یافته بدند )24 2(. اغلب محیطهای کشت حای -2 PO1 نیز هستند. اگرچه محیطهای کشتی که به طر اختصاصی برای ریانها در مرحله کلیاژ سللهای تخم تلید میشند فاقد -2 PO1 میباشند. تقریبا از بین این 0-2 ین معدنی سدیم کلراید بهمقدار بیشتری در محیطهای کشت حضر دارند. بهعاله غلظتهای بسیار پایین از سایر ینهای معدنی نیز به محیطهای کشت ریان اضافه میشند به خصص زمانی که این محیطهای کشت با منابع پرتئینی از جمله سرم یا سرم آلبمین غنیسازی شده باشند. دلیل این امر تمایل زیاد سرم آلبمین برای جذب )کیالت کن( ینهایی مانند CU 22 Zn 22 میباشد )3(. البته سرم آلبمین ماد مشابه از جمله EDTA میتانند اثرات مفید خد را از طریق کیالت کن ینهای دیگر که در صرت باالرفتن از مقدار مجاز منجر به برز اثرات سمی میشند اعمال نمایند. منبع ینهای معدنی در محیطهای کشت ریان به طر عمده نمکهایی هستند که در فرمالسین محیطهای کشت استفاده میشند )جدل 4-3(. منبع عمده سدیم نمکهای NaCl NaHCO 3 میباشند. البته نمک های سدیمی پیرات الکتات فسفات سیترات استات نیز به مقادیر کمتر در فراهم کن ین سدیم دخیل میباشند. مقادیر به نسبت ناچیز سدیم نیز میتاند از طریق سایر ترکیبات (EDTA) حای سدیم به محیط کشت افزده شد. ین کلراید مجد در محیطهای کشت تقریبا به طر عمده از NaCl حاصل میشد. منابعی مانند KCl MgCl 2 CaCl 2 یا کلینکلراید از جمله منابعی هستند که بخش جزیی از ین - Cl مجد در محیطهای کشت را تامین می- نمایند. آخرین ین تک ظرفیتی مجد در محیط کشت پتاسیم میباشد که به طر عمده از KCl به کار رفته در فرمالسین محیطهای کشت حاصل میشد. البته مقادیر به نسبت کمی از ین پتاسیم از نمکهایی مانند فسفات پتاسیم نیز تامین میشد. Ca 22 از نمکهای CaCl یا کلسیم الکتات اضافه شده به محیطهای کشت بدست میآید. البته مقادیر اندکی 2 ین دظرفیتی 22 Ca 22 نیز از منابع پنتتنات کلسیم حاصل میشد. Mg 22 MgSO SO به 1 اغلب به همراه یکدیگر به عنان نمک 1 از ین +2 MgCl Mg به محیط کشت محیط کشت اضافه میشد. اگرچه در یک سری از محیطهای کشت ریان انسان به اسطه 2-2 PO در محیط کشت حضر دا از یکی از د منبع نمکی سدیم یا پتاسیم مربط به محیط کشت افزده میشد. زمانی که 1 افزده شده است. در نظر داشتن این نکته که منشا نمکی ینهای مذکر از نظر فیزیلژیی نمیتاند تعیین کننده منشا اثر باشد در تهیه محیطهای کشت بسیار حایز اهمیت میباشد ( البته با این پیش فرض که تمام نمکهای به کار رفته مناسب کشت ریان بده خالص میباشند(. این امر مهم به دلیل خاصیت تفکیک شدن نمکها در محیط آبی به اجی ینی سازندهشان میباشد )1(. بنابراین زمانی که یک محیط کشت ساخته شده از نمکهای معدنی به گنهای است که تمام ینهای مجد در آن قابل مبادله تعیض میباشند تنها مهمترین عامل غلظت نهایی هریک از ینهای ششگانه است که در تعیین یژگیهای فیزیکی- شیمیایی محیط کشت تسعه تکامل ریان مثر میباشند. 51

61 جدل نمکهای استفاده شده در محیطهای کشت ریان انسان مش کل ین کلر ید سل فات منیز کلرید منیز یم پنتتنا ت کلسی الک تات کلس کلر ید کل فسفا ت پتا نمکها کلر ید پتا استا ت سد سیترا ت سدیم سد یم فسفا سدی م الک سدیم پیرا ت بیکربنا ت سدیم کلر ید سد یم یم م یم سیم سیم سیم یم ت تات X X X X X X X X X محیط- کشت شرکت تلید کننده Cook IVF Cook IVF Cooper Surgical (SAGE) Cooper Surgical (SAGE) GyneMe d FertiPro N.V. Irvine Scientifi c LifeGlo bal (IVFonli ne) Origio (MediC ult) VitroLif e n/a (mouse) Sydney IVF Cleavag e Sydney IVF Blastoc yst Quinn s Advanta ge Cleavag e Quinn s Advanta ge Blastoc yst X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X GM314 X X X X X X X X FertiCul X X X X X X X X t IVF FertiCul t G3 X X X X X X X X SSM X X X X X X X X P4 X X X X X X X X ECM X X X X X X X X Multibl X X X X X X X X X ast global X X X X X X X X HTF X X X X X X X X Blastoc X X X X X X X X yst Univers X X X X X X X X al IVF ISM4 X X X X X X X X X X ISM2 X X X X X X X X X X X X X Embryo X X X X X X X X Assist BlastAs X X X X X X X sist G-4 X X X X X X X X X X (G3 series ) G-2 X X X X X X X X X (G3 series ) Whitten X X k k X X X k X s M42 X X X X X X X X CZB X X X X X X X X KSOM X X X X X X X X 55

62 تاریخچه محیط کشت ریان: چرا این نمکها استفاده شدهاند تاریخ الین کشت ریان به سال 4842 باز میگد. این رند کشت مفقیتآمیز بالستسیت خرگش تسط Barchet همکاران به قع پیست )3(. در سال Lewis 4833 Hartmann الین کارهای آزمایشی در کشت ریان پرایمتها )میمن رسس( در مرحله کلیاژ را آغاز نمدند )2( در تمام این آزمایشات از مایعات پیچیده بیلژیک مانند سرم یا پالسمای خن )0( استفاده شده بد. ماهیت غیر مشخص متغیر چنین مایعات بیلژیکی نه تنها برای ریههای آزمایشگاهی بسیار مشکلساز بد بلکه استفاده از پالسما یا سرم مانع تسعه تکامل ریان اکثر پستانداران از جمله جندگان مشهر آزمایشگاهی میشد )مرر شده تسط )9( Pncus )0(.)Alexander الین محیط کشت ریان که کامال تعریف شده دارای اجی مشخص بد برای الین بار در سال 4832 تسط Whitten برای ریانهای مش ساخته شد )2(. محیط کشت Whitten برپایه رینگر-کربس- بیکربنات (KRB) بنا شده بد که در سال 4832 تسط Krebs )8( Henseleit فرمله شده بد. KRB یک محلل نمکی بافری ساده شامل سیستم بیکربنات / 2 CO میباشد که برپایه محلل Warburg تلید شده است. محلل Warburg از نظر محتای بیکربنات / 2 CO مشابه غلظتهای فیزیلژی بیکربنات / 2 CO میباشد. جه تمایز KRB محلل Warburg در این نکته نهفته است که غلظت های ینهای معدنی در KRB به دقت تنظیم شده است به طری که این غلظتها در KRB مشابه غلظت سرم پستانداران شده است. این تشابه برپایه اندازهگیری غلظتهای ینهای معدنی در سرم خن اغلب پستانداران ایجاد شده است که در مطلعات دهه به اثبات رسیده بد )8(. این محیطهای ابتدایی سعی در شبیهسازی شرایط درن- تنی برای سللها را داشتهاند که در نهایت منجر به تالشهایی برای هرچه بیشتر نزدیک کن ترکیب این محیطها با ترکیب مایعات تلید شده از ایداکت رحم شد. ریانهای مش تحت هیچ شرایطی در محیط کشت KRB به هیچ مرحلهای از تکامل دست پیدا نمیکنند. اما استفاده از محیط کشت Whitten )جدل ( که فقط به اسطه افزدن گلکز BSA نسبت به KRB متفات میباشد منجر به حمایت از رشد تکامل ریانها از مرحله 9 سللی تا مرحله بالستسیت میشد )2(. این بالستسیتها دارای قدرت زندهمانی هستند زیرا بعد از انتقال منجر به تلد ند شدهاند )41(. خیلی زد مشخص شد که محیط کشت Whitten تانایی حمایت از تسعه تکین ریان در شرایط برنتنی را دا مشابه با شرایطی که محیط کشت ساده تعریف شده مکمل سازی شده با الکتات برای ریانها فراهم میکند )کلسیم الکتات یا سدیم الکتات(. این ترکیبات تانایی تسعه ریان از مرحله 2 سللی به بعد را دارا میباشند. اما متاسفانه این محیط کشت تانایی القا حمایت از رشد تکین ریان از مرحله لقاح به مرحله 2 سللی را از خد نشان نمیدهد )44(. نزدیک به یک دهه بعدWhittingham Biggers, Donohue مشخص نمدند که افزدن پیرات منجر به تلید محیط کشتی میشد که میتاند تسعه تکامل ریان را از مرحله لقاح تخم به مرحله 2 سللی حمایت کند )242 43(. تنها تغییر ایجاد شده در این محیط افزدن منبع انرژی )گلکز الکتات پیرات( به محیط کشت بده است. دلیل این ادعا تشابه کامل ترکیبات نمکی / ینی مجد در فرمالسین محیط کشت تعریف شده تسط این 3 محقق با محیط کشت KRBمیباشد. در طی دهه 4821 میالدی تا اایل دهه 4801 میالدی مجمعهای از محیطهای کشت تسعه یافتند که شامل محیط M42 )241 Whittingham 43( بد که برای دههها به عنان محیط کشت پایه استاندا کشت ریان مش شناخته شده بد )مرر شده در منابع )24 42((. 241 محیط کشت M42 از نظر ترکیب غلظت ینهای معدنی کامال مشابه KRB میباشد به جز اینکه الکتات سدیم )23 میلی مل( جایگزین NaCl شده که منجر به کاهش در مقدار کل ین کلراید شده. همچنین محتای کلسیم این محیط نیز به مین متسط کاهش یافته است )جدل (. مطالعات زیادی انجام شد تا بتانند محیط کشت تعریف شده برای ریانهای همستر تلید شد. به یژه گره Bavister پیشتاز این تالشها بد که در نهایت مفق به تلید محیط کشتی شدند که از نظر ترکیب نمکی مشابه KRB M42 بده است. البته این گره سلفات را از ترکیب م نظر خد حذف نمدند )40(. جالب تجه این نکته بد که از بین ینهای معدنی در محیط کشت KRB فقط حذف سلفات تاثیری ری تسعه تکامل ریانهای مش ندا )41(. اختراع این محیط کشت نه تنها به طر سیعی ریانشناسی آزمایشی را تسهیل نمد بلکه عاملی کلیدی در تلید نسل ال محیطهای کشت فرمله شده برای تلید ریانهای انسان از جمله HTF 56

63 بده است )49(. این محیطهای کشت مخصص دارای ترکیب ینی معدنی مشابه با هم میباشند )در ادامه تضیح داده شده است(. اما این محیط کشت تانایی حمایت کامل از تسعه تکین سلل تخم لقاح یافته تا مرحله بالستسیت را نداشته است. تکین سلل تخم لقاح یافته مش تنها تا رسیدن به مرحله 2 سللی حمایت میشد. ریانهای تلید شده در شرایط درنتنی که در مرحله 2 سللی از درن بدن خارج شده م کشت در شرایط برنتنی قرار میگرفتند تانایی تکین تا مرحله بالستسیست را داشته بدن هیچ مشکلی مراحل تکین برنتنی را سپری مینمدند. اما همانطر که پیشتر نیز بیان شده بد این محیط های کشت تانایی حمایت از سلل تخم لقاح یافته مش تا مرحله بالستسیست را نداشته است این سللهای تخم لقاخ یافته در نهایت در مرحله 2 سللی متقف میشدند )48(. این تقف که محصل کشت سلل تخم در شرایط برنتنی می- 420 باشد با عنان تقف 2 سللی شناخته میشد. تقف 2 سللی ریانهای مش ماده در تمام سیهها ژنتیپهای مش به چشم میآید به جز در م مشهای هیبرید F4 که این اتفاق رخ نمی دهد )4(. ریان سایر گنههای پستانداران نیز از چنین تقفی در رند تکین رنج میبرند به عنان مثال ریانهای همستر در مرحله 2 تا 1 سللی متقف میشند )21( درحالی که تقف در مرحله 2 سللی برای رت )24( 9 سللی برای گا )22( 1 تا 9 سللی برای ریانهای انسان )23( به اثبات رسیده است. رند تقف تکین ریان تا ااخر دهه 4891 میالدی اایل دهه 4881 همچنان به صرت یک مشکل حل نشده باقی 429 مانده بد. در دره زمانی مطالعات سیعی تسط مرکز ملی تسعه سالمت کدکان جامعه بشری امریکا در زمینه تلید محیطهای کشت ریان انجام شد که منجر به تلید د محیط کشت برای ریانهای مش شد. الین محیط کشت تلید محیط کشت شده تسطChatot Bavister, Ziomek, همکاران با نام CZB شناخته میشد )21(. محیط کشت CZB بسیار مشابه M42 میباشد. البته تفاتهای اندکی بین فرمالسین این د محیط کشت دیده میشد )جدل (. این تفاتها شامل افزدن گلتاتین EDTA افیش در مقدار الکتات / پیرات حذف NaClمیباشد. دلیل افزدن گلتاتین نتایج تحقیقاتی بد که اثر مفید افزدن این ماده در محیط کشت بر تسعه ریان همستر را نشان میداد. به عاله در م مصرف CZB نکته حایز اهمیت استفاده از محیط کشت د مرحلهای میباشد. استفاده از محیط کشت د مرحلهای باعث غلبه بر مشکل تقف تکین ریانهای مش نژادهای مختلف میشد. تهیه د مرحلهای محیط کشت CZB شامل حذف گلکز از این محیط برای 2 رز ال کشت افزدن گلکز به محیط CZB برای کشت ریانهای 1 تا 9 سللی به بعد میباشد. در صرت حضر گلکز در محیط کشت CZB در 2 رز ابتدایی کشت با مشکل تقف تکین ریانها ماجه خاهیم شد. دمین محیط کشت معرفی شده تسط Culture Club با نام KSOM شناخته شده است. KSOM تسط گره Biggers تلید طراحی شد )جدل (. KSOM محصل نهایی از مجمعه سیع محیطهای کشت ریان بد که به کمک بهینهسازی Simplex تلید میشدند. بهینهسازی Simplex در حقیقت با استفاده از یک الگریتم کامپیتری به بهینه- سازی بازده اکنشهای بین ماد شیمیایی میپازد )23(. یکی از محصالت نهایی تلید شده به اسطه نرم افر بهینهسازی Simplex 428 بد. SOM تانایی حمایت از تسعه تکین ریانهای مش با بهرهگیری از محیط کشت یک مرحلهای حای گلکز از ابتدای مرحله تقف د سللی را دارا میباشد )22(. مطالعات آتی نشان داد که باالبن غلظت ین پتاسیم در محیط کشت نسبت + K/ Na + داخل سلل را بهینه مینماید. شایان ذکر است که SOM حای غلظتهای بسیار اندک ین پتاسیم می- باشد )20(. این مطالعات منجر به افیش ین پتاسیم در فرمالسین نهایی محیط کشت شد. این افیش در محتای ین پتاسیم محیط کشت SOM منجر به تغییر نام آن به KSOM شد SOM( مکمل سازی شده با پتاسیم(. محیط کشت KSOM هم اکنن به طر نرمال در کشت ریانهای مش م استفاده بهره باری قرار میگی )229 28(. محیط کشت KSOM نیز همانند CZB حای گلتاتین EDTA میباشد. در محیط کشت KSOM همچنین شاهد حضر اجئی که در محیط کشت Whitten شرکت داشته است میباشیم. البته غلظت تمامی نمکها در خالل بهینهسازی دستخش تغییر شده است که cell block NIH SOM (Simplex Optimized Medium) 57

64 این تغییرات منجر به تمایز KSOM نسبت به KRB Whitten یا M42 میگد )جدل 2-3(. یکی از تفاتهای ایجاد شده در محیطهای کشت نین در مقایسه با M42 سایر محیطهای کشت کالسیک افزدن اسیدهای آمینه به محیط کشت میباشد. تا قبل از تلید محیط کشت CZB KSOM هیچکدام از محیطهای کشت کالسیک حای اسید آمینه نبد. درحالی که KSOM CZB با افزدن گلتاتین تقیت غنیسازی شدند. مطالعات انجام شده تسط گره Bavister مشخص ک که یک مجمعه چندتایی از اسیدهای آمینه میتانند در تسعه تکامل ریانهای همستر نقش مفیدی ایفا نماید درحالی که برخی دیگر از اسیدهای آمینه اثرات مضر مخربی در رند تسعه تکین ریان از خد برز میدهند )40(. Gardner Lane نشان دادند که مجمعه اسیدهای آمینه غیرضرری Eagle دارای اثرات مفیدی ری تسعه تکین ریانهای مش میباشند )34(. تغییر تحل انجام شده حاصل از نتایج ذکر شده منجر به تلید محیط کشت KSOM بهینه شده با نام KSOMaa شد. محیط کشت KSOMaa حای تمامی 21 اسید آمینه شناخته شده در بدن مجدات زنده میباشد که منجر به تکین بالستسیستهای سالم تانمند شده است )232 33(. محیط کشت KSOM بهینه شده که تنها حای اسیدهای آمینه غیر ضرری Eagel میباشد تانایی حمایت از تکین ریانهای مش از مرحله کلیاژ تا انتهای مرحله پیش از النه گزینی را دارا میباشد )234 31(. همانطر که در ادامه بحث شده است اثرات مفید افزدن مجمعهای از اسیدهای آمینه به محیطهای کشت KSOM CZB باعث ایجاد تغییرات در غلظت نمکهای این محیطهای کشت در مقایسه با محیطهای کشت کالسیک شده است. مشخص شده که اثرات غلظتهای مختلف ینهای معدنی ری تسعه تکین ریان ابسته به حضر اسیدهای آمینه میباشد بلعکس این ماجرا نیز صادق خاهد بد تاریخچه محیط های کشت ریان انسان محیطهای کشت م استفاده در دهه ال آغاز مطالعات ری ریان انسان شامل محیطهای کشتی بد که به منظر کشت سللهای سماتیک انسان استفاده میشد. از جمله این محیطهای کشت میتان به محیطهای کشت سادهای همچن محیط کشت Earle که مقداری پیرات سرم به آن اضافه شده بد اشاره نمد. از سی دیگر محیطهایی با پیچیدگی نسبی بیشتر نیز در این رند م استفاده قرار میگرفت که از آن جمله میتان به محیط کشت 41-F Ham s که سرم به آنها افزده شده بد اشاره ک. با تجه به افزدن سرم به تمامی این محیطهای کشت میتان به این نکته اشاره ک که این محیطها به 431 اسطه حضر سرم در ترکیبشان در طبقه بندی محیط کشت تعریف شده قرار نمیگی )33(. در ااسط دهه 4891 میالدی محیطهای کشت ریان به طر اختصاصی برای ریانهای انسان تلید شد که فرمالسین آنها با تجه به ترکیب مایع مجد در لله فالپ تنظیم شده بد. محیط کشت )49( Quinn s HTF 434 برپایه ترکیب نمکی مشابه با M42 که برای کشت ریان- های مش تلید شده بد همچنین محیطهای کشت کالسیک همانند Whitten بنا نهاده تلید شد. البته الزم به ذکر است که مقادیر این نمکها کامال با مقادیر استفاده شده در محیط کشت M42 Whitten متفات بد )جدل 2-3(. در نهایت قتی مقدار کل ینهای مجد در این محیطهای کشت محاسبه با هم مقایسه میشد تفات قابل تجهی در مقادیر کل ینهای 2 - مجد در محیطهای کشت مذکر به چشم نمیآید. البته در این م د استثنا جد دا که عبارتند از ینهای منیزیم PO 1 که در بین محیطهای کشت مختلف تفاتهای قابل تجهی را از خد نشان میدهند )جدل 2-3(. تفات دیگری که در م HTF قابل ذکر است سطح پایینتر گلکز در مقایسه با M42 Whitten میباشد که تقریبا برابر نصف سطح گلکز در این د محیط کشت میباشد. با در نظر داشتن اینکه در محیط کشت HTF غلظت متابلیتها در سطحی مشابه سطح آنها در شرایط درنتنی تنظیم میشد تفات عمده دیگری از این نظر بین HTF محیطهای کشت کالسیک مشاهده میشد. برخالف این مشابهت مجد بین محتای متابلیتهای مجد در HTF با ترکیب اقعی آنها در لله فالپ سطح ینهای معدنی مجد در HTF هیچ گنه مشابهت بیشتری با مایع مجد در لله فالپ در مقایسه با سایر محیطهای کالسیک ندا. اندازهگیریهای مختلفی در را بطه با غلظت ینهای معدنی مایع مجد در لله فالپ به انجام رسیده نتایج آن گرش شده Defined medium HTF: Human Tubal Fluid 58

65 است )مرر شده تسط )32((. Borland این اندازهگیریها سطح مختلفی برای سدیم کلر پتاسیم کلسیم را ارایه نمدهاند که این مقادیر برای سدیم میلی مل برای کلر میلی مل برای پتاسیم 21-2 میلی مل برای کلسیم 3-4 میلی مل میباشند. غلظت ینی در HTF برای تمامی 2 ین معدنی مجد در محیطهای کشت در همین محددههای ذکر شده تعیین شده است )جدل 2-3(. بنابراین غلظت ینهای معدنی به طر مشخص اضح عامل تمایز بین محیطهای کشت مختلف نمیباشد. در حقیقت نمی تان به ضح بیان نمد که کدام محیط کشت از نظر غلظت ینهای معدنی بیشتر به استاندا فیزیلژی نزدیک مشابه میباشد. دلیل این امر تفات در مقادیر اندازهگیری شده این ینها در مطالعات مختلف همچنین در افراد مختلف میباشد )232 30(. در پی مفقیت HTF دامنه سیعی از محیطهای کشت ریان انسان تسعه تکامل یافت. هم اکنن بیشتر محیطهای کشت م استتفاده در پی پیشرفتهای حاصل شده در زمینه تلید محیطهای کشت ریان جندگان که مفق به عبر از سد تقف سللی شدهاند تلید فرمالسین شده است. به دلیل انحصاری بدن اطالعات دقیق مربط به ترکیب محیطهای کشت ریان انسان متاسفانه امکان انجام مطالعه مقایسه دقیق بین محتای ینی غیرینی محیطهای کشت مختلف یا حتی مقایسه آنها با محیط مایع لله فالپ جد ندا. به هر ری تاریخچه تلید تسعه محیط- های کشت ریانهای انسان گاهی بر مشابهتهای عمده بین ترکیبات این محیطها با محیطهای کشت کالسیک محیطهای 432 کشت ریان مش میباشد. حداقل 2 محیط کشت یک مرحلهای ریان انسان بسیار شبیه به محیط KSOMaa میباشد. محیط کشت Life Global s Global محیط کشت GyneMed d GM314 د محیط کشت بدست آمده حاصل از تغییر تحالت کچک در KSOMaa هستند. در نتیجه این د محیط کشت از نظر ترکیبات ینهای معدنی بسیار شبیه به محیطهای کشت ریان مش میباشند. مجمعه محیطهای کشت 4-G Vitrolife s در حقیقت حاصل تغییر تحالتی است که ری محیط کشت 4-G که فرمالسین آن منتشر شده است میباشد )31(. مقدار )93 NaCl میلی مل( که در تلید محیط کشت 4-G استفاده شده است )جدل 2-3( ممکن است که برپایه مقدار NaCl مجد در SOM باشد زیرا SOM نیز حای 93 میلیمل NaClمیباشد )22( که بسیار متفاتتر از مقدار NaCl در محیط کشت KSOM که معادل 83 میلیمل است می- باشد. در نتیجه محیط کشت 4-G غلظت نهایی + Na - Cl مشابه با SOM را دارا میباشد. )421 میلیمل 98 میلیمل برای ین کلراید سدیم در.)SOM مقدار نهایی غلظت ین پتاسیم در محیط 4-G بسیار باالتر از این مقدار در SOM KSOM میباشد. دلیل این افیش در پتاسیم افزدن مقادیر بیشتری KCl به محیط کشت 4-G میباشد. مقدار پتاسیم 4-G بسیار شبیه نزدیک به CZBمیباشد. به طر کلی مشخص شده است که غلظت ینهای معدنی مجد در 4-G بسیار شبیه به مقدار این ینها در محیطهای کشت ریان مش میباشد. بنابراین مشخص شده است که حداقل نسل حاضر محیطهای کشت ریان انسان از آزمنهای انجام شده تغییرات اعمال شده ری محیطهای کشت ریان مش که تانایی عبر از سد تقف سللی را دا حاصل شدهاند در نتیجه پایه ینهای مجد در این محیطهای کشت کامال مشابه با ترکیب این ینها در محیطهای کشت ریان مش میباشد. جدل 2-3. مقایسه بین غلظتهای اجی متشکله محیطهای کشت متفات اجی متشکله غلظت )میلی مل ) KRB Whitten s M42 CZB SOM KSOM HTF G 4 NaCl KCl 1 / 0 1 / 0 1 / 9 1 / 9 1 / 23 2 / 3 1 / 0 3 / 3 KH 2 PO 1 4 / 2 4 / 2 4 / 2 4 / 2 1 / 33 1 / 33 1 / 30 NaH 2 PO 1 1 / 3 NaHCO CaCl 2 2 / 3 2 / 3 4 / 0 4 / 0 4 / 0 4 / 0 2 / 1 4 / 9 MgSO 1 4 / 2 4 / 2 4 / 2 4 / 2 1 / 2 1 / 2 1 / 2 4 / 1 Single step human embryo culture medium 53

66 Na lactate c / 3 Na pyruvate 1 / 33 1 / 20 1 / 2 1 / 2 1 / 33 1 / 32 EDTA (tetra Na) 1 / 44 1 / 14 1 / 14 1 / 14 Glucose 3 / 2 3 / 2 1 / 2 2 / 1 2 / 9 1 / 3 Glutamine 4 / 1 4 / 1 4 / 1 4 / 1 Total Na Total Cl Total K + 3 / 8 3 / 8 2 / 1 2 / 1 1 / 21 2 / 9 3 / 4 3 / 3 Total dissolved particles d اسمالریته محیط کشت ینهای معدنی دامنه سیعی از عملکها در سلل را برعهده داشته برای تعداد بیشماری از ریههای فیزیلژیی سلل حیاتی ضرری میباشند. یکی از عملکهای عمده در بنانهادن یژگی محیط داخل سلل نگهداشتن غلظت پتاسیم در سطح باال میباشد درحالی که غلظت ین سدیم کلراید در سطح پایین نگهداری میشد. این تعادل به اسطه فعالیت پمپ سدیم/پتاسیم برقرار میشد )39(. این گرادیان ینی برقرار شده به اسطه حضر پمپ سدیم/پتاسیم به منظر حفظ پتانسیل غشای الزم ضرری میباشد. همچنین این گرادیان به عنان یک منبع غیرمستقیم انرژی برای نقل انتقال سللی زج شده با گرادیان ینی م استفاده قرار میگی. یکی از این نع نقل انتقاالت سللی شامل انتقال متابلیتها اسیدهای آمینه نیز میشد. از جمله دیگر اثرات این گرادیان ینی حفظ ثبات فیزیلژیی سلل از جمله تنظیم ph داخل سلل میباشد )38(. یکی دیگر از نقشهای کلیدی که بر عهده این ینها میباشد تنظیم ایجاد فشار اسمزی اختالف آن در د سی غشای سلل میباشد. به دلیل غلظت باالی مجمعه ینهای غیرمعدنی که در مقایسه با سایر ماد حل شده در محللهای داخل خارج سلل نسبت باالیی را به خد اختصاص میدهند میتان بیان داشت که عامل عمده تعیین کننده اسمالریته در سیتپالسم 433 مایعات خارج سللی چه در شرایط درنتنی چه در شرایط برنتنی همین ینها میباشند. اسماللیته در حقیقت اندازه مجمع فشارهای اسمزی مجد در یک محلل حای ماد حل شده میباشد. احد اسماللیته به صرت کیلگرم/اسمل (osmoles/kg) بیان میشد. فشار اسمزی برای یک محلل ایده آل 4 مالر حای تنها یک ماده حل شنده میباشد که به طر کامل در آب حل شده است معادل 4 osmoles/kg است. رش دیگر در بیان مفهم اسمتیک در یک محلل اسمالریته است که به کمک احد osmoles/l اندازه گیری بیان میشد )اسمالر: OsM (. برای محللهای تغلیظ شده این احد )اسمالریته( دچار انحراف خاهند شد زیرا ل چگای محلل به طر شگفتآری به باالی 4 Kg/L افیش مییابد. در م محللهای رقیق که با منظر تهیه محیطهای کشت ریان یا محیطهای محلل مجد در شرایط طبیعی بدن که سللها را دربر میگی اسمالریته اسماللیته مفاهیم قابل تعیض با یکدیگر هستند. در این ما اغلب از مفهم اسمالریته استفاده میشد زیرا احد اسمالریته احدی بسیار آسان جهت محاسبات میباشد )معمال به صرت.)mOsM همچنین اسمالریته تانایی بیان غلظت به صرت مالریته را دارا میباشد. )غلظت اسمزی که به صرت اسمالریته شناخته میشد به غلظت ماده حل شنده در حالل مربطه اشاره دا به صرت OSmoles/L بیان میشد. OSmole به تعداد ملهای یک ماده حل شنده در حالل که منجر به ایجاد فشار اسمزی میشد اطالق میگد(. اگرچه در مثال محلل ایدهال ذکر شده در باال اسماللیته )اسمالریتی( ماللیته )نرمتاتی( همگی مسای هستند لی این مطلب را نمیتان به صرت یک اصل عممی همیشگی در نظر گرفت. ال اینکه فشار اسمزی تسط هر ماده حل شنده به اسطه تعداد کل ذرات ماده حل شنده ایجاد می- شد بنابراین در م نمکهایی که تقریبا بهطر کامل در محیطهای آبی تفکیک میشند تاثیر اسمتیک آنها از حاصلضرب غلظت نرمال نمک اضافه شده بهدست میآید. بهعنان مثال حل شدن 1/4 مل NaCl در آب قاعدتا منجر به اسماللیته نزدیک به Osmoles/Kg 1/2 خاهد شد زیرا هر NaCl به 2 جزیی که از نظر اسمزی فعال میباشند تبدیل تفکیک میشد. osmolality 61

67 دم اینکه معمال انحراف معنیداری در رفتار اسمزی ایدهآل هر ماده حل شنده مشاهده میشد. دلیل این انحراف میتاند تقابل اثر حل شنده با حالل یا تفکیک شدن جزیی ماده حل شنده باشد )ماده حل شنده به طر کامل به اجی سازنده تفکیک نشد(. برای نمنه NaCl که به عنان مثال در این بخش اشاره شد اسماللیته حقیقی معادل 1/492 Osm/Kg را از خد نشان میدهد که معادل 492 mosm است )1(. این مقدار در مقایسه با 211 mosm یا 1/211 mosm/kg به ضح انحراف دا. این کاهش در مقدار اسماللیته حقیقی به اسطه تعریف یک ضریب اسمزی )ᵨ( به صرت تجربی برای هرماده حل شنده قابل محاسبه پیشبینی است. البته الزم به ذکر است که این ضریب براساس غلظت ماده حل شنده مقادیر مختلفی را به خد اختصاص میدهد. مقدار این ضریب برای مثال ذکر شده در م NaCl معادل 1/83 میباشد )1(. بنابراین اسماللیته یک محلل به کمک فرمل زیر محاسبه میشد: )غلظت n ᵨ( در این فرمل n تعداد ذراتی است که ماده حل شنده به آنها تفکیک خاهد شد )برای NaCl مقدار n برابر 2 میباشد(. این اثر بیان کننده دلیل کمتر بدن مقدار اقعی اسماللیته محیطهای کشت نسبت به آنچه که از مجمع تمام اجی تفکیک شده مجد در محیط کشت بدست میآید میباشد. به عنان یک مثال تعداد کل ذرات تفکیک شده در محیط کشت KSOM معادل 203 mm است )جدل 3-2(. اما اسمالریته KSOM تقریبا معادل 232 Osmoles/Kg میباشد )جدل 3-3(. در نتیجه ضریب ᵨ برای اجی محیط کشت KSOM از حاصل تقسیم 232/203 بدست میآید که معادل 1/81 میباشد این ضریب محاسبه شده تقریبا معادل ضریب ᵨ برای NaCl به تنهایی می- باشد. در عمل به دلیل اینکه هماره تقابل اثر بین ماد حل شنده در یک مخلط جد دا اسماللیته محیط کشت معمال به کمک ابرهای اندازه گیری از جمله اسممتر اندازه گیری میشد. کاهش عمده در اسماللیته محیطهای کشت نین دلیل تغییرات عمده در محیطهای کشت ریان مش که تانایی غلبه بر تقف سللی در مرحله 2 سللی را دارا شدهاند نسبت به سایر محیطهای کشت که این تانایی را نداشتهاند میباشد. به عنان نمنه اسماللیته محیط M42 معادل 281 mosmoles/kg )43( اسماللیته محیط کشت KSOM معادل )29( 233 mosmoles/kg اسماللیته محیط کشت CZB معادل )11( 203 mosmoles/kg اسماللیته SOM فقط 231 mosmoles/kg ذکر شده است )22(. محیطهای کشت نین ریان انسان دارای دامنه سیعی از محددههای اسماللیته هستند )جدل 3-3(. پایینترین حد قابل قبل اسماللیته که در محیطهای کشت تجاری م استفاده برای کشت ریان در نظر گرفته شده است )در میان محیطهایی که اطالعات آنها فاش شده است( مربط به محیط کشت G2 با HSA میباشد که مقداری معادل 219 mosmoles/kg ذکر شده است درحالی که باالترین حدقابل قبل مربط به محیط کشت P4 میباشد که معادل 289 mosmoles/kg است )جدل 3-3(. در نتیجه ریانهای انسان در دامنه متغیر 31 mosmoles/kg تانایی رشد تسعه در نهایت تلد نتاج سالم را دارا میباشند. این دامنه سیع اسماللیته که تانایی حمایت از ریان انسان را دارا میباشد در م ریانهای مش نیز صادق میباشد )14( تاثیر اسماللیته ری تسعه تکامل ریان اگرچه ریانهای پستانداران شامل مش انسان میتانند در دامنه سیعی از اسمالریته رشد تکامل یابند با این جد اثر بسیار قی اسماللیته ری تسعه تکامل ریان ثابت شده است. حداقل به طر جزیی میتان بیان ک که دامنه سیع تحمل ریانها در برابر تغییرات اسمالریته نشاندهنده تقابل بسیار قی بین اسماللیته دیگر اج محیط کشت به یژه برخی اسیدهای آمینه میباشد که در نتیجه باعث تفات در مین بهینه متفات اسماللیته برای محیطهای کشت مختلف خاهد شد )در ادامه تضیح داده شده است(. همانطر که میتان از مشاهدات استنباط نمد تنها تفات بین محیطهای کشت ریان که دارای اج مشابه میباشند اما یک دسته تانایی عبادن ریان از مرحله تقف سللی را داشته دسته دیگر این تانایی را نداشتهاند این است که در دسته ال اسماللیته محیط کشت پایینتر میباشد. افیش یافتن اسماللیته به باالتر از آستانه تحمل ریان باعث تقف رشد تسعه ریان در شرایط برنتنی خاهد شد. بالفاصله بعد از تلید فرمله کن الین محیط کشتی که تانایی عبر دادن ریان مش از مرحله تقف 2 سللی را داشت Biggers )222 Lawitts 20( در مطالعهای نشان دادند که افیش غلظت NaCl در محیط کشت SOM از 93 به 423 میلی اسمل که تانست یک افیش 03 mosmoles/kg از 64

68 231 به 313 mosmoles/kg در محیط کشت ایجاد نماید قطعا باعث ممانعت از تسعه تکامل ریان مش از مرحله 2 سللی میشد. بالفاصله بعد از این مطالعات Baltz Dawson )12( نشان دادند که این افیش اسماللیته عامل مهم تعیین کننده در تانایی محیط کشت ریان میباشد نه مقدار NaCl به خدی خد این د محقق نشان دادند که افیش اسماللیته به اسطه افزدن یک کربهیدارت بیاثر از نظر اکنش شیمیایی )تری ساکارید( با نام رافینز به محیط کشت که باعث افیش اسماللیته محیط کشت میشد نیز همانند افزدن NaCl اثر مخرب در تسعه تکامل ریان را باعث میشد. در ادامه Hadi همکاران )13( نشان داند که افیش در اسماللیته محیط کشت فقط باعث تقف در تسعه ریان در ژنتیپهایی که این 431 مشکل را برز میدهند نمی شد بلکه ژنتیپهایی مانند هیبرید F4 نیز که این مشکل را نداشتند با استفاده از این محیطهای کشت با اسماللیته باال دچار تقف در مرحله 2 سللی میشدند. البته این نکته مشخص شده است که تمامی سیههای مختلف مش یا به عبارت بهتر ریان تمامی پستانداران تا حدی تانایی تخمل افیش اسماللیته را دارا میباشند بعد از گذشت فشار اسمزی از حد آستانه تقف سللی را در مراحل تکین ریان از خد برز میدهند. در نتیجه آنچه در یک گنه یا در بین گنه- های مختلف در این باره متفات است حد آستانه تحمل آن گنه میباشد. هنز تحقیقی که تاثیر دامنههای مختلف اسمالریته را ری تکامل تسعه ریان نشان دهد به انجام نرسیده است در نتیجه آستانه تحمل ریان انسان در مقابل افیش اسمالریته هنز ناشناخته میباشد. چرا اسمالریته پایین بهتر میباشد حداقل د پاسخ برای این پرسش جد دا. ال اینکه محیطهای کشت جدید بازسازی کننده محیط درنتنی میباشند. این مسئله به این نکته اشاره دا که مایع مجد در ایداکت دارای اسمالریته در حدد mosmole/kg میباشد. این مقدار از اسمالریته مشابه اسمالریته محیطهای کشت SOM KSOM CZB میباشد. در نتیجه پایین نگهداشتن اسمالریته محیطهای کشت ریان محیطی مشابه با اسمالریته نرمال مجد در شرایط درنتنی را برای ریان فراهم مینماید. البته این مسئله کمی با در نظر گرفتن اسمالریته ایداکت مش که در حدد mosmole/kg میباشد در تناقض است. پس شاید دلیل ال دلیلی منطقی درست نباشد )211 13(. همچنین مشخص شده است که اسمالریته مایع ایداکت خک در نزدیکی )12( 321 mosmole/kg این مقدار برای رت در نزدیکی 281 mosmole/kg میباشد )10(. اسمالریته مایع جاری در للههای فالپ انسان هنز به دقت اندازهگیری نشده است. البته الزم به یادآری است که این مقدار در هیچ کدام از پرایمتها اندازهگیری نشده است. الزم بهذکر است که در هر مجدی که اسمالریته مایع ایداکت اندازهگیری شده است مقداری نزدیک مشابه با اسمالریته خن همانگنه را نشان داده است. بهعنان نمنه اسمالریته خن مشهای ماده در دامنه رت ماده خک میلی اسمل بر کیلگرم اندازهگیری ذکر شده است )31-19(. اگر این مشابهت بین اسمالریته خن مایع ایداکت در م انسان نیز صادق باشد آنگاه اسمالریته مایع مجد در للههای فالپ در حدد 281 mosmole/kg خاهد بد )34( در نتیجه اسمالریته زیر این سطح خارج از سطح اقعی اسمالریته مایع للههای فالپ خاهد بد. احتمال دم در م علت مفید بدن اسماللیته پایین محیط کشت در مقایسه با شرایط درنتنی به دستآ حاصل از شرایط برنتنی مربط میباشد که منجر به برز کمبد در برخی ماد مجد در شرایط برنتنی میشد. در حقیقت حضر برخی ماد در شرایط درنتنی منجر به جبران باالتر بدن اسمالریته مایع ایداکت در مقایسه با محیطهای کشت برنتنی است. حضر این ماد برای تسعه نرمال ریان در اسمالریته نرمال )باالتر از سطح حاضر آن در محیطهای کشت( حیاتی ضرری میباشد. این فرضیه دم عمال اشاره به اقعیت ماجرای مفید بدن اسماللیته پایین دا. محیطهای کشت کالسیک از نظر محتای اسیدهای آمینه کامال تهی می- باشند. به نظر می رسد که این اسیدهای آمینه بازیگران مهمی در تنظیم حجم سلل در ریان پیش از النه گزینی میباشند تنظیم حجم سلل: نقش ینهای معدنی اسیدهای آمینه سللهای حیانات حجم خد را به اسطه فشار اسمزی تنظیم مینمایند. این سللها از طریق تنظیم غلظت اسملیت- های سیتپالسم به تنظیم فشار اسمزی داخل سلل میپازند )32(. پاسخ الیه سللها به کاهش حجم سلل فعال نمدن Nonblocking strains 62

69 ناقلین مجد در غشای سلل میباشد که اسطه تجمیع ینهای معدنی در سلل میباشند )33(. در سللهای پستانداران مکانیسم اصلی سریع دفاعی در برابر کاهش ناخاسته حجم سلل فعالسازی جابهجا کننده )معاضه کننده( سدیم هیدرژن است. معاضه کننده + Na + H از ژن خاناده NHE مشتق میشد )31(. عملک معاضه کننده + Na + H در حقیقت ا کن سدیم به داخل سلل خارج سازی ین هیدرژن میباشد. این معاضه کننده همچنین باعث افیش ph داخل سللی - HCO H + Na + میشد. در حقیقت فعال شدن معاضه کننده منجر به خارج سازی ین هیدرژن از سلل در نهایت تلید 3 آد در داخل سلل خاهد شد که در نتیجه خرج ین هیدرژن افیش ph را شاهد خاهیم بد. در نهایت این خرج ین - AE خاهد شد. این معاضه کننده از محصالت ژنی خاناده HCO /Cl - هیدرژن منجر به فعال شدن ثانیه معاضه کننده 3 میباشد این معاضه کننده در نهایت باعث باشت ین کلر تسط سلل میشد )231 33(. نتیجه نهایی کلی اسازی ین سدیم کلراید به داخل سلل میباشد که منجر به افیش فشار اسمزی داخل سللی ترم سلل میشد. درخالل باشت NaCl به اسطه مکانیسم ذکر شده یک کاهش خالص مختصر در ph داخل سللی رخ میدهد. زیرا خرج هر ین هیدرژن که - - در معاضه با سدیم از سلل به بیرن رانده میشد از طریق زج شدن با معاضهگر HCO 3 که منجر به خرج - 3 Cl HCOاز / سلل در عض رد ین کلراید به داخل سلل میشد به نعی خنثی بیاثر میگد. در نتیجه هر ین هیدرژن در نهایت با یک HCO 3 خنثی میشد. در پی کاهش حجم سلل مکانیسم مذکر به سرعت فعال شده باشت NaCl به سرعت رخ میدهد. این باشت NaCl در نهایت باعث بازگشت سریع حجم سلل به حالت عادی میشد. این اتفاق در تنها چند دقیقه کتاه رخ میدهد. به نظر میرسد که ریان نیز از چنین مکانیسمی به منظر تنظیم سریع حجم خد بهره میب. به صرت آزمایشی نشان داده شده است که القا کاهش حجم سلل به ریان مش در مرحله 2 سللی منجر به القا فری فعالیت معاضه- گر + H/ Na + خاهد شد. درحالی که ممانعت از فعال شدن معاضهکننده + H/ Na + باعث نقص در تنظیم حجم سلل میشد )مطالعه منتشر نشده.C(. Zhoa, JM Baltz بنابراین یکی از عملکهای کلیدی ینهای معدنی در محیط خارج سللی ریان شامل محیط کشت فراهم نمدن ین سدیم کلراید برای زمانهایی است که سلل نیاز به تجمیع این د ین در داخل خد برای حفظ برگاندن حجم کاهش یافته خد دا. درحالی که باشت ینهای معدنی به سرعت منجر به برگشت حجم سلل به حالت عادی استاندا میشد اما این رش نمیتاند به عنان یک رش بهینه درازمدت در نظر گرفته شد. در سلل- هایی که اسماللیته در محیط خارج سللی به شدت باال میباشد )همانند آنچه در کلیههل شاهد هستیم( حفظ سطح م نیاز ینهای معدنی داخل سللی برای متعادل نگهداشتن فشار اسمزی در درازمدت میتاند به شدت به سللها آسیب ا نماید. در این گنه سللها نسبت زیادی از ینهای معدنی در سیتپالسم به اسطه اسملیتهای بیبار سدمند )بی ضرر( جایگزین میشند. این اسملیتها از افیش قدرت مقدار اسملیتهای ینی باقی ماندن آنها در سطح مضر جلگیری به عمل می- آرند )232 30(. این نع از اسملیتها از مجمعهای از ماد غیر مرتبط )از خانادهها مختلف( تشکیل شده اند. از جمله این اسملیتها میتان به اسیدهای آمینه مشتقات اسیدهای آمینه قندها اشاره نمد که با عملکهای بیشیمیایی سلل از جمله فعالیتهای آنزیمی بازآرایی ماکرملکلها حتی در غلظتهای باال تضادی نداشته تداخل با آنها ایجاد نمیکنند. با بهره- گرفتن از این اسملیتها به جای ینهای معدنی به منظر فراهم نمدن بخشی از اسملیتهای سیتپالسمی قدرت ینی داخل سللی در سطح بهینه حفظ شده همچنین در این ضعیت سلل به تنهایی تانایی کنترل اسماللیته خد را حفظ خاهد نمد. به طر کلی میتان بیان ک که تجمع این نع از اسملیتها تنظیم حجم سلل با این مکانیسم بسیار آهستهتر از تنظیم حجم سلل که با اسطه فعالیت ناقلین ینهای معدنی رخ میدهد انجام میپذی )32(. در نتیجه در سللهای که از هر د مکانیسم استفاده میکنند تنظیم سریع حجم سلل به اسطه ینهای معدنی رخ داده درحالی که حفظ همستاز در مدت طالنی نیازمند باشت اسملیتهای غیر معدنی میباشد هرچند تعداد زیاد متنعی از مادی که به عنان اسملیتهای غیر معدنی عمل میکنند تسط سللهای حیانی گیاهان یکاریتهای تک سللی قارچها باکتریها به کار میرند اما سلل- های مختلف تمایل به استفاده از یک مجمعه کچک از این اسملیتهای غیر معدنی به منظر حفظ پشتیبانی فشار اسمزی را shrinkage 69

70 از خد نشان میدهند. Biggers Winkle Van ابتدا پیشنهاد کرند که ریانهای در مرحله پیش از النهگزینی برای تسعه تکین نرمال نیازمند اسملیتهای غیر معدنی )ارگانیک( میباشند )39(. یکی از الین اسملیتهای غیر معدنی که در بد امر شناسایی م تجه اقع شد گلتامین بد. این ماده به محیطهای کشت CZB KSOM اضافه شد به ریانهای مش acid taurine نیز تا حددی چنین اثراتی از خد نشان میدهد )38(. تحقیقات بعدی که عمدتا در مش انجام گرفته بد نشان داد که این اسیدهای آمینه مشتقاتشان میتانند به عنان اسملیتهای ارگانیک در ریانها عمل نمایند. مشخص شده است که گلیسین اسملیت ارگانیک اصلی م استفاده تسط ریانها میباشد. یک ناقل با تمایل باال برای گلیسین GLYT4 تا مرحله 1 سللی در ریانهای مش بیان فعال میشند. این ناقل باعث تجمع گلیسین در داخل ریان میشد که این تجمع گلیسین یکی از مکانیسمهای تنظیمگر اسمالریته است )21(. در شرایط درنتنی سطح گلیسین محلل درن سللی در ریان- های مش از مرحله 2 سللی به شدت افیش مییابد. این افیش تا دامنه 21 تا 31 میلیمل میباشد که باعث ایجاد یک فشار اسمزی معادل mosmole/kg خاهد شد. این افیش معنی دار در سطح گلیسین در ریانهای تلید شده در شرایط درنتنی نشان دهنده این نکته است که گلیسین به عنان یک اسملیت در شرایط درنتنی ایفای نقش مینماید )24(. همچنین انتقال گلیسین به اسطه GLYT4 در ریانهای انسان نیز مشخص شده است )22(. این نکته مبین نقش مشابه برای گلیسین در ریانهای انسان میباشد. شرکت تلید کننده محیط کشت Cook IVF Cooper Surgical (SAGE) Fertipro GyneMed InVitroCare Irvine Scientific LifeGlobal (IVFonline) اجازه داد که به بعد از مرحله تقف 2 سللی تکین یابند. گلتامین یک تقابل شدید قی با غلظت NaCl در محیط کشت SOM از خد نشان داد. در نتیجه استفاده از گلتامین فقط در غلظتهای باالی NaClمیتاند به عنان یک اسملیت ارگانیک نقش ایفا نمده مفید اقع شد )22(. همچنین مشخص شد که گلیسین همانند گلتامین ریانها را در برابر غلظتهای باالی (N,N,Ntrimethylglycine) NaCl در محیط کشت محافظت میکند )39(. استفاده از د ماده دیگر با نامهای پرلین بتائین نیز نشان داد که این د ماده اثرات نیرمند محافظتی در مقابل افیش اسمالریته محیط کشت دا )220 12(. همچنین مشخص شده است که B-amino acid B-alanine نیز دارای اثرات محافظتی مشابه میباشد. البته B-amino نام محیط کشت Sydney IVF Cleavage Sydney IVF Blastocyst Quinn s Advantage Cleavage Quinn s Advantage Blastocyst Ferticult IVF Ferticult G3 GM 314 IVC-ONE, IVC- TWO IVC-THREE SSM (plain, SSS, DSS) P4 (plain, SSS, DSS) ECM (plain, SSS, DSS) Multiblast (plain, SSS, DSS) HTF (plain, SSS) global 61 جدل 3-3. اسمالریته محیطهای کشت متفات مرحله ای که م استفاده قرار میگی میانگین محدده اسماللیته mosmoles/kg کلیاژ 281( ) سللی تا بالستسیست 281( ) کلیاژ -203)223( سللی تا بالستسیست )223( )291( )291( )291( )291( )291( )223( )281( )299( کلیاژ 9 سللی تا بالستسیست تمام مراحل رشد ریان کلیاژ 9 سللی تا بالستسیست تمام مراحل رشد ریان کلیاژ کلیاژ 9 سللی تا بالستسیست )292( )291( )223( کلیاژ تمام مراحل رشد ریان

71 Origio (MediCult) VitroLife Mouse media HTF Blastocyst Universal IVF ISM4 ISM2 EmbryoAssist BlastAssist G- 4 (G3 series ) G- 4 with HSA (G3 series ) G- 2 (G3 series ) G- 2 with HSA (G3 series ) M42 CZB SOM KSOM کلیاژ 9 سللی تا بالستسیست کلیاژ کلیاژ 9 سللی تا بالستسیست کلیاژ 9 سللی تا بالستسیست کلیاژ کلیاژ 9 سللی تا بالستسیست 9 سللی تا بالستسیست )292( )223( )293( )291( )291( )291( )291( )224( )231( )221( )233( ) 281( ) 203( ) 228( ) 232( GLYT4 همچنین انتقال دهنده گلتامین در ریانهای مش میباشد البته تمایل GLYT4 برای گلیسین بسیار بیشتر از تمایل آن برای گلتامین میباشد )23(. به نظر میرسد که این تانایی GLYT4 در انتقال گلتامین به خصص در صرت غیاب گلیسین میتاند از ریانها در برابر افیش اسمالریته محافظت نماید ( برای مثال د محیط کشت KSOM.)SOM به نظر میرسد که مکانیسمهای ابسته به GLYT4 در تنظیم حجم سلل مکانیسم اختصاصی برای ریانها در مراحل ابتدایی زندگی میباشند. زیرا مکانیسم باشت گلیسین باسطه GLYT4 تا کنن در هیچ یک از سللهای بدنی پستانداران مشاهده نشده است. درعض سللهای بدنی پستانداران از یکی از چهار ناقل شناخته شده برای اسملیتهای ارگانیک استفاده مینمایند )221 23(. GLYT4 در سللهای ریان تانایی انتقال بتائین پرلین را ندا. در عض یک ناقل از خاناده SIT4 مسئل باشت این د اسیدآمینه )بتائین پرلین( به عنان اسملیت ارگانیک را بر عهده دا )222 20( SIT4 فقط در مرحله 4 2 سللی رشد ریانها فعال میباشد به نظر میرسد که از ایفای نقش اصلی GLYT4 حمایت میکند. دلیل این ادعا سطح بسیار پائین )2 تا 0 میلی مل( بتائین است که در ریانها در مرحله 4 تا 2 سللی تجمع مییابد )20(. همانند GLYT4 باشت انتقال اسملیتهای تا تسط SIT4 اختصاصی سللهای ریان در مراحل ابتدایی رشد تکین میباشد. عملک این د ناقل اسملیتهای ارگانیک در ریانهای پیش از النه گزینی نقشهای تنظیم تکامل ریان که بر عهده این نافلین میباشد به طر جز به جز تسط Tartia Baltz مرر شده است )42(. دامنه سیعی از محیطهای کشت که تانایی حمایت از ریانها در مراحل پیش از النه گزینی را دار هستند نشان دهنده تقابل بین اسملیتهای معدنی به عنان نمکهای مجد در محیط کشت اسیدهای آمینه به عنان اسملیتهای ارگانیک هستند. در محیطهای کشت حای مقادیر زیاد نمک اسماللیته باال حضر اسملیتهای ارگانیک مانند گلیسین به منظر کاهش تخفیف اثرات مضر سطح باالی ینهای معدنی داخل سللی که برای حفظ حجم سلل الزم هستند اجب ضرری است. البته امکان تسعه تکامل برای ریانهایی که در محیطهای کشت فاقد اسملیتهای ارگانیک کشت داده میشند نیز جد دا. البته شرط الزم برای رشد ریانها در چنین شرایطی حفظ سطح کل اسملیتها در زیر آستانه تحمل ریانها )زیر حد مضر( میباشد. بنابراین فقط یک اسماللیته بهینه برای تکامل ریانها در شرایط برنتنی جد ندا. برخی ماقع محیطهای کشت حای اسملیتهای ارگانیک با اسمالریته باال جد دارند که تانایی حمایت از رشد تکامل ریان را دارا میباشند. همچنین مجمعهای از محیطهای کشت فاقد اسملیتهای ارگانیک تلید شده است که در صرت پایین نگه داشتن اسمالریته تانایی حمایت از تکامل ریان را دار میباشند. 65

72 3-3. خالصه نمکهایی که برای فرمالسین محیطهای کشت ریان از جمله ریانهای انسان )کالسیک نین( استفاده میشند 432 همان نمکهایی هستند که در محیطهای کشت سللهای بدنی محیطهای کشت بافت استفاده میشند. اعمال تغییرات در در غلظتهای این نمکها در حقیقت نقش اساسی در پیشرفتهایی را داشته است که منجر به تلید محیطهای کشت با تانایی حمایت از تکامل ریان در شرایط برنتنی از مرحله لقاح تا بالستسیست شده است. در کل افیش اسماللیته برای ریانها در مرحله پیش از النه گزینی میتاند مضر مرگبار باشد. شاید دلیل این مسئله تجمع داخل سللی ینهای معدنی در سطح مضر باشد که به منظر حفظ حجم سلل رخ میدهد. افیش سطح داخل سللی ینهای معدنی در ریانها به عنان دلیل عمده تقف تکامل سللی ریانهای کشت شده در محیطهای کشت کالسیک ریان شناخته شده است. این اقعه در م ریانهای انسان نیز صادق است. درحقیقت نشان داده شده است که تقف تکامل در رشد ریانهای انسان کشت داده شده در محیطهای کشت کالسیک که اسمالریته مشابه با اسمالریته مایع ایداکت بده است قطع به یقین اتفاق میافتد. این تقف به دلیل عدم حضر اسملیتهای تا در محیطهای کشت کالسیک ریان میباشد. ریانها به طر معمل از اسملیتهای ارگانیک بهره می- برند. عمده اسملیت ارگانیک مصرف شده تسط ریانها گلیسین میباشد که در حقیقت جایگزین بخش عظیمی از ینها معدنی میشد. زمانی که اسملیتهای ارگانیک فراهم باشند ریانها میتانند در محیطهای کشت با اسماللیته مشابه یا حتی باالتر از شرایط درنتنی رشد تسعه یابند. بنابراین مادی که به عنان اسملیتهای ارگانیک عمل مینمایند به عنان اج کلیدی بیشتر محیطهای کشت شناخته میشند. 4. Biggers JD (4889) Reflections on the culture of the preimplantation embryo. Int J Dev Biol 12: Whitten WK (4832) Culture of tubal mouse ova. Nature 400:82 3. Giroux EL, Henkin RI (4803) Macromolecular ligands of exchangeable copper, zinc and cadmium in human serum. Bioinorg Chem 2: Burton, RF (4803) Appendix A: osmolality and osmotic coefficients. In: Ringer solutions and physiological salines. Wright Scientechnica, Bristol 3. Brachet A (4842) Développement in vitro de blastodermes et de jeunes embryons de Mammifères. C R Acad Sci Paris 433: Lewis WH, Hartmann CG (4833) Early cleavage stages of the egg of the monkey (Macacus rhesus). Contrib Embryol (Carnegie Inst Wash) 21: Alexandre H (2114) A history of mammalian embryological research. Int J Dev Biol 13: Pincus G (4832) The eggs of mammals. MacMillan, New York, NY 8. Krebs HA, Henseleit K (4832) Untersuchen über die Harnstoffbildungim Tierkörper. Z Phys Chem 241: McLaren A, Biggers JD (4839) Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature 492: Whitten WK (4830) Culture of tubal ova. Nature 408: Biggers JD, Whittingham DG, Donahue RP (4820) The pattern of energy metabolis m in the mouse oocyte and zygote. Proc Natl Acad Sci USA 39: Whittingham DG, Biggers JD (4820) Fallopian tube and early cleavage in the mouse. Nature 243: Whittingham DG (4804) Culture of mouse ova. J Reprod Fertil Suppl 41: Hogan B et al (4881) Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY منابع Somatic cell 66

73 42. Baltz JM, Tartia AP (2141) Cell volume regulation in oocytes and early embryos: connecting physiology to successful culture media. Hum Reprod Update 42: McKiernan SH, Clayton MK, Bavister BD (4883) Analysis of stimulatory and inhibitory amino acids for development of hamster one cell embryos in vitro. Mol Reprod Dev 12: Quinn P, Kerin JF, Warnes GM (4893) Improved pregnancy rate in human in vitro fertilization with the use of a medium based on the composition of human tubal fl uid. Fertil Steril 11: Goddard MJ, Pratt HPM (4893) Control of events during early cleavage of the mouse embryo: an analysis of the 2-cell block. Development 03: Schini SA, Bavister BD (4899) Two-cell block to development of cultured hamster embryos is caused by phosphate and glucose. Biol Reprod 38: Kishi J et al (4884) Block to development in cultured rat 4-cell embryos is overcome using medium HECM-4. Hum Reprod 2: Camous S et al (4891) Cleavage beyond the block stage and survival after transfer of early bovine embryos cultured with trophoblastic vesicles. J Reprod Fertil 02: Bolton VN et al (4898) Development of spare human preimplantation embryos in vitro: an analysis of the correlations among gross morphology, cleavage rates, and development to the blastocyst. J In Vitro Fertil Embryo Transfer 2: Chatot CL et al (4898) An improved culture medium supports development of randombred 4-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 92: Lawitts JA, Biggers JD (4884) Optimization of mouse embryo culture media using simplex methods. J Reprod Fertil 84: Lawitts JA, Biggers JD (4882) Joint effects of sodium chloride, glutamine, and glucose in mouse preimplantation embryo culture media. Mol Reprod Dev 34: Biggers JD, Lawitts JA, Lechene CP (4883) The protective action of betaine on the deleterious effects of NaCl on preimplantation mouse embryos in vitro. Mol Reprod Dev 31: Lawitts JA, Biggers JD (4883) Culture of preimplantation embryos. Methods Enzymol 223: Erbach GT et al (4881) Differential growth of the mouse preimplantation embryo in chemically de fi ned media (published erratum appears in Biol Reprod 4881 Aug;34(2):313). Biol Reprod 31: Gardner DK, Lane M (4882) Alleviation of the 2-cell block and development to the blastocyst of CF4 mouse embryos: role of amino acids, EDTA and physical parameters. Hum Reprod 44: Ho Y et al (4883) Preimplantation development of mouse embryos in KSOM: augmentation by amino acids and analysis of gene expression. Mol Reprod Dev 14: Biggers JD, McGinnis LK, Raffin M (2111) Amino acids and preimplantation development of the mouse in protein- free potassium simplex optimized medium. Biol Reprod 23: Lane M, Gardner DK (4880) Differential regulation of mouse embryo development and viability by amino acids. J Reprod Fertil 418: : Edwards RG (4894) Test-tube babies, Nature 283: Borland RM et al (4891) Elemental composition of fluid in the human Fallopian tube. J Reprod Fertil 32. Lippes J (4802) The collection and analysis of human fallopian tubal fluid. Contraception 3: Gardner DK, Lane M (4888) Embryo culture systems. In: Trounson AO, Gardner DK (eds) Handbook of in vitro fertilization. CRC, Boca Raton, FL 39. Kaplan JH (2112) Biochemistry of Na, K-ATPase. Annu Rev Biochem 04: Hediger MA et al (2111) The ABCs of solute carriers: physiological, pathological and therapeutic implications of human membrane transport proteins: introduction. P fl ugers Arch 110: Devreker F, Hardy K (4880) Effects of glutamine and taurine on preimplantation development and cleavage of mouse embryos in vitro. Biol Reprod 30: Baltz JM (2114) Os moregulation and cell volume regulation in the preimplantation embryo. In: Schatten GP (ed) Current topics in developmental biology. Academic, San Diego, CA 67

74 12. Dawson KM, Baltz JM (4880) Organic osmolytes and embryos: substrates of the Gly and beta transport systems protect mouse zygotes against the effects of raised osmolarity. Biol Reprod 32: Hadi T et al (2113) Similar effects of os molarity, glucose, and phosphate on cleavage past the 2-cell stage in mouse embryos from outbred and F4 hybrid females. Biol Reprod 02: Collins JL, Baltz JM (4888) Estimates of mouse oviductal fluid tonicity based on osmotic responses of embryos. Biol Reprod 21: Fiorenza MT et al (2111) Early transcriptional activation of the hsp0124 gene by osmotic stress in onecell embryos of the mouse. Biol Reprod 01: Li R (2110) Concentration and composition of free amino acids and osmolalities of porcine oviductal and uterine fluid and their effects on development of porcine IVF embryos. Mol Reprod Dev 01: Waring DW (4802) Rate of formation and osmolality of oviductal fl uid in the cycling rat. Biol Reprod 43: Williams N, Kraft N, Shortman K (4802) The separation of different cell classes from lymphoid organs. VI. The effect of osmolarity of gradient media on the density distribution of cells. Immunology 22: Waymouth C (4801) Os molality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro 2: Knudsen JF et al (4808) Follicular fl uid electrolytes and osmolality in cyclic pigs. J Reprod Fertil 30: Anon (4891) Normal reference laboratory values. N Engl J Med 312: Hallows KR, Knauf PA (4881) Principles of cell volume regulation. In: Strange K (ed) Cellular and molecular physiology of cell volume regulation. CRC, Boca Raton, FL 33. Hoffmann EK, Lambert IH, Pedersen SF (2118) Physiology of cell volume regulation in vertebrates. Physiol Rev 98: Alexander RT, Grinstein S (2112) Na+/H+ exchangers and the regulation of volume. Acta Physiol (Oxf) 490: Jiang L, Chernova MN, Alper SL (4880) Secondary regulatory volume increase conferred on Xenopus oocytes by expression of AE2 anion exchanger. Am J Physiol 202: C484 C Yancey PH (4892) Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science 240: Lang F, Busch GL, Volkl H (4889) The diversity of volume regulatory mechanisms. Cell Physiol Biochem 9: Yancey PH (4881) Compatible and counteracting solutes. In: Strange K (ed) Cellular and molecular physiology of cell volume regulation. CRC, Boca Raton, FL 38. Van Winkle LJ, Haghighat N, Campione AL (4881) Glycine protects preimplantation mouse conceptuses from a detrimental effect on development of the inorganic ions in oviductal fl uid. J Exp Zool 233: Hammer MA, Baltz JM (2113) Beta-alanine but not taurine can function as an organic osmolyte in preimplantation mouse embryos cultured from fertilized eggs. Mol Reprod Dev 22: Steeves CL et al (2113) The glycine neurotransmitter transporter GLYT 4 is an organic osmolyte transporter regulating cell volume in cleavage-stage embryos. Proc Natl Acad Sci USA 411: Tartia AP et al (2118) Cell volume regulation is initiated in mouse oocytes after ovulation. Development 432: Hammer MA et al (2111) Glycine t ransport by single human and mouse embryos. Hu m Reprod 43: Lewis AM, Kaye PL (4882) Characterization of glutamine uptake in mouse two-cell embryos and blastocysts. J Reprod Fertil 83: Kwon HM, Handler JS (4883) Cell volume regulated transporters of compatible osmolytes. Curr Opin Cell Biol 0:

75 22. Pastor-Anglada M et al (4882) Long-term os motic regulation of amino acid transport systems in mammalian cells. Amino Acids 44: Anas MKI (2110) The organic osmolytes betaine and proline are transported by a shared system in early preimplantation mouse embryos. J Cell Physiol 241: Anas MK et al (2119) SIT4 is a betaine/proline transporter that is activated in mouse eggs after fertilization and functions until the 2-cell stage. Development 433:

76 فصل 2 اجی محیط کشت: منبع انرژی متابلیسم شرع پیشرفت در تلید آمادهسازی محیطهای کشت تعریف شده که تانایی تسعه تکامل ریان را داشته باشند از طریق مکملسازی محیط Krebs-Ringer bicarbonate با گلکز آلبمین پالسمای گا آنتی بیتیک استفاده از بافر -CO 2 بیکربنات آغاز شده است. این مکملسازیها به منظر نزدیکتر شدن شرایط کشت ریان به سطح نزدیک به فیزیلژی متابلیسم ریان پستانداران انجام میپذی. اگرچه غلظت ماد مصرفی در محیط کشت میتاند متفات باشد اما اج زیادی در این محیطها به کار میرد که از اهمیت زیادی در رند تکامل ریان برخار هستند. از جمله این ماد پر اهمیت میتان به منابع انرژی اشاره نمد. این منابع انرژی نقش مهمی در تنظیم متابلیسم زندهمانی ریان برعهده دارند. در اینجا به شرح ماد انرژی در محیطهای کشت میپازیم سنجشهایی را مشخص میکنیم که به کمک آنها بتانیم متابلیسم ریان را اندازه- گیری نماییم. این رشهای سنجش متابلیسم به عنان شاخصهای تعیین فیزیلژی زندهمانی ریان بهکار میرند مقدمه در شرایط درنتنی در هنگامی که ریان در مسیر رسیدن به رحم عبر از ایداکت درحال آماده شدن برای النه- گزینی است در مجارت یک محیط پیچیده دایما در حال تغییر که محتای ماد مغذی مختلف شامل پیرات الکتات گلکز اسیدهای آمینه ینها فاکترهای رشد ماکرملکلهای مختلف میباشند قرار میگی )4 2(. همزمان با این تغییرات در محیط ایداکت ریانها متحمل تغییرات فیزیلژی عمدهای میشند. تسعه تکامل ریان پیش از النه گزینی به دفعات متعدد در د فاز مختلف م بحث قرار گرفته است: مرحله قبل از تراکم بعد از تراکم. این د مرحله به ترتیب بهشدت مرتبط با زمانی است که ریان در ایداکت قرارگرفته است هنگامی که ریان درحال عبر از ایداکت رد به رحم میباشد )2(. ریان در مرحله پیش از تراکم دارای سللهای تخصص نیافته میباشد که به صرت ل متای دچار تقسیمات سللی میشد. این درحالی است که هیچ رشد خاصی را از خد نشان نمیدهند. در این مرحله تا پیش از فعال شدن کامل ژنم ریان کنترل ژنتیکی کامال به mrnaهای با منشا مادری ابسته است. فعال شدن ژنم ریان در انسان در مرحله 1 تا 9 سللی رخ میدهد )2 3(. در این مراحل الیه رشد ریان فعالیت متابلیکی به یژه در زمینه مصرف اکسیژن سنتز RNA/DNA سنتز پرتئین بسیار پایین میباشد )1(. در مراحل بعدی تکامل ریان کامال در کنترل ژنم ریان خاهد بد. در همین هنگام متابلیسم ریان به شدت افیش مییابد )2(. اسیتها ریانهای الیه نرخ متابلیسم مشابه با بافت مغز از خد نشان می- 438 دهند. در مقابل بالستسیت نرخ متابلیسمی مشابه با سللهای سرطانی از خد نشان میدهد این نرخ متابلیسم 2 برابر نرخ متابلیسم ریانها در مراحل ابتدایی تکامل میباشد )1(. این افیش در مصرف انرژی نرخ متابلیسم به دلیل شرع انجام ریههای بسیار انرژیخاه در ریان از جمله متراکم شدن سللهای ICM تلید حفره بالستکل میباشد. مشخص شده است که این تغییرات در نرخ متابلیسم به نعی بازتاب تغییرات رخ داده در ترکیب دستگاه تلید مثل به یژه تغییرات بین ایداکت رحم میباشد. در این مسیر یک گرادیان غلظت کربهیدارت ph اکسیژن محتای اسیدهای آمینه همچنین تفات در فاکترهای رشد پرتئینها برقرار میباشد. به عبارت دیگر تمامی ترکیبات یاد شده در طل مسیر ایداکت به رحم دچار تغییر تحل میشند )جدل 4-2( )3-8(. Precompaction postcompaction )اندازه نرخ باشت خرج ماد از سلل ) weight/h) (metabolic quotient: QO µg/mg dry 71

77 جدل 4-2. غلظت (mm) ماد مغذی در لله ایداکت مایع مجد در رحم اسیدهای آمینه گلکز الکتات پیرات اسیدهای آمینه غیر ضرری )آالنین آسپاراتات گلتامات گلیسین سرین تائرین ) /1 3 41/ 3 1/ 32 ایداکت مخلط اسیدهای آمینه ضرری غیر ضرری /3 43 3/ 90 1/ 41 رحم متابلیسم ریان انسان فعالیت متابلیکی تنظیم آن برای تلید ATP تلید ماد حداسط برای بیسنتز همچنین فراهم کن سبستراها برای اکنشهای استیلیشن متیالسین تسط تمام سللها مهم میباشد. ضعیت متابلیکی هر سلل به عنان یک شاخص مهم برای سنجش سالمت زنده مانی آن سلل به حساب میآید. ریان پستانداران نیز از این قاعده مستثنی نیستند. در اقع تانایی یک ریان در تنظیم متابلیسم خد بهطر مستقیم مربط به تانایی آن ریان در النهگزینی ایجاد یک آبستنی زنده میباشد )41(. جالب این است که ریان پستانداران میتانند خد را با شرایط پیرامنی تطابق دهند البته الزم به ذکر است که این انعطاف پذیری میتاند به قیمت از دست رفتن قدرت زنده مانی ریان تمام شد. از دست دادن تعادل بین مسیرهای متابلیکی به یژه مسیرهایی که برای برخی ماد حد اسط مشترک رقابت دارند میتاند منجر به تخلیه ذخایر این سبستراها در ریان شد بنابراین تانایی ریان برای تلید ATP کاهش خاهد یافت. این نکته به خبی در ریانهای پیش از متراکم شدن مشخص شده است. متابلیسم خارج از کنترل یا نرخ باال مصرف سبستراهای غیر مرتبط به عنان مثال متابلیسم زدهنگام گلکز منجر به از دست دادن قدرت زندهمانی ریان میشد. این درحالی است که یک متابلیسم تحت کنترل متعادل میتاند منجر به حفظ زنده مانی ریان شد )44(. بنابراین تفکر اندیشیدن در م متابلیسم انرژی ریان به عنان یک عامل برقرار کننده تعادل بین مسیرهای متفات متابلیکی در شرایطی که سبستراها را نمیتان به صرت کامال مج انحصاری در نظر گرفت همچنین در نظر داشتن این نکته که هر تغییر جا به جایی در مسیرهای متابلیک میتاند ری مسیرهای دیگر تاثیرگذار باشد الزم به نظر میرسد )شکل 4-2(. شکل 4-2. نمدار باال مسیرهای متابلیکی تقابل بین سه منبع عمده انرژی در ریانهای درحال تکین را نمایش میدهد. 74

78 به منظر مرر مسیرهای متابلیسمی در ریان انسان این مسیرها به 1 دسته مسیر/سبسترا تقسیم میشد: 4( پیرات الکتات 2( گلکز 3( اسید آمینه 1( اسیدهای چرب/بتا اکسیداسین 2-2. پیرات الکتات کشف اصل پایه مطالعات دهه میالدی به عنان الین مطالعاتی شناخته میشند که اهمیت پیرات به عنان منبع انرژی برای ریان پیش از مرحله تراکم را مشخص نمد )42(. به اسطه فسفریالسین اکسیداتی پیرات به سیله میتکندری به طر مستقیم اکسید میشد. در نهایت فسفریالسین اکسیداتی پیرات به تلید ATP منجر میشد. الزم به ذکر است که ریان- های الیه فقط از همین منبع انرژی میتانند برای تلید ATP استفاده نمایند. الکتات نیز میتاند به عنان یک منبع تامین کننده انرژی برای حمایت از تکامل ریان به حساب آید. البته این تانایی فقط از مرحله 2 سللی به بعد امکان پذیر میباشد. در مدلهای حیانی نشان داده شده است که متابلیسم پیرات الکتات در تعادل با یکدیگر صرت میپذی به این ترتیب که رشد تکامل بهینه ریان تنها در صرتی رخ میدهد که این د ماده به طر همزمان به صرت متعادل در محیط کشت حضر داشته باشند )43(. با این جد مقادیر زیاد الکتات در محیط کشت میتاند تغییر دهنده نرخ اکسیداسین پیرات شد. بنابراین چنین تغییری میتاند منجر به تغییر در مین فراهمی + NAD NADH در سلل شده در نهایت تلید ATP را دچار اختالل نماید )41(. بنابراین تعادل یا نسبت بین پیرات الکتات در محیط کشت میتاند تنظیم متابلیک ریان را تحت تاثیر قرار دهد در نهایت منجر به تاثیر بر بازده تلید ATP شد. حاصل این تغییرات برتانایی رشد تسعه ریان در مراحل ابتدایی مثر اقع خاهد شد محیط کشت ریان انسان از نتایج این مطالعات میتان به این نکته رسید که پیرات به عنان یک جز کلیدی در محیطهای کشت ریان انسان محسب میشد غلظتی از آن که در محیطهای کشت ریان برای مرحله کلیاژ درنظر گرفته شده است بسیار باالتر از محیطهای کشتی میباشد که برای ریانها در مرحله بالستسیست تلید طراحی شده است. الکتات نیز در محیطهای کشت مختلف حضر دا. سطح الکتات همانند پیرات در محیطهای کشت مربط به مرحله کلیاژ بالستسیست متفات میباشد. عاله بر غلظت مطلق هر یک از این د ماده نکته حایز اهمیت در م پیرات الکتات در حقیقت نسبت این د ماده در 411 محیطهای کشت میباشد. در نهایت غلظت مطلق این د ماده است که نقش آنها در تنظیم پتانسیل احیا سرنشت نهایی سبستراها را تعیین خاهد نمد. با در نظر گرفتن تمامی این ما طبیعی به نظر میرسد که مقدار نسبت پیرات به الکتات برای ریانهای مجد در مرحله کلیاژ در مقایسه با مرحله بالستسیست بیشتر باشد سنجش قدرت زنده مانی کشش های فراانی در زمینه برقراری ارتباط بین باشت پیرات تسط ریان انسان تلید الکتات با قدرت زندهمانی آن صرت پذیرفته است. نکته بسیار جالب این که بعد از اندازه گیری مقدار باشت پیرات تسط ریانهای مرحله 2 تا 9 سللی یک رابطه معکس بین این مقدار باشت شده نرخ آبستنی مشاهده شده است )43(. همچنین مشخص شده است که ریانهایی که در مرحله کلیاژ متقف شدهاند به طر معنیداری در مقایسه با ریانهای تسعه یافته به مرحله بالستسیست مقادیر کمتری از پیرات را باشت نمدهاند. در نتیجه مقادیر کمتری از الکتات را نیز تلید مینمایند )42 40(. در تمام مطالعاتی که تاکنن صرت پذیرفته است تنها باشت سبستراها تسط ریان م اندازهگیری ارزیابی قرار گرفته است. شاید سرنشت نهایی متابلیکی پیرات است که در مقایسه با باشت آن تسط ریان باید بیشترین تجه را به خد معطف نماید. Redox potential 72

79 دلیل ادعای حاضر میتاند مربط به این نکته باشد که نرخ باالی باشت پیرات م مکن است نشان دهنده استفاده نامناسب غیر بهینه از سبستراهای انرژی تسط ریان باشد. در مقابل در مرحله بعد از تراکم که نیاز به ATP فعالیتهای بیسنتزی در حال افیش میباشد ریانهایی با قدرت باالی باشت پیرات دارای بیشترین تانایی برای رسیدن به مرحله بالستسیست میباشند )49(. دباره باید ذکر شد که کماکان سرنشت حقیقی متابلیکی سبستراها اندازهگیری نشده است گلکز کشف اصل پایه گلکز به عنان منبع اصلی الیه تلید ATP تقریبا تسط تمامی سللهای پستانداران م استفاده قرار میگی. گلکز باشت شده تسط سلل در سیتزل با استفاده از مسیر Embden-Meyrhif که شامل مجمعهای از اکنشهای بیشیمیایی میباشد به پیرات تبدیل میشد. تبدیل گلکز به پیرات در سیتزل منجر به تلید 2 ملکل ATP میشد. سپس پیرات به استیل کآنزیم تبدیل شده بالفاصله ا چرخه TCA میشد در حضر اکسیژن مراحل اکسیداسین را طی نمده تا منجر به تلید CO 2 O H 2 در میتکندری میشد. اکسیداسین کامل گلکز منجر به تلید 39 ملکل ATP می- شد که همانطر که ذکر شد 2 ملکل آن حاصل گلیکلیز 32 ملکل باقیمانده در چرخه TCA تلید خاهد شد. جدل 2-2. تاثیر کشت ریانهای مش در محیط کشت mmft در باشت گلکز تلید پیرات تسط بالستسیستهای مش )20( باشت گلکز pmol/e/h( ) تلید الکتات pmol/e/h( ) فعالیت گلیکلیتیک )%( کنترل /1/98±1 28 2/04±1/ /1±2/ 3 استرس به مدت 2 ساعت 1 /33±1/ 32 9 /44±1238* 83/8±9/3* دادهها به صرت mean±sem بیان شدهاند تعداد 21 بالستسیست م استفاده قرار گرفته است. دادههایی که با * مشخص شدهاند دارای اختالف معنی دار میباشند )1/13>P( 414 مطالعات ری ریان حیانات مشخص نمده است که ریان 2 سللی مش سلل تخم تانایی استفاده از گلکز به به عنان منبع انرژی را ندارند )48-24(. درمقابل ریانهای 9 سللی مش در حضر گلکز تانایی تسعه تکامل را داشته در حقیقت بهترین منبع تلید انرژی برای آنها همین گلکز میباشد )21-22(. همچنین پیشنهاد شده است که قرار دادن ریان- های 9 سللی در معرض گلکز منجر به افیش نرخ تسعه تکامل ریانها به مرحله بالستسیست میشد ) (. به عاله در ریان های حیانات نشان داده شده است که جد مسیری که گلکز در داخل ریان برای رسیدن به سرنشت نهایی خد طی میکند به عنان یک فاکتر ضرری برای زنده مانی ریان به حساب میآید. در صرتی که ریانهای مش در مرحله بالستسیست به مدت 2 ساعت در محیط کشتی که فاقد تنظیم گرهای اصلی میباشد )محیط )mmft قرارگی باشت گلکز تسط ریانها دچار اختالل نشده اما سرنشت گلکز به طر معنیداری دچار تغییر تحل خاهد شد. مسیر این تغییرات در جهتی میباشد که اکسیداسین در چرخه TCA زنجیره انتقال الکترن به شدت کاهش مییابد. در عض متابلیسم گلکز به سمت مسیر گلیکلیتیک سیتپالسمی منتقل میشد. در نهایت این قایع به تلید الکتات بیشتر منجر شده به شدت تلید ATP را دچار نقصان مینماید تمامی این اتفاقات درحالی رخ میدهد که باشت گلکز دچار هیچ نقصانی نشده است )جدل 2-2( )20(. باشت گلکز تسط ریان انسان در حقیقت یادآر اتفاقاتی است که در مدلهای حیانی گرش شده است این باشت در مراحل ابتدایی رشد ریان به مین کم رخ داده اما به تدریج با پیشرفت رشد ریان بعد از فعال شدن ژنم آن )مرحله 1 تا 9 سللی( به صرت تصاعدی تا مرحله بالستسیست افیش مییابد )40(. zygote 79

80 محیطهای کشت ریان انسان دادههای بدست آمده از مطالعات مختلف نشان میدهد که در معرض گلکز قرارگرفتن برای تسعه رسیدن ریانها به مرحله بالستسیت الزم ضرری میباشد حتی اگر برای مدت بسیار کتاهی در حد چند دقیقه باشد )23 22( در حقیقت گلکز به عنان یک جز کلیدی در تمام محیطهای کشت برای تسعه بالستسیتهای انسان میباشد. نیاز به گلکز برای ریانها در مرحله پیش از متراکم شدن چندان حیاتی به حساب نمیآید. اما با این حال نقش خد را در مسیر پنتزفسفات همچنین در مسیرهای بیستزی همچنان ایفا خاهد نمد البته باید در نظر داشت که مقدار گلکز برای محیطهای کشت ریان در مرحله کلیاژ هماره باید درپایینترین سطح در نظر گرفته شد )42( ارزیابیهای زندهمانی مطالعات انجام شده با مدلهای حیانی درگنههای مختلف نشان دهنده همبستگی بین نرخ باشت گلکز همچنین سرنشت متابلیکی آن با قدرت زنده مانی ریان میباشند. مطالعات ابتدایی در گا نشان داد که ریانها با قدرت باشت گلکز به مین بیشتر از 3 میکرگرم در ساعت در مقایسه با آنهایی که مقادیر کمتری گلکز باشت مینمایند بهتر با نرخ باالتری به مرحله بالستسیست خاهند رسید )29(. با استفاده از مش به عنان مدل مطالعاتی مشخص شد که به طر معنیدار مقدار گلکز کمتری تسط ریانهای با قدرت زندهمانی کم در مقایسه با ریانهایی که منجر به تلد نتاج میشند از محیط کشت باشت میشد )28(. همچنین نشان داده شد که ریانهایی با متابلیسم متعادل گلکز قادر خاهند بد که نرخ باالیی از النه گزینی را ایجاد نمایند )41(. همینطر باشت گلکز از محیط کشت تسط ریانهای انسان همبستگی باالیی با کیفیت ریان- های از خد نشان میدهد. در رز 1 بعد از لقاح ریانهایی که در مراحل تقف سللی درگیر شدهاند تانایی انتقال به سمت استفاده از گلکز به عنان منبع انرژی در مقایسه با ریانهایی که تانایی رسیدن به مرحله بالستسیت را از خد نشان میدهند ندارند )40 49(. ریانهای حاصل از لقاح منجر به پلیاسپرمی ریانهای پارتنژینک نیز تانایی باشت مقادیر بسیار کم گلز در رز 3/3 در مقایسه با ریانهای با کیفیت از خد نشان میدهند )42(. همچنین در رزهای 3 2 بعد از لقاح بالستسیتهای با کیفیت باال )منظر بالستسیستهایی با ICM کامال مج ترفکتدرم یکپارچه میباشد( به طر معنیداری باشت مقادیر باالتری از گلکز را در مقایسه با ریانهایی با یژگیهای ظاهری نامشخصتر از خد نشان میدهند )49(. باشت گلکز تسط بالستسیست در پی انتقال آن به رحم مجد پذیرنده به طر مشخص با تانایی زندهمانی ایجاد یک آبستنی مفق تسط بالستسیست در ارتباط میباشد. این اطالعات در مقایسه بین بالستسیستهای منتقل شده به رحم که تانایی النهگزینی را نداشته در مقایسه با بالستسیستهایی که منجر به آبستنی میشند بدست آمده است )31( اسیدهای آمینه کشف اصل پایه مایع ایداکت رحم حای مقادیر قابل تجهی از اسیدهای آمینه میباشند. همچنین اسیت ریان نیز حای ناقلین یژه اسیدهای آمینه در غشای خد بده که اجازه باشت این ریز مغذیها از محیط اطراف را به آنها میدهد ) (. اسیدهای آمینه عملکهای یژه متفاتی را در ریان برعهده دارند. از جمله این نقشها میتان به نقش آنها به عنان منابع انرژی یاد ک. همچنین این اس یدهای آمینه به عنان سبستراهای مثر در ایجاد تنظیم فشار اسمزی آنتی اکسیدانها کیالت کنندهها تنظیم کنندههای ph همچنین پیشسازهای الزم برای سنتز پرتئینها اسیدهای نکلئیک نیز نقشهای کلیدی حیاتی خد را ایفا مینمایند )11-33(. انتقال متابلیسم اسیدهای آمینه نقش حیاتی در تسعه تکامل ریان ایفا مینماید. مطالعات انجام شده در جندگان )12-14( حیانات اهلی )18-10( انسان )34-31( نشان داده است که افزدن اسیدهای آمینه به محیطهای کشت به طر مشخصی منجر به ارتقای تکامل تکین ریانها همچنین قدرت زنده مانی ریانها در شرایط 71

81 برنتنی شده است. این مطالعات همچنین مشخص کند که با گذشت مراحل مختلف رشد تکین ریان از کلیاژ به بالستسیست منجر به تغییر در نیازها به این اسیدهای آمینه از سی ریانها میشد محیطهای کشت ریان انسان به عنان نتیجه بدست آمده از مطالعات انجام شده ری ریان حیانات انسان که نشان دهنده اثر فقالعاده اسیدهای آمینه بر قدرت تکین تکامل ریان مجدات مختلف میباشد تمامی محیطهای کشت حای مقادیر مختلفی از این اسیدهای آمینه شدهاند. ترکیب اسیدهای آمینه اضافه شده به محیطهای کشت در بین سیستمهای مختلف کشت متفات میباشد. بیشترین شباهت بین ترکیبهای متفات اسیدهای آمینه در سیستمهای کشت د مرحله ای مشاهده میشد که محیطهای کشت طراحی شده برای ریان های در مرحله کلیاژ حای مقادیر مختلفی از اسیدهای آمینه شامل آالنین آسپاراتات آسپاراژین گلتامات یک ماده مشتق شده پایدار از گلتامین پرلین سرین تائرین میباشند. این ترکیب شباهتهایی با اسیدهای آمینه غیر ضرری Eagels دارا هستند )32(. محیطهای کشت فرمله شده برای ریانهای در مراحل بعد از تراکم تقریبا شامل یک طیف سیعی از اسیدهای آمینه میباشند که بیشتر شبیه به آن ترکیبی است که برای محیطهای کشت سللهای بدنی فرمله میشد )معمال شامل تمامی 21 اسید آمینه شناخته شده میباشد( )32( ارزیابی زندهمانی فهم این مطلب که اسیدهای آمینه به عنان یکی از منابع ضرری در تسعه برنتنی ریان مجدات مختلف ایفاگر نقش میباشند منجر به آغاز مجمعه مطالعاتی شد که از آزمایشهای Leese همکاران با هدف برقراری ارتباط بین مین متابلیسم turnover اسیدهای آمینه با قدرت زندهمانی ریان طراحی اجرا گید. با بهره گیری از تکنیک HPLC محیط کشت باقیمانده حاصل از کشت ریانهای مرحله کلیاژ که تانایی عبر از مرحله تقف سللی را داشتهاند به مرحله بالستسیست رسیدهاند مشخص شد که محتای اسیدهای آمینه باقیمانده در محیط کشت این ریانها با ریانهایی که در مرحله تقف سللی دچار ایست شده بدند کامال متفات میباشد )33(. همچنین در مطالعات بعدی مشخص شد که باشت مصرف اسیدهای آمینه برای ساخت ماکرملکلها یا استفاده از این منابع به عنان منشا انرژی با قدرت النه گزینی ریان همچنین ایجاد یک آبستنی مفق در نهایت تلید ند زنده ارتباط تنگاتنگی دا )33 31(. به هرحال اگرچه مطالعات الیه امیدارکننده بد همچنان مقدار دانستههای ما در م اینکه چگنه یک سیستم کشت منحصر به ف میتاند بازگ کننده تغییر در مقدار یک اسید آمینه خاص باشد بسیار اندک ناچیز است اسیدهای چرب کشف اصل پایه درحالی که دانستههای ما در زمینه تانایی اسیت ریان در متابلیسم ماد مغذی با منشا خارج سللی از جمله کربهیدراتها آمین اسیدها به نسبت زیاد میباشد اما نقش متابلیسم منابع درندی ذخیرهای متابلیسم مانند گلیکژن لیپیدها تقریبا به در از تجه کافی قرار گرفته است. مطالعات گذشته مشخص نمده است که ریان اسیت حای منابع ذخیره درندی لیپیدی میباشند. در بین گنههای مختلف این مقادیر متفات میباشد. این تفات در محتای لیپیدی ذخیره در ریان اسیت گنههای مختلف شاید به دلیل فاصله کم بین لقاح النه گزینی در انسان جندگان میباشد. در حقیقت در گنه- هایی که فاصله بین لقاح النه گزینی ریان طالنیتر میباشد نیاز به ذخیره لیپیدی در اسیت ریان نیز بیشتر میشد )33(. نقش در نظر گرفته شده برای متابلیسم لیپیدها در ریان به صرت چندجهی در نظر گرفته شده است. شاید دلیل این چند عملکی بدن لیپیدها به نقش مهم آنها در رند تلید هرمن تغییر تبدیل کانالهای ینی ممانعت از فعالیت DNA پلیمراز بیان ژن عملک آنها به عنان یک منبع مغذی همچنین نقش تعیین کننده آنها در شکل گیری غشای لیپیدی 75

82 سللها باشد )32(. مطالعات صرت گرفته در نشخارکنندگان نشان داده است که محتای لیپید درند اسیت ریان می- تاند به اسطه ترکیبات مجد در محیط کشت تحت تاثیر قرار داده شد )39 30( به عنان مثال اسیتهای گا بعد از قرار گرفتن در محیط کشت حای سرم ریان گای یک افیش معنیدار در سطح تریگلیسرید درندی از خد نشان میدهند )38(. همچنین شاهد مستقیمی از قع فرایند بتااکسیداسین در اسیت گا خک مشاهده شده است )38 24( همچنین مطالعات صرت گرفته در ریان انسان نشان داده است که لینلئیک پالمتیک اسید هر د میتانند تسط ریان انسان رند اکسیداسین را طی نمایند )32 22(. با تمام این تفاسیر مطالعات بسیار کمی به انجام رسیده است که نشان دهنده این نکته باشد که افزدن اسیدهای چرب آد غیر اشباع مختلف یا مشتقاتشان به محیط کشت بتاند ارتقا دهنده تانایی ریان در رسیدن به مرحله بالستسیست در شرایط برنتنی باشد تا به امرز هیچ مطالعهای به انجام نرسیده است که نشان دهنده افیش در نرخ بارری آبستنی در اثر افیش اسیدهای چرب آد غیر اشباع به محیط کشت باشد محیط کشت ریان انسان تاکنن هیچ محیط کشت خاصی برای ریان انسان که حای اسیدهای چرب باشد به صرت تجاری تلید نشده است. البته گفتن این مطلب میتاند تا حددی گمراه کننده باشد زیرا تمامی محیطهای کشت که حای سرم آلبمین به عنان منبع پرتئین میباشند محتای 2 تا 3 مل اسید چرب به ای هر مل از پرتئین میباشند )23( ارزیابی زنده مانی در حال حاضر تمایل فیندهای در بررسی نقش اسیدهای چرب در متابلیسم اسیت ریان جد دا البته این مطالعات در ابتدای مسیر خد میباشند. در نتیجه نیاز به مطالعات بیشتری در این زمینه قبل از افزدن اسیدهای چرب به عنان یک منبع تعیین کننده در محیط کشت ریان انسان احساس میشد. ماد 2-2. معرفترین رش در بین رشهای ارزیابی زنده مانی ریان در آزمایشگاههای ریانشناسی استفاده از سیستم نمره دهی ظاهری میباشد. اگرچه این رش ارزشمند میباشد اما تفسیر نتایج حاصل از بررسی ظاهری ریانها میتاند گمراه کننده بیدقت باشد. این عدم دقت یکپارچگی نه تنها بین کلینیکها آزمایشگاههای مختلف مشاهده میشد بلکه بین دانشمندان مختلف نیز به ضح بهچشم میآید. در نتیجه نیاز به تسعه ایجاد رشهای دقیق کمی غیرتهاجمی به منظر سنجش کیفیت ریانها احساس میشد. همانطر که پیشتر بیان شد متابلیسم میتاند به طر مستقیم به قدرت همستاز ریان مرتبط بده در نتیجه میتاند به عنان یک شاخص ارزشمند از قدرت النه گزینی ریان در نظر گرفته شد. رشهای میکرفلرسنس که در دهه 4891 میالدی بنا شد محققین را قادر میسازد که باشت ماد مغذی تسط یک سلل را م ارزیابی قرار دهند. این رش برای استقاده در زمینه ریانشناسی به منظر ارزیابی ریانها تعدیل شده هم اکنن م استفاده قرار میگی. استفاده از رش سنجش میکرفلرسنس یک اساس بنیان ارزیابی برای سنجش محیط کشت باقیمانده از کشت برنتنی ریان با بهرهگیری از آنالیزهای آنزیمی را فراهم نمده است. اگرچه بسیاری از این رشهای سنجش با بهره گیری از قطراتی با حجم 41 تا 21 نانلیتر کار میکنند اما این امکان جد دا که ظرفیت عملکی این رشها را به حدی افیش داد که بتان محیط کشت باقیمانده از کشت برنتنی ریانهای انسان بعد از 4 تا 2 رز کشت را م ارزیابی قرااد. امکان استفاده از این رشهای سنجش برای اندازهگیری مقدار هر مادهای از جمله کربهیدرات آمین اسیدها یا اسیدهای چرب که میتانند به صرت خطی با تغییرات ماده نشان دار شده با فلرسنت مرتبط شند جد دا. رشی که در ادامه ارایه شده 76

83 412 است تضیح دهنده نحه استفاده از رش میکرفلئرمتریک است که میتاند به منظر آنالیز باشت سبستراها از محیط کشت تسط ریان در انتخاب ارزیابی ریان م استفاده قرار بگی. شایان ذکر آماده سازی ماد برای تضیح اهداف این فصل به ارایه رش اندازه گیری پیرات گلکز به عنان نمنههایی میپازیم. است که اصل ارایه شده در این مجال برای هر نع ماده دیگر قابل تطبیق استفاده میباشد پیرات: اندازه گیریشده در رز 2 یا 3 کشت ریان سنجش فلئرمتریک بر پایه بررسی مصرف یا تلید NADH یا NADPH در یک اکنش آنزیمی مزدج بنا شده است. این نکلئتیدها در زمانی که تحریک میشند باعث تابش نر فلرسنت خاهند شد. درحالی که فرم اکسید شده آنها یعنی + NAD + NADP این تانایی را از خد برز نمیدهند. شکل 2-2. نمدار استاندا برای گلکز پیرات. سطح مختلف پیرات به اسطه کاهش در نر فلرسنت میتاند اندازهگیری شد. درحالی که سطح مختلف گلکز با افیش تلید نر فلرسنت سنجیده میشد. تغییرات در مین فلرسنت به اسطه اکنش زیر منجر به اندازهگیری سبسترای م نظر میشد. بنابراین مقدار پیرات در محیط کشت به طر مستقیم مرتبط با مقدار نر فلرسنت میشد به طری که افیش سطح پیرات مطمئنا منجر به کاهش در مقدار نر فلرسنت خاهد شد )شکل 2-2(. 3 بافر EPPS 2/3 گرم EPPS 211 میلیلیتر آب میلیکی 4 مالر هیدرکسید سدیم با اسیدیته 9 سپس محلل فیلتر شده در دمای 1 درجه سانتیگراد نگهداری شد. میلیمل محلل NADH 40/0 میلیگرم NADH 3 میلیلیتر آب میلیکی microfluorometric Reagents 77

84 411 محلل کاری 41 میلیلیتر بافر EPPS 1/3 میلیلیتر بافر 3 میلیمالر NADH 221 احد بین المللی الکتات دهیدرژناز ما مذکر در للههای 311 میکرلیتری در دمای منفی 21 درجهسانتیگراد نگهداری شد. محر استاندا محلل 4 میلی مالر پیرات را آماده نمده ) گرم پیرات را به 411 میلی لیتر آب Milli Q اضافه نمایید(. سپس فیلتراسین انجام شده در دمای 1 درجه سانتیگراد نگهداری میشد. محلل 4 mm پیرات را به صرت سریالی به مقادیر 1/423 1/23 1/3 1/1223 میلی مل رقیق میسازیم گره کنترل م نظر فقط حای آب در نظر گرفته میشد. این محلل در نتیجه نمدار استاندا باید هر هفته آماده شده در دمای 1 درجه سانتیگراد ذخیره شد. به کمک این محلل میتانیم نمدار استاندا را تلید نماییم گلکز: در رزهای کشت ریان اندازه گیری میشد سنجش گلکز همانند رش مشابه برای سنجش پیرات عمل مینماید اما مقدار گلکز به طر مستقیم با افیش نر فلرسنت در ارتباط میباشد. بنابراین با افیش در مقدار گلکز محیط کشت شاهد افیش در نر فلرسنت تلیدی خاهیم بد )شکل 2-2(. نمدار استاندا همانند بخش قبل به جز اینکه محلل 4 میلی مالر گلکستفاده میشد )1/149 گرم گلکز در 411 میلی لیتر آب.)Milli Q 3-2. رشها به منظر برقراری ارتباط بین باشت مقادیر مختلف ماد مغذی تسط ریانها باید ریانها به صرت انفرادی کشت داده شند. تصیه شده است که شرایط محیط کشت ریان براساس نسبت ریان/حجم که تسط کارخانه سازنده تصیه شده است ثابت در نظر گرفته شد تا اطمینان کامل نسبت به تامین نیازهای ریان برای رشد تکامل حاصل شد. این نکته به خصص در صرتی که جزییات محیط کشت تسط کارخانه سازنده بیان نشده باشد میتاند بسیار حایز اهمیت باشد. زیرا در غیر این صرت شما به طر غیر عمدی تسعه ریان را به اسطه تخلیه ماد مغذی محیط کشت مختل مینمایید آماده سازی رش سنجش 4- محلل پیرات/گلکز از فریزر 21- خارج نمده ری یخ اجازه دهید تا محلل یخگشایی شد. در هر رز از محلل تازه الیکت شده استفاده نمایید. 2- از رشن بدن میکرسکپ فلرسنت آماده تصیر باری بدن آن اطمینان حاصل نمایید ) 413 اطمینان حاصل نمایید که میکرسکپ برای سیگنال یکپارچه عبر کننده از جسم هدف کالیبره شده باشد(. 3- د سری از تیبهای 1/3 1/23 1/ را برای نمدار استاندا برچسب گذاری نمایید )b,a(. 1- ابتدا تلید نمدار استاندا را آغاز Working solution Uniform 78

85 نمایید. 8 میکرلیتر از محلل کاری را در انتهای تیبهای eppendorf الیکت نمایید. در این مرحله باید دقت شد که تمام ککتل در انتهای لله eppendorf جایگزین شده هیچ قطرهای به دیاره لله باقی نماده است. 3- استانداهای گلکز/پیرات را هماره در فریز نگهداری نمایید )1 1123/3 1/23 1/423 4 مل( محللها نمدار استاندا باید به صرت هفتگی تهیه شد. 2- اطمینان حاصل نمایید که محللهای استاندا به خبی مخلط شده باشند. سپس 4 میکرلیتر از 412 هریک از محللهای استاندا را به 8 میکرلیتر از مخلط تهیه شده برای سنجش با در نظر گرفتن برچسبهای مجد ری تیبها اضافه نمایید زمانسج را فعال نمایید )مطمئن شید که محلل استاندا مستقیما به مخلط سنجش کننده اضافه شد نه اینکه به دیاره تیبها چسبیده باشد. همچنین اطمینان حاصل کنید که محلل استاندا به خبی با کل مخلط سنجش کننده مخلط شد(. 0-2 عدد اسالید شیشهای را کامال از گ خاک پاک کنید )از اسالیدهای پلی لیزین استفاده نشد به دلیل سطح ناهمار آنها که منجر به ایجاد نر ناهمار نااضح فلرسنت میشد(. 9- نار باریکی از آلمینیم را در اطراف لبه های اسالید قرار دهید تا سدی برای جلگیری از فرار حرکت رغن ایجاد شد. خطط سیاه ری اسالید کشیده شد تا نشان دهنده این باشد که کدام قطره استاندا است. با استفاده از پیپت شیشهای سرنگ یک نار باریک از رغن معدنی بر ری اسالید قرار دهید )شکل 3-2(. 8- بعد از گذشت 9 دقیقه پیرات/گلکز مخلط سنجش (a) را با پیپت به باال پایین کشیده تا مطمئن شید که مخلط به خبی با هم آمیخته شده باشد. سپس قطره 4 میکرلیتری از هرکدام از مخلط محلل استاندا/محلل سنجش را ری اسالید زیر رغن معدنی مخلط کنید یک قطره بین هر یک از د خط قرار دهید. مراحل ذکر شده در همین قسمت )مرحله 8( را با مخلط تکرار شده محلل استاندا/محلل سنجش (b) را ری اسالید دم قرار دهید. مطمئن شید که قطرات کامال به کف اسالید چسبیده کامال یک شکل هستن. اندازه قطرات بسیار مهم میباشد. هرچه قطرات بزرگتر پهنتر باشند در مقایسه با قطرات کچکتر مرتفعتر نر فلرسنت متفاتی ساطع میکند. اگر قطرات از نظر سایز متفات باشند نیاز است که یک قطره دیگر را بر ری اسالید قرار دهیم. 41- بعد از گذشت 41 دقیقه به کمک میکرسکپ با المپ جیه با طل مج 311 نانمتر (UV) از قطرات تصیر باری نمایید. تصایر را میتان به کمک فتمتر متصل شده به میکرسکپ یا به اسطه دربین CCD ضبط ثبت نمایید. در صرت استفاده از هرکدام از د رش ذکر شده زمان الزم برای برانگیخته شدن برابر میباشد )معمال این دامنه بین 211 تا 311 میلی ثانیه اشت(. برای سیستمهایی که از دربینهای مجهز به نرم افرهایی از جمله نرم افر تجزیه تحلیل کننده تحقیقات )Olympus( LS سطح متسط فلرسنت هر قطره را میتان به اسطه نرم افرهای تجزیه تحلیل کننده از جمله Image J م ارزیابی قرار داد /NIH: (. 44- بعد از آنکه نمدار استاندا م تجزیه تحلیل قرارگرفت در صرتی که انحراف معیار اشتباه نسخه تکرار شده کمتر از %3 باشد R 2 بزرگتر از 1/89 نمدار م قبل قرار میگی. اگر نمدار استاندا پذیرفته نشد باید دباره نمدار استاندا دیگری تهیه شد قبل از اینکه آزمایش اصلی ری نمنههای م نظر آغاز شد. شکل 3-2. تصیر شماتیک پیشنهادی برای اسالید سنجش کننده مقدار نر فلرست cocktail 73

86 سنجش پیرات / گلکز برای نمنههای حاصل از بیماران م مطالعه 4- محیط کشت باقی مانده مجد ری کشتهای ریان را رقیق سازی نمده در تیبهای eppendorf قرار داده برچسب گذاری مینمایید. رقیق سازی ابسته به سبسترا ترکیب استفاده شده در محیط کشت میباشد. زمانی که به کمک پیپت 41-4 میکرلیتری الیکتهای محیط کشت را خارج میسازید. به دقت نک پیپت را به لبه ظرف کشت کشیده تا قبل از ریختن محیط کشت به داخل آب برای رقیق سازی رغن معدنی از آن خارج شد. )یادداشت شماره 4 را مطالعه نمایید(. 2- همچنین حجم یکسانی از محیط کشت کنترل را با پیپت باست نمایید به همان رش ذکر شده در مرحله قبل رقیق سازی را انجام دهید. این مسئله به شما کمک میکند تا یک سطح کنترل برای پیرات/ گلکز بدست آه که در نهایت برای محاسبه مقدار پیرات/ گلکز باشته شده تسط ریان به کار آید )یادداشت 2 را مالحظه نمایید(. 3- رش سنجش را مطابق آنچه که در قسمتهای قبل تضیح داده شده است به اجرا در آرید. یک میکرلیتر از محیط کشت )خالص یا رقیق شده( به 8 میکرلیتر از مخلط (cocktail) سنجش اضافه نمایید. سپس به مجمعه حاصل اجازه دهید تا انکبه شند سپس سنجش را ری اسالید شیشهای به اجرا درآرید. 1- نمنههای حاصل از کشت ریان بیماران مختلف را ا مراحل سنجش نمایید از 4 تا ماکزیمم 3 نمنه مختلف را به صرت همزمان میتان م ارزیابی قرار داد. به منظر تلید نمدار استاندا از ریهای که در باال تضیح داده شده است اشتفاده نمایید )یادداشت 3 را مطالعه نمایید(. 3-3 تکرار برای هر نمنه از محیطهای کشت ریان منحصر به ف میتان به عنان داده م قبل فرض شد درصرتی که انحراف معیار اشتباه کچکتر از 1/13 باشد. 2 -اگر انحراف معیار اشتباه د تکرار بزرگتر از 1/13 باشد باید آزمایش تکرار شد. 0 -به کمک نمدار استاندا میتان مقدار باشت گلکز پیرات از محیط کشت باقیمانده را به دست آ. 9 -مقدار باشت گلکز پیرات تسط ریان را میتان از طریق کم کن مقدار مجد این د ماده در محیط کشت باقیمانده حاصل از محیط کشت ریان از محیط کشت کنترل بدست آ. 8 -سپس میتان ریانها را به اسطه مین باشت گلکز پیرات رتبه بندی نمد یادادشتها 4- برای صحت نتایج به دست آمده در ست کن ظرف کشت بیماران باید دقت الزم را به کار گرفت. برای اینکه بتانیم با دقت صحت کافی مقدار باشت هر یک از ماد مغذی از محیطکشت تسط ریان را بسنجیم باید در کچکترین ما از جمله حجم قطرات محیط کشت دقت الزم را مبذل داریم زیرا کچکترین تفات حجم در اندازه قطرات محیط کشت باعث برز اشتباه در سنجش مقادیر باشت شده تسط ریان میشد. در نتیجه تمامی ظرف کشت با پیپت کن دقیق باید آماده شند )استفاده از پیپتهای چندگانه Gilson میتاند مفید باشد(. بعد از قطره گذاری تمامی قرات باید تسط رغن معدنی پشانده شده تا از تبخیر در نتیجه تغییر در اسمالریته آن همچنین تغییر در غلظت ماد مغذی آن جلگیری شد. هر ظرف کشت باید حای د قطره اضافی به عنان قطرات فاقد ریان که نقش گره کنترل را ایفا مینمایند به همراه یک قطره جهت شستش باشد. 2- در هنگام قراادن ریانها به داخل هر قطره باید دقت الزم به کار گرفته شد. هر ریان باید به خبی در محیط کشت شستش شد تا از حمل شدن اج مختلف بین محیطهای کشت متفاات جلگیری شد. هرریان در هنگام انتقال بین محیطهای کشت باید کمترین مقدار از محیطهای کشت را باخد حمل نماید )کمتر از 2 درصد حجم قطرات کشت(. باید اطمینان حاصل نمایید که محیطهای کشت کنترل به منظر شستشی ریان یا کشت ریان استفاده نشد. زمانی که تصمیم دارید تا یک سنجش درباره مقدار باشت ماد مغذی تسط ریانها را به اجرا درآرید هر ریان را به صرت انفرادی به ظرف کشت جدید منتقل نمایید. دقت شد که شما قصد انتقال حتی ذرهای از محیط کشت تازه به محیط کشت باقیمانده که قصد سنجش آن را دارید را نداشته ندارید. ریان را به گنهای از قطرهای که قصد سنجش آن را دارید خارج نمایید که تا حد امکان کمترین اختالل در آن قطره ایجاد نشد. به این منظر ابتدا ریان از قطره کشت خارج شده درمحیط شستش شسته شد. اسن کار برای تمام ریانها به ترتیب انجام شده ریانها از محیط کشت قبلی به محیط کشت جدید به این ترتیب منتقل میشد. در این زمان محیط کشت باقیمانده آماده رد به مرحله سنجش میباشد. 3- این آزمایشها میتاند برای بررسی 81

87 محیط کشت چه در درههای کتاه مدت )چند ساعته( کشت چه در درههای بلند مدت کشت )4 تا 2 رز( م ارزیابی سنجش قرار بگی. در رز انتقال ریانها باید تمام ریانها را م ارزیابی ریخت شناسی قرار دهیم. چنانچه ریانهای زیادی در یک گره مشابه از نظر معیارهای ظاهری قرار گرفتند میتان با مراجعه به دادههای حاصل از محیطهای کشت باقیمانده مقدار ماد مغذی باشت شده مراجعه نمد ریانها را بر این اساس از هم تفکیک ک. در این مرحله ارزیابی ریخت شناسی ریانها به محیط کشت جدید که جدا از محی طکشت م سنجش است ا میشند. درخالل جا به جا نمدن ریانها دقت کافی باید مبذل شد تا مقدار محیط کشتی که از قطره کشت به اسطه جا به جایی سر سمپلرها یا در دهانه پیپت باقی میماند از محیط خارج میشد به حداقل مین ممکن کاهش یابد. زمانی که محیط کشت باقیمانده آنالیز شد مقدار باشت ماد مغذی مشخص شد مقدار کمینه باشت باید بر اساس 2 41 درصد از باشت حقیقی محاسبه شد )این محدده به عنان محددیت سنجش در نظر گرفته میشد(. ریانهایی که مقدار باشتهای مسای دارند باید در یک سطح طبقه بندی شند.. Leese HJ ( ) The formation and function of oviduct fl uid. J Reprod Fertil ( ):. Leese HJ ( ) Metabolic control during preimplantation mammalian development. Hum Reprod Update ( ):. Brinster RL ( ) Protein content of the mouse embryo during the first five days of development. J Reprod Fertil ( ):. Leese HJ ( ) Metabolism of the preimp lantation mammalian embryo. Oxf Rev Reprod Biol :. Gardner DK et al ( ) Environment of the preimplantation human embryo in vivo: metabolite analysis of oviduct and uterine fluids and metabolis m of cumulus cells. Fertil Steril ( ):. Fischer B, Bavister BD ( ) Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys, hamsters and rabbits. J Reprod Fertil ( ):. Casslen BG ( ) Free amino acids in human uterine fluid. Possible role of high taurine concentration. J Reprod Med ( ):. Miller JG, Schultz GA ( ) Amino acid content of preimplantation rabbit embryos and fluids of the reproductive tract. Biol Reprod ( ):. Maas DH, Storey BT, Mastroianni L Jr ( ) Hydrogen ion and carbon dioxide content of the oviductal fluid of the rhesus monkey (Macaca mulatta). Fertil Steril ( ):. Lane M, Gardner DK ( ) Selection of viable mouse blastocysts prior to transfer using a metabolic criterion. Hum Reprod ( ):. Lane M, Gardner DK ( ) Understanding cellular disruptions during early embryo development that perturb viability and fetal development. Reprod Fertil Dev ( ):. Biggers JD, Stern S ( ) Metabolism of the preimplantation mammalian embryo. Adv Reprod Physiol :. Brinster RL ( ) Studies on the development of mouse embryos in vitro. IV. Interaction of energy sources. J Reprod Fertil ( ):. Wales RG, Whittingham ( ) The metabolism of specifically labelled lactate and pyruvate by twocell mouse embryos. J Reprod Fertil ( ):. Conaghan J et al ( ) Selection criteria for human embryo transfer: a comparison of pyruvate uptake and morphology. J Assist Reprod Genet ( ):. Hardy K et al ( ) Non-invasive measurement of glucose and pyruvate uptake by individual human oocytes and preimplantation embryos. Hum Reprod ( ):. Gott AL et al ( ) Non-invasive measurement of pyruvate and glucose uptake and lactate production by single human preimplantation embryos. Hum Reprod ( ):. Gardner DK et al ( ) Noninvasive assessment of human embryo nutrient consumption as a measure of developmental potential. Fertil Steril ( ):. Biggers JD, Whittingham DG, Donahue RP ( ) The pattern of energy metabolism in the mouse oocyte and zygote. Proc Natl Acad Sci USA ( ):. Whitten WK ( ) Culture of tubal ova. Nature ( ):. Brinster RL ( ) Studies on the development of mouse embryos in vitro. II. The effect of energy source. J Exp Zool :. Whitten WK ( ) Culture of tubal mouse ova. Nature ( ): منابع 84

88 . Brinster RL, Thomson JL ( ) Development of eight-cell mouse embryos in vitro. Exp Cell Res ( ):. Daniel JC Jr, Krishnan RS ( ) Amino acid requirements for growth of the rabbit blastocyst in vitro. J Cell Physiol ( ):. Martin KL, Leese HJ ( ) Role of glucose in mouse preimplantation embryo development. Mol Reprod Dev ( ):. Pantaleon M, Scott J, Kaye PL ( ) Nutrient sensing by the early mouse embryo: hexosamine biosynthesis and glucose signaling during preimplantation development. Biol Reprod ( ):. Lane M, Gardner DK ( ) Amino acids and vitamins prevent culture-induced metabolic perturbations and associated loss of viability of mouse blastocysts. Hum Reprod ( ):. Renard JP, Philippon A, Menezo Y ( ) In-vitro uptake of glucose by bovine blastocysts. J Reprod Fertil ( ):. Gardner DK, Leese HJ ( ) Assessment of embryo viability prior to transfer by the noninvasive measurement of glucose uptake. J Exp Zool ( ):. Van den Bergh M et al ( ) Glycolytic activity: a possible tool for human blastocyst selection. Reprod Biomed Online (Suppl ):. Menezo Y, Laviolette P ( ) Amino constituents of tubal secretions in the rabbit. Zymogram proteins free amino acids. Ann Biol Anim Biochim Biophys ( ):. Gardner DK, Leese HJ ( ) Concentrations of nutrients in mouse oviduct fluid and their effects on embryo development and metabolism in vitro. J Reprod Fertil ( ):. Epstein CJ, Smith SA ( ) Amino acid uptake and protein synthesis in preimplantation mouse embryos. Dev Biol ( ):. Lane M, Gardner DK ( ) Differential regulation of mouse embryo development and viability by amino acids. J Reprod Fertil ( ):. Van Winkle LJ, Haghighat N, Campione AL ( ) Glycine protects preimplantation mouse conceptuses from a detrimental effect on development of the inorganic ions in oviductal fl uid. J Exp Zool ( ):. Dumoulin JC et al ( ) Taurine acts as an osmolyte in human and mouse oocytes and embryos. Biol Reprod ( ):. Nasr-Esfahani MH, W inston NJ, Johnson MH ( ) Effects of glucose, glutamine, ethylenediaminetetraacetic acid and oxygen tension on the concentration of reactive oxygen species and on development of the mouse preimplantation embryo in vitro. J Reprod Fertil ( ):. Edwards LJ, Williams DA, Gardner DK ( ) Intracellular ph of the mouse preimplantation embryo: amino acids act as buffers of intracellular ph. Hum Reprod ( ):. Dawson KM, Collins JL, Baltz JM ( ) Osmolarity-dependent glycine accumulation indicates a role for glycine as an organic osmolyte in early preimplantation mouse embryos. Biol Reprod ( ):. Wu F, Cholewa B, Mattson DL ( ) Characterization of l -arginine transporters in rat renal inner medullary collecting duct. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol ( ):R R. Dumoulin JC et al ( ) Temporal effects of taurine on mouse preimplantation development in vitro. Hum Reprod ( ):. Gardner DK, Lane M ( ) Amino acids and ammonium regulate mouse embryo develop ment in culture. Biol Reprod ( ):. Gardner DK, Lane M ( ) Alleviation of the -cell block and development to the blastocyst of CF mouse embryos: role of amino acids, EDTA and physical parameters. Hum Reprod ( ):. Kane MT, Carney EW, Bavister BD ( ) Vitamins and amino acids stimulate hamster blastocysts to hatch in vitro. J Exp Zool ( ):. Bavister BD, Arlotto T ( ) Influence of single amino acids on the development of hamster onecell embryos in vitro. Mol Reprod Dev ( ):. Carney EW, Bavister BD ( ) Stimulatory and inhibitory effects of amino acids on the development of hamster eight-cell embryos in vitro. J In Vitro Fertil Embryo Transfer ( ):. Gardner DK et al ( ) Enhanced rates of cleavage and development for sheep zygotes cultured to the blastocyst stage in vitro in the absence of serum and somatic cells : amino acids, vitamins, and culturing embryos in groups stimulate development. Biol Reprod ( ):. Takahashi Y, First NL ( ) In vitro development of bovine one-cell embryos: influence of glucose, lactate, pyruvate, amino acids and vitamins. Theriogenology ( ):. Steeves TE, Gardner DK ( ) Temporal and differential effects of amino acids on bovine embryo development in culture. Biol Reprod ( ): 82

89 . Devreker F, W inston RM, Hardy K ( ) Glutamine improves human preimplantation development in vitro. Fertil Steril ( ):. Devreker F et al ( ) Effects of taurine on human embryo development in vitro. Hum Reprod ( ):. Eagle H ( ) Amino acid metabolis m in mammalian cell cultures. Science ( ):. Houghton FD, Leese HJ ( ) Metabolism and developmental competence of the preimplantation embryo. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol (Suppl):S S. Brison DR et al ( ) Identi fi cation of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover. Hum Reprod ( ):. Sturmey RG et al ( ) Role of fatty acids in energy provision during oocyte maturation and early embryo development. Reprod Domest Anim (Suppl ):. Haggarty P et al ( ) Fatty acid metabolis m in human preimplantation embryos. Hum Reprod ( ):. Abe H et al ( ) Accumulation of cytoplasmic lipid droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different culture systems using serum-free or serumcontaining media. Mol Reprod Dev ( ):. Reis A et al ( ) Consequences of exposure to serum, with or without vitamin E supplementation, in terms of the fatty acid content and viability of bovine blastocysts produced in vitro. Reprod Fertil Dev ( ):. Ferguson EM, Leese HJ ( ) Triglyceride content of bovine oocytes and early embryos. J Reprod Fertil ( ):. Kim JY et al ( ) Lipid and fatty acid analysis of fresh and frozen-thawed immature and in vitro matured bovine oocytes. Reproduction ( ):. Sturmey RG, Leese HJ ( ) Energy metabolism in pig oocytes and early embryos. Reproduction ( ):. Matorras R et al ( ) Fatty acid composition of fertilization-failed human oocytes. Hum Reprod ( ):. Chen RF ( ) Removal of fatty acids from serum albumin by charcoal treatment. J Biol Chem ( ): 89

90 فصل 0 اج محیط کشت: اسیدهای آمینه همستازی سلل اسیدهای آمینه برای تکین تکامل ریان پیش از النهگزینی مفید میباشند. در نتیجه به عنان یکی از اج مهم محیط کشت شناخته میشند. در این فصل به مرر نقادانه اهمیت اسیدهای آمینه برای ریان پیش از النه گزینی تاثیر این تحقیق بر تسعه محیطهای کشت چند مرحلهای استفاده شده در احدهای تحقیقاتی آزمایشگاهی میپازیم. همچنین میای کشت ریان در محیط کشتی که از مجمعه کامل اسیدهای آمینه البته در غلظتی مشابه غلظت فیزیلژی آن تشکیل شده است م 410 تجه قرار خاهد گرفت. بعاله رشهای اندازه گیری غیرتهاجمی مصرف اسیدهای آمینه به سیله ریان رشی که به سیله آن بتانیم پیش از انتقال ریان تانایی آن برای زندهمانی تلد را بررسی نماییم م بحث قرار خاهد گرفت. بنابراین در فصل پیشر نقش بنیادی اسیدهای آمینه برای تنظیمات متابلیک همستاتیک در ریان پیش از النه گزینی را م بحث بررسی قرار میگی مقدمه اسیدهای آمینه از اجی بسیار مهم محیط کشت ریان انسان بهشمار میآیند. اسیدهای آمینه سنگبنای پرتئینها را تشکیل میدهند همچنین ممکن است به عنان منابع بالقه انرژی نیز م استفاده قرار بگیرند عملکهای بیشمار دیگری از جمله کیالت نمدن فلت سنگین ایفای نقش به عنان اسملیت تنظیم ph را میتان به اسیدهای آمینه نسبت داد. بنابراین با تجه به نقشهای ذاتی تعریف شده برای اسیدهای آمینه تعجب آر نخاهد بد که اسیدهای آمینه برای تکین ریانها در مرحله پیش از النه گزینی مفید اقع شند. بنابراین بدیهی میباشد که به طر معمل به محیط کشت افزده شند. در این فصل به مرر نقادانه نقش اسیدهای آمینه با تجه به نتایج مجد درمتن علمی که به بررسی نقش اسیدهای آمینه در تکین ریان پاختهاند خاهیم پاخت. به دلیل محددیتها در اجرای مطالعات سیع به منظر آزمدن غلظتهای مختلف ترکیبات متفات اسیدهای آمینه استفاده شده در محیطهای کشت در ریان انسان بیشتر دانش ما با استفاده از مدلهای حیانی به دست آمده است. بنابراین اگرچه شاید ایدهآل نباشد بیشتر ماد مغذی افزده شده در محیط کشت ریان انسان در غلظتهایی که حاصل مطالعات ری مدلهای حیانی بده است به محیط کشت افزده شده اند. به هر ری در مقعیتهایی که امکانپذیر باشد دادههایی مربط به ریان انسان بیشتر م تجه قرار خاهد گرفت با دادههای مشابه بدست آمده از حیانات مقایسه خاهند شد طبقه بندی اسیدهای آمینه اسیدهای آمینه بسته به اینکه ضرری یا غیر ضرری باشند به د گره تقسیم میشند )جدل 4-0(. اسیدهای آمینه 419 ضرری قابلیت ساخته شدن از ابتدا را ندارند میبایست از منشا ماد مجد در برنامه غذایی تامین شند در مقابل نیازی به حضر اسیدهای آمینه غیرضرری در برنامه غذایی نیست زیرا این دسته از اسیدهای آمینه تانایی ساخته شدن در بدن مجدات زنده را دارند. علی رغم استفاده گسته از این طبقه بندی اسیدهای آمینه این طبقه بندی کالسیک میبایست با دقت م استفاده قرار بگی زیرا در انسانها برخی اسیدهای آمینه غیرضرری در برخی شرایط خاص پارهای از بیماریها به نعی تبدیل به اسیدهای آمینه ضرری میشند. به این دسته از اسیدهای آمینه اسیدهای آمینه ضرری شرطی گفته میشد می- بایست از منبع ماد غذایی ا بدن انسان شند )2 4(. turnover de novo 81

91 2-0. اسیدهای آمینه: ترکیب اسیدهای آمینه تاثیر ری تکین ریان یکی از الین گرشاتی که اهمیت اسیدهای آمینه برای تکین ریان را بررسی نمده است نشان داد که منبع ثابتی از نیترژن از منشا BSA یا اسیدهای آمینه برای تکین ریان 2 سللی مش تا رسیدن به مرحله بالستسیت الزم ضرری است )3(. در مطالعات بعدی مشخص شد که 41 اسید آمینه شامل )آرژنین هیستیدین لسین لیزین متینین فنیل آالنین سرین ترئنین تریپتفان الین( برای تکین ریان خرگش تا رسیدن به مرحله بالستسیست ضرری میباشند )1(. در طل دهه 4881 میالدی مجمعهای بسیار ارزشمند از مقاالت منتشر شد که تایید مینمد اسیدهای آمینه برای تکین ریان انسان بایستی به محیطهای کشت افزده شند. مطالعات الیه به تحقیق بررسی تاثیر افزدن اسیدهای آمینه ضرری غیر ضرری یا ترکیب کاملی از اسیدهای آمینه به محیط کشت ریان مش پاخته بدند. تاحددی جالب غیر منتظره به نظر میرسید که مشخص شد تکین ریان از منظر تشکیل بالستسیست تعداد سللهای آن نرخ هچ شدن بالستسیست در حضر اسیدهای آمینه غیرضرری در مقایسه با ترکیب کامل 21 اسید آمینه شناخته شده نرخ باالتری از خد نشان میدهد )3(. به عاله ریان- های مش که برای مدت 19 ساعت )از مرحله 2 تا 9 سللی( پیش از انتقال به رحم پذیرنده در محیط حای اسیدهای آمینه غیرر ضرری قرار داده شده بدند نرخ باالتری از النه گزینی تکین ریان را از خد نشان میدهند. اما زمانی که ریانها تا مرحله بالستسیست کشت داده میشند در مدت زمان 82 ساعت قبل از انتقال به رحم پذیرنده در معرض تمام 21 اسیدآمینه قرار داده میشند باالترین نرخ النه گزینی به دست میآید. این یافتهها پیشنهاد میکنند که ریانها متناسب با پیشرفت مرحله تکین نیازهای متفاتی برای اسیدهای آمینه را از خد نشان میدهند )2(. ممکن است که به نظر برسد ریان در مرحله کلیاژ از حضر اسیدهای آمینه غیر ضرری سد میبرند در مقابل تمام اسیدهای آمینه برای تشکیل بالستسیت م نیاز میباشند. اما این دادهها میبایست به دقت م مالحظه قرار بگی زیرا: الف( سیاست جداسازی اسیدهای آمینه به د گره ضرری یا غیر ضرری بسیار آکادمیک بده زیرا در شرایط درن تنی ریان ممکن است در معرض مجمعه کاملی از اسیدهای آمینه که از دستگاه تلید مثل تراش میشند قرار بگی. ب( غلظت اسیدهای آمینه استفاده شده در مطالعات ذکر شده در قسمت باال همگی در محدده غلظتهای یافت شده در محیط (MEM) Eagel s essential medium بده است. در نتیجه در محدده غلظتهای فیزیلژی نمیباشند. بررسی مجدد این مطالعات با استفاده از دادههای جدیدتری که غلظتهای اسیدهای آمینه یافت شده در ایداکت رحم مش را مشخص نمده است جالب خاهد بد )0(. این مطالعات جدید درصرت انجام شدن امکان تفسیر نتایج با تجه به غلظتهای فیزیلژی از مخلط کاملی از اسیدهای آمینه را فراهم خاهد نمد. علیرغم گرشات متعددی که تکین ارتقا یافته ریان با افزدن اسیدهای آمینه در محیط کشت را تضیح میدهند هنز نگرانیهای اساسی با تجه به تجمع سمی آمنیم جد دا. آمنیم در حقیقت یکی از محصالتی است که به صرت خد به خدی در اثر شکسته شدن اسیدهای آمینه تلید میشد. این محصل را میتان در محیط کشتی که فاقد ریان میباشد نیز بعد از انکبه نمدن محیط کشت حای اسید آمینه در دمای 30 درجه سانتیگراد اندازه گیری نمد )3(. نکته جالب در م تلید آمنیم این است که در صرت کشت ریان مش تا مرحله بالستسیست در حضر اسیدهای آمینه غیرضرری یا در حضر ترکیبی کامل از تمامی اسیدهای آمینه سطح تلید آمنیم کامال مشابه میباشد )3( بعد از انتقال هر د گره به رحم پذیرنده ریانهای 418 Exencephaly تلید میشند )2(. اما در شرایطی که محیط کشت استفاده شده برای کشت ریان بعد از گذشت 19 ساعت تازه شد شاهد افیش معنی داری در تعداد مکانهای النه گزینی ریان حجم ریان میباشیم تکین ریانهای Exencephaly کامال از بین خاهد رفت )2(. این مطالب نشان دهنده اهمیت معنی دار تجمع آمنیم در اثر افزدن اسیدهای آمینه در محیط کشت ریان میباشند. به هر ری این دادهها میبایست با دقت تفسیر شند زیرا آثار مخرب مشاهده شده در کشت ادامه یابنده ریان ممکن است به سادگی منعکس کننده غلظت باالی اسیدهای آمینه استفاده شده در این مطالعات باشد ریانهایی که مغزشان خارج از جمجمه تشکیل میشد 85

92 که منتج به افیش سطح شکست اسیدهای آمینه به طر خد به خدی تجمع آمنیاک شده است. در سال 4880 مطالعهای برجسته به مقایسه تاثیر کشت ریان مش در مراحل قبل از النه گزینی با استفاده از ترکیبهای متفات اسیدهای آمینه پاخته بد. این مطالعه نشان داد که افزدن اسیدهای آمینه غیر ضرری به محیط کشت ریان تا مرحله 9 سللی در پی آن افزدن تمامی 21 اسیدآمینه شناخته شده به محیط کشت برای کشت آتی ریان تا مرحله بالستسیت منجر به باالترین نرخ تکین ریان در شرایط برنتنی خاهد شد. همچنین مهمتر اینکه زنده مانی ریان بعد از انتقال به رحم پذیرنده را نیز افیش داده است )9(. این مجمعه از مطالعات اهمیت فق العاده زیاد استفاده از اسیدهای آمینه با د ترکیب مختلف در مراحل مختلف کشت ریان را نشان میدهد به عنان زمینه پیدایش سیستم کشت 2 مرحلهای یا سیستم محیط کشت پیدرپی که هم اکنن در بسیاری از آزمایشگاههای تلید برنتنی ریان انسان در کشت ریان استفاده میشد به حساب میآید. اینکه استفاده از محیط کشت تک مرحلهای تانایی حمایت از تکین ریان تا مرحله یالستسیست را دا یا محیطهای کشت 2 مرحلهای می- بایست استفاده شند همچنان م بحث میباشد. این مسئله زمانی که دادههای حاصل از کشت ریان مش در میحط کشت تک مرحلهای فرمله شده با استفاده از رش (KSOM) )8( Potassium simplex optimization medium در حضر اسیدهای آمینه ضرری غیر ضرری کشت داده شدند نتایج آن نشان داد که نرخ تشکیل بالستسیست هچ شدن تعداد سللها در مقایسه با کشت در غیاب اسیدهای آمینه ارتقا یافته بد گیج کنندهتر نیز خاهد شد )41(. به هر ری آنچه که شاید جالبتر باشد این است که در سطح ملکلی بالستسیستهایی که در حضر تمام 21 اسیدآمینه کشت داده میشند 9 ژن از 8 ژنی که در مرحله مشابه در ریان تلید شده در شرایط درنتنی بیان میشند را بیان میکند )41(. این یافتهها به نعی باعث اطمینان بیشتر پیشنهاد دهنده این مضع میباشد که افزدن ترکیب کامل از تمام اسیدهای آمینه شناخته شده منجر به حصل کمیت مشابه در نرخ تکین ریان در شرایط برنتنی در مقایسه با شرایط درنتنی خاهد شد. تناقض در م اینکه کدام دسته از اسیدهای آمینه در چه مرحلهای از کشت ریان باید به محیط کشت ریان افزده شند مضعی بسیار پیچیده است. به نظر میرسد که این مطلب ابسته به نع محیط کشت استفاده شده در کشت ریان حضر غلظت اسیدهای آمینه به همراه سایر منابع انرژی تانایی ریان در تطبیق پیدا کن با شرایط محیطی جدید مکانیسمهای جبرانی ذاتی ریان میباشد. زمانی که غلظت اسیدهای آمینه مجد در مایع فلیکلی انسان مشخص شد نشان داده شد که تقریبا غلظت اسیدهای آمینه این مایع نصف غلظت اسیدهای آمینه محیط MEM Eagel s است تئری مطرح شده در قسمت باال قت گرفت )44(. زمانی که ریانهای مش در مایع تعدیل شده لله ایداکت انسان ) 431 (HTF محتای اسیدهای آمینه با غلظتهای یافت شده در مایع فلیکلی کشت داده شد نرخ تشکیل بالستسیست در مقایسه با ریانهای کشت داده شده در HTF به تنهایی افیش یافت. در مقابل تکین ریان زمانی که ریانها در محیط کشت HTF حای اسیدهای آمینه در غلظتهای یافت شده در -F Ham s 41 یا MEM کشت داده شدند متقف شد. جالب تجه مقدار کمتر آمنیم تلید شده در زمانی است که ریانها در محیط HTF حای اسیدهای آمینه در سطح یافت شده در مایع فلیکلی کشت داده میشند در مقایسه با محیط کشت حای مقادیر اسیدهای آمینه مجد در MEM یا 41-F Ham s میباشد )44(. این نکته اهمیت در نظر داشتن غلظت اسیدهای آمینه برای دست یافتن به نرخ تکین بهینه ریان را برجسته میکند; غلظتهای بسیار باال یا بسیار پایین از اسیدهای آمینه از تکین ریان ممانعت به عمل میآرند. درحال حاضر KSOM KSOM مکملسازی شده با اسیدهای آمینه با غلظتی معادل نصف غلظت یافت شده در Eagle s MEM که به نام )43 KSOM aa 42( به عنان محیطهای کشتی در نظر گرفته میشند که بیشترین استفاده را در کشت ریان مش در مراحل پیش از النه گزینیدارا میباشند. از نظر تکین به مرحله بالستسیست پشیده شده در زناپلسیدا تفات کچکی بین این د محیط کشت جد دا. به هر ری کشت در محیط KSOM aa به طر معنی داری منجر به ارتقا نرخ هچ شدن بالستسیست افیش تعداد سللهای ترفکتدرم ICM بدن تاثیر پذیری نرخ آپپتزیس مرگ سللی human tubal fluid 86

93 میشد )43 42(. به عاله الگی کلی بیان ژن ریانهای کشت شده تا مرحله بالستسیست در KSOM aa مشابه با نرخ تکین درنتنی ریانها میباشد )41( نیازهای ریان پیش از النه گزینی به اسیدهای آمینه در مقایسه با مش دیگر مدلهای حیانی به نسبت دانش کمی پیرامن احتیاجات اسیدهای آمینه ریانهای انسان جد دا. مطالعات ابتدایی تاثیر افزدن اسیدهای آمینه به صرت انفرادی را م بررسی قرار دادهاند. از جمله این اسیدهای آمینه میتان به گلتامین یا تائرین به محیط کشت استفاده شده در کشت ریانهای پیش از النهگزینی انسان اشاره نمد. هر د این اسیدهای آمینه به صرت انفرادی منجر به افیش نرخ تشکیل بالستسیت شدهاند اما افزدن این د اسیدآمینه به طر همزمان منجر به برز افیش آثار مثبت این د اسیدآمینه به صرت تجمعی نشده است )42 43(. به هر ری نکته مهم در این آزمایشها غیبت گلکز بده است که باید در نظر گرفته شد چن به نظر میرسد که به همراه پیرات گلتامین به عنان یک منبع غالب انرژی به حساب میآید. زمانی که ریانهای انسان در محیط کشت پیدرپی حای اسیدهای آمینه غیر ضرری برای ریان در مرحله کلیاژ کشت داده میشند در پی آن ریانها ا محیط کشت حای تمامی اسیدهای آمینه شناخته شده )21 اسیدآمینه شناخته شده( میشند تا مرحله بالستسیت در این محیط کشت داده میشند تعداد سللهای بالستسیست به طر معنی داری در مقایسه با کشت ریان در حضر تنها یک اسیدآمینه که گلتامین بد افیش یافته است )40(. این نکته پیشنهاد کننده این مطلب است که همانند ریان مش تکین بالستسیت انسان با اسیدهای آمینه ارتقا مییابد. در سال 4880 غلظت اسیدهای آمینه مجد در لله فلپ اندازه گیری گرش شد )49(. این مطالعه برای الین بار امکان کشت ریانهای انسان در مخلط فیزیلژی اسیدهای آمینه را فراهم نمد. مشخص شده است که نیازهای ریان به اسیدهای آمینه همزمان با پیشرفت تکین ریان افیش مییابد. لسین تنها اسیدآمینهای است که از رز 2 تا رز 3 تکین ریان منابع آن تخلیه میشد درحالی که لسین سرین آرژنین برای تمام مدت پیشرفت تکین از مرحله 9 سللی تا مرحله مرال الزم میباشند. همچنین لسین سرین آرژنین متینین الین برای رشد تکین ریان بین مرحله مرال تا بالستسیت الزم میباشد )48(. این نیازهای متنع به اسیدهای آمینه در مراحل مختلف تکین ریان به طر یژهای جالب میباشد همانطر که در باال م بحث بررسی قرار گرفت بیشتر محیطهای کشت پیدرپی استفاده شده برای کشت ریان انسان تا رز 3 قبل از افزدن هر د دسته اسیدهای آمینه ضرری غیر ضرری تا مرحله بالستسیست فقط شامل اسیدهای آمینه غیر ضرری میباشند )21(. به هر ری چناچه ترکیب کاملی از اسیدهای آمینه در دسترس ریان در محیط کشت افزده شد فقط اسیدآمینه لسین یکی از اسیدهای آمینه ضرری تسط ریان باشت مصرف میشد این مسئله باعث پیشنهاد شدن این نکته شد که این محیطهای کشت فراهم کننده ماد مغذی م ترجیح نیاز ریان نیست. مصرف اسیدهای آمینه تسط ریان انسان نه تنها برای رند تکین ریان مفید می باشد بلکه به عنان الین رش غیر تهاجمی تعیین تانایی تکین ریان انسان نیز شناخته شده نقش ایفا مینماید )48(. تخلیه کل اسید آمینه برای ریانهایی که به مرحله بالستسیست تکین مییابند به طر معنیداری کمتر از ریانهایی میباشد که در مرحله قبل از تشکیل بالستسیست متقف میشند. به یژه ریانهایی که از رز 2 به رز 3 تکین می یابند تفات معنی داری در مصرف آسپاراژین گلتامین آرژنین آالنین در مقایسه با ریانهایی که در مراحل پیش از تشکیل بالستسیست متقف میشند را نشان میدهند )48(. این تفات علیرغم این نکته است که بین این د گره از ریانها هیچ نع تفات معنی داری از نظر ظاهری جد ندا. شاهد متضادی مبنی بر اینکه ریانهایی که از نظر تانایی تکین تکامل در ضعیت مناسبی قرار دارند نیازهای کمتری به اسیدهای آمینه در مقایسه با ریانهایی که در مراحل ابتدایی متقف میشند دارند جد دا این نکته منجر به ایجاد فرضیه ریان ساکت شد )24 48(. همچنین نتایج مشابهی از کشت ریانهای منجمد یخگشایی شده در محیط کشت حای مخلط اسیدهای آمینه با غلظتهایی نزدیک به غلظتهای طبیعی بدست آمده است )22(. علیرغم عدم تفات در ریختشناسی ریانها امکان پذیر بد که بین ریانهایی که تانایی تکین به مراحل باالتر را دارا میباشند با ریانهایی که در مراحل ابتدایی تکین متقف میشند تمایز قایل شد. یافته قابل ذکر دیگر از این مطالعات 87

94 تانایی استفاده از رش تعیین پرفایل اسیدهای آمینه برای تشخیص تفات بین ریانهایی که از نظر قدرت تکین زنده مانی در ضعیت مناسبی قرار دارند با ریانهای غیر زنده میباشد که منجر به تعیین ریانها با بهترین کیفیت ریانهای درجه 4 میشد )22(. به منظر تعیین اینکه آیا معیارهای متابلیک ظاهری با تمایز ترفکتدرم در ریانهای انسان مرتبط میباشند Eckert همکاران )22( تهیه پرفایل اسیدهای آمینه از هر ریان به همراه ارزیابی ساخته شدن اتصال پرتئینها با استفاده از 434 رشهای ایمنسیتشیمی استفاده از میکرسکپ confocal را اجرا نمدند. ارتباطی بین چرخه مصرف اسیدهای آمینه ساخته شدن پرتئینهای ل اتصای در ترفکتدرم مشاهده شد. تاثیری که مستقل از یژگیهای ظاهری ریان بد )23(. این مطالعه جالب الین مطالعه برای تعیین تانایی بدل شدن اسیدهای آمینه به منظر پیش بینی یکپارچگی ترفکتدرم بد. یافته قابل تجه دیگری که از تعیین پرفایل اسیدهای آمینه به دست آمد تانایی مصرف آسپاراژین گلیسین لسین ارتباط آن با نرخ تلد زنده بعد از انتقال ریانهای حاصل از ICSI میباشد )21(. بعاله مشخص شد که این همپشانی مستقل از دیگر پیش بینی کنندههای بازده آبستنی از جمله نمره کیفی ریان تعداد سللها سن ماده سطح پایه FSH که این سطح مقیاسی برای تعیین ذخیره تخمدانی میباشد عمل میکند. این یافته کارب برجستهای در انتخاب بهترین ریان برای انتقال به رحم پذیرنده در رندهای تلید مثل آزمایشگاهی دا اهمیت اسیدهای آمینه در تکین ریان را مشخص مینماید. بنابراین بخش بندی نیازهای اسید آمینه برای استفاده در محیط کشت پیدرپی به دقت م تجه قرار بگی زیرا استفاده از این محیط- های کشت در مقابل استفاده از محیط کشت تک مرحلهای قرار گرفته در نتیجه این دقت اعمال شده منجر به تامین نیازهای ریان به اسیدهای آمینه خاهد شد: 4( پیش زمینه ابتدایی محیطهای کشت پیدرپی بر پایه مطالعات انجام شده در مش میباشد. 2( ریانها هرگز در معرض زیرمجمعهای از اسیدهای آمینه قرار نمیگیرند چه از گره اسیدهای آمینه ضرری باشند یا غیر ضرری در حقیقت ریانها یک ترکیب کامل از اسیدهای آمینه با غلظت فیزیلژی را تجربه میکنند. 3( دادههای حاصل از کشت ریان با استفاده از مخلط فیزیلژک اسیدهای آمینه نشان داد که لسین تسط ریانهای انسان که از نظر تانایی تکین در ضعیت مناسبی قرار گرفتهاند مصرف میشد به عنان یکی از 3 اسیدآمینهای که با نرخ تلد زنده بعد از انتقال ریان همپشانی دارند شناخته میشد. به هر ری حضر اسیدهای آمینه غیرضرری به تنهایی در زمان کشت ریان در مراحل الیه تکین در محیطهای کشت پیدرپی پیشنهاد کننده تامین محیط مغذی در سطح کمتر از بهینه میباشد. 1( خطر از دست دادن ریان مرتبط با جابه-.3-0 جایی ریانها با استفاده از محیط کشت تک مرحلهای خنثی میشد. نهایتا تحقیقات بیشتری برای تعیین نمدن اینکه محیط کشت تک مرحلهای برای کشت ریان انسان م ترجیح است یا محیط کشت پیدرپی م نیاز میباشد. همچنین الزم است که کمپانی ها ترکیبات کامل هر محیط کشت را مشخص نمایند در اختیار مصرف کننده قرار بدهند. نقش اسیدهای آمینه در تکین ریان اسیدهای آمینه نقشهای متعددی در ریان پیش ازمرحله النهگزینی ایفا مینمایند. علیرغم اینکه محتای پرتئینی ریانها در مرحله پیش از النه گزینی با پیشرفت مراحل تکین افیش نمییابد )23(. سنتز پرتئین به عنان یکی از مهمترین مصارف اسیدهای آمینه به حساب میآید که دلیل این امر سخت ساز ادامه دار پرتئین میباشد. یکی دیگر از نقشهای بالقه که برای اسیدهای آمینه تعریف شده است ایفای نقش به عنان منبع انرژی برای ریان درحال تکین در مراحل پیش از النه گزینی میباشد. به عنان نمنه گلیسین باشت شده تسط ریان ممکن است که در تشکیل ماکرملکلها دخیل باشد یا به سرین آالنین برای متابلیسم انرژی تبدیل شد )22(. همچنین اسیدهای آمینه عملکهای متفات دیگری نیز دارند. نشان داده شده است که گلیسین به عنان یکی از اسملیتهای داخل سللی در ریانهای مش انسان در مراحل الیه کلیاژ عمل میکند )28( بنابراین ممکن است از ریان در برابر سطح باالی ینهای معدنی مجد در دستگاه تناسلی جلگیری به عمل آ )31(. زمانی که تائرین را به عنان تنها اسید آمینه مجد در محیط کشت ریان در نظر گرفته شد نشان داده شده است immunocytochemistry 88

95 که تکین ریان مش در مرحله 2 سللی به سمت بالستسیست را ارتقا میدهد )32 34(. به عاله تائرین پرلین هر د در به تعادل رساندن تنظیم فشار اسمزی دخیل میباشند. بنابراین در تنظیم حجم ریان مثر اقع میشند )31 33( درحالی که گلتامین میتاند منجر به ایجاد حفاظت دربرابر غلظتهای باالی NaCl مجد در محیط کشت ریان مش شد )33(. اسیدهای آمینه به یژه اسیدهای آمینه غیر ضرری تانایی ایفای نقش به عنان بافر داخل سللی تنظیم ph حداقل تا مرحله سللی را دارا میباشند )32(. یک نقش مهمتر دیگر برای اسیدهای آمینه در سیستم پیام رسانی سلل میباشد. به عنان مثال آرژنین به عنان پیش ساز نیتریک اکسید عمل که که یکی از مهمترین ملکلهای دخیل در سیستم پیام رسانی به عنان عض غیر قابل حذف در سیستم پیام رسانی سلل در ریانهای پیش از النه گزینی میباشد )30(. دیگر اسیدهای آمینه با منشا برنتنی به یژه لسین نیز تنظیم کننده فعالیت ترفکتدرم تانایی آن در گسته شدن از طریق مسیر ابسته به (mtor) Rapamycin میباشد بنابراین ممکن است به عنان کنترل کننده النهگزینی به حساب آید )38 39(. بنابراین اسیدهای آمینه در فرایندهای متنع فیزیلژی که باعث حصل اطمینان از حفظ همستازی سلل میشد دخیل میباشند نکات برجسته جمع بندی کننده این فصل بر اهمیت اسیدهای آمینه در تکین ریان متمرکز شده بد. به هر ری مهم است که به خاطر داشته باشیم که بیش از اینکه هر جز را به تنهایی م بررسی قرار دهیم در نظر داشته باشیم که یک محیط کشت کامل ارایه دهنده یک ریز محیط پیچیده میباشد که حضر غلظت هر یک از اجی آن ممکن است تغذیه ریان در حال تکامل را تحت تاثیر قرار دهد. همانطر که در باال بحث شده عمده نگرانی در م استفاده از اسیدهای آمینه در محیط کشت تلید آمنیم سمی میباشد. بنابراین به منظر جلگیری از شکست خدبهخدی اسیدهای آمینه محیط کشت باید در دمای 1 درجه سانتیگراد نگهداری شد. بعاله باید دقت شد که مقدار زمانی که محیط کشت در دمای 30 درجه سانتیگراد قبل از افزدن ریانها نگهداری میشد به حداقل ممکن برسد. اگر محیطهای کشت به درستی آماده شند اسیدهای آمینه میای بیشمار متابلیک همستاتیک برای ریان در حال تکین خاهد داشت. Histidine Isoleucine Leucine Lysine Methionine Phenylalanine Threonine Tryptophan Valine جدل طبقه بندی اسیدهای آمینه ضرری غیر ضرری اسیدهای آمینه ضرری شرطی (C) غیر ضرری ضرری Alanine Arginine (C( Asparagine Aspartic acid Cysteine (C) Glutamic acid Glutamine (C) Glycine (C) Proline (C) Serine (C) Tyrosine (C( منابع 4. Reeds PJ (2111) Dispensable and indispensable amino acids for humans. J Nutr 431:4933S 4911S 2. Fűrst P, Stehle P (2111) What are the essential elements for the determination of amino acid requirements in humans? J Nutr 431(Suppl): 4339S 4323S 3. Brinster RL (4823) Studies on the development of mouse embryos in vitro. III. The effect of fi xednitrogen source. J Exp Zool 439: cell signaling 83

96 1. Daniel JC, Krishnan RS (4820) Amino acid requirements for growth of the rabbit blastocyst in vitro. J Cell Physiol 01: Gardner DK, Lane M (4883) Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture. Biol Reprod 19: Lane M, Gardner DK (4881) Increase in postimplantation development of cultured mouse embryos by amino acids and induction of fetal retardation and exencephaly by ammonium ions. J Reprod Fertil 412: Harris SE, Gopichandran N, Picton HM, Leese HJ, Orsi NM (2113) Nutrient concentrations in murine follicular fl uid and the female reproductive tract. Theriogenology 24: Lane M, Gardner DK (4880) Differential regulation of mouse embryo development and viability by amino acids. J Reprod Fertil 418: Lawitts JA, Biggers JD (4883) Culture of preimplantation embryos. Methods Enzymol 223: Ho Y, Wigglesworth K, Eppig JJ, Schultz RM (4883) Preimplantation development of mouse embryos in KSOM: augmentation by amino acids and analysis of gene expression. Mol Reprod Dev 41: Nakazawa T, Ohashi K, Yamada M, Shinoda S, Saji F, Murata Y, Araki H (4880) Effect of different concentrations of amino acids in human serum and follicular fl uid on the development of one-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 444: Biggers JD, McGinnis LK, Raf fi n M (2111) Amino acids and preimplantation development of the mouse in protein-free potassium simplex optimized medium. Biol Reprod 23: Summers MC, McGinnis LK, Lawitts JA, Raf fi n M, Biggers JD (2111) IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Hum Reprod 43: Rinaudo P, Schultz RM (2111) Effects of embryo culture on global pattern of gene expression in preimplantation mouse embryos. Reproduction 429: Devreker F, Winston RM, Hardy K (4889) Glutamine improves human preimplantation development in vitro. Fertil Steril 28: Devreker F, Van den Bergh M, Biramane J, Winston RL, Englert Y, Hardy K (4888) Effects of taurine on human embryo development in vitro. Hum Reprod 41: Devreker F, Hardy K, Van den Bergh M, Vannin AS, Emiliani S, Englert Y (2114) Amino acids promote human blastocyst development in vitro. Hum Reprod 42: Tay JI, Rutherford AJ, Killick SR, Maguiness SD, Partridge RJ, Leese HJ (4880) Human tubal fl uid: production, nutrient composition and response to adrenergic agents. Hum Reprod 42: Houghton FD, Hawkhead JA, Humpherson PG, Hogg JE, Balen AH, Rutherford AJ, Leese HJ (2112) Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo developmental capacity. Hum Reprod 40: Gardner DK, Lane M (4889) Culture of viable human blastocysts in de fined sequential serumfree media. Hum Reprod 43(Suppl 3): Leese HJ (2112) Quiet please, do not disturb: a hypothesis of embryo metabolism and viability. Bioessays 21: Stokes PJ, Hawkhead JA, Fawthrop RK, Picton HM, Sharma V, Leese HJ, Houghton FD (2110) Metabolism of human embryos following cryopreservation: implications for the safety and selection of embryos for transfer in clinical IVF. Hum Reprod 22: Eckert JJ, Houghton FD, Hawkhead JA, Balen AH, Leese HJ, Picton HM, Cameron IT, Fleming TP (2110) Human embryos developing in vitro are susceptible to impaired epithelial junction biogenesis correlating with abnormal metabolic activity. Hum Reprod 22: Brison DR, Houghton FD, Falconer D, Roberts SA, Hawkhead J, Humpherson PG, Lieberman BA, Leese HJ (2111) Identi fi cation of viable human embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover. Hum Reprod 48: Sellens MH, Stein S, Sherman MI (4894) Protein and free amino acid content in preimplantation mouse embryos and in blastocysts under various culture conditions. J Reprod Fertil 24: Fertil 01: Hobbs JH, Kaye PL (4893) Glycine transport in mouse eggs and preimplantation embryos. J Reprod 31

97 20. Dawson KM, Collins JL, Baltz JM (4889) Osmolarity-dependent glycine accumulation indicates a role for glycine as an organic osmolyte in early preimplantation mouse embryos. Biol Reprod 38: Steeves CL, Baltz JM (2113) Regulation of intracellular glycine as an organic osmolyte in early preimplantation mouse embryos. J Cell Physiol 211: Hammer MA, Kolajova M, Léveillé M, Claman P, Baltz JM (2111) Glycine transport by single human and mouse embryos. Hum Reprod 43: Van Winkle LJ, Haghighat N, Campione A L (4881) Glycine protects preimplantation mouse conceptuses from a detrimental effect on development of the inorganic ions in oviductal fl uid. J Exp Zool 233: Dumoulin JC, Evers JL, Bras M, Pieters MH, Geraedts JP (4882) Positive effect of taurine on preimplantation development of mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 81: Dumoulin JC, Evers JL, Bakker JA, Bras M, Pieters MH, Geraedts JP (4882) Temporal effects of taurine on mouse preimplantation development in vitro. Hum Reprod 0: Dumoulin JC, van Wissen LC, Menheere PP, Michiels AH, Geraedts JP, Evers JL (4880) Taurine acts as an osmolyte in human and mouse oocytes and embryos. Biol Reprod 32: Anas MH, Hammer MA, Lever M, Stanton JA, Baltz JM (2110) The organic osmolytes betaine and proline are transported by a shared system in early preimplantation mouse embryos. J Cell Physiol 241: Lawitts JA, Biggers JD (4882) Joint effects of sodium chloride, glutamine and glucose in mouse preimplantation embryo culture media. Mol Reprod Dev 34: Edwards LJ, Williams DA, Gardner DK (4889) Intracellular ph of the mouse preimplantation embryo: amino acids act as buffers of intracellular ph. Hum Reprod 43: Manser RC, Leese HJ, Houghton FD (2111) Effect of inhibiting nitric oxide production on mouse preimplantation embryo development and metabolis m. Biol Reprod 04: Martin PM, Sutherland AE (2114) Exogenous amino acids regulate trophectoderm differentiation in the mouse blastocyst through an mtor-dependent pathway. Dev Biol 211: Martin PM, Sutherland AE, Van Winkle LJ (2113) Amino acid transport regulates blastocyst implantation. Biol Reprod 28:

98 فصل 9 اجی محیط کشت: درشت ملکلها رشد ریان ریک استفاده از پرتئینها در غنیسازی محیطهای کشت در مقایسه با استفاده از درشت ملکلهای غیر پرتئینی 433 محصالت پرتئینی نترکیب از ارجحیت برخار میباشند. شاید بهتان بیان نمد که سرمآلبمینانسانی معملترین مکمل 431 استفاده شده در محیطهای کشت در پی آمادهسازی به رش گلبلین غنی شده میباشد. مکملسازی با سرم همکشتی 433 ریانها متعلق به گذشته میباشند. مکملهای غیر پرتئینی تعریف شده یا پرتئینهای نترکیب به عنان جایگزینهای مناسب قدرتمندی در خالل دسترزی گامتها ریان به حساب میآیند. مکملهای پرتئینی زیستی همچنان به عنان مکملهای اصلح م ترجیح برای زمانهای طالنی کشت ریان به حساب میآیند. فهمیدن هدف منظر استفاده از درشت ملکلها به عنان مکمل در محیط کشت ریان در خالل هر یک از مراحل لقاح برنتنی در آزمایشگاه میبایست به عنان یاری دهنده ما در انتخاب مطمئنترین با ثباتترین درشت ملکل برای هر مرحله از تلید برنتنی ریان بهحساب آید همچنین انتخاب محصلی که تانایی ایجاد بهترین نتایج کلینیکی آزمایشگاهی را دارا میباشد م نظر است. هر یک از بستههای مکمل پرتئینی منحصر به ف میباشند حتی اگر تسط یک کمپانی تلید عرضه شده باشند. هر بسته از مکملهای پرتئینی معمال شامل پرتئینهای مضر آلده به هرمنها پرتئینهای غیلخاه مخصص به آن بسته میباشد. مکمل- های درشت ملکل محیطهای کشت میبایست به عنان یکی از مهمترین عامل مخاطره آمیز در یک آزمایشگاه لقاح برن- تنی به حساب آیند که ممکن است در تفسیر نتایج کلینیکی باعث برز تید شند. تمام تالشها در استفاده از بستههای مکمل که سالمت کیفیت آنها م تایید قرار گرفتهاست تا زمان فرارسیدن تاریخ انقضا هر بسته باید به کار گرفته شد. تاثیرات مثبت مکملهای پرتئینی پیچیده بعد از فعال شدن ژنم ریان مشخص ثابت میشد. شاید دلیل آن حضر فاکترهای رشد در این مکملها باشد. نرخ پایینتر تلد زنده به دلیل مکملسازی با مکملهای پرتئینی در زیر سطح بهینه ممکن است که به طر مستقیم دلیل از دست رفتن اختصاصی ریانهای ماده باشد. زمانی که تصمیم به استفاده از یک سیستم کشت خاص گرفته می- شد باید تجه خاص به تقابل بین محیط کشت درشت ملکلهای استفاده شده به عنان مکمل اختصاص داده شد. محیط- های کشت آماده استفاده که از قبل غنیسازی شدهاند به عنان تصیه اصلح در برابر محصالت پیچیدهتر در شرایطی که برنامه کامل مدیریت کیفی درشت ملکلها امکانپذیر نباشد در نظر گرفته میشد. به هر ری هنز پرسش در م اینکه افیش در رند سادهسازی مکملهای استفاده شنده در محیط کشت ریان به عنان پیشنهادی کاربی در مقیاس سیع کیلینیکی به حساب میآید یا خیر پابرجاست مقدمه درحال حاضر رند لقاح برنتنی به گنهای انجام میشد که تمام محیطهای کشت تلید ریان به منظر کارب در لقاح برنتنی با استفاده از برخی پرتئینها غنی میشند. در اقع اگر نگییم همه شرکتهای تلید کننده محیطهای کشت تجاری به تلید محیطهای کشت "آماده مصرف" یا "کامل" که با پرتئینها غنی شدهاند میپازند باید اعتراف کنیم که اکثر آنها به این ریک گرایش دارند. شاید در نظر گرفتن تاریخچه خاستگاه غنیسازی محیطهای کشت با پرتئین دلیل غنیسازی محیط کشت با پرتئین یا بازنگری در منبع م نظر نع نه تنها پرتئینها بلکه امکان استفاده از دیگر درشت ملکلها به منظر غنیسازی بیشتر یا جایگزین شدن این درشت ملکلها بهجای پرتئینها به عنان تنها منبع درشت ملکل در محلل کشت به عنان عملکی سنجیده دراندیشانه به حساب آید. ما تمایل داریم که به الدت الین ند انسان که به اسطه لقاح HAS (human serum albomin) Globulinenriched preparations Defined supplement 32

99 برنتنی در تاریخ 23 جالی 4809 به دنیا آمد به عنان سرآغاز لقاح برنتنی انسان تجه کنیم )4(. اما لقاح برنتنی انسان کشت برنتنی ریان قبال تسط Menkin در سال 4811 به انجام رسیده بد )3 2(. بالستسیت انسانی برای الین بار در سال 4804 در شرایط برنتنی با مفقیت تلید شد )1(. در طل این سالهای الیه ریانهای تلید شده در شرایط برنتنی در محیطهای کشتی که برای سللهای سماتیک طراحی شده بدند به طر معمل با سطح باالیی از منابع مختلف سرم غنی میشدند رشد داده میشدند. با تجه به مطالعات گذشته حضر سرم در محیط کشت سلل برای تکثیر مفقیت آمیز سللها اتصال سللها به سطح ظرف کشت الزم ضرری میباشند. تاریخچه تالش برای کشت ریان بهگنهای بده است که ریک استفاده از کشت ریان در سرم کامل یا پالسما بهعنان تنها محیط کشت هماره م تجه بده است. تا پیش از سال 4809 ترکیب ناکافی محلل نمکی ساده به همراه سرم گاهی اقات با اثرات مضر ناشناخته بر ریان )3( تاحددی به عنان عامل مسبب عدم حصل مفقیت در تلد ند زنده انسان شناخته میشد. به هر ری چند سال بعد ایجاد یک آبستنی مفق با استفاده از سرم کامل انسانی به عنان تنها محیط کشت م استفاده در تلید برنتنی ریان گرش شد )2(. درخالل دهه میالدی غنیسازی محیط کشت با 41 درصد سرم آلبمین گای (BSA) سرم نخاع ریان انسان سرم گرفته شده از مجد بارر یا بعد از بارری سرم مادر به عنان راهکار معمل در نظر گرفته میشد )9 0(. برخی چالشهایی که در طل این سالها با آن ماجه میشدند نقصان شدید در ثبات منشا مکملها )41 8( سمیت ناشناخته بستههای خاص پرتئین سرم )9( خطر انتقال بیماری به اسطه استفاده از این منابع پرتئینی بدهاست )44-43(. دهه 4881 میالدی همچنین به عنان دره همکشتی شناخته میشد. با محیطهای کشت آن دره کسب نتایج بهتر با استفاده از همکشتی غیر معمل به نظر نمیرسید. ریانها با همکشتی با استفاده از اناع مختلفی از سللها از جمله سللهای رحمی ریان گا )41( سللهای ناحیه آمپال )43( سللهای اپیتلیال ایداکت گا )42( سللهای )40( Vero سللهای ایداکتی )49( کشت داده میشدند. به منظر حفظ ثبات سالمت کشت این سللها مکملسازی این محیطهای کشت با سرم الزم میباشد. یکی دیگر از د راهی- هایی که در استفاده از سامانه همکشتی ریان به همراه سللهای سماتیک با آن ماجه بدیم این بد که نیازهای متابلیک ریان سللهای سماتیک بسیار متفات از یکدیگر میباشند. بنابراین به منظر بهینه نمدن تکین تکامل ریان نیازمند محیطهای کشت با اج متفات بدیم. فرمالسین محیطهای کشت در آن دره برای تالش جهت تامین نیازهای هر د نع سلل سماتیک ریان در یک زمان هرگز قادر به تامین نیازهای هر د نع سلل به مین بهینه کافی نبدند. شناسایی نیازهای بسیار اختصاصی برای ریان انسان منجبر به تلید تکامل محیطهای کشت ابسته به مرحله تکین ریان یا همان محیطهای کشت پیدرپی شد. برخی از این محیطها شامل )21( G-4/G-2 )48( Universal IVF/M3 P-4/Blastocyst )24( Medium میباشند. با تلید این محیطهای کشت به نظر میرسید که یک دستآ جدید برای کشت ریان در شرایط برنتنی ظهر که است اما الزم به ذکر است که محیط کشت پیدرپی 41-F Bavister/Ham s برای کشت ریان انسان پیشتر از اینها تلید فرمله شده بد )1(. با این پیشرفتها در تلید محیطهای کشت پیشرفته ریان درحال حاضر امکان حرکت در زمینه تلیدات برنتنی ریان عالر استفاده از سیستم همکشتی غنیسازی محیطهای کشت با سرم فراهم شده است. مطالعات متعددی نشان دادهاند که غنیسازی محیط کشت لقاح برنتنی با سرم آلبمین انسانی (HAS) یا غنیسازی با استفاده از جایگزین مصنعی سرم ) 432 (SSS منجر به حصل نتایج مشابه استفاده از سرم یا حتی بهتر از استفاده سرم در نتایج 430 کلینیکی میشد. باید ذکر شد که SSS هم تاکنن به عنان مکمل جایگزین سرم شناخته میشد. امرزه بسیاری از محیطهای IVF تجاری حای HSA به عنان تنها منبع پرتئینی مکمل میباشند تلیدکنندگان این محیطهای کشت ادعا میکنند که ارتقا بد این محیطهای کشت پیشرفته با مکملهای پرتئینی پیچیدهتر امری غیر ضرری به حساب میآید. با تنظیمات تغییرات فینده از جمله جستج برای پایداری ثبات دری از هرگنه احتمال انتقال بیماری کارب رنه رشهای تهاجمیتر از جمله ICSI نمناری از ریان ظهر فناریهای متابلمیک/پرتنمیک برای انتخاب Synthetic serum substitute (sss) serum substitute supplement 39

100 بگی. ریانها همچنان تالشهای ادامه داری در جهت سادهسازی تعیین غنیسازی محیط کشت ریان انسان با درشت ملکلها در حال انجام میباشد )23 41(. استفاده از آلبمین نترکیب انسانی )20 22( یا هیالرنات )29( به عنان تنها منبع مکمل درشت ملکل استفاده شده در محیط کشت تسط برخی از محققان م حمایت تایید قرار گرفته است. در حقیقت مشخص شده است که نرخ آبستنی منطقی بدن افزدن هرگنه پرتئین در محیط کشت ریان قابل دست یابی میباشد )28(. ریک دیگر قابل استفاده شامل غنی سازی محیط انتقال م استفاده برای انتقال به رحم پذیرنده با پرتئین نترکیب )31( یا با استفاده از درشت ملکلهایی از جمله اسید هیالرنیک )34( پلیینیل پیرلیدن (PVP) یا پلی ینیل الکل (PVA) )23(. اگرچه میای استفاده از مکملهای ساده یا درشت ملکلی تعریف شده برای محیط کشت برنتنی ریان اضح مشخص میباشد امکان دا که بیش از حد سادهسازی ریه غنیسازی محیط کشت منجر به ایجاد نقصان در نتایج کلینیکی بدست آمده شد. Tanikawa همکاران نشان دادند که افزدن آلفا بتا گلبلینها به محیط کشت ریان مش با در نظر گرفتن شیه ابسته به دز به طر معنیداری باعث افیش تکین بالستسیست مش هچ شدن برنتنی بالستسیست شد )32(. پاسخ ارتقا دهنده رشد مشابه با آنچه که ذکر شد در زمانی که فقط غلظت آلبمین افیش مییابد قابل دستیابی نمیباشد. اخیرا نشان داده شده است که استفاده از محیطهای کشت غنی شده با ترکیبات پیچیدهتر SSS منجر به حصل نتایج بهتر در زمینه نرخ النه- گزینی نرخ تلد زنده در انسان در قیاس با زمانی که محیط کشت فقط با HSA غنی شده است میشد )33(. ریانهای پیش از مرحله النه گزینی به طر طبیعی در معرض فاکترهای رشد قرار میگیرند همچنین این ریانها برای قرار گرفتن در معرض این فاکترها طراحی آماده شدهاند در حقیقت این نع از ریانها به بسیاری از ماد به صرت پاراکراین اتکراین پاسخ می- دهند. در شرایط درنتنی ریان های انسان در معرض بسیاری از عامل رشد متنع که تسط خد ریان فلیکلها ایداکت اندمتریم رحم تلید میشند قرار میگیرند. الم حضر فاکترهای رشد مناسب در محیط کشت منجر به تانایی ریان در هچ شدن در شرایط برنتنی میشد )21(. مطالعات در حیانات انسان نشان میدهند که محیطهای کشتی که از فاکترهای رشد خاصی تهیه شدهاند )31( یا با فاکترهای رشد نامناسب غنی شدهاند )33( یا با ماد دیگری از جمله لیپپرتئینها مکمل شدهاند )8( رشد تکین ریان را با مشکل ماجه میکنند ممکن است حتی باعث برز اناع مختلف نقصانهای کتاه مدت درازمدت در تکامل ریان شند. افزدن فاکترهای رشد به محیط کشت ریان میتاند منجر به ارتقا مشخص تکین ریان در شرایط برنتنی همچنین ارتقا نتایج کیلینیک شد )32(. اال استفاده از مکملهای درشت ملکل تعیین هیت شده در مقایسه با رشهای غنی سازی کالسیک مانند افزدن سرم نتایج بهتری را در برخاهد داشت ثانیا فهم اینکه ریانها نیازمند به حضر ابسته به زمان فاکترهای رشد در غلظتهای فیزیلژی هستند به همراه انتخاب دقیق محیط کشت غنیشده برای کشت برنتنی ریان باید به دقت در نظر گرفته شد. این سال که آیا ساده سازی بیش از اندازه غنیسازی محیط کشت برای کارهای کلینیکی بهتر است یا ما فقط آغاز کننده پژهش در م تعیین فاکترهای رشد اختصاصی مقتی م نیاز برای تکین برنتنی ریان پیش از النه گزینی هستیم هنز پابرجاست. با در نظر داشتن اینکه فاکترهای رشد م نیاز کشت برنتنی ریان هنز به دقت مشخص نشده است بیش از حد ساده سازی به منظر حفظ ثبات به تنهایی باید م شک سال قرار اهداف مکمل سازی محیطها با درشت ملکلها بهطر کلی تکین برنتنی ریان در غیاب مکملهای پرتئینی با نقص ماجه میشد. زمانی که مکملسازی محیط کشت با پرتئین یا دیگر درشت ملکلها در شرایط برنتنی م نظر میباشد تمیز قایل شدن بین لقاح برنتنی (insemination) دسترزی ریان / گامت کشت برنتنی ریان میتاند مفید اقع شد. در زمان لقاح برنتنی اسیت- ها هنز به سیله هران سلل کملس ریز محیط ایجاد شده تسط آنها که اسیت را دربر میگی احاطه محافظت می- شند. هدف از مکمل سازی با درشت ملکلها در زمان لقاح برنتنی در محیط کشت مربط به آن ممکن است که فقط به عنان تسهیل کننده حرکت آدانه اسپرم قادر ساختن آن در رسیدن به سلل هدف که همان اسیت است کمک کند. عاله 31

101 بر این نکته مکملسازی با درشت ملکلها میتاند منجر به کاهش غلظت اسپرمها در زمان لقاح شد درحالی که نرخ لقاح مفقیت آمیز کاهش نمییابد. همین طر هدف اصلی از مکملسازی محیطهای دسترزی آمادهسازی )برای ریزدسترزی انتقال ریان( با استفاده از درشت ملکلها تسهیل این ریهها میباشد به شرط آنکه محیط مذکر از جهات دیگر به خبی فرمله تنظیم شده باشد همچنین بافر مناسب اسیدهای آمینه م نیاز دیگر ماد مغذی مناسب در آن استفاده شده باشد )30(. مکمل سازی محیطها محلل های نمکی بیش از حد ساده با پرتئین به یژه در زمانی که با اسیت لخت یا ریان عاری شده از سللهای کملس کار میکنیم ممکن است که باعث محافظت از این سللها شد )39(. زمانی که در محیط لقاح برنتنی یا محیط انتقال ریان قصد غنیسازی داریم مشخصا آن پرتئینها را میتان با دیگر درشت ملکلها مانند اسید هیالرنیک )34( یا )23( PVP با مفقیت جایگزین نماییم. از آنجا که هر پرتئینی در محیط کشت میتاند اثرات تنظیم کننده اسمزی از خد برز دهد عملک هشمندانه این است که هرگز ریانها یا اسیتها را از محیطی که غلظت پرتئین آن باال است به محیطی که غلظت پرتئین آن کم است منتقل نکنیم. این اصل معمال در زمانی که اسیتها یا ریانها یخگشایی را سپری مینمایند رعایت نمیشد. محلل مرحله نهایی یخگشایی معمال حای مقادیر بیشتری از پرتئین در مقایسه با محیط کشت بعد از یخگشایی میباشد. این امر ممکن است یکی از دالیلی باشد که محیط انتقال غنی شده با هیالرنان را به عنان محیط ارتقا دهنده نتایج کلینیکی بعد از انجماد-یخگشایی معرفی مینماید )38(. مشخص شده است که زمانی که درحال تصمیم گیری در م مکمل سازی محیط لقاح برنتنی با پرتئین یا درشت ملکلها هستیم گزینه سادهتر بهتر است )21( اینکه اثرات مفید بعد از غنیسازی محیط لقاح با مکملهای پرتئینی پیچیدهتر فقط زمانی قابل مشاهده است که لقاح انجام شده باشد )11 33(. استفاده از سرم یا SSS برای لقاح برنتنی تصیه نمیشد زیرا بسیاری از ما عدم مفقیت بارری یا نرخ بسیار پایین بارری قابل انتظار میباشد به گنهای که تضیح دلیل آن آسان نیست. به نظر میرسد که پرتئینها باعث پایدار شدن غشا اسیت سللهای ریانی در محیط برنتنی میشند. این اقعه با ارتقا بارری کیفیت ریان بعد از پیشانکباسین اسیتها در محیط غنی شده با پرتئینها قبل از لقاح برنتنی یا ICSI )12 12( ثابت شده است. همچنین کشت برنتنی ریانها بالستسیستهایی که بعد از ریه انجماد-یخگشایی بازیافت شده بدند تا حدد 21 ساعت قبل از انتقال به رحم پذیرنده منجر به افیش نرخ النه گزینی بالستسیست تا 3 برابر میشد )13(. یک مکانیسم پایدار کننده محافظت کننده غشاهای سللی ممکن است که از طریق ممانعت مثر از پراکسیداسین لیپیدها با 439 متصل نمدن اسیدهای چرب هیدرپرکسی باشد. به دلیل مساحت بزرگ مکانهای اتصال فراان ری پرتئینها پرتئینها به طر فعاالنه آماده بهکار بهعنان یک تله برای ماد سمی از جمله فلت سنگین آنتی بادیها لیپپرتئنیها دیگر ماد سمی تعیین هیت نشده عمل میکنند. ممکن است که پرتئینها اثرات سمی محیط کشت را بهپشانند بنابراین میتان آزمنهای زیست سنجی کنترل کیفی را با کاهش یا حذف مکمل پرتئینی از محیط کشت م ارزیابی قرار داد )13 11(. بهعاله پرتئینها )به یژه )HSA ممکن است که به عنان ماد مغذی ضرری یا دست ال )مستقیم( / منبع نیترژن برای مرحله بالستسیست ریانها ایفای نقش نمایند )12(. این عملک پرتئینها با هیچ یک از مکملهای خاناده درشت ملکلها از جمله هیالرنیک اسید PVP PVA قابل جایگزین شدن نیست. پرتئینها درشت ملکلهای پیچیده هستند در حقیقت پرتئینها با بسیاری از هرمنها فاکترهای رشد برای آدسازی در زمان لزم در محیط کشت برنتنی اتصال برقرار 438 میکنند. فاکتر فعال کننده پالکتی (PAF) یکی از بزرگترین مثالها برای تقابل بین ریان آلبمین فاکتر رشد میباشد. PAF تسط ریان تلید شده به طر همزمان ریان دارای گیرندههایی با تمایل باالی اتصال برای PAF میباشد. به هر ری مشخص شده است که PAF به طر مستقیم به محیط آد میشد تحت تاثیر متابلیسم سریع به سیله آنزیم -PAF استیل-هیدرالز ) 421 (PAFAH قرار میگی )10(. PAF آد شده به طر منحصر به فی از این هیدرلیز آنزیمی به اسطه عملک محافظتی در اثر اتصال به آلبمین فرار میکند. ساختار دم سم آلبمین با حضر 40 پیند سلفیدی بین زنجیرهای hydroperoxy fatty acids Platelet activating factor (PAF) PAF-acetyl-hydrolase 35

102 که تقریبا تمام باقیمانده سیستئین مجد در آلبمین را با هم متصل میسازد شکل گرفته پایدار میشد. جالب تجه این است که آلبمینی که در معرض ریانها یا محیطهای کشت همراه با ریانها بده است دنبالههای تیل دار بازفعال شده بیشتری را نشان میدهند. آلبمینی که تحت تاثیر تغییرات ساختاری القا شده به اسطه ریان قرار میگی این تغییرات را در پیندهای دی سلفید سیستئین-سیستئین نشان میدهد این تغییرات اجازه بارگیری PAF حاصل از ریان در مکانهای بسیار خاص حفاظت شده حالل گنه بین اسیدهای آمینه ملکل آلبمین را فراهم میآ )19(. کامال مشهد میباشد که طبیعت اختصاصی اتصال PAF تلید شده از ریان به آلبمین این اطمینان را ایجاد میکند که این ملکل (PAF) به سرعت تسط PAFAH غیر فعال نشد درحالی که میتاند در غلظتهای نزدیک به غلظتهای بیلژیکی در شرایط برنتنی تجمع یابند. مقدار PAF آد شده تسط ریان 2 سللی مش به طر مسثقیم ابسته به غلظت آلبمین خارج سللی میباشد به طری که مقدار PAF آد شده هم س با افیش غلظت آلبمین افیش خاهد یافت )18(. با دانستن اینکه فاکترهای رشد برای تکین ریان زنده ضرری میباشند )32( مشاهده تقابل منحصر به ف بین ریان آلبمین PAF به منظر تسهیل برز اثرات 424 تغذیه کننده PAF بر ری ریان محققین میبایست بی همتایی پرتئینها به عنان مکملهای درشت ملکل ضرری در فرمله نمدن نسل بعد محیطهای کشت ریان را در نظر داشته باشند خطرات پیچیدگیهای استفاده از پرتئینها به عنان مکمل در محیطهای کشت از مرر متن علمی کامال مشخص میشد که غنیسازی محیط کشت ریان با HSA منجر به ارتقای نتایج کلینیکی همچنین حصل نتایج با ثبات بیشتر در مقایسه با استفاده سنتی از سرم در غنیسازی محیط کشت میشد )23(. به هر ری برخی نشانههای اضح مشخصی جد دا که نشان میدهد افزدن گلبلینها )32( / یا فاکترهای رشد به محیط کشت ریان نتایج را در مقایسه با مکمل سازی با HSA به تنهایی ارتقا میدهد )31 33(. این نشانهها بیانگر این است که پرتئینها دارای عملکهای بسیار اختصاصی هستند که ممکن است احتمال جایگزینی پرتئینها در محیط کشت ریان انسان با درشت ملکلهای غیر پرتئینی را بدن احتمال برز نقص آسیب در نتایج کلینیکی غیر ممکن سازد. درمقابل اگرچه ما اهمیت نیاز به پرتئینها برخی از عملکهای بیهمتای مکملهای پرتئینی در محیطهای کشت ریان انسان را درک کهایم اما پرتئینهای افزده شده در محیطهای کشت ممکن است دارای خطرات مهم برجستهای نه فقط برای نتایج کلینیکی بلکه برای گیرنده ریان باشند. منابع مختلفی از سرم عصارههای به دست آمده از سرم از جمله Plasmanate Plasmatein SSS یا HSA بهدست آمده از خن تماما به طر ثابت خطر انتقال اج عفنت به ریان یا بیمار را ایجاد مینمایند. غنیسازی محیط کشت ریان با سرم بهدست آمده از اهدا کنندهای که آلده به یرس هپاتیت B بده است منجر به آلده شدن 08 زن شده است )44(. با جد نگرانیهای جدی هنز هیچ سند مدرکی مبنی بر انتقال HIV به اسطه محیط کشت یا آلدگی 422 پرین به این سیله در ریانهای انسان زنان دریافت کننده ریان مشاهده ثبت نشده است. به هر ری در ااسط دهه 4881 میالدی فراخانی از سی International Baxter به منظر جمعآری HSA استفاده شده در غنیسازی محیط کشت لقاح برنتنی صادر شد. دلیل این فراخان مرگ یکی از اهدا کنندگان خن بد که تسط این شرکت برای تلید HSA استفاده میشد در نظر گرفتن احتمال آلده بدن آن ف به بیماری Creutzfeldt-Jakob بد )43(. خطر ابتال به پرین یا آلدگیهای یرسی برای ریان به اسطه غنیسازی محیط کشت با پرتئینها همگام با تسعه کارب رنه ریزدسترزیهای تهاجمی که زنا پلسیدا را سراخ میکنند مانند نمناری از بالستمرها یا استفاده از رش ICSI شدت یافته است. نامه رفع مسئلیت صادر شده تسط شرکتهای تلید کننده محیط لقاح برنتنی در انسان پیرامن استفاده از مکملهای پرتئینی که ممکن است دارای منشا انسانی یا حیانی باشد را میتان به نعی قبل این اقعیت در نظر گرفت که این شرکتها از این منابع مشکک استفاده مینمایند. خطر آلدگی عفنی با استفاده از محصالت تجاری HSA به اسطه استفاده از تیمار حرات دیده در 21 درجه embryotrophic prion 36

103 سانتیگراد به مدت 41 ساعت به حداقل میرسد همچنین میتان بدن استفاده از گرما با اتانل این آلدگیها را استخراج نمد.)34( ممکن است این سال ایجاد شد که اثرات مخرب م انتظار این نع تیمارها ری ساختار سم تانایی عملکی پرتئینهای متفات در کشت برنتنی ریان همچنین برز نقص در ظهر اثرات مفید هرمنها فاکترهای رشد در کنار حذف عامل آلده کننده مجد در محلل غنی شده با پرتئین چگنه تجیح میشد. اگر فرض کنیم در زمانی که غنیسازی با پرتئینهای پیچیدهتر مانند SSS انجام میشد )32 33( 31 فاکتر رشدی که مسئل مستقیم بد نتایج کلینیکی میباشد همان عامل حای آلدگی باشد این رشهای استریل نمدن ممکن است که به طر نسبی باعث برز اثرات مخرب ری یژگیهای ایجاد کننده رشد در برخی از این بستههای مکمل پرتئینی شد. به منظر اینکه بعد از ریه استریل نمدن همچنان یژگیهایی مانند ساختار شکلگیری فضایی محللیت آلبمین حفظ شد تمام محللهای HSA تایید شده تسط FDA به سیله سدیم کاپریالت سدیم استیل تریپتفانات )33( پایدار میشند عاله بر این پایدار کنندهها; بسیاری از محصالت 423 حای ماده نگهدارنده مآللیک اسید میباشند )23(. با در نظر داشتن مکملسازی حجمی که به مقدار %21 HSA یا SSS به 421 محیط کشت لقاح برنتنی محیط انجماد آهسته افزده میشد سالمت یکناختی ماد شیمیایی افزده شده ناخاسته مانند محیط حالل که ممکن است محلل %1/8 نمکی NaCl فیزیلژی باشد م سال اقع خاهد شد. به نظر میرسد که بیشترین دلیل برای حصل نتایج غیر مناسب لقاح برنتنی اریانس مجد بین بستههای مختلف مکمل پرتئینی استفاده شده در محیط کشت لقاح برنتنی باشد. این امر ممکن است که به دلیل تنع تفات ذاتی مجد در منبع دهنده پرتئین همچنین رشهای فرآری متفات درجه خالص سازی افزدن پایدار کنندههای متفات ماد نگهدارنده افزده شده به محلل پرتئین یا حتی آلدگی به اندتکسینهای ناشناس باشد )31(. در بررسیهای اخیر انجام شده در آزمایشگاه شخصی پیرامن TSH FSH که شامل پرژسترن SSS سطح فیزیلژیی برخی استرئیدهای معمل هرمنهای پرتئینی در SSS hcg DHEA-S انسلین به همراه فاکترهای رشدی مانند VEGF IGF-II میباشند را م ارزیابی قرار دادیم. نتایج بررسیها نشان داد که سطح این ماد بین بستههای مختلف SSS یا HSA مشابه نمیباشد )جدل 4-9(. اگر این نتایج برای این هرمنها صحیح قلمداد شد به طر منطقی میتان انتظار داشت که دیگر اج مجد در مکملهای پرتئینی نیز ممکن است که چنین اریانسی را در بین بستههای مختلف از خد برز دهد. اینکه تصر کنیم تمام مکملهای پرتئینی تجاری یا حتی محیطهای آماده مصرف که از پیش غنیسازی را سپری نمدهاند عصارههای خالص از پرتئین م نظر میباشند تصری صحیح نمیباشد. ارزیابی یک بسته از HSA آماده برای استفاده در لقاح برنتنی SSS با استفاده از رش الکترفرز ژل اکریل آمید- SDS به ضح مشخص نمد که مکملهای تجاری HSA لقاح برنتنی از HSA خالص تشکیل نشدهاند حتی مقدار خلص آن در زمانی که با محصالتی پیچیدهتر مانند SSS غنی شده باشند کمتر خاهد شد )شکل 4-9(. برای هر د مکمل HAS SSS یک نار کامال مشخص را میتان بین نشانگرها با اندازه kda مشاهده نمد که فرض میشد نار مذکر مربط به آلبمین است. در نمنه HSA نارهای بیشتری به کچکی 23 kda به بزرگی 231 kda که مبین حضر پرتئینهایی به غیر از HSAمیباشند را میتان مشاهده نمد. در نمنههای SSS میتان به ضح نبانی از پرتئین به کچکی 42 kda را مشاهده نمد. هر دی مکملهای پرتئینی مذکر HSA SSS نشان دادند که دارای ملکلهای پرتئینی سنگین زن بین kda هستند. نتایج این الکترفرز نشان داد که به طر کلی به نظر میرسد که SSS دارای ملکلهای سبک زنتری از پرتئینها در دامنه kda در قیاس با HSAمیباشند. زمانی که به اسطه استفاده از nanoflow LC-MS/MS به بررسی این پرتئینهای سبک زن پاختیم مشخص شد که اناع گناگنی از سایتکینها فاکترهای رشد پرتئینهای حامل را شامل میشند. برای نمنههای HSA SSS آزمن شده SSS نشان داد که قدرت volume-volume Cryopreservation media 37

104 پیام رسانی کلی سایتکینهای مجد در آن %23 این معیار برای نمنه HSA تقریبا معادل %4 در قیاس با همین معیار در پالسمای گره کنترل میباشد. سطح این آلدگی پرتئینی ناخاسته در مکملهای پرتئینی تجاری IVF به طر گستهای متفات میباشد. این تفات ابسته به هر بسته از این محیط همچنین رش خالص سازی محصل میباشد. رش معمل استفاده شده به منظر خالص 423 سازی آلبمین شامل رسب دهی با رش تعیض ینی یا ریه جداسازی Cohn میباشد )23(. هر یک از این د ریک منجر به بدست آن محصل نهایی با مخلطی متفات از پرتئنیها میشد. همانطر که پیشتر از این نیز مطرح شده بد با استفاده از مکملهای پرتئینی تلید شده با استفاده از رش نترکیبی به طر قابل تجهی رد آلده کنندهها در نتیجه اریانس بین بستههای مختلف را میتانیم کاهش دهیم )33 29( همچنین میتانیم از حضر آلده کننده یا آلده کنندههای خاصی که اثرات مخرب در نتیجه کار برجا خاهند گذاشت جلگیری به عمل آریم. به هر حال اثرات مفید برخی از بستههای پرتئینی ممکن است بسیار خب باشد دلیل آن میتاند به حضر برخی آلدگیهای پرتئینی ناخاسته مفید باشد از جمله این آلدگیها میتان به انسلین سیترات )32( یا فاکترهای رشد اشاره نمد )31 33(. مکملهای پرتئینی به عنان منشا آلدگی اندتکسین برای محیطهای کشت ریان معرف شدهاند. حتی بستههای مکملهای پرتئینی ممکن است حای برخی اندتکسینهای به جا مانده از آلدگیهای باکتریایی گرم منفی باشند. ملکلهای اندتکسینی با منشا لیپپلیساکارید میتاند به کچکی 31 kda باشند که این ملکلها به شدت در برابر حرارت مقام پایدار هستند. بنابراین با ریههای استاندا استریل کن همچنین فیلتراسین با فیلترهای میکرنی از محیط کشت حذف شدنی نیستند. سطح باالتری از اندتکسینها EU/ml) 1/4 ) که بهعنان آلدگیهای محیط کشت IVF به حساب میآیند ممکن است به سرعت آسانی با مشاهده اثرات آن در شرایط برنتنی ری ریان از جمله قطعه قطعه شدن بالستمرها تکین با تاخیر ریان قابل تشخیص باشد )30 31(; به هر ری آلدگیهای اندتکسینی کم غلظتتر )به کمی 1/12( EU/ml ممکن است دارای اثرات قابل مشاهده در کیفیت ریان در شرایط برنتنی نباشد اما اثرات مخرب مربط به این دسته از اندتکسینها را میتان با کاهش نرخ تلد زنده ندان که قابل تجیح تضیح نیست مشاهده نمد. جدل 4-9. مقایسه بین هرمنهای پرتئینی منتخب هرمنهای استرئیدی فاکترهای رشد اندازهگیری شده در بستههای مختلف آلبمین سرم انسانی (HAS) مکمل جایگزین سرم( SSS ) HSA Hormone/protein Company 4 Company 2 Lot 4 Lot 2 Lot 3 FSH (miu/ml) 9/ 2 2/ 3 1/ 1 3/ 8 1/ 1 LH (miu/ml) hcg (miu/ml) 34/ 31 29/ 1 49/ 1 41/ 8 41/ 0 Progesterone (ng/ml) / 34 1/ 1 1/ 32 Estradiol (pg/ml) DHEA-S (ug/dl) 211/ 2 29/ 4 23/ 3 242/ 0 221/ 1 TSH (uiu/ml) 1/ 130 1/ 441 1/ 411 1/ 439 1/ 413 PRL (ng/ml) IGF-4 (ng/ml) IGF-2 (ng/ml) VEGF (pg/ml) Interleukin-2 (pg/ml) Insulin (uiu/ml) / 2 1/ 4 1/ 3 SSS ion-exchange precipitation 38

105 اهمیت ارزیابی کیفی مکملهای درشت ملکل IVF در پژهش انجام شده تسط ما به منظر تعیین بهترین مناسبترین درشت ملکلها به عنان مکمل برای محیط- های کشت ریان که امرزه م استفاده قرار میگیرند ما باید تانایی درشت ملکلهای مکمل برای حصل نتایج بهینه را با در نظر داشتن حاشیه امنیت مناسب عملک با ثبات فراهمی ماده م نظر قیمت آن متعادل نماییم. شناسایی درشت ملکل م نظر به معنی مکمل سازی با بسته خاص حای این ملکل دستیابی به بهترین نتایج در تکین برنتنی ریان نیست. کنترلهای کیفی درن آزمایشگاهی شدید سخت برای تایید اینکه یک بسته خاص از درشت ملکل مکمل نتایج م دلخاه کلینیکی را منجر میشد ضرری است. ارزیابی کیفی درشت ملکلهای مخصص هر بسته باید تایید کننده مخلط بهینهای از درشت ملکلهای بدست آمده از منشا دهنده مشخص باشد همچنین میبایست عدم حضر آلدگیهای ایجاد کننده سمییت برای ریان به اسطه حضر پایدار کنندهها نگهدارندهها سطح قابل قبل از اندتکسینها; آماده سازی مناسب در حین انتقال ریان را تایید نماید. شکل 4-9. SDS-PAGE %21-41 از HSA.SSS نشانگر زن ملکلی (Mw) در دامنه 2-231kDa به عنان مرجع نشان داده شده است. به عنان الین سطح در کنترل کیفی مکملهای حای درشت ملکل کارب رشهای زیستسنجی تماسی حساس اجتناب ناپذیر میباشد. یک رش زیست سنجی تماسی یا رش زیست سنجی چندگانه مناسب به منظر تایید تانایی درشت- 422 ملکلها افزده شده در محیط کشت IVF در برز اثرات تغذیهکنندهریان باید به کار گرفته شد همچنین این رش منتخب باید تانایی تایید عدم حضر اثرات سمی محتمل درشت ملکلها را نیز داشته باشد. عدم حضر یژگیهای تغذی- کنندهریان / یا حضر اج سمی برای ریان ممکن است که به دلیل طبیعت ذاتی منشا اصلی درشت ملکل باشد یا; مهمتر اینکه ممکن است به دالیل ثانیه مثال عدم اجرای ریه مناسب در زمان انتقال یا ذخیره نمدن باشد. به همین دلیل هر حمل نقلی )حتی از یک بسته( میبایست به منظر تایید ایمنی برای استفادههای کلینیکی آزمده شد. آزمن برای تعیین سمیت ماد برای ریان را میتان با استفاده از حداقل یک رش زیست سنجی تماسی مانند سنجش زندهمانی اسپرم برای مدت طالنی یا سنجش حساسیت ریان مش در اثر قرار گرفتن در معرض ماده م نظر به انجام رساند )13 11(. غیاب سمیت برای ریان در م یک مکمل که در اثر عدم برز آسیب به اسپرم یا ریان مش م تایید اقع شده است لزما به معنی ضمانت برز اثرات تغذیهکنندهریان نیست. حساسیت تانایی پیش بینی کنندگی رش زیست سنجی ریان مش میتاند با آغاز آزمن در مرحله تک سللی به جای استفاده از ریان د سللی تعیین سیههای حساس مش استفاده از سیستم محیط کشت ساده / یا با در 420 نظر گرفتن نقاط پایانی در کنار نرخ تشکیل بالستسیست از جمله نرخ تکین ریان تعداد کل سللها هچ شدن برنتنی بالستسیست برقراری تمایز بین ICM سللهای ترفبالست بهینهتر شد. از آنجا که میدانیم بیشتر پرتئینهای مکمل embryotrophic End point 33

106 با فاکترهای رشد مفید از جمله VEGF IGF-II انسلین )جدل 4-9( آلده شدهاند نقاط پایانی اندازه گیری شده از جمله نرخ هچ شدن برنتنی ممکن است که به عنان شاخص غیر مستقیمی از حضر ماد دستدار ریان در یک بسته مکمل 429 پرتئینی مشخص باشد. با در نظر داشتن مکملسازی حجمی که به مقدار %21 HSA یا SSS به محیط کشت لقاح برنتنی 428 محیط انجماد آهسته افزده میشد باید قدان این نکته بد که آنچه که به محیط کشت افزده میشد بیشتر از ماکرملکلهایی است که تصر میکنیم ممکن است که مکمل به طر معنی داری تغییر دهنده ترکیب یژگیهای محیط کشت آماده شده نهایی باشد. درکنار افزدن آلدگیهای پرتئینی همانطر که پیشتر از این بحث شد تعادل ph الکترلیتی محصل نهایی ممکن است که تحت تاثیر قرار بگی. به عنان مثال محیطهای کشت (Vitrolife, Gotheburg, G Sweden) اصال به گنهای فرمله شدهاند که بایستی با 1/3 mg/ml از HSA یا (v/v) %3 از محلل %41 HSA غنی شند. اما زمانی که محیط کشت G نسخه 2 را با %41 SSS نیز غنی میکنیم )عاله بر HSA افزده شده( ph به تعادل رسیده در حدد 1/4 احد کاهش مییابد غلظت سدیم کلراین کاهش یافته غلظت پتاسیم کلسیم به طر معنی داری افیش مییابد حتی سطح گلکز به طر جزیی ممکن است باال برد )جدل 2-9(. برنامه دم ارزیابی کیفی درشت ملکلها باید تعیین کننده در عین حال مشاهده کننده ph م نظر باشد اطمینان حاصل نماید که اسمالریته غلظت الکترلیتها همچنان در محدده م نظر میباشد. اگرچه فرمالسین یک مکمل تجربیات گذشته از یک مکمل ممکن است پیشنهاد کننده این باشد که این مکمل باید برای مصارف کلینیکی مفید باشد از سی دیگر مکمل درشت ملکل ممکن است که نتاند از تکین ریان حمایت الزم را به عمل آ که دلیل آن حضر ماد سمی برای ریان در بسته مذکر باشد. به عنان مثال حضر لیپپرتئینها در مکمل درشت ملکل نشان داده شده که منجر به برز اثرات منفی در رند تکین ریان انسان مش میشد )8(. آلدگی- های هرمنی مخصص یک بسته مکمل از جمله hcg / یا پرژسترن دسرساز میباشد )جدل 4-9( اثرات مخرب یا اکنش متقابل بین این هرمنها با برچسبهای تجاری مختلف محیط کشت همچنین با فاکترهای رشد دیگر یا ریانهای برنتنی به طر گستهای ناشناخته یا غیرقابل پیش بینی میباشند. فراانی مدام حضر hcg در ذخیره حاصل شده از ف اهدا کننده HSA( مکمل غنی شده گلبلین شگفت آر میباشد ) در مدت کشت برنتنی طالنی شده ریان م تقاضا بدن آن در زمانی که تاثیرات برجسته عملک طالنی مدت آن در فعالیت LH در شرایط درنتنی م تجه قرار میگی می- بایست م سال اقع شد. یکی از ماد سمی که در مکملهای درشت ملکل که بسیار زیاد قابل مشاهده میباشد اندتکسینهای باکتریایی می- باشد. ممکن است که اندتکسینها به صرت شنار در محیط کشت ریان یافت شند یا معملتر این است که ممکن است به پرتئینهای مجد در مکمل محیط کشت ریان متصل شند. اثرات مخرب اندتکسینها ری ریان انسان در شرایط برنتنی نتایج کلینیکی م انتظار به خبی بررسی شده است )39 31(. 30 جالب تجه این است که ما از شیب غلظت Percoll با سطح باالیی از اندتکسینها در حد 411 EU/ml برای سالهای زیادی در ریه آماده سازی اسپرم برای لقاح برن- تنی استفاده میکیم بدن اینکه هیچ گنه نقصانی در تکین نهایی ریان را مشاهده نماییم. این عدم آسیب مشاهده شده در اثر استفاده از Percoll حای اندتکسین به شرطی به قع میپیندد که باقیمانده Percoll به طر کامل از محلل حای اسپرم پیش از استفاده برای لقاح برنتنی خارج شد. البته ممکن است که اثرات منفی اندتکسینهای باکتریایی فقط مخصص اسیت ریان باشد با تجه به این نکته که ریان تمام گنهها لزما به طر مسای تحت تاثیر اثرات منفی اندتکسینهای باکتریایی قرار نمیگیرند. تعیین نمدن محدده تحمل خاص آزمایشگاه همچنین کنترل غلظت اندتکسینهای مجد در بستههای مکمل درشت ملکل برای حصل اطمینان از به دست آن نتایج عملک برنتنی یکناخت مکملهای درشت ملکل الزم ضرری میباشد. برپایه اثرات گرش شده اندتکسینهای باکتریایی بر ریانهای انسان بیشینه حد تحمل محتای اندتکسینی در بستههای محللهای ذخیره مکملهای درشت ملکل به مقدار EU/ml volume-volume Cryopreservation media 411

107 1/4 به عنان مقدار مناسب تعیین شده است. چالشهای زیادی جد دارند محققین با تجه به گرش معتبرتجزیه محصالت باید مقداری از سطح اندتکسین را که تسط شرکت سازنده گرش شده است بپذی: 4( سطح اندتکسین گرش شده ممکن است که برای محلل ذخیره صادق نباشد اما در صرت استفاده از محصل م نظر طبق تصیه کارخانه سازنده مقدار م انتظار اندتکسینها در محلل کاری به مین گرش صادر شده از شرکت سازنده خاهد بد. 2( سطح استاندا قابل قبل برای اندتکسینها در مکملهای پرتئینی ممکن است که درکارخانهها مشابه نباشد همانطر که برای آزمایشگاه مصرف کننده این محصالت این سطح استاندا متفات است. محدده قابل قبل برای ارسال محصل به بار برای هر کارخانه ممکن است که بر پایه سطح تصیه شده تسط آژانسهای کنترل کیفی مانند FDA براساس ریه صحیح تلید مشخص شد به جای اینکه بر پایه آنچه که قابل قبل برای کشت ایمن ریان میباشد مشخص شد. بر اساس مدرک مربط به تجزیه تحلیل صادر شده برخی مکملهای پرتئینی تجاری مانند SSS که برای مصارف تلید برنتنی ریان رانه بار میشند تا زمانی که سطح اندتکسینهای آنها کمتر از 42 EU/ml باشد منعی برای تزیع ندارند اگرچه اثرات مخرب آن بر ری تکین ریان در سطحی به کمی 1/12 EU/ml گزراش شده است )39(. 3( پرکاربترین رش برای سنجش اندتکسین رش انعقاد ژل Limulus (LAL) Amebocyte Lysate میباشد که برپایه مشاهده لخته یا ته نشین شدن در رقیقسازی سریالی محلل م آزمن بنا نهاده شده است. تفسیر نتایج حاصل از این رش سنجش تا حددی ابسته به هر م میباشد تجربه نقش بسیار مهمی در خاندن نتایج ایفا مینماید. سنجش سطح اندتکسینها با استفاده از سایل تخصصی سنجش در خارج از کارخانه سازنده ممکن است بسیار قابل اعتمادتر از آزمنهای آزمایشگاههای مصرف کننده این ماد یا آزمنهای انجام شده تسط کارخانههای سازنده 401 ماد م نظر باشد. 1( خطای سنجش انعقاد-ژل که برای آزمن مقدار اندتکسینها به انجام میرسد معادل ±2-4 برابر رقیق شدگی است. این نکته اشاره به آن دا که سطح اقعی اندتکسینهای مجد در یک مکمل ممکن است مشابه مقداری باشدکه در گاهی صادر شده تجزیه مکمل م نظر نشته شده است همچنین ممکن است که مقدار آن نصف یا حتی 2 برابر مقدار گرش شده باشد. آزمن مجدد حداقل ارایه کننده مقدار ثانیهای میباشد که میتاند م تجه قرار بگی )3(. ساخت 404 تلید یک مکمل درشت ملکل سنجش آن برای سطح اندتکسینها تسط یک شرکت میتاند منجر به تضاد عالیق شد از صحت کار کاسته شد. سنجش مستقل اندتکسینها تایید کننده کیفیت محصل ارایه شده تسط شرکت تلید کننده میباشد این گزینه میبایست به عنان یکی از اج جدا نشدنی از برنامههای مدیریت کیفی IVF هماره م تجه باشد. آزمن تایید کننده اندتکسینها به طر گستهای تسط آزمایشگاههای IVF نادیده گرفته شده است دلیل این نادیده گرفتن نبد نیاز بررسی کیفی برای انجام آن بده است همچنین یکی دیگر از دالیل آن فهم نیازهای متفات لژستیکی برای انجام چنین آزمنهایی میباشد. درحال حاضر خرید استفاده از محیطهای کشت ریان انسان که از پیش غنی سازی شدهاند همچنین آماده مصرف میباشند بسیار عممی شده است. آزمایشگاههای IVF از نتیجه ساده شدن کارشان با استفاده از محصالت آماده مصرف بسیار خرسند هستند زیرا دسرهای انجام آزمنهای کیفیت سنجی مکملهای درشت ملکل یا احتمال خطر با ایجاد اریانس در کیفیت محیط کشت در زمان ساخت مصرف محللهای ذخیره مکمل درشت ملکل را متحمل نمیشند. میبایست در نظر داشته باشیم که در زمان انجام آزمن کیفیت سنجی محیطهای آماده مصرف ما دیگر به محلل ذخیره اصلی دسترسی نداریم. ممکن است که در محلل ذخیره اصلی نشانههایی از مکمل درشت ملکل بی کیفیت )از جمله حضر اندتکسینها( جد داشته باشد که با رقیق سازی تا 21 برابر این اندتکسینها قابل تشخیص تسط مصرف کننده نباشد. مدیریت کیفی مکملهای درشت ملکل باید به عنان یکی از باالترین تقدمها در برنامههای مدیریت کیفی کلی برای هر آزمایشگاه IVF در نظرگرفته شد زیرا مکملهای درشت ملکل به عنان معملترین عامل انحراف عملک در محیط کشت ریان شناخته میشند. دلیل این بد نامی برای مکمل های پرتئینی این است که هیچ د مکمل پرتئینی از نظر عملک اج متشکله آن مشابه نمیباشند. Gell-clott Conflict of interest 414

108 عمر هر بسته از بیشتر مکملهای درشت ملکل بیشتر از عمر هر بسته از محیطهای کشت ریان مجد میباشد. در نتیجه زمانی که به صرت معمل از محیطهای کشت ریان که از پیش غنی شدهاند استفاده میکنیم عمر مکمل پرتئینی با اسطه طل عمر محیط کشت ریان محدد میشد. به عاله هر یک از این محیطهای از پیش غنی شده بالقه میتانند محتای 402 بیش از یک بسته از مکملهای پرتئینی باشند. همچنین لقاح برنتنی ریزدسترزی مراحل متفات کشت ریان ممکن است که به طر بالقه با استفاده از بستههای مختلفی از مکملهای درشت ملکل به انجام برسند. این نکته اشاره به این مسئله دا که ریان به دست آمده از یک بیمار میتاند در معرض بستههای مختلفی از مکملهای درشت ملکل قرار بگی که باعث ایجاد اریانس غیرضرری در سیستم کشت شد. پذیرش دسر اضافی به منظر بررسی آزمن مکملهای درشت ملکلی خرید آن بعد از این بررسیها ذخیره نمدن آن به طر ایمن تا رسیدن به زمان تاریخ انقضا آن عملکی هشمندانه میباشد. این مکملهای انتخاب شده میبایست بستههای متعددی از محیط کشت ریان را غنی نماید این کار تا زمانی که پایداری در نتایج کشت مدت دار یا کشت الیه حاصل شده از غنی سازی محیط کشت با این مکمل پرتئینی را منجر میشد بایستی ادامه پیدا کند. مدیریت کیفی دقیق سنجش مکملهای درشت ملکلی محیط کشت ریان نه تنها برای حصل اطمینان از کیفیت نتایج کلینیکی بلکه برای دستیابی به نتایج پایدار الزم ضرری میباشد. اگر تمایلی به صرف قت نیری انسانی منابع مالی برای برنامههای مدیریت کیفی نداریم بسیار بهتر است که آزمایشگاهها ر به استفاده از محیطهای کشت آماده مصرف که از قبل غنی شدهاند شرکتهای تلید کننده آن حداقل سطحی از سنجشها را بر ری آنها انجام دادهاند بیارند. اگرچه نشانههایی از عملک بهتر مکملهای درشت ملکل پیچیدهتر در قیاس یا HSA استاندا تحت شرایط خاص مشاهده شده است به طر کلی در صرتی که آزمایشگاههای IVF به انجام آزمنهای دقیق پایبند نیستند راهای بد کیفیت بستههای مکمل محیط کشت به گنه دلخاه را در نظر نمیگیرند استفاده مکملهای سادهتر ممکن است که منجر به حصل نتایج با ثباتتری شند. جدل 2-9. مقدار م انتضار ph دامنه غلظت الکترلیتها در محیطهای کشت G نسخه 2 غنی شده با HSA یا SSS (mean±sd) فراسنجه سرم G HSA G SSS G HSA G SSS ph (U) 0 / 33 0 / 13 0 / 33 0 / 13 0 / 23 0 / 33 0 / 33 0 / 13 0 / 23 0 / 33 Na + (mmol/l) K + (mmol/l) 3 / 3 3 / 2 1 / 0 3 / 4 1/ 88 3 / 3 1 / 0 3 / 4 3 / 4 3 / 3 Cl - (mmol/l) Ca 22 (mg/dl) 9 / 0 41 / 2 3 / 1 1 / 2 2 / 0 0 / 3 3 / 1 1 / 2 2 / 9 0 / 2 Glucose (mg/dl) <23 < الگی مفرض برای مدیریت کیفی درشت ملکلها به صرت زیر میباشد: 4( شرع به بررسی تحت نظر داشتن نمنههای منتخب 2 ماه زدتر. 2( نمنهها با گاهی تایید شده آنالیز با سطح اندتکسین بیشتر از 1/4 EU/ml فرا در ریخته شد. 3( سنجشهای مقادیر اندتکسینها خارج از شرکت سازنده به منظر تایید مقادیر گرش شده در گاهی آنالیز به انجام برسد. برای نمنه از کمپانی Associate of Cape Cod.( )میتان برای ارسال نمنهها برای سنجش مین اندتکسین استفاده نمد. 1( آزمن زندهمانی اسپرم به مدت 3 رز به انجام برسد. 3( آزمن ارزیابی ریان 4 سللی مش به انجام برسد این کار با استفاده از محیط کشت استاندا ریان انسان استفاده شده در آزمایشگاههای IVF همچنین رشهای مکملسازی درشت ملکلهای مربطه به انجام برسد. حتما از نرخ هچ شدن برنتنی ریان به عنان یکی از نقاط پایانی به منظر به دست آن برخی نشانهها از فعالیت فاکترهای رشد استفاده نمایید. 2( بعد از گذراندن سنجشهای زیستی مکمل پرتئینی را برای آلدگیهای هرمنی از جمله FSH micromanipulation 412

109 hcg DHEA-S انسلین به عنان شاخصهای دقیق م ارزیابی قرار دهید. با گذشت زمان این مقادیر را میتان با نتایج به دست آمده مطابقت داد یک دامنه معنی دار برای مشاهدات سیع بعدی بنا نهاد. 0( لیست استاندا الکترلیتهایی را در محیط غنی شده نهایی باید مجد باشد را مشخص نمده این الکترلیتها شامل + Na K + Cl - Ca 22 گلکز میباشند. اگرچه بسیاری از شرکتهای تلید کننده محیطها غلظت این الکترلیتها را به صرت دقیق مشخص نمیکنند با گذشت زمان این مقادیر را میتان در هر آزمایشگاه محاسبه نمد تا یک دامنه معنی دار از این مقادیر به عنان مرجع برای مشاهدات بررسی- های سیع به دست آید. 9( بر اساس استنادا آزمایشگاه ph نهایی به محیط غنی شده به تعادل رسیده را محاسبه تایید نمایید. 8( درحالی که هنز مقداری از بستههای محیط قبلی باقی مانده است سعی کنید به منظر استفاده کلینیکی مقایسه با مکملهای قبلی مکملهای جدیدی به محیطها بیافیید. مطالعات مقایسهای بین ریانهای خاهر-برادر را در مدت این بررسی مکملهای جدید به منظر تایید کاربی بدن آنها برای بیماران اقعی به انجام رساند. 41( حجم م انتظار مکمل الزم برای اینکه قادر به غنی سازی تمام محیطهای کشت مناسب در زمان طل عمر بسته مکمل م نظر باشیم را محاسبه نمایید. مقادیر کافی از این مکمل را سفارش داده تا منبع پایدار مناسب از مکمل به گنهای که طل عمر بسته مکمل از زمان خد نگذ را هماره در دسترس داشته باشیم. 44( تمام محصالت جدید تازه رسیده را میبایست برای آزمن زنده مانی اسپرم ریان مش جهت تایید حمل نقل مناسب م آزمن قرار دهیم. 42( از ذخیره سازی نگهداری صحیح مناسب تمام محصالت بر اساس تصیه کارخانه تلید کننده اطمینان حاصل نمایید. مطمئن شید که هیچ مکمل پرتئینی را بدن اینکه تصیه شده باشد منجمد نکهاید مگر اینکه تصیه کارخانه تلید کننده باشد. معمال مکملها را در دمای 2 تا 9 درجه سانتیگراد نگهداری نمایید. 43( حتما در نظر داشته باشید که الیکت سازی هر مکمل فقط یکبار صرت بگی این کار باید در ظرفهای کچک ایمن سنجش شده برای کاهش خطر آلدهگی باکتریایی / یا اندتکسین همچنین تکرار برگشت ماد به ظرف اصلی مکمل باید انجام شد. 41( اطمینان حاصل نمایید که هر نمنه را که برای سنجش دیرتر دریافت مینمایید دیرتر از 2 مانده به تاریخ انقضا دریافت نکه باشید زیرا بستههای جدید محدد بده تاریخ ارسال آن دیرتر خاهد بد. به عاله در نظر داشته باشید که انتظار میرد حداقل %03 از نمنهها بعد از آزمنهای کیفی مد شند. در مطالعات تصادفی که ری 329 بیمار انجام گرفت نشان داده شد که %9/2 نرخ تلد زنده در زمانی که محیطهای کشت تجاری با HSA+SSS غنی شده بدند بیشتر از زمانی بد که HSA به تنهایی استفاده شده بد )33(. جالب تجه این 403 است که نرخ آبستنی کلینیکی بین د گره تیمار متفات نبد فقط نرخ تلد زنده با تجه به این د تیمار بد یافته بد. این نتایج مشاهدات تا حد زیادی به دلیل تمایل به از دست رفتن ریان بعد از النه گزینی در گره تیمار شده با HSA میباشد. همچنین نرخ تلد زنده فقط زمانی که ریان در مرحله بالستسیست منتقل شد باالتر خاهد بد. درصرت انتقال در رز 2 تا 3 شاهد افیش در نرخ تلد زنده نخاهیم بد. تانایی ریان برای النهگزینی رشد تا سرحد تلد مفقیت آمیز تا حددی با در نظر گرفتن برنامه غنیسازی غیر بهینه محیط کشت با مکملهای پرتئینی در فاصله رزهای 3 تا 3 کشت برنتنی میتاند م آسیب اقع شد. در تایید این یافته هیچ تفاتی بین کیفیت ظاهری ریانهایی که در محیط HSA یا SSS کشت داده شدهاند در رز 3 مشاهده نشد )11(. مشخص شده است که اثرات مفید غنیسازی با SSS فقط بعد از فعال شدن ژنم ریان در رز 3 قابل مشاهده است که این یافته به نبه خد اشاره به نقشهای احتمالی فاکترهای رشد دا. زمانی که استاندا سازی یا سادهنمدن غنیسازی محیطهای کشت ریان با درشت ملکلها با ریههای آمادهسازی تعریف شده از جمله هیالرنات )29( )23( PVA PVP یا آلبمین نترکیب انسانی )20( م نظر است مشاهده نتایج بعد از 3 رز ال کشت ممکن است که این ریهها را برای کشت طالنی تا مرحله بالستسیست استفاده نکنیم. درپی تحقیقات بیشتر در م ندان متلد شده بعد از کشت ریان در محیط غنی شده با HSA یا با HAS+SSS مشاهده شد که نه تنها نرخ تلد زنده درصرت استفاده از HSA به تنهایی از خد کاهش نشان میدهد بلکه نسبت جنسی ندان به سمت تلد ندان نر گرایش از خد نشان میدهد )شکل 2-9(. ما میدانیم که افزدن d-glucose یا گلکزآمین به آبستنی کلینیکی: تایید آبستنی با آزمایش خن که فاکترهای اندازهگیری شده نمایانگر النهگیزینی ریان میباشد. 419

110 محیط کشت در مرحله 9 سللی منجر به افیش نسب نر:ماده در ریانهای گای حاصل شده از ریه IVF میشد اما هیچ اثری از این د تیمار در زمانی که قبل از MZT اعمل شند مشاهده نمیشد )38(. متاآنالیزی که اخیرا از 1 مطالعه 2390 ند متلد شده انجام شده است نشان دهنده یک افیش مشخص در نسب نر به ماده در زمانی که بالستسیست منتقل شده بد مشاهده شد اما زمانی که ریان در مرحله کلیاژ منتقل شد چنین تفاتی مشاهده نشد )21(. مشاهده نرخ جنسیت مشابه زمانی که ریانهای قرار گرفته در مرحله کلیاژ منتقل میشند نتایج حاصل از مطالعات انجام شده در گا پیشنهاد میکند که مکملسازی محیط کشت با HSA به تنهایی به طر مشابه ممکن است که منجر به از دست رفتن انتخاب برای ریانهای ماده بعد از مرحله 9 سللی شد این نکات به نقش محصالت مرتبط به ژن X اشاره دارند. این شرایط با غنیسازی با استفاده از مکملهای درشت ملکل پیچیدهتر اصالح میشد از جمله این مکملهای پیچیدهتر میتان به SSS اشاره نمد. شاهد 401 فیندهای جد دا که به نقش عمده غیر فعال شدن کرمزم جنسی اشاره دارند )24(. تفاته یا بیان ژن ابسته به جنسیت ممکن است که بسیاری از مسیرهای ملکلی را تحت تاثیر قرار دهد از جمله این مسیرها میتان به متابلیسم گلکز پرتئین متیالسین DNA تنظیمات اپیژنتیکی با عاقب تکینی بعدی آنها از جمله از دست دادن انتخاب ابسته به جنسیت ریان در شرایط کشت برنتنی با کیفیت نامناسب اشاره نمد )22(. بنابراین افیش نرخ تلد زنده زمانی که محیط کشت با SSS مکمل سازی میشد ممکن است نتیجه مستقیم زندهمانی ریانهای ماده بیشتری در شرایط برنتنی باشد. زمانی که برای انتخاب یک مکمل درشت ملکل برای افزدن به محیط کشت تصمیم گیری مینماییم نباید فقط به مکمل تجه داشته باشیم بلکه امر مهمتر اکنش متقابل بین محیط کشت مکمل انتخاب شده میباشد. ترکیب مکمل محیط کشت باید مد نظر قرار بگی تا اینکه انتخاب محیط کشت مکمل درشت ملکل به تنهایی م تجه قرار بگی )23(. محیطهای کشت به نسبت ساده مانند 4-P (Irvine Scientific, Santa Anna, California) ممکن است که از مکملهای پیچیدهتر درشت ملکل مانند SSS بیشتر سد ببرند )34( در قیاس با محیطهای پیچیدهتر از جمله محیط کشت سری (Vitrolife, G Sweden) Gotheburg, که با استفاده از مکملهای سادهتر مانند HSA نتایج کلینیکی قابل قبلی را منجر میشند. اگرچه میای کلینیکی یک بسته مشخص از مکمل پرتئینی پیچیده مانند SSS ممکن است که به اثبات رسیده باشد )33( لی افیش در پیچیدگی این مکملها میتاند منجر به افیش احتمال خطر انتقال بیماریها اریانس خطر آلدگی به سمم مختلف از جمله اندتکسینها لیپپرتئینها یا سایتکینهای نامناسب / یا فاکترهای رشد شد )9(. مکملسازی با پرتئین نامناسب ممکن است به صرت تغییر در متابلیسم ریان که میتاند منحصر به جنسیت ریان باشد تغییر بیان ژن imprinting ریانی تغییرات ظاهری قابل مشاهده در شرایط برنتنی تشکیل بالستالی ناقص یا دیر هنگام نقص فراساختاری یا تاثیر بر زن ریان به یژه در حیانات گنه نشخارکننده ظاهر شد. بعد از غنی سازی محیط بلغ برنتنی محیط کشت ریان با سرم در گا )33( گسفند )23( imprinting نامناسب ژن منجر به افیش طل آبستنی زن تلد میشد. بررسی های دقیق هر بسته از مکمل پرتئینی مدیریت کیفی در نظر داشتن زمان بهینه مصرف هر بسته همانطر که پیشتر م بحث قرار گرفت برای جلگیری کاهش خطر همراه با مکمل سازی محیطهای کشت با مکمل درشت ملکل الزم ضرری میباشد. استفاده از مکمل درشت ملکل ساده برای محیط کشت که ایمن با ثبات به خبی آزمن شده است در قیاس با استفاده از مکملهای تایید نشده دقیق بررسی نشده حتی اگر از نظر بالقه تانایی بیشتری دا ترجیح داده میشد.)21( sex chromosome dosage 411

111 شکل 2-9. نسبت جنسی نر به ماده برای تلد زنده از ریانهای کشت شده در محیط غنی شده با که ریانها در محیط غنی شده با HSA به تنهایی کشت داده میشند متفات خاهد بد HSA یا.HSA+SSS جنسیت برای تلد زنده زمانی خالصه یادداشتها هم اکنن مشخص شده است که بیشتر محیطهای کشت ریان هنز با استفاده از پرتئینها غنی میشند تا اینکه از درشت ملکلهای غیرپرتئنینی یا محصالت پرتئنینی نترکیب استفاده نمایند. به نظر میرسد که HSA معملترین مکملی است م استفاده قرار میگی بعد از آن مکملهایی مانند مکملهای حاصل شده از ریه گلبلین غنی شده از جمله SSS Scientific) LGPS (Life global) SPS (SAGE) (Irvine دیگر مکملها قرار دارند. تجربیات حاصل از مطالعات کلینیکی افیش آگاهی از ایمنی تنظیم کنترل محیط کشت ریان در بار جهانی ربه تسعه IVF پیشنهاد مینماید که مکمل سازی محیط کشت با سرم همکشتی ریان با سللهای سماتیک به گذشته تعلق داشته است. اضح است که مکمل- های غیرپرتئینی تعریف شده یا پرتیینهای نترکیب به عنان جایگزینهای ارزشمندی در طل مدت ریه دسترزی ریان گامتها محسب میشند اما مکملهای پرتیینی با منشا زیستی هنز م ترجیح برای استفاده در هر نع کشت طالنی ریان به حساب میآیند. فهم اهداف منظر استفاده از درشت ملکلهای مکمل در محیط کشت ریان در طل هر یک از مراحل ریه IVF در آزمایشگاهها باید به ما در انتخاب ایمنترین با ثباتترین درشت ملکل برای هر مرحله کمک کند همچنین باید منجر به انتخاب محصلی شد که تانایی ایجاد بهترین نتایج کلینیکی را دارا میباشد. هر بسته از پرتئینهای مکمل با منشا زیستی منحصر به ف میباشد اگر حتی تسط یک شرکت تلید شد. عملک تغذیهکننده ریان هربسته از مکملهای پرتئینی با منشا زیستی ممکن است که در بسته جدید تکرار نشد چن ریه آماده سازی پرتئینها کامال یکسان نمیباشند. هربسته از مکملهای پرتئنی به طر معمل حای ماد مضر هرمنهای ناخاسته آلدگیهای پرتیینی مخصص به آن بسته میباشد. مکملهای درشت ملکل استفاده شده در محیط کشت ریان باید به عنان یکی از بزرگترین عامل خطر آفرین در آزمایشگاههای IVF در نظر گرفته شد ممکن است در ایجاد نقصان در نتایج کلینیکی دخیل باشد ; بنابراین الزم است که برنامههای کیفی تفصیلی تکین یافته این رشها باید به گنهای باشند که به طر یژه به سمت شناسایی درشت ملکلهای ایمن برای کشت ریان منجر حرکت کند. قتی در حال بررسی یک منبع بالقه درشت ملکل برای افزدن به محیط کشت ریان هستیم حضر ماد تانایی تغذیهکنندریان همچنین غیاب تمایالت برای برز اثرات سمی برای ریان باید در نظر گرفته شد. در م هر بسته از مکمل درشت ملکلی که دارای خطرات جدید میباشد تمام تالش ها برای حصل اطمینان از کیفیت آن بسته برای تمام مدت زمان عمر آن تا فرارسیدن تاریخ انقضا باید به کار گرفته شد. مشخص شده است که اثرات سدمند مکملهای پرتئینی پیچیدهتر مانند SSS بعد از فعال شدن ژنم ریان بسیار مشهدتر میباشد ممکن است مربط به حضر فاکترهای رشد سدمند باشد. هر نع جمع بندی که برپایه مطالعات حال حاضر مطالعات آینده باشد بر پایه استفاده از درشت ملکلهای تعریف شده یا پرتئینهای نترکیب فقط در طل 3 رز ال کشت برنتنی ریان باشد باید م سال اقع شد زیرا این دسته از مشاهدات ممکن است برای دره طالنی کشت تا رسیدن به مرحله بالستسیست کارب نداشته باشند. با تج ه با شاهد ربه افیش در حمایت از غیرفعال شدن کرمزم جنسی احتمال

112 ابستگی حساسیت ریان کشت داده شده در شرایط برنتنی به جنسیت ریان نرخ پایینتر تلد زنده به دلیل شرایط غیر بهینه غنیسازی محیط کشت ریان بعد از رز 3 کشت ریان یکی از نتایج مستقیم از دست دادن ترجیحی ریانهای ماده میباشد. درهنگام تصمیم گیری برای انتخاب سیستم نع ماد به کار رفته در کشت برنتنی ریان نه تنها باید با اج تشکیل دهنده بخشهای دخیل در سیستم کشت تجه داشت بلکه میبایست به اکنش متقابل بین مکملدرشت ملکل محیط کشت نیز دقت کافی را مبذل نمد. استفاده از مکمل درشت ملکل ساده با سطح خطر پایین در غنیسازی محیط کشت یا محیطهای کشت از قبل غنی شده آماده مصرف در صرتی که برنامههای مدیریت کیفی تفصیلی برای بررسی مکمل پرتئینی پیچیده با احتمال برز خطر زیاد جد نداشته باشد از الیت باال برخار میباشد. سال اساسی هنز پابرجاست آیا ساده سازی ربه افیش مکملهای محیط کشت برنتنی ریان برای استفاده سیع در کلینیکها آماده است. این سال در مقابل این نکته است که آیا ما فقط در ابتدای پژهش برای تعیین فاکترهای رشدی هستیم که به صرت ابسته به مرحله با دقت باید به مجمعه کشت ریان اضافه شد اما محیط های کشت ریان تعریف شده قادر به رقابت یا کنار گذاشتن نتایج کلینیکی کننی با استفاده از فاکترهای رشدی که به صرت آلدگی مکملهای پرتئینی پیچیده ا محیط کشت شدهاند خاهند بد. 4. Steptoe PC, Edwards RG (4809) Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet 2(9193): Rock J, Menkin MF (4811) In vitro fertilization and cleavage of human ovarian eggs. Science 411(2399): McLaughlin L (4892) The Pill, John Rock and the Church. A biography of a revolution, 4st edn. Little, Brown and Company, Boston 1. Steptoe PC, Edwards RG, Purdy JM (4804) Human blastocysts grown in culture. Nature 228(3291): Dokras A, Sargent IL, Redman CW G (4883) Sera from woman with unexplained infertility inhibit both mouse and human embryo growth in vitro. Fertil Steril 21: Kemeter P, Feightinger W (4891) Pregnancy following in vitro fertilization and embryo transfer using pure human serum as culture and transfer medium. Fertil Steril 14(2): Staessen C, Van Den Abbeel E, Carle M et al (4881) Comparison between human serum and Albuminar-21 supplement for in vitro fertilization. Hum Reprod 3(3): Leveille MC, Carnegie J, Tanphaichitr N (4882) Effects of human sera and human serum albumin on mouse embryo culture. J Assist Reprod Genet 8(4): Weathersbee PS, Pool TB, Ord T (4883) Synthetic serum substitute (SSS): a globulinenriched protein supplement for human embryo culture. J Assist Reprod Genet 42(2): Pool TB (2111) Development of culture media for human assisted reproductive technology. Fertil Steril 94: Alberda AT, Van Os HC, Zeilmaker GH (4898) Hepatitis B virus infectie bij vrouwen behandeld met in vitro fertilisatie. Neederlands Tijdskrift Voor Geneeskunde 433: Klein R, Dumble LJ (4883) Transmission of Creutzfeldt-Jakob disease by blood transfusion. Lancet 314: Otani T, McDonough PG (4883) Earthquakes and prions. Fertil Steril 23: Wiemer KE, Cohen J, Amborskir GF et al (4898) In-vitro development and implantation of human embryos following culture on fetal bovine uterine fi broblast cells. Hum Reprod 1(3): Bongso A, Ng SC, Ratnam S (4881) Co-cultures: their relevance to assisted reproduction. Hum Reprod 3(9): Wiemer KE, Hoffman DI, Maxson WS et al (4883) Embryonic morphology and rate of implantation of human embryos following coculture on bovine oviductal epithelial cells. Hum Reprod 9(4): Ménézo YJR, Sakkas D, Janny L (4883) Co -culture of the early human embryo: factors affecting human blastocyst formation in vitro. Microsc Res Tech 32(4): منابع

113 49. Rieger D, Grisart B, Semple E et al (4883) Comparison of the effects of oviductal cell coculture and oviductal cell-conditioned medium on the development and metabolic activity of cattle embryos. J Reprod Fertil 413: Forsdahl F, Bertheussen K, Bungum LJ et al (4881) A study on extended culture time with embryo replacement at the morula and blastocyst stage. Hum Reprod 8: Barnes FL, Crombie A, Gardner DK et al (4883) Blastocyst development and pregnancy after in vitro maturation of human primary oocytes, intracytoplasmic sperm injection and assisted hatching. Hum Reprod 41: Behr B, Pool TB, Milki A et al (4888) Preliminary clinical experience with human blastocyst development in vitro without coculture. Hum Reprod 41(2): Dugan KJ, Shalika S, Smith RD et al (4880) Comparison of synthetic serum substitute and fetal cord serum as media supplements for in vitro fertilization: a prospective, randomized study. Fertil Steril 20(4): Laverge H, De Sutter P, Desmet R, et al (4880) Prospective randomized study comparing human serum albumin with fetal cord serum as protein supplement in culture medium for invitro fertilization (IVF). Hum Reprod 42 (41): Tucker KE, Hurst BS, Guadagnoli S et al (4882) Evaluation of synthetic serum substitute versus serum as protein supplementation for mouse and human embryo culture. J Assist Reprod Genet 43(4): Blake D, Svalander P, Jin M et al (2112) Protein supplementation of human IVF culture media. J Assist Reprod Genet 48(3): Bungum M, Humaidan P, Bungum L (2112) Recombinant human albumin as protein source in culture media used for IVF: a prospective randomized study. Reprod Biomed Online 1(3): Takenaka M, Horiuchi T (2110) Recombinant human albumin supports mouse blastocyst development and improves fetal development. Reprod Med Biol 2(1): Gardner DK, Lane M (4889) Culture of viable human blastocysts in de fi ned sequential serum-free media. Hum Reprod 43(Suppl 3): Ali J, Shahata MA, Al-Natsha SD (2111) Formulation of a protein-free medium for human assisted reproduction. Hum Reprod 43(4): Friedler S, Schachter M, Strassburger D et al (2110) A randomized clinical trial comparing recombinant hyaluronan/recombinant albumin versus human tubal fl uid for cleavage stage embryo transfer in patients with multiple IVFembryo transfer failure. Hum Reprod 22(8): Simon A, Safran A, Revel A et al (2113) hyaluronic acid can successfully replace albumin as the sole macromolecule in a human embryo transfer medium. Fertil Steril 08(2): Tanikawa T, Harada T, Ito M et al (4888) Globulins in protein supplements promote the development of preimplantation embryos. J Assist Reprod Genet 42: Meintjes M, Chantilis SJ, Ward DC et al (2118) A randomized controlled study of human serum albumin and serum substitute supplement as protein supplements for IVF culture and the effect on live birth rates. Hum Reprod 21(1): Richter KS (2119) The importance of growth factors for preimplantation embryo development and in vitro culture. Curr Opin Obstet Gynecol 21(3): Behboodi E, Anderson GB, BonDurant RH et al (4881) Birth of large calves that developed from invitro derived bovine embryos. Theriogenology 11: Hardy K, Spanos S (2112) Growth factor expression and function in the human and mouse preimplantation embryo. J Endocrinol 402: Lane M, Hooper K, Gardner DK (2114) Effect of essential amino acids on mouse embryo viability and ammonium production. J Assist Reprod Genet 49: Alvarez JG, Storey BT (4883) Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa. Mol Reprod Dev 12:

114 38. Hambiliki F, Ljunger E, Olof Karlström P et al (2118) Hyaluronan-enriched transfer medium in cleavage-stage frozen-thawed embryo transfers increases implantation rate without improvement of delivery rate. Fertil Steril 81(3): Graham MC, Partridge AB, Lewis V et al (4883) A prospective comparison of synthetic serum substitute and human serum albumin in culture for in vit ro fert ilization-embryo transfer. Fertil Steril 21(3): Rienzi L, Ubaldi F, Anniballo R et al (4889) Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 43(1): Ho JY, Chen MJ, Yi YC et al (2113) The effect of preincubation period of oocytes on nuclear maturity, fertilization rate, embryo quality and pregnancy outcome in IVF and ICSI. J Assist Reprod Genet 21(8): Guerif F, Cadoret V, Poindron J et al (2113) Overnight incubation improves selection of frozen-thawed blastocysts for transfer: preliminary study using supernumary embryos. Theriogenology 21(9): Gorrill MJ, Rinehart JS, Tamhane AC et al (4884) Comparison of the hamster sperm motility assay to the mouse one-cell and twocell embryo bioassays as quality control tests for in vitro fertilization. Fertil Steril 33(2): Claasens OE, Harrison KL (4888) Optimizing sensitivity of human sperm motility assay for embryology toxicity testing. In: Proceedings of the 44 th world congress on IVF and human reproductive genetics. Sydney, Australia 12. Pemble LB, Kaye PL (4802) Whole protein uptake and metabolism by mouse blastocysts. J Reprod Fertil 09: O Neil C (2113) The role of PAF in embryo physiology. Hum Reprod Update 44(3): Ammit AJ, O Neill C (4880) Studies of the nature of the binding by albumin of plateletactivating factor released from cells. J Biol Chem 202: O Neil C (4880) Ev idence for the requirement of autocrine growth factors for development of mouse preimplantation embryos in vitro. Biol Reprod 32: Paria BC, Dey SK (4881) Preimplantation embryo development in vitro: cooperative interactions among embryos and role of growth factors. Proc Natl Acad Sci USA 90(42): Hink JH, Hidalgo J, Seeberg VP et al (4830) Preparation and properties of a heat-treated human plas ma protein fraction. Vox Sanguinis 2(3): Ben-Yosef D, Yovel I, Schwartz T et al (2114) Increasing synthetic serum substitute (SSS) concentrations in P4 glucose/phosphate-free medium improves implantation rate: a comparative study. J Assist Reprod Genet 49(44): Mosley AK, Brouwer KL (4880) Heat treatment of human serum to inactivate HIV does not alter protein binding of selected drugs. Ther Drug Monit 48: Snyman E, Van der Merwe JV (4892) Endotoxin-polluted medium in a human in vitro fertilization program. J In Vitro Fertil Embryo Transfer 3: Mahani IM, Davar R (2110) Hyaluronic acid versus albumin in human embryo transfer medium. East Mediterr Health J 43(1): Gray CW, Morgan PM, Kane MT (4882) Puri fi cation of an embryotrophic factor from commercial bovine serum albumin and its identification s citrate. J Reprod Fertil 81: Fishel S, Jackson P, Webster J et al (4899) Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertil Steril 18: Nagata Y, Shirakawa K (4882) Setting standards for the levels of endotoxin in the embryo culture media of human in vitro fertilization and embryo transfer. Fertil Steril 23: Kimura K, Spate LD, Green MP et al (2113) Effects of d -glucose concentration, d -fructose, and inhibitors of enzymes of the pentose phosphate pathway on the development and sex ratio of bovine blastocysts. Mol Reprod Dev 02: Chang HJ, Lee JR, Jee BC et al (2118) Impact of blastocyst transfer on offspring sex ratio and the monozygotic twinning rate: a systematic review and meta-analysis. Fertil Steril 84(2):

115 24. Bermejo-Alvarez P, Rizos D, Lonergan P et al (2144) Transcriptional sexual dimorphism during preimplantation embryo development and its consequences for developmental competence and adult health and disease. Reproduction 414: Gutierrez-Adan A, Perez-Crispo M, Fernandez-Gonzalez R et al (2112) Developmental consequences of sexual dimorphism during preimplantation embryonic development. Reprod Domest Anim 14(Suppl 2): Holm P, Walker SK, Seamark RF (4882) Embryo viability, duration of gestation and birth weight in sheep after transfer of in vitro matured and in vitro fertilized zygotes cultured in vitro or in vivo. J Reprod Fertil 410: Pool TB, Martin JE (4881) High continuing pregnancy rates after in vitro fertilizationembryo transfer using medium supplemented with a plas ma protein fraction containing α and β globulins. Fertil Steril 24:

116 فصل 8 اج محیط کشت: آنتی اکسیدانها/کیالت کنندهها عملک سللی حفاظت از ریان در برابر آسیبهای اکسیداتی در طل مدت کشت برنتنی برای ادامه رند رشد زندهمانی ریان ضرری میباشد. تلید بیش از حد گنه اکسیژن فعال ) 403 (ROS به اسطه ماد مختلف مجد در محیط کشت برنتنی آغاز میشد بیشتر ریانها به طر طبیعی در شرایط درنتنی با این ماد ماجه نمیشند. برای جبران این نقیصه در محیط کشت آنتی اکسیدانها کیالت کنندهها معمال برای کنترل یا سرکب مین ROS تلید شده همزمان با تکین ریان م استفاده قرار میگیرند. اما درم مقدار مصرف زمان در معرض قرار دادن یا ترکیب مناسب آنتی اکسیدانها کیالت کنندهها در محیط کشت ریان بین محققان اتفاق نظر جد ندا. به منظر مشخص نمدن جزییات مربط به این جنبه از محیط شیمیایی دربرگیرنده ریان در شرایط برنتنی در این فصل به ارایه دانش مجد در م عملک تاثیر هر کدام از آنتیاکسیدانها یا کیالت کنندهها که معمال در محیط کشت ریان افزده میشند میپازیم مقدمه استرس اکسیداتی یکی از دغدغههای مهم برای تکین ریان میباشد. استرس اکسیداتی زمانی رخ میدهد که ملکل- های حای اکسیژن فعال که به آنها گنه اکسیژن فعال (ROS) میگیند به سطحی از غلظت میرسند که برای ایجاد آسیب- های عملکی ساختاری به DNA پرتئینها لیپیدها کافی میباشند )2 4( تلید ROS در طل مدت کشت برنتنی از تلید آن در شرایط درنتنی پیشی گرفته است دلیل این بیش تلید ROS در شرایط برنتنی عامل مختلف پراکسیدانی است که در محیط کشت حضر دارند )0(. معمال ROS مجد در دستگاه تلید مثل ماده شامل آنین سپراکسید پراکسید هیدرژن ین هیدرکسیل میباشند )8 9(. در شرایط برنتنی تلید این نع از ROS دیگر گنههای آن در ریان محیط کشت آن به اسطه قرار گرفته در معرض غلظت اکسیژن مجد در اتمسفر )%21 در شرایط مجد در اتمسفر در برابر 2-2 درصد در شرایط درن تنی( )41-42( نر )41 43( ینهای فلزی )43( نقصهای محیط کشت )40 42( شدت مییابد. شکل 4-8. رادیکال هیدرکسیل به اسطه اکنش Haber-Weiss از پراکسید هیدرژن آهن تلید میشد. این اکنش با ferrous ین ferric تسهیل میشد. الین مرحله در این اکنش احیا ینهای ferric به ینهای ferrous به اسطه سپراکسید )تلید کننده اکسیژن( میباشد. اکنش Fenton در سمت راست نشان داده شده است دمین مرحله در اکنش Haber-Weiss میباشد که در آن پراکسید هیدرژن به رادیکال هیدرکسیل تبدیل میشد درحالی که ین ferrous به ین ferric اکسید میشد. به طر یژه ینهای فلزی از جمله آهن مس در محیط کشت ارتقا دهنده اکنش Haber-Weiss اکنش Fenton میباشند که بیشترین مقدار ROS از نع رادیکالهای هیدرکسیل را تلید میکنند )شکل 4-8( )49(. به عاله ینهای ferrous آد میتانند اکسیداسین لیپیدها را که به اسطه ROS آغاز میشد به طر مستقیم افیش دهند )48(. بیشتر ماد شیمیایی م استفاده در آزمایشگاهها دارای مقادیر کم آهن دیگر فلت میباشند. البته مقدار این فلت به اندازهای میباشد که به منظر تسهیل تلید novo) 4/2-48/1( µm( ROS (de کامال در محیطهای کشت در دسترس میباشند )21 Reaxctive Oxygen Spiceis 441

117 49(. زمانی که این ماد حای فلت عناصر کمیاب به محیط کشت افزده شند آهن منجر به افیش سطح پراکسیدهیدرژن میشد همچنین منجر به افیش نرخ مرگ زدهنگام ریان یا متقف شدن تکین ریان میشد )24(. افزدن ROS یا اجی تلید کننده ROS مستقیما به محیط کشت نیز چنین تاثیری را دربر دا )1(. یک ارتباط مستقیم بین غلظت پراکسید- هیدرژن آپپتزیس یا قطعه قطعه شدن DNA در ریان مش کشت داده شده در شرایط برنتنی مشخص شده است )22( ریانهای مش کشت شده در شرایط برنتنی پراکسیدهیدرژن بیشتری از ریانهایی که در شرایط درن تنی هستند تلید میکنند )43 2(. به طر سیعی پذیرفته شده است که استرس اکسیداتی در طل مدت کشت برنتنی منجر به برز نقصان در تکین ریان میشد. د خاناده ملکلی شامل آنتیاکسیدانها کیالت کنندهها به عنان عاملی شناخته شدهاند که با ایجاد سد محافظت کننده در برابر آسیبهای القا شده تسط ROS از ریانها در برابر آسیبهای بالقه محافظت به عمل میآرند. آنتی اکسیدانها به طر سیعی به عنان ملکلهایی پذیرفته شدهاند که قادر به ممانعت از اکسیداسین سایر ملکلها می- باشند. با در نظر داشتن تکین ریان فعالیت آنتیاکسیدانی در برخی آنزیمها اسیدهای آمینه یتامینها حاملین انرژی اج دارای تیل مشاهده میشد. آنتی اکسیدانها یا به صرت آنزیمی یا غیر آنزیمی عمل مینمایند عملک غیرآنزیمی آنها به اسطه عملکن به عنان ماد قابل اکسید شدن در برابر ظرفیت اکسیداسین ROS قرار گرفته این ظرفیت را کاهش می- دهد. آنتی اکسیدانهای آنزیمی شامل سپراکسید دیسمتاز (SOD) کاتاالز گلتاتین پراکسیداز (GPx) میباشند درحالی که برخی آنتیاکسیدانهای غیر آنزیمی عبارتند از گلتاتین (GSH) س سی تامین (CSH) تائرین هایپتائرین یتامینها پیرات میباشند. در بسیاری از ما عملک یک آنتیاکسیدان با بسیاری دیگر از آنتیاکسیدانها جفت میشند )شکل 2-8(. SOD با رادیکالهای سپراکسید اکنش میدهند تا پراکسیدهیدرژن تلید نماید این پراکسیدهیدرژن با استفاده از کاتاالز GPx به محصالت غیرسمی تجزیه میشد. GSH به عنان یک ماده ضرری برای اکنش GPx ایفای نقش میکند این عاله بر نقش محری غیر آنزیمی دفاعی GSH بر علیه ROS در ریان است )23-22(. CSH رادیکالهای هیدرکسیل را کاهش میدهد همچنین منجر به افیش ساخت GSH میشد افیش GSH را با تبدیل جزیی GSH اکسید شده به GSH احیا انجام میدهد )20(. CSH به نبه خد زمانی که به سیله رادیکالهای هیدرکسیل اکسید میشد به هایپتائرین تبدیل میشد )29( بعد از اینکه هایپتائرین با ROS اکنش داد به تائرین تبدیل میشد. تائرین آلدهیدها را که از محصالت 402 نهایی سمی پراکسیداسین لیپیدها تحت تاثیر ROS میباشند را خنثی مینماید )28(. تیکسین یک پرتئین کس کچک میباشد که پیندهای دیسلفید ماد پرتئینی را احیا مینماید )31(. در آخر یتامین C لیپپرتئینها را تعدیل نمده تا مقامت آنها را در برابر اکسیداسین القا شده به اسطه فلت را افیش دهد همچنین از برز آسیب به DNA ممانعت به عمل آ یتامین E به عنان یک جمع کننده محلل در چربی برای ROS شناخته میشد پیرات کاهنده پراکسید هیدرژن میباشد. کیالت کنندهها ملکلهایی هستند که حداقل دارای د گره ملکلی با بار منفی میباشند. این یژگی به کیالت کنندهها این امکان را میدهد که با ینهای فلزی که دارای چندین بار مثبت میباشند ترکیب شده مجمعه یا کیالت را تشکیل دهند. گرههای دارای بار منفی معمال دارای اکسیژن سلفر یا نیترژن میباشند که در طل ملکل فضایی ایجاد میکنند که این فضای متصل شنده به فلت یک ساختار دایرهای با حداقل یک پیند کاالن ایجاد خاهد نمد )شکل 3-8(. پایدارترین حلقه کیالت کننده آنهایی هستند که دارای 3 تا 0 پیند یا نقطه برای اتصال بین کیالت کننده ین فلزی میباشند )34(. لغت کیالت از لغت ینانی Chele به معنی پنجه مشتق شده است. فرایند تشکیل کیالت اهداف فیزیلژی متفاتی را برعهده دا معمال باعث تغییرات در محتای ین فلت میشند. یکی از تغییراتی که در اثر فعالیت کیالت کنندهها ایجاد می شد با اهداف این فصل ارتباط یژه دا این است که فرایند تشکیل کیالت منجر به محصر شدن ینهای فلزی میشد این فرایند تا حدی منجر به جلگیری از تانایی شرکت این ینهای فلزی در اکنشهای Fenton Haber-Weiss میشد. این د اکنش مسئل تلید تکثیر ROSمیباشند. به عاله کیالتها عملک تشکیل بسیاری از آنزیمیها را تسهیل نمده همچنین در نقل انتقال فلت داخل سللی دخیل میباشند. تعداد زیادی از کیالت کنندهها چه به صرت طبیعی چه به Thioredoxin 444

118 صت ملکلهای مصنعی شناسایی شده اند. برخی از این کیالت کنندهها که مربط به کشت برنتنی ریان هستند شامل DFO 409 EDTA 400 سیترات ترانسفرین NTA 494 ETGA 491 EDDA 408 DTPA 492 هستند. همچنین باید در نظر داشت داشت که تمام اسیدهای آمینه تا حددی تانایی کیالت نمدن فلت را دارا میباشند )32 34(. شکل 2-8. بسیاری از آنتی اکسیدانها به طر همراه با یکدیگر به منظر کاهش یا خنثی سازی ROS عمل میکنند. آنچه که در اینجا نمایش داده شده است شبکهای از اکنشهای متقابل بین SOD )سپراکسید دیسمتاز( GPx )گلتاتین پراکسیداز( CAT )کاتاالز( سیستامین هایپتائرین تائرین را نشان میدهد. ROS با رنگ قرمز نشان داده شده است. پیکانهای خط چین که از سیستامین خارج شدهاند نشان دهنده این هستند که این ملکل در ساخت گلتاتین (GSH) دخیل میباشد. شکل 3-8. فعالیت کیالت کننده ساختار ملکلی EDTA برای مشخص نمدن سازکار عملک کیالت کنندهها نمایش داده شده است. EDTA دارای 1 گره اسید کربکسیلیک د گره آمین با یک زج الکترن تنها میباشد. این 2 گره اجازه تشکیل 2 نقطه اتصال با فلز را میدهند. تجه داشته باشید که ساختار حلقهای زمانی تشکیل میشد که EDTA به فلز صل شد. این برای تمام کیالتها طبیعی محسب شد. حرف M قرمز رنگ نشان دهنده فلز میباشد خط چین قرمز مشخص کننده پیند بین کیالت کننده فلز میباشد. آنتیاکسیدانها کیالت کننده ها به طر طبیعی در ریان پستانداران ایداکت رحم این مجدات حضر دارند. در این محیط است که سلل تخم بارر شده به بالستسیست تکین مییابد بالستسیست مرحلهای از تکامل ریان است که در ریه کشت برنتنی ریان خاسته نهایی محققین دستیابی به این مرحله میباشد. بنابراین اگرچه محیط درنتنی قابل جایگزین شدن با شرایط برنتنی نیست به دست آن دانش در م نیازمندیهای تکین ریان الیه هشمندان به نظر میرسد. نشان داده شده است که GPx به عنان یکی از آنتی اکسیدانهای آنزیمی در ایداکت گا مجد میباشد این آنتی اکسیدان ایزفرم- های متفاتی دا که تمایل به حضر در زیر بخشهای مختلف ایداکت را دا )33(. فعالیت SOD کاتاالز در مایع ایداکت گا خک انسان )31( در مش خرگش )32 33( گرش شده است. یتامین C پیرات در مایع ایداکت انسان مش به ترتیب شناسایی شده است )39 30(. درآخر هایپتائرین تائرین به عنان رایجترین اسیدهای آمینه در مایع ایداکت گا گسفند خک خرگش مش شناخته شده است )38(. در مایع رحمی تائرین اسید آمینه غالب در انسان گاها خرگش- ها میباشد )11(. حداقل 41 اسیدآمینه دیگر شامل گلتامین گلیسین آالنین در مایع ایداکت رحم پستانداران شناسایی شده 493 است )11(. همچنین گرش شده است که سیستآمین در تراشات دستگاه تناسلی مایع فلیکلی گاها خکها سگها ethylenediaminetetraacetate desferrioxamine ethylenediaminediacetate ethyleneglycolbistetraacetate nitrilotriacetate Diethylenetriaminepentaacetic acid Cysteamine 442

119 حضا اما در مایع ایداکت حضر این اسیدآمینه به اثبات نرسیده است )14(. گلتاتین به عنان یکی از حیاتیترین آنتی- اکسیدانهای درن سللی در ریان پستانداران شناخته شده است )23-22( همچنین ریان ابتدایی دارای نسخههای ترجمه شده ژنی برای آنزیمهای SOD کاتاالز GPx میباشد )12(. عاله بر اسیدهای آمینه کیالت کنندههایی مانند ترانسفرین سیترات در دستگاه تناسلی پستانداران ماده یافت میشد. به یژه ترانسفرین یکی از فرانترین پرتئینها در مایع ایداکت می- باشد )13(. همچنین سیترات در ریانها یافت میشد مقدار سیترات در بالستسیست تا 42 برابر مقدار آن در ریان مراحل ابتداییتر میباشد )13 11(. فلت نیز در محیط فیزیلژی در برگیرنده ریانها حضر دارند. حضر ینهای پتاسیم کلسیم منیزیم ری در مایع ایداکتی گا گسفند خرگش انسان اسب گرش شده است )12(. همچنین بهنظر میرسد مقادیر بسیار کمی از سایر فلت سنگین در شکل نکلئتیدهای پرتئینی GTP) (ATP, یا ترکیبات سیترات در دستگاه تلید مثلی حضارند )10(. محدد نمدن سطح ROS در طل مدت کشت برنتنی ریان به طر سیعی به عنان یکی از ریههای محافظت کننده از ریان در برابر محیط برنتنی در نظر گرفته شده است. مطالعات انجام شده در م محیطهای استفاده شده در کشت برنتنی ریان انسان شباهتهایی را نشان داده است اما هنز تفاتهایی در این زمینه جد دا این تفات در م افزدن اجیی است که اثرات آنتی اکسیدانی کیالت کنندگی آنها اثبات شده یا در این م به عنان گزینههای محتمل در نظر گرفته میشند. جدل 4-8 به طر خالصه مین افزدن کل آنتی اسیدانها به محیطهای کشت D3-D3 D4-D3 -D4 D3 را به ترتیب نشان میدهد. حضر هر یک از اجیی که در زیر آمده است به اسطه شک کن به فعالیتی که در پرانتز برای آن ماده ذکر شده است شناسایی شده است: تائرین )آنتیاکسیدان( سیترات )کیالت کننده( یتامینها )آنتیاکسیدان( گلتاتین )آنتیاکسیدان( سیستئین/سیستین )پیش ساز تلید آنتیاکسیدان( پیرات )آنتی اکسیدان( پرتئینهای سرم )آنتیاکسیدان( اسیدهایآمینه )کیالت کننده( EDTA )کیالت کننده(. تجه به این نکته بسیار مهم است که تمامی این ماد افزده شده به محیطهای کشت با قصد مشخص مثال عملک به عنان آنتیاکسیدانها یا کیالت کنندهها به محیط کشت افزده نمیشند بلکه گاهی اقات برای سایر اثرات شناخته شده به محیط کشت افزده میشند. این م به یژه در زمانی که پیرات یتامینها اسیدهای آمینه مکملهای سرم به محیط کشت افزده میشند قابل اشاره است. حضر هر یک از این ماد در زیر به بحث بررسی کشیده شده است گرشهایی که ذکر خاهند شد بر پایه تاریخچه شاهد برای افزدن این ماد به محیط کشت همچنین سازکارهای عملک آنتیاکسیدانی/کیالت کننده در هر می که اطالعات علمی در م آن مجد باشد ارایه شدهاند. ابتدا به بررسی آنتی اکسیدانها بعد عامل کیالت کننده میپازیم. برخی آنتیاکسیدانها کیالت کنندههایی جد دارند که هنز در کشت برنتنی ریان انسان م استفاده قرار نگرفته اند اما در م استفاده در کشت برنتنی ریان حیانات م بررسی قرار گرفته اند. این ماد نیز م بحث بررسی قرار خاهند گرفت به گنهای که ارایه کننده سطح دانش مربط به آنها احتمال یا عدم احتمال افزدن آنها به محیط کشت ریان انسان در آینده باشد. جدل 4-8. نسبتهای ماد با فعالیت آنتی اکسیدانی کیالت کننده که در محیط کشت ریان انسان افزده میشد Taurine a Vitamins b Glutathione Cysteine cystine EDTA Sodium citrate D4-D3 0 / 9 3 / 9 4 / 8 3 / 9 0 / 8 1 / 9 D3-D3 3 / 9 0 / 8 2 / 8 0 / 0 4 / 8 2 / 9 D4-D3 1 / 2 1 / 2 1 / 2 2 / 2 2 / 2 1 / 2 a برای هر د محیط D4-D3 D3-D3 4/9 از هر د ماده تائرین هایپتائرین تشکیل شده است b برای محیط کشت D4-D3 یکی فقط یتامین C اضافه شده یکی یتامین B یکی یتامینهیا یتامین B8 B2 B3 یک یتامین C فقط یک یتامین B3 B3 B8 B2 برای محیط کشت D3-D3 چهار 449

120 2-8. آنتیاکسیدانها تائرین هایپتائرین هم اکنن تائرین در نسبت بزرگی به محیط کشت برنتنی ریان انسان برای طل مدت تکین پیش از النه گزینی افزده میشد. %99 (D4-D3) %23 (D3-D3) از محیطهای کشت حای تائرین میباشند با نسبتی که تا %99 برای محیط کشت (D3-D3) افیش مییابد. این افیش قتی به قع میپیندد که سیستئین/سیستسن به محیط کشت افزده شد )این اسیدهای آمینه پیشساز متابلیکی تائرین هستند(. این مسئله مربط به این نکته است که د محیط کشت تجاری عاله بر تائرین حای هایپتائرین میباشند. همچنین هایپتائرین میتاند از سیستئین ساخته شد همچنین این ماده پیشساز متابلیکی تائرین نیز میباشد )19(. همچنین این مسئله به تانایی ریان در باشت تائرین نیز مرتبط است )18(. مکملسازی با استفاده از تائرین در طل زمان کشت ریان منجر به بد تکین بالستسیست تعداد سللهای ریان در مش )34 31( در خرگش )32( با در نظر داشتن نتایج مشابه برای هایپتائرین در ریان گا شده است )14(. همچنین مشخص شده است که هایپتائرین به عنان جزیی ضرری از محیط کشت برنتنی ریان اجازه تکین برنتنی ریانهای همستر را میدهد )33(. اما مطالعهای در ریان 1-2 سللی انسان نشان داده است که تکین به مرحله بالستسیست زمانی که محیط کشت با تائرین یا گلتامین غنی شد با هم قابل مقایسه می باشند در این مطالعات استفاده هم زمان از تائرین گلتامین منجر به افیش بازده در مقایسه با استفاده انفرادی از این ماد نشد )31(. به طر مشابه نشان داده شد که افزدن تائرین )با یا بدن گلتامین( تکین ریان مش از مرحله یگت تا بالستسیست را تحت تاثیر قرار نداد )33(. شاید دلیل این مشاهدات مربط به این نکته باشد که این د مطالعه که اثر خاصی از افزدن تائرین را نشان نداد هر د به نعی از دیگر گرشها مج میباشند دلیل این تفات مربط به تفات منشا زمان در معرض قرار دادن ریانها باشد. در مطالعه انجام شده ری مش یگتهای بارر شده در بدن مش در ادامه از بدن خارج شده در معرض محیط کشت قرار گرفته )33( در مطالعه انجام شده در انسان در معرض قرار دادن ریان با تائرین تا 13 ساعت بعد از لقاح انجام نگرفته است )31(. درحالی که بیشتر مطالعات با ریک غنیسازی محیط کشت از مرحله یگت تا بالستسیست از تائرین استفاده نمدهاند همچنین اثرات ابسته به زمان تائرین در تکین پیش از النه گزینی ریانهای تلید شده در شرایط برنتنی به طر مستقیم در مش م آزمن قرار گرفته است. زمانی که اثرات غنی سازی با تائرین را در شکلگیری بالستسیت میآزماییم استفاده از تائرین در 2 رز ابتدایی بعد از بارر شدن به گنهای که ریان در نزدیکی مرحله 2 سللی باشد بیشترین اثرات مثبت خد را به اثبات رسانده است )34(. همچنین نشان داده شده است که در م ریان همسترغنیسازی با هایپتائرین برای تکین ریانهای برنتنی در مقایسه با ریانهایی که در شرایط درن تنی بارر شدهاند اثرات مفید بیشتری دا )33(. شاهد به دست آمده تا به امرز پیشنهاد میکند که اهمیت تائرین هایپتائرین به یژه در مدت انجام لقاح برنتنی الین تقسیم کلیاژ دارای اهمیت میباشد )40(. درحالی که تائرین هایپتائرین میتانند به عنان جمع کننده رادیکالهای اکسیژن عمل نمایند )30 32( فقط شاهد غیر مستقیمی مبنی بر اینکه این سازکار در ریان به قع میپیندد جد دا. د مطالعه در گا به انجام رسیده است که نشان میدهد نرخ تشکیل بالستسیست برای ریانهای کشت شده با تائرین هایپتائرین در شرایطی که استرس اکسیداتی ربه افیش بده )در معرض تلید کنندههای رادیکالهای آزد قرار بگی یا استفاده از %21 اکسیژن در برابر %3 از مرحله 9-1 سللی تا مرحله بالستسیست( بد یافته است )38 39(. از نکات قابل تجه دیگر عملکهای محافظتی مفرض برای تائرین در تکین ریان میباشد درمیان این عملکها میتان به انجام ظیفه به عنان اسملیت در برخ با عدم تعادل اسمزی اشاره نمد )21(. همچنین میتان در نظر گرفت که تائرین به عنان یک کیالت کننده عمل میکند )32(. مطالعات آتی در م ساز کار دقیق عملک تائرین هایپتائرین )با این دیدگاه که به عنان آنتی اکسیدان عمل میکنند( میتاند منجر به گشده شدن دریچههای نین در م نیاز به این د ماده باشد. اینکه آیا هایپتائرین نسبت به تائرین دارای ارجحیت میباشد یا خیر نیز در نع خد ارزش بررسی مطالعه را دا. برتری هایپتائرین نسبت به تائرین محتمل میباشد زیرا هایپتائرین نسبت به تائرین از منظر فعالیت آنتیاکسیدانی مثرتر است )32(. به لطف غلظتهای باالی تائرین هایپتائرین در مایع ایداکت 441

121 رحم اثرات مثبت کلی در مطالعات تجربی به نظر میرسد که افزدن این د ماده در محیطهای کشت کننی الزم میباشد. اگرچه تمام مطالعات میای این غنیسازی را تایید نکهاند )شاید به دلیل اکنش متقابل با سایر اج محیط کشت باشد(. همچنین آیا پیشسازهای سیستئین افزده شده به محیط کشت اجازه ساخت تائرین به مقدار کافی را میدهد در نتیجه آیا منجر به برز تانایی محافظتی خاهد شد به گنهای که در بررسی مستقیم شایستگیهای ریان قابل مشاهده باشد. شایان ذکر است که دامنه غلظت های تائرین هایپتائرین که تاکنن م بررسی قرار گرفته است بین 1/4-31 mm برای هایپتائرین 1/4-41 mm برای تائرین بده است. درحالی که تائرین هایپتائرین اندازهگیری شده در مایعات ایداکتی )مش گا میش خک خرگش( به ترتیب در دامنه 1/ mm 1/43 )31 1/29 mm 38( قرار دا اثرات تائرین هایپتائرین در شرایط برنتنی فقط زمانی برز میکند که مقدار بیش از 1/3 mm هایپتائرین یا مقادیر بیشتر از 4 mm تائرین به محیط کشت افزده شد. همچنین برخی مطالعات نشان دادهاند که بیشترین اثر مفید زمانی حاصل شده است که غلظتهای حد متسط در مطالعات م سنجش قرار گرفته بدند mm( 1/3-4 هایپتائرین در گا در مطالعه انجام شده تسط Guyader-Joly همکاران )14( 4 mm هایپتائرین در مطالعه انجام شده تسط Barnett )33((. Bavister برای تائرین اثرات قابل مقایسه برای غلظتهای 2/3-41 mm در خرگش )32( بیشترین میا برای ریان مش زمانی به دست آمده که مقدار تائرین بین 41 mm 3 بده است )31( همچنین تغییرات مشابه در گا با استفاده از غلظتهای 41 mm 0 تائرین گرش شده است )39(. به هرحال تن ها محیط کشت تجاری که اطالعات مربط به غلظت تائرین آن در دسترس می- باشد محتای 1/4 mm یا 1/13 تائرین میباشد این مقادیر هر د پایینتر از مقادیری است که اثرات مثبت آن با آزمنهای برنتنی تاکنن به اثبات رسیده است میباشد. اما این مقادیر همچنان در دامنه غلظتهای فیزیلژی مجد در ایداکت می- باشند. جالب تجه است که غلظتهای تائرین به یژه در مایع رحمی انسان باال میرد mm( 1-42 بسته به مرحله چرخه قاعدگی( )11(. با در نظر گفتن تمام جانب باید بررسیهای بیشتری جهت تعیین غلظتهای بهینه تائرین هایپتائرین استفاده شده برای غنیسازی محیط کشت برنتنی همچنین تعیین زمانهای مختلف که این مقادیر در طل دره تکین پیش از النه گزینی میبایست به محیط کشت افزده شد به انجام برسد یتامین C E چندین محیط کشت جد داد که حای یتامینها میباشند برخی از این محیطهای کشت فقط حای یک یتامین برخی حای چندین یتامین میباشند. افزدن یتامین C به محیط کشت ارتباط مستقیم با این فصل دا )یا اسید اسکربیک( زیرا یتامین C در حقیقت یک آنتیاکسیدان قی است. قتی که برای مدتی از زمان ریانهای مش به اسطه حضر منبع برندی ROS تحت استرس قرار میگیرند ریانها از مکملهای یتامینی افزده شده به محیط کشت بهره میبرند در این میان نقش یتامین C محافظت علیه کاهش القا شده در تشکیل بالستسیست میباشد یتامین E با ظرفیت کمتری این عمل را 491 انجام میدهد )24(. Tarin همکاران )22( دریافتند که در ریانهای انسان غنیسازی محیط کشت با آسکربات در زمان لقاح تکین ریان تا رز 3 هیچ اثر مثبتی ندا )چه در محیط کشت ساده باشد چه در محیط کشت پیچیده که حای آهن مس است(. این مطالعه فقط یک غلظت از آسکربات را م بررسی قرار داده بد )مشابه به سطح مجد در مایعات بدن( یک غلظت هم که مشابه مقدار مجد در مایعات بدن در زمان تکین قبل از متراکم شدن بالستسیستها بده است م بررسی قرار گرفته بد. زمانی که ریانهای همستر در شرایط گازی حای %3 اکسیژن در محیط کشت تعریف شده فاقد پرتئین کشت داده شدند نیز هیچ تاثیری از افزدن یتامین 41( µm( C در کلیاژ تشکیل بالستسیست مشاهده نشد )23(. به طر معمل یتامین (α-tocopherol) E به فرمالسین محیط کشت ریان انسان افزده نمیشد. به هر ری یتامین E نیز دارای فعالیت آنتیاکسیدانی میباشد بسیاری از مطالعات انجام شده در حیانات هیچ اثری از فعالیت مثبت این یتامین به عنان آنتیاکسیدان را نتانستند اثبات کنند. در گا تکین بالستسیست اندازه ریان بعد از انتقال به رحم پذیرنده در شرایطی که محیط کشت ascorbate 445

122 برنتنی در مدت کشت با استفاده از 411 µm یتامین E به عنان مکمل غنی شده بد افیش یافته است )21(. در طل مدت کشت ریان گسفند α-tocopherol )به طر یژه در غلظت 211( µm منجر به بد نرخ کلیاژ مرال تشکیل بالستسیست شده است. این بد به همراه افیش در تعداد سللهای بالستسیست بد که به مین قابل تجهی به قع پیست. جالب این که این اثرات مثبت α-tocopherol در کشت ریان گسفند درحالی که شرایط کشت به گنهای بد که حای %21 اکسیژن بد نه کشت قرار گرفته در شرایط گازی حای %3 اکسیژن قابل مشاهده بده است )23(. به عاله آسیب- های ا شده به DNA در ریانهایی که با 211 µm یتامین E کشت داده شده بدن در مقایسه با کشت فاقد یتامین E کاهش یاقته است )%21 اکسیژن(. در خک ریانهایی که در محیط کشتی که در شرایط گازی حای %21 اکسیژن است کشت داده شده اند 31 µm یتامین E منجر به افیش نرخ تشکیل بالستسیست افیش تعداد سللهای بالستسیست کاهش مقدار پراکسید هیدرژن در ریان 2-1 سللی کاهش آسیبهای اه به DNA در مرحله 9-42 سللی ریانها در مقایسه با گره کنترل شده است )22(. اثرات مثبت مشابهی از افزدن یتامین E به محیط کشت ریانهای بفال در تکین ریان پیش از النه گزینی در محیط برنتنی به ثبت رسیده است )20(. برای ریانهایی که با استفاده پراکسیدانهای شیمیایی با منشا برندی تحت استرس قرار میگیرند ریانهای مرحله مرالی گا زمانی که در معرض Trolox 111µM یک آنالگ قابل حل در محیط آبی میباشد قرار میگیرند افیش مشخصی در نرخ تکین بالستسیست را نشان میدهند ( با افیش در تشکیل هچ شدن تعداد سللهای بالستسیست( )29(. با در نظر داشتن تمامی این ما مطالعات تجربی در مدلهای حیانی از برخی اثرات مفید کشت ریانها در حضر یتامین C یا E حمایت میکنند. این مطالعات همچنین نکات قابل تجهی در م احتیاطهای یژه در استفاده از این د یتامین در محیط کشت را بیان میکنند. الین نکته احتیاط آمیز این است که تضادی در غنیسازی محیط کشت با استفاده از یتامین C E در شرایط خاص )حضر فلت قابل تبدیل به ین مثبت مانند آهن( جد دا در این شرایط خاص این یتامینها به عنان عامل پراکسید کننده عمل خاهند نمد )28-04(. با تجه به این نکته Olson )21( Seidel افزدن EDTA به عنان کیالت کننده به محیط کشت به همراه یتامین C E را م آزمن قرار دادند درحالی که فرض بر این بد که افزدن EDTA منجر به تقیت اثرات مفید غنیسازی با یتامینها میشد )شاید به اسطه ممانعت از برز خطر فعالیت پراکسیداسین انجام شده به سیله یتامینها( نتایج این مطالعه هیچ گنه بدی در رند تشکیل بالستسیست گای را نشان نداد. این یافته در تضاد با نتایج به دست آمده از غنیسازی محیط کشت با EDTA بدن یتامینها بد )02( بنابراین میتان اینگنه استنباط ک که بین یتامینهای C E EDTA اکنش متقابل جد دا. فهم اثرات غنیسازی محیط کشت با یتامین C به نظر میرسد که بسیار پیچیده است به یژه با تجه به یافتههای اخیر در زمینه کشت سللهای سماتیک که نشان دهنده این نکته است که یتامین C دارای فعالیت دگانه میباشد )به عنان آنتی اکسیدان یا پراکسیدان( در حقیقت فعالیت یتامینC بستگس به عامل متعددی دا از جمله غلظت زمان مکان سللها )04(. دمین نکته این است که بین یتامین C یتامین E اکنشهای متقابل شناخته شدهای جد دا یکی از این اکنشها شامل بازتلید tocopherol از رادیکالهای tocopheroxyl به سیله یتامین Cمیباشد )رادیکال tocopheroxyl زمانی که یتامین E مشغل جمع آری رادیکالهای اکسیژن آد میباشد تلید میشد(. بنابراین مطالعات زیادی به بررسی اثرات سینرژیسم مجد بین این د یتامین در زمانی که محیط کشت ریان با هر د این یتامینها غنی شده باشد پاخته است. نکته حایز اهمیت این است که Olson )21( Seidle اثرات مخرب غنی نمدن محیط کشت ریان گا با هر د یتامین C E )در غلظت 411( µm را به ثبت رسانده اند. افیش در تعداد سللهای آپپتز شده بالستسیستهای ریانهای خک که در محیط کشت غنی شده با هر د یتامین C E )در غلظت 411( µm کشت داده شدهاند مشاهده شده است )03(. در اسپرم انسان غنیسازی به سیله هر د یتامین C E منجر به القا آسیبهای ا شده به DNAمیشد که مشابه آسیبهای ا شده به DNA بعد از قرار گرفتن در معرض H 2 O 2 میباشد اما با این جد مقدار ROS تلید شده در اثر قرار گرفتن در معرض H 2 O 2 کم میباشد )01(. کم بد میای اضافی در زمان غنیسازی با استفاده از هر د یتامین به طر همزمان لزما به دلیل فعالیت پراکسیدانی این یتامینها نمیباشد در حقیقت شاید دلیل این مسئله سایر ساز کارهایی باشد که به اسطه حضر 446

123 همزمان این د یتامین فعال میشد. احتیاطهای ذکر شده در زمان استفاده از این د یتامین به طر همزمان جد دا به یژه اگر افزدن این د یتامین در سطح بهینه افزده نشده باشد یتامین خاناده B بسیاری از محیطهای کشت ریان حای ترکیبی از یتامینهای خاناده B میباشند درحالی که بیشتر مطالعات به ارایه نتایج برز اثرات این یتامینها در زمانی پاختهاند که به صرت ترکیبی استفاده شده اند برخی مطالعات تجه بیشتری را معطف سنجش اثرات انفرادی این یتامینها نمدهاند. ارتباط بحث پیرامن غنیسایز محیط کشت ریان با مکملهای یتامین B با این فصل از کتاب به تانایی یتامین B2 )پریدکسین( یتامین B8 )فلیک اسید( در جمع آری ROS باز میگد )00-03(. به عاله یتامین B3 )پنتتنات( میتاند به طر غیر مستقیم در برابر رادیکالهای آد ایجاد صد دفاعی نماید. این کار را با بازسازی نمدن لیپیدهای آسیب دیده یا تحت تاثیر قرار دادن سنتز گلتاتین به انجام میرساند )08 09(. نشان داده شده است که غنیسازی با پنتتنات (B3) دارای اثرات معنی دار مثبت در تکین بالستسیست آبستنی ایجاد شده در پی انتقال بالستسیت میشد این بد در بازده تلیدات برنتنی ریان از میایی که هم اکنن برای اثرات ترکیب انتخابی از یتامین- های خاناده B )شامل یتامین B3( شناخته شده است بیشتر نمیباشد. با در نظر داشتن تمام این ما این نتیجه حاکی از اکنشهای متقابل سینرژیک بین برخی یتامینهای خاناده B )به جز برای یتامین B3( اثرات تحریک کننده معنی دار B3 میباشد اثرات محرک B3 حتی زمانی که به تنهایی مصرف شد نیز به چشم میخ )23(. زمانی که این یتامین درمرحله 9 سللی تا بالستسیست از مخلط یتامینها حذف شد کمبد یتامین B3 به طر معنیداری نرخ بالستسیستهای هچ شنده را در همستر کاهش میدهد )91(. زمانی که پریدکسین )یتامین B2( در ترکیب با تیامین پنتتنات اینزیتل اسید فلیک کلین م سنجش قرار گرفت هیچ بدی در تشکیل بالستسیست تعداد سللها در زمانی که ریانها از مرحله 4 سللی کشت داده شده بدند مشاهده نشد )94(. به عاله حذف پریدکسین از مخلط یتامینها تشکیل بالستسیست هچ شدن بالستسیستها در زمانی که ریان 9 سللی مش تلید شده در بدن همستر را جهت کشت برنتنی استخراج نمدند تحت تاثیر قرار نداد )91(. اکنشهای متقابل گیج کننده بین این یتامینها قابل چشم پشی نمیباشد بنابراین اثرات بالقه مفید مصرف پریدکسین به تنهایی پشانده میشد. در آخر پریدکسال )B2( منجر به تغییرات در نرخ کلیاژ تشکیل بالستسیست ریانهای همستر که در شرایط کشت حای %3 اکسیژن در محیط کشت فاقد پرتئین کشت داده شدهاند نمیشد )23(. همینطر اسید فلیک )یتامین B8( این یتامین تکین بالستسیست یا تعداد سللهای بالستسیست را در زمان کشت برنتنی ریان مش )92( همستر )91 23( خرگش بد نمیبخشد. نیاز به فالت با منشا درندی جد دا )92( اما به محض اینکه ریانها مقادیر کافی از ذخایر اسید فلیک را به دست میآرند به نظر نمیرسد که دیگر این نیاز به اسید فلیک به عنان مکمل در محیط کشت جد داشته باشد. به طر کلی اثرات غنیسازی با یتامینهای گره B پیچیده میباشد زیرا یک یتامین B ممکن است که مفید باشد درحالی که دیگر یتامینهای این گره زمانی که به صرت ترکیبی مصرف میشند ممکن است که ممانعت کننده باشند. بنابراین در نظر داشتن احتیاط در استفاده از این یتامینها الزم میباشد نیاز به هر یک از این یتامینها ) اثرات بالقه آنتی اکسیدانی آنها( میبایست م آزمنهای تجربی قرار بگی همچنین در بازههای زمانی مختلف از تکین ریان پیش از النه گزینی اثرات هر یک از این یتامینها باید م بررسی قراربگی. به عاله شاهد به تفاتهای یژه در زمانی که اثرات مکملسازی با یتامینها در کشت ریان م بررسی قرار میگی اشاره میکند )91 93.) اج تیلی: گلتلتین (GSH) سیستآمین (CSH) سیستئین سیستین بتامرکاپتاتانل (BME) فقط 3 محیط کشت از 21 محیط کشت تجاری که م بررسی قرار گرفتهاند دارای GSH میباشند )یک م برای D4-D3 2 م برای ;)D3-D3 به هر ری 42 محیط کشت از )3 40 م برای D4-D3 2 م برای D4-D3 0 م 447

124 برای )D3-D3 محیط دارای اسیدهای آمینه سیستین / یا سیستئین میباشند که خد به عنان پیشساز GSH به حساب می- آیند )مستقیما یا به اسطه سنتز.)GSH سیستین از اکسیداسین د ملکل اسیدآمینه سیستئین با همدیگر تلید میشد اما در حضر یک ماده تیلی )از جمله CSH یا )BME سیستین میتاند با اکنش احیا به سیستئین تبدیل شد. در تایید این یافته نشان داده شده است که اثرات مفید ماد تیلی در زمان کشت برنتنی ریان پستانداران غیر قابل انکار میباشد. همچنین هر تغییری در ضعیت thiol-redox در ریانها ممکن است که منجر به تقف تکین / یا مرگ سللی شد )93(. ضعیت redox میتاند بیان ژن ریان عملکهای آنها را نیز تحت تاثیر قرار دهد )92(. مطالعات زیادی به بررسی اثرات مستقیم غنیسازی با GSH در زمان کشت برنتنی ریان پاخته اند. یک مطالعه ابتدایی به بررسی افزدن GSH 1/3-1 µm در محیط کشت ریان اثر آن بر عبر از مرحله تقف تکین ریان مش در مرحله 2 سللی پاخته بد نتایج این مطالعه نشان داد که هیچ بدی با این غلظتهای پایین حاصل نمیشد )90(. در زمان کشت برنتنی ریان گسفند )در شرایط گازی %3 اکسیژن( GSH 4µM منجر به افیش نرخ کلیاژ تکین بالستسیست میشد )44(. تحت شرایط تعریف شده SOF( با BSA سیترات اسیدهای آمینه( زمانی که 2 رز بعد از لقاح GSH به محیط کشت افزده شد در مقابل افزدن آن بین رزهای 2 41 یا رزهای 2 3 بد ضعیت مشاهده شد این درههای زمانی در معرض قرار گرفتن ریانها با GSH منجر به کاهش بالستسیستهای تسعه یافته میشند. برعکس کلیاژ مرال تشکیل بالستسیست با تیمار مدام ریان با استفاده از GSH با استفاده از شرایط تعریف نشده )با همکشتی با سللهای کملس سرم( ارتقا مییابد )44(. در خک )ریان کشت شده تحت شرایط گازی %21 اکسیژن در شرایط کشت تعریف شده با )BSA در معرض قرار دادن ریان با mm BSA به طر مدام فرکانس تشکیل بالستسیست تعداد سللهای بالستسیست را در زمانی که در غیاب GSH1/423-1/3 کشت انجام شده بد افیش میدهد. با حضر BSA این غلظتهای GSH منجر به ارتقا بیشتر بازده تلید بالستسیست می- شد اما اثرات افینده GSH در تعداد سللها فراتر از حالتی که BSA به تنهایی استفاده میشد نخاهد شد )99(. همچنین در طل مدت کشت ریان خک )در شرایط گازی %3 اکسیژن در محیط کشت تعریف شده با حضر BSA 4/1- µm )BME GSH 1/3 منجر به افیش نرخ تشکیل بالستسیست تعداد کل سللهای بالستسیست میشد همچنین منجر به کاهش تعداد سللهای آپپتز شند بعد از گذشت 2 رز از کشت ریان میشند )98(. جالب اینکه سطح داخل سللی GSH با در معرض قرار دادن ریانها در برابر GSH 4/1 µm در مرحله 1 سللی مرحله بالستسیست افیش مییابد اما این اتفاق در مرحله 9-42 سللی مشاهده نمیشد )98(. هر د مطالعه انجام شده در خک فقط به بررسی در معرض قرار دادن ادامهدار ریان با GSH پاخته است هنز اثر منفی از قرار دادن زدهنگام در معرض GSH گرش نشده است برعکس نتایج حاصل از مطالعات انجام شده در گا. تفات ذاتی در محتای لیپیدی )هدف پراکسیداسین( بین گنهها باید در نظر گرفته شد. با تجه به محتای لیپیدی زیاد مجد در ریان خک )81( این ریانها ممکن است که به طر یژه از محیط احیا کننده سد ببرند. گلتاتین به خدی خد به طر مثر به داخل سلل منتقل نمیشد )84( بنابراین سدمندی آن زمانی که به صرت برن- دی فراهم میشد ممکن است محدد باشد. به هر ری مطالعات ذکر شده در باال از نقش GSH زمانی که به صرت خارج سللی استفاده میشد حمایت مینمایند شاید نقش سدمند GSH به اسطه ممانعت از پراکسیداسین لیپیدهای غشا سللی که تسط ROS القا میشد برز مینماید. ماد دیگر ممکن است که فراهم کننده جایگزینهای مناسب برای افیش محتای GSH درن سللی باشند از جمله این ماد میتان به تیلهای با زن ملکلی کم اشاره نمد از جمله این ماد تیلی می- تان به CSH BME اشاره نمد. به نظر میرسد که مصرف CSH به طر یژه مربط به ریانهایی است که نمیتانند از سیستین خارج سللی برای ساخت GSH استفاده نمایند همانطر که در گا نشان داده شده است )23(. به عاله سیستئین 493 حاضر در محیط کشت به سرعت به صرت خداکسیداسین به سیستین تبدیل میشد. CSH میتاند منجر به احیا سیستین به سیستئین شد افزدن آن به محیط کشت میتاند منجر به افیش امکان ساخت GSH شد این اتفاق حتی در نبد تک الیه سللی )عدم استفاده از سامانه همکشتی( به عنان حمایت کننده کشت هم به قع خاهد پیست. بعد از کشت autooxidized 448

125 ادامهدار ریان از مرحله 2-9 سللی )در حضر سرم( در CSH 31 µm در نسب تشکیل بالستسیست بالستسیست هچ شده در گا شاهد افیش معنی داری خاهیم بد )23(. در مطالعه انجام شده تسط de Matos همکاران )82( تاثیر غنیسازی محیط کشت ریان از رز 2 تا رز 1 با CSH بر ری تکین ریانهای گا م بررسی قرار گرفت نتیجه غنی سازی محیط کشت با CSH 31 µm در این مطالعه نشان دهنده افیش نرخ تشکیل بالستسیست مرال بد. همچنین در ریانهای گا یک مطالعه مختصر که به بررسی در معرض قرار دادن ادامه یابنده ریان از مرحله 4 سللی تا مرحله بالستسیست در کنار µm CSH 411 میپاخت نشان داد که نرخ تکین به مرحله مرال کاهش یافته همچنین در مقایسه با گره کنترل هیچ بالستسیستی تلید نشده بد )14(. در مطالعهای که تسط Guyader-Joly همکاران انجام شد در رند تطبیق دادن این نتایج به ظاهر متناقض استفاده از سرم در محیط کشت پیچیده کشت همراه تک الیه )که ممکن است بر سر منابع تیلی رقابت کند( م بررسی قرار گرفت )14(. با در نظر داشتن شبکه متقاطع مسیرهای متابلیکی در متابلیسم اج تیلی اکنشهای متقابل بالقه با چندین ملکل دیگر سیستم کشت میتاند به ضح منجر به تغییر در اثرات غنی سازی محیط کشت ریان با CSH در طل مدت کشت شد. از آنجایی که اثرات مفید مضر برای CSH به اثبات رسیده است تجه با دقت به زمان بندی افزدن این ماده به محیط کشت ریان همچنین نع محیط کشت مکملهای استفاده شده در آن از اهمیت باالیی برخار است. تانایی بالقه CSH در تبدیل به هایپتائرین تائرین )با اثرات یژه آنها که در باال بحث شد( به پیچیدگی مضع بیشتر می- افید با تجه به اینکه تعادل این سه ماده در محیط کشت تغییر خاهد نمد. پایه استفاده شده در غنیسازی محیط کشت با 492 ماده تیلی BME از تانایی آن در ارتقا باشت سیستین تسط سلل استفاده از این سیستین در سنتز از ن GSH بنا شده است. در طل مدت کشت برنتنی ریان گا در سیستم کشتی که محیط کشت شیمیایی تعریف شده در آن استفاده میشد غنیسازی با 411 µm( BME یا 41( منجر به ارتقا تشکیل بالستسیست تعداد سللهای بالستسیست میشد )81 83( قابل تجه که مین این بد بازده در تشکیل بالستسیست تعداد سللهای آن زمانی که ریان از مرحله 9-42 سللی در معرض BME قرار میگی در قیاس با حالتی که در تماس قرار دادن ریان با BME از مراحل قبل از 9 سللی میباشد بیشتر بده است )83(. همچنین زمانی که BME با سرم مکمل شد این ترکیب منجر به برز میای بیشتری خاهد شد شاید دلیل این ارتقا بیشتر به اسطه کاهش ساخت پیشسازهای GSH )که در سرم جد دارند( در دسترس قرار گرفتن آنها برای ریان قابل تجیه باشد )83(. به محض قرار دادن ریانهای 2-9 سللی گا در مقابل BME 31µM تکین به بالستسیست هچ شدن بالستسیست افیش مییابد این افیش همراه با باال رفتن سطح GSH داخل سللی میباشد )23(. در مطالعه دیگری که ری گا انجام شده است تکین به اسطه قرار گرفتن ریان برای 3 تقسیم کلیاژ الیه در برابر 2/23-42/3( µm( BME بد یافته بد در این مطالعه هیچ مزیت قابل مشاهدهای در زمانی که ریانها در مرحله 42 سللی م تیمار قرار گرفته بدند مشاهده نشد مرحله 42 سللی زمانی است که محتای درندی GSH افیش یافته است )83(. تمام این مطالعات ابتدایی در گا تحت شرایط %21 فشار اکسیژن به انجام رسیده بد مطالعات بعدی نشان دادند که اثرات ارتقا دهنده غنیسازی با 31 µm BME برای ریان این امکان را فراهم میکند که به مرحله بالستسیست تکین یابد نرخ این تکین مشابه با زمانی بد که ریانهای گا تحت شرایط گازی %3 اکسیژن کشت شده بدند )82(. در سیستم همکشتی که مکمل سازی محیط کشت با سرم نیز انجام میشد BME فقط زمانی نرخ تکین بالستسیست را باال میب که ریانهای گا تحت شرایط گازی محتای %21 اکسیژن کشت داده شده اند این نکته دباره به اهمیت ابستگی به شرایط کشت در زمانی اشاره مینماید که در نظر داریم هر آنتیاکسیدانی را به عنان مکمل ا محیط کشت نماییم. نکته با اهمیت این است که افزدن BME باشت سیستین در ریان را تقیت مینماید بنابراین یک سازکار دخیل در اثرات مفید BME به این اسطه تعریف تجیح میشد )82(. کاهش سطح µm به همراه افیش در نرخ تکین بالستسیست در ریانهای گای کشت شده با DNA کاهش قطعه قطعه شدن H 2 O 2 BME 31 تحت شرایط گازی محتای %21 اکسیژن مشاهده شده است )22(. تانایی BME 411 µm برای محافظت از ریانهای گای از آسیبهای القا شده به اسطه پراکسیدانها زمانی بیشتر م تایید قرار میگی که کاهش در مرگ سللی de novo 443

126 افیش در تعداد سلل تحریک ساخت GSH به اسطه این مقدار BME مشاهده میشد )29(. در نهایت باید در نظر داشت که استفاده از BME مصنعی منجر به ایجاد مضعات بحث بیشتری خاهد شد زیرا ایمنی مصرف این ماده برای تکین به سرانجام رساندن یک آبستنی هنز ناشناخته است. اسیدآمینه سیستئین به طر معمل به محیطهای کشت ریان افزده میشد با تجه به نقش این اسیدآمینه در ساخت GSH افزدن سیستئین میتاند به تعدیل تنظیم محیط احیا کننده برای ریان کمک نماید. در گا غنیسازی محیط کشت در مدت زمان 02 ساعت ابتدایی کشت )در شرایط گازی محتای %0 اکسیژن درمحیط SOF حای EDTA BSA گلکز کم( با استفاده از 1/12 mm سیستئین منجر به ارتقا نرخ تشکیل مرال بالستسیست میشد البته این بد معنیدار نبده است )89(. زمانی که سیستئین در طل تمام مدت کشت افزده شد )در محیط SOF محتای سرم( 1/12 mm سیستئین نرخ کلیاژ را تحت تاثیر قرار نداد اما نرخ تشکیل بالستسیست کاهش یافت بنابراین در استفاده از سیستئین میبایست احتیاط الزم در نظر گرفته شد. به عاله فشار اکسیژن نرخ تشکیل بالستسیست را تحت تاثیر قرار میدهد زیرا کشت در شرایط گازی %3 اکسیژن بدن سیستئین منجر به باالترین نرخ تشکیل بالستسیست کمترین نرخ سللهای آپپتتیک میشد )88(. اما در شرایط گازی حای %3 اکسیژن تعداد سللهای ICM در حضر N-acetyl-lcysteine سیستئین باالتر از حالتی است که محیط کشت فاقد سیستئین بده است )88(. نکته جالب این است که استفاده از )با پایداری افیش یافته نسبت به سیستئین( تکین ریان گا را ارتقا نداده است. درحالی که سیسئتین منجر به بد نرخ تکین ریان گا میشد )89(. به طر کلی تفسیر بیشتر در م اثرات سیستئین لزم فهم بهتر باشت این اسید آمینه متابلیسم آن در ریان را مشخص نمده است. از جمله مطالعات مرتبط میتان به غنیسازی محیط بلغ برنتنی اسیت گا با سیستئین اشاره نمد. این مطالعه نشان داد که غنیسازی با سیستئین منجر به افیش سنتز GSH داخل سللی میشد )20( اما هنز مطالعات بیشتر با محریت ریانهایی که در آنها باشت سیستئین در کمترین مین به قع میپیندد م نیاز است. مگر اینکه BME یا CSH به عنان اج تیلی در محیط کشت افزده شده باشد )82(. ذخیره ترکیبات تیلی درن سللهای ریان محدد میباشد. به یژه سطح داخل سللی GSH از زمان قع لقاح برنتنی تا رسیدن به پایان تکین بالستسیست مش در شرایط برنتنی به مقدار 41 برابر کاهش مییابد )21(. این کاهش در محتای GSH منعکس کننده تخلیه ذخایر GSH مادری به صرت پیش رنده در اسیت در ماجهه با محیط اکسید کننده کشت برنتنی میباشد. به عاله الین نشانههای ساخت GSH به صرت de novo برای الین بار در مرحله بالستسیست در ریان مش مشاهده میشد )411(. همچنین محتای GSH داخل سللی در مرحله 9-2 سللی در کمترین مین خد میباشد سپس این مقدار در مرحله 42-8 سللی باالتر رفته بیشترین مقدار در بالستسیستهای هچ شده در ریانهای گای کشت شده در شرایط برنتنی قابل مشاهده میباشد )83(. نیاز به افزدن GSH از منابع خارج سللی در زمان تکین در مراحل پیش از النه گزینی متفات میباشد )نتایج مطالعات de Matos همکاران )414( اثرات سدمند افزدن این ماده به تنهایی را در زمان کشت برنتنی بین رزهای 2-1 کشت را تایید مینماید(. به لطف دادههای مجد محققین میبایست تفاتهای یژه در ساخت GSH تسط ریان که ابسته به مراحل متفات تکین میباشد را در نظر داشته باشند. بدن تجه به اهمیت غنیسازی محیط کشت با ترکیباتی که ساخت GSH را افیش میدهند که به کاهش دادن تخلیه GSH در ریان در حال تکین کمک میکند باید در نظر داشت که این غنیسازی ضعیت thiol-redox مجد در ریان را در حد مناسب نگاه میدا. این نکته به نعی مرتبط با سطح باالتر GSH در ریانهای بدست آمده از درن بدن مجد زنده در قیاس با ریانهای کشت شده در شرایط برنتنی میباشد )21( پیرات اگرچه پیرات به عنان یکی از منابع انرژی ضرری جهت ادامه حفظ رند تقسیم کلیاژی ابتدایی ریان به تمام محیطهای کشت افزده میشد اما عاله بر این نقش پیرات قابلیت حمایت حفاظت ریان در برابر آسیبهای ایجاد شده به اسطه ROS را نیز دارا میباشد. در حضر پراکسید هیدرژن پیرات متحمل اکنش decarboxylasion شده استات دی اکسید کربن آب تلید مینماید )412(. مطالعات انجام شده ری سللهای سماتیک نشان دادهاند که پیرات قادر است 421

127 در برابر آسیبهای ایجاد شده به اسطه پراکسید هیدرژن همچنین آپپتز القا شده تسط آن مقامت ایجاد نماید ) ( همچنین 2 مطالعه در م محیطهای کشت سللی گرش نمدهاند که حضر پیرات منجر به برز تفاتهایی در سطح پراکسید هیدرژن در مقایسه با محیطهای کشت مشابه که پیرات نداشتهاند شده است ) (. همچنین مطالعات انجام شده پیرامن نقش پیرات در ریانهای کشت شده در شرایط برنتنی اثرات محافظتی بالقه این ماده علیه ROS را - 3 مشخص نمد. در ریانهای گا افزدن 1/3 mm پیرات به محیط SOF تعدیل شده که حای 41 M پراکسید هیدرژن میباشد به مقدار قابل تجهی سطح پراکسید هیدرژن را کاهش میدهد در نتیجه منجر به حمایت از ریان در برابر صدمات ناشی از پراکسید هیدرژن میشد )419(. مطالعهای در ریانهای مش اثرات مشابهی را گرش مینماید که در آن پیرات - 1 منجر به حمایت از رند طبیعی تکین بالستسیست بعد از افزدن 41 M پراکسید هیدرژن به محیط کشت شده بد )418(. نکته قابل تجه این است که نتایج مطالعات نشان میدهد پیرات به طر کامل از zygoteها در برابر آسیبهای حاصل از پراکسید هیدرژن به طر کامل محافظت مینماید این درحالی است که پیرات به صرت جزیی تانایی حمایت از بالستسیستهای گا را دارا میباشد )419(. این نتایج نشان میدهد که ممکن است ریانها از نظر حساسیت در برابر ROS همچنین نیازهایشان برای حمایت در برابر اکسیدانها با الگی ابسته به مراحل مختلف تکین متفات باشند. چن آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی به منظر خنثی نمدن ROS با این ماد اکنش نشان میدهند ذخایر این ماد بعد از گذشت زمان تخلیه میشد. این مضع به طر یژه با کشت برنتنی ریان در ارتباط میباشد زیرا نقص در محیط کشت میتاند منجر به برز استرس متابلیکی شد که در نهایت این استرس متابلیک منجر به برز استرس اکسیداتی آسیب سللی میشد. عملک آنتی اکسیدانی پیرات به اسطه عملک غیر آنزیمی میباشد بنابراین مقدار پیرات به مات اکنش با پراکسید هیدرژن کاهش دادن سطح پراکسید هیدرژن کاهش مییابد. این پیایی در مقادیر پراکسید هیدرژن پیرات به صرت تجربی نیز نشان داده شده است )412(. تجه به نتایج تحقیقاتی که به بررسی تاثیر پیرات ری مراحل تکین ریان مش در حضر عدم حضر آنتی اکسیدانها کیالت کنندهها میپازند خالی از لطف نمیباشد. این مطالعات نشان میدهند که هیچ تفاتی در تخلیه ذخایر پیرات در گرههای م مطالعه جد ندا. اما چن سطح پراکسید هیدرژن در این آزمایشها به صرت مصنعی تلید نشده است میتان پیشنهاد نمد که فعالیت پیرات در زددن پراکسید هیدرژن ممکن است که که در سطحی بسیار پایینتر از مقداری باشد که به سیله آزمنهای استفاده شده در این مطالعات قابل درک باشد )10(. اگر مقادر زیادتر از حد پراکسید هیدرژن یا دیگر جمله پیرات را میتان مشاهده نمد. گنههای ROS در محیط کشت ریان تلید شند تخلیه منابع ضرری محیط کشت از مکملهای پرتئینی بیشتر محیطهای کشت ریان حای یک منبع پرتئینی میباشند این منابع میتاند آلبمین سرم انسان (HAS) یا مکملهای جایگزین سرم یا ترکیبات جایگزین SSS( یا SSR این د ماده به خدی خد از بیش از %91 HSA در حدد %42 گلبلینهای انسانی تشکیل شدهاند( دیگر باشند )441(. درکنار حضر بالقه عامل ناشناس با فعالیت آنتی اکسیدانی یا فعالیت کیالت کننده شاهد این نکته خاهیم بد که آلبمین دارای فعالیت آنتی اکسیدانی میباشد. در ریانهای مش افزدن SSS منجر به کاهش محتای داخل سللی H 2 O 2 در مقایسه با کشت ریان در مایع لله فالپ انسان به تنهایی برای مدت ساعت میشد )444( بنابراین میتان اینگنه پیشنهاد نمد که SSS دارای فعالیت پاک کنندگی برای ROS میباشد. اینکه آلبمین ممکن است نرخ اکنشهای رادیکالهای آد را تحت تاثیر قرار دهد تعجب برانگیز نمیباشد به یژه زمانی که به این نکته تجه داشته باشیم که آلبمین در محیط کشت به عنان ذخایر استرئیدها یتامینها فلت ایفای نقش مینماید. آلبمین به طر یژه با مس ترکیب میشد منجر به کمتر در دسترس بدن مس در نتیجه کاهش اکنشهایی میشد که منجر به تلید رادیکالهای آد میشند این لتفاق در حالی رقم میخ که خد آلبمین ممکن است دچار آسیب شد )این آسیب به اسطه ایجاد پیند با رادیکالهای هیدرکسیل میباشد(. درحالی که دیگر ملکلهای ضرری م هدف آسیبهای 424

128 ناشی از رادیکالهای آد محافظت شده دست نخه باقی میمانند ) (. بنابراین آلبمین به عنان یکی از قطع کنندههای زنجیره استرس اکسیداتی یا آنتیاکسیدان ممانعت کننده شناخته نمیشد اما مانند پیرات به عنان مادهای در نقشی فداکارانه به عنان عاملی که میبایست در زمان ارزیابی دفاع آنتیاکسیدانی در محیط کشت ریان در نظر گرفته شد شناخته میشد آنتیاکسیدانهای آنزیمی Thioredoxin اگرچه تاکنن آنتی اکسیدانهای آنزیمی thioredoxin (TRX) به محیطهای کشت ریان انسان افزده نشدهاند اما این ماد با منشا برند در تلید برنتنی ریان حیانات م استفاده قرار گرفته است. در سیههایی از مش که در تکین برنتنی ریان آنها در مرحله 2 سللی متقف میشند غنیسازی محیط کشت با SOD به مقدار 31 µg/ml )از مرحله تشکیل پیش هستهها تا مرحله بالستسیست( منجر به ارتقا رند تشکیل بالستسیست میشد )33( این اتفاق یژه زمانی که در شرایط گازی حای 3% اکسیژن کشت انجام شده باشد مشهدتر است بنابراین میتان از این نتایج اینگنه باشت نمد که افزدن SOD در شرایط گازی با فشار اکسیژن کم میتاند باعث برز اثرات مفید تجمعی شد )441(. در مطالعه انجام شده تسط Chun همکاران اثرات مثبت 301U( 31/ µl( SOD در رند تشکیل بالستسیستهای مش به اثبات رسیده است. در یک مطالعه که مجددا تسط همین گره تحقیقاتی به عنان مطالعه پشتیبانی کننده از این ادعا به انجام رسیده است نتایج نشان داد که 311( µg/ml( SOD اثرات بسیار برجسته مثبتی در رند تکین ریان از خد برز میدهد. این آثار مثبت زمانی مشاهده شد که SOD در تمام مدت دره کشت برنت ین ریان در مقایسه با یک دره زمانی محدد مثال 31 ساعت بعد از لقاح در محیط حضر داشته است )443(. همچنین در مش SOD با منشا برندی در غلظتهای 411U/ml اثرات مثبتی در شکل گیری بالستسیست از خد برز داده است. درحالی که غلظتهای باالتر در حدد 4111U/ml منجر به برز اثرات مخرب در رند تکین ریان میشد. به هرری مشخص شده است که اثرات مثبت غنیسازی محیط کشت با SOD تنها زمانی که فشار کم اکسیژن معادل 3% در محیط برقرار باشد )فشار %21 اکسیژن از برز اثرات مفید SOD ممانعت که است( مشاهده خاهد شد. همچنین این آثار مثبت به طر سیعی در گنههای مختلف مش متفات میباشد )442(. زمانی که کشت در شرایط عاری از پرتئین انجام میشد یگتهای خرگش که برای مدت 02 ساعت در معرض SOD 211U/ml قرار گرفتهاند افیش معنیداری در تعداد بالستسیستهای هچ شنده تعداد سللهای بالستسیست از خد نشان میدهند )اثرات مثبت در غلظت های کمتر مشاهده نمیشد افیش بیشتر در این نرخها با افیش بیشتر در غلظت SOD نیز قابل مشاهده نمیباشد( )32(. تمام مطالعات اثرات مثبت غنی سازی محیط کشت با SOD را م تایید قرار نمیدهند. Legge Sellens در مطالعهای که به بررسی اثرات غنیسازی محیط کشت فاقد سرم تسط SOD با غلظت 3111 U/ml پاخته بدند هیچ تاثیر مثبتی از این غنیسازی مشاهده نکند. در مطالعهای که در گا تسط Liu )39( Foote انجام شد نشان داده شد که هیچ تاثیر مثبتی از غنی سازی محیط کشت در بین مرحله 1 تا 9 سللی مرحله بالستسیست با استفاده از 211 U/ml( SOD یا 311) در شرایط گازی 3 21 درصد اکسیژن بدست نمیآید. همچنین هیچ تاثیر مثبتی از غنیسازی محیط کشت تسط U/ml( SOD 4311( در مدت زمان کشت برنتنی ریان گا )تحت شرایط گازی کم اکسیژن( در محیط کشت تعریف شده )با BSA سیترات( یا تعریف نشده )کشت شده به همراه یک الیه سلل همراه( مشاهده نشده است )44(. همچنین تحت شرایط تعریف شده )با BSA دیگر مکملها شامل )EDTA افزدن 4111 U/ml( SOD 41( نرخ تشکیل بالستسیست کلیاژ بعد از در معرض قرار دادن ریان با این ماده در 02 ساعت ابتدایی کشت ریان گا تحت تاثیر قرار نمیگی )89(. دلیل این نتایج ضد نقیض را میتان به اسطه تفات در فرمالسین محیط کشت در مطالعههای مختلف که شامل تفات در منبع پرتئین )با فعالیت آنتی اکسیدانی( اسیدهای آمینه یا کیالت کننده از جمله سیترات یا EDTA )بخشهای بعدی را مشاهده نمایید( می- باشد دانست. به یژه KSOM حای EDTA در مطالعه انجام شده تسط Liu )39( Foote به همراه فعالیت کیالت کننده مثر برای فلت م استفاده قرار گرفته بد در حقیقت در این مطالعه تلید ROS به اسطه افزدن EDTA محدد شده بد 422

129 احتماال هیچ فایده افزدهای مارای اثر سدمند افزدن EDTA در این مطالعه قابل تصر نمیباشد. این یافتهها تسط دادههای تجربی که تاثیر غنیسازی ترکیب SOD EDTA را در برابر غنیسازی انفرادی این د ماده در مدت کشت برنتنی ریان مش م آزمن قرار داده است تایید میشند )10(. جالب تجه این نکته بد که در سیههای مختلف مش SOD این تانایی را داشت که به طر مثری جانشین EDTA در مدت کشت برنتنی ریان مش شد )32(. به لطف نتایج حاصل از مطالعاتی که در آنها محیط کشت ریان با SOD غنیسازی شده بد گنههای بالقه یا حتی سیههای متفات باید به دقت در نظر گرفته شد همانطر که فعالیت زیستی SOD در طل مدت کشت ابسته به آماده سازی آنزیمی / یا اینکه دفعاتی که غنیسازی محیط کشت جایگزین میشد باید مد نظر قرار بگی. غنیسازی با SOD منجر به برز اثرات سدمندتری در رند تلید برن- تنی ریان در شرایطی که فشار اکسیژن %21 باشد در مقایسه با فشار %3 میشد )10(. در ریانهای گای SOD منجر به ارتقا نرخ تشکیل بالستسیست در شرایطی که غنیسازی از مرحله 1 تا 2 سللی انجام شده باشد میشد البته باید در نظر داشت که شرط مشاهده این رند بدیافته کشت در شرایط %21 فشار اکسیژن میباشد )38( این یافتهها به عنان پشتانههایی برای اثبات حضر اکنش متقابل بین فشار اکسیژن فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی استفاده شده برای غنیسازی میباشد. بنابراین درحالی که اثرات سدمند استفاده از آنتی اکسیدانهای با فعالیت آنزیمی در شرایط خاصی از کشت به اثبات رسیده است افزدن این نع از آنتیاکسیدانها ممکن است تضمینی برای کاهش تشکیل رادیکالهای آد همانند آنچه که از دیگر ماد آنتیاکسیدان 490 انتظار میرد نباشد اثرات سدمند افزدن آنتی اکسیدانهای آنزیمی به یژه در غیاب ینهای فلت اسطه تحت فشار کم کم اکسیژن قابل مشاهده است. به هر ری میای بسیار زیاد غنی سازی با SOD در شرایط کم فشار اکسیژن )441( یا حتی نبد اثرات مفید SOD در زمانی که در فشار باالی اکسیژن کشت ریان صرت میگی منجر به به جد آمدن نتایج ضد نقیضی میشد که در باال به آنها اشاره شده است. یکی دیگر از مکملهای استفاده شده در محیط کشت که میتاند اثرات SOD را بپشاند گلکز میباشد. عمال غلظتهای باالی گلکز منجر به افیش تلید ROSمیشد ) ( بنابراین به احتمال زیاد اثر غنیسازی با SOD با افزده شدن تلید ROS پشانده میشد. فشار اکسیژن سطح متفات گلکز مجد در محیط کشت ممکن است در تضیح برخی از این نتایج ناسازگار کمک نماید برای مثال در تضیح عدم مشاهده تاثیر در فشار کم اکسیژن غلظت پایین گلکز mm( 4/3( )89( اثرات سدمند در غلظتهای باالی گلکز mm( 3/32-9/3( فشار باالی اکسیژن میتاند مثر سدمند باشد )441 32(. غنیسازی با کاتاالز U/ml( 3111 یا 4111( نیز در طل مدت کشت برنتنی ریان مش م سنجش قرار گرفته است در این م هیچ تاثیر قابل شناسایی به ثبت نرسیده است ) ( همچنین هیچ تاثیری از کاتاالز ) U/ml( در نرخ تکین یگتهای خرگش که برای 02 ساعت در محیط فاقد پرتئین با فشار اکسیژن %21 کشت شده بدند مشاهده نشده است )32( همچنین در گا نیز هیچ تاثیری در نرخ کلیاژ تشکیل بالستسیست در 02 ساعت ابتدایی کشت برنتنی ریان گا مشاهده نشده است )سط م استفاده کاتاالز 420 U/ml 3 به همراه EDTA در شرایط گازی که حای %0 اکسیژن( )89(. در مطالعهای دیگر غنیسازی با کاتاالز U/ml( 411( در مش نرخ تشکیل بالستسیست را ارتقا بخشیده است اما این تاثیر تنها زمانی رخ میدهد که EDTA در محیط کشت حضر نداشته باشد شرایط کشت از نظر مقدار گاز اکسیژن حای %21 اکسیژن باشد )10(. با این جد آثار سدمند در مقایسه با دیگر دسترزی- ها از جمله EDTA SOD یا دستکاری درصد اکسیژن در کمترین مین خد قرار دا. در این ارتباط میتان به بیاثر بدن کاتاالز با منشا برندی در کاهش محتای H 2 O 2 داخل سللی در ریان اشاره نمد )2(. این نکته شاید منعکس کننده عدم تانایی کاتاالز در رد به داخل سللهای ریان باشد. مطالعات بیشتری باید در ارتباط با بررسی اثرات کاتاالز با منشا برندی در دستر کار قرار بگی با در نظر داشتن اینکه سیستم دفاعی ابسته به کاتاالز در ریان حضر دا باید بررسی نمد که آیا ذخایر کاتاالز در ریان به مقدار کافی است یا خیر همچنین ممکن است که اثرات کاتاالز افزده شده م تایید قرار نگی. مالحظات مشابهی برای SOD در نظر گرفته میشد اگرچه این آنتیاکسیدانهای آنزیمی همچنان تانایی تعدیل نمدن سطح ROS خارج سللی را دارا میباشند. در پایان باید خاطر نشان نمد که یکی دیگر از مشکالت در جمع بندی نمدن میا معایب Transition metal 429

130 غنی سازی با آنتیاکسیدان های آنزیمی تنها ابسته به مطالعات شامل چندین آنتی اکسیدان یا در مقابل مطالعاتی که فقط یک آنتیاکسیدان را در نظر دارند نمیباشد. م آخر به عنان یک محددیت در نظر گرفته میشد زیرا این آنتی اکسیدانها به صرت همکار با یکدیگر عمل میکنند )شکل 2-8(. همچنین مطالعاتی که به بررسی چندین آنتی اکسیدان پاختهاند نیز ممکن است که بهترین ترکیب آنتی اکسیدانی ممکن را هدف قرار نداده باشند ) / یا ممکن است که غلظتهای مناسب را در نظر نداشته باشند( µg/ml( TRX بدست آمده از.E( coli نیز در مدت کشت برنتنی ریان حیانات م آزمن قرار گرفته است به یژه مشخص شده است که TRX در قایع بعد از النه گزینی در ریانهای مش که ژن Trx آنها از کار افتاده است )421( یا مشهای ترانس ژنیک )424( دخیل میباشند. در مشها تشکیل بالستسیست با استفاده از TRX ارتقا مییابد )422( همچنین تقف تکین ریان در مرحله د سللی در شرایط کشت برنتنی به اسطه تحت تاثیر قرار دادن تکین از مرحله پیش هسته تا مرحله 2 سللی را از بین میب ) (. اما Nasr-Esfahani )90( Johnson در مطالعهای نشان دادند که هیچ ارتقایی در تانایی تکین ریانهای مش فراتر از تقف تکین در مرحله 2 سللی بعد از غنی سازی محیط کشت با TRX )تا 311( µg/ml مشاهده نمیشد. تمام این کشتها در شرایط گازی حای %21 اکسیژن بده است. بنابراین به لطف این نتایج متناقض میبایست تفاتها درشرایط کشت را در نظر گرفت که ممکن است منجر به تاثیر گذاشتن ری رند محافظتی برندی در ریانها یا تلید رادیکالهای آد شند بسته به این شرایط اثرات غنیسازی با TRX ممکن است متفات شد. در طل مدت کشت ریان خک در شرایطی که فشار اکسیژن %3 میباشد 4( mg/ml( TRX منجر به ارتقای تشکیل بالستسیست افیش تعداد سللهای ریان میشد. همچنین تعداد سللهایی که دچار مرگ برنامه ریزی شده سللی شدهاند کاهش یافته ضعیت ( redux محتای GSH /سطح H( 2 O 2 داخل سللی در مرحله 1 سللی مرحله بالستسیست افیش مییابد )98(. در مدل گای تکین ریانها در نزدیکی مرحله 9 سللی متقف میشد در این مرحله TRX نترکیب احیا شده µg/ml( 1/3( منجر به ارتقا تشکیل بالستسیست میشد )421(. در تایید اثرات حساسیت ابسته به زمان گرشهای ارایه شده از مطالعات صرت گرفته در مش تایید مینمایند که TRX اثرات مفید خد را تنها زمانی که بین ساعت بعد از لقاح افزده شد برز میدهد. شگفت انگیز خاهد بد که این اثر فقط در شرایطی که مقدار اکسیژن %3 باشد قابل مشاهده خاهد بد در صرتی که تعداد سللهای بالستسیست در شرایط %21 اکسیژن با حضر TRX کاهش می- یابد )421(. آنتی اکسیدان بالقه بنابراین غیر فعالسازی TRX در یک محیط اکسید کننده که دارای %21 اکسیژن میباشد نیازمند مطالعات بیشتر میباشد به یژه در حضر ریانها. به عاله TRX همچنین میتاند به عنان یک اکسیدان عمل نماید این عملک به اسطه بد رند تشکیل پیندهای دیسلفید در شرایط خاص به قع میپیندد )31(. TRX تسط سللهای 499 اپیتلیمی عدسی قابل باشت هستند )423( شاید این اتفاق در ریان نیز به قع بپیندد لی تا کنن شاهد مستقیمی در این زمینه به دست نیامده است. تا به امرز تمام مطالعات )به استثنای مطالعه انجام شده تسط Bing همکاران )421(( از فرم اکسید شده TRX به منظر غنیسازی استفاده نمدهاند. به هر ری به محض رد به سلل TRX اکسید شده ممکن است که به اسطه فعالیت آنزیم تکسین کتاز احیا شد. نهایتا میای اضافی غنیسازی TRX با SOD یا فشار کم اکسیژن در تشکیل بالستسیست مش به اثبات رسیده است )423(. بنابراین شاهدی که تاکنن به دست آمده است به نعی لزم انجام آزمنهای بیشتری را که به بررسی میای بالقه غنیسازی با آنتی اکسیدانهای با فعالیت آنزیمی یا تکسین میپازد را آشکار مینماید. در پایان باید ذکر ک که علیرغم فراانی حضر گلتاتین پراکسیداز در مایع ایداکت تاکنن هیچ مطالعهای به بررسی غنیسازی محیط کشت با گلتاتین پراکسیداز نپاخته است )33(. به نظر میرسد که اثرات مفید غنیسازی با SOD از عدم تانایی ریانها در خنثی سازی رادیکالهای آد سپر اکسید منشا میگی رادیکالهای سپراکسید ممکن است که اثرات مخربی در تکین ریانهای مش بعد از مرحله 2 سللی را منجر شند )440 33(. این حقیقت به اسطه شناسایی پیک تلید قابل مقایسه H 2 O 2 در شرایط برنتنی در مرحله 2 سللی در گنه- lens epithelial cells 421

131 هایی از مش که در مرحله 2 سللی دچار تقف تکین میشند آنهایی که این تقف را از خد برز نمیدهند بیشتر م تایید قرار گرفت )2(. تکسین ممکن است که به عنان عامل ممانعت کننده از اکسیداسین گرههای تیلی مجد ری پرتئین- های مادری عمل نماید. نقش متصر برای این دسته از پرتئینهای مادری نقشی کاربی در پیشرفت تکین ریان میباشد. این حقیقت برپایه تانایی تکسین در کاهش دادن تقف در مرحله 2 سللی درحالی که در محیط کشت در خالل مراحل ابتدایی تکین افزده میشد بنا شده است ) (. 422 در مطالعهای که تسط Natsuyama همکاران )422( انجام شد مشخص شد که فعالسازی p31 cdc2 به عنان یکی از تنظیم کنندههای اصلی چرخه سللی بعد از افزدن SOD TRX در خالل کشت ریان مش به شدت به قع میپیندد. به هرحال تمام تقسیمهای مرحله کلیاژ ممکن است که تسط افزدن TRX ارتقا پیدا نکند )421( همچنین پرتئین)ها( م نظر برای احیا تسط TRX همچان باید م شناسایی بررسی قرار بگی. در نهایت TRX ممکن است در تعدیل تغییر مرگ سللهای ریان ایفا کننده نقش باشد نشان داده شده است که غنی- سازی محیط کشت ریان خک با TRX منجر به کاهش نرخ سللهای آپپتز کننده بالستسیست خاهد شد )98( کیالت کنندهها EDTA EDTA به عنان معملترین کیالت کننده در محیطهای کشت ریان انسان که به صرت تجاری آماده سازی می- شند شناخته شده است )جدل 4-8( EDTA در %09 از محیطهای کشت D4-D3 %411 محیطهای کشت ریان مربط به D4-D3 %44 از محیطهای کشت D3-D3 افزده میشد. EDTA پلیپرتیک اسید مصنعی با چهار گره اسید کربکسیلیک د گره آمین با یک جفت الکترن تنها میباشد که این امکان را فراهم میآ تا ینهای فلزی با نسبت 4:4 فلز- EDTA ترکیب شند این ترکیب با 2 نقطه تماسی برقرار میشد )شکل 3-8(. الین اثرات مثبت EDTA در کشت ریان در سال 4800 زمانی که افزدن EDTA به محیط کشت )420( Whitten منجر به غلبه بر رند تقف تکین برنتنی ریان مش در مرحله 2 سللی شد گرش شد )429(. مطالعات بعدی که در مش گا انجام شد این اثرات مثبت EDTA را م تایید قرار داد نشان داد که EDTA به طر مثبت در تکین ریانها در محیطهای کشت متفات دخیل میباشد ) (. به هر ری علیرغم تاییدات کننی در م EDTA به عنان یکی از اج محیط کشت ریان انسان سازکاری که EDTA بررند تکین ریان مثر اقع میشد به طر کامل مشخص نشده است. در معرض EDTA قرار دادن ریانها به صرت بهینه هنز م تایید نهایی نیست. هنز هیچ اتفاق نظری در م غلظت بهینه EDTA ایجاد نشده است. اما بنظر می- رسد که غلظت بهینه EDTA بیشتر به آلدگی محیط کشت با رادیکالهای آد در ارتباط میباشد. در یکی از مطالعات انجام شده EDTA 3-3 µm تانسته بد که تکین ریانهای گا در محیط کشت تعریف شده را ارتقا دهد درحالی که µm EDTA 423 به طر بسیار شدیدی منجر به برز اثرات مضر در رند تکین ریان شده است )02(. مطالعات دیگر که از µm 411 یا EDTA 41 در محیط کشت SOF KSOM دیگر محیطهای کشت تعریف شده استفاده شده بد رندهای مفقیت آمیز تکین ریان را نشان دادهاند ) (. باید در نظر داشت که سطح بسیار کم ینهای فلزی ممکن است که در هر محیط کشت در مطالعات مذکر متفات باشد بنابراین این مقادیر متفات مقدار م نیاز EDTA برای بهترین شرایط محیط کشت در نهایت نرخ بد یافته تکین ریان را تحت تاثیر قرار میدهد. در مقادیر بیش از حد مجاز EDTA ممکن است که منجر شد ینهای فلزی سدمند برای تکین ریان را نیز از دسترس ریان خارج نماید )439 21( اما در مقادیر غلظتهای صحیح EDTA میتاند از ریانها در برابر مقادیر سمی ینهای فلزی مقادیر زیاد ROS تلید شده در محیط کشت محافظت نماید. برای مثال افزدن EDTA به محیط کشت عاری از سللهای همراه سطح ROS مجد در محیط کشت را در مقایسه محیط کشت فاقد EDTA مشابه به شدت کاهش میدهد )438( در مطالعهای دیگر EDTA تانسته بد از ریان- های مش در حال تکین در برابر اثرات سمی رغن معدنی استفاده شده برای پشاندن قطرات کشت که مشکک به آلدگی با 425

132 498 ری بده است محافظت نماید )411(. به منظر حفظ سطح ینهای آد فلزی در محیطهای کشت فاقد پرتئین به صرت ثابت استفاده از بافرهای ینهای فلزی بهینه شده به عنان راهکاری مناسب درنظر گرفته شده است. این بافر برپایه مخلطی از لیگاندها شامل 11 µm سیترات )بخش زیر را مشاهده نمایید( EDTAمیباشد 1/3 µm )414(. ممکن است که EDTA دارای اثرات ابسته به مراحل تکین ریانها باشد. مطالعات متعدد انجام شده در شرایط برنتنی پیشنهاد میکنند که ریان- هایی که به طر ادامه یابنده در معرض EDTA قرار میگیرند در مقایسه با ریانهایی که فقط در مرحله پیش از تراکم در معرض EDTA قرار میگیرند دارای رند تکین ناقص میباشند. مدافعان مصرف محدد شده EDTA گرش نمدهاند که تیمار ریانها تا بعد از مرحله 9 سللی منجر به برز صدمات آسیبهای زیادی به ریان میشد از جمله این صدمات میتان به کاهش در تعداد سللهای ICM بالستسیست گا همچنین زن بدن پایینتر ریان مش بعد از انتقال ریانها به مادران پذیرنده تلد نتاج اشاره نمد ) (. 430 مدت زمانهای متفاتی ) ساعت بعد از لقاح یا تا زمان متراکم شدن سللهای ریان ابتدایی( به عنان بهترین مدت تیمار با EDTA در مش گا در نظر گرفته شده است ) (. درحال حاضر محیطهای کشتی که برای مرحله پیش پس از متراکم شدن ریان انسان مجد است به گنهای طراحی شدهاند که فقط محیط کشت م استفاده برای پیش از مرحله متراکم شدن حای EDTAمیباشند. دیگر محققان ذکر نمده- اند که اثرات مضر EDTA در مرحله بعد از متراکم شدن سللهای ریان ممکن است که به سادگی به عنان پرسش در م غلظت مناسب EDTA مطرح شد. با استفاده از sequential simplex optimization غلظت بهینه EDTA برای محیط کشت KSOM در حدد EDTA 41 µm گرش شده است )411(. در مطالعهای که به بررسی ریههای کشت برنتنی ریان پاخته است مشخص شده است که ریانهای مش که به صرت ادامه یابنده در محیط KSOM کشت داده شدهاند رند تکین طبیعی را طی نمدهاند درحالی که ریانهایی که در محیط کشت DM2 به صرت ادامه یابنده کشت شدهاند رند تکین ناقصی را از خد نشان داده اند. شرایط مین تکین ریانها با شمارش تعداد سللهای بالستسیست نرخ هچ شدن ریانها م ارزیابی قرار گرفته اشت )433(. درحالی که KSOM حای EDTA 41 µm بد DM2 دیگر محیطهای کشت استفاده شده در مطالعات تایید کننده اثرات مخرب قرار گرفتن در معرض EDTA 411µM یه صرت ادامه یابنده را نشان داده- اند ) (. 430 در مطالعهای ری ریانهای انسان 3 بالستسیست از 8 بالستسیستی که به طر ادامه یابنده در EDTA کشت داده شده بدند منجر به تلد نتاج زنده شد )413(. در نتیجه مفرض است که غلظتهای پایینتر KSOM µm( 41( ممکن است منجر به اثرات مخرب مشابهی در ریانهای بعد از متراکم شدن همانند آنچه که در صرت استفاده از 411( µm( EDTA برز مینماید نشد. در مطالعهای که به تازگی در ریان مش انجام گرفته است مشخص شده است که نرخ بهینه تکین بالستسیست با استفاده از EDTA 411 µm تا 2 رز بعد از لقاح ادامه استفاده از EDTA به مقدار 41 µm در ادامه رند کشت به دست میآید )414(. حداقل یک سازکار برای تضیح دلیل اینکه چرا EDTA اثرات متفاتی بر ریانها در مراحل پیش از متراکم شدن پس از متراکم شدن را ایجاد مینماید تا کنن شناسایی شده است. در ریانهای مش مشخص شده است که EDTA به اسطه مهار یک کیناز سیتزلی با نام 3 -فسفگلیسرات کیناز به تنظیم رند گلیکلیز می- پازد )430(. ریانها فقط بعد از مرحله متراکم شدن برای تامین انرژی به مسیرهای گلیکلیتیک ابسته میباشند. قبل از آن استفاده پیشرس از مسیرهای گلیکلیزی منجر به کاهش نرخ تکین ریانها از طریق ممانعت از عملک تنفسی میتکندریها میشد )412 42(. بنابراین با محدد نمدن گلیکلیز EDTA ممکن است که به نعی تقف تکین در مرحله د سللی را بد ببخشد )در مش( منجر به ارتقا تکین در مرحله کلیاژ برای ریانها شد اما مصرف EDTA بعد از مرحله متراکم شدن میتاند منجر به ا آمدن آسیب در رند تکین ریان شد. بررسیهای انجام شده پیرامن سطح داخل سللی منیزیم فعالیت گلیگلیتیکی در زمان تیمار نمدن محیط کشت با EDTA منجر به بیان این پیشنهاد شد که EDTA از طریق کاهش فراهمی منیزیم که ین الزم برای عملک طبیعی آنزیم 3 -فسفگلیسارت کیناز میباشد به اسطه کیالت نمدن منیزیم منجر به تغییرات در عملک گلیکلیتیک سللهای ریان میشد )410(. اما دیگر شاهد پیشنهاد کننده این نکته هستند که zinc 426

133 EDTA ممکن است از عملک آنزیم 3 -فسفگلیسرات کیناز با رشی دیگر ممانعت به عمل آ این مکانیسم به نعی ناشناخته میباشد لی میتان بیان نمد که از طریق سازکاری غیر از ساز کار کیالت نمدن میباشد )419(. نکته حایز اهمیت اینجاست که برخی مطالعات نشان دادهاند EDTA به طر معنیداری منجر به کاهش تعداد سللهای بالستسیت در ریانهای مش میشد درحالی که به طر همزمان منجر به افیش نرخ تشکیل بالستسیست شده یا هیچ تاثیری بر این نرخ اعمال نکه است )433 32(. 10 بنابراین محتمل است که افیش در نرخ تشکیل بالستسیست به اسطه افزدن EDTA به محیط کشت تاثیر منفی ثانیه کیالت کنندهها را بر کیفیت ریان در برخی مقعیتها را پنهان نماید. به عاله باید در نظر داشت که آیا EDTA به عنان یکی از نیازمندهای مطلق برای کشت ریانهای انسان به یژه در مقعی که ماد مغذی آنتی اکسیدانهای مناسب به مقدار کافی در محیط کشت جد دارند به حساب میآید یا خیر. در مقایسه با ریانهایی که در محیطهای کشت فاقد EDTA کشت شدهاند در ریانهای کشت داده شده در KSOM تفات معنیداری در نرخ تشکیل بالستسیست مشاهده نشده است )413(. در مطالعه دیگری که در انسانها به انجام رسیده است نرخ تشکیل بالستسیست النهگزینی آبستنی بین ریانهایی که در محیطهای کشت فاقد EDTA کشت داده شدهاند با ریانهایی که تا مرحله 2-9 سللی در محیط کشت حای EDTA با سیستم کشت پیدرپی کشت داده شدهاند تفات معنی داری نداشتهاست )418(. در ه این مطالعات غلظت EDTA افزده شده 41 µm در نظر گرفته شده بد سیترات سیترات به عنان یکی از اجی مجد در بیشتر محیطهای کشت تجاری )%33( که برای کشت ریان انسان م 481 استفاده قرار میگی به حساب میآید. برای الین بار در سال 4882 سیترات به عنان یکی از اجی تغذیه کننده ریان مجد مجد در BSA شناخته شد نشان داده شده است که تانایی تحریک رشد بالستسیستهای خرگش را دا )431(. قابل پیش بینی است که سیترات در ارتقا تکین ریانها دارای نقشهای متعددی میباشد ازجمله این نقشها میتان به ایفای نقش به عنان منبع انرژی تحریک کننده ساخت اسیدهای چرب اشاره نمد ) ( همچنین میتاند به عنان فعال کننده آلستریک استیل کآنزیم A کربکسیالز عمل نماید همچنین به عنان کیالت کنندهها نیز میتان برای آن نقشی متصر بد 484 ) ( به عنان کیالت کننده سیترات دارای تمایل اتصال باالیی برای ینهای فریک کلسیم 482 استرانسیم منگنز منیزیم میباشد )439(. به یژه کیالت شدن ین کلسیم به سیله سیترات به عنان یکی از مهمترین قایع در حفظ یکپارچگی اتصاالت در ریان در نظر گرفته شده است ) (. 434 همانطر که برای دیگر کیالت کنندهها نیز صادق است این ساز کار در ادامه م بحث قرار خاهد گرفت. در کشت ریان گرش شده است که سیترات دارای اثرات متفاتی در رند تکین ریان میباشد شاید دلیل این تنع به نعی مرتبط با فعالیتهای چندگانه سیترات همچنین ترکیبات متفات محیطهای کشت باشد. در گا نشان داده شده است که افزدن سیترات به محیطهای کشت SOF G4 منجر به ارتقا تکین بالستسیست میشد ) (. 433 مطالعهای که در مش انجام شده است گرش مینماید که اسید سیتریک منجر به ارتقا تکین ریان در برابر گره کنترل میشد اما تاثیر آن به اندازه EDTA مثر نمیباشد ) 431 (.دیگر مطالعات در گا نشان دادهاند که سیترات در محیطهای کشت شیمیایی تعریف شده هیچ تاثیر مشخصی بر رند تکین ریان ندا ) ( درحالی که دیگر مطالعات نشان دادهاند که اثرات مفید سیترات فقط زمانی که به صرت هماهنگ با اسیدهای آمینه غیر ضرری در SOF استفاده شد قابل مشاهده است )421(. در خاتمه باید ذکر ک که یک مطالعه گرش نمده است که سیترات در زمانی که ریان گا با ریک استفاده از سامانه همکشتی کشت داده میشد دارای اثرات مفید میباشد )432(. نیسندگان این مقاله )432( پیشنهاد نمدهاند که فعالیت کیالت کننده سیترات متابلیتها ماد سمی تراش شده تسط سللهای سماتیک در سیستم همکشتی را از محیط پاک مینماید. embryotrophic ferric strontium 427

134 کیالت کنندههای تجربی )آزمایشی( دیگر کیالت کنندههای استفاده شده در مطالعات انجام شده در زمینه کشت ریان شامل ترانسفرین DTPA DOF EGTA EDDA NTAمیباشند. اگرچه این کیالت کنندهها به طر معمل در محیط کشت ریان انسان استفاده نمیشند. مطالعات پیرامن این کیالت کنندهها اطالعات جدید را فراهم نمدهاند باعث ایجاد دریچهای به سی در نظر داشتن استفاده عممی از این کیالت کنندهها در کشت ریان شده است. ترانسفرین پرتئینی است که تمایل اتصال باالیی برای آهن دا ظرفیت اتصال هر ملکل ترانسفرین به اندازه اتصال به 2 اتم از ین فریک میباشد )424(. در مطالعاتی که در ریانهای مش انجام شده است نشان داده است که ترانسفرین با منشا گای مفقیت ریان مش در رند تکین عبر از تقف در مرحله 2 سللی بعد از گذشت 22 ساعت پس از اعمال تیمار در پی بازیافت یگتها را نشان داده است )422 24(. نکته جالب این است که ترانسفرین انسانی هیچ اثر مثبتی ری ریانهای مش اعمال نکه است حتی در برخی از غلظتها دارای اثرات سمی نیز میباشد )24(. این نتایج مشخص مینماید که تفاتهای گنهای را میبایست به عنان یکی از مهمترین مالحظات در زمان افزدن کیالت کنندهها به محیط کشت ریان در نظر داشت. در مطالعه دیگری که با استفاده از مش به انجام رسیده بد غیاب ترانسفرین زمانی که EDTA اسیدهای آمینه در محیط کشت مجد بده است هیچ تاثیری بر رند تکین ریان مش نداشته است )430(. چنین نتایجی نشان میدهد که تاثیر برخی از کیالت کنندهها ممکن است تسط دیگر کیالت کنندهها پشانده شد 483 در نتیجه حضر این نع از کیالت کنندهها در برخی شرایط به نعی غیر الزم میباشد. DOF یکی از حمل کنندههای آهن برای باکتریها میباشد که به گرهی از ملکلها تعلق دا که به عنان یکی از قیترین کیالت کنندههای محلل ین فریک شناخته میشد این حمل کننده با نسبت 4 به 4 با آهن اتصال برقرار میکند این حمل کننده 2 نقطه اتصال برای ارتباط با آهن دا. در سطح باال DOF به عنان مادهای سمی برای ریانهای مش به حساب میآید در سطح پایین تانایی غلبه بر تقف تکین در مرحله 2 سللی را ندا )24(. غلضتهای 41 یا µm 4 از DOF که در مرحله 4 سللی به محیط کشت افزده شده است منجر به کاهش نرخ کلیاژ در مقایسه با مشهای گره کنترل میشد )419(. همچنین DOF به عنان یکی از عاملی شناخته میشد که به اسطه پرتئینهای تثبیت کننده هایپکسی ) 481 (HIF القا میشد. زمانی که مرال گای در شرایط حای 0 درصد اکسیژن کشت داده میشد )در شرایط 2 درصد اکسیژن صادق نمیباشد( با افزدن DOF تا 4 µm بیان ژنهای تنظیم شده تسط HIF در بالستسیستهای در حال تکامل افیش مییابد )424( این حقیقت از منظر ژنتیکی پیشنهاد کننده این نکته است که DOF ممکن است به نعی شرایطی مشابه با محیط حای اکسیژن کم را بازسازی نماید. بی ارتباط نمیباشد که در نظر داشته باشیم دیگر کیالت کنندهها نیز ممکن است بیان ژنها را دچار تغییر نماید. DTPA از نظر ساختاری مشابه EDTA میباشد این ماده در سال 4809 معرفی شد )421(. در غلظتهای µm 41 DTPA تکین ریان سیههای خاصی از مش را که مشکک به تقف تکین در مرحله 2 سللی میباشند را در شرایط برنتنی ارتقا میدهد )419 24(. در گا DTPA 423 µm برای ریان سمی میباشد درحالی که DTPA 3-3 µm به طر مثبتی در رند تکین ریان مشارکت مینماید )02(. تفاتهای مجد در غلظتهای گرش شده ممکن است که نتیجه گنه یا تفات در محیط کشت باشد. در مطالعات مشی BSA در محیط کشت حضر داشته ممکن است که به عنان بافر برای ریان عمل نماید در نتیجه ایجاد نسان در مقادیر کیالت کنندهها جلگیری به عمل آ این شرایط امکان تحمل مقادیر باالی DTPA را برای ریان فراهم مینماید )02(. در آخر باید ذکر نمد که همچنین نشان داده شده است که دیگر کیالت کنندهها مانند EGTA EDDA 483 دیپیکلینیک اسید NTA نیز تانایی کاهش تقف تکین در مرحله 2 سللی در مش را دارا میباشند )419(. siderophore hypoxia-induced factor dipicolinic acid 428

135 یادداشتهایی در م کیالت کننده های م استفاده در کشت ریان درجههای متفات مفقیت در استفاده از کیالت کنندهها در کشت ریان بیشتر به نظر میرسد که قابل ارتباط با ساختار ملکلی هر یک از این ماد باشد. میتان اینگنه بیان نمد که کیالت کنندههایی مانند DTPA EDTA سیترات در شرایط خاصی میتانند پراکسید هیدرژن را به اسطه تبدیالت کاتت کا به رادیکالهای هیدرکسیل تبدیل نمایند. اگر نسبت کیالت کننده به فلز پایین باشد EDTA یا DTPA ممکن است نرخ این فرایندهای اکسیداتی را افیش دهد به طر مثری به عنان پراکسیدانها عمل نمایند اما اگر کیالت کنندهها در مقایسه با مقدار فلز پراکسید هیدرژن بیشتر باشد )تقریبا نسبت معادل 2:4 کیالت کننده به فلز( ممکن است که نرخ ریههای اکسیداتی را کاهش دهد در نتیجه ریانها را در برابر تلید ROS محافظت مینماید )423(. به هر ری باید در نظر داشت که همانطر که پیشتر از این نیز تضیح داده شد بیشتر کیالت کنندهها در صرت استفاده شدن به مقدار بیش از حد تحمل آستانه ریان میتانند به عنان عامل سمی در محیط کشت ایفای نقش نمایند. به عاله ساختار ملکلی کیالت کنندهها برای مثال تعداد نقاط ارتباط بین کیالت کننده فلز بر رند چگنگی تغییرات ینهای فلزی در زمان کیالت شدن تاثیر گذار میباشد. مفرض است که غیاب اثرات مثبت DFO در کشت برنتنی ریان به دلیل تمایل اتصال بسیار باالی این ماده برای آهن میباشد. DFO متصل به آهن نمیتاند در اکنشهای کاتالیتیک ا شد یژگی که بیان مینماید اگر آهن به عنان یک نیاز مثبت درن سللی در زمان تکین ابتدایی ریان مجد باشد ممکن است با ریههای الزم سللی تداخل ایجاد نماید )419 24(. در مقابل این مطالب باید ذکر ک که کیالت کنندهها با تمایل اتصال کمتر ممکن است به عنان حاملین آهن عمل نمایند یا "چاپرنها" بنابراین تکین را تحریک مینمایند درحالی که به طر همزمان تلید ROS را محدد مینمایند. ساختار ملکلی بار الکتریکی کیالت کنندهها نیز تعیین کننده این است که آیا کیالت کننده م نظر میتاند به صرت خارج سللی یا درن سللی عمل نمایند. در مش باشت ترانسفرین در بالستسیست رخ میدهد اما در ریانی که در مراحل ابتدایی تکین میباشد چنین اتفاقی رخ نمیدهد )422( این نکته مبین آن است که اثرات مفید ترانسفرین در رند تکین ریان ابتدایی از جمله غلبه بر تقف تکین در مرحله 2 سللی به دلیل فعالیت کیالت کننده آن است اثرات بعدی ترانسفرین مربط به حمل نقل آهن میباشد. از سی دیگر EDTA دارای بار منفی میباشد که مفهم آن این است که نمیتاند به غشا سللی نفذ نماید. بنابراین EDTA یک کیالت کننده برای ینهای فلزی 482 خارج سللی میباشد )419(. در حقیقت اگر ریان با EDTA م تزریق قرار بگی چه این تزریق در ناحیه پیشیتلین باشد چه در داخل سلل باشد فقط ریانهایی به طر نرمال تکین مییابند که تزریق در آنها صرت نگرفته است )431(. هر کیالت کنندهای دارای تمایل اتصال متفاتی برای ینهای فلزی یژهای میباشد. برای نمنه ترانسفرین با ینهای فریک اتصال برقرار مینماید درحالی که DTPA EDTA هم به ینهای فریک هم به ینهای فرس متصل میشند. معمال اسید 480 دیپیکلینیک به عنان کیالت کننده انتخابی برای ین فلزی ری استفاده میشد )422(. EDTA DTPA ترانسفرین هرکدام در شرایط یژهای میتانند به عنان فراکسیداز عمل نمایند که ینهای فرس را به ینهای فریک تبدیل مینماید. این تبدیل ممکن است که از تلید رادیکالهای خطرناک هیدرکسیل به اسطه محدد نمدن فراهمی ین فرس در اکنش Habre-Weiss ممانعت به عمل آ )شکل 4-8(. به عاله DTPA EDTA ترانسفرین همچنین میتانند به دیگر ین- های فلزی متصل از جمله مس متصل شند شایان ذکر است که DFO چنین تانایی را دارا نمیباشد. از آنجایی که مس نیز میتاند در اکنش Haber-Weiss شرکت نماید این یژگی ممکن است باعث محافظت بیشتر در برابر ROS در رند کشت برنتنی ریان شد. درپایان پیشنهاد شده است که کیالت شدن ینهای کلسیم ممکن است اتصاالت محکم (tight junction) را برای تسهیل نمدن انتقال ماد محلل باز نماید )431(. چنین عملکی برای حفظ یکپارچگی اتصاالت مهم می- باشد بنابراین برای متراکم شدن تشکیل بالستکل در ریان نیز حایز اهمیت میباشد ) (. به یژه این عملک برای سیترات EDTA م بررسی قرار گرفته پیشنهاد شده است ) (. perivitelline Dipicolinic acid 423

136 خالصه 1-8. در این فصل از کتاب تالش بر این بد که استفاده کننی دانش پیرامن آنتیاکسیدانها کیالت کنندهها در کشت برنتنی ریان را به طر خالصه ارایه نماییم. اگرچه هنز ما زیادی جد دا که پیرامن آنها اطمینان الزم جد ندا از جمله این ما میتان به دز مصرفی مدت زمان در معرض قرار دادن حتی اثرات ملکلهای متفات که به منظر محافظت از ریانها در برابر ROS استفاده میشند اشاره نمد اما یک نکته مشخص است که دقت الزم در برقرار نمدن تعادل بهینه بین حفاظت اثرات مضر این ماد در مقادیر زیادتر از حد مجاز در نظر گرفته شد. به عاله طبیعت شیمیایی هر آنتی آکسیدان یا کیالت کننده به مقدار زیادی در رابطه با عملک آنها اینکه چگنه با تمام دیگر اج محیط کشت اکنش میدهند میباشد. به نظر بسیار غیر معمل است که آنتی اکسیدان یا کیالت کنندهای پیدا شد که اثرات یژه آن کم کن غلظت ROS باشد. عاله بر اثرات محافظتی آنها این ملکلها به عنان تعدیل کنندههای بالقه عملکهای سللی نیز ایفای نقش مینمایند همچنین این ملکلها ممکن است عملک دیگر آنتیاکسیدانها یا کیالت کنندهها را نیز تحت تاثیر قرار می- دهند. اثرات ریز محیط شیمیایی محیط کشت نباید در زمان ارزیابی بررسی اثرات آنتیاکسیدانها یا کیالت کنندهها نادیده گرفته شد. چن ملکلها به طر مدام تغییر مییابند تلید میشند یا تخلیه میشند سیستم کشت یک سیستم پیا میباشد که دارای یک جریان ثابت است. بنابراین نمیتان این گنه فرض ک که تعادل عملک آنتیاکسیدانها کیالت کنندهها در تمام مدت کشت دست نخه باقی میماند. برای مثال اینکه آیا محیط کشت در مدت کشت تجدید شد یا خیر بر حضر مکملهای بالقه تاثیر خاهد گذاشت دلیل این امر پایداری میباشد که در آن محیط شیمیایی به طر یژه حضر دا. نیمه عمر این آنتیاکسیدانها از جمله یتامین C به اسطه فراهمی اکسیژن فلت آد تحت تاثیر قرار میگی )439 04(. عاله بر این مالحظه دیگری که باید در نظر داشت این است که اج مختلف با منشا درن دی ممکن است به سرعت در محیط کشت ریان اکسید شند. ROS تلید شده تسط این اکنشها میتاند به اسطه عملک آنتیاکسیدانی دیگر اج مجد در محیط کشت از جمله پیرات از نظر ناپدید شد. اگر چنین باشد سطح پیرات ممکن است کاهش یابد درحالی که اج پراکسید کننده ناشناخته باقی میمانند )412(. ضعیت redox ریان در بیان بسیاری از ژنها عملک طبیعی سللها دخیل میباشد ممکن است تعیین کننده مسیر اثرات آنتی اکسیدانها یا کیالت کنندهها بر رند تکین ریان باشد. در سطح فیزیلژی طبیعی ROS به عنان یکی از اج ایفای نقش کننده در رند پیام رسانی سلل شناخته شده است )420( اهمیت حضر آنها در ریانها در تحقیقهای متعدد مشخص شده است )444(. بنابراین هدف آنتیاکسیدانها کیالت کنندههایی که به محیط کشت افزده میشند حفظ سطح ایمن برای ROS میباشد نباید اینگنه فرض شد که هدف حذف کامل این ماد از محیط کشت میباشد. غلظتهای نامناسب آنتیاکسیدانها یا کیالت کنندهها با در نظر داشتن اهمیت ROS ممکن است با فرایندهای طبیعی جاری در سلل تداخل ایجاد نماید. سطح بهینه برای چنین مکملهایی میبایست برای هر م از استفاده تعیین شد این م باید به طر یژه در م کشت ریان انسان نیز م تجه قرار بگی. مکانهای تلید بیش از حد رادیکالهای آد مکانهای اکنش آنتیاکسیدانها کیالت کنندههای استفاده شده به عنان مکمل نیازمند بررسیهای بیشتری میباشد. فهم این نکته که آیا حفاظت در مقابل ROS به صرت برن سللی یا درن سللی )یا ه( الزم میباشد یا خیر ممکن است که به عنان اهداف دیگری برای بهینه سازی محیط کشت در نظر گرفته شد. همچنین مطالعات بیشتری برای اینکه بین اثر محافظت کننده مستقیم مکملها عاقب اکنش آنها با اج محیط کشت تمیز قایل شیم الزم است. به عنان نکته آخر ممکن است که تفاتی مرتبط با منشا ریان در نظر داشتن اینکه ریان از منشا درن تنی حاصل شده یا در شرایط برنتنی شکل گرفته است در برز پاسخهای متفات حاصل از مکمل سازی با آنتیاکسیدان کیالت کنندهها نقش داشته باشد. در نهایت تاییدیههایی مبنی بر ترجیح در استفاده از آنتیاکسیدانها کیالت کنندههای فیزیلژی در مقابل ما مشابه مصنعی در کشت ریان جد دا. چنین ترکیباتی میتاند شامل پرتیینها اسیدهای آمینه یتامینها به جای ملکلهای مصنعی مانند EDTA باشند. پیشنهاد شده است که اگر کشت در شرایط حای اکسیژن %3 انجام شد آنتیاکسیدانها کیالت 491

137 کنندههای طبیعی به عنان مکملهای محافظت کننده در برابر ROS کافی میباشند )10(. اگرچه آنتی اکسیدانها کیالت کنندهها به طر معمل در محیطهای کشت ریان افزده میشند جنبههای زیاد مهمی از این ماد هستند که میبایست بررسی رشن شند. درحال حاضر باید در نظر داشت که در هنگام استفاده از این مکملها در محیط کشت ریان باید احتیاط الزم را به عمل آ تالش باید در جهت فهم اینکه چگنه هر مکمل افزده شده ممکن است با محیط کشت شیمیایی ریان اکنش دهد به انجام برسد. 4. Bertout J, Mahutte N, Preston S, Behrman H (2111) Reactive oxygen species and ovarian function. In: Leung PCK, Adashi EY (eds) The ovary, 2nd edn. Elsevier, London, pp Halliwell B (2110) Biochemistry of oxidative stress. Biochem Soc Trans 33: Hashimoto S, Minami N, Yamada M, Imai H (2111) Excessive concentration of glucose during in vitro maturation impairs the developmental competence of bovine oocytes after in vitro fertilization : relevance to intracellular reactive oxygen species and glutathione contents. Mol Reprod Dev 32: Cebral E, Carrasco I, Vantman D, Smith R (2110) Preimplantation embryotoxicity after mouse embryo exposition to reactive oxygen species. Biocell 34: Betts DH, Madan P (2119) Permanent embryo arrest: molecular and cellular concepts. Mol Hum Reprod 41: Nasr-Esfahani MH, Aitken JR, Johnson MH (4881) Hydrogen peroxide levels in mouse oocytes and early cleavage stage embryos developed in vitro or in vivo. Development 418: Bedaiwy MA, Falcone T, Mohamed MS, Aleem AA, Sharma RK, Worley SE, Thornton J, Agarwal A (2111) Differential growth of human embryos in vitro: role of reactive oxygen species. Fertil Steril 92: Krajcir N, Chowdary H, Gupta S, Agarwal A (2119) Female infertility and assisted reproduction: impact of oxidative stress. Curr Women s Health Rev 1:0 8. Agarwal A, Gupta S, Sharma RK (2113) Oxidative stress and its implications in female infertility a clinician s perspective. Reprod Biomed Online 44: Fischer B, Bavister BD (4883) Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys, hamsters and rabbits. J Reprod Fertil 88: Luvoni GC, Keskintepe L, Brackett BG (4882) Improvement in bovine embryo production in vitro by glutathione-containing culture media. Mol Reprod Dev 13: Pabon JE Jr, Findley W E, Gibbons WE (4898) The toxic effect of short exposures to the atmospheric oxygen concentration on early mouse embryonic development. Fertil Steril 34: Grzelak A, Rychlik B, Bartosz G (2114) Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radic Biol Med 31:9 41. Nakayama T, Noda Y, Goto Y, Mori T (4881) Effects of visible light and other environmental factors on the production of oxygen radicals by hamster embryos. Theriogenology 14: Goto Y, Noda Y, Mori T, Nakano M (4883) Increased generation of reactive oxygen species in embryos cultured in vitro. Free Radic Biol Med 43: Catt JW, Henman M (2111) Toxic effects of oxygen on human embryo development. Hum Reprod 43(Suppl 2): Bavister BD (4883) Culture of preimp lantation embryos: facts and artifacts. Hum Reprod Update 4: Halliwell B, Gutteridge JM (4898) Free radicals in biology and medicine, 2nd edn. Oxford University Press, New York, NY 48. Minotti G (4883) Sources and role of iron in lipid peroxidation. Chem Res Toxicol 2: Gutteridge JM (4890) A method for removal of trace iron contamination from biological buffers. FEBS Lett 241: منابع 494

138 24. Nasr-Esfahani M, Johnson MH, Aitken RJ (4881) The effect of iron and iron chelators on the in-vitro block to development of the mouse preimplantation embryo: BAT2 a new medium for improved culture of mouse embryos in vitro. Hum Reprod 3: Yang HW, Hwang KJ, Kwon HC, Kim HS, Choi KW, Oh KS (4889) Detection of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis in human fragmented embryos. Hum Reprod 43: Takahashi M, Nagai T, Hamano S, Kuwayama M, Okamura N, Okano A (4883) Effect of thiol compounds on in vitro develop ment and intracellu lar glutathione content of bovine embryos. Biol Rep rod 18: Gardiner CS, Reed DJ (4881) Status of glutathione during oxidant-induced oxidative stress in the preimplantation mouse embryo. Biol Reprod 34: Gardiner CS, Reed DJ (4883) Synthesis of glutathione in the preimplantation mouse embryo. Arch Biochem Biophys 349: Gardiner CS, Salmen JJ, Brandt CJ, Stover SK (4889) Glutathione is present in reproductive tract secretions and improves development of mouse embryos after chemically induced glutathione depletion. Biol Reprod 38: de Matos DG, Furnus CC (2111) The importance of having high glutathione (GSH) level after bovine in vitro maturation on embryo development effect of beta-mercaptoethanol, cysteine and cystine. Theriogenology 33: Harvey MB, Arcellana-Panlilio MY, Zhang X, Schultz GA, Watson AJ (4883) Expression of genes encoding antioxidant enzymes in preimplantation mouse and cow embryos and primary bovine oviduct cultures employed for embryo coculture. Biol Reprod 33: Ogasawara M, Nakamura T, Koyama I, Nemoto M, Yoshida T (4883) Reactivity of taurine with aldehydes and its physiological role. Chem Pharm Bull (Tokyo) 14: Debarbieux L, Beckwith J (2111) On the functional interchangeability, oxidant versus superfamily. J Bacteriol 492: Lindenbaum A (4803) A survey of naturally occurring chelating ligands. Adv Exp Med Biol 11: Jeppsen RB (2114) Toxicology and safety of Ferrochel and other iron amino acid chelates. Arch Latinoam Nutr 34: Lapointe J, Bilodeau JF (2113) Antioxidant defenses are modulated in the cow oviduct during the estrous cycle. Biol Reprod 29: Lapointe S, Sullivan R, Sirard MA (4889) Binding of a bovine oviductal fl uid catalase to mammalian spermatozoa. Biol Reprod 39: Noda Y, Matsumoto H, Umaoka Y, Tatsumi K, Kishi J, Mori T (4884) Involvement of superoxide radicals in the mouse two-cell block. Mol Reprod Dev 29: Chun YS, Kim JH, Lee HT, Chung KS (4881) Effect of superoxide dis mutase on the development of preimplantation mouse embryos. Theriogenology 14: Paszkowski T, Clarke RN (4888) The Graa fi an follicle is a site of l -ascorbate accumulation. J Assist Reprod Genet 42: Gardner DK, Leese HJ (4881) Concentrations of nutrients in mouse oviduct fl uid and their effects on embryo development and metabolism in vitro. J Reprod Fertil 99: Guerin P, Guillaud J, Menezo Y (4883) Hypotaurine in spermatozoa and genital secretions and its production by oviduct epithelial cells in vitro. Hum Reprod 41: Casslen BG (4890) Free amino acids in human uterine fl uid. Possible role of high taurine concentration. J Reprod Med 32: Guyader-Joly C, Guerin P, Renard JP, Guillaud J, Ponchon S, Menezo Y (4889) Precursors of taurine in female genital tract: effects on developmental capacity of bovine embryo produced in vitro. Amino Acids 43:

139 12. El Mouatassim S, Guerin P, Menezo Y (2111) Mammalian oviduct and protection against free oxygen radicals: expression of genes encoding antioxidant enzymes in human and mouse. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 98: Virji N, Phillips DM, Dunbar BS (4881) Identi fi cation of extracellular proteins in the rat cumulus oophorus. Mol Reprod Dev 23: Pemble LB, Kaye PL (4892) Whole protein uptake and metabolism by mouse blastocysts. J Reprod Fertil 09: Barbehenn EK, Wales RG, Lowry OH (4801) The explanation for the blockade of glycolysis in early mouse embryos. Proc Natl Acad Sci USA 04: Aguilar J, Reyley M (2113) The uterine tubal fluid: secretion, composition and biological effects. Anim Reprod 2: Orsi NM, Leese HJ (2114) Protection against reactive oxygen species during mous e preimplantation embryo development: role of EDTA, oxygen tension, catalase, superoxide dis mutase and pyruvate. Mol Reprod Dev 38: Fellman JH, Green TR, Eicher AL (4890) The oxidation of hypotaurine to taurine: bisaminoethylalpha-disulfone, a metabolic intermediate in mammalian tissue. Adv Exp Med Biol 240: Van Winkle LJ, Dickinson HR (4883) Differences in amino acid content of preimplantation mouse embryos that develop in vitro versus in vivo: in vitro effects of five amino acids that are abundant in oviductal secretions. Biol Reprod 32: Dumoulin JC, Evers JL, Bras M, Pieters MH, Geraedts JP (4882) Positive effect of taurine on preimplantation development of mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 81: Dumoulin JC, Evers JL, Bakker JA, Bras M, Pieters MH, Geraedts JP (4882) Temporal effects of taurine on mouse preimplantation development in vitro. Hum Reprod 0: Li J, Foote RH, Simkin M (4883) Development of rabbit zygotes cultured in protein-free medium with catalase, taurine, or superoxide dis mutase. Biol Reprod 18: Barnett DK, Bavister BD (4882) Hypotaurine requirement for in vitro development of golden hamster one-cell embryos into morulae and blastocysts, and production of term offspring from in vitro-fertilized ova. Biol Reprod 10: Devreker F, Van den Bergh M, Biramane J, Winston RL, Englert Y, Hardy K (4888) Effects of taurine on human embryo development in vitro. Hum Reprod 41: Devreker F, Hardy K (4880) Effects of glutamine and taurine on preimplantation development and cleavage of mouse embryos in vitro. Biol Reprod 30: Aruoma OI, Halliwell B, Hoey BM, Butler J (4899) The antioxidant action of taurine, hypotaurine and their metabolic precursors. Biochem J 232: Huxtable RJ (4882) Physiological actions of taurine. Physiol Rev 02: Liu Z, Foote RH (4883) Development of bovine embryos in KSOM with added superoxide dismutase and taurine and with fi ve and twenty percent O 2. Biol Reprod 33: Fujitani Y, Kasai K, Ohtani S, Nishimura K, Yamada M, Utsumi K (4880) Effect of oxygen concentration and free radicals on in vit ro develop ment of in vitro-produced bovine embryos. J Anim Sci 03: Dumoulin JC, van Wissen LC, Menheere PP, Michiels AH, Geraedts JP, Evers JL (4880) Taurine acts as an osmolyte in human and mouse oocytes and embryos. Biol Reprod 32: Wang X, Falcone T, Attaran M, Goldberg JM, Agarwal A, Sharma RK (2112) Vitamin C and vitamin E supplementation reduce o xidative stress-induced embryo toxicity and improve the blastocyst development rate. Fertil Steril 09: Tarin JJ, de los Santos MJ, de Oliveira MN, Pellicer A, Bonilla-Musoles F (4881) Ascorbatesupplemented media in short-term cultures of human embryos. Hum Reprod 8: McKiernan SH, Bavister BD (2111) Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins : pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod 43:

140 21. Olson SE, Seidel GE Jr (2111) Culture of in vitro-produced bovine embryos with vitamin E improves development in vitro and after transfer to recipients. Biol Reprod 22: Natarajan R, Shankar MB, Munuswamy D (2141) Effect of alpha-tocopherol supplementation on in vitro maturation of sheep oocytes and in vitro development of preimplantation sheep embryos to the blastocyst stage. J Assist Reprod Genet 20: Kitagawa Y, Suzuki K, Yoneda A, Watanabe T (2111) Effects of oxygen concentration and antioxidants on the in vitro developmental ability, production of reactive oxygen species (ROS), and DNA fragmentation in porcine embryos. Theriogenology 22: Thiyagarajan B, Valivittan K (2118) Ameliorating effect of vitamin E on in vitro development of preimplantation buffalo embryos. J Assist Reprod Genet 22: Feugang JM, de Roover R, Moens A, Leonard S, Dessy F, Donnay I (2111) Addition of betamercaptoethanol or Trolox at the morula/blastocyst stage improves the quality of bovine blastocysts and prevents induction of apoptosis and degeneration by prooxidant agents. Theriogenology 24: Halliwell B (4882) Vitamin C: antioxidant or pro-oxidant in vivo? Free Radic Res 23: Yamamoto K, Niki E (4899) Interaction of alpha-tocopherol with iron: antioxidant and prooxidant effects of alpha-tocopherol in the oxidation of lipids in aqueous dispersions in the presence of iron. Biochim Biophys Acta 839: Osiecki M, Ghanavi P, Atkinson K, Nielsen LK, Doran MR (2141) The ascorbic acid paradox. Biochem Biophys Res Commun 111: Olson SE, Seidel GE Jr (2111) Reduced oxygen tension and EDTA improve bovine zygote development in a chemically de fi ned medium. J Anim Sci 09: Jeong YW, Park SW, Hossein MS, Kim S, Kim JH, Lee SH, Kang SK, Lee BC, Hwang WS (2112) Antiapoptotic and embryotrophic effects of alpha-tocopherol and l -ascorbic acid on porcine embryos derived from in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer. Theriogenology 22: Donnelly ET, McClure N, Lewis SE (4888) The effect of ascorbate and alpha-tocopherol supplementation in vitro on DNA integrity and hydrogen peroxide-induced DNA damage in human spermatozoa. Mutagenesis 41: Matxain JM, Ristila M, Strid A, Eriksson LA (2112) Theoretical study of the antioxidant properties of pyridoxine. J Phys Chem A 441: Hellmann H, Mooney S (2141) Vitamin B2: a molecule for human health? Molecules 43: Stocker P, Lesgards JF, Vidal N, Chalier F, Prost M (2113) ESR study of a biological assay on whole blood: antioxidant ef fi ciency of various vitamins. Biochim Biophys Acta 4224: Slyshenkov VS, Rakowska M, Moiseenok AG, Wojtczak L (4883) Pantothenic acid and its derivatives protect Ehrlich ascites tumor cells against lipid peroxidation. Free Radic Biol Med 48: Slyshenkov VS, Dymkowska D, Wojtczak L (2111) Pantothenic acid and pantothenol increase biosynthesis of glutathione by boosting cell energetics. FEBS Lett 328: Kane MT, Bavister BD (4899) Vitamin requirements for development of eight-cell hamster embryos to hatching blastocysts in vitro. Biol Reprod 38: Tsai FC, Gardner DK (4881) Nicotinamide, a component of complex culture media, inhibits mouse embryo develop ment in vitro and reduces subsequent developmental potential after transfer. Fertil Steril 24: O Neill C (4889) Endogenous folic acid is essential for normal development of preimplantation embryos. Hum Reprod 43: Kane MT (4899) The effects of water-soluble vitamins on the expansion of rabbit blastocysts in vitro. J Exp Zool 213: Shirley BA (4898) Inhibition of development of preimplantation mouse embryos in vitro by some water soluble vitamins. Med Sci Res 40: Liu L, Trimarchi JR, Keefe DL (4888) Thiol oxidation-induced embryonic cell death in mice is prevented by the antioxidant dithiothreitol. Biol Reprod 24:

141 92. Harvey AJ, Kind KL, Thompson JG (2112) REDOX regulation of early embryo development. Reproduction 423: Nasr-Esfahani MH, Johnson MH (4882) Quantitative analysis of cellular glutathione in early preimplantation mouse embryos developing in vivo and in vitro. Hum Reprod 0: Wang WH, Day BN (2112) Development of porcine embryos produced by IVM/IVF in a medium with or without protein supplementation: effects of extracellular glutathione. Zygote 41: Ozawa M, Nagai T, Fahrudin M, Karja NW, Kaneko H, Noguchi J, Ohnuma K, Kikuchi K (2112) Addition of glutathione or thioredoxin to culture medium reduces intracellular redox status of porcine IVM/IVF embryos, resulting in improved development to the blastocyst stage. Mol Reprod Dev 03: McEvoy TG, Coull GD, Broadbent PJ, Hutchinson JS, Speake BK (2111) Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil 449: Meister A, Anderson ME, Hwang O (4892) Intracellular cysteine and glutathione delivery systems. J Am Coll Nutr 3: de Matos DG, Gasparrini B, Pasqualini SR, Thompson JG (2112) Effect of glutathione synthesis stimulation during in vitro maturation of ovine oocytes on embryo development and intracellular peroxide content. Theriogenology 30: Caamano JN, Ryoo ZY, Thomas JA, Youngs CR (4882) Beta-mercaptoethanol enhances blastocyst formation rate of bovine in vitromatured/ in vitro-fertilized embryos. Biol Reprod 33: Caamano JN, Ryoo ZY, Youngs CR (4889) Promotion of development of bovine embryos produced in vitro by addition of cysteine and beta-mercaptoethanol to a chemically defined culture system. J Dairy Sci 94: Lim JM, Liou SS, Hansel W (4882) Intracytoplasmic glutathione concentration and the role of betamercaptoethanol in preimplantation development of bovine embryos. Theriogenology 12: Takahashi M, Nagai T, Okamura N, Takahashi H, Okano A (2112) Promoting effect of betamercaptoethanol on in vitro development under oxidative stress and cystine uptake of bovine embryos. Biol Reprod 22: Lim JM, Reggio BC, Godke RA, Hansel W (4888) Development of in-vitro-derived bovine embryos cultured in 3 % CO 2 in air or in 3 % O 2, 3 % CO 2 and 81 % N 2. Hum Reprod 41: Ali AA, Bilodeau JF, Sirard MA (2113) Antioxidant requirements for bovine oocytes varies during in vitro maturation, fertilization and development. Theriogenology 38: Van Soom A, Yuan YQ, Peelman LJ, de Matos DG, Dewulf J, Laevens H, de Kruif A (2112) Prevalence of apoptosis and inner cell allocation in bovine embryos cultured under different oxygen tensions with or without cysteine addition. Theriogenology 30: Gardiner CS, Reed DJ (4883) Glutathione redox cycle-driven recovery of reduced glutathione after oxidation by tertiary-butyl hydroperoxide in preimplantation mouse embryos. Arch Biochem Biophys 324: de Matos DG, Herrera C, Cortvrindt R, Smitz J, Van Soom A, Nogueira D, Pasqualini RS (2112) Cysteamine supplementation during in vitro maturation and embryo culture: a useful tool for increasing the ef fi ciency of bovine in vitro embryo production. Mol Reprod Dev 22: Holleman MAF (4811) Notice sur l action de l eau oxygenee sur les acides alpha-cetoniques et sur les dicetones. Recl Trav Chim Belg 23: Andrae U, Singh J, Ziegler-Skylakakis K (4893) Pyruvate and related alpha-ketoacids protect mammalian cells in culture against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity. Toxicol Lett 29: O Donnell-Tormey J, Nathan CF, Lanks K, DeBoer CJ, de la Harpe J (4890) Secretion of pyruvate. An antioxidant defense of mammalian cells. J Exp Med 423: Salahudeen AK, Clark EC, Nath KA (4884) Hydrogen peroxide-induced renal injury. A protective role for pyruvate in vitro and in vivo. J Clin Invest 99: Long LH, Halliwell B (2118) Artefacts in cell culture: pyruvate as a scavenger of hydrogen peroxide generated by ascorbate or epigallocatechin gallate in cell culture media. Biochem Biophys Res Co mmun 399:

142 410. Babich H, Liebling EJ, Burger RF, Zuckerbraun HL, Schuck AG (2118) Choice of DM EM, formulated with or without pyruvate, plays an important role in assessing the in vitro cytotoxicity of oxidants and prooxidant nutraceuticals. In Vitro Cell Dev Biol Anim 13: Morales H, Tilquin P, Rees JF, Massip A, Dessy F, Van Langendonckt A (4888) Pyruvate prevents peroxide-induced injury of in vitro preimplantation bovine embryos. Mol Reprod Dev 32: O Fallon JV, Wright RW (4883) Pyruvate revisited: a non-metabolic role for pyruvate in preimplantation embryo development. Theriogenology 13: Weathersbee PS, Pool TB, Ord T (4883) Synthetic serum substitute (SSS): a globulinenriched protein supplement for human embryo culture. J Assist Reprod Genet 42: Esfandiari N, Falcone T, Agarwal A, Attaran M, Nelson DR, Sharma RK (2113) Protein supplementation and the incidence of apoptosis and oxidative stress in mouse emb ryos.obstet Gynecol 413: Halliwell B (4899) Albumin an important extracellular antioxidant? Biochem Pharmacol 30: Halliwell B, Gutteridge JM (4881) The antioxidants of human extracellular fl uids. Arch Biochem Biophys 291: Umaoka Y, Noda Y, Narimoto K, Mori T (4882) Effects of oxygen toxicity on early development of mouse embryos. Mol Reprod Dev 34: Nonogaki T, Noda Y, Narimoto K, Umaoka Y, Mori T (4884) Protection from oxidative stress by thioredoxin and superoxide dismutase of mouse embryos fertilized in vitro. Hum Reprod 2: Payne SR, Munday R, Thompson JG (4882) Addition of superoxide dis mutase and catalase does not necessarily overcome developmentalretardation of one-cell mouse embryos during in-vitro culture. Reprod Fertil Dev 1: Legge M, Sellens MH (4884) Free radicalscavengers ameliorate the 2-cell block in mouse embryo culture. Hum Reprod 2: Karja NW, Kikuchi K, Fahrudin M, Ozawa M, Somfai T, Ohnuma K, Noguchi J, Kaneko H, Nagai T (2112) Development to the blastocyst stage, the oxidative state, and the quality of early developmental stage of porcine embryos cultured in alteration of glucose concentrations in vitro under different oxygen tensions. Reprod Biol Endocrinol 1: Iwata H, Akamatsu S, Minami N, Yamada M (4888) Allopurinol, an inhibitor of xanthine oxidase, improves the development of IVM/ IVF bovine embryos (>1 cell) in vitro under certain culture conditions. Theriogenology 34: Matsui M, Oshima M, Oshima H, Takaku K, Maruyama T, Yodoi J, Taketo MM (4882) Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mouse thioredoxin gene. Dev Biol 409: Kobayashi-Miura M, Nakamura H, Yodoi J, Shiota K (2112) Thioredoxin, an anti-oxidant protein, protects mouse embryos from oxidative stress-induced developmental anomalies. Free Radic Res 32: Natsuyama S, Noda Y, Narimoto K, Umaoka Y, Mori T (4882) Release of two-cell block by reduction of protein disul fi de with thioredoxin from Escherichia coli in mice. J Reprod Fertil 83: Goto Y, Noda Y, Narimoto K, Umaoka Y, Mori T (4882) Oxidative stress on mouse embryo development in vitro. Free Radic Biol Med 43: Bing YZ, Hirao Y, Takenouchi N, Che LM, Nakamura H, Yodoi J, Nagai T (2113) Effects of thioredoxin on the preimplantation development of bovine embryos. Theriogenology 38: Spector A, Yan GZ, Huang RR, McDermott MJ, Gascoyne PR, Pigiet V (4899) The effect of H 2 O 2 upon thioredoxin-enriched lens epithelial cells. J Biol Chem 223: Natsuyama S, Noda Y, Yamashita M, Nagahama Y, Mori T (4883) Superoxide dismutase and thioredoxin restore defective p31cdc2 kinase activation in mouse two-cell b lock. Biochim Biophys Acta 4402: Whitten WK (4804) Nutrient requirements for the culture of preimplantation embryos in vitro. In: Raspa G (ed) Advances in the Biosciences, Vol 2. Pergamon Press, Oxford, pp

143 429. Abramczuk J, Solter D, Koprowski H (4800) The bene fi cial effect EDTA on development of mouse one-cell embryos in chemically defined medium. Dev Biol 24: Loutradis D, John D, Kiessling AA (4890) Hypoxanthine causes a 2-cell block in randombred mouse embryos. Biol Reprod 30: Fissore RA, Jackson KV, Kiessling AA (4898) Mouse zygote development in culture medium without protein in the presence of ethylenediaminetetraacetic acid. Biol Reprod 14: Nasr-Esfahani MH, Winston NJ, Johnson MH (4882) Effects of glucose, glutamine, ethylenediaminetetraacetic acid and oxygen tension on the concentration of reactive oxygen species and on development of the mouse preimplantation embryo in vitro. J Reprod Fertil 82: Nakao H, Nakatsuji N (4881) Effects of coculture, medium components and gas phase on in vitro culture of in vitro matured and in vitro fertilized bovine embryos. Theriogenology 33: Gardner DK, Lane MW, Lane M (2111) EDTA stimulates cleavage stage bovine embryo development in culture but inhibits blastocyst development and differentiation. Mol Reprod Dev 30: Mehta TS, Kiessling AA (4883) The developmental potential of mouse embryos conceived in Ham s F-41 medium containing ethylenediaminetetraacetic acid. Fertil Steril 21: Biggers JD, McGinnis LK, Lawitts JA (2113) One-step versus two-step culture of mouse preimplantation embryos: is there a difference? Hum Reprod 21: Biggers JD, McGinnis LK, Summers MC (2112) One-step versus two-step culture of mouse preimplantation embryos. Hum Reprod 24: Gardner DK, Lane M (4882) Alleviation of the 2-cell block and development to the blastocyst of CF 4 mouse embryos: role of amino acids, EDTA and physical parameters. Hum Reprod 44: Chaberek S, Martell AE (4838) Organic sequestering agents. Wiley, New York, NY 438. Martin-Romero FJ, Miguel-Lasobras EM, Dominguez-Arroyo JA, Gonzalez-Carrera E, Alvarez IS (2119) Contribution of culture media to oxidative stress and its effect on human oocytes. Reprod Biomed Online 40: Erbach GT, Bhatnagar P, Baltz JM, Biggers JD (4883) Zinc is a possible toxic contaminant of silicone oil in microdrop cultures of preimplantation mouse embryos. Hum Reprod 41: Hentemann M, Bertheussen K (2118) New media for culture to blastocyst. Fertil Steril 84: Lane M, Gardner DK (2110) Embryo culture medium: which is the best? Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 24: Gardner DK, Vella P, Lane M, Wagley L, Schlenker T, Schoolcraft W B (4889) Culture and transfer of human blastocysts increases implantation rates and reduces the need for multiple embryo transfers. Fertil Steril 28: Lawitts JA, Biggers JD (4884) Optimization of mouse embryo culture media using simplex methods. J Reprod Fertil 84: Biggers JD, Racowsky C (2112) The development of fertilized human ova to the blastocyst stage in KSOM(AA) medium: is a two-step protocol necessary? Reprod Biomed Online 3: Crabtree HG (4828) Observations on the carbohydrate metabolism of tumours. Biochem J 23: Lane M, Gardner DK (2114) Inhibiting 3-phosphoglycerate kinase by EDTA stimulates the development of the cleavage stage mouse embryo. Mol Reprod Dev 21: Matsukawa T, Ikeda S, Imai H, Yamada M (2112) Alleviation of the two-cell block of ICR mouse embryos by polyaminocarboxylate metal chelators. Reproduction 421: Macklon NS, Pieters MH, Hassan MA, Jeucken PH, Eijkemans MJ, Fauser BC (2112) A prospective randomized comparison of sequential versus monoculture systems for in-vitro human blastocyst development. Hum Reprod 40: Gray CW, Morgan PM, Kane MT (4882) Puri fi cation of an embryotrophic factor from commercial bovine serum albumin and its identification as citrate. J Reprod Fertil 81:

144 434. Holm P, Booth PJ, Schmidt MH, Greve T, Callesen H (4888) High bovine blastocyst development in a static in vitro production system using SOFaa medium supplemented with sodium citrate and myo-inositol with or without serum-proteins. Theriogenology 32: Sung LY, Du F, Xu J, Chang W, Nedambale TL, Zhang J, Jiang S, Tian XC, Yang X (2111) The differential requirement of albumin and sodium citrate on the development of in vitro produced bovine embryos. Reprod Nutr Dev 11: Keskintepe L, Brackett BG, Menezo Y, Kaufmann RA, Servy EJ, Bagis H (4889) Influences of EDTA and sodium citrate on initial bovine embryo development in defined conditions. Theriogenology 18: Cho MJ, Scieszka JF, Burton PS (4898) Citric acid as an adjuvant for transepithelial transport. Int J Pharm 32: Kuran M, Robinson JJ, Staines ME, McEvoy TG (2114) Development and de novo protein synthetic activity of bovine embryos produced in vitro in different culture systems. Theriogenology 33: Keskintepe L, Brackett BG (4882) In vitro developmental competence of in vitro-matured bovine oocytes fertilized and cultured in completely defined media. Biol Reprod 33: Rorie RW, Miller GF, Nasti KB, McNew RW (4881) In vitro development of bovine embryos as affected by different lots of bovine serum albumin and citrate. Theriogenology 12: Lim KT, Lee BC, Kang SK, Hwang WS (2113) Effects of protein source and energy substrates on the in vitro development of bovine embryos in a two-step culture system. J Vet Sci 1: Gomez E, Duque P, Diaz E, Diez C (2114) Effects of acetoacetate on in vitro development of bovine embryos in medium containing citrate and myo-inositol. Reprod Domest Anim 32: Keskintepe L, Burnley CA, Brackett BG (4883) Production of viable bovine blastocysts in defined in vitro conditions. Biol Reprod 32: Anderson GJ, Vulpe CD (2118) Mammalian iron transport. Cell Mol Life Sci 22: Nasr-Esfahani MH, Johnson MH (4882) How does transferrin overcome the in vitro block to development of the mouse preimplantation embryo? J Reprod Fertil 82: Harvey AJ, Kind KL, Thompson JG (2110) Regulation of gene expression in bovine blastocysts in response to oxygen and the iron chelator desferrioxamine. Biol Reprod 00: Buettner GR (4899) DETAPAC (DTPA), aqueous stock solution. University of Iowa, Iowa City, IA 423. Engelmann MD, Bobier RT, Hiatt T, Cheng IF (2113) Variability of the Fenton reaction characteristics of the EDTA, DTPA, and citrate complexes of iron. Biometals 42: Larson AA, Kitto KF (4888) Chelation of zinc in the extracellular area of the spinal cord, using ethylenediaminetetraacetic acid disodium-calcium salt or dipicolinic acid, inhibits the antinociceptive effect of capsaicin in adult mice. J Pharmacol Exp Ther 299: Kamata H, Hirata H (4888) Redox regulation of cellular signalling. Cell Signal 44:43 498

145 فصل 41 اج محیط کشت: ph بافرها یکی از اساسیترین عامل تاثیر گذار در رند کشت برنتنی ریان گامتها با بازده بهینه ph مناسب محیط کشت میباشد. انتخاب ph صحیح برای محیط کشت پایدار نگهداشتن این ph به عنان متغیرهای با اهمیتی در کاهش استرس داخل سللی بهینه نمدن رند تکین ریان گامت کشت شده در شرایط برنتنی در نظر گرفته میشد. در این فصل تنظیم ph داخل سللی (phi) ph خارج سلل (phe) م بحث قرار خاهد گرفت. همچنین رشهایی به منظر جلگیری از نسانات مخرب در phe نیز م بررسی قرار میگی. به عاله ریکهای مناسب به منظر حصل اطمینان از اندازهگیری دقیق phe محیط کشت نیز تضیح داده خاهد شد مقدمه معمال بحث درم محیط کشت ریان مستلزم داشتن دانشی عمیق پیرامن نقش مکملهایی است که به محیط کشت افزده میشند همچنین داشتن اطالعات در م اثر غلظتهای متفات یا ترکیبات مختلف حاصل از این ماد بر حمایت از ریان در حال تکین میباشد. این مکملها شامل ماد منشا انرژی یا پرتیینها میباشند. به هر ری در پایه این نع از مطالعات که به بررسی افزدنیهای مکمل میپازند یکی از پایهایترین اصل کشت برنتنی سلل قرار گرفته است که استرس تحمیل شده به سلل را در زمانی که در شرایط برنتنی م دسترزی قرار میگی به کمترین حد خد برساند. به عاله کاهش دادن عامل ایجاد کننده استرس خارج سللی منجر به کاهش آشفتگی بینظمیهای درن سللی میشد. این کاهش عامل استرس در نهایت به حفظ همستازی کمک میکند حفظ همستازی به عنان یکی از مهمترین عامل در بهینه سازی سیستم کشت به حساب میآید. دست یابی به این مفقیت فقط به اسطه تنظیم دقت در فرمالسین محیط کشت حاصل نمیشد بلکه باید در دسترزی آمادهسازی سللها دقت نمد. همچنین میبایست دقت کافی در استفاده کنترل مکملهای مجد در آزمایشگاه اعمال شد. نکته مهم دیگر این است که میبایست تجه الزم کافی را نسبت به جزییات در نظر داشت. مهمترین نکته در تالش جهت کاستن از استرس این است که سللها در انکباتر آزمایشگاهی به صرت محصر شده قرار داده شند زمان خارج سازی آنها از انکباتر به کمترین مقدار ممکن کاهش یابد. الزم به یادآری است که انکباتر فقط در شرایطی که عامل مناسب به منظر حفظ رطبت الزم دما غلظتهای گازی م نیاز گامتها ریانها به درستی تنظیم شده باشند میتاند نقش محافظتی خد را ایفا نماید. غلظت گازی مجد در انکباتر به یژه مقدار CO 2 تنظیم کننده ph خارجی محیط کشت میباشد.(pHe) به عاله حداقل برای مدت بسیار کتاهی انکباتر باید گشده شد تا سللها برای اهداف مختلفی خارج شده م بررسی در آزمایشگاه قرار بگیرند. برای اضح شدن اهمیت شرایط کشت باید ذکر شد که phe محیط کشت به عنان یکی از مهمترین متغیرهایی که میتاند در بهینه سازی سیستم کشت ایفای نقش کند در نظر گرفته میشد به گنهای که phe نامناسب میتاند رند تکین ریان را مختل نماید. چن phe نقطه پایانی است که به طر مستقیم در آزمایشگاه قابل کنترل است بنابراین شایسته تجه سخت گیرانه میباشد باید دامنهای بسیار باریک برای آن تعریف شد. به عاله تالشهای صرت گرفته به منظر حفظ ph پایدار برای ریههایی که خارج از محیط محصر شده انکباتر رخ میدهد به منظر جلگیری از آشفتگیهای درن سللی کاهش اثرات مخرب آن بر عملک گامتها تکین ریان به نعی اجتناب ناپذیر میباشد. بنابراین کامال اضح است که کنترل مشاهده مدام phe استفاده از ابری حفاظتی برای پایدار نمدن phe از جمله بافرها از عاملی هستند که در بهینهسازی سیستم کشت ریان از اهمیت بسیار باالیی برخار میباشند بررسی دقت بیشتر در استفاده از بافرها در راستای بیهنهسازی محیط کشت تضمین کننده رند مفقیت کشت برنتنی خاهد بد. 493

146 شد تعریف ph ph اندازه اسیدی یا بازی بدن یک ماده است که به مجب آن اسید به عنان مادهای تعریف میشد که غلظت ین + H را افیش میدهد باز به مادهای گفته میشد که غلظت ین هیدرژن را کاهش میدهد. بنابراین ph اندازه غلظت ین +H میباشد. قابل تجه این است که این ینها در مقادیر بسیار کم در محلل جد دارند درنتیجه به آسانی قابل مشاهده نیستند. بنابراین مقایس لگاریتمی منفی به منظر نشان دادن محاسبه آن به کارگرفته شده است که منجر به فراهم شدن یک سیستم شمارشی قابل فهم مدیریت شده است. به عنان مثال: 1/ ین +H در یک معادله لگاریتمی منفی به صرت =1/ log 0 تبدیل میشد. یکی از د طرف معادله با یک عبارت آشنا جایگزین میشد: -log(h+) به عنان یک نکته جالب -log را میتان با حرف p جایگزین نمد. برخی از حرف p به منظر تاکید بر قدرت هیدرژن استفاده مینمایند. بدن در نظر گرفتن دلیل استفاده از p با جایگزین نمدن p در معادله باال شکل آن به صرت زیر تغییر میکند: P(H+) یا.pH بنابراین معادله به صرت (+H) ph=-log نشته میشد. مقیاس نتیجه شده از این معادله در دامنه 41-4 قرار میگی از شماره 4-0 مقایس به عنان اسید م سنجش قرار میگی باز از دامنه 0-41 در نظر گرفته میشد نقطه میانی این دامنه که معدل 0 ph است نقطه خنثی ذکر میشد. مهم است که بدانیم ph خارج سللی یا ph محیط کشت به عنان phe شناخته میشد درحالی که ph داخل سللی به عنان phi شناخته میشد. اهمیت این جداسازی در ادامه بحث خاهد اهمیت phi phe به منظر ارزیابی نمدن اهمیت phe مناسب پایدار میبایست ابتدا مفهم تنظیم phi درک شد. تنظیم کتاه مدت phi در سلل به اسطه ظرفیت بافری فیزیشیمیایی محدد مجد در سیتپالسم رخ میدهد )4(. به عاله ریان دارای ناقلینی میباشد که که امکان حفظ phi را فراهم میآرند )42-4(. این ناقلین شامل تنظیم کنندههایی هستند که با اسیدز 489 داخل سللی مقابله مینماید از جمله تعیض کننده - /Cl HCO3 - ابسته به سدیم (HCE) آنتیپرتر Na+/H+ یا تعیض کننده - /Cl HCO3 - به منظر مقابله با آلکالز )شکل 4-41(. جالب تجه است که تانایی تنظیم phi با تغییر مرحله تکین زندگی سلل تغییر مییابد. مشخص شده است که ریانهای در مراحل مرال بالستسیست کنترل بسیار شدیدتری برای phi 488 دارند شاید دلیل این امر تشکیل اتصاالت محکم بین سللها باشد )8( درحالی که اسیتهای بالغ عاری شده از کملس دارای ظرفیت تنظیمی کم تانی برای تنظیم phi میباشند. تانایی تنظیم phi به طر طبیعی به اسطه سللهای کملس اطراف اسیت فراهم میشد )41 43( این تانایی در اسیتهای مشی بالغ عاری از کملس تنها بعد از گذشت چندین ساعت از قع لقاح تا حددی به جد میآید )43 3( اسیتهای گا انسان تانایی بسیار کمی در مقابله با شرایط آلکالز دارا میباشند )41 2(. 0 در می که کملسهای اسیت به عمد باشته شده است از جمله در هنگام انجام ICSI طبیعت بسیار حساس اسیت اهمیت ثبات phe قابل اثبات است. به هر رری میبایست خاطر نشان نمد که اگرچه تنظیم کنندههای phi در ریان حضر دارند phi در ابتدا به نعی متاثر از pheمیباشد این رند تا زمانی که مکانیسمهای تنظیم کننده فعال شند ادامه دا )41( ریههای آزمایشگاهی از جمله vitrificationمیتاند بر این تنظیم کنندهها تاثیر گذار باشد فعال شدن این تنظیمگرها را با تاخیر ماجه نماید )42(. برای مشاهده مستقیم اثرات phe میتان به آسانی تکین ریان را در باالتر از دامنه phe م ارزیابی قرار داد )40 2( این تاثیر به نظر میرسد که به دلیل تغییر در phi باشد. در حقیقت phi چندین مکانیسم مختلف درن سللی که میتانند بر ریان تاثیر گذار باشند را کنترل مینماید همچنین تکین ریان را نیز تحت تاثیر خد قرار میدهد )49(. به عنان یک مثال باالرفتن )0/1( یا پایین آمدن )2/9( phi در ریانهای مش برای مدت 3 ساعت مکانیابی میتکندریها فیالمنتهای اکتین را در مقایسه با گره کنترل که )2 phi 0( داشته است را مختل antiporter tight-junctions 411

147 که است )48(. حتی یک افیش کچک در phiمیتاند به شدت ری متابلیسم ریان از طریق تنظیم آنزیمهای متفات اثر گذار باشد از جمله این آنزیمها فسففرکتکیناز (PFK) میباشد. باالرفتن phi به مقدار 1/4-1/43 احد به طر معنی دار منجر به افیش رند گلیکلیز میشد متابلیسم اکسیداتی را کاهش میدهد )42 8( که این ما میتانند به شدت رند تکین ریان را تحت تاثیر قرار دهند. در یک رند جایگزین میتان بیان نمد که انرژی مصرف شده جهت حفظ phi در زمانی که phe بهینه نمیباشد ممکن است که تضیحی دیگر برای کاهش نرخ تکین ریان باشد. با این جد مطالعات انجام شده پیرامن مفهم phi میتاند به عنان مضعی سدمند در تعریف phe مناسب در نظر گرفته شد. مکرار نشان داده شده است که phi اسیت انسان ریانها در حدد 0/4 میباشد که به طر مشخص نسبت به ph اغلب مایعات بدن که معادل 0/1 است پایینتر میباشد. شکل ناقلین تنظیم کننده phi که در ریان شناسایی شدهاند. ریان امکان تکین در باالتر از دامنه phe را میدهد. اگرچه در ریان ابتدا phi پیر phe میباشد این مکانیسمهای تنظیم کننده به.2-41 phe کاربی حال که اهمیت phi phe مشخص شد ارتباط بین این د به صرت شفاف بیان شد بحث پیرامن phe از دیدگاه کاربی در جهت تالش برای بهینه سازی سیستم کشت میتاند مفید باشد. به این منظر بررسی phe با این دید که در 3 فاز در آزمایشگاه میبایست به phe تجه نمد ممکن است که سدمند باشد این سه فاز عبارتند از تعادل نقط بهینه پایدار سازی )ثبات( )شکل 2-41( تعادل phe داخل محفظه انکباتر آزمایشگاه phe نتیجه الیه CO 2 مقدار بیکربنات مجد در محیط کشت میباشد. محتای گاز CO 2 مجد در انکباتر در محلل حل میشد تا اسید کربنیک تلید نماید این اسید کربنیک با مقدار بیکربنات حل شده در محیط کشت به تعادل میرسد. به طر کلی سطح بیکربنات که به صرت سدیم بیکربنات به محیط افزده شده است تسط شرکت تلید کننده محیط کشت تنظیم میشد. بنابراین به منظر تنظیم نقطه بهینه phe محیط کشت مقدار CO 2 مجد در انکباتر باید تنظیم شد. یک رابطه معکس بین مقدار CO 2 ph جد دا که هرچه CO 2 باالتر برد مقدار ph کاهش می- یابد. به تعادل رسیدن مستلزم در نظر داشتن مدت زمان الزم برای انتشار گاز به محیط کشت زمان بندی اکنش مربط به تلید اسید کربنیک میباشد. بنابراین phe آغاز کننده phe نهایی به عنان عامل مهمی در تنظیم ph محیط کشت باید در نظر گرفته شند. دلیل گازدهی بطریهای حای محیطهای کشت با %2 2 CO بعد از گشدن درب بطری در برخی آزمایشگاهها این است که phe الیه را پایین آرند به افیش سرعت رسیدن به تعادل کمک نمایند. به عاله استفاده از حجمهای کمتر محیط کشت در ظرف کشت با استفاده از رغن کمتر به عنان پشاننده حتی نیمه باز گذاشتن درپش ظرف کشت به phe Equilibration 414

148 منظر افیش مبادله گاز حصل اطمینان از اینکه رغن پشاننده قطرهها باعث ایجاد یک الیه نفذ ناپذیر در برابر گاز نمی- شد میتاند در رند برقراری تعادل تسریع ایجاد نماید. شکل سه مرحله در ایجاد phe که میتان برای کشت برنتنی ریان تعیین نمد. هر مرحله از منظر بهینه سازی سیستم کشت حایز اهمیت میباشد نقطه تنظیم phe پاسخ به این سال که چه غلظتی از CO 2 در انکباتر باید استفاده شد بسیار مشکل است. برای تنظیم بهترین phe هم CO 2 هم انکباتر به عنان اساسیترین عامل دخیل در این ریه در نظر گرفته میشند البته این د عامل تنها عامی نیستند که باید در نظر گرفته شند. به عنان مثال منبع پرتئینی غلظت آن هر د جز عامل تاثیر گذار بر phe هستند. به عاله ارتفاع آزمایشگاه از سطح دریا نیزبه عنان یکی دیگر از عامل تاثیر گذار به حساب میآید. بنابراین محیطهای کشت پایهای یکسان ممکن است که نقطه تنظمی phe متفاتی را در د آزمایشگاه متفات از خد نشان دهند حتی اگر سطح یکسانی از CO 2 برای آنها فراهم شد. ما آغاز به بررسی این مشکل نمدهایم این کار از طریق تنظیم CO 2 در غلظت مشخص برای انکباتر یا سیلندر گاز مخلط انجام میشد مثال تنظیم در %2. مجدادا باید ذکر کنیم که باتجه به این شرایط برای تعیین phe بهینه پاسخ به این سال که کدام phe بهترین است بسیار سخت میباشد. همچنین به نظر میرسد که باید بگییم هیچ phe را نمیتان بهینه در نظر گرفت. انحراف به مقدار زیاد در مقدار phe نسبت به مقدار phi که نزدیک به 0/4 تعیین شده است منجر به برز استرس برای ریان میشد چن در این صرت منابع بیشتری برای حفظ phi بهینه م نیاز میباشد. بنابراین شاهد معمل به ما میگیند که pheمیبایست به مقدار بسیار کمی نسبت به phi باال باشد تا بتاند اسیدی شدنی را که نتیجه متابلیسم درن سللی ریان است را متعادل نماید. بنابراین شرکتهای تلید کننده محیطهای کشت تجاری معمال تصیه میکنند که phe در محدده 0/2-0/1 تنظیم شد البته این دامنه تسط بسیاری از آزمایشگاهها به عنان دامنه بهینه برای کشت ریان در نظر گرفته میشد البته برخی آزمایشگاهها ترجیح در کشت ریانها در محیطی با ph نزدیک به 0/2 دارند. متاسفانه به نظر میرسد که phe بهینهای جد ندا چن این مقدار از یک محیط به محیط دیگر براساس اج مجد در هر محیط کشت میتاند متفات باشد. مقادیر منکربکسیلیک اسید مانند الکتات پیرات در محیط کشت میتانند phi را کاهش دهند )21 8(. به عاله اسیدهای آمینه یژهای از جمله گلیسین تائرین گلتامین به عنان zwitterionها عمل مینمایند کمک به سیستم بافری برای phi مینمایند )8(. بنابراین ریانهایی که در محیطهای کشت با مقادیر متفات این ماد کشت داده میشند ممکن است که دارای phi متفاتی باشند اگرچه که phe برای این محیطها یکسان در نظر گرفته شده باشد. به عاله اینکه آیا ریان در مراحل ابتدایی کلیاژ در مقایسه با مراحل بعدی تکین ریان phe متفاتی را م ترجیح قرار میدهند هنز مشخص نیست )همانطر که ذکر شد مشخص شده است که ریان در مراحل پایانی تکین مرال بالستسیست در مقایسه با ریان در مراحل ابتدایی تکن میتانند phi خد را با قدرت بیشتری تنظیم نمایند(. همانطر که پیشتر از این نیزبیان شد دادههای ضعیفی جد دا که بیان میدا phe کمی قلیایی شده ممکن است که نرخ لقاح را بد ببخشد. مطالعه انجام شده تسط Dale همکاران )0( نشان داد که نرخهای باالتری از اتصال اسپرم به زناپلسیدای لخت شده در 0/3 phe در مقایسه با phe پایینتر رخ میدهد اگرچه اتصال اسپرم به زنای لخت شده ارتباط آن با لقاح ممکن است که کمی سال برانگیز باشد. این مطلب ممکن است منجر به ایجاد الگی "باال-پایین-باال در لقاح برنتنی شد اسیت phe 412

149 باال برای انجام لقاح نیاز دا ریان در مرحله کلیاژ phe پایینتری را طلب میکند کشت بالستسیست نیازمند phe باالتر میباشد. این الگ تسط شرکتهای تلید کننده محیط کشت از طریق تنظیم سطح بیکربنات به اجرا در میآید بنابراین هر نع اثر بالقه بر ری تکین ریان نمیتاند فقط مربط به ph به تنهایی باشد ممکن است به دلیل تغییرات در سطح بیکربنات باشد. همچنین باید در نظر داشت که این الگ ممکن است با آنچه که سلل در محیط دستگاه تناسلی phe آن تجربه مینماید در تعامل نباشد. برای مثال در گا معمال ایداکت دارای محیط قلیایی بده رحم آن اسیدیتر میباشد )22 24(. بنابراین هنز مشخص نیست که اگر یک phe م استفاده قرار بگی یا phe در مدت کشت ریان تغییر نماید منجر به برز اثرات مثبت میشد یا خیر. بدن تجه به این ما درحالی که شرکتهای تجاری مختلف دامنه سیعی از phe قابل قبل برای محیط- های کشت خد تعریف نمدهاند )جدل 4-41( برخی آزمایشگاهها ممکن است در م مفید بدن phe به نسبت پایین برای کشت ریان به بحث بپازند هیچ شک تیدی جد ندا که تنظیم دقیق شدید phe در یک دامنه بسیار باریک به عنان یکی از اج اساسی کنترل کیفی آزمایشگاه در جهت بهینه نمدن سیستم کشت به حساب میآید پایدار شدن phe شاید بتان بیان نمد که پایدار سازی phe به همان اندازه تنظیم نقطه بهینه phe دارای اهمیت میباشد. این نکته زمانی بیشتر قابل تجه خاهد شد که در نظر داشته باشیم با ظهر ریک کشت ریان در قطرههای کشت با حجم کم تراکم باالی سللها در هنگام کشت منجر به کاهش خطرناک در phe میشد. اما برهم خن افیش آسیب زننده phe در اثر ایجاد بینظمی در محیط انکباتر باید بیشتر م تجه باشد از جمله دالیل برهم خن شرایط درنی انکباتر میتان به باز بسته نمدن در انکباتر اشاره نمد. این یکی از دالیلی است که در آزمایشگاهها تعداد بیماران برای هر انکباتر محدد شده باید باشد که تعداد دفعات باز بسته شدن در انکباتر را به حد اقل برساند همچنی دلیلی بر این نکته است که ظرف کشت فقط خارج از انکباتر برای مدت بسیار کتاهی م بررسی قرار میگیرند. به عاله زمانی که تغییری در phe اتفاق میافتد مضع رسیدن مجدد به تعادل به عنان یکی از نگرانیهای محققین در نظر گرفته میشد زیرا phe میبایست به نقطه تنظیم بهینه خد بازگد این ریه بازگشت مجدد به تعادل میتاند برای چندین ساعت به طل بیانجامد. اگرچه استفاده از درهای داخلی برای انکباتر رغن معدنی پشاننده ری قطرات کشت میتانند فرار گاز را کاهش دهند همچنین استفاده از انکباترهای کچکتر به عنان عاملی کمک کننده در بازیافت گاز میتاند در نظر گرفته شد اما این ریکها کامل بی- نقص نمیباشند. بنابراین به طر فیندهای مشخص شده است که از بافرها در محیط کشت برای کمک به حفظ پایداری phe به عنان ابری ارزشمند در کاهش استرس محیطی در ریههایی که در خارج از انکباتر به قع میپیندد از جمله منجمد 214 سازی ICSI انتقال ریان استفاده میشد بافرهای phe برای ریههایی که در خارج از انکباتر به قع میپیندد استفاده از بافرهای بیلژیکی به عنان یکی از ابرهای ارزشمند در پایدار سازی phe جلگیری از انحراف این مقدار به صرتی که برای سالمت ریانها بسیار مضر میباشند جلگیری به عمل میآرند. تقریبا 21 بافر مصنعی ارگانیک که عمدتا ز اسیدهای آمینه zwitterionic تلید شدهاند برای حفظ phe در دامنه م انتظار فرمله تلید شدهاند )23-23(. دامنههای تصیه شده ممکن است بر اساس نع سلل استفاده شده مرحله تکین متفات باشد. phe بهینه متفات خاهد بد زیرا محیطهای متفات دارای ترکیبات متفات میباشند که در نهایت باعث تاثیر بر phi میشد. به عاله مقدار پرتئین میتاند phe را تغییر دهد باید در نظر گرفته شد )ستارهها اشاره به این دارند که ph تصیه شده تسط کمپانیها در آزمایشگاه باید با استفاده از سطح CO 2 انکباتر به سطح بهینه 0/3 برسانند(. این بافرها معمال به عنان Good s Buffers برای دانشمندانی که آنها را تلید نمدهاند شناخته میشند این بافرها cryopreservation 419

150 ایجاد کننده ظرفیت بافری مکمل در باالتر از محدده فیزیلژی ) ( هستند. این ریه معمال با استفاده از کاهش محتای بیکربنات محیط کشت به مقدار تقریبی نزدیک به 1 میلیمل افزدن بافر یژه به مقدار نزدیک به 24 میلیمل برای حفظ phe بدن نیاز به باالبن سطح CO 2 در انکباتر به انجام میرسد. نکته حایز اهمیت این است که اناع سللهای متفات سطح متفاتی از حساسیت را برای هر یک از بافرهای zwitterionic غلظتهای استفاده شده در محیط کشت نشان میدهند )23(. بنابراین تعیین مناسب بدن یک بافر یژه غلظتهای م نیاز به منظر حفظ phe برای استفاده در محیط کشت گامتهای پستانداران ریانها در ریه IVF بسیار حایز اهمیت میباشد. د بافری که به طر معمل در محیطهای کشت برای تنظیم محیطهای کشت استفاده شده در ART م استفاده قرار میگیرند عبارتند از HEPES 212 MOPS 213 که که بر اساس مقدار pka که شاخصی برای ظرفیت بهینه بافری هر بافر میباشد انتخاب شدهاند )جدل 2-41(. مطالعات متعددی به بررسی بازده HEPES در اناع مختلف سلل پاخته است با تجه به pka قدرت بافری برای HEPES ph به عنان یکی از ایدهآلترین بافرها برای کشت گامتها ریان پستانداران شناخته شده است. این نکته را باید همراه در نظر داشت که دمای محیط نقش مهمی در در ظرفیت بافری یک بافر ایفا میکند زمانی که با سلل در دمای 30 درجه سانتیگراد کار میکنیم HEPES دارای pka به مقدار 0/34 میباشد )این مقدار بسیار نزدیک به phe بسیاری از محیطهای کشت آزمایشگاهی ریان میباشد(. اخیرا حداقل د شرکت تجاری بافری با نام MOPS را که کمتر م مطالعه قرار گرفته است را به محیط IVF افزدهاند. این بافر دارای pka پایینتری در مقایسه با HEPESمیباشد که این مقدار در دمای 30 درجه سانتیگراد معادل 2/83 است )23(. شایان ذکر است که این مقدار pka نزدیک به phi ریانها میباشد. قابل تجه است که هر د این بافرها با مقدار مفقیت بسیار باال م استفاده قرار میگیرند هر کدام دارای نقاط ضعف خد میباشند )22(. در نتیجه قبل از پیشنهاد نمدن یا مقصر شناختن یک بافر به خصص الزم است که مقاالت به دقت بررسی شند. به یژه اینکه هنز امکان ارتقا بد در م استفاده از بافرها همچنین فیش بازده IVF جد دا. بسیاری از عادتهایی که در رند کشت ریان استفاده میشد برپایه نتایج مطالعات انجام شده در م سللهای سماتیک میباشد به استفاده از اناع متفات بافرها غلظتها ترکیبات آنها مربط میشد که ممکن است برای ریانها گامتها نیز مفید باشد. برای مثال HEPES یا MOPS در غلظت 24 میلیمل به عنان استاندا صنعتی در تلید محیط IVF در نظر گرفته میشد. استدالل استفاده شده در انتخاب غلظت این بافرها کامال مشخص نمیباشد اما شاید به دلیل حفظ اسمالریته محیط کشت استفاده میشند همانطر که سطح بیکربنات تا میلیمل در بیشتر محیطهای کشت کاهش یافته است. بنابراین 24 میلیمل از بافر مزدج با سدیم میتاند اسمالریته 213 محیط کشت در انکباتر را مشابه با اسمالریته محیط حای 23 میلیمل بیکربنات مزدج با سدیم در انکباتر حفظ نماید. اما استفاده از غلظتهای کمتر بافر در زیر 24 میلیمل تانایی حفظ phe پایدار در فضای خارج از انکباتر را دارا میباشد )شکل 3-41(. به عاله ترکیب بافرهای متفات این امکان را فراهم میکند که ریه کشت با یک بافر که در حال حاضر م استفاده است را ارتقا داده زیرا محیطهای کشت حای بافرهای ترکیبی با مفقیت به منظر کاهش غلظت هر یک از بافرها به منظر تنظیم pka بهینه به منظر کشت ریان استفاده میشند )20 22( )شکل 1-41(. اگرچه به نظر میرسد که ابستگی به محیطهای کشت اناع متفات سلل در تعیین نع غلظت بافرها مهم میباشد لی هنز دانش ما در م phe ایدهآل به منظر کشت گامتها ریانها کافی نبده اطالع دقیقی از این م یا اینکه کدام سیستم بافری ممکن است بهینهتر باشد دسترس نیست. آنچه که تاکنن مشخص شده است این است که phe به عنان یکی از مهمترین متغیرها در کاهش استرس بیرنی بهینه سازی سیستم کشت IVF میباشد اینکه مشاهده با دقت نقاط پایانی هدف در آزمایشگاه به منظر ارتقا رشد ریان میتاند در شناسایی phe بهینه م کمک کننده باشد. عاله بر سمیت بالقه این ماد ظرفیت بافری (pka) بافر در دمای م استفاده در انکباتر میبایست به عنان یکی از عامل مهم م تجه قرار بگی. بهترین سیتم بافری برای phe -( -hydroxyethyl)- -piperazineethanesulfonic acid -( N -morpholino)-propanesulfonic acid Na-conjugated Na-bicarbonate 411

151 زمانی به دست میآید که مقدار pka بافر نزدیک به phe م نیاز برای محیط کشت استفاده شده در فرایند کشت باشد. در م IVF سطح معمل phe به مقدار کمی باالتر از phi اسیتها ریانها میباشد دامنه آن از 0/1 تا 0/2 میباشد )داده- ها از مرجعهای )24-23( بدست آمده اند( ماد اج الزم برای اندازهگیری phe 4( الکترد مناسب برای ph 2( دستگاه اندازه گیری ph مناسب با پراب ATC یا پراب اندازه گیری دما 3 (محلل پر نمدن الکترد محل نگهداری الکترد 1( الکترد استاندا کالیبره نمدن )0 41( 3( محیط )2 کشت برای آزمدن 2( محفظه گرمایی با دمای 30 درجه سانتیگراد )اختیاری(. شکل تغییراتpH محیط کشت بافر شده با MOPS بعد از گذشت بیش از 4 ماه با غلظتهای متفات بافر. استفاده از غلظتهای پایینتر بافر phe محیط IVF را که حای 1 mm بیکربنات سدیم است پایدار نگه میدا. غلظتهای پایین بافر ممکن است به بد محیطهای دسترزی ریان از طریق کاهش سمیت احتمالی آنها کمک نماید. تمام اندازه گیریها در دمای 30 درجه سانتیگراد انجام شده است. دادهها به صرت mean±sem ارایه شده است برپایه سه محیط کشت که م اندازه گیری قرار گرفته است میباشد. شکل ترکیب اناع متفات بافرهای zwitterionoc امکان تنظیم pka را به گنهای که در تطابق با phe م ترجیح برای محیط کشت باشد را فراهم نمده یا سیستم بافری را بهینه مینماید. به عاله غلظت هر بافر در این سیستم کاهش یافته بنابراین سمیت ابسته به مقدار مصزف ماد در محیط کشت را کاهش میدهد. نمدار نشان دهنده تغییرات phe محیطهای کشت بافر شده با سیستمهای متفات در پاسخ به افزدن اسید یا باز می- باشد. نقطه عطف نمدار pka میباشد که بر اساس نع غلظت بافر متفات میباشد )برگرفته شده از مرجع شماره )20((. Irvine PI ECM Single-step (SSM ) Multi-blast HTF SAGE 0 /20 0 / 32 0 /2 0 / /29 0 / 32 0 /3 0 / 1 0 /2 0 / جدل دامنه phe تصیه شده برای محیطهای کشت ریان تجاری Origio Universal IVF ISM4 ISM2 EmbryoAssist BlastAssist Life Global 0 /3 0 / 1 0 /2 0 / 3 0 /33 0 / 13 0 /2 0 / 3 0 /33 0 / 13

152 Fert Media Cleavage Media Blastocyst Media IVM Cook Sydney IVF Cleavage Sydney IVF Blastocyst Sydney IVF Fert 0 /3 ± 1 / 4 0 /2 ± 1 / 4 0 /3 ± 1 / 4 0 /2 ± 1 / 4 0 /3 0 / 3 0 /3 0 / 3 0 /3 0 / 3 Global Global Fert Blastocyst HTF HTFxtra Vitrolife G3 Series 0 /2 0 / 1* 0 /2 0 / 1* 0 /2 0 / 1* 0 /2 0 / 1* 0 /2 0 / 1* 0 /20 ± 1 / 10 جدل اناع مختلف بافر zwitterionic مجد که میتان به منظر پایدار ساختن phe در محیط IVF استفاده ک بافر دامنهpHe pka 23 C pka 30 C MOPS 2 / 3 0 / 8 0 / 21 0 / 12 TES 2 / 9 9 / 2 0 / 11 0 / 42 HEPES 2 / 9 9 / 2 0 / 19 0 / 34 DIPSO 0 / 1 9 / 2 0 / 21 0 / 33 MOBS 2 / 8 9 / 3 0 / 21 گرش نشده TAPSO 0 / 1 9 / 2 0 / 21 0 / رشها کالیبره نمدن ph سنج 4( بالفاصله قبل از سنجش نمدن نمنهها باید ph سنج را با تجه به ریه تضیح داده شده تسط شرکت سازنده کالیبره نمد. بسیار حایز اهمیت است که نسبت به تنظیم تصحیح ph سنج بر مبنای دمای کاری یا 30 درجه سانتیگ اقدام شد یا در زمان تنظیم از پراب ATC که در آب در دمای 30 درجه قرار داده شده است استفاده نماییم )شکل 3-41( )یادداشت 4-3 را مشاهده نمایید(. مقدار مناسبی از محلل استاندا کالیبراسین را در للههای آزمایشگاهی بالفاصله پیش از استفاده الیکت نمده ردی آن را با کالهک بپشانید. phهای استاندا باید phe م دلخاه شما را مشخص نماید )یادداشت شماره 1 را مشاهده نمایید(. 2( بالفاصله قبل از استفاده محلل استاندا را تا رسیدن به دمای کاری گرم کنید )30 درجه سانتیگراد( )یادداشت شماره 3 را مشاهده نمایید(. 3( زمانی که محلل استاندا گرم شد الکترد ph را در محلل استاندا ph 0 قرار دهید. دادهها را مشاهده نمایید تا ph پایدار شده کالیبراسین انجام شد )2/89 در 30 درجه سانتیگراد ph م نظر است که باید خانده شد(. الکترد را با آب دینیزه شسته ش دهید له آهستگی خشک نمایید )بدن استفاده از دستمال(. پاک کن پراب میتاند مقدار ph خانده شده را تحت تاثیر قرار دهد در نتیجه از این کار باید خدداری شد. الکترد را در محلل استاندا 41 ph قرار دهید تکرار نمایید. 1( زمانی که کالیبراسین به انجام رسید الکترد را در استاندا 0 ph قرار دهید عدد مشاهده شده را بخانید )2/89±1/12(. اگر عدد خانده شده خارج از دامنه بد کالیبراسین را دباره تکرار نمایید )یادداشت شماره 2( اندازهگیری phe برای محیط کشت استفاده شده در انکباتر الیکتهای محیط کشت را در للههای آزمایشگاهی که درب آن نیمه بسته است را در انکباتر میگذاریم. حجم محیط کشت بر حسب اینکه چه للهای استفاده میشد سایز پراب چقدر است متفات خاهد بد. اجازه دهید این محیط برای ساعت در انکباتر قرار داده میشد تا اطمینان حاصل شد که تعادل دمایی

153 گازی مناسب برقرار شده است اگرچه زمان کمتر ممکن است برای حجمهای کمتر محیط کشت م ترجیح باشد )یادداشت شماره 0 را مشاهده نمایید(. برای محیطهای دسترزی حای HEPES یا MOPS محیط را در دمای 30 درجه سانتیگراد در حمام آب گرم یا داخل بلک گرمایی قرار دهید. مدت زمان این گرما دادن 31 دقیقه میباشد. للهها باید درب بسته باشند )یادداشت شماره 9 را مشاهده نمایید(. درپی متعادل شدن محیط کشت کالیبراسین ph سنج به سرعت لله حای نمنه را از انکباتر خارج نمده درب آن را ببندید. به سرعت لله را به ph سنج منتقل نمده الکترد ph سنج را در داخل محیط کشت قرار دهید. این کار درصرتی که ph سنج در کنار انکباتر قرار داده شده باشد آسانتر خاهد بد. اجازه دهید که دادهها ثابت شد بعد خانده شد. برای هرانکباتر هر محیط کشت این کار را تکرار نمایید )یادداشت شماره 8 41 را مشاهده نمایید( تنظیم phe اگر تمام pheهای خانده شده در دامنه م نظر بد )دامنه قابل قبل تعیین شده تسط آزمایشگاه( هیچ کار اضافی دیگری م نیاز نمیباشد. به هر ری اگر phe هر انکباتر خارج از دامنه باشد سطح CO 2 انکباتر باید مطابق با تصیه کارخانه تغییر کند تا phe باال یا پایین برد. سطح CO 2 را باال به تا phe را پایین بای سطح CO 2 را پایین آه تا phe باال برد این کار تا زمانی باید ادامه یابد که phe در محدده مشخص قرار داده شد )یادداشت شماره را مشاهده نمایید(. اگر خاندن ph آهسته انجام شد ph سنج کم سرعت باشد ممکن است که نیاز به جایگزین نمدن پراب باشد )یادداشت شماره 41 را مشاهده نمایید( یادداشتها 4( با الکتردهای جدید دستگاه جدید برخی تنظیمات دارای دسترالعمل اختصاصی برای استفاده میباشند. این ریهها جزییات استفاده از یک ph سنج استاندا را که با الکترد دگانه پر شده از KCl نرمال میباشد ارایه میدهد. اریانس در دادهها قابل قبل میباشد. این ما تصیههایی است که برمبنای تجربه ارایه شده است. 2( الکترد شیشهای دگانه مزدج پر شده با KCl به دلیل محتای پرتئینی محیط کشت برای استفاده از بافرهای ارگانیک تصیه میشند. این امر به حصل اطمینان نسبت به خاند سریع دقیق ph کمک میکند. اما دیگر الکتردها در بسیار از ما کافی میباشند اگرچه در تمیز کن نگهداری آنها باید دقت الزم در نظر گرفته شد تا از سرعت پاسخ گیی باال ارایه دادههای دقیق اطمینان حاصل شد. بدن در نظر گرفتن نع الکتردها شرایط نگهداری بهینه تمیز کن الکتردها به طر مناسب برای حفظ عملک بهینه الزم ضرری میباشد. در این م الکتردها باید در محلل 3 KCl مالر نگهداری شند نه در آب الکتردها باید هماره با 3 KCl مالر پرشده باشند. 3( قبل از استفاده پیش از باز نمدن نمنهها از اینکه الکتردها با محلل مناسب پر شده است اطمینان حاصل کنید. تصیه شده است که دقت صحت هر الکترد جدید با استفاده از محلل استاندا مشخص یا الکترد استاندا قبل از هرگنه کارب کلینی تایید شد. برخی الکتردها ممکن است که منجر به خاندن ph های متفات شند )28 29( این نکته میتاند مشکل ساز باشد اگر این مشاهدات برای تنظیم انکباتر یا های پیرامنی استفاده شد. 1( بسیار مهم است که از الیکتهای تازه استاندا برای هر مرتبه از کالیبراسین استفاده شد چن ph محللهای استاندا در اثر در معرض ها قرار گرفتن میتانند دچار انحراف شند. استفاده از سیستم کالیبراسین د نقطهای با در نظر گرفتن 0 ph 41 کافی میباشد اگرچه سیستم کالیبره نمدن 3 نقطهای با در نظر گرفتن 1 ph به عنان نقطه تنظیم گر سم نیز میتاند مفید اقع شد. 3( اگرچه در نظر داشتن تغییرات دمایی در هنگام کالیبراسین حیاتی نمی باشد اما میتاند منجر به حصل اطمینان از تنظیم دقیق دستگاه ph سنج شد. دلیل این امر تاثیر دما بر الکترد ph ph محیطها میباشد. 417

154 2( زمانی که کالیبراسین به پایان رسید یا زمانی که الکتردها استفاده نمیشد الکترد را براساس دسترالعمل کارخانه نگهداری نمایید. معمال نحه نگهداری صحیح الکترد به گنهای است که میبایست داخل محلل 3 KCl مالر قرار داده شد. 0( محیطهای کشت م آزمن برای سنجش ph میبایست دقیقا محیطی باشد که برای کار با گامتها م استفاده قرار میگی. هماره میبایست ph محیطهای م استفاده برای دسترزی گامتها را نیز م سنجش ph قرار داد تا در دامنه مطمئن قرار گرفته باشد. 9( یکی از دل مشغلیهای کاربی در م ph بافرها بکارگیری آنها در محیطهای م استفاده به منظر دست- رزی گامتها در ریه IVF تعیین اندازه گیری ph این محیطها میباشد. اگرچه بسیاری از آزمایشگاهها ph محیطهای کشت م استفاده در انکباتر را م بررسی قرار میدهند بسیاری از این آزمایشگاهها نیز این فراسنجه را برای محیطهای م استفاده در خارج انکباتر م تجه قرار نمیدهند. که این امر کاری غیر خمندانه به حساب میآید. زیرا ماد ترکیبات متفات م استفاده در محیطهای کشت منجر به برز ph های متفات میشد )جدل 3-41(. به این منظر یک محقق می- بایست اثرات دما ری phe را م تجه قرار دهد. نه تنها تغییرات دمایی منجر به تاثیر بر الکترد ph میشد بلکه مقدار حقیقی phe را نیز متاثر مینماید. این نکته به یژه زمانی که با بافرهای zwitterionic کار میکنیم بسیار مشهد میباشد. افیش دمای محیطهای کشت که دارای بافرهایی مانند HEPES یا MOPS میباشند منجر به کاهش در phe محیطهای کشت میشد. بنابراین در آزمایشگاههای IVF میبایست phe تمام محیطهای کشت م استفاده را م بررسی قرار داد از قرار داشتن آن در دامنه صحیح اطمینان حاصل نمد. دامنه 0/20 تا 0/32 در دمای 30 درجه سانتیگراد دامنه م قبل برای محیطهای کشت میباشد. 4. Barr KJ, Garrill A, Jones DH, Orlowski J, Kidder GM (4889) Contributions of Na+/H+exchanger isoforms to preimplantation development of the mouse. Mol Reprod Dev 31(2): Zhao Y, Chauvet PJ, Alper SL, Baltz JM (4883) Expression and function of bicarbonate/chloride exchangers in the preimplantation mouse embryo. J Biol Chem 201(14): Lane M, Baltz JM, Bavister BD (4889) Regulation of intracellular ph in hamster preimplantation embryos by the sodium hydrogen (Na+/H+) antiporter. Biol Reprod 38(2): Lane M, Baltz JM, Bavister BD (4888) Bicarbonate/chloride exchange regulates intracellular ph of embryos but not oocytes of the hamster. Biol Reprod 24(2): Lane M, Baltz JM, Bavister BD (4888) Na+/H+ antiporter activity in hamster embryos is activated during fertilization. Dev Biol 219(4): Lane M, Bavister BD (4888) Regulation of intracellular ph in bovine oocytes and cleavage stage embryos. Mol Reprod Dev 31(1): Dale B, Menezo Y, Cohen J, DiMatteo L, W ilding M (4889) Intracellular ph regulation in the human oocyte. Hum Reprod 43(1): Edwards LJ, Williams DA, Gardner DK (4889) Intracellular ph of the mouse preimplantation embryo: amino acids act as buffers of intracellular ph. Hum Reprod 43(42): Edwards LJ, Williams DA, Gardner DK (4889) Intracellular ph of the preimplantation mouse embryo: effects of extracellular ph and weak acids. Mol Reprod Dev 31(1): Phillips KP, Leveille MC, Claman P, Baltz JM (2111) Intracellular ph regulation in human preimplantation embryos. Hum Reprod 43(1): Phillips KP, Petrunewich MA, Collins JL, Baltz JM (2112) The intracellular ph-regulatory HCO 3 /Cl exchanger in the mouse oocyte is inactivated during fi rst meiotic metaphase and reactivated after egg activation via the MAP kinase pathway. Mol Biol Cell 43(44): Zhao Y, Baltz JM (4882) Bicarbonate/chloride exchange and intracellular ph throughout preimplantation mouse embryo development. Am J Physiol 204(3 Pt 4): منابع 418

155 43. Fitzharris G, Baltz JM (2112) Granulosa cells regulate intracellular ph of the murine growing oocyte via gap junctions: development of independent homeostasis during oocyte growth. Development 433(1): FitzHarris G, Siyanov V, Baltz JM (2110) Granulosa cells regulate oocyte intracellular ph against acidosis in preantral follicles by multiple mechanisms. Development 431(23): Phillips KP, Baltz JM (4888) Intracellular ph regulation by HCO 3 /Cl exchange is activated during early mouse zygote development. Dev Biol 219(2): Lane M, Lyons EA, Bavister BD (2111) Cryopreservation reduces the ability of hamster 2-cell embryos to regulate intracellular ph. Hum Reprod 43(2): Leclerc C, Becker D, Buehr M, Warner A (4881) Low intracellular ph is involved in the early embryonic death of DDK mouse eggs fertilized by alien sperm. Dev Dyn 211(3): Zander-Fox DL, Mitchell M, Thompson JG, Lane M (2141) Alterations in mouse embryo intracellular ph by DMO during culture impair implantation and fetal growth. Reprod Biomed Online 24(2): Squirrell JM, Lane M, Bavister BD (2114) Altering intracellular ph disrupts development and cellular organization in preimplantation hamster embryos. Biol Reprod 21(2): Gibb CA, Poronnik P, Day ML, Cook DI (4880) Control of cytosolic ph in two-cell mouse embryos: roles of H(+)-lactate cotransport and Na+/H+ exchange. Am J Physiol 203(2 Pt 4):C Hugentobler S, Morris DG, Kane MT, Sreenan JM (2111) In situ oviduct and uterine ph in cattle. Theriogenology 24(0 9): Elrod CC, Butler WR (4883) Reduction of fertility and alteration of uterine ph in heifers fed excess ruminally degradable protein. J Anim Sci 04(3): Good NE, W inget GD, Winter W et al (4822) Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry 3(2): Good NE, Izawa S (4802) Hydrogen ion buffers. Methods Enzymol 21: Ferguson WJ, Braunschweiger KI, Braunschweiger WR et al (4891) Hydrogen ion buffers for biological research. Anal Biochem 411(2): Swain JE (2141) Optimizing the culture environment in the IVF laboratory: impact of ph and buffer capacity on gamete and embryo quality. Reprod Biomed Online 24(4): Swain JE, Pool TB (2118) New ph-buffering system for media utilized during gamete and embryo manipulations for assisted reproduction. Reprod Biomed Online 49(2): Quinn P, Cooke S (2111) Equivalency of culture media for human in vitro fertilization formulated to have the same ph under an atmosphere containing 3 % or 2 % carbon dioxide. Fertil Steril 94(2): Pooler PM, Wahl ML, Rabinowitz AB, Owen CS (4889) ph measurement: a comparison of results using glass membrane electrodes vs solid-state electrodes as a function of solution composition. Anal Biochem 232(2):

156 فصل 44 ترکیب محیطهای کشت: فاکترهای رشد علیرغم این حقیقت که اصل بنیادی اغلب رشهای کشت محیطهای کشت استفاده شده در تلیدات برنتنی ریان سعی در تقلید محیط طبیعی ریان پیش از النه گزینی دارند اما یکی از تفاتهای اساسی بین محیطهای کشتی که هم- اکنن م استفاده قرار میگیرند با شرایط درنتنی غیاب فاکترهای رشد میباشد. تا کنن فاکترهای رشد متفاتی در شرایط درنتنی محیط پیرامن ریان پیش از النه گزینی در انسانها مجدات پستاندار غیرانسان م شناسایی قرار گرفتهاند در بیشتر ما پیک تلید شناسایی این فاکترهای رشد زمانی به قع میپیندد که لقاح رخ داده باشد یا رشد ریان در مرحله پیش از النهگزینی آغاز شده باشد. اگرچه این فاکترهای رشد در غلظتهای بسیار اندکی تلید میشند اما اثرات برجسته مشهدی بر رشد بافتها تمایز سللی اعمال میکنند. اعمال اثر فاکترهای رشد بر بافت هدف از طریق اتصال این عامل به گیرنده اختصاصی مجد در سطح سللها به قع میپیندد. گیرندهای فاکترهای رشد مختلفی ری سللهای ریان پیش از النهگزینی در ریان انسان مشاهده میشد. ریانها در مرحله پیش از النهگزینی بهخدی خد فاکترهای رشد متعددی را بیان میکنند. تلید فاکترهای رشد گیرندههای مرتبط با آنها از نظر متابلیکی برای ریان هزینر میباشند. بنابراین حضر آنها در محیط ریان پیش از النهگزینی درن ریان بهشدت ریانهای مذکر را تحت تاثیر قرار میدهند. مطالعات انجام شده در م همکشتی ریانها نیز به طر غیرمستقیم پیشنهاد کننده این نکته است که فاکترهای رشد میتانند تکین تکامل ریان در شرایط برنتنی را ارتقا دهند. مطالعات متعددی در حیانات انسان به سنجش اثرات مفید احتمالی افزدن فاکترهای رشد به محیط کشت پاخته اند. به هر ری همچنان در زمینه تعیین نقش دقیق فاکترهای رشد در تکین ریان دز بهینه فاکترهای رشد که به محیطهای کشت افزده میشند اثرات ترکیبی اثرات اندکراین فاکترهای رشد در تکین ریان م سال تید میباشد مقدمه در طل 2 دهه گذشته فرمالسین محیطهای کشت ارتقا قابل مالحظهای را به خد دیدهاند که در نتیجه باعث ارتقا تانایی حفظ رشد ریان زنده در محیط کشت تا زمانی که ریان به مرحله بالستسیست برسد شده است )4(. فرمالسین محیطهای کشت پیرامن یکی از د فلسه غالب در زمینه محیطهای کشت هماره درحال ارتقا پیشرفت بده است. این د فلسفه عبارت از فرمالسین محیط کشت چند مرحلهای کشت تک مرحلهای میباشند. به هر ری اینکه فرض را بر این بگذاریم که درحال حاضر شرایط محیط کشت بهینه شده است بسیار فریبنده است. یکی از مسایل حایز اهمیت نیاز به داشتن محیط کشتی می باشد که حای تمام نیازهای ریان از زمان لقاح تا انتهای سفر آن در طل لله فالپ به سمت رحم باشد. به گنهای که تمام ماد مجد در شرایط درنتنی در آن جد داشته باشد. یکی از دلمشغلیهای باالقه حایز اهمیت برای ارتقا محیطهای کشت در آینده میتاند نیاز به محیط کشتی باشد که نیازهای متعدد ریان به فاکترهایی را که در شرایط درن- تنی با آنها ماجه میباشد که منجر به تحریک تقسیمات سللی تکثیر تمایز میشند را مرتفع نماید. این عامل را فاکتر رشد فاکتر ایمنی مینامند. سللهایی که در محیطهای فاقد این فاکترها قرار داده میشند رشد تکثیر نخاهند یافت. در سالهای اخیر عالقه محققین به بررسی فاکترهای رشد ایمینی تلید شده از ریانها در محیط کشت ربه فزنی داشته به عنان شاخصه مهمی در ارزیابی زنده بدن تانایی رشد ریان شناخته میشند محیط کشت: چرا نیاز به ارتقای بیشتر محیط کشت در آینده احساس میشد برای مدتهای زیادی است که انتخاب محیط کشت برای مرحله کلیاژ ریان به عنان مسئلهای که دارای اهمیت قابل تجهی میباشد در نظر گرفته نمیشد. دلیل این امر آن است که محیطهای کشت متفات با مفقیت در کشت ریان در این 451

157 مرحله استفاده شده است. ریان انسان هم در محیطهای کشت بسیار ساده که فقط حای نمکهای ساده میباشد کشت داده شده هم در محیطهای بسیار پیچیده حای اسیدهای آمینه فاکترهای رشد هرمنها کشت نگهداری میشند استرسهای بیشیمیایی ا شده به ریان این یک حقیقت مسلم است که ریان انسان دارای قدرت تطابق پذیری تحمل در برابر شرایط متنع فرمالسین محیط کشت میباشد میتاند در محیطهای کشت با فرملهای متفات رشد نمده به نعی خد را با این شرایط فق دهد. به هر ری درجه مین تطابق پذیری به شرایط محیطی / یا نرخ تطابق پذیری به شرایط متغیر محیط کشت ممکن است که باعث درجات مختلفی از استرس بیشیمایی تحمیل شنده به ریان باشد )2(. ریانها دارای تاناییهای تسعه یابنده متغیری در برابر سیستمهای کشت متعدد میباشند. این تانایی متغیر بسته به پیشینه ژنتیکی ریان است )3 1(. درحال حاضر شاهد متعددی مشخص شدهاند که نشان میدهند پاسخ تطابق پذیری برز که تسط ریان در زمان کشت میتاند اثرات مهم شایان تجهی ری تکین آتی ریان داشته باشد. محیط کشت به خدی خد یا تغییرات در محیط کشت منجر به تفاتهای کمی( quantitative ) در سطح بیان mrna اناع متفاتی از ژنها میشد )42-3( مطالعات میکراری انجام شده به منظر نشان دادن اینکه شرایط کشت منجر به برز تغییرات کچک اما معنی دار در ترانسکریپتم ریان میشد این نکته را با مفقیت اثبات نمده است. مطالعات متعددی که در حیانات به انجام رسیده است نشان داده است که ناهنجاریهای ریخت- شناسی بیشیمیایی حاصل از لقاح برنتنی کشت ریان در شرایط برنتنی ممکن است که برای مدت طالنی بعد از در معرض شرایط برنتنی قرار گرفتن حتی در طل دره تکین ریان در دره پس از تلد نیز ادامه یابد. مطالعات متعددی تغییر در اندازه بدن تغییر در نسبت اندازه بافتها )اسکلت ماهیچه بافت چربی( ارگانها )قلب کبد کلیه مغز تیرئید( در ریان )21-43( ند گا مش گسفند را گرش نمدهاند. ناهنجاریهای مربط به جفت نیز از عاقب معمل کشت برنتنی ریان به شمار میآید ممکن است که منجر به برز اثرات متعددی حتی در نسلهای آتی مجد م نظر با جد جفت گیری آبستنی طبیعی شد )41 23(. اختالل ایجاد شده در فرایندهای طبیعی مربط به رند اپیژنتیک طبیعی در رند کشت برن- تنی ریان ممکن است که در برخی از ناهنجاریهای تکاملی مشاهده شده در حیان حاصل از رند لقاح برنتنی مشاهده شد. مطالعات انجام شده در زمینه لقاح برنتنی در مش گا گسفند نشان دادهاند که خطر ربه افیش خطاهای اپیژنتیکی به دلیل متیالسین تغییر یافته DNA هیستنها میباشد ) ( همچنین این خطاهای اپیژنتیکی به سندرم نتاج 212 غلآسا مرتبط میباشد (LOS) این سندرم یکی از معرفترین ناهنجاریهای حاصل از لقاح برنتنی حیاناتی مانند گسفند گا میباشد )21-49(. اگرچه شاهدی که مستقمیا ریانهای تلید شده انسان در شرایط برنتنی را با ریانهای انسانی تلید شده در شرایط درنتنی مقایسه نمایند بسیار محدد کم میباشند اما به طر کلی پذیرفته شده است که رشد ریان در شرایط برنتنی در کمینه حد مطلب رشد قرار دا حتی با جد استفاده از محیطهای کشت چند مرحلهای که امرزه م استفاده قرار گرفته اند. از جمله اختالالت مشاهده شده میتان به رشد آهستهتر تعداد سلل کمتر اشاره نمد که در پستانداران غیر از انسان مشاهده شده است )20(. مطالعات مجد پیرامن مشکالت احتمالی تکاملی در ریانهای انسانی حاصل از لقاح برنتنی اغلب این اطمینان را به جد میآرند که میبایست در انتظار اختالالت تکاملی بد همچنین شاهد بسیار کمی مبنی بر این نکته که اختالالت اپیژنتیکی کمی به غیر از سندرمهای Beckwith Weidemann Angelman syndrome در نتاج حاصل از لقاح برنتنی معملتر میباشد جد دا )34-23(. با این جد تلد حاصل از لقاح برنتنی در معرض خطر نسبی ربه افیش از جمله مرگ ریان یمان زدهنگام زن تلد کم ناهنجاریهای متفات مادردی عمده یا مختصر شامل مشکالت قلبی عرقی مشکالت اسکلتی ماهیچهای مشکالت دستگاه دفع ادرار مشکالت دستگاه عصبی نقصان در دستگاه گارش میباشند همچنین به نظر میرسد که ند ریان حاصل از این رش لقاح (IVF) نیازمند مراقبتهای شدید یژه بستری شدن در بیمارستان فیزیتراپی گفتار درمانی در دران کدکی میباشند ) (. یکی از ناهنجاری- large offspring syndrome 454

158 هایی که در م لقاح برنتنی انسان به ثبت رسیده است اندازه کچک ریان برای استاندا تعریف شده در سن آبستنی می- باشد )10-13(. مطالعهای که در این ااخر ری کدکان پیش از بلغ در سن 1 تا 41 سالگی که از لقاح برنتنی متلد شدهاند به انجام رسیده اس ت نشان داده است که تغییرات دائمی در متابلیسم این کدکان منجر به تغییر معنی دار در بیان IGF تغییر در پرفایل لیپیدی شاخص تده بدنی قد در مقایسه با کدکانی که به طر طبیعی به جد آمدهاند قابل مشاهده است )19(. بنابراین فهم کامل از اثرات محیط کشت بر ری تکین آتی ریان اثرات طالنی مدت در زمان زندگی ل بزرگسای همچنان از حیطه فهم درک ما بسیار فاصله دا. به نظر میرسد که هیچ تطابق پذیری در ریان اتفاق نمیافتد مگر اینکه در آینده منجر به برز ناهنجاریها عاقب غیر قابل جبرانی باشد )2(. به هر ری شا هد مطالعاتی کافی به منظر حمایت از این مفهم که شرایط کشت که به شرایط درنتنی نزدیکتر باشد ریانهای با کیفیت بهتری را تلید خاهند نمد که بیشتر به ریانهای حاصل از شرایط درنتنی مشابه میباشند در نتیجه منجر به انحراف کمتری از استاندا بیان ژن رند اپیژنتیک تلید پرتئین در مقایسه با ریانهای حاصل از لقاح برنتنی در شرایط پر استرس خاهد شد )34-18(. در نهایت میتان بیان نمد که شرایط فیزیلژیی درنتنی شامل فاکترهای رشد متعدد میباشد. همچنین تغییراتی در مقایسه با شرایط درنتنی که منجر به تغییر در بیان ژن ساخت پرتئینها میشد در نهایت میتاند در زندهمانی ریان مثر اقع شد / یا تکین ریان را مختل نمده شاید اثرات دراز مدتی در زندگی ل بزرگسای ایجاد نماید )2( فاکترهای رشد تکین ریان اگرچه فرضیه اصلی که برپایه آن محیطهای کشت چند مرحلهای تسعه یافته است تقلید از شرایط درنتنی میباشد اما هنز یکی از محددیتهای عمده در زمینه تلید محیطهای کشت غیاب فاکترهای رشدی است که ریان در شرایط طبیعی با آن ماجه میباشد است. مسلما مطالعهای جد ندا که به طر مستقیم به بیان علت ارتباط بین غیاب فاکترهای رشد هر نعی از اثرات مخرب محیط کشت ری ترانسکریپتم ژنم تکین آتی ریان بپازد. به هر ری نشان داده شده است که رشد در شرایط برنتنی آهستهتر شده تعداد سللها کاهش یافته همچنین نرخ زنده مانی آنها نیز کاهش مییابد )32-24(. همچنین Giritharan همکاران )24( با استفاده از رش میکراری نشان دادهاند که الگی بیان ژنها در بالستسیست مش بدست آمده از لقاح طبیعی با بالستسیستهای بدست آمده از رش IVF به طر معنی داری در 4842 ژن متفات میباشند این تفات به اندازهای بده است که در برخی ما بیان ژنها تا 1 برابر از حد مجد در بالستسیست حاصل از لقاح طبیعی کمتر بده است همچنین نرخ آپپتز مسیرهای مرتبط با رندهای ریختیی به شدت تحت تاثیر کشت برنتنی ریان قرار گرفته است )24(. همچنین مطالعات نشان دادهاند که تغییرات اکنش احیا درمیتکندری هسته )22 23( ارتباطات داخل سللی ) ( نقص در اسکلت سللی )31( افیش اکئلها باقیماندههای داخل سللی از جمله عاقب کشت برنتنی ریان میباشد )38 23(. 22 باتجه به نقش بسیار مهم تعیین کننده فاکترهای رشد در مسیرهای رشد همچنین در تقسیمات سللی تکثیر تمایز سللها اینکه فرض کنیم برخی ا ز این اثرات منفی برشمه شده میتاند به دلیل غیاب فاکترهای رشد در شرایط کشت برنتنی برز نماید کامال منطقی به نظر میرسد. تغییر معنی دار در بیان ژنهای مرتبط با بیان فاکترهای رشدی مانند IGF-4 LIF IGF-2 FGF در مطالعات مربط به کشت برنتنی ریان پستانداران به اثبات رسیده است )22-04(. شاهد برای به اثبات رسیدن نقش فاکترهای رشد در تکین ریانها به اسطه 1 اصل علمی ثابت شده م قبل قرار گرفته است. به ترتیب اهمیت میتان این شاهد را به صرت زیر نام ب بیان فاکترهای رشد در دستگاه تلید مثلی ماده بیان گیرندههای مرتبط با این فاکترهای رشد ری سطح سللهای ریانی ارتقا رشد ریان به اسطه استفاده از سیستم همکشتی بدن در نظر داشتن نع سلل م استفاده در این سامانه بیان فاکترهای رشد تسط خد ریان آخرین شاهد در این راستا میباشد. debris 452

159 بیان فاکترهای رشد در دستگاه تلید مثلی در سالهای اخیر شاهد ربه افیشی در م حضر فاکترهای رشد در دستگاه تلید مثلی انسان سایر پرایمتها به دست آمده است معمال پیک غلظت این فاکترهای رشد در زمان لقاح در هنگام رشد ریان در زمان پیش از النهگزینی به 219 قع میپیندد )20(. فاکتر رشد شبه انسلین 4 )03( 2 فاکتر رشد محرک کلنی گرانلسیت-ماکرفاژ فاکتر رشد اپیدرمی متصل شنده به هپارین فاکتر رشد اندتلیتا عرقی )91-01( فاکتر مهار کننده لسمی فاکتر رشد اپیدرمی فاکتر رشد تبدیل کننده آلفا فاکتر رشد فیبربالستی )93-94( فاکتر رشد تحریک کننده کلنی ماکرفاژی )91( فاکتر رشد مشتق شده از پالکت )92-93( فاکتر محرک تشکیل کلنی )90( اینهیبین )84-99( فیبرنکتین اکتیین )82( A تمام فاکترهای رشد ذکر شده به اسطه قسمتهای متفات دستگاه تلید مثل ماده در زمانهای متفات در خالل چرخه تلید مثل تلید میشند به نظر میرسد که نقش مهمی در رشد تکین ریان ایفا می- نمایند. به طر شاخص بیان IGF-2 )83( اکتیین )81( A به اسطه تحریک سللهای گرانل تسط hcg بیان VEGF )83 82( اینهیبین )98 81( به اسطه تحریک سللهای گرانل جسم ز به اسطه همین هرمن (hcg) القا میشند. این مسئله مبین آن است که ممکن است این فاکترهای رشد در تکین ریان نقش خاصی را ایفا نمایند. مشخص شده است که مایع فلیکلی به دست آمده در زمان بازیافت اسیت محتای IGF-2 IGF-4 FGF )03 MCSF 91( 93 میباشد. جدل 4-44 فاکترهای رشد گناگنی که تسط قسمتهای متفات دستگاه تلید مثلی در زمانهای مختلف از چرخه تلید مثل تلید میشند را بررسی نمده است. تقریبا کامال اضح میباشد که فاکترهای رشد در مایعات مجد در دستگاه تلید مثل که ریان در آن حضر دا در طل آن در حال حرکت میباشد بنا به دالیل یژهای تلید تراش میشند. میتان انتظار داشت که این دالیل یژه همان برآ نیازهای رشد سللی تکثیر تمایز سللی میباشد که این فاکترها در م سایر سیستمهای سللی مجد در بدن مجدات زنده برعهده دارند. مسیرهای رشد تکثیر تمایز سللی که فاکترهای رشد بر آنها در دستگاه تلید مثلی ماده نظارت داشته به نعی این مسیرها را هدایت مینمایند منجر به برز اثرات متعددی بر بافت دستگاه تلید مثلی میشد میتان انتظار داشت که این فاکترهای رشد اثرات مشابهی بر بافتهای ریان نیز اعمال نمایند. تلید فاکترهای رشد ریهای هزینه بر برای سیستم بدن مجد زنده یا سللهای ترشح کننده آنها میباشد در نتیجه بیان تلید آنها کامال هدفمند میباشند )20( بیان گیرنده ها تسط ریان پیش از النه گزینی یکی از دالیل مهم در افزدن فاکترهای رشد به محیط کشت ریان حضر گیرندههای فاکترهای رشد ری سطح سللهای ریان میباشد. تلید بیان ژن مرتبط با گیرنده این فاکترهای رشد نیز ریهای بسیار پرهزینه برای سلل میباشد. بنابراین حضر این گیرندهها ری سطح سللهای ریان مبین این نکته است که ریان گیرندهای مذکر به این منظر طراحی شدهاند که در ماجه با فاکترهای رشد پاسخ مناسب را از سی سللهای ریان منجر شند )20(. در جدل شماره 2 تزیع گیرندههای فاکترهای رشد مختلف ری ریان انسان در مرحله پیش از النهگزینی نشان داده شده است. گیرندههایی برای GM -CSF HB-EGF VEGF LIF EGF TGF- α FGF M-CSF PDGF CSF Fibronectin Activin A 459

160 221 CSF GM-CSF LIF TGF-α EGF HB-HGF فاکتر رشد مشتق شده از پالکت اکتیین PDGF IGF-4 IGF-2 همگی ری اسیت لقاح نیافته یا ری ریان یا ری هر دی این سللها بیان میشند ) ( کشت ریان تجربیات گذشته با ریک استفاده از سیستم همکشتی پیشنهاد کننده میایی میباشد که ممکن است از افزده شدن فاکترهای رشد به محیط کشت ناشی شده باشد. مطالعات متعددی مشخص نمدهاند که ارتقا رشد ریان با ریک استفاده ازسامانه همکشتی بدن تجه به نع سلل م استفاده در این سامانه به قع میپیندد ) (. سامانه همکشتی تنها راهی بده است که تا پیش از ابداع محیطهای کشت پیدرپی تانایی حمایت از تکین ریان تا مرحله بالستسیست را داشته است. افزدن سللهای Vero به عنان سللهای حمایت کننده سامانه همکشتی با در نظر داشتن استفاده از محیطهای کشت پیدرپی منجر به افیش در نرخ کیلاژ تا حدد %32 نرخ بالستسیست تا %31 در مقایسه با استفاده از سیستم کشت پیدرپی به تنهایی شده است )418(. سللهای به کار رفته در سامانه همکشتی اناع متفاتی از فاکترهای رشد را تلید مینمایند که اعتقاد بر آن است که همین فاکترها مسئل ارتقا نرخ تکین ریان میباشند. الزم به ذکر است که این ارتقا بدن تجه به مخلطهای متفاتی از فاکترهای رشد که تسط سللهای متفات تلید میشند به قع میپیندد. جدل 3-44 ارتقای ایجاد شده تسط اناع متفات سللهای استفاده شده در سامانه همکشتی را شرح داده است. Menezo Sakkas نشان دادهاند که هیچ تلدی از نع دقلهای همسان در بیش از 911 آبستنی حاصل از انتقال بالستسیستهای تلید شده در سامانه همکشتی ثبت نشده است )441(. این نکته مبین آن است که فاکترهای رشد افزده شده به محیطهای کشت در اثر استفاده از سامانه هم- کشتی ممکن است که شرایط کشت را بسیار نیرمندتر نمایند. از جمله این افیش قدرت را میتان در تقیت نمدن اتصاالت ضعیف بین سللی مشاهده شده که در اثر کشت برنتنی در بین سللهای ریان ایجاد میشد مشاهده نمد که در نهایت منجر به کاهش نرخ دقلیی همسان میشد. در صرت عدم استفاده از سامانه همکشتی در نتیجه حذف فاکترهای رشد احتمال برز دقلیی همسان در اثر کشت درازمدت جد دا ) (. اما استفاده از سامانه همکشتی با مجمعهای از نقاط منفی هم راستا میباشد ال اینکه در این سامانه تغییرات تنظیم نشدهای در شرایط کشت جد دا که به نع سلل استفاده شده در این سامانه بستگی دا. استفاده از سامانه همکشتی منجر به برز شرایط محیط پیا ناپایدار میشد )441(. دمین نکته این است که افزدن سللهایی با منشا غیر از خد ف به یژه سللهای حیانی با آلدگیهای بیماری همراه میباشد. استفاده از سللهای غیرانسان برای کاربهای پزشکی در انسان غیر قاننی میباشد. به هرری استفاده از سللهای اتلگ )سللهای مربط به همان مجد( نیز دارای مشکالت زیادی میباشد. این کار از نظر رش کار چالش برانگیز بده اگر در سیستم همکشتی از سللهای اندمتریم رحم همان ف استفاده شد ممکن است که منجر به تلید در معرض قرار دادن ریان با مادی شد که منجر به نابارری شده است. برای مثال استفاده از اندمتریم خد ف برای سامانه همکشتی تلید ریان ممکن است که منجر به در معرض قرار دادن ریان با عامل ایمینی تغییر یافته شد. اینکه استفاده از سامانه همکشتی به عنان یک رش در کشت برنتنی ریان پیش از افزدن فاکترهای رشد مشخص به محیط کشت تانسته است اعتماد یژهای را متجه خد نماید کمی شگفتآر میباشد. دلیل این شگفتی به این حقیقت بازمیگد که فاکترهای رشد افزده شده به محیطهای کشت به اسطه استفاده از سامانه همکشتی مقادیر آنها ناشناخته میباشند. تعجب برانگیز نمیباشد که استفاده از سامانه همکشتی به عنان یک رش در ریه کشت برنتنی ریان به فرامشی سپه شده باشد اما تجربه استفاده از این تکنیک منجر به فراهم آمدن شاهدی شد که منتج به تعیین مقدار اهمیت افزدن فاکترهای رشد معین به محیط کشت ریان به منظر حمایت از تکین ریان شده است. PAF 451

161 .1-44 تکین تلید فاکترهای رشد به سیله ریانها در محیط کشت کشت گرهی ریانها به طر عادی در آزمایشگاههای IVF به انجام میرسد به عنان دلیل الیه برای تجیح ارتقا ریان که در این رش مشاهده میشد میتان به تلید فاکترهای رشد از سللهای ریانها اشاره نمد که به اسطه گیرندههای مجد در سطح سللهای ریانی منجر به ارتقا رند تکین ریانها میشد ) (. کاهش دادن حجم محیط کشت نیز به عنان راهکاری مفید در راستای ارتقا رند تکین ریان شناخته میشد. شاید یکی از دالیل آن افیش تراکم فاکترهای رشد در محیط کشت باشد ) (. مطالعات متعددی تلید فاکترهای رشد به اسطه ریانهای پیش از النه گزینی را به اثبات رسانده است. ازجمله این فاکترهای رشد میتان به PDGF VEGF IGF-2 IGF-4 TGF-α EGF PAF فیبرنکتین اشاره نمد ) ( در حال حاضر شاهد ربه افیشی جد دا که بر پتانسیل استفاده از فاکترهای رشد متفات تلید شده در محیط کشت به عنان شاخص زیستی پیشبینی کننده در م زنده بدن ریان تانایی النه گزینی آن اشاره دا. Juriscova همکاران برای الین بار در سال 4882 به نقش بالقه shla-g به عنان شاخص زیستی اشاره نمدند )422(. در سال Menicucci 4888 همکاران حضر ملکل shla-g در بخش ریی محیط کشت ریان ابتدایی انسان که از لقاح برنتنی تلید شده بد را گرش نمدن از آن به عنان شاخصی پیش بینی کننده از قدرت احتمال النه گزینی ریان یاد نمدند )423(. مطالعات متعددی به گرش این نکته پاختهاند که حضر shla-g در سطح باالیی محیط کشت با نرخ النه گزینی ارتقا یافته نرخ آبستنی در ارتباط میباشد ) (. Rebmann همکاران )429( در یکی از مراکز پژهشی در آلمان متجه شدند که سنجش shla-g میتاند منجر به ارتقا نرخ آبستنی از 31 به 11 درصد شد. همچنین مین ضعیت shla-g تلید شده تسط ریان میتاند با آبستنی بعد از انتقال یک ریان قدرت دچندان بخشیده به گنهای که احتمال مفقیت را تا 22 درصد ارتقا دهد. به هر ری آنها دریافتند که سیستم درجه بندی ریان براساس ضعیت ظاهری آن همچنان یکی از بهترین ریکها برای انتخاب انتقال ریان میباشد. الزم به ذکر است که در مطالعات این گره مشخص شده که استفاده از شاخص shla-g تلید شده تسط ریان میتاند به عنان دمین ابر تشخیص کیفیت ریان م استفاده قرار بگی. این بدان معنی است که بعد از ارزیابی ظاهری ریان درجه بندی آنها با استفاده از شاخص ظاهری در مرحله دم میبایست به مقدار shla-g تلید شده تسط آنها تجه نمد ریانی را انتخاب نمد که بیشترین مین از این فاکتر را تلید نمده باشد. مشابه با مطالعه Roudebush Rebmann همکاران )411( نشان دادند که بیمارانی که بعد از لقاح برنتنی آبستن شدهاند دارای سطح باالتری از PAF در محیط کشت ریان خد در مقایسه با سایر بیمارانی که در پی IVF آبستن نشدهاند بدهاند شاهد مجد با تجه به فاکترهای رشد مطالعات حیانی مطالعات متعددی در حیانات صرت گرفته است که نشان میدهد افزدن اناع متفات فاکترهای رشد به محیط کشت ریان دارای اثرات سدمندی میباشد )جدل شماره 1(. Desai همکاران ) ( نزدیک به دجین از فاکترهای رشد شامل PDGF IGF-2 IGF-4 TGF-α LIF GM-CSF EGF به سامانه کشت سللهای Vero گره کنترل افزده م مطالعه قرار دادند. این گره دریافتند که سرعت مین تلید بالستسیست به شدت ارتقا یافته مین تفریخ بالستسیست به همراه تعداد سللهای بالستسیست قطر زنا پلسیدا نیز افیش یافته است. همچنین تعداد سللهای ICM به همراه کیفیت آنها برای تک تک فاکترهای رشد در مقایسه با گره کنترل ارتقا یافته بد اگرچه هیچ یک از فاکترهای رشد به خبی سامانه همکشتی سللهای Vero از خد عملک نشان نداده بد. این نکته پیشنهاد کننده این مطلب است که مخلط پیچیدهتر تلید شده تسط سامانه همکشتی میتاند به نعی تقلید کننده محیط طبیعی مجد در بدن مجد زنده باشد. 455

162 مطالعات انسانی بسیاری از مطالعات تصادفی انجام شده در انسان اثرات مفید افزدن فاکترهای رشد یژه به محیط کشت ریان انسان را نیز م تایید قرار دادهاند )جدل 3-44(. مطالعات بسیار اندکی در انسان جد دا که در آنها فاکترهای رشد مشخصی به محیط کشت ریان افزده شده باشد نیاز به برقرار نمدن برنامه مجداد لقاح برنتنی برای بیمار ایجاد شد )20(. افزدن PAF منجر به افیش نرخ آبستنی در پی IVF به مین 01 درصد میشد )434(. افزدن LIF به محیط انتقال ریان منجر به افیش نرخ النه گزینی آبستنی میشد اما این مطالعه در گره کچکی از بیماران انجام شده بد )تعداد 30 بیمار( در نتیجه از نظر آماری این نتایج قابل اعتماد نمیباشند )432(. مکمل سازی محیط کشت با GM-CSF منجر به افیش 31 درصدی در نرخ آبستنی کلینیکی در پی انتقال ریان در رز 3 پس از لقاح میشد )433(. Shapiro همکاران )431( نشان دادند که افزدن GM-CSF به محیط کشت پیدرپی بالستسیست منجر به افیش تعداد سللها در مرحله کلیاژ شده افیشی 31 درصدی در تعداد بالستسیستهای تسعه یافته که برای انتقال مناسب میباشند را ایجاد که است درحالی که نرخ النه گزینی آبستنی به ای هر انتقال با بدن افزدن GM-CSF کامال مشابه بده است. بدن شک این مطالعات گاه بر این ادعا هستند که میای بهینه با کمترین اثر بالقه مخرب در رند تکین ریان به اسطه استفاده از بسیاری از فاکترهای رشد به طر انفرادی یا ترجیحا ترکیبی از فاکترهای رشد که به دقت جزییات مجد در بدن انسان یا حیان زنده را بازسازی مینماید قابل استحصال میباشد. مشهدترین فاکترهای رشدی که افزدنشان به محیط کشت میتاند مفید باشد آنهایی میباشند که در شرایط درنتنی جد داشته همچنین ریان برای آن فاکترهای رشد دارای گیرنده میباشد از جمله این فاکترها می- تانیم به PDGF EGF CSF TGF-α IGF-2 IGF-4 HB-EGF GM-CSF LIF اکتیین اشاره نمد.)20( فاکترهای رشد دیگری که در دستگاه تلید مثلی حضر دارند از جمله FGF VEGF فیبرنکتین المینین اینهیبین یا آنهایی که با اثرات مفید اثبات شده بررند تکین ریان شناسایی شدهاند از جمله PAF نیز به عنان انتخابهای مناسب جهت افزدن به محیط کشت ریان به حساب میآیند )20( خالصه بیان این نکته که محیطهای کشتی که هم اکنن در کشت برنتنی ریان م استفاده قرار میگیرند در ضعیت پایینتر از حد مطلب قرار دارند کمی تامل برانگیز میباشد. بدن شک مطالعات انجام شده تاکنن گاه بر اثرات احتمالی مفید افزدن فاکترهای رشد به محیط کشت میباشند. اما کارب اقعی میحطهای کشت به گنهای که کامال مشابه با ترکیب مجد در بدن مجد زنده باشد فاصله زیادی با اقعیت دا. ممکن است که افزدن فاکترهای رشد به محیطهای کشت کمی با اکراه انجام شد که دلیل آن خشندی از کفایت سیستمهای کشت کننی در تلید ریانهای زنداشد این نکته تسط Richer همکاران م اشاره قرار گرفته است )20(. به هر ری همچنان در م سهم دقیق کمبد فاکترهای رشد در محیطهای کشت اثرات مخرب شرایط کشت بر تکین ریان ابهام جد دا. در حقیقت رابطه علت معللی مستقیمی تاکنن در زمینه اثرات مخرب مرتبط با شرایط محیط کشت هنز به دست نیامده است. نشان داده شده است که فاکترهای رشد اثرات مفیدی در رند تکین ریان از خد برجای می گذارند اما هنز به اثبات نرسیده است که غیاب این عامل با آثار مخرب مشاهده شده حاصل از کشت برنتنی در ارتباط باشد. حتی اگر رابطه علت معللی مستقیمی در این ارتباط بنا شده باشد مسئله مهمی که میبایست د ر مرحله بعد م تجه قرار بگی این است که مقدار دقیق صحیح م نیاز برای رشد ریان چه مین خاهد بد. تخمین غلظت فاکترهای رشد در مایعات فیزیلژی مجد در بدن مجد زنده با تجه به کاربها رشهای مجد بسیار مشکل به نظر میرسد. پیشرفتهایی که در زمینه پرتئمیک سنجشهای میکراری در راستای اندازه گیری مین فاکترهای رشد در مایع فلیکلی مایع ایداکت مایعات اندمتریم رحم به تحقق پیست است این عده را میدهد که به زدی امکان اندازه گیری دقیق فاکترهای رشد در شرایط درنتنی فراهم خاهد شد )20(. اما نکتهای که باید در نظر داشت این است که به دست آن مایعات مجد در شرایط درنتنی بدن آلده شدن جهت سنجش در شرایط آزمایشگاهی به یژه مایع ایداکت کاری 456

163 بسیار سخت به نظر میآید. اگر فاکترهای رشد به مینی بیشتر از آنچه در حقیقت جد دا به محیط کشت افزده شد می- تاند باعث برز ناهنجاریهایی در رند تکین ریان شد. نمیتان نادیده گرفت که دانش کامل بینقص در م اثرات بالقه فاکترهای رشد ری رند کشت برنتنی ریان هنز برای ما در دسترس نمیباشد. به هرری به نظر میرسد که تخمین غلظت فاکترهای رشد در مایعات فیزیلژی فقط بخش کچکی از راه حل باشد. فاکترهای رشد متعددی به عنان عامل اتکراین عمل نمده این امکان جد دا که اثرات این نع از فاکترهای رشد در شرایط برنتنی تغییر یابد. همچنین فاکترهای رشد متعددی در مکانهای دیگر تلید شده در شرایط درنتنی به اسطه گیرندههایی که در سطح ریان جد دارند برعملک رند تکین ریان تاثیر میگذارند. تقریبا غیر ممکن است که این اثرات اندکراین فاکترهای رشد م فهم قرار بگی. همچنین یکی از نکات مهم در استفاده از فاکترهای رشد این است که کدام ترکیب از فاکترهای رشد م استفاده قرار بگیرند. در حقیقت فاکترهای رشد به صرت انفرادی عمل نمینمایند ترکیبات متعددی از فاکترهای رشد در شرایط درنتنی مایعات فیزیلژی بدن جد دارند. به هر ری بیشتر مطالعات به بررسی انفرادی فاکترهای رشد پاختهاند تجهی به اثرات ترکیبی این فاکترها نکه اند. به نظر میرسد که ترکیبی از فاکترهای رشد میتانند محیطی را ایجاد نمایند که تقلید کننده شرایط درنتنی باشد. برآ دقیق از اثرات ابسته به مقدار مصرف فاکترهای رشد اثرات اندکراین آنها اثرات ترکیبی این فاکترها مضعی دشار پیچیده به نظر میرسد. بنابراین به طر خالصه میتان اینگنه بیان نمد که افزدن فاکترهای رشد به محیط کشت یکی از مراحل امید بخش در شناسایی مسیر آینده به سی ارتقا محیطهای کشت به منظر ارتقا ضریب مفقیت IVF به حساب میآید. یکی از مشهدترین عامل که میبایست در محیطهای کشت افزده شد مادی هستند که در شرایط درنتنی جد دارند ریان برای آنها گیرنده اختصاصی داشته میتاند به آنها پاسخ دهد از جمله این عامل میتان به- HB CSF, EGF, GM-CSF, PDGF 2EGF IGF-4, IGF-2, LIF اکتیین TGF- α اشاره نمد. اما مطالعات بیشتری به منظر تعیین مقدار مصرف ترکیب بهینه فاکترهای رشد الزم میباشد که باید قبل از افزدن فاکترهای رشد به محیطهای کشت به عنان ریهای استاندا معمل به انجام برسد. سللها مایعات در دستگاه تلید مثل آندمتریم جدل بیان فاکترهای رشد در دستگاه تلید مثلی در ارتباط با چرخه تلید مثلی مرحله چرخه تلید مثلی فاکتر رشد بیشترین مین در فاز لتئال تلید میشد ) ( فاکتر مهارکننده لسمی تسط سللهای اپیتلیال لله تناسلی ) ( در تمام مدت چرخه تلید مثلی به یژه در فاز لتئال اکتیین آ به سسیله سللهای اپیتلیال )82 ) )90( در تمام مدت چرخه تلید مثلی به جز در زمان ابتدای فاکتر محرک تشکیل کلنی )90 ) فاز فلیکلی )411( فاکتر رشد اپیدرمی )411 ) در تمام مدت چرخه تلید مثلی )09( فیبرنکتین بیشترین تلید در ااسط فاز لتئال بیشترین تلید بالفاصله قبل از النهگرینی ) ( فاکتر محرک کلنی گرانلسیت-ماکرفاژ به اسطه سلل- های اپیتلیال لله تناسلی سللهای اپیتلیال تراشی )414( فاکتر رشد اپیدرمی متصل شنده به هپارین به اسطه سطح راسی سللهای اپیتلیال لله تناسلی ) ( بیشترین مین تلید از ااخر فاز فلیکلی تا ااسط فاز فاکتر رشد شبه انسلسن 4 به اسطه سللهای اپیتلیال لله دستگاه تلید مثلی به سیله سللهای تراشی )02( لتئال )413( فاکتر رشد شبه انسلسن )412 2 ) 410 در خالل فاز لتئال ) ( اینهیبین 82( ) ابتدا در خالل فاز لتئال )00 91(

164 فاکتر رشد مشتق شد از پالکت )93 444( 92 فاکتر رشد اندتلیال عرقی در سطح راسی سللهای اپیتلیم 00( )91 08 ایداکت ( ) EIF بیشترین مقدار از ااخر فاز فلیکلی تا ااسط فاز لتئال GM-CSF بیشترین مقدار از ااخر فاز فلیکلی تا ااسط فاز لتئال )414( HB-EGF بیشترین مقدار از ااخر فاز فلیکلی تا ااسط فاز لتئال )434( LIF در تمام مدت چرخه تلید مثلی )432( TGF-α بیشترین مقدار از ااخر فاز فلیکلی تا ااسط فاز لتئال ) ( VEGF بیشترین مقدار تلید در زمان پیش از تخمکریزی )03 )433 مایع فلیکلی )93( FGF, Fibronectin در تمام مدت چرخه تلید مثلی )03(IGF-4 )03(IGF-2 )91(M-CSF جسم ز اینهیبین تحریک تلید تسط هرمن جفت انسان )99 ) 98 VEGF )تحریک تلید تسط هرمن جفت انسان( )431( سللهای اکتیین آ )تحریک تلید تسط هرمن جفت انسان( )81 ) در تمام مدت چرخه تلید مثلی کملس/گرانل )92 94(FGF فیبرنکتین ابتدا تسط سللهای کرنا )433 ) )80(IGF-4 IGF-2 )تحریک تلید تسط هرمن جفت انسان( )83( اینهیبین )81( )تحریک تلید تسط هرمن جفت انسان )) 84( )432(LIF )91(M-CSF )80(TGF-α VEGF در فلیکل بالغ فلیکل پیش از تخمک ریزی )01( که تسط هرمن جفت انسان تحریک شده است )83 )430 جدل فاکتر رشد اکتیین آ بیان گیرندههای فاکترهای رشد تسط اسیت ریان اسیت ریان 2 2 تا 1 سللی ریان 2 بالستسیست تضیح با استفاده از سامانه همکشتی با سللهای اندمتریم افیش مییابد منبع )81( )439( )89-82( )438( )88-89( )449-80( )449( 2 تا 9 سللی CSF-4 EGF GM-CSF HB-EGF IGF-4 IGF-2 458

165 -423( )424 )411( )414( )89-82( LIF PAF PDGF TGF-α جدل ارتقا رشد با استفاده از سللهای متفات افزده شده به سامانه همکشتی ارتقا رشد نع سلل افیش در تعداد سلل )413( کاهش قطعه قطعه شدن ) ( افیش نرخ تلید بالستسیست )423( سلل کملس اتلگ افیش نرخ بارری افیش تعداد سلل افیش نرخ النه گزینی ) ( ایداکت سللهای انسان سللهای اتلگ آندمتر سللهای سرطانی تخمدان فیبربالست رحم ریان گا اپیتلیال ایداکت گا سللهای کبدی بفال سلل های Vero کاهش نرخ قطعه قطعه شدن )410( افیش نرخ تلید بالستسیست )419( کاهش نرخ قطعه قطعه شدن ریان افیش چسبندگی سلل به سلل تسعه بالستمرها تغییرات در قطر زناپلسیدا ارتقا مین تفریخ بالستسیست افیش نرخ قع آبستنی )41( افیش نسانات در قطر زنا پلسیدا افیش نرخ النه گزینی نرخ آبستنی )423( افیش نرخ آبستنی النه گزینی )422( افیش کیفیت ریان افیش نرخ کلیاژ افیش نرخ تشکیل بالستسیست لفیش نرخ آبستنی ) ( جدل اثرات سدمند فاکترهای رشد در مطالعات کشت برنتنی ریان حیانات فاکتر رشد IGF-4 اثرات مفید مشاهده شده در مطالعات حیانی در مش ) ( 401 خک ) ( خرگش )401( گا ) ( منجر به افیش نرخ تشکیل بالستسیست افیش تعداد سللهای بالستسیست شده است. همچنین شاهد کاهش نزخ آپپتزیس قطعه قطعه شدن در خک خرگش گا ) ( خاهیم بد. همچنین در مش شاهد ارتقا کیفیت بالستسیست افیش نسان در قطر زنا پلسیدا افیش نرخ تفریخ بالستسیست بدهاند ) ( 431 در گا منجر به افیش آبستنی تلد زنده ند خاهد شد )491(. نرخ قطعه قطعه شدن ریان را کاهش داده نرخ تشکیل بالستسیست را افیش میدهد همچنین نرخ تفریخ رشد ربه خارج ترفبالست را افیش میدهد ) ( درحالی که در گسفند تحلیل رفتن اسیت ریان راکاهش یافته نرخ لقاح افیش چشمگیری از خد نشان میدهد تعداد سللهای ICM نرخ تفریخ بالستسیست نرخ النه گزینی نیز افیش یافته است 491( )493 افیش نرخ تشکلی بالستسیت گا )492(. دز مش GM-CSF منجر به افیش تشکیل بالستسیست شده نرخ تفریخ را باال به باشت گلکز را افیش داده تعداد سللهای بالستسیست را افیش داده نرخ النه گزینی ریان زنده را افیش داده مقدار آپپتزیس را کاهش داده تسعه مجدد بالستسیست بعد از ذب در پی یخگشایی را نیز افیش داده است ) ( همچنین نشان داده شده است که ناهنجاریهای ریانی دران بزرگستا حیان را نیز کاهش داده است که ناهنجاریهایی معمل در ریانهای تلید شده از رند IVF میباشند )41(. GM-CSF اثر کشت بر رشد ناهنجاررا معکس که نسبت مساحت ترفبالست جفتی که برای تغذیه ریان استفاده میشد را نیز افیش میدهد )41(. در مش نرخ تشکیل بالستسیست تعداد سللهای بالستسیست را افیش میدهد )481( در رت نرخ تشکیل بالستسیست را افیش داده )484( در مش نرخ تفریخ رشد ترفبالستیک النه گزینی را افیش می- دهد )482( در مش نرخ تشکیل بالستسیست تعداد سللهای بالستسیست کیفیت بالستسیست نرخ تفریخ را افیش میدهد ) ( در گا نرخ تشکیل بالستسیست تلد زنده را افیش داده )483( در رت نرخ النه گزینی را دبرابر مینماید )481(. در مش نرخ تشکیل بالستسیست نرخ بارری تکین پیش از النهگزینی را اقیش داده نرخ تحلیل رفتن ریان قطعه قطعه شدن آپپتزیس را کاهش داده نرخ تلد را افیش داده ) ( در گسفند نرخ آپپتزیس ریان پیش از النه گزینی را کاهش داده )480( نرخ تشکیل بالستسیست را افیش داده کیفیت 453 LIF GM-CSF M-CSF HB-EGF EGF- Fibronectin PAF TGF-α

166 بالستسیست را افیش داده اریانس در قطر زنا را افیش داده نرخ تفزیخ را افیش داده رشد ترفبالستیک را نیز را ارتقا میدهد 428( ) جدل اثرات سدمند افزدن فاکترهای رشد مشاهده شده درانسان فاکتر رشد اثرات مفید مشاهده شده در مطالعات حیانی افیش بیش از د برابری تشکیل بالستسیست افیش بیش از 3 برابری بالستسیست با کیفیت بسیار باال ) ( کاهش نرخ آپپتزیس افیش نرخ تشکیل بالستسیست با نرخی بیش از 31 درصد افیش 21 درصدی در تعداد سللهای ICM درحالی که آنتیبادی IGF-4 باعث ممانعت از تشکیل بالستسیست میشد )02 214( افیش بیش از د برابری تشکیل بالستسیست افیش سرعت تکین بالستسیست افیش نرخ تفریخ بالستسیست کاهش آپپتزیس با درصدی نزدیک به 31 درصد کاهش افیش تعداد سللهای زنده ICMبا نرخی نزدیک به 31 درصد افزیش ) ( افیش نرخ تشکیل بالستسیست تفریخ آن به مین 31 درصد )213( افیش تراش فعال کننده پالسمینژن )این ماده با نرخ النه گزینی ارتباط دا( تسط ریان )211( افیش نرخ تفریخ ریان )421( LIF IGF-4 GM -CSF HB-EGF EGF Laminin or fi bronectin. Behr B, Wang H ( ) Effect of culture conditions on IVF outcome. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol S:S S.Thompson J, Mitchell M, Kind K ( ) Embryo culture and long-term consequences. Reprod Fertil Dev ( ):. Whittens W, Biggers J ( ) Complete development in vitro of the pre-implantation stages of the mouse in a simple chemically defined medium. J Reprod Fertil ( ):.Payne S, Munday R, Thompson J ( ) Addition of superoxide dis mutase and catalase does not necessarily overcome developmental retardation of one-cell mouse embryos during in-vitro culture. Reprod Fertil Dev :.Ho Y, Doherty A, Schultz R ( ) Mouse preimplantation embryo development in vitro, effect of sodium concentration in culture media onrnasynthesis and accumulation and gene expression. Mol Reprod Dev :.Wrenzycki C, Herrman D, Carnwarth J, Niemann H ( ) Alterations in the relative abundance of gene transcripts in preimplantation bovine embryos cultured in medium supplemented with either serum or PVA. Mol Reprod Dev :.Wrenzycki C, Herrmann D, Keskintepe L, Martins A Jr, Sirisathien S, Brackett B, Niemann H ( ) Effects of culture system and protein supplementation on mrna expression in pre-implantation bovine embryos. Hum Reprod :.Niemann H, Wrenzycki C ( ) Alterations of expression of developmentally important genes in preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions, implications for subsequent development. Theriogenology :.Rizos D, Lonergan P, Boland M, Arroyo- Garcia R, Pintado B, De La Fuente J, Gutierrez-Adan A ( ) Analysis of differential messenger RNA expression between bovine blastocysts produced in different culture systems, implications for blastocyst quality. Biol Reprod :.Lonergan P, Rizos D, Gutierrez-Adan A, Fair T, Boland M ( ) Oocyte and embryo quality, effect of origin, culture condition and gene expression patterns. Reprod Domest Anim :.Lonergan P, Pedersen H, Rizos D, Greve T, Thomsen P, Fair T, Evans A, Boland M ( ) Effect of the postfertilization culture environment on the incidence of chromosome aberrations in bovine blastocysts. Biol Reprod :.Kind K, Collett R, Harvey A, Thompson J ( ) Oxygen-regulated expression of GLUT-, GLUT-, and VEGF in the mouse blastocyst. Mol Reprod Dev : 461 منابع

167 .Bertolini M, Moyer A, Mason J, Batchelder C, Hoffert K et al ( ) Evidence of increased substrate availability to in vitro-derived bovine foetuses and association with accelerated conceptus growth. Reproduction :.Sjoblom C, Roberts C, Wikland M, Robertson S ( ) Granulocyte macrophage colonystimulating factor alleviates adverse consequences of embryo culture on fetal growth trajectory and placental morphogenesis. Endocrinology :.Farin P, Farin C ( ) Transfer of bovine embryos produced in vivo or in vitro, survival and fetal development. Biol Reprod :.Max fi eld E, Sinclair K, Broadbent P et al ( ) Short-term culture of ovine embryos modifies fetal myogenesis. Am J Physiol :E E.Crosier A, Farin C, Rodriguez K et al ( ) Development of skeletal muscle and expression of candidate genes in bovine fetuses from embryos produced in vivo or in vitro. Biol Reprod :.Young L, Fernandes K, McEvoy T et al ( ) Epigenetic change in IGF R is associated with fetal overgrowth after sheep embryo culture. Nat Genet :.Hiendleder S, Mund C, Reichenbach H et al ( ) Tissue-speci fi c elevated genomic cytosine methylation levels are associated with an overgrowth phenotype of bovine fetuses derived by in vitro techniques. Biol Reprod :.Hiendleder S, Wirtz M, Mund C et al ( ) Tissue-speci fi c effects of in vitro fertilization procedures on genomic cytosine methylation levels in overgrown and normal sized bovine fetuses. Biol Reprod :.Sangild P, Schmidt M, Jacobsen H et al ( ) Blood chemistry, nutrient metabolis m, and organ weights in fetal and newborn calves derived from in vitro-produced bovine embryos. Biol Reprod :.van Wagtendonk-de Leeuw A, Mullaart E, de Roos A et al ( ) Effects of different reproduction techniques, AI MOET or IVP, on health and welfare of bovine offspring. Theriogenology :.McEvoy T, Sinclair K, Broadbent P et al ( ) Postnatal growth and development of Simmental calves derived from in vivo or in vitro embryos. Reprod Fertil Dev :.Rivera R, Stein P, Weaver J et al ( ) Manipulations of mouse embryos prior to implantation result in aberrant expression of imprinted genes on day. of development. Hum Mol Genet :.Li T, Vu T, Ulaner G, Littman E, Ling J, Chen H, Hu J, Behr B, Giudice L, Hoffman A ( ) IVF results in de novo DNA methylation and histone methylation at an Igf - H imprinting epigenetic switch. Mol Hum Reprod ( ):.Fauque P, Jouannet P, Lesaffre C et al ( ) Assisted reproductive technology affects developmental kinetics, H imprinting control region methylation and H gene expression in individual mouse embryos. BMC Dev Biol :.Richter K ( ) The importance of growth factors for preimp lantation embryo development and invitro culture. Curr Obstet Gynecol ( ):.Lidegaard O, Pinborg A, Andersen AN ( ) Imprinting diseases and IVF, Danish National IVF cohort study. Hum Reprod :.DeBaun MR, Niemitz EL, Feinberg AP ( ) Association of in vitro fertilization with Beckwith Wiedemann syndrome and epigenetic alterations of LIT and H. Am J Hum Genet :.Gicquel C, Gaston V, Mandelbaum J et al ( ) In vitro fertilization may increase the risk of Beckwith Wiedemann syndrome related to the abnormal imprinting of the KCN OT gene. Am J Hum Genet :.Halliday J, Oke K, Breheny S et al ( ) Beckwith Wiedemann syndrome and IVF, a case control study. Am J Hum Genet :.Chang A, Moley K, Feinberg A, Wangler M, DeBaun M ( ) The association between Beckwith Weidemann syndrome and assisted reproductive technology, a case series of nineteen patients. Fertil Steril :.Doornbos M, Maas S, McDonnell J, Vermeiden J, Hennekam R ( ) Infertility, assisted reproduction technologies and imprinting disturbances, a Dutch study. Hum Reprod ( ):.Sutcliffe A, Peters C, Bowdin S, Temple K, Reardon W, Wilson L, Clayton-Smith J, Brueton L, Bannister W, Maher E ( ) Assisted reproductive therapies and imprinting disorders a preliminary British survey. Hum Reprod ( ):.Hansen M, Kurinczuk J, Bower C, Webb S ( ) The risk of major birth defects after intracytoplasmic sperm injection and in vitro fertilization. N Engl J Med :.Stromberg B, Dahlquist G, Ericson A et al ( ) Neurological sequelae in children born after in-vitro fertilisation, a populationbased study. Lancet :.Helmerhorst F, Perquin D, Donker D, Keirse M ( ) Perinatal outcome of singletons and twins after assisted conception, a systematic review of controlled studies. BMJ : 464

168 .Jackson RA, Gibson KA, Wu YW, Croughan MS ( ) Perinatal outcomes in singletons following in vitro fertilization, a meta-analysis. Obstet Gynecol :.Bonduelle M, Wennerholm U, Loft A et al ( ) A multicentre cohort study of the physical health of -year-old children conceived after intracytoplasmic sperm injection, in vitro fertilization and natural conception. Hum Reprod :.Klemetti R, Gissler M, Sevon T et al ( ) Children born after assisted fertilization have an increased rate of major congenital anomalies. Fertil Steril :.Olson C, Keppler-Noreuil K, Romitti P et al ( ) In vitro fertilization is associated with an increase in major birth defects. Fertil Steril :.Shevell T, Malone F, Vidaver J et al ( ) Assisted reproductive technology and pregnancy outcome. Obstet Gynecol :.Helmerhorst F, Perquin D, Donker D, Keirse M ( ) Perinatal outcome of singletons and twins after assisted conception, a systematic review of controlled studies. BMJ :.Jackson R, Gibson K, Wu Y, Croughan M ( ) Perinatal outcomes in singletons following in vitro fertilization, a meta-analysis. Obstet Gynecol :.Doyle P, Beral V, Maconochie N ( ) Preterm delivery, low birthweight and small for-gestationalage in liveborn singleton babies resulting from in-vitro fertilization. Hum Reprod :.Wang J, Clark A, Kirby C et al ( ) The obstetric outcome of singleton pregnancies following invitro fertilization/gamete intrafallopian transfer. Hum Reprod :.Koudstaal J, Braat DD, Bruinse HW et al ( ) Obstetric outcome of singleton pregnancies after IVF, a matched control study in four Dutch university hospitals. Hum Reprod :.Miles HL, Hofman PL, Peek J et al ( ) In vitro fertilization improves childhood growth and metabolism. J Clin Endocrinol Metab :.Rinaudo P, Schultz R ( ) Effects of embryo culture on global pattern of gene expression in preimplantation mouse embryos. Reproduction :.Katz-Jaffe M, Linck D, Schoolcraft W, Gardner D ( ) A proteomic analysis of mammalian preimplantation embryonic development. Reproduction :.Corcoran D, Fair T, Park S, Rizos D, Patel O et al ( ) Suppressed expression of genes involved in transcription and translation in in v itro co mpared with in v ivo cultured bovine emb ryos. Reproduction :.Machaty Z, Day BN, Prather RS ( ) Development of early porcine embryos in vitro and in vivo. Biol Reprod :.Farin P, Slenning B, Britt J ( ) Estimates of pregnancy outcomes based on selection of bovine embryos produced in vivo or in vitro. Theriogenology :.Wang W, Abeydeera L, Han Y et al ( ) Morphologic evaluation and actin fi lament distribution in porcine embryos produced in vitro and in vivo. Biol Reprod :. Khurana N, Niemann H ( ) Effects of cryopreservation on glucose metabolism and survival of bovine morulae and blastocysts derived in vitro or in vivo. Theriogenology :.Montag M, Koll B, Holmes P, van der Ven H ( ) Signi fi cance of the number of embryonic cells and the state of the zona pellucid for hatching of mouse blastocysts in vitro versus in vivo. Biol Reprod :.Holm P, Booth P, Callesen H ( ) Kinetics of early in vitro development of bovine in vivo- and in vitro-derived zygotes produced and/or cultured in chemically de fi ned or serum-containing media. Reproduction :.Papadopoulos S, Rizos D, Duffy P et al ( ) Embryo survival and recipient pregnancy rates after transfer of fresh or vitrified, in vivo or in vitro produced ovine blastocysts. Anim Reprod Sci :.Rizos D, Ward F, Duffy P et al ( ) Consequences of bovine oocyte maturation, fertilization or early embryo development in vitro versus in vivo, implications for blastocyst yield and blastocyst quality. Mol Reprod Dev :.Watkins A, Platt D, Papenbrock T et al ( ) Mouse embryo culture induces changes in postnatal phenotype including raised systolic blood pressure. Proc Natl Acad Sci USA :.Giritharan G, Talbi S, Donjacour A et al ( ) Effect of in vitro fertilization on gene expression and development of mouse preimplantation embryos. Reproduction :.Crosier AE, Farin PW, Dykstra MJ et al ( ) Ultrastructural morphometry of bovine compact morulae produced in vivo or in vitro. Biol Reprod :.Crosier AE, Farin PW, Dykstra MJ et al ( ) Ultrastructural morphometry of bovine blastocysts produced in vivo or in vitro. Biol Reprod :.Boni R, Tosti E, Roviello S, Dale B ( ) Intercellular communication in in vivo- and in vitroproduced bovine embryos. Biol Reprod : 462

169 .Abe H, Otoi T, Tachikawa S et al ( ) Fine structure of bovine morulae and blastocysts in vivo and in vitro. Anat Embryol (Berl) :.Wrenzycki C, Herrmann D, Carnwath JW, Niemann H ( ) Expression of the gap junction gene connexin (Cx ) in preimplantation bovine embryos derived in vitro or in vivo. J Reprod Fertil :.Eckert J, Niemann H ( ) mrna expression of leukaemia inhibitory factor (LIF) and its receptor subunits glycoprotein and LIF-receptor-beta in bovine embryos derived in vitro or in vivo. Mol Hum Reprod :.Stojanov T, Alechna S, O Neill C ( ) In-vitro fertilization and culture of mouse embryos in vitro signi fi cantly retards the onset of insulin-like growth factor-ii expression from the zygotic genome. Mol Hum Reprod :.Stojanov T, O Neill C ( ) In vitro fertilization causes epigenetic modi fi cations to the onset of gene expression from the zygotic genome in mice. Biol Reprod :.Bertolini M, Beam SW, Shim H et al ( ) Growth, development, and gene expression by in vivoand in vitro-produced day and bovine embryos. Mol Reprod Dev :.Lazzari G, Wrenzycki C, Herrmann D et al ( ) Cellular and molecular deviations in bovine in vitro-produced embryos are related to the large offspring syndrome. Biol Reprod :.Lighten AD, Moore GE, W inston RM, Hardy K ( ) Routine addition of human insulinlike growth factor-i ligand could bene fi t clinical in-vitro fertilization culture. Hum Reprod :.Wang TH, Chang CL, Wu HM et al ( ) Insulin-like growth factor-ii (IGF-II), IGFbinding protein- (IGFBP- ), and IGFBP- in follicular fl uid are associated with oocyte maturation and embryo development. Fertil Steril :.Kamat BR, Brown LF, Manseau EJ et al ( ) Expression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor by human granulosa and theca lutein cells. Role in corpus luteum development. Am J Pathol :.Gordon JD, Mesiano S, Zaloudek CJ, Jaffe RB ( ) Vascular endothelial growth factor localization in human ovary and fallopian tubes, possible role in reproductive function and ovarian cyst formation. J Clin Endocrinol Metab :.Lam PM, Briton-Jones C, Cheung CK et al ( ) Vascular endothelial growth factor in the human oviduct, localization and regulation of messenger RNA expression in vivo. Biol Reprod :.Torry D, Holt V, Keenan J, Harris G, Caudle M, Torry R ( ) Vascular endothelial growth factor expression in cycling human endometrium. Fertil Steril ( ):.Hornung D, Lebovic DI, Shifren JL et al ( ) Vectorial secretion of vascular endothelial growth factor by polarized human endometrial epithelial cells. Fertil Steril :.Zhang L, Scott P, Turley H et al ( ) Validation of antivascular endothelial g rowth factor (anti- VEGF) antibodies for immunohistochemical localization of VEGF in tissue sections, expression of VEGF in the human endometrium. J Pathol :.Sugino N, Kashida S, Karube-Harada A et al ( ) Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors in human endometrium throughout the menstrual cycle and in early pregnancy. Reproduction :.Watson R, Anthony F, Pickett M et al ( ) Reverse transcription with nested polymerase chain reaction shows expression of basic fibroblast growth factor transcripts in human granulosa and cumulus cells from in vitro fertilization patients. Biochem Biophys Res Commun :.Di Blasio AM, Vigano P, Cremonesi L et al ( ) Expression of the genes encoding basic fi broblast growth factor and its receptor in human granulosa cells. Mol Cell Endocrinol :R R.Seli E, Zeyneloglu HB, Senturk LM et al ( ) Basic fi broblast growth factor, peritoneal and follicular fl uid levels and its effect on early embryonic development. Fertil Steril :.Salmassi A, Zhang Z, Schmutzler A et al ( ) Expression of mrna and protein of macrophage colony-stimulating factor and its receptor in human follicular luteinized granulose cells. Fertil Steril :.Boehm K, Daimon M, Gorodeski I et al ( ) Expression of the insulin-like and platelet-derived growth factor genes in human uterine tissues. Mol Reprod Dev :.Desai N, Goldfarb J ( ) Growth factor/ cytokine secretion by a permanent human endometrial cell line with embryotrophic properties. J Assist Reprod Genet :.Kauma S, Aukerman S, Eierman D, Turner T ( ) Colony-stimulating factor- and C-FMS expression in human endometrial tissues and placenta during the menstrual cycle and early pregnancy. J Clin Endocrinol Metab :.Davis S, Krozowski Z, McLachlan R, Burger H ( ) Inhibin gene expression in the human corpus luteum. J Endocrinol :R R.Wang H, Lu S, Han X et al ( ) Control of inhibin production by dispersed human luteal cells in vitro. Reprod Fertil Dev : 469

170 .He Z, Liu H, Mele C et al ( ) Expression of inhibin/activin subunits and their receptors and binding proteins in human preimplantation embryos. J Assist Reprod Genet :.Vanttinen T, Liu J, Hyden-Granskog C et al ( ) Regulation of immunoreactive inhibin A and B secretion in cultured human granulosa- luteal cells by gonadotropins, activin A and insulin-like growth factor type- receptor. J Endocrinol :.Petraglia F, Florio P, Luisi S et al ( ) Expression and secretion of inhibin and activin in normal and neoplastic uterine tissues. High levels of serum activin A in women with endometrial and cervical carcinoma. J Clin Endocrinol Metab :.Ramasharma K, Li C ( ) Human pituitary and placental hormones control human insulin-like growth factor II secretion in human granulosa cells. Proc Natl Acad Sci USA :.Muttukrishna S, Groome N, Ledger W ( ) Gonadotropic control of secretion of dimeric inhibins and activin A by human granulosaluteal cells in vitro. J Assist Reprod Genet :.Neulen J, Raczek S, Pogorzelski M et al ( ) Secretion of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor from human luteinized granulosa cells is human chorionic gonadotrophin dependent. Mol Hum Reprod :.Chia C, Winston R, Handyside A ( ) EG, TGF-alpha and EGFR expression in human preimplantation embryos. Development :.Smotrich D, Stillman R, W idra E et al ( ) Immunocytochemical localization of growth factors and their receptors in human preembryos and fallopian tubes. Hum Reprod :.Jiang Q, Chen S, Xing F ( ) Expression of epidermal growth factor receptor in human preimplantation embryos. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi :.Chobotova K, Chobotova K, Spyropoulou I, Carver J et al ( ) Heparin-binding epidermal growth factor and its receptor ErbB mediate implantation of the human blastocyst. Mech Dev :...Roudebush W, Purnell E, Stoddart N, Fleming S ( ) Embryonic platelet-activating factor, temporal expression of the ligand and receptor. J Assist Reprod Genet :.Osterlund C, Wramsby H, Pousette A ( ) Temporal expression of platelet-derived growth factor (PGDF)-A and its receptor in human pre implantation embryos. Mol Hum Reprod ( ):.Freeman M, Whitworth C, Hill G ( ) Granulosa cell co-culture enhances human embryo development and pregnancy rate following in-vitro fertilization. Hum Reprod :.Mansour R, Aboulghar M, Serour G, Abbass A ( ) Co-culture of human pronucleate oocytes with their cumulus cells. Hum Reprod :.Quinn P, Margalit R ( ) Bene fi cial effects of coculture with cumulus cells on blastocyst formation in a prospective trial with supernumerary human embryos. J Assist Reprod Genet :.Yeung W, Lau E, Chan S, Ho P ( ) Coculture with homologous oviductal cells improved the implantation of human embryos, a prospective randomized control trial. J Assist Reprod Genet :.Kervancioglu M, Saridogan E, Atasu T et al ( ) Human fallopian tube epithelial cell coculture increases fertilization rates in male factor infertility but not in tubal or unexplained infertility. Hum Reprod :.Nieto F, Watkins W, Lopata A et al ( ) The effects of coculture with autologous cryopreserved endometrial cells on human in vitro fertilization and early embryo morphology, a randomized study. J Assist Reprod Genet :.Ben-Chetrit A, Jurisicova A, Casper R ( ) Coculture with ovarian cancer cell enhances human blastocyst formation in vitro. Fertil Steril :.Shapiro B, Richter K, Harris D, Daneshmand S ( ) A randomized controlled study comparing human embryo growth in sequential blastocyst media with or without Vero cell coculture. Fertil Steril :s s.menezo Y, Sakkas D ( ) Monozygotic twinning, is it related to apoptosis in the embryo? Hum Reprod :.Behr B, Fisch J, Racowsky C, Miller K, Pool T, Milki A ( ) Blastocyst-ET and monozygotic twinning. J Assit Reprod Genet ( ):.Milki A, Jun S, Hinckley M, Behr B, Giudice L, Westphal L ( ) Incidence of monozygotic twinning with blastocyst transfer compared to cleavage-stage transfer. Fertil Steril ( ):.Wright V, Schieve L, Vahratian A, Reynolds M ( ) Monozygotic twinning associated with day embryo transfer in pregnancies conceived after IVF. Hum Reprod ( ):.Desai N, Goldfarb J ( ) Co-cultured human embryos may be subjected to widely different microenvironments, pattern of growth factor/cytokine release by Vero cells during the co-culture interval. Hum Reprod :.O Neill C ( ) Autocrine mediators are required to act on the embryo by the -cell stage to promote normal development and survival of mouse preimplantation embryos in vitro. Biol Reprod : 461

171 .O Neill C ( ) Evidence for the requirement of autocrine growth factors for development of mouse preimplantation embryos in vitro. Biol Reprod :.Jin Y, Guo X, Li L et al ( ) The effect of autocrine factors on development of early embryos of mouse. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao :.Lighten A, Hardy K, Winston R, Moore G ( ) Expression of mrna for the insulinlike growth factors and their receptors in human preimplantation embryos. Mol Reprod Dev :.Punjabi U, Vereecken A, Delbeke L et al ( ) Embryo-derived platelet activating factor, a marker of embryo quality and viability following ovarian stimulation for in vitro fertilization. J In Vitro Fert Embryo Transf :.Turpeenniemi-Hujanen T, Feinberg R, Kauppila A, Puistola U ( ) Extracellular matrix interactions in early human embryos, implications for normal implantation events. Fertil Steril :.Hwu Y, Chen C, Li S et al ( ) Expression of vascular endothelial growth factor messenger ribonucleic acid and protein in human preimplantation embryos. Fertil Steril :.Juriscova A, Casper R, MacLusky N, Mills G, Librach C ( ) HLA -G expression during preimplantation human embryo development. Proc Natl Acad Sci USA :.Menicucci A, Noci I, Fuzzi B, Criscuoli L, Scarselli G, Barricordi O ( ) Nonclassic shla class I in human oocyte culture medium. Hum Immunol :.Fuzzi B, Rizzo R, Criscuoli L, Noci I, Melchiorri L, Scarselli B et al ( ) HLA-G expression in early embryos is a fundamental prerequisite for the obtainment of pregnancy. Eur J Immunol ( ):.Gardner D, Sakkas D ( ) Assessment of embryo viability, the ability to select a single embryo for transfer a review. Placenta :.Noci I, Fuzzi B, Rizzo R, Melchiorri L, Criscuoli L, Diabizzi S et al ( ) Embryonic soluble HLA- G as a marker of developmental potential in embryos. Hum Reprod ( ):.Sher G, Keskintepe L, Nouriani M, Roussev R, Batzo fi n J ( ) Expression of shla-g in supernatants of individually cultured -h embryos, a potentially valuable indicator of embryo competency and IVF outcome. Reprod Biomed Online :.Rebmann V, Switala M, Eue I, Grosse-Wilde H ( ) Soluble HLA-G is an independent factor for the prediction of pregnancy outcome after ART, a German multi-centre study. Hum Reprod ( ):.Desai N, Lawson J, Goldfarb J ( ) Assessment of growth factor effects on postthaw development of cryopreserved mouse morulae to the blastocyst stage. Hum Reprod :.Desai N, Kattal N, AbdelHafez F et al ( ) Granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and co-culture can affect post thaw development and apoptosis in cryopreserved embryos. J Assist Reprod Genet :.O Neill C, Ryan J, Collier M et al ( ) Supplementation of in-vitro fertilisation culture medium with platelet activating factor. Lancet :.Borini A, Bulletti C, Cattoli M et al ( ) Use of recombinant leukemia inhibitory factor in embryo implantation. Ann N Y Acad Sci :.Kim D, Kim M, Kang H et al ( ) The supplementation of granulocyte macrophage colonystimulating factor (GM-CSF) in culture medium improves the pregnancy rate in human ART programs. Fertil Steril :s.shapiro B, Richter K, Daneshmand S et al ( ) Granulocyte macrophage colonystimulating factor enhances human embryo development to the blastocyst stage, a randomized study. Fertil Steril :.Huang J, Mehrens D, Wiese R et al ( ) High-throughput genomic and proteomic analysis using microarray technology. Clin Chem :.Soulet D, Rivest S ( ) Perspective, how to make microarray, serial analysis of gene expression, and proteomic relevant to day-to-day endocrine problems and physiological systems. Endocrinology :.Arici A, Engin O, Attar E, Olive D ( ) Modulation of leukemia inhibitory factor gene expression and protein biosynthesis in human endometrium. J Clin Endocrinol Metab :.Cullinan E, Abbondanzo S, Anderson P et al ( ) Leukemia inhibitory factor (LIF) and LIF receptor expression in human endometrium suggests a potential autocrine/paracrine function in regulating embryo implantation. Proc Natl Acad Sci USA :.Tsai H, Chang C, Hsieh Y, Lo H ( ) Leukemia inhibitory factor expression in different endometrial locations between fertile and infertile women throughout different menstrual phases. J Assist Reprod Genet : 465

172 .Sato A, Bo M, Otani T, Mochizuki M ( ) Expression of epidermal growth factor, transforming growth factor-alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA in human endometrium and endometrial carcinoma. Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi :.Zhao Y, Chegini N ( ) The expression of granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) and receptors in human endometrium. Am J Reprod Immunol :.Yoo H, Barlo w D, Mardon H ( ) Temporal and spatial regulation of expression of heparinbinding epidermal growth factorlike growth factor in the human endometrium, a possible role in blastocyst implantation. Dev Genet :.Leach R, Khalifa R, Ramirez N et al ( ) Multiple roles for heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor are suggested by its cell-specific expression during the human endometrial cycle and early placentation. J Clin Endocrinol Metab :.Stavreus-Evers A, Aghajanova L, Brismar H et al ( ) Co-existence of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor and pinopodes in human endometrium at the time of implantation. Mol Hum Reprod :.Tang X, Rossi M, Masterson B, Chegini N ( ) Insulin-like growth factor I (IGF-I), IGF-I receptors, and IGF binding proteins in human uterine tissue, tissue localization and IGF-I action in endometrial stromal and myometrial smooth muscle cells in vitro. Biol Reprod :.Giudice L, Dsupin B, Jin I et al ( ) Differential expression of messenger ribonucleic acids encoding insulin-like growth factors and their receptors in human uterine endometrium and decidua. J Clin Endocrinol Metab :. Giudice L, Lamson G, Rosenfeld R, Irwin J ( ) Insulin-like growth factor-ii (IGF-II) and IGF binding proteins in human endometrium. Ann N Y Acad Sci :. Morishige K, Kurachi H, Amemiya K et al ( ) Menstrual stage-specific expression of epidermal growth factor and transforming growth factor-alpha in human oviduct epithelium and their role in early embryogenesis. Endocrinology :. Chegini N, Zhao Y, McLean F ( ) Expression of messenger ribonucleic acid and presence of immunoreactive proteins for epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor alpha (TGF alpha) and EGF/ TGF alpha receptors and I-EGF binding sites in human fallopian tube. Biol Reprod :. Kurachi H, Morishige K, Imai T et al ( ) Expression of epidermal growth factor and transforming growth factor-alpha in fallopian tube epithelium and their role in embryogenesis. Horm Res (Suppl ):. Pfeifer T, Chegini N ( ) Immunohistochemical localization of insulin-like growth factor (IGF-I), IGF-I receptor, and IGF binding proteins in human fallopian tube at various reproductive stages. Biol Reprod :. Keltz M, Attar E, Buradagunta S et al ( ) Modulation of leukemia inhibitory factor gene expression and protein biosynthesis in the human fallopian tube. Am J Obstet Gynecol :. Lam P, Briton-Jones C, Cheung C et al ( ) Vascular endothelial growth factor in the human oviduct, localization and regulation of messenger RNA expression in vivo. Biol Reprod :. Sugino N, Kashida S, Takiguchi S et al ( ) Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in the human corpus luteum during the menstrual cycle and in early pregnancy. J Clin Endocrinol Metab :. Familiari G, Verlengia C, Nottola S et al ( ) Heterogeneous distribution of fibronectin, tenascin- C, and laminin immunoreactive material in the cumulus -corona cells surrounding mature human oocytes from IVF-ET protocols evidence that they are composed of differen subpopulations, an immunohis-tochemical study using scanning confocal laser and fl uorescence microscopy. Mol Reprod Dev :. Piccinni M, Scaletti C, Mavilia C et al ( ) Production of IL- and leukemia inhibitory factor by T cells of the cumulus oophorus, a favorable microenvironment for preimplantation embryo development. Eur J Immunol :. Neulen J, Yan Z, Raczek S et al ( ) Human chorionic gonadotropin-dependent expression of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in human granulosa cells, importance in ovarian hyperstimulation syndrome. J Clin Endocrinol Metab :. Zolti M, Ben-Rafael Z, Meirom R, Shemesh M, Bider D, Mashiach S, Apte R ( ) Cytokine involvement in occytes and early embryos. Fertil Steril ( ):. Sjoblom C, Wikland M, Robertson S ( ) Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) acts independently of the beta common subunit of the GM-CSF receptor to prevent inner cell mass apoptosis in human embryos. Biol Reprod : 466

173 . Sharkey A, Dellow K, Blayney M et al ( ) Stage-speci fi c expression of cytokine and receptor messenger ribonucleic acids in human preimplantation embryos. Biol Reprod :. van Eijk M, Mandelbaum J, Salat-Baroux J et al ( ) Expression of leukaemia inhibitory factor receptor subunits LIFR beta and gp in human oocytes and preimplantation embryos. Mol Hum Reprod :. Wanggren K, Lalitkumar P, Hambiliki F et al ( ) Leukaemia inhibitory factor receptor and gp in the human fallopian tube and endometrium before and after mifepristone treatment and in the human preimplantation embryo. Mol Hum Reprod :. Quinn P, Margalit R ( ) Beneficial effects of coculture with cumulus cells on blastocyst formation in a prospective trial with supernumerary human embryos. J Assist Reprod Genet :. Wiemer K, Cohen J, Wiker S et al ( ) Coculture of human zygotes on fetal bovine uterine fibroblasts, embryonic morphology and implantation. Fertil Steril :. Tucker M, Ingargiola P, Massey J et al ( ) Assisted hatching with or without bovine oviductal epithelial cell co-culture for poor prognosis in-vitro fertilization patients. Hum Reprod :. Hu Y, Maxson W, Hoffman D et al ( ) Co-culture with assisted hatching of human embryos using buffalo rat liver cells. Hum Reprod :. Schillaci R, Ciriminna R, Cefalu E ( ) Vero cell effect on in-vitro human blastocyst development, preliminary results. Hum Reprod :. Magli M, Gianaroli L, Ferraretti A et al ( ) Human embryo co-culture, results of a randomized prospective study. Int J Fertil Menopausal Stud :. Turner K, Lenton E ( ) The influence of Vero cell culture on human embryo development and chorionic gonadotrophin production in vitro. Hum Reprod :. Harvey M, Kaye P ( ) Insulin-like growth factor- stimulates growth of mouse preimplantation embryos in vitro. Mol Reprod Dev :. Lin T, Yen J, Gong K et al ( ) IGF- / IGFBP- increases blastocyst formation and total blastocyst cell number in mouse embryo culture and facilitates the establishment of a stem-cell line. BMC Cell Biol :. Kim S, Lee G, Lee S et al ( ) Embryotropic effect of insulin-like growth factor (IGF)-I and its receptor on development of porcine preimplantation embryos produced by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer. Mol Reprod Dev :. Kim S, Lee S, Kim J et al ( ) Antiapoptotic effect of insulin-like growth factor (IGF)-I and its receptor in porcine preimplantation embryos derived from in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer. Mol Reprod Dev :. Herrler A, Krusche C, Beier H ( ) Insulin and insulin-like growth factor-i promote rabbit blastocyst development and prevent apoptosis. Biol Reprod :. Byrne A, Southgate J, Brison D, Leese H ( ) Regulation of apoptosis in the bovine blastocyst by insulin and the insulin-like growth factor (IGF) super-family. Mol Reprod Dev :. Makarevich A, Markkula M ( ) Apoptosis and cell proliferation potential of bovine embryos stimulated with insulin-like growth factor I during in vitro maturation and culture. Biol Reprod :. Moreira F, Paula-Lopes F, Hansen P et al ( ) Effects of growth hormone and insulin- like growth factor-i on development of in vitro derived bovine embryos. Theriogenology :. Sirisathien S, Hernandez-Fonseca H, Brackett B ( ) Influences of epidermal growth factor and insulin-like growth factor-i on bovine blastocyst development in vitro. Anim Reprod Sci :. Palma G, Muller M, Brem G ( ) Effect of insulin-like growth factor I (IGF-I) at high concentrations on blastocyst development of bovine embryos produced in vitro. J Reprod Fertil :. Block J, Drost M, Monson R et al ( ) Use of insulin-like growth factor-i during embryo culture and treatment of recipients with gonadotropin-releasing hormone to increase pregnancy rates following the transfer of in vitro-produced embryos to heat-stressed, lactating cows. J Anim Sci :. Mitchell M, Swanson R, Hodgen G, Oehninger S ( ) Enhancement of in vitro murine embryo development by recombinant leukemia inhibitory factor. J Soc Gynecol Investig :. Lavranos T, Rathjen P, Seamark R ( ) Trophic effects of myeloid leukaemia inhibitory factor (LIF) on mouse embryos. J Reprod Fertil :. Mezhevikina L, Fedorova V, Kapralova I, Fesenko E ( ) Increased survival of preimplantation mouse embryos in medium with recombinant cytokine LIF. Ontogenez :. Fry R, Batt P, Fairclough R, Parr R ( ) Human leukemia inhibitory factor improves the viability of cultured ovine embryos. Biol Reprod :. Ptak G, Lopes F, Matsukawa K et al ( ) Leukaemia inhibitory factor enhances sheep fertilization in vitro via an influence on the oocyte. Theriogenology : 467

174 . de Moraes A, Hansen P ( ) Granulocyte macrophage colony-stimulating factor promotes development of in vitro produced bovine embryos. Biol Reprod :. Robertson S, Sjoblom C, Jasper M et al ( ) Granulocyte macrophage colonystimulating factor promotes glucose transport and blastomere v iability in mu rine preimp lantation embryos. Biol Reprod :. Papayannis M, Eyheremendy V, Sanjurjo C, Blaquier J, Raffo F ( ) Effect of granulocyte macrophage colony stimulating factor on growth, resistance to freezing and thawing and re-expansion of murine blastocysts. Reprod Biomed Online ( ):. Behr B, Mooney S, Wen Y, Polan M, Wang H ( ) Preliminary experience with low concentration of granulocyte macrophage colony- stimulating factor, a potential regulator in preimplantation mouse embryo development and apoptosis. J Assist Reprod Genet ( ):. Bhatnagar P, Papaioannou V, Biggers J ( ) CSF- and mouse preimplantation development in vitro. Development :. Tamada H, Higashiyama C, Takano H et al ( ) The effects of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor on preimplantation- embryo development and implantation in the rat. Life Sci :. Lim J, Lee D, Song H et al ( ) Heparinbinding epidermal growth factor (HB-EGF) may improve embryonic development and implantation by increasing vitronectin receptor (integrin alphanubeta ) expression in peri-implantation mouse embryos. J Assist Reprod Genet :. Lim K, Jang G, Ko K et al ( ) Improved in vitro bovine embryo development and increased ef fi ciency in producing viable calves using defined media. Theriogenology :. Aflafo E, Sod-Moriah U, Potashnik G, Har-Vardi I ( ) EGF increases expression and activity of Pas in perimplantation rat embryos and their implantation rate. Reprod Biol Endocrinol ( ):. Shi H, Miller F, Miller K, Kim M ( ) The effect of platelet activating factor on different phases of murine in vitro fertilization. J Assist Reprod Genet :. Roudebush W, Duralia D, Butler W ( ) Effect of platelet-activating factor (PAF) on preimplantation mouse B D F /J embryo formation. Am J Reprod Immunol :. Zhou P, Liu D, Cang M et al ( ) TGFalpha and EGFR in ovine preimplantation embryos and effects on development. Anim Reprod Sci :. Taniguchi F, Harada T, Yoshida S et al ( ) Paracrine effects of bfgf and KGF on the process of mouse blastocyst implantation. Mol Reprod Dev :. Dunglison G, Barlow D, Sargent I ( ) Leukaemia inhibitory factor significantly enhances the blastocyst formation rates of human embryos cultured in serum-free medium. Hum Reprod :. Hsieh Y, Tsai H, Chang C, Hsu L, Chang S, Lo H ( ) Prolonged culture of human cryopreserved embryos with recombinant human leukemia inhibitory factor. J Assist Reprod Genet ( ):. Spanos S, Becker D, W inston R, Hardy K ( ) Anti-apoptotic action of insulin-like growth factor- I during human preimplantation embryo development. Biol Reprod ( ):. Sjoblom C, Wikland M, Robertson S ( ) Granulocyte macrophage colony-stimulating factor promotes human blastocyst development in vitro. Hum Reprod :. Martin K, Barlow D, Sargent I ( ) Heparin-binding epidermal growth factor significantly improves human blastocyst development and hatching in serum-free medium. Hum Reprod :. Khamsi F, Armstrong D, Zhang X ( ) Expression of urokinase-type plasminogen activator in human preimplantation embryos. Mol Hum Reprod : 468

175 فصل 42 سیستمهای کشت: سیستم کشت تک مرحلهای محیطهای کشت استفاده شده به منظر حمایت از تکین ریان تا مرحله بالستسیست معمال براساس د دسته متفات فرمالسین شدهاند که شامل محیط کشت یک مرحلهای محیط د مرحلهای میباشند. محیطهای کشت یک مرحلهای م استفاده به منظر کشت ریان فارغ از اینکه با رسیدن به رز 3 محیط کشت تازه با محیط کشت قدیمی تعیض شد یا خیر معمال در آزمایشگاهها به منظر کاهش هزینه سادهسازی امر اجرایی م استفاده قرار میگیرند. در حال حاضر به منظر مقایسه بین استفاده از محیط کشت یک مرحلهای محیط کشت پیدرپی دادههای کلینیکی بسیار کمی جد دا که منجر به عدم تانایی در م تعیین یک سیستم برتر میشد. در این فصل با کمک دادههای بدست آمده از الگهای حیانی انسانی به خالصه نمدن دالیل منطقی در استفاده از محیط کشت یک مرحلهای میپازیم همچنین به بررسی این نکته نیز خاهیم پاخت که آیا تجدید نمدن محیطهای یک مرحلهای در رز 3 کشت ریان میتاند در بد بازده تکین ریانها مثر باشد یا خیر مقدمه در شرایط درنتنی اسیت انسان در ناحیه آمپالی لله فالپ با اسپرم مالقات نمده فرایند لقاح به انجام میرسد ریان تشکیل شده بعد از لقاح در طل لله فالپ در ناحیه ایستمس به طی مسیر میپازد. بعد از پیمدن مسیر در ناحیه 224 ایستمس به ناحیه ارتباط دهنده ایستمس-رحم میرسد در این زمان ریان در مرحله مرال در رز 1 بعد از لقاح قرار دا بعد از رد ریان به رحم فرایند النهگزینی در رز 2 بعد از لقاح در مرحله بالستسیست رخ میدهد )4-3(. تجزیه نمدن ماد حامل انرژی مجد در مایع جمع آری شده از لله فالپ رحم در زنان در مراحل مختلف سیکل جنسی نشان دهنده غلظت- های متفات این حاملهای انرژی در ناحی مختلف دستگاه تلید مثل رحم لله فالپ میباشد )3 1(. مایع مجد در لله فالپ دارای مقادیر به نسبت زیادی از الکتات در مقایسه با غلظت گلکز میباشد )3-0(. مطالعات نشان دادهاند که شرایط مایع رحمی در م این د حامل در مقایسه با لل فالپ کامال متفات میباشد. به گنهای که در مایع مجد در رحم مقادیر گلکز بسیار باالتر از الکتات مجد در آن بده است. همچنین با بررسی نتایج تجزیه شیمیایی مایعات رحم لله فالپ مشخص شده است که این د ناحیه از نظر محتای پیرات مجد در آنها کامال یکسان میباشند. در طل 43 سال گذشته افیش رز افزنی در تمایل به تسعه کشت ریان انسان تا مرحله بالستسیست مشاهده شده است )1( این تغییر ریک منجر به افیش تمایل دقت در تسعه تلید محیطهای کشت گناگن شده است. رند منطقی بهکار گرفته شده در بحث تسعه تکامل محیطهای کشت برنتنی ریان به اسطه د مفهم اساسی تحت تاثیر قرار گرفته است که این د مفهم عبارتند از استفاده از 222 محیط کشت یک مرحلهای در مقابل استفاده از محیط کشت چند مرحلهای یا پیدرپی. در صرت استفاده از محیط کشت یک مرحلهای ریان از بد لقاح تا مرحله بالستسیست در یک نع محیط کشت قرار داده میشد. در چنین کشتهایی د ریک هماره م تجه بدهاست: ریک ال شامل عدم تعیض محیط کشت با محیط کشت تازهتر در رز 3 ریک دم شامل تعیض محیط کشت با محیط کشت تازهتر لی از همان نع ال در رز 3 بعد از لقاح میباشد. این محیطهای کشت یک 223 مرحلهای به اسطه استفاده از ریک بهینهسازی ساده کننده که منجر به تعیین غلظتهای بهینه برای اج محیط کشت شده 221 که البته به کمک رشهای زیست سنجی نیز تعیین تایید شدهاند تلید میشند )9( ( به مقاله مرری Let the embryo choose مراجعه کنید(. با استفاده از محیطهای کشت د مرحلهای ریانها در مراحل ابتدایی شامل تشکیل ریان بعد از لقاح uterotubal junction sequential culture media Simplex optimization approach bioassay 463

176 تا مرحله کلیاژ در یک نع از محیط کشت از رز 3 به بعد ریانها به محیط کشتی با ترکیبات متفات منتقل شده تا رز 3 در همان محیط نگهداری میشند. فلسفه استفاده از محیط کشت د مرحلهای به ماهیت حقیقی فرایند رشد ریان در شرایط درنتنی بازمیگد. همانطر که میدانیم ریانها در رزهای ابتدایی زندگی خد با د محیط کامال متفات از نظر ماد مغذی رحم لله فالپ در تماس هستند )3(. بنابر این به منظر حمایت از تسعه تکین ریانها در د فاز مختلف که شامل مرحله ابتدایی تشکیل تا مرحله کلیاژ مرحله کلیاژ تا مرحله بالستسیست میباشد نیاز به تغییر در اجی محیط کشت در هر یک از مراحل رشد احساس میشد )8-44( )به فلسفه nature back to مراجعه نمایید(. محدده مطالعاتی این فصل پیرامن محیط کشت یک مرحلهای میباشد. در این فصل به کمک دادههای بدست آمده از مدلهای حیانی مدلهای انسانی به بررسی تاریخچه تلید استفاده تکامل محیطهای کشت یک مرحلهای میپازیم. همچنین مقایسهای نیز بین د رش کشت مذکر )محیط کشت پیدر پی محیط کشت یک مرحله ای( انجام خاهیم داد تکامل محیطهای کشت برای کشت ریان در سال Whitten 4832 برای الین بار نشان داد که ریان 9 سللی مش با استفاده از محیط کشت ساده که برپایه سرم نمک فیزیلژی بنا شده بد تانایی تسعه به مرحله بالستسیست را از خد نشان میدهند )42(. 2 سال بعد در سال 4839 McLaren Biggers در یک مقاله برجسته نشان دادند که بالستسیستهای تلید شده به این ترتیب درصرت انتقال به رحم پذیرندهها میتاند منجر به تلد نتاج زنده شد )43(. این دستا بزرگ زمانی حاصل شد که محیطهای کشتی که در گذشته به اسطه محللهای بیلژیکی از جمله سرم مکمل سازی شده بدند با محیطهای کشت شیمیایی تعریف شده جایگزین شد )1(. در پی الین مطالعه انجام شده تسط Whitten بعدها ا بیان نمد که درصرت افزدن الکتات به محیط کشت فرمله شده تسط تیم تحقیقاتیاش امکان تسعه تکین ریان از مرحله 2 سللی به بالستسیست فراهم خاهد شد. اما این محیط کشت تانایی حفظ تسعه ریان از مرحله کلیاژ تا بالستسیست را نداشته است )مفهم تقف تکین در مرحله سللی ) )41(. این مطالعات منجر به افیش احتمال تاثیر مثبت ریزمحیط اختصاصی فراهم شده تسط ایداکت برای رشد رشد تسعه الیه ریان شد. این ایده تسط مطالعات انجام شده از سی, Biggers Gwatkin Bavister به نعی تقیت شد. در حقیقت زمانی که این دانشمندان با کمک کشت بافت لله فالپ نشان دادند که ریانهای مش مراحل ابتدایی رشد مرحله کلیاژ تا مرحله بالستسیت را با مفقیت سپری مینمایند این ادعا به اثبات رسید )43(. در مطالعات بعدی Brinster با کاهش غلظت کلسیم محیط کشت Whittens افزدن پیرات به آن به تلید BMOC2 نایل شد که تانایی حمایت از تکین ریان از مرحله 2 سللی تا مرحله بالستسیست را از خد نشان میداد. بازده تلید بالستسیست با بهره گرفتن از BMOC2 بسیار باالتر از محیطهای کشت هم نسل آن بد )42(. محیط کشت Brinster در مطالعات بعدی تسط whittingham دستخش تغییر شد. محیط کشت M42 شد )40(. هر د محیط کشت بالستسیست در نظر گرفته میشدند درحالی تغییر در محیط کشت BMOC2 تلید محیط کشت CZB شد. سرانجام در سال برطرف شد. این تغییر شامل کاهش در محتای الکتات افیش غلظت پیرات بد که منجر به تلید ) M42 )BMOC2 به عنان پیشرفتهای برجستهای در زمینه تلید برنتنی که هنز تانایی عبر از مرحله تقف 2 سللی را از خد نشان نمیدادند. ایجاد شامل افیش نسبت الکتات به پیرات جایگزینی گلکز EDTA با گلتامین منجر به 4898 مشکل عبر از مرحله تقف 2 سللی به اسطه تلید محیط کشت CZB نتایج این تغییرات نشان داد که شاید گلکز در مراحل ابتدایی رشد ریان به عنان یک عامل ممانعت کننده عمل مینماید. همچنین مشخص شد که حضر یک عامل کیالت کننده به منظر حذف عناصر کمیاب مضر از محیط کشت الزم ضرری میباشد. محیط کشت CZB به ریانهای مش از سیههای مختلف این امکان را میداد که بتانند از مرحله تقف two cell block Microenvironment 471

177 چرخه سللی در گامه 2 سللی به سالمت با مفقیت عبر نمایند )49(. تنها زمانی که ریانها به مرحله مرال رسیده باشند افزدن گلکز میتاند به عنان یک فاکتر مثر در تلید بالستسیست در نظر گرفته شد اجی با اهمیت محیطهای کشت ریان اکثر محیطهای کشت شامل اجی ثابت کلیدی میباشند که ایفاگر نقشهای مهمی در تسعه تکامل ریان هستند. افرادی که از طرفداران استفاده از محیطهای کشت پیدرپی هستند بیان میکنند که برخی از اجی محیطهای کشت در مرحله خاصی از تسعه تکین ریان میتانند به عنان عامل ممانعت کننده از ادامه رند تکامل ریان شند گلکز مطالعات متعدد چه در انسان )22( چه در ریانهای حیاناتی مانند همستر گسفند مش گا ) ( نشان دادهاند که سطح باالی گلکز در محیط کشت ریان میتاند منجر به تاخیر در رند تکامل ریان یا حتی تقف تکین ریان در مرحله کلیاژ شد. کمبد گلکز از مرحله متراکم شدن سللهای ریان به بعد نیز باعث برز اثرات مخرب متعددی خاهد شد. از آن جمله میتان به تکین ناقص ریان در مرحله بالستسیست همچنین از دست دادن قدرت زندهمانی ریان اشاره نمد )0(. با تمام این تفاسیر در یک سیستم کشت ریان که با دقت کنترل برنامهریزی شده بد Biggers McGinnis نشان دادند که استفاده از گلکز حتی در غلظتهای باال نیز نمیتاند منجر به برز اثرات مخرب در رند تکین ریانهای مش شد )23(. این مسئله شاید مربط به حضر دیگر اجی محیط کشت ریان باشد آسیدهای آمینه آمنیم محیطهای کشت ریان حای مقادیر زیادی از اسیدهای آمینه آد میباشند. همانطر که مایع مجد در رحم لله فالپ نیز حای مقادیر زیادی از اسیدهای آمینه آد میباشند )21(. علیرغم میای زیاد اسیدهای آمینه در رند تکین برن- تنی ریانها همچنان نگرانی در م مصرف این ماد در محیطهای کشت جد دا. شاید دلیل این نگرانی تلید آمنیم در اثر متابلیسم این اسیدهای آمینه باشد. یکی از مادی که تجه یژه محقیقن را در باره تلید آمنیم در محیطهای کشت به خد جلب مینماید آمین اسید ناپایداری به نام گلتامین میباشد. استفاده از محیطهای کشتی که حای گلتامین میباشند میتاند منجر به تلید بیش از حد آمنیم در محیط کشت شد. حتی در صرتی که محیط کشت هر 21 ساعت یکبار تعیض شد )23(. Lane Gardner در مطالعاتی نشان دادند که تجمع آمنیم در محیط کشت میتاند منجر به تمایز ناهنجار بالستسیست متابلیسم غیر طبیعی بیان ژن غیر معمل مشکل در تنظیم ph در پی تمام این عاقب نامطلب تغییر در تکامل ریان ریان مش شد )22(. همچنین Orsi Leese دریافتند که در معرض آمنیم بدن ریان منجر به تغییر در متابلیسم اسیدهای آمینه تسط بالستسیست گا در شرایط برنتنی شد )20(. در مطالعهای که تسط Zander همکاران انجام شد مشخص گید که قرار دادن ریانهای مش در معرض آمنیم در مرحله پیش از تراکم چه از مرحله کلیاژ تا مرحله 2 سللی چه از مرحله 2 سللی تا مرحله بالستسیست هیچ گنه تاثیری بر ری تانایی تکین ریان تا رسیدن به مرحله بالستسیست نمیگذا )29(. اما نکته قابل تجه در م این مطالعه کاهش تعداد سللهای بالستسیست همچنین افیش نرخ مرگ 220 برنامهریزی شده در سللهای بالستسیست میباشد. اگرچه با این شرایط نرخ النهگزینی ریان کاهش نمییافت اما تعداد ریانها در اثر کشت ریانها با آمنیم در مراحل قبل از تراکم ریانها کاهش یافته همچنین تکامل ریانها نیز با تاخیر ماجه خاهد شد. این تاخیر در رند تکامل ریانها را میتان به اسطه کاهش طل سر تا ناحیه کفل همچنین کاهش نرخ تکمیل شدن ریان )بلغ( به اثبات رساند. در مقابل مشخص شده است که ریانها در مراحل پیشرفتهتر نسبت به عارض منفی آمنیم مقامتر میباشند )29(. در مطالعهای که تسط Virant-Klun با استفاده از محیطهای کشت پیدرپی به انجام رسیده بد مشخص شد چنانچه ریانهای انسان در مرحله کلیاژ در معرض آمنیم قرار داده شند تانایی خد در رسیدن به مرحله apoptosis 474

178 بالستسیست را از دست خاهند داد )28(. نگرانیهای ذکر شده در م استفاده از گلتامین تلید آمنیم منجر به استفاده از دیپپتیدهای پایدار گلتامین مانند L -alanyl- L -glutamine یا glycyl- L -glutamine شد. استفاده از این دیپپتیدها باعث ممانعت از تلید آمنیم میشد. EDTA اتیلن دی آمید تترا استیک اسید (EDTA) به عنان یک عامل کیالت کننده شناخته میشد. نشان داده شده است که افزدن EDTA به محیط کشت از نظر پیمدن رند تکین ریان از مرحله Zygote تا مرحله کلیاژ میتاند مفید اقع شد ) (. از سی دیگر مشخص شده است که افزدن EDTA در مراحل بعد از تراکم ریان منجر به کاهش تعداد سللهای 228 مجمعه سللی درنی بالستسیست همچنین کاهش تکین ریان بعد از انتقال به رحمهای پذیرندگان خاهد شد )3(. شاید دلیل این کاهش بازده در تلید ریان با استفاده از EDTA در محیط کشت ریانهای بعد از مرحله تراکم به اثر ممانعت کنندگی EDTA ری فعالیت 3 -فسفگلیسرات کیناز در نتیجه ممانعت از اکنشهای گلیکلیتیک شد استفاده از محیطهای کشت تک مرحلهای یکی از محددیتها در تسعه تکامل محیطهای کشت م استفاده در کشت برنتنی ریان انسان به عدم امکان پایهریزی مطالعات تجربی ری ریان انسان مربط میشد. از عامل بازدارنده دیگر در این زمینه میتان عدم امکان مطالعات کنترل کننده ری هر جزء از اجی تشکیل دهنده محیط کشت اشاره نمد. بنابراین بیشتر دادههایی که پایهریزی کننده تکامل تسعه محیطهای کشت برای استفاده در کلینیکها میباشند بر اساس مطالعات انجام گرفته در مدلهای حیانی جمعآری شدهاند. با این جد بر اساس تفات غلظت همچنین نع ماد حامل انرژی در مایع للههای فالپ رحم همچنین نتایج حاصل از مطالعات ری ریانهای جانران Gardner Lane پیشنهاد نمدهاند که به منظر بهینه سازی رشد تکین ریان در شرایط برنتنی استفاده از محیط کشت د مرحلهای الزم به نظر میرسد )32(. به هر صرت شاهد استفاده شده در حمایت از فرضیه استفاده از محیط کشت پیدرپی چندان قابل اعتماد نمیباشد که شاید یکی از دالیل این عدم اعتماد به مشکل در نمنه گیری از مایعات مجد در دستگاه تلید مثل باشد. الزم به ذکر است که نتایج بدست آمده از تجزیه تحلیلهای صرت گرفته ری اجی مایعات مجد در دستگاه تلید مثل ماده )للههای فالپ رحم( از زنان غیر آبستن در مراحل مختلف سیکل جنسی بدست آمده است )3( بنابراین همبستگی نتایج بدست آمده از آنالیز مایعات دستگاه تناسلی با اقعیت مجد زمانی افیش مییابد که این نمنهها در مرحله لتئال بدست آمده باشند که در آن مرحله ریان زنده در دستگاه تناسلی مجد می- باشد. همانطر که تسط Summers )33( Biggers مطرح شده است این اندازه گیریها بسیار متغیر میباشند یک نمای کلی از اجی تشکیل دهنده مایع مجد در دستگاه تلید مثلی را ارایه میدهند. در حقیقت این دادهها بیانگر دقیق اجی تشکیل دهنده ریز محیط پیرامن ریان نمیباشند. محیط کشت برنتنی ریان کامال از اقعیت جاری در شرایط درنتنی فاصله داشته در حقیقت د ترکیب کامال مج میباشند. در شرایط برنتنی ریانها در یک فاز مایع کشت داده میشند که از این لحاظ مشابه با شرایط درنتنی میباشد در شرایط درنتنی ریان به اسطه یک الیه نازک از محیط مایع مجد در دستگاه تناسلی احاطه میشد در نتیجه ارتباط بسیار نزدیکی با بافتهای دستگاه تلید مثلی مادر برقرار مینماید. این ارتباط نزدیک تنگاتنگ به ریان این اجازه را میدهد که نقل انتقال گاز بین بافتهای مادر ریان به آسانی به سرعت برقرار شد همچنین ماد مغذی ماد ید نیز با همین راحتی سرعت بین د سیستم جابهجا میشند. از سی دیگر در شرایط کشت برنتنی ریان در یک فاز مایع قرار گرفته که به سرعت از ماد مغذی تهی شده با همین سرعت نیز از ماد مضر حاصل از متابلیسم ریان اشباع میشد. د نع از رشهای استفاده از محیطهای کشت تک مرحلهای به منظر کشت ریان از ابتدایی- Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Inner cell mass cells 472

179 231 ترین مراحل رشد ریان تا مرحله بالستسیت را میتان تصیه استفاده نمد )31(: 4- کشت تک مرحلهای مختل شده : در 234 این رش محیط کشت در رز 3 بعد از لقاح تجدید میشد )در رز 3 ریانها در مرحله 2 تا 9 سللی قرار دارند(. تجدید محیط کشت امکان باز فراهمی ماد مغذیی که از ابتدای کشت تا رز 3 تسط ریان مصرف شده است را فراهم میآ. در طرف مقابل این تعیض محیط منجر به خارج سازی فاکترهای رشد مفیدی که تسط ریان در محیط کشت تلید شده است 232 میگد. 2- کشت تک مرحلهای یکناخت : محیط کشت استفاده شده به منظر کشت ریان برای تمام مدت 2-3 رز کشت بدن تعیض باقی خاهد ماند. در این نع از محیطهای کشت درصرتی که نیاز به استفاده از گلتامین باشد تصیه اکید این است که از دیپپتید این اسید آمینه استفاده شد. میای بسیار زیادی چه از نظر تئری چه از نظر عملی در زمینه استفاده از محیط کشت یک مرحلهای در فرایند کشت ریان از ابتدای تشکیل آن تا مرحله بالستسیت ذکر شده است. دالیل تئری مطرح شده در این زمینه اشاره به کاهش استرس حاصل از تعیض محیط کشت ریان در رز 3 در معرض قرار گرفتن ریان با ماد ترکیبات جدید باشد. جابهجا نمدن ریان از یک محیط کشت به محیط کشت جدید با ترکیبات متفات منجر به ایجاد استرس اسمزی همچنین تخلیه شدن محیط کشت از تمامی فاکترهای اتکراین پاراکراینی میشد که ریانها در محیط کشت در خالل 3 رز ال کشت تلید نمدهاند. از دالیل عملی تجیه کننده استفاده از محیط کشت یک مرحلهای میتان به مای همچن کاهش مقدار محیط کشت م نیاز در آزمایشگاههای لقاح برنتنی کاهش احتمال برز اشتباه خطا در تهیه نگهداری محیطهای کشت اشاره نمد. به طر کلی میتان بیان نمد که استفاده از کشت د مرحلهای بسیار پر زحمتتر پر هزینهتر از استفاده از کشت یک مرحلهای ریان خاهد بد. مقایسه یژگیهای مختلف محیط کشت یک مرحلهای )تجدید شده یا بدن تجدید نمدن محیط( با محیطهای کشت پی در پی به همراه نقاط قت ضعف آنها در جدل 4-42 نشان داده شده است. جدل مقایسه یژگیهای مختلف محیط کشت یک مرحلهای محیط کشت پیدرپی در حالتهای مختلف محیط کشت چند مرحلهای محیط کشت یک مرحلهای )تجدید محیط کشت یک مرحلهای )تجدید یژگی شنده( نشنده( خیر خیر بله کشت بدن محمت بله بله خیر جایگزینیماد مغذی ضرری حذف شده حذف شده در محیط باقی مانده تجمع ماد سمی زیاد متسط کم استرس محیطی القا شده برای د محیط برای یک محیط تنها برای یک محیط کشت نیاز به کنترل کیفی زیاد متسط کم فشار سختی کار زیاد کم کم هزینه نسبی دادههای حاصل از مدلهای حیانی به دست آمده از محیط کشت یک مرحلهای در مقابل محیط کشت د مرحلهای در مطالعهای که تسط Biggers همکاران صرت گرفته بد به بررسی مقایسهای بین پتانسیل برز تکامل ریانهای مش بعد از کشت ریانها در محیط کشت یک مرحلهای بدن تجدید نمدن محیط کشت )با استفاده از محیط کشت )KSOM AA233 کشت ریانها در همین محیط کشت با در نظر گرفتن تجدید نمدن محیط بعد از گذشت 19 ساعت استفاده از محیط کشت پیدرپی (G4/G2) پاخته بدند )33(. نتایج این مطالعات هیچ گنه تفات معنی داری بین این 3 نع محیط 231 کشت در زمینه نرخ تلید بالستسیست نرخ هچ شدن بالستسیست تعداد سللهای ICM 233 تعداد سللهای ترفکتدرم Interrupted single medium culture renewed Uninterrupted potassium simplex optimized medium supplemented with glucose and amino acids Hatching 479

180 ترفکتدرم را به اثبات نرساند. به عاله هیچ گنه تفات معنی داری در نسبت قع ناهنجاریها در ریانها مشاهده نشده است. Perin همکاران به بررسی تاثیر استفاده از محیط کشت یک مرحلهای ) AA (KSOM با در نظر گرفتن فاصله زمانی 3 رز برای تجدید نمدن محیط کشت در مقابل استفاده از محیط کشت پیدرپی (G4/G2) بر قدرت شرع ادامه رند تکین ریانهای مش از مرحله بعد از لقاح تا بالستسیت پاختند )32(. نتایج این مطالعات نشان داد که نرخ تشکیل بالستسیست نرخ هچ شدن کامل یا نسبی بالستسیستها در رز 3 در گرهی از ریانها که در محیط کشت یک مرحلهای کشت داده شده بدند در مقایسه با گرهی که در محیط کشت پیدرپی کشت داده شدهاند باالتر بده است. نیسندگان مقاله مذکر اینگنه نتیجهگیری نمدهاند که استفاده از محیط کشت KSOM AA که به صرت تجاری مجد میباشد در مقایسه با استفاده از محیط کشت پیدرپی G4/G2 به منظر کشت ریان مش از مرحله 4 سللی تا بالستسیست دارای برتری میباشد مطالعات انجام شده با استفاده از ریانهای انسان در سال Biggers 2112 Racowsky نتایج مطالعاتی را منتشر نمدند که به بررسی بازده استفاده از سیستم کشت یک مرحلهای با در نظر داشتن استفاده از محیط کشت KSOM AA که به عنان محیط پایه در ساخت Global medium در نظر گرفته میشد پاختند )44(. ریانها در این مطالعه با استفاده از محیط کشت KSOM AA به صرت زیر کشت داده میشدند: کشت از رز 4 تا 3 کشت از رز 3 تا 3 کشت از رز 4 تا 3 نتایج این آزمایشها با نتایج استاندا کشت ریان با استفاده از 232 P4 محیط کشت پیدرپی که در آن زمان شامل استفاده از محیط محیط بد مقایسه نمدند. نتایج نشان داد که 239 تعداد سللها نرخ تشکیل بالستسیست در رز 3 رتبه قطعه قطعه شدن در رز 3 بین تمامی گرهها مشابه بدن تغییر بده است. Macklon همکاران 439 ریان انسان را که به صرت تصادفی انتخاب شده بدند را با استفاده از یکی از 3 سیستم کشت ارایه شده در ادامه م آزمن بررسی قرار دادند. این 3 سیستم کشت شامل: 4( کشت در محیط کشت یک مرحلهای ابداعی تسط خدشان medium) (Rotterdam از رز 4 تا 3 بدن تجدید محیط کشت یا تجدید محیط کشت در رز 3 یا CCM 230 2( کشت در محیطهای کشت پیدرپی که به صرت تجاری قابل تهیه میباشد بد. نتایج نشان داد که کیفیت ریانها در رز 3 یا 3 نرخ النهگزینی نرخ آبستنی در بین تمام گرهها مشابه میباشد )30(. Reed همکاران به مقایسه نتایج حاصل از کشت شانه به شانه 983 ریان خاهر/برادر که از 91 سیکل IVF به دست آمده بدند با یکی از رشهای کشت تک مرحله- ای ادامه یابنده )بدن تجدید نمدن محیط( یا کشت تک مرحلهای تجدید شنده در رز medium) 3 (Global در مقابل کشت پیدرپی Sweden) (G3 series sequential media, Vitrolife, Gothenberg, پاختند.)39( Sepulveda همکاران به برسی مقایسهای نرخ تکین ریان انسان )از مرحله 4 سللی تا مرحله بالستسیست( با ریک استفاده از اسیت- های استحصال شده از برنامه اهدا اسیت پاختند. در این مطالعه د سیستم کشت تک مرحلهای تجدید شنده در رز 3 با سیستم کشت پیدرپی م بررسی قیاس قرار گرفت. نرخ تکین 290 ریان کشت شده در سیستم کشت تک مرحلهای تجدید شنده با نرخ تکین 322 ریان کشت شده در سیستم کشت پیدرپی م بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه نشان داد که نرخ تکین ریانها در رز همچنین نرخ النه گزینی به طر معنی داری برای ریانهایی که در محیط کشت تک مرحلهای تجدید شنده کشت داده شده بدند در مقایسه با سیستم کشت پیدرپی باالتر بهتر بده است. نتایج تمامی مطالعات ذکر شده در این قسمت میبایست با طراحی آزمایشهای کامال تصادفی به تایید برسد. به هر ری با استفاده از نتایج مذکر میتان به این جمع بندی رسید که حداقل برتری مشخصی برای سیستم کشت پیدرپی در مقابل کشت تک مرحلهای را نمی- تان متصر بد )31(. Inner cell mass Irvine Scienti fi c, Santa Ana, CA CCM: Vitrolife, Gothenberg, Sweden Fragmentation score 471

181 2-42. محیط کشت تک مرحلهای تجاری شده قابل استفاده اگرچه تعداد زیادی محیط کشت طراحی شده به منظر استفاده در سیستمهای کشت پیدرپی به صرت تجاری در بار مجد قابل تهیه میباشد اما تاکنن فقط 3 محیط کشت به منظر استفاده در سیستم کشت تک مرحلهای در بار تلید عرضه شدهاند )البته تا سال تهیه این کتاب( این محیطها عبارتند از: GM Global 238.SSM 214 اگرچه غلظت اجی تشکیل دهنده این محیطهای کشت ناشناخته است اما همانطر که در جدل 2-42 نشان داده است ترکیبات محیطهای GM 314 SSM بسیار شبیه به محیط کشت Global میباشد که در حقیقت این محیط کشت به نعی تغییر یافته محیط کشت KSOMمیباشد. AA خالصه تکامل محیطهای کشت به منظر ارتقای تانایی آنها در حمایت از تکین ریان از مرحله 4 سللی تا مرحله بالستسیست برپایه د فلسفه بنا نهاده شده است: فلسفه محیط کشت تک مرحلهای که با نام "اجازه دهید ریان انتخاب کند" در مقابل فلسفه استفاده از محیط کشت پیدرپی با نام "بازگشت به طبیعت". مدافعان سیستم کشت تک مرحلهای بر این بار هستند که تعیض محیط کشت منجر به القا استرس به ریانها شده همچنین منجر به از دست دادن فاکترهای رشد تلید شده از ریانها به اسطه تحریکات اتکراین پاراکراین حاصل از ریانهای مجار خاهد شد. از سی دیگر افرادی که اعتقاد به استفاده از سیستمهای کشت پیدرپی دارند این فرض را مطرح میکنند که استفاده از محیط کشت تک مرحلهای می- تاند منجر به تلید تجمع آمنیم در محیط کشت شد که برای ریان مضر میباشد. همچنین این افراد بیان میکنند که در سیستمهای کشت تک مرحلهای اجیی مانند گلکز از ابتدادر دسترس ریان میباشد که از نظر فیزیلژی منطقی به نظر نمی- رسد. تاکنن دادههای مطلق قاطع در تایید یکی از د سیستم م بحث بدست نیامده است اما به دلیل کم هزینهتر بدن سادهتر بدن همچنین عدم نیاز به کنترل کیفی آزمایشگاهها ترجیح در استفاده از محیطهای کشت تک مرحلهای را در دستر کار خد قرار دادهاند. جدل اج محیطهای کشت تک مرحلهای جزییات متشکله Globalمحیط کشت SSMمحیط کشت GMمحیط 314 کشت نمک Sodium chloride Potassium chloride Potassium phosphate Calcium chloride Magnesium sulfate بافر Sodium bicarbonate ماده حامل انرژی Sodium pyruvate Glucose Sodium lactate/lactate Na salt ماده کیالت کننده EDTA (IVF Online, Guelph, ON) (Gynemed, Lenshan, Germany) (Irvine Scienti fi c; Santa Ana, CA) Let the embryo choose Back to nature 475

182 دیپپتید Alanyl-glutamine Glycyl-glutamine phنشانگر Phenol Red آنتی بیتیک Gentamicin اسید آمینه L -Alanine L -Asparagine L -Aspartic acid L -Glutamic acid Glycine L -Proline L -Serine L -Arginine L -Arginine HCl L -Cystine L -Histidine L -Isoleucine L -Leucine L -Lysine L -Lysine HCl 2-2 L -Methionine L -Phenylalanine L -Threonine L -Tryptophan L -Tyrosine L -Valine ماد به منظر انجام کشت ریان انسان با استفاده از سیستم کشت تک مرحلهای باید یکی از محیطهای کشت تک مرحلهای که به صرت تجاری در بار مجد میباشد را انتخاب نمد مطابق با دسترالعملهای استاندا آزمایشگاههای تلید برنتنی ریان آماده استفاده شد آماده سازی محیط کشت 4( محیط کشت تک مرحلهای کشت ریان انسان م استفاده در آزمایشگاه باید انتخاب تعیین شد. این محیطها ممکن است شامل GM 314 Global SSM یا سایر محصالت دیگر باشد. 2( منبع پرتئینی مناسب جهت افزدن به این محیطها باید انتخاب شد به اسطه تکنیکهای استریل ا محیط 211 کشت شند. این منابع تنها منحصر به HSA میتان از HSA نترکیب یا HSA به همراه گلبلینها نیز استفاده نمد. رشها تمامی مراحل را با در نظر گرفتن رشهای استریل انجام دهید Human serum albumin 476

183 4( زمانی که محیط کشت استریل با منبع پرتئینی مناسب آماده شد )یادداشت 4( ظرف کشت براساس ریههای تعریف شده در آزمایشگاه باید آماده سازی شده در انکباتر قرار داده شند. 4 رز قبل از کشت ریانها باید این کار انجام بپذی )یادداشت 2 3(. 2( ریانها باید مطابق ریههای تعریف شده در آزمایشگاه در محیط کشت تک مرحلهای قرار داده شند. این محیط کشت میتاند مربط به لقاح باشد یا اینکه مربط به کشت ریان درپی فرایند ICSI /چک نمدن لقاح )رز 4( باشد )یادداشت 1 3(. 3( ریان ها تا زمان م نظر جهت استفاده مناسب انتقال یا انجماد باید در محیط کشت قرار داشته باشند. محیط کشت را میتان در رز 2 یا رز 3 برای ریانهایی که کلیاژ را طی نمدهاند تعیض نمد. البته بدن تجدید محیط کشت نیز میتان برای تمام 3 رز کشت ریان از همان محیط ابتدایی بدن تغییر استفاده نمد )یادداشت 2( یادداشتها 4( انتخاب منبع پرتئینی تلید کننده آن کامال ابسته به تصمیم آزمایشگاه میباشد. برخی محیطهای کشت ممکن است از ابتدا دارای منبع پرتئینی باشند. غلظت پرتئین نیز کامال ابسته به تصمیم آزمایشگاه بده البته ممکن است براساس نع ریه انتخاب شده در آزمایشگاه این غلظتها دچار تغییر شد. به عنان مثال برخی آزمایشگاهها ممکن است ازبه دلیل نیاز به تلید ریان به منظر انجماد یخگشایی ترجیح در استفاده از غلظتهای باالی پرتئین داشته باشند. 2( نع ظرف کشت حجم ظرف کشت استفاده از رغن معدنی جهت پشاندن قطرات کشت همگی بستگی به ترجیحات آزمایشگاه مربطه دا. 3( تصیه شده است که ظرف کشت را حداقل 9 ساعت قبل از زمان قرار دادن ریانها در ظرف کشت داخل انکباتر با دما شرایط گازی مناسب قرار دهیم البته زمان بیشتر از 42 ساعت برای هم دمایی برقراری تعادل بین محیط کشت مجد در ظرف کشت انکباتر قابل تصیه اکید میباشد. این امر امکان برقراری تعادل از نظر دما ph را فراهم مینماید. 1( اگر محیط جداگانهای برای لقاح استفاده نمیشد همان محیط کشت تک مرحلهای را میتان برای رند IVF م استفاده قرار داد. سپس در رز بعد از لقاح پس از چک نمدن قع آن ریانهای تک سللی را میتان به قطرات جدید یا حتی ظرف جدیدی که از قبل در انکباتر قرار داده شدهاند حای همان محیط کشت تک مرحلهای میباشند منتقل نمد. در م فرایند ICSI میتان بالفاصله بعد از تزریق اسپرم ریانهای فرضی را به محیط کشت تک مرحلهای منتقل نمد. 3( ریانها را میتان به صرت گرهی یا انفرادی م کشت قرار داد. هدف تانایی شناسایی یابی صحیح ریانها بر اساس نیاز آزمایشگاه میباشد. 2( اگر تصمیم به تعیض نمدن محیط کشت در رز 2 یا 3 دارید حتما از قبل از رز جابهجایی محیطهای کشت را در ظرف جدید در انکباتر قرار داده باشید که به تعادل م نظر رسیده باشند. منابع 4. Pauerstein CJ, Eddy CA (4808) The role of the oviduct in reproduction; our knowledge and our ignorance. J Reprod Fertil 33: Diaz S, Ortiz ME, Croxatto HB (4891) Studies on the duration of ovum transport by the human oviduct. III. Time interval between the luteinizing hormone peak and recovery of ova by transcervical fl ushing of the uterus in normal women. Am J Obstet Gynecol 430: Lyons RA, Saridogan E, Djahanbakhch O (2112) The reproductive signi fi cance of human fallopian tube cilia. Hum Reprod Update 42: Biggers JD (4889) Re fl ection of the culture of preimplantation embryo. Int J Dev Biol 12: Gardner DK, Lane M (4882) Alleviation of the 2-cell block a development to the blastocyst of CF 4 mouse embryos: role of amino acids, EDTA and physical parameters. Hum Reprod 44: Leese HJ, Tay JI, Reischl J, Downing SJ (2114) Formation of fallopian tubal fl uid: role of a neglected epithelium. Reproduction 424:

184 0. Lane M, Gardner DK (2110) Embryo culture medium: which is the best? Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 24(4): Biggers JD (2111) Thoughts on embryo culture conditions. Reprod BioMed Online 1(4): Leese HJ (4884) Metabolism of the preimp lantation mammalian embryo. Oxford Rev Reprod Bio l 43: Leese HJ (4889) Human embryo culture: back to nature. J Assist Reprod Gene 43: Biggers JD, Racowsky C (2112) The development of fertilized human ova to the blastocyst stage in KSOM AA medium: is a two-step protocol necessary? Reprod Biomed Online 3(2): Whitten WK (4832) Culture of tubal ova. Nature 400: McLaren A, Biggers JD (4839) Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature 492(1238): Whitten WK (4830) Culture of tubal ova. Nature 408: Biggers JD, Gwatkin RB, Brinster RL (4822) Development of mouse embryos in organ cultures of fallopian tubes on a chemically de fi ned medium. Nature 481: Brinster RL (4802) Cultivation of the mammalian embryo. In: Rothblat G, Cristofalo V (eds) Growth, nutrition and metabolism of cells in culture Academic, New York 40. Whittingham DG (4804) Culture of mouse ova. J Reprod Fertil 41: Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD, Lewis JL, Torres I (4898) An improved culture medium supports development of Randombred 4-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil 92: Schini SA, Bavister BD (4899) Two-cell block to development of cultured hamster embryos is caused by phosphate and glucose. Biol Reprod 38: Thompson JG, Simpson AC, Pugh PA, Tervit HR (4882) Requirement for glucose during in vitro culture of sheep preimplantation embryos. Mol Reprod Dev 34: Takahashi Y, First NL (4882) In vitro development of bovine one-cell embryos: influence of glucose, lactate, pyruvate, amino acids and vitamins. Theriogenology 30: Quinn P (4883) Enhanced results in mouse and human embryo culture using a modified human tubal fl uid medium lacking glucose and phosphate. J Assist Reprod Genet 42: Biggers JD, McGinnis L (2114) Evidence that glucose is not always an inhibitor of mouse preimplantation development in vitro. Hum Reprod 42(4): Miller JF, Schulz GA (4890) Amino acid content of preimplantation rabbit embryos and fluids of the reproductive tract. Biol Reprod 32: Gardner DK, Lane M (4883) Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture. Biol Reprod 19: Lane M, Gardner DK (2113) Ammonium induces aberrant blastocyst differentiation, metabolism, ph regulation, gene expression and subsequently alters fetal development in the mouse. Biol Reprod 28(1): Orsi NM, Leese HJ (2111) Ammonium exposure and pyruvate affect the amino acid metabolis m of bovine blastocysts in vitro. Reproduction 420(4): Zander DL, Thompson JG, Lane M (2112)Perturbations in mouse embryo development and viability caused by ammonium are more severe after exposure at the cleavage stages. Biol Reprod 01(2): Virant-Klun I, Tomazevic T, Vrtacnik-Bokal E, Vogler A, Krsnik M, Meden-Vrtovec H (2112) Increased ammonium in culture medium reduces the development of human embryos to the blastocyst stage. Fertil Steril 93: Erbach GT, Bhatnagar P, Baltz JM, Biggers JD (4883) Zinc is a possible toxic contaminant of silicone oil in microdrop cultures of preimplantation mouse embryos. Hum Reprod 41: Nasr-Esfahani MH (4882) Effects of glucose, glutamine, ethylenediaminetetraacetic acid and oxygen tension on the concentration of reactive oxygen species and on development of the mouse preimplantation embryo in vitro. J Reprod Fertil 82: Gardner DK, Lane M, Schoolcraft WB (2112) Physiology and culture of the human blastocyst. J Reprod Immunol 33(4 2):

185 33. Summers MC, Biggers JD (2113) Chemically defined media and the culture of mammalian preimplantation embryos: historical perspective and current issues. Hum Reprod Update 8(2): Biggers JD, Summers MC (2119) Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril 81(3): Biggers JD, McGinnis LK, Lawitts JA (2113) One-step versus two-step culture of mouse preimplantation embryos: is there a difference? Hum Reprod 21(42): Perin PM, Maluf M, Nicolosi Foltran Januário DA, Nascimento Saldiva PH (2119) Comparison of the efficacy of two commercially available media for culturing one-cell embryos in the in vitro fertilization mouse model. Fertil Steril 81: Macklon NS, Pieters MH, Hassan MA, Jeucken PH, Eijkemans MJ, Fauser BC (2112) A prospective randomized comparison of sequential versus monoculture systems for in-vitro human blastocyst development. Hum Reprod 40(41): Reed ML, Hamic A, Thompson DJ, Caperton CL (2118) Continuous uninterrupted single medium culture without mediu m renewal versus sequential media culture: a sibling emb ryo study. Fertil Steril 82(3): Sepulveda S, Garcia J, Arriaga E, Diaz J, Noriega-Portella L, Noriega-Hoces L (2118) In vitro development and pregnancy outcomes for human embryos cultured in either a single medium or in a sequential media system. Ferti Steril 84:

186 فصل 43 سیستمهای کشت: سیستم کشت پیدرپی تکنیکهای م استفاده به منظر کشت ریان انسان در مراحل الیه رشد تکامل از رشهایی که برای کشت ریان مش پایهریزی شده بد مشتق شده است. معمال رشهای ابتدایی شامل کشت ریان در محیط کشت تک مرحلهای به کمک قطرههای ایجاد شده از این محیط در ظرف کشت انکبه نمدن آنها برای مدت 2 تا 3 رز قبل از انتقال ریانها به رحم تشکیل میشد. سپس به تدریج کشت ریان برای تمام مدت دره پیش از النهگزینی )کشت به مدت 3 تا 2 رز تا رسیدن به مرحله بالستسیست( م تجه قرار گرفت. بحث گفت گ مجد در این میان تعیین بهترین سیستم کشت جهت کشت ریان در طل 3 تا 2 رز م نظر میباشد. آیا بهتر است سیستم کشت پیدرپی با تجه به نیازهای متغیر فیزیلژی متابلیک ریان از مرحله 4 سللی تا مرحله بالستسیست م تجه قرار بگی یا سیستم کشت تک مرحلهای م استفاده اقع شد در این فصل میا مضرات هر یک از این د سیستم م بحث خاهد بد مقدمه کشت ریان در محیطی که به نعی بازتاب کننده شرایط درنتنی مجد در ایداکت باشد مفهمی منطقی امکانپذیر به نظر میرسد. این مفهم به فرضیهای به عنان بازگشت به طبیعت مرتبط میباشد که در مقابل فرضیه دیگری قرار دا با 213 عنان "اجازه دهید ریان انتخاب کند" محققان معتقد به این فرضیه بیان میکنند که محیط کشت ریان باید تمام ماد مغذی شناخته شده مفید برای کشت سللهای پستانداران را داشته باشد تا امکان بهره باری استفاده از این منبع غنی برای ریان با تجه به نیازهای متغیر آن در رزهای آغازین زندگی فراهم باشد )4 2(. محر اصلی فرضیه دم با تجه به نیازهای بسیار متغیر ریان به اسیدهای آمینه بنا نهاده شده است. در ابتدای مسیر پیشرفت رشهای کمکی تلید مثل در انسان در دهه 4891 با در نظر داشتن تعداد کیفیت ریانها در هر زمانی بین رزهای 4 تا 3 بعد از لقاح ریانها به رحم منتقل میشدند )3(. در ااخر دهه 4881 کشت ریان در شرایط برنتنی به 3 تا 2 رز افیش یافت )1( تیم تحقیقاتی Gardner نیاز به یک محیط کشت اختصاصی برای ریانهای بین رزهای 3 تا 3 را بیان تبیین نمد. نیاز به تسعه چنین محیط کشتی به منظر فراهم آن احتیاجات اختصاصی ریان در این دره حساس زمانی )رز 3 تا 3( احساس شده بد. تصمیم گیری برای ادامه دادن کشت ریان تا رز 3 تا 2 بعد از لقاح نیز بسته به تعداد کیفیت ریانها در رز 3 بعد از لقاح میباشد. چنانچه تصمیم به ادامه رند کشت برای 3 تا 2 رز باشد در رز 3 ریانها از محیط کشت ابتدایی به محیط کشت ثانیه که کمی پیچیدهتر از محیط کشت ال میباشد منتقل شده تا رز 2 در آن محیط نگهداری میشند. محیطهای کشت چند مرحلهای معمال برای 3 مرحله: لقاح کلیاژ بالستسیست فرمله میشند. در حقیقت این محیطهای کشت با ریک استفاده از محیطهای کشت تجاری به عنان پایه تلید فرمله میشند )3(. محیط کشت کلیاژ بالستسیست که برای فاز ال دم تکین ریان استفاده میشند با نام D4-D3 D3-D3 به ترتیب شناخته میشند. این تغییر در محیط کشت در رز 3 در انسان به دلیل ایجاد تغییرات زیادی است که در ریان انسان در این زمان به قع میپیندد. این تغییرات با رند متراکم شدن سللها فعال شدن 212 ژن ریان رخ میدهد. فرایند متراکم شدن به اسطه ایجاد اتصاالت محکم بین غشای پالسمایی بالستمرهای الیه 210 محیطی آغاز می شد منجر به برقراری پیند محکمی بین این الیه از بالستمرها شده باعث ایجاد ظاهری مسطح در الیه بیرنی بالستمرها میشد. این مسطح شدن ظاهری منجر به ایجاد نمایی تیره تار برای هر بالستمر میشد در نهایت مجمعه سللهای بالستمر به شکل تت درآمده به همین دلیل ریان در رز 3 را با نام مرال میشناسیم. ینهای کلسیم Let the embryo choose Tight junction Peripheral 481

187 منیزیم به عنان اجی ضرری در ایجاد فرایند متراکم شدن بالستمرها شناخته میشند در غیاب آنها اتصاالت محکم تشکیل نمیشند. بنابراین به منظر انجام نمنهگیری از بالستمرها در رز 3 بعد از لقاح میبایست از محیطهای کشت فاقد کلسیم منیزیم استفاده شد تا نمنه گیری از بالستمرها به منظر انجام آزمایشهای ژنتیکی امکانپذیر شد در غیر این صرت به دلیل قع فرایند متراکم شدن امکان نمنه گیری از بالستمرها جد ندا )2(. عاله بر این انجام ریه متراکم شدن به عنان یک پیشنیاز اساسی برای آغاز رندهای تکینی پیآیند ریان رسیدن آن به مرحله بالستسیست شناخته می- شد. دلیل این امر را میتان به نقش اتصاالت محکم ایجاد شده در الیه بیرنی بالستمرها مرتبط ساخت. این اتصاالت باعث 219 تشکیل حفره بالستکل میشند که به طر کامل محتای مایع محافظت کننده ICM است. برقراری این اتصاالت محکم به عنان یک سد مقام در برابر نشت این مایع به سمت محیط پیرامن ریان عمل میکند. بالستمرهایی که به این شیه به طر محکم در کنار هم قرار گرفتهاند حفره بالستکل را در برگرفتهاند با نام ترفکتدرم شناخته میشند به عنان یک الیه اپیتلیم حمل نقل کننده اعمال ظیفه نمده که امکان کنترل بیشتر در تنظیم نقل انتقال ملکلها به داخل خارج حفره بالستکل در نهایت به داخل بالستمرها را فراهم مینماید. این ظیفه کنترل نقل انتقال ماد برای تنظیم ph داخل سلل- های ریان بسیار مهم میباشد. پیش از مرحله متراکم شدن افیش کمی در ph باعث افیش در فعالیت آنزیم فسففرکتکیناز (PFK) میشد که نقشی کلیدی در تنظیم متابلیسم ریان برعهده دا )0( این افیش فعالیت آنزیم PFK باعث افیش فعالیت گلیکلیتیک میشد که تا قبل از این )پیش از متراکم شدن بالستمرها( تاثیری منفی ری ریان پیش از النه گزینی داشته است. همانطر که پیش از این هم ذکر شده است تغییر عمده دیگری که در نزدیکی رز 3 زندگی ریان انسان رخ میدهد یکی از دالیل اعمال تغییرات در محیط کشت میباشد فعال شدن ژنم ریان انسان در این رز است )9(. به نظر میرسد که این ریداد مرتبط با تغییرات شدید در فعالیت متابلیکی ریان میباشد. برخی از این تغییرات را میتان با بررسی باشت منابع انرژی تسط ریان از محیط کشت مانند الکتات پیرات گلکز اسیدهای آمینه اسیدهای چرب پرینها پیریمیدینها که برای افیش زیاد در محتای DNA هسته ای میتکندریایی RNA سیتپالسمی به اثبات رساند )0 8(. هنز نیاز به تحقیق بررسی جهت تعیین اینکه از کدام یک از تکنیکهای کشت ریان )کشت یک مرحلهای در مقابل کشت چند مرحلهای( استفاده کنیم احساس میشد. شاهد مجد به نعی تایید کننده هر د سیستم میباشد )41(. فارغ از نع محیط کشتی که م استفاده قرار میگی همانطر که در ادامه مشاهده خاهید نمد همچنان ممکن است بین نیازهای ریان در مراحل مختلف زندگی پیش از النه گزینی تفاتهایی جد داشته باشد که نیاز به تعدیل در مقدار ph یکی از این ما است اجی محیطهای کشت پیدرپی تقابل آنها با ریانها مضع "اج تشکیل دهنده محیطهای کشت پیدرپی" بارها م مطالعه قرار گرفته است )3(. به عنان یک تضیح مختصر میتان بیان نمد که بیشتر اجی مجد در محیطهای کشت مادی هستند که در بدن یافت میشند. این ماد شامل نمکها حاملهای انرژی میباشند که در ادامه به بحث بررسی آنها میپازیم. جالب تجه این که بسیاری از اجی اختصاصی مایع مجد در دستگاه تلیدمثلی جنس ماده به محیطهای کشت شناخته شده ریان افزده نمیشند برای مثال میتان به ایداکتین 4 انسانی یا فتپرتیین آلفا انسانی )44( اشاره نمد که در تقسیمات سللی دخیل میباشند )42(. درمقابل برخی ماد به محیطهای کشت افزده میشند که هرگز در بدن مجدات زنده یافت نمیشند از جمله این ماد می- تان به EDTA اشاره نمد. بیان نمدن این نکته بسیار حایز اهمیت میباشد زیرا بسیاری از محققین در پیری از فرضیه "بازگشت به طبیعت" سعی در شناسایی افزدن اجی متشکله مایعات مجد در دستگاه تلید مثلی ماده در زمان پیش از النه گزینی ریان را داشته دارند. همچنین الزم به یادآری میباشد که افزدن بسیاری از ماد )مانند اسیدهای آمینه( به محیطهای کشت ریان اجباری نمیباشد افزدن آنها به محیطهای کشت تنها منجر به ارتقای بازده تلید ریان افیش شانس زنده Blastocole Human oviductin-i Human alpha-fetoprotein 484

188 مانی آنها خاهد شد )43(. همچنین حضر بسیاری از مادی که در دستگاه تلید مثل ماده جد نداشته لی به محیطهای کشت افزده میشند نیز در جهت ارتقا بازده تلید ریان میباشد نبد آنها نمیتاند منجر به شکست قطعی تلیدات برنتنی ریان شد بلکه بازده آن را کاهش میدهد )43(. نکتهای که باید هماره در ذهن داشت این است که افزدن هر مادهای که منجر به کاهش استرس ا شده به ریان در شرایط برنتنی در نتیجه منجر به حفظ همستاز سللی شد میتاند منجر به برز اثرات مفید در تلیدات برنتنی ریان باشد )0( ینهای معدنی تقریبا تمامی محیطهای کشت تلید شده تا کنن از استراتژی تعریف شده تسط Whitten )41 Brinster 43( پیری نمده دارای ترکیبات ینی مشابه با ترکیبات محلل Krebs-Ringer میباشند )42(. ترکیب ینی مجد در مایعات ایداکت رحم جزء الین فاکترهایی بد که در این مایعات م سنجش ارزیابی قرار گرفت اطالعات حاصل از آن به منظر فرمله نمدن بسیاری از محیطهای کشت الیه ریان انسان )40( حیانات اهلی )49( م استفاده قرار گرفت. تفسیر اج ترکیب ینی مجد در مایعات دستگاه تلید مثلی جنس ماده هماره مشکل بده است. تجزیه مایع ایداکت به اسطه اسپکترمتری با اشعه ایکس با به کار گیری تحریک پراب الکترنی )48( در مقایسه با دیگر مطالعات نشان داد که غلظتهای باالیی از پتاسیم در این مایعات مجد میباشد. همچنین مشخص شد که غلظتهای فسفات نیز در این مایعات بسیار باال می- باشد. نتایج مذکر به این ترتیب تفسیر شد که این تفات در غلظت پتاسیم فسفات شاید به دلیل تفات در انتخاب بیماران رش استفاده شده در نمنه گیری باشد. متاسفانه تحقیقات بیشتری در این زمینه به منظر شناسایی ماد ینی مجد در مایعات دستگاه تلید مثلی جنس ماده صرت نگرفته است تا بتانیم به اقع مین یهای مهمی همانند پتاسیم فسفات کلسیم منیزیم را که در فرایندهای متابلیک تعیض کاتینی دخیل میباشند )21 40( را تضیح تفسیر نماییم. تغییر دادن ترکیب ینی محیطهای کشت در فاز ( 4 رز 4 تا 3( فاز 2 رز )3 تا 3( کشت ریان به اسطه استفاده از محیطهای کشت پیدرپی امری غیر الزم به نظر میرسد زیرا ترکیب ینی مجد در مایعات دستگاه تلید مثلی ریان به نعی منعکس کننده همان ترکیب ینی مجد در خن سرخرگی که للههای فالپ را تغذیه میکنند میباشد که در تمام دره پیش از النه گزینی ترکیبی ثابت را از خد نشان میدهد. هنز جنبههای زیادی از ترکیب ینی محیطهای کشت ریان باید م بررسی تحقیق قرار بگی تا اینکه بتانیم محیطهای کشت با عملک بهینه افیش در بازده تلید ریان را فرمله نماییم. تاثیر تغییرات اعمال شده در اجی ینی محیطهای کشت در مطالعات )0 Lance Bavister Gardner 21( م ارزیابی قرار گرفته است. برخی از جنبه- های مطالعاتی ذکر شده در ادامه بحث میشد ین فسفات نشان داده شده است که استفاده از مقادیر زیاد ین فسفات میتاند منجر به ایجاد اثرات منفی در رند متابلیک ریان شد. ین فسفات با فسفریله نمدن گلکز منجر به افیش گلیکلیز شده در اثر این افیش در رند گلیکلیز میتاند منجر به کاهش اکسیداسین در نهایت کاهش تلید انرژی شد. به این تاثیر ین فسفات اثر Crabtree میگیند )1(. نبدن ین فسفات یا استفاده از مقادیر کم ین فسفات در محیط های کشت ریان نه تنها هیچ تاثیر منفی بر تسعه تکین ریان ندا بلکه منجر به افیش بازده تلید ریان نیز خاهد شد )24 22(. ریان در مراحل پیش از النه گزینی در رزهای ابتدایی بعد ازلقاح دارای مقادیر زیادی ATPمیباشد که میتاند به عنان یک منبع درندی ین فسفات عمل نماید )23(. نسبت باالی ATP به ADP در ریان پیش از النه گزینی )21( به اسطه مهار آلستریک آنزیم PFK که آنزیم تعیین کننده در سرعت مین قع جریان گلیکلیز میباشد )0( میتاند منجر به کاهش جریان گلیکلیتیک در ریان شد. مصرف گلکز در رز 3 بعد از لقاح ریان انسان بعد از قع مرحله تراکم افیش مییابد )1(. در این هنگام است که نسبت ATP به ADP کاهش یافته در نتیجه این کاهش محتای ین فسفات در محیط کشت باید افیش یابد تا از متابلیسم بهینه این ماده اطمینان حاصل شد. 482

189 نسب سدیم به پتاسیم نسبت کلسیم به منیزیم در مطالعهای که منجر به تلید محیط کشت HTF 234 شد )40( مشخص شد که مقدارسدیم 1 برابر کمتر از مقدار پتاسیم مجد در HTF در مقایسه با محیط کنترل T2 است. نکته جالب تجه نسبت بسیار پایین ریانهایی بد که با استفاده از محیط کشت T2 در مقایسه با محیط کشت HTF به مرحله بالستسیست رسیده بدند. همچنین نرخ آبستنی کلینیکی نیز به اسطه استفاده از محیط کشت HTF بسیار باالتر از این نرخ برای محیط کشت T2 بد. دیگر محیطهای کشتی که در آن زمان به منظر کشت ریانهای انسان م استفاده قرار میگرفت از جمله Ham s F41 محیط کشت Hoppe )23( Pitts دارای نسبت سدیم به پتاسیم مشابه با محیط کشت HTF بدند. مقدار باالی پتاسیم در مایع لله فالپ انسان )48( همانطر که پیشتر از این تضیح داده شد شاید به دلیل نع بیماران انتخاب شده رش نمنه گیری از آنها بده است که تانسته ری ترکیب مایع لله فالپ مثر اقع شد )22(. Biggers )22( همچنین بیان نمد که نمنه گیری از مایع ایداکت بسیار سخت پیچیده بده نتایج بیشتر تجزیه تحلیلها سال برانگیز میباشد. نتیجه کلی که تاکنن به دست آمده است نشان دهنده این نکته است که بیشتر محیطهای کشت با یک بازده کار میکنند. باید در نظر داشت که آزمایشهای تصادفی دقیقی به منظر مقایسه محیط های کشت باید طراحی اجرا شد تا بتانیم نتیجه دقیق مناسب را در این خصص به دست آریم. مطالعه انجام شده تسط )0 Lane 20( با ریک تمرکز ری نسبت کلسیم به منیزیم با استفاده از ریانهای همستر نشان داد که داخل سلل- های ریان یک تاثیر متقابل تاثیر گذار مهم بین ph ینهای کلسیم منیزیم جد دا. کلسیم به عنان یک تنظیمگر عممی در تمام سللها شناخته میشد تغییرات غیر طبیعی در غلظتهای آن میتاند منجر به تغییر در ساخت پرتئینها تنظیم DNA عملک میتکندری مانند متابلیسم اکسیداتی ارتباطات بین سللی شد. به طر معمل سطح کلسیم داخل 232 سللی به اسطه ذخیرهسازی آن در شبکه اندپالسمیک میتکندری هسته یا به اسطه انتقال آن از غشای سللی یا به اسطه انتقال از کانالهای کلسیمی ابسته به لیگاند تنظیم میشد. تمام این مسیرهای یژه تنظیم کننده ین کلسیم فرایندهای انرژی خاه هستند به اسطه دستکاریهای نامناسب ریان برهم خن نظم متابلیکی آن میتانند دچار نقصان شده 233 منجر به عملک سللی نامناسب ریان شند )0(. جریان ربه داخل کلسیم از کانالهای کلسیمی به اسطه افیش غلظت منیزیم در محیطهای کشت کاهش مییابد در نتیجه تا به امرز این ریک به عنان رشی جهت کاهش باشت کلسیم از منبع خارج سللی )محیط کشت( در ساخت محیطهای کشت ریان م استفاده قرار گرفته است. همچنین این ریک منجر به بد بازده تسعه تکین ریانهای همستر در شرایط برنتنی شده است )20(. به عاله مشخص شده است که منیزیم نقش 231 بسیار مهمی در متابلیسم انرژی ایفا مینماید )0(. به هر ری باید به خاطر داشت که افیش نیزهای کلسیم در اسپرم به اسطه آد شدن +2 Ca در خالل اتصال به غشای اسیت )29( رخ میدهد بنابراین میبایست از غلظتهای پایینتر منیزیم در محیطهای لقاح استفاده شد. به منظر ماجه با این نیازهای متضاد در ریه لقاح برنتنی کشت ریان پیشنهاد میشد که غلظتهای پایینتری از منیزیم )1/2 میلی مل( را در محیطهای فرمله شده به منظر انجام لقاح برنتنی در نظر گرفت غلظتهای باالتری از منیزیم )باالتر از 1/2 میلیمل ) را در محیطهای کشت ریان منظر نمد. جزء ینی دیگر که در محیط- های کشت مجد است سدیم بیکربنات میباشد. این مضع در ادامه م بحث قرار خاهد گرفت ماد حامل انرژی این مضع جز الین مضعاتی بد که در ارتباط با تکین ریان پیش از النه گزینی م تجه قرار گرفت محققین به طر سیع به مرر این مضع پاختند )3-3 28(. 22 تقریبا تمام محیطهای کشت استفاده شده در آزمایشگاههای Human Tubal Fluid Endoplasmic reticulum influx Calcium spike 489

190 حای سهگانه پیرات الکتات گلکز در غلظتهای مشابه با غلظتهای اندازهگیری شده در مایعات دستگاه تلید مثلی انسان )31( میباشند. همچنین باید در نظر داشت که تمام 21 اسید آمینه شناخته شده میتانند برز دهنده اثرات متقابل با ART 233 ماد مشتق شده از ناقلین انرژی 3 گانه ذکر شده باشند چه به طر مستقیم چه غیر مستقیم به اسطه تبدیل شدن به پیرات استیل کآنزیم A یا استاستیل کآنزیم A به ماد حد اسط مجد در چرخه کربس تبدیل شند )34(. بهعاله نشان داده شده است که به منظر کشت ریان 4 سللی همستر تا مرحله مرال/بالستسیست برخی آمین اسیدهای مشخص میتانند جایگزین مناسبی برای پیرات محسب شند )32(. نقشهای دیگر اسیدهای آمینه در کشت برنتنی ریان به تفصیل در قسمتهای بعدی کتاب م بحث بررسی قرار خاهد گرفت گلکز مطالعه انجام شده تسط )31( Gardner بیان مینماید که به مات عبر ریان از منطقه آمپال ایداکت به سمت رحم ریان در معرض غلظتهای ربه کاهش الکتات پیرات قرار میگی در مقابل غلظت گلکز در این رند هماره ربه افیش میباشد. این الگی تغییرات در محتای مایعات سراسر دستگاه تلید مثلی ماده به نعی بازتاب کننده تغییرات در فعالیت متابلیک ریان در دره پیش از النه گزینی میباشد. بیشتر این مطالعات متابلیکی با استفاده از ریانهای مش به انجام رسیده است به شرایط مشابه در انسان تعمیم داده شده است اگرچه مطالعات زیادی نیز با ریک استفاده از ریان انسان این یافتهها را تایید نمده است. به طر خالصه میتان بیان نمد که ریان در مرحله پیش از النه گزینی حای مقادیر زیادی از آنزیمهای گلیکلیتیک می باشد درصرت فراهم شدن شرایطی یژه از جمله فر گلکز فسفات رند گلیکلیز سرعت یافته )تبدیل گلکر به الکتات( که این افیش در رند گلیکلیز میتاند منجر به برز آسیب به متابلیسم اکسیداتی شد. این رخ داد با عنان اثر Crabtree شناخته شده میتاند منجر به تقف تکین ریان یا کاهش نرخ مفقیت تکین ریان برخی سیههای مش به مرحله بالستسیست شد )1(. به اسطه رشهای متفاتی میتانیم از برز این پدیده جلگیری به عمل آریم. یکی از این رش ها شامل کاهش یا حذف فسفات به طر کلی از محیط کشت مربط به مرحله کلیاژ میباشد. ریک دیگر در این راستا شامل افزدن اسیدهای آمینه به محیطهای کشت میباشد. رش سم با افزدن EDTA به محیط کشت مرحله کلیاژ به انجام 232 میرسد. این ماده به اسطه به دام انداختن منیزیم داخل سللی که کفاکتر الزم برای کینازهای متابلیکی مجد در مسیر Embden-Meyerhof میباشد باعث ممانعت از انجام فرایند گلیکلیز میشد )0 33(. افزدن EDTA آمین اسیدها به محیط کشت ریانهای مش سیه GF4 که در مرحله 2 سللی تقف تکین را از خد نشان میدهند منجر به افیش نسبت ATP به ADP در مرحله 2 سللی شده که معادل همین نسبت در ریانهای 2 سللی حاصل از سیه F4 که تقف تکین در مرحله د سللی را برز نمیدهند میباشد. همچنین Gardner )33( Lane نشان دادند که حضر EDTA اسیدهای آمینه حتی در شرایطی که غلظت های باالیی از گلکز فسفات در دسترس ریان باشد تانایی غلبه بر تقف تکین ریان در مرحله 2 سللی را دارا میباشند. بعد از مرحله متراکم شدن ریان گلیکلیز به عنان مهمترین عمدهترین مسیر تلید انرژی قلمداد می- شد بنابراین میبایست EDTA را از محیط کشت حذف نمد غلظت گلکز را افیش داد. این تغییر در متابلیسم ریان که 230 همزمان با تسعه تکین آن به مرحله بالستسیت رخ میدهد مرتبط با شرایط بیهازی )کمبد اکسیژن ) است که در رحم )31( برقرار میشد باعث آغاز محدد شدن فراهمی انرژی از مسیر فسفریالسین اکسیداتی میشد. الزم به ذکر است که شک تیدهایی در م حذف EDTA از محیطهای کشت مربط به مرحله بعد از متراکم شدن ریان مطرح شده است. یافتههای مطالعات Biggers همکاران )33( نشان داد که کاهش غلظت EDTA از 1/4 میلیمل که تسط Gardner )33( Lane در مطالعات ابتدایی انجام شده بد به 1/14 میلیمل منجر به برز اثرات منفی در ادامه رند رشد تکین ریان مش بعد از مرحله 9 سللی نشده است. این فراسنجهها با یافتههایی که Biggers همکاران )33( به اسطه استفاده از محیط Assisted Reproductive Technique Chelating Anoxia 481

191 کشت G2 که تسط Gardner Lane برای کشت ریان بعد از مرحله متراکم شدن استفاده شده بد تفاتی نداشت بنابراین تمایل کلی به سی حذف EDTA از محیطهای کشت پیدرپی که م استفاده در مرحله بعد از متراکم شدن ریان قرار خاهد گرفت میباشد پیرات به طر کلی میتان بیان نمد که پیرات به عنان مهمترین منبع انرژی برای ریانها در مرحله کلیاژ قلمداد شده درحالی این نقش را در مرحله بعداز متراکم شدن ریان گلکز برعهده دا. در مطالعاتی که اخیرا تسط Gardner همکاران )32( به انجام رسیده است مشخص شده است که باشت نمدن گلکز تسط ریان انسان در رزهای 1 3 بعد از لقاح به طر مستقیم مرتبط با افیش نرخ النه گزینی تلید زنده نتاج میباشد. مشخص شده است که افیش باشت گلکز کاهش رند گلیکلیز به عنان فراسنجههای مهم دخیل در این رند میباشند )32 30( الکتات الکتات برای رشد تکین ریان در مرحله کلیاژ مهم میباشد. در ارتباط با الکتات در محیطهای کشت استفاده شده 239 در ART باید ذکر ک که سدیم-الکتات به عنان منبع الیه اضافه شده در محیط کشت به منظر تامین الکتات در نظر گرفته میشد. اگرچه ایزمر ال-الکتات ایزمری است که از نظر متابلیکی م استفاده قرار میگی ه ایزمر دی- ال- -الکتات میتاند به طر مثر منجر به کاهش phi در الکتات میتانند ph را تحت تاثیر قرار داده فقط 3 میلی مل دی-لا سللهای ریان مش به مین 1/43 احد ph شد )39(. بنابراین امرزه برخی محیطهای کشت تجاری فقط حای ال- الکتات می باشند بنابراین این ایزمر منجر به فراهم نمدن فرم فعال بیلژیک الکتات شده از طریق حذف دی-الکتات منجر به جلگیری از افیش زیادتر از حد الکتات میشد. پیشنهاد شده است که محیطهای کشت استفاده شده در ART که حای الکتات میباشند منجر به فراهم شدن نسبت مناسبی برای الکتات/پیرات داخل سللی میشند که این نسبت در تعادل با نسبت NAD + /NADH داخل سللی میباشد )28( اسیدهای آمینه نقشهای بسیار زیاد متنعی برای اسیدهای آمینه در فرایند تکین ریان در رزهای آغازین رشد تعریف شده است 238 دامنه نقشهای تعریف شده شامل ریههای زیستساختی منبع تامین کننده انرژی همچنین ایفا نمدن نقش به عنان اسملیت تا بافر ph داخل سللی آنتی اکسیدانت کیالت کننده تنظیم کننده تمایز میباشد )43(. اسیدهای آمینه آد در مایعات مجد در دستگاه تناسلی ماده حضر دارند )38( بنابراین منطقی به نظر میرسد که این ماد را در محیطهای کشت ریان اضافه نمد. در آغاز استفاده از تکنیکهای نین تلید مثلی در انسان یکی از محیطهای کشت استفاده شده تسط Edwards )11( Stepto محیط Ham s F41 بد که شامل دامنه سیعی از اسیدهای آمینه میشد. به هرحال در دهه 4891 محیطهای کشت ساده شامل Tyrode s T2 HTF که فاقد اسیدهای آمینه بدند بسیار مشهر شده م تجه قرار گرفته بدند. مطالعات سیعی که در دهه 4881 تسط Lane Gardner همکاران در مش حیانات اهلی به انجام رسید نقش برجسته اسیدهای آمینه بر تکین رشد الیه ریان را به اثبات رساند )43( درحال حاضر منجر به افزدن اسیدهای آمینه به تمام محیطهای کشت ریان استفاده شده در ART شد. عاله بر اینکه اسیدهای آمینه در مایعات مجد در دستگاه تناسلی جنس ماده حضر دا ثابت شده است که اسیت ریان نیز دارای سیستم نقل انتقال یژهای برای اسیدهای آمینه هستند 221 )14( همچنین دارای ذخایر درندی برای این اسیدهای آمینه میباشند )12(. اهمیت حضر اسیدهای آمینه در محیطهای Sodium- DL -Lactat biosynthetic endogenous 485

192 کشت محیطهای آمادهسازی اسیت ریان در جلگیری از خرج منابع درندی این ماد از اسیت ریان میباشد )13(. غلظت لزم حضر تمام اسیدهای آمینه در طل تمام مدت فرایند تکین پیش از النهگزینی ریان هماره م بحث سال قرار گرفته است. برپایه مطالعات صرت گرفته در مش Gardner )43 Lane 11( از لزم افزدن اسیدهای آمینه غیرضرری به محیطهای کشت در مرحله پیش از متراکم شدن ریان انسان در فاز ال )رز 4 تا رز 3( دفاع نمده اما بیان میکنند که بعد از متراکم شدن هر د دسته اسیدهای آمینه ضرری غیر ضررری باید به محیطهای کشت ریان افزده شند. در حقیقت مشخص شده است که قتی ریانهای مش در محیطهای کشت حای اسیدهای آمینه ضرری کشت داده میشند رند تکین انها دچار نقصان میشد )43(. این اصل تسط سایر محققان نیز تایید شده است. در مطالعهای ری ریان همستر که تسط Bavister همکاران صرت پذیرفته است مشخص شده است که قتی محیط کشت به اسطه یکی از اسیدهای آمینه غیرضرری مانند آسپاراژین آسپاراتات گلیسین سرین همچنین تائرین غنیسازی میشد این اسیدهای آمینه با غلظت های بسیار باالیی در دستگاه تلیدمثلی مجد ماده حضر دا منجر به تحریک تکین بالستسیت از مرحله ریان تک سللی میشد. اما افزدن اسیدهای آمینه ضرری مانند سیستئین ایزلسین لسین فنیلآالنین ترئنین الین منجر به ممانعت از تکین ریان رسیدن آن به مرحله بالستسیت میشد. تنها اسیدآمینه ضرری که باعث تحریک ریان در رسیدن به مرحله بالستسیست میشد اسیدآمینه هیستیدین میباشد. از این مطالعات به طر کلی میتان اینگنه نتیجهگیری نمد که اسیدهای آمینه غیرضرری د ر رندهای کلیاژ الیه نرخ تقسیمات میتزی ترفکتدرم تشکیل بالستکل نقش تحریکی دارند. به طر کلی اسیدهای آمینه ضرری در پیشرفت فرایند کلیاژ الیه نقش مهاری داشته لی بعد از مرحله متراکم شدن ریان این اسیدهای آمینه نقش تحریکی در افیش نرخ کلیاژ تشکیل را برعهده دارند. به طر عممی میتان اینگنه بیان ک که اسیدهای آمینه غیر ضرری در غلظتهای باال اسیدهای آمینه ضرری در غلظتهای پایین در مایع مجد در لله فالپ که محل اختصاصی برای رشد ریان در مراحل الیه کلیاژ است حضر دارند )43(. عاله بر تاثیر حضر اسیدهای آمینه در محیط های کشت ریان بر رند تکین ریان مصرف تلید اسیدهای آمینه به سیله ریان در مراحل آغازین زندگی )پیش از النه گزینی( در شرایط برنتنی نیز م مطالعه قرار گرفته است. بیشتر اینگنه مطالعات از آزمایشگاه Henry Leese خارج شده است شامل بیشتر گنههای پستانداران از جمله انسان میشد. در ریانهای انسان اسید آمینه لسین در ICM 224 تمام مراحل از رز 2 تا رز 3 تکین تا مرحله بالستسیت م مصرف قرار میگی همچنین مین باشت سرین آرژنین تعداد زیاد دیگری از اسیدهای آمینه ضرری به طر معنی دار در مراحل بعدی تکین م استفاده ریان قرار میگی )13(. براساس باشت لسین تسط ریان منطقی به نظر میرسد که این اسید آمینه را در محیط کشتهای م استفاده در تمامی مراحل کشت ریان م استفاده قرار دهیم اما از آنجا که لسین جز اسیدهای آمینه ضرری به طبقه بندی میشد همچنان در این م شک بزرگی جد دا که آیا این افزدن لسین به محیط کشت برای تمام مراحل رشد ریان منجر به ایجار اثرات مهاری در تکین ریان در مراحل آغازین کلیاژ نشد. اسیدهای آمینهای که در تمام مراحل تکین پیش از النهگزنی تسط ریان تلید میشند شامل آالنین گلتامین میشد. بنابراین هشمندانترین تصمیمگیری در باره محیطهای کشت ART ریان انسان حذف آالنین از این محیطها در تمامی مراحل کشت ریان به حساب میآید. حذف آالنین از محیطهای کشت ممکن است منجر به کمک رسانی در ادامه یافتن فرایند ترانسآمیناسین پیرات به آالنین در خالل فرایند خارج سازی آمنیم از ریان به اسطه آنزیم ترانسآمیناز شد. همچنین باتجه به تلید گلتامین تسط ریان در نظر داشتن اینکه این اسیدآمینه سریعا تسط رندهای دآمیناسین منجر به تلید آمنیم میشد تصیه میشد که گلتامین از تمام محیطهای کشت ریان حذف شد )12(. گلتامین تسط آنزیم گلتامین سنتتاز در ریان تلید میشد ریانهایی که فاقد این آنزیم باشند محکم به مرگ هستند )12(. بنابراین استفاده از فرمهای پایدار گلتامین مانند دیپپتیدهای حای این اسیدآمینه میتاند منجر برز 222 فایدی برای رشد تکین ریان شد همانطر که نشان داده شده است این سیاست کاربی به طر چشمگیری منجر به Inner cell mass Strategy 486

193 کاهش تجمع آمنیمم در محیط کشت ریان میشد )10( به هرحال تاثر اسید آمینه مزدج همرا با گلتامین چه آالنین باشد چه گلیسین بر ری رند رشد تکین ریان در محیطهای کشت باید م تجه بررسی قرار بگی. گرشهایی در این زمینه جد دا که انتخاب دیپپتید آالنین-گلتامین در مقایسه با گلیسین-گلتامین به عنان منبع تامین کننده گلتامین منجر به برز اثرات بهتری در رند تکین ریان انسان شده است )19( درحالی که گرش دیگری در این زمینه تاثیر بیشتر مفید گلیسین-گلتامین در مقایسه با آالنین-گلتامین را گزراش نمده است )18(. به عاله کاهش مین آمنیم تلید شده در محیط کشت به اسطه شکست اسیدهای آمینه بد شرایط کشت ریان باعثشده است که کاهش غلظتهای اسیدهای آمینه به عنان سیلهای جهت بد رند کشت برنتنی ریان در نظر گرفته شد )31 34( یتامینها اینکه آیا افزدن یتامینها به محیطهای کشت ریان انسان چه اثری در رند تکین رشد ریان در رزهای آغازین بعد از لقاح دا همچنان باید م بررسی قرار بگی. گرشهای متععدی جد دا که با تجه به مطالعات صرت گرفته در حیانات )به غیر از انسان( نشان میدهد که افزدن یتامینها به محیط کشت به اسطه کاستن از مین استرس ا شده در شرایط برنتنی به ریان منجر به تحریک یا به عبارت دقیقتر منجر به حفظ تکین رشد ریان پیش پس از النه گزینی شد. در مطالعهای که تسط Lane )32( Gardner ری ریانهای مش رت انجام شده بد نشان داد که یتامینهای مجد در محیط کشت MEM 223 زمانی که به محیط کشت ساخته شده از مایع لله ایداکت افزده میشد در ترکیب با اسیدهای آمینه مجد در محیط کشت MEM باعث حفظ متابلیسم طبیعیتری در بالستسیت تشکیل شده در شرایط برنتنی از ریان این د مجد میشد. زمانی که این بالستسیتها به رحم پذیرنگان منتقل میشد نرخ النه گزینی زن ریان مشابه با شرایط درنتنی میباشد. در مقابل در گرههایی که محیط کشت آنها فاقد یتامینها اسیدهایآمینه بده است این 221 نرخها بسیار پایینتر میباشد. درم رند رشد تکین ریان همستر تنها یتامین محلل در آب پنتتنات تانسته است که منجر به تحریک رند تکین از مرحله 4 سللی به بالستسیست شد )33( درحالی که در خرگش چندین یتامین محلل در 223 آب دیگر میتانند منجر به ارتقا نرخ تسعه هچ شدن بالستسیت شد )31(. برپایه این گرشات حضر یتامینها در محیط کشت Ham s F41 Eagle s MEM که در کشت ریانها در رزهای الیه لقاح برنتنی انسان استفاده میشد شرکتهای تلید کننده محیطهای کشت تجاری جهت کشت ریان به تمام یا بیشتر محیطهای کشت تلید شده جهت کشت ریان در تمام مراحل کشت اقدام به افزدن این یتامینها نمدهاند )33(. تمایل الیه در افزدن تمامی 9 یتامین مجد در محیط کشت MEM بده است اما به تدریج تعداد این یتامینها به پنتتنات با یا بدن 3 یتامین دیگر محدد شد. بیان این نکته که تاکنن مشخص نشده است که نیازهای ریان انسان به یتامینها چگنه است به نعی اعترافی عادالنه میباشد فاکترهای رشد فاکترهای رشد پپتیدی زیادی در مایعات مجد در دستگاه تناسلی جنس ماده جد دا مشخص شده است که ریانها نیز برای این فاکترهای رشد دارای گیرندههای اختصاصی میباشند )مرر شده تسط Kane همکاران )32((. فاکترهای رشد به محیطهای کشت استفاده شده در تلید محیطهای ART تلید برنتنی ریان انسان افزده میشند باعث ارتقا تشکیل بالستسیت )30( میگند اما تاکنن فقط یک فاکتر رشد فاکتر تحریک کننده تشکیل کلنی ماکرفاژهای گرانلسیتی (GM-CSF) 222 به طر کلینیکی م آزمن اقع شده ثابت شده است که افیش متسطی در نرخ آبستنی 220 بدن افیش در نرخ سقط ریان یا افیش در نرخ ناهنجاریهای مادردی را منجر میشد )39(. تحقیقات در زمینه میای Minimal Essential Medium pantothenate Expansion Granulocyte macrophage colony stimulating factor Miscarriage 487

194 احتمالی افزدن فاکترهای رشد به محیطهای کشت ریان امری الزم ضرری مینماید به خصص که همراه نگرانیهایی در این خصص احتمال برز ناهنجاریها در رند تکامل ریانها جد دا )38(. به عاله اینکه آیا در معرض فاکترهای رشد متفات قرار دادن ریان به طر پی در پی میتاند منجر به برز اثرات مفید شد یا خیر همچنان سال برانگیز میباشد کنترل ph دما اهمیت ph در انجام ریه لقاح برنتنی اخیرا در یک مقاله مرری )21( م بررسی قرار گرفته است در فصل 41 این کتاب به بررسی آن پاختهایم. به منظر کشت ریانهای مش از مرحله 2 سللی تا مرحله بالستسیست Whitten از محلل Whitten در ترکیب های اتمسفر استفاده نمد )24(. سپس در شرایط گازی 3 درصد CO 2 Krebs-Ringer bicarbonate مفق به کشت ریانهای مش هیبرید F4 از مرحله 4 سللی تا بالستسیست شد که این مفقیت را با تجه به استفاده از محیطی که محتی پیرات الکتات کلسیم گلکز بد به دست آ. اما الزم به یادآری است که مقدار سدیم بیکربنات را به جای 23 میلی مل که به عنان استاندای جهت کشت ریانهای مش تسط Brinster تعریف شده بد به 22/2 میلی مل کاهش داده بد )43(. Whitten یادآر شد که محیط کشت تعدیل شده تسط ا دارای اسمالریتهای بین میلی اسمل میباشد )دامنه اسمالریته بهینه بین میلی اسمل تعریف شده است( همچنین ph این محیط 0/2 بد. تا پایان قرن 21 هنز مشخص نشده بد که ph محیطهای کشت باید کمتر از 0/1 که در محیطهای کشت معمل ریان در نظر گرفته شده بد باشد همچنین هنز مشخص نشده بد که دامنه ph بهینه در مراحل مختلف تکین ریان متفات میباشد. ph در نزدیکی محدده 0/2 به عنان ph بهینه برای کشت ریان در مراحل الیه کلیاژ ph در محدده 0/1-0/3 به عنان دامنه مناسب ph برای کشت بالستسیست در نظر گرفته شده است )23(. یافتن اینکه phi مناسب برای ریان در مراحل ابتدایی کلیاژ ریان انسان 0/4 میباشد )21( از ایده بیان شده مبنی بر کاهش ph محیط کشت ریان در مراحل الیه کلیاژ در نزدیکی 0/2 به منظر کاهش هر نع استرس اضافی در زمانی که ph از دامنه بهینه بسیار در باشد حمایت مینماید. Phillips همکاران )21( نشان داند که ریان انسان در مرحله کلیاژ دارای سیستم انتقال دهنده یژهای برای تعیض نمدن ین + H - HCO 3 از عرض غشای سللی ریان میباشند که تانایی حفظ phi در یک دامنه به نسبت محدد در مقابل ph محیط پیرامنی که مقدار بسیار بیشتری را به خد اختصاص داده است میباشد. گرش شده است که زمانی که به دلیل شرایط گاز رسانی غیر اصلی ph محیط کشت به باالتر از 021 میرسد ریخت شناسی ریان ناهنجار شده نتیجتا آبستنی حاصل از انتقال این ریانها بسیار ضعیفتر از ریانهای معملی میباشد )23(. مقدار phi عاله بر اینکه به عنان یک تنظیم کننده قدرتمند برای بسیاری از مسیرهای آنزیمی به حساب میآید تانایی کنترل نمدن مسیرهای متابلیسم اکسیداتی گلیکلیز را دارا بده همچنین فرایندهای سللی از جمله تقسیمات سللی تمایز رخ دادهای مرتبط با اسکلت سللی را نیز کنترل مینماید )0(. ph محیط کشت به دالیل متعددی میتاند تخت تاثیر قرار بگی از جمله این دالیل میتان به ارتفاع از سطح دریا دما ظرفیت سیستم حفظ سطح CO 2 که به دلیل باز بسته شدن درب انکباتر دچار نسان میشد یا مشکل نشت گاز اشاره نمد در نتیجه بسیار حایز اهمیت است که phدر هر انکباتر به طر منظم م سنجش ارزیابی قرار بگی. سدیم بیکربنات مجد در محیط کشت به همراه دی اکسید کربن مجد در اتمسفر بزرگترین تاثیر را ری ph محیط کشت داشته مشخص شده است که اندازهگیری ph محیط کشت بسیار مهمتر از اندازهگیری غلظت CO 2 مجد در اتمسفر کشت میباشد )22(. همانطر که پیشتر اشاره شد ph بهینه برای مراحل مختلف زندگی تکین ریان متفات میباشد. در فاز 4 مرحله کلیاژ دامنه ph در محدده 0/23-0/21 باعث بدست آن بهترین نتایج در رند تکین ریان بین رزهای 4 3 بعد از لقاح شده است )شکل 4-43(. اندازه گیری برای ph محیط کشت ریان انسان در مرحله فاز 2 تکین ریان در دسترس نمیباشد اما دادههای حاصل از مشاهدات مختلف بیانگر این است که بهترین محدده ph در این مرحله در مقایسه ph که تصیه شده در مرحله کلیاژ بیشتر بده بین 0/33-0/31 میباشد )شکل 4-43(. به منظر جلگیری از تغییرات سطح CO 2 انکباتر جهت دست یافتن به این تغییر در مین بهینه ph شرکتهای تلید کننده محیطهای کشت متسل به اعمال تغییر در غلظت سدیم بیکربنات شدهاند در 488

195 نتیجه فراهم نمدن phهای متفات با استفاده از مین ثابت دی اکسید کربن در انکباتر در تمام دره کشت ریان در زمان پیش از النه گزینی امکانپذیر میباشد. چنین سیاست اجرایی با ریک استفاده از محیط کشت یک مرحلهای برای تمام مدت کشت ریان امکانپذیر نبده مجبر به فدا کن یکی از phهای بهینه به نفع دیگری در این رش از کشت میباشیم. به منظر حفظ ph بهینه با ریک استفاده از محیط کشت یک مرحلهای تنها راه حل جایگزین تغییر دادن مین CO 2 در مرحله قبل یا بعد از متراکم در رز 3 بعد از لقاح میباشد. یادآری این نکته بسیار مهم میباشد که سطح CO 2 سدیم بیکربنات مجد در محیط کشت ه دارای تاثیر شگرفی بر رند تکین ریان میباشند. در نتیجه در نظر داشتن اثرات این د عامل درحالی که تنظیم ph نیز در نظر گرفته میشد الزم ضرری است. در م دمای بهینه جهت کشت ریان گامت انسان باید ذکر نمد که دمای مرکزی بدن که معادل 30 درجه سانتیگراد میباشد به عنان دمای بهینه در نظر گرفته میشد. مشخص شده است که همانند دمای کیسه اسکرتم دمای فلیکلهای تخمدانی لله فالپ )ایداکت( به مین 4 تا 2 درجه سانتیگراد پایینتر از دمای مرکزی بدن میباشد این کاهش دما نسبت به دمای مرکزی بدن دارای اثرات مفیدی در کاهش نرخ فعالیتهای 229 متابلیکی اسیت ریان در مراحل آغازین اعمال مینماید این مسئله در راستای فرضیه "ریان کم فعالیت " که تسط Leese بیان شد میباشد )20(. شاهدی مبنی بر اینکه دامنه دمایی 3223 تا 3228 میتاند منجر به بهترین نتایج در تلیدات برنتنی ریان انسان شد به دست آمده است )29( دادهها در شکل 3-43 ابسته بدن بازده تلیدات برنتنی ریان انسان نرخ ریانهای منتقل شده که در رز 3 ازتباط آن با نرخ النه گزینی به دمای آسپیره نمدن را نشان میدهد. تاکنن شاهدی مبنی بر نیازهای متغیر ریان در رزهای مختلف تکین مراحل مختلف آن به دماهای مختلف در نظر داشتن این نع از طریق با ریک استفاده از محیطهای کشت پیدرپی مشخص نشده است. شکل تاثیرpH بر درصد تکین ریانها به مرحله 9 سللی در رز 3 بعد از کشت ریانها. برپایه اطالعات حاصل از درصد تکین ریانهای رز 3 به مرحله بالستسیست در رز 3 یا 2 بعد از کشت ریانها ( Miller.K دادههای منتشر نشده(. تاثیر ph بر Quiet Embryo Hypothesis 483

196 شکل تاثیر دمای آسپیره نمدن بر نرخ انتقال ریان در رز 3 نرخ النه گزینی. برپایه مشاهدات حاصل از 4944 بیمار ( منتشر نشده(. K. Miller دادههای خط مشی پیا یا ثابت سیستمهای کشت ثابت به عنان رشهای کشت برنتنی کالسیک ریان در نظر گرفته میشد با رشد مفقیت ربه افیشی نیز همراه بده است )28(. یکی از این سیستمهای ثابت که به فر م استفاده تجه قرار گرفته است استفاده از قطرات کشت یا چاهکهای کشتی بده که با یک الیه از رغن معدنی پشانده میشد )43(. بعد از یک آغاز آهسته سیستم- های کشت پیا که در آنها محیط کشت به اسطه استفاده از یک سیله جمع آری کننده تزیع کننده مایعات در اندازههای میکرلیتری هماره به در گامت یا ریان درحال گش است ظهر نمد )01(. اگرچه نرخ تکین تسعه ریان به اسطه استفاده از این سیستم کشت افیش یافت لی هنز هیچ گرشی مبنی بر برتری این رش در نرخ آبستنی ایجاد شده نسبت به رش ثابت ارایه نشده است. یکی از اثرات منفی سیستمهای کشت پیای ریان که بسیار مشهد نیز میباشد حذف فاکترهای رشدی است که به اسطه اثرات اتکراین/پاراکراین میتانند تکین ریانها را تحت تاثیر قراهند )04(. درصرتی که شخصی ایداکت تازه مش را بالفاصله بعد از آد شدن تخمک از بدن آن خارج نماید در زیر میکرسکپ مشاهده نماید حتما حرکات ر به جل عقب مجمعههای سللی کملس را در داخل مجرای ایداکت مشاهده مینماید. این حرکات فعالیتهای مکانیکی هم شامل فعالیت ماهیچهای هم شامل فعالیت سللی میباشد که منجر به مخلط شدن گامتها با یکدیگر تراشات لله ایداکت میشد. فعالیت سللی دخیل در این حرکت جابهجایی ماد مجد در ایداکت به اسطه زنش مژک- های سللهای اپیتلیم ایداکت میباشد که همره جهت این زنش به سمت رحم میباشد. حرکت مشابه این نع فعالیت مکانیکی در شرایط کشت برنتنی باعث افیش ارتقا رند تکین ریان میشد. این ارتقا در تکین ریان چه با ایجاد حرکات یک سیه در مایع محیط کشت چه با ایجاد نسانات به اسطه لرزش مکانیکی ایجاد میشد )02(. از الین گرشات رسمی در م مفقیت لرزش مکانیکی میتان به مطالعه انجام شده تسط Hoppe )23( Pitts اشاره نمد که با استفاده از ظرف کشتی که به طر دائم درحال لرزش بد در رند کشت ریان مش باعث ایجاد حرکت در ظرف کشت ریان میشد. سیستم کشت ثابت برای انجام لقاح برنتنی در مش نیز ایجاد تسعه یافت )03( با این تفات که مقدار اسپرم الزم جهت ایجاد لقاح در این سیستم بسیار بیشتر از سیستم کشت پیا که تسطHoppe )23( Pitts معرفی شده بد میباشد. در 228 مطالعاتی که اخیرا تسط Isachenko همکاران )02( با استفاده از سیستم ایجاد لرزش ظریف به کشت ریان انسان پاخته است ارتقا چشمگیری در بازده تلیدات برنتنی ریان ایجاد شده نرخ آبستین نیز افیش یافته است. فرایند ایجاد لرزش یک فرایند پالسی میباشد )3 ثانیه در هر یک ساعت(. تاکنن هیچ مطالعهای مشابه با مطالعه Hoppe )23( Pitts که از لرزش در Micro-vibration system 431

197 تلید ریان مش به طر ثابت استفاده نمده است در م انسان گرش نشده است. همچنین نشان داده شده است که لرزش مکانیکی منجر به بد رند تکثیر فعالیت تراشی سللهای بدنی در محیط کشت میشد )01(. تغییر تبدیل دیگر در زمینه بد سیستمهای کشت ریان رشی است که بانام Well-of-the-Well شناخته میشد (WOW) )03( شامل ایجاد چاهکهایی با سایز میکرنی در چاهکهای ظرف کشت میباشد به این ترتیب امکان کشت ریان به صرت انفرادی را فراهم مینماید درحالی که همچنان از میای کشت گرهی نیز بهره مند میشند. سیستم WOW منجر به تلید بالستسیتهایی با کیفیت باالتری در مقایسه با رشهای متدال دیگر شده این مطالعه با استفاده از ریانهای خاهر برادر به انجام رسیده است نزدیک به %31 نرخ آبستنی را در زنانی که به دلیل کیفیت پایین یا متسط ریان یا تکین ناقص ریان حداقل در یک سیکل لقاح برنتنی شکست خهاند را افیش داده است )03(. شاید سدمندی سیستم 201 کشت ریزمحیط یا سیستم کشت با لرزشهای مکانیکی حذف عامل سمی از مجارت ریانها بده سیستم WOW به نعی برز دهنده اثری مخالف این سیستمها باشد شاید باعث ارتقا باال رفتن محتای فاکترهایی باشد که به اسطه فرایندهای اتکراین/ پارارکراین در اطراف ریان باعث ارتقا کیفیت آن میشند. هر د این دستاها با سیستم کشت پیدرپی سازگار بده درهر حال سیستم کشت پیا با بهره جستن از سیله پخش کننده میکرنی محیط کشت پتانسیل باالتری را به اسطه تعیض محیط کشت در طل مدت زمان کشت کسب میکند. درصرتی که این د سیستم کشت بتانند باهم ترکیب شده باعث ارتقای بازده تلید ریان شند نتیجه بسیار جالبی بدست خاهد آمد خالصه مراحل رشد تکین ریان در آغاز پایان دره تکین ریان پیش از النه گزینی مرحله سلل تخم بالستسیست نه تن ها از نظر ظاهری باهم تفات دارند بلکه از نظر فیزیلژی بیشیمی نیز باهم متفات میباشند. سال پیش آمده در این زمینه اشاره به انتخاب نع سیستم محیط کشت دا بیان مینماید که آیا محیط کشت تک مرحلهای با محیط کشت پیدرپی کدامیک میتانند باعث ارتقا رند تلیدات برنتنی ریان شند. شرایط کشت نامناسب چه به دلیل فرمالسین نامناسب محیط کشت ph دما شرایط فیزیکی سیستم کشت یا دیگر فاکترها یا ترکیبی از مجمعه عامل یاد شده باشد میتانند باعث ایجاد استرس سللی اعمال صدمه به ریان شند )1(. استفاده از محیطهای کشت تک مرحلهای در مقایسه با محیط کشت پیدرپی اگر بازده باالتری نداشته باشد میتان بیان نمد که بازده یکسانی خاهد داشت )41(. شاید مقدار ph ری تکین عملک ریان در محیطهای کشت مختلف تاثیر گذار باشد به هر حال برخی مطالعات )02 00( از جمله مطالعه انجام گرفته تسط Reed همکاران )41( به هیچ عنان ph را تحت کنترل قرار نداده هیچ برنامهای مبنی بر بهینه سازی ph در مراحل مختلف رشد تکین ریان در نظر نداشتهاند. برخی تفاتها بین محیطهای کشت پیدرپی محیط کشت تک مرحلهای در جدل 4-43 ارایه شده است. در این مرحله از مطالعات هنز هیچ شاهدی مبنی بر نتیجه گیری کلی که بتاند بیان کند کدام سیستم کشت بر دیگری برتری دا بدست نیامده است. جدل مقایسه پرتکلهای محیط کشت پیدرپی محیط کشت تک مرحلهای محیط کشت تک مرحلهای محیط کشت پیدرپی تغییرات م نیاز محیط کشت در نزدیکی رز 3 می تان بدن تغییر در محیط کشت برای تمام مدت کشت استفاده شد بدن تغییر در رز 3 تغییر مینماید عامل تغییر محیط کشت ماد حامل انرژی حضر EDTA حای EDTA بده که امکان دا رند گلیکلیز را در مرحله محیط کشت بالستسیست حای EDTA نمیباشد زیرا فرایند گلیکلیز را کاهش میدهد بالستسیست دچار نقصان نماید محیط کشت کلیاژ حای اسیدهای آمینه ضر ری نمیباشد زیرا ممکن است حای اسیدهای آمینه ضرری بده که ممکن است رند تکین تاثیر اسیدهای microfluidic 434

198 ریان در مراحل الیه رشد را تحت تاثیر قرار دهد که تکین از مرحله تخم به بعد را دچار نقصان نماید آمینه ضرری ph در تمام مراحل کشت یکسان بده البته تغییر در مین CO 2 در رز 3 امکان پذیر است. مطالعات مقایسهای بین د نع سیستم کشت پیدرپی تک مرحلهای منجر به بهینه سازی ph نشده است. محیط کشت کلیاژ ph در دامنه را دارا بده که باعث بهینه شدن ph تکین از مرحله سلل تخم تا ریان 9 سللی میشد. محیط کشت بالستسیست دارای ph در نزدیکی بده که بهترین دامنه برای تکین بالستسیست است ماد 4( سایزهای مختلف نک پیپت. 2 (ظرف کشت مناسب جهت کشت ریان که قبال به این منظر آزمده تایید شده است. 3( محیطهای کشت لقاح کلیاژ بالستسیست. 1( محیطهای کشت دسترزی آماده سازی )مانند HEPES یا بافر.)MOPS 3( منبع پرتئینی مناسب 2( رغن معدنی آزمده شده جهت کشت ریان 0( انکباتر 9( میکرسکپ رشها رز قبل از باشت اسیتها (OPU) 204 تمام ظرف کشت عالمت گذاری شد. زمانی که قصد ایجاد قطرات محیط کشت را داریم با استفاده از پیپت استریل قبل از قطره گذاری نک پیپیت دبار با محیط کشت شستش داده شد. به منظر انجام لقاح برنتنی. محیط کشت لقاح با در نظر داشتن شرایط استریل آماده شداید در نظر داشت که منبع پرتئینی مناسب به مقدار کافی در این محیط اضافه شده باشد. قطرات لقاح را با تجه به ریه م استفاده در آزمایشگاه ری ظرف کشت قرار دهید )یادداشت شماره 4 2 را مالحظه نمایید(. بالفاصله بعد از قطره گذاری تمام قطرهها با رغن معدنی پشانده شده در 202 انکباتر CO 2 قرار داده شد )یادداشت شماره 3 تا 3 را مالحظه نمایید(. به منظر انجام تزریق اسپرم به داخل اسیت. ظرف ظرف کشت حای قطرههای محیط کلیاژ را آماده نمده در انکباتر CO 2 قرار دهید )یادداشت شماره 3 تا 3 را مالحظه نمایید(. زمانی که ظرف کشت را به داخل انکباتر منتقل نمدید به آهستگی درپش ظرف را باشته به صرت مرب ری لبه ظرف آن را قرار دهید به این ترتیب امکان تبادل گازی بین محیط قطرهها برقرار میشد. ظرف کشت باید به مدت حداقل 1 ساعت در معرض گاز قرار بگیرند )یا در طل شب قبل از انجام ریه م نظر(. برای مای که قصد انجام لقاح برنتنی داریم در رز 1 )رز )OPU ظرف کشت را با محیط کلیاژ مطابق آنچه در مرحله 1 ذکر شد آماده نمایید. برای هر د ریه IVF ICSI رز 1 یا رز 4 قبل از چک نمدن لقاح. محیطهای دست رزی آماده سازی را بر اساس ریه م نظر آزمایشگاه آماده نمایید. محیط کشت را میتان به مدت یک شب در دمای اتاق قرار داد یا صبح رز 4 محیط را آماده نمد در دمای 30 درجه سانتیگراد قرار داد )برای هر گنه باید دمای بدن آن گنه مرجع عمل باشد(. در تمامی ما باید ظرف کشت را نیز در رز 4 در دمای 30 درجه قرار دهیم تا هم دما شند. به منظر انجام IVF در پایان رز 1 یا ساعات آغازین رز 4. ظرف شستش حای محیطهای شستش باید آماده شده باشند. در رز 4 یا رز چک نمدن لقاح سللهای کملس را به آرامی طبق ریه م استفاده در آزمایشگاه از پیرامن تخم لقاح شده جدا نمایید )یادداشت شماره 2 را مطالعه نمایید(. به آرامی اسیتهای عاری شده از کملس را در محیطهای دسترزی شستش نمایید. سپس اسیتهای لقاح یافته را در محیط کلیاژ قرار دهید. برای اسیتهایی که باسطه تزریق اسپرم بارر شدهاند اسیتهایی که با مفقیت لقاح را سپری نمدهاند در محیط کلیاژ باقی خاهند ماند. ریانها را میتان تا رز 3 در همان محیط کشت کلیاژ نگهداشت )یادداشت شماره 0 را مطالعه نمایید(. در رز 2 میتان ریانها را براساس ریه م استفاده در آزمایشگاه بررسی نمد. ظرف کشت بالستسیستها که در رز 3 م نیاز است باید همانطر که در مراحل قبل ذکر شد حداقل 1 ساعت قبل از انتقال ریانها به قطرههای کشت در انکباتر قرار داده شده باشد تا به تعادل دمایی گازی مناسب دست یابد. در رز 3 بعد از آنکه محیط کشت بالستسیستها Ovum pickup Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) 432

199 در به منظر به تعادل رسیدن حداقل 1 ساعت در انکباتر بد باید ما زیر را به ترتیب انجام دهیم. ریانهایی که باید تا رز 3 تا 2 کشت داده شند از محیط کلیاژ به محیط کشت بالستسیست منتقل شد )یادداشت 9 را مطالعه نمایید( یادداشتها 4( نع پرتئین غلظت آن بر اساس ریه م استفاده در ازمایشگاه متفات میباشد. HSA به عنان منبع پرتئینی تصیه شده به منظر انجام فرایند لقاح برنتنی تصیه میشد. غلظت بهینه معادل 3 میلی گرم بر میلی لیتر میباشد. 2( نع ظرف کشت حجم محیطهای کشت براساس ریههای م نظر آزمایشگاه متفات میباشد. حجم رغن معدنی استفاده شده نیز بسته به ریه تصیه شده در آزمایشگاه متفات است. 3( بیش از 2 ظرف کشت را در یک زمان آماده نسازید تا از تبخیر تغییر در مین اسمالریته تغییر ph جلگیری به عمل آید. 1( دما شرایط گازی باید براساس ریه آزمایشگاه م نظر تنظیم شد. دما نباید بیشتر از 30 درجه سانتیگراد باشد ( البته در م هرگنه حیانی باید دمای مرکزی بدن مجد م نظر مبنای کار قرار بگی( اگرچه برخی آزمایشگاهها کمی کمتر از دمای مرکزی بدن مجد م نظر را در نظر میگیرند. کاهش فشار اکسیژن دارای اثرات مثبت ری کیفیت تکین ریان است. همچنین مین CO 2 نیز باید به دقت تنظیم شد تا ph محیطها در دامنه بهینه آن نگهداری شد. 3( لخت نمدن اسیتها را میتان با استفاده از آنزیم هیالرنیداز پیپت نمدن آهسته انجام داد. البته هر آزمایشگاهی ریه خاص خد را دارا میباشد. 2( تصیه شده است که از پیپتهایی با قطر µm استفاده شد تا کمترین مقدار محیط کشت بین قطرهها جا- بهجا شد. حجم محیط کشت جابهجا شده نباید بیشتر از 4 میکرلیتر باشد. 0( بنا به برخی گرش ها انتقال ریان در مرحله کلیاژ از محیط کشت کلیاژ به محیط بالستسیست در رز 2 یا 1 منجر به حصل نتایج بهتری میشد نسبت به انتقال ریان در مرحله کلیاژ در رز 3. در حقیقت هر آزمایشگاهی باید به منظر تعیین رز مناسب این انتقال برای ریه استاندا م نظرش به جمع بندی برسد. به منظر رسیدن به این تصمیم گیری باید در نظر داشت که به نعی بهترین رز انجام این انتقال به نعی به شرایط بیمار ابسته میباشد. در برخی بیماران انتقال در رز 2 بهتر بده در برخی دیگر انتقال در رز 3 در دستهای دیگر شاید رز 1 مناسبترین زمان این جابهجایی باشد. منابع 4. Biggers JD, Culture techniques in animal and human reproductive biology. Workshop on evidence based assisted reproductive technologies (ART). Food and Drug Administration, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, Wednesday, September 49, /News Events/WorkshopsMeetingsConferences/ TranscriptsMinutes/UCM pdf. Accessed 49 June Biggers JD, Summers MC (2119) Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril 81: Quinn P (2142) Short culture: day 4/day 2/day 3 embryo culture. In: Nagy ZP, Varghese AC, Agarwal A (eds) Practical manual of in vitro fertilization. Advanced methods and novel devices. Springer, New York, NY 1. Gardner DK (4889) Changes in requirements and utilization of nutrients during mammalian preimplantation embryo development and their significance in embryo culture. Theriogenology 18: Quinn P (2113) Media used in the assisted reproductive technologies laboratories. In: Patrizio P, Tucker MJ, Guelman V (eds) A color atlas for human assisted reproduction: laboratory and clinical insights. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia 2. Handyside AH et al (4881) Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-speci fi c DNA ampli fi cation. Nature 311: Lane M, Gardner DK (2114) Blastomere homeostasis. In: Gardner DK, Lane M (eds) ART and the human blastocyst. Springer, New York, NY 439

200 9. Braude P, Bolton V, Moore S (4899) Human gene expression first occurs between the fourand eight-cell stages of preimplantation development. Nature 332: Brison DR et al (2111) Identi fi cation of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover. Hum Reprod 48: Reed ML et al (2118) Continuous uninterrupted single medium culture without medium renewal versus sequential medium culture: a sibling embryo study. Fertil Steril 82: Wagh PV, Lippes J (4883) Human oviductal fl uid proteins. V. Identi fi cation of human oviductin-i as alpha-fetoprotein. Fertil Steril 38: Keel BA et al (4884) Synergistic action of puri fi ed α -fetoprotein and growth factors on the proliferation of porcine granulose cells in monolayer culture. Endocrinology 428: Gardner DK (2119) Dissection of culture media for embryos: the most important and less important components and characteristics. Reprod Fertil Dev 21: Whitten WK (4832) Culture of tubal mouse ova. Nature 400: Brinster RL (4823) A method for in vitro cultivation of mouse ova from two-cell to blastocyst. Exp Cell Res 32: Krebs HA, Henseleit K (4832) Untersuchungen uber die harnstoffbildung im tierkorper. Zeirschrift fur Pysikalische Chemie 241: Quinn P, Kerin JF, Warnes GM (4893) Improved pregnancy rate in human in vitro fertilization with the use of a medium based on the composition of human tubal fl uid. Fertil Steril 11: Tervit HR, Whittinghan DG, Rowson LEA (4802) Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J Reprod Fertil 31: Borland RM et al (4891) Elemental composition of fluid in the human fallopian tube. J Reprod Fertil 39: Lane M, Gardner DK (2111) Regulation of ionic homeostasis by mammalian embryos. Semin Reprod Med 49: Quinn P et al (4883) Successful human in vitro fertilization using a modi fi ed human tubal fl uid medium lacking glucose and phosphate ions. Fertil Steril 23: Pool TB, Atiee SH, Martin JE (4889) Oocyte and embryo culture: basic concepts and recent advances. In: May JV (ed) Assisted reproduction: laboratory considerations. Infertil Reprod Med Clin N Am 8: Quinn P, Wales RG (4804) Adenosine triphosphate content of preimplantation mouse embryos. J Reprod Fertil 23: Quinn P, Wales RG (4803) The effect of culture in vitro on the levels of adenosine triphosphate in preimplantation mouse embryos. J Reprod Fertil 32: Hoppe PC, Pitts S (4803) Fertilization in vitro and development of mouse ova. Biol Reprod 9: Biggers JD (2114) Thoughts on embryo culture conditions. Reprod Biomed Online 1(Suppl 4): Lane M et al (4889) Intracellular divalent cation homeostasis and developmental competence in the hamster preimplantation embryo. Mol Reprod Dev 31: Rogers BJ, Yanagimachi R (4802) Competitive effect of magnesium on the calcium-dependent acrosome reaction in guinea pig spermatozoa. Biol Reprod 43: Leese HJ (4889) Human embryo culture: back to nature. J Assist Reprod Genet 43: Gardner DK et al (4882) Environment of the preimplantation human embryo in vivo: metabolite analysis of oviduct and uterine fl uids and metabolis m of cumulus cells. Fertil Steril 23: Pool TB (2114) Summary: fi ve take-home lessons regarding the optimization of culture media and the use of commercial products for human embryo culture. In : Quinn P (ed) ART media. Commercial and in-house products. Proceedings of the 3th Annual Symposium of the American Association of Bioanalysts College of Reproductive Biology, Las Vegas, AAB, St. Louis, MO, 3th May Bavister BD, McKiernan SH (4883) Regulation of hamster embryo development in vitro by amino acids. In: Bavister BD (ed) Preimplantation embryo development. Springer, New York, NY 431

201 33. Gardner DK, Lane M (4882) Alleviation of the 2-cell block and development to the blastocyst of CF4 mouse embryos: role of amino acids, EDTA and physical parameters. Hum Reprod 44: Fischer B, Bavister BD (4883) Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys, hamsters and rabbits. J Reprod Fertil 88: Biggers JD, McGinnis LK, Lawitts JA (2113) One-step versus two-step culture of mouse preimplantation embryos: is there a difference? Hum Reprod 21: Gardner DK et al (2144) Glucose consumption of single post-compaction human embryos is predictive of embryo sex and live birth outcome. Hum Reprod 22: Lane M, Gardner DK (4882) Selection of viable mouse blastocysts prior to transfer using a metabolic criterion. Hum Reprod 44: Edwards LJ, Williams DA, Gardner DK (4889) Intracellular ph of the preimplantation mouse embryo: effects of extracellular ph and weak acids. Mol Reprod Dev 31: Tay JI et al (4880) Human tubal fluid: production, nutrient composition and response to adrenergic agents. Hum Reprod 42: Steptoe PC, Edwards RG, Purdy JM (4804) Human blastocysts grown in culture. Nature 228: Van W inkle LJ (4899) Amino acid transport in developing animal oocytes and early conceptuses. Biochim Biophys Acta 810: Schultz GA et al (4894) Endogenous amino acid pool sizes in mouse eggs and preimplantation embryos. J Reprod Fertil 24: Kolajora M, Baltz JM (4888) Volume-regulated anion and organic osmolytes channels in mouse zygotes. Biol Reprod 21: Gardner DK, Lane M (4883) Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture. Biol Reprod 19: Houghton FD et al (2112) Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo development capacity. Hum Reprod 40: He Y et al (2110) Glutamine synthetase is essential in early mouse embryogenesis. Dev Dyn 232: Lane M, Gardner DK (2113) Ammonium induces aberrant blastocyst differentiation, metabolism, ph regulation, gene expression and subsequently alters fetal development in the mouse. Biol Reprod 28: Quintans CJ et al (2113) Human IVF outcome in media containing either alanyl- L glutamine or glycyl- L -glutamine. Fertil Steril 91(Suppl 4): S Biggers JD, McGinnis LK, Lawitts JA (2111) Enhanced effect of glycyl- L glutamine on mouse preimplantation embryos in vitro. Reprod Biomed Online 8(4): Eagle H (4838) Amino acid metabolis m in mammalian cell cultures. Science 431: Lane M, Hooper K, Gardner DK (2114) Effect of essential amino acids on mouse embryo viability and ammonium production. J Assist Reprod Genet 49: Lane M, Gardner DK (4889) Amino acids and vitamins prevent culture-induced metabolic perturbations and associated loss of viability of mouse blastocysts. Hum Reprod 43: McKiernan SH, Bavister BD (2111) Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod 43: Kane MT (4899) The effects of water-soluble vitamins on the expansion of rabbit blastocysts in vitro. J Exp Zool 213: Behr B et al (4888) Preliminary clinical experience with human blastocyst development in vitro without co-culture. Hum Reprod 41: Kane MT, Morgan PM, Coonan C (4880) Peptide growth factors and preimplantation development. Hum Reprod Update 3: Bavister B, Baltz J (2112) Influence of culture media on embryo development. In: De Jonge CJ, Barratt CLR (eds) Assisted reproductive technology. Accomplishments and new horizons. Cambridge University Press, Cambridge 435

202 39. Origio (2144) Embryogen. com/~/media/origio/files/pds/ MEC/EmbryoGen_101244_v4_web.ashx. Accessed 42 Sept Rawlins RG (2114) Modern media for in vitro fertilization an evolution. In : Quinn P (ed) ART media. Commercial and in -house products. Proceedings of the 3th Annual Symposium of the American Association of Bioanalysts College of Reproductive Biology, Las Vegas, AAB, St. Louis, MO, 3th May 2114, pp Swain JE (2141) Optimizing the culture environment in the IVF laboratory: impact of ph and buffer capacity on gamete and embryo quality. Reprod Biomed Online 24: Whitten WK (4830) Culture of tubal ova. Nature 408: Whitten WK (4801) Nutrient requirements for the culture of preimplantation embryos in vitro. Adv Biosci 2: Ferring Pharmaceuticals (4888) The Assisted Reproductive Global Monitor, May Council Meeting, Special Meeting Reporter, Session 4, Council for the Advancement of Ovulation Induction and Assisted Reproductive Technology, Marrs RP, Steinkampf MP (chairpersons) 21. Phillips KP et al (2111) Intracellular ph regulation in human preimplantation embryos. Hum Reprod 43: Quinn P, Stone BA, Marrs RP (4881) Suboptimal laboratory conditions can affect pregnancy outcome after embryo transfer on day 4 or day 2 after insemination in vitro. Fertil Steril 33: Pool TB (2111) Optimizing ph in clinical embryology. J Clin Embryol 0: Leese HJ et al (2119) Metabolism of the viable mammalian embryo: quietness revisited. Mol Hum Reprod 41: Higdon HL, Blackhurst DW, Boone WR (2119) Incubator management in an assisted reproductive technology laboratory. Fertil Steril 98: Quinn P (2111) The development and impact of assisted reproductive technologies culture media. Fertil Steril 9: Heo YS et al (2141) Dynamic microfunnel culture enhances mouse embryo development and pregnancy rates. Hum Reprod 23: Paria BC, Dey SY (4881) Preimplantation embryo development in vitro: co-operative interactions among embryos and role of growth factors. Proc Natl Acad Sci USA 90: Isachenko E et al (2141) Mechanical agitation during the in vitro culture of human pre-implantation embryos drastically increases the pregnancy rate. Clin Lab 32: Stanger JD, Quinn P (4892) Fertilization of cumulus-free, zona-intact mouse ova in vitro at high and low sperm concentrations. Gamete Res 3: Isachenko V (2144) In-vitro culture of human embryos with mechanical micro-vibration increases implantation rates. Reprod Biomed Online 22: Vajta G et al (2119) The well-of-the-well system: an efficient approach to improve embryo development. Reprod Biomed Online 40: Sepulveda S et al (2118) In vitro development and pregnancy outcomes for human embryos cultured in either a single medium or in a sequential media system. Fertil Steril 84: Wirleitner B et al (2141) Individual demands of human embryos on IVF culture medium: influenceon blastocyst development and pregnancy outcome. Reprod Biomed Online 24:

203 فصل 41 سیستمهای کشت: سامانه همکشتی ریان در طل دهه 4801 علم بیتکنلژی در حیانات اهلی انتقال ریان در حیانات مزرعهای با مشکلی به عنان تقف تسعه تکین ریانهایی که در شرایط برنتنی تلید میشدند ماجه شد. این تقف به یژه در زمان فعال شدن ژنم ریان انتقال از مرحله ابستگی به ژنم مادر به سی فعال شدن ژنم ریان (MZT) به قع میپیندد. در حیانات مزرعهای به منظر انتقال ریان مفق رساندن ریان به مرحله بالستسیست در شرایط برنتنی اجباری میباشد. مشخص شده است که انتقال ریان در مراحل ابتداییتر یعنی قبل از تشکیل بالستسیست منجر به خارج شدن آن از رحم به داخل اژن دام میشد. در انسان تمام تالشهای ابتدایی به منظر رسیدن به مرحله بالستسیست با بهره گرفتن از محیطهای کشت کالسیک با شکست ماجه شد. همین مسئله همچنین طبیعت سامانه همکشتی به نعی باعث ایجاد انگیزههایی برای آزمدن تانایی این رش در تلید بالستسیست در شرایط برنتنی گید. الین نتایج برجسته قابل تجه در این زمینه در اایل دهه 4891 با بهرهگیری از بافت ترفبالستی به عنان یک الیه سلل حمایت کننده برای تقلید اثرات اتکراین سیستم تغذیه کننده ریان به دست آمد. سیستم سللی حمایت کننده بعدی که در سامانه همکشتی م بهره باری قرارگرفت استفاده از سللهای اپیتلیال ایداکت رحم بد که به منظر بهره جستن از تانایی اثرات تقیت کننده پاراکراین این سللها بد. عدم ابستگی به هرمنهای تلید مثلی در مطالعات بعدی به اسطه استفاده از سللهای ایداکتی - رحمی استحصال شده از حیانات پیش از بلغ به اثبات رسید سرانجام این نکته به اسطه استفاده از سللهای غیرمرتبط به دستگاه تناسلی استفاده از الینهای سللی مختلف به طر قطعی به تایید رسید )سللهای کلیه میمن سبز آفریقایی با نام سللهای.Vero یژگیهای حمایتی الیه سلل همراه در سامانه همکشتی به مشخصههای سللهای اپیتلیمی از جمله سللهای اپیتلیمی که در نقل انتقاالت بین بافتی دخیل می- باشند مرتبط است. در تلیدات برنتنی ریان انسان سللهای Vero به طر شگفت انگیزی م استفاده قرار گرفتند. همچنین بخش عظیمی از اطالعات بدست آمده پیرامن بالستسیست ریان انسان به اسطه همین تکنلژی به دست آمده است. در حال حاضر همچنان سامانه همکشتی در تلیدات برنتنی ریان به طر سیعی م استفاده قرار میگی اما ریک استفاده از سللهای سماتیک به سمت استفاده از سللهای رحمی همان ف تغییر یافته است. نتایج بدست آمده به اسطه استفاده از سامانه همکشتی در مقایسه با استفاده از سیستمهای کشت پیدرپی از برتری قابل تجهی برخار میباشد. میای استفاده از سامانه همکشتی به د نکته مربط میباشد: 4( پاکسازی رادیکالهای آد تلید شده به اسطه متابلیسم ریانها در محیط کشت تسط سللهای حمایت کننده در سامانه همکشتی 2( تلید آدسازی فاکترهای رشد به اسطه استفاده از این سللهای حمایت کننده در سامانه همکشتی میباشد. در زمینه بیتکنلژی حیانی یک جز مهم در تلیدات ریان به یژه در بحث شبیه سازی استفاده از سامانه همکشتی با سللهای کبدی buffalo rat یا سللهای Vero میباشد مقدمه الین سیستم کشت استفاده شده در زمینه تلیدات برنتنی بالستسیست حیانات که در نهایت منجر به انتقال مفق ریان شد با استفاده از سامانه همکشتی به قع پیست. انتقال ریان در حیانات مزرعهای فقط در مرحله بالستسیست امکان- پذیر میباشد. انتقال ریان در مراحل ابتداییتر )بالفاصله بعد از لقاح یا با گذشت مدت کتاهی از کشت ریان( قبل از رز 3 منجر به خارج شدن ریانهای منتقل شده به داخل اژن میشد. در رند کشت برنتنی ریان مشکل بزرگی با نام تقف تکین در خالل چرخه سللی به یژه در مرحله فعال شدن ژنم ریان به قع میپینند. این مرحله فعال شدن ژنم ریان شامل قطع ابستگی ریان از نظر متابلیکی ذخیره پرتئین مادری ذخیره mrna به ارث رسیده از مادر به ریان فعال شدن ژنم ریان برای هدایت مستقیم به سمت تکامل میباشد. این انتقال ضعیت در ریانهای مش در مرحله 2 تا 1 سللی در انسان در مرحله 1 تا 9 سللی در گا در مرحله 9 تا 42 سللی رخ میدهد. این انتقال ضعیت در طل چرخه سللی زندگی 437

204 ریان حضر داشته به گنهای که طالنیترین زمان انتقال ضعیت در خالل مراحل الیه تکامل ریان رخ میدهد. این زمان حدد 21 ساعت به طل میانجامد تا الین نسخههای ترجمه شده از ژنم ریان تلید م استفاده قراربگی. بعد از این فعالسازی ریان به یک مجد خدمختار تبدیل میشد. شرایط پیای مجد در درن بدن مجدات زنده به گنهای است که معمال امکان بازسازی آن در شرایط برنتنی به طر بهینه فراهم نمیشد. نتایج بدست آمده از مطالعات انجام شده در تلید بالستسیست )نرخ کمتر از %31( با بهرهگیری از سیستمهای کشت معمل میتاند شاهد خبی بر این ادعا باشد. بنابراین سامانه همکشتی به عنان یک سیستم کشت همزمان سللهای بدنی به همراه ریان تعریف میشد که یک قدم حداسط بین شرایط مجد درن بدن حیان شرایط برنتنی میباشد. سامانه همکشتی استفاده شده برای گا الین بار در اایل دهه 4891 با استفاده از زیکلهای ترفبالستیک )24 2( برای تقلید اثر اتکراین سیستم تغذیه کننده ریان به کار گرفته شد. این رش در حقیقت الین رشی بد که اجازه کشت ریان گا از مرحله تک سللی تا رسیدن به مرحله بالستسیت را فراهم نمد به گنه ای که منجر به آبستنی مفق تلد گساله شد. دمین سیستم حمایت سللی استفاده شده در سامانه همکشتی شامل بهره گرفتن از سللهای اپیتلیال ایداکت بد که منجر به بهرهمند شدن ریانها از اثرات پاراکراین ایجاد شده تسط این سللها شده است )3(. این نع از سامانه همکشتی برای الین بار در م ریانهای میمن تسط )1( Goodeaux همکاران م استفاده قرار گرفت. این گره با استفاده از سللهای اپیتلیال رحم سامانه همکشتی را بنا نهادند. همچنین برای الین بار Bongso)3 2( همکاران با استفاده از سللهای اپیتلیال ایداکت هملگس انسان ریانهای انسانی را در سامانه همکشتی تا مرحله بالستسیست کشت دادند. سپس با استفاده از سللهای اپیتلیال ایداکت مش گا نابالغ نشان داده شد که اثرات حمایتی الیه سللی سماتیک در سامانه همکشتی اثری مستقل از اثرات هرمنهای جنسی میباشد )0(. همچنین استفاده از سللهایی غیر از سللهای دستگاه تناسلی در انسان شاهد دیگری بر این ادعا که اثرات سللهای حمایتی هیچ ارتباطی با عامل هرمنی ندا قلمداد میشد )9(. منشا ریانی سللهای Vero )سللهای کلیه میمن سبز( همانند منشا ریانی سللهای رحم ایداکت میباشد (mesonephros) به طر سیعی در سیستمهای همکشتی ریان انسان استفاده میشند. همچنان سللهای Vero سللهای کبدی (BRL) buffalo rat در تلیدات برنتنی ریان گا م استفاده قرار میگیرند. ما در این فصل به تضیح مکانیسمهایی میپازیم که به اسطه آنها سامانه همکشتی باعث بد تسعه تکین ریان در سیستم کشت برنتنی میشد زمان طالنی کشت انتقال ریانها قبل از قع فرایند فعال شدن ژنم ریان به عنان رشی با درنمای نامشخص در نظر گرفته میشد حتی در صرتی که قبل از انتقال ریان سرعت رند تکین ریختشناسی ریانها به درستی ارزیابی بررسی شده باشند. از سی دیگر مرحله مرال در برگیرنده تغییرات تحالت ساختاری عظیم از لحاظ سللی میباشد در نتیجه انتقال ریان به رحم پذیرنده در مرحله بالستسیست به عنان یک استراتژی منطقی در نظر گرفته میشد. همچنین الزم به یادآری میباشد که تحرکات رحم بعد از گذشت 3 رز از پایان لقاح به شدت کاهش یافته که این کاهش در حقیقت همزمان با مرحله بالستسیست در ریان میباشد )8(. در سالهای نچندان در انتخاب انتقال بالستسیست به عنان یک ریه سال برانگیز در بین محققان مختلف در نظر گرفته میشد )42-41( اما در حال حاضر این مفهم کامال م بررسی قرار گرفته به صرت رندی کامال اضح در آمده است. در مفاهیم سیتلژی این اصل به اثبات رسیده است که رحم مجد پذیرنده در حقیقت تنها ریانهای سالم با کیفیت را انتخاب نمده به این نع از ریانها اجازه النه گزینی میدهد )43(. اثر این انتخاب مثبت به همراه بازده به نسبت پایین PGD/PGS منجر به این نتیجهگیری شده است که PGD نمیتاند به عنان معیار مناسبی جهت سنجش ریانها باشد )41(. عاله براین مشخص شده است که ریان به اسطه رند خد اصالحی در طی مرحله ابتدایی کلیاژ بالستسیست میتاند ضعیت سیتژنتیک خد را به طر مثر کاربی اصالح نماید. در پی طراحی انجام شده برای رش PGD شمار زیادی از تیمهای تحقیقاتی در حال حاضر با بهره گرفتن از رش نمنه باری از بالستسیست به منظر انجام PGD مشغل 438

205 به ارزیابی ریانهای تلید شده در شرایط برنتنی میباشند ) (. به هرحال همانند سایر رشهای بهکار رفته در فرایندهای بیلژیک رش انتخاب ریان به اسطه PGD رشی کامل بهینه با بازده باال نیست زیرا همانطر که میدانیم تریزمی در کرمزمهای به طر طبیعی در ریانها رخ میدهد. با این جد زمانی که هدف انتقال تنها یک ریان میباشد تصمیمگیری باید در جهت انتقال بالستسیست اقع شد رشهای متفات تسعه تکین ابتدایی ریان فرایندی د مرحلهای میباشد. الین تقسیم سللی در مرحله کیاژ به طر کامل تسط ذخایر مجد در اسیت که از مادر در خالل رشد بلغ اسیت در آن ذخیره شده است انجام کنترل میشد. به یژه مقادیر زیادی از mrna مادری که به شدت به اسطه پلی آدنیالسین به صرت دستههای متراکم در اسیت ذخیره شده که آماده ترجمه در مراحل بعدی تسعه رشد ریان میباشد. این فاز که به عنان مرحله ال ضرری در رند تکامل ریان شناخته میشد حساسترین شکنندهترین مرحله میباشد. هرگنه نقصان در مراحل ذخیرهسازی پرتئین mrna که به منظر انجام امر حمایتی حفاظتی سلل حفظ همستاز سلل تقسیمهای سللی تنظیم پتانسیل احیا متابلیسم انرژی حمایت در برابر عامل آسیب رسان خارجی یا به منظر ترمیم DNA م استفاده قرار میگی مطمئنا منجر به تقف کامل تکین ریان همچنین برز آپپتز خاهد شد. همچنین مشخص شده است که نا هنجاریهای الیه در نهایت منجر به برز مشکالت در ریان در مراحل بعدی رشد تکامل آن خاهد شد )49( )به مبحث نتاج غل آسا مراجعه شد(. زمان به نسبت طالنی م نیاز برای MZT باعث برز مشکالتی در رند تکامل ریان میشد. بسیاری از سیستمهای کشت حمایت کننده که میتانند از برز تاخیر در این رند جلگیری نمایند باعث میشند که سطح مناسبی از ماد ذخیرهای تا مرحله بالستسیست حفظ شند. حضر الیهای از سللهای حمایت کننده میتاند تا حددی باعث نجات یافتن ریانهایی شد که از قدرت به نسبت کمی برای بقا برخار هستند همچنین حضر این الیه سللی مانع تقف این ریانها در مرحله تقف چرخه سللی خاهند شد. به هر ری این مسئله فقط یک تضیح شماتیک از اقعیت جاری در رشد تکامل الیه ریان میباشد چن برخی از mrnaهای ذخیره شده در طل بلغ اسیت در مرحله بالستسیست م استفاده قرار میگی. سللهای بدنی بهکار رفته در سامانه هم- کشتی به رشهای مختلفی از جمله سسپانسین سللی بخشی از یک بافت )ترفبالست( یا به صرت تک الیه سللی م استفاده قرار میگیرند. سامانه همکشتی دارای یک مجمعه از رابط سه گانه میباشد که شامل محیط کشت سللهای سماتیک ریان میباشد. الین آزمایش طراحی شده با بهره گیری از سامانه همکشتی در ابتدای دهه 4881 به انجام رسید که منجر به انتقال مفق ریان گا بعد از IVF IVM IVC شد که تانمندی این رش را به اثبات رساند. استفاده از سللهای ترفبالستیک )به دست آمده از ریانهای رز 49 بعد از لقاح( برای کشت ریانهای 4 سللی مشخص نمد که اثرات حمایتی تغذیهای ایجاد شده در سامانه همکشتی به هیچ عنان تحت کنترل سیستم هرمنی نمیباشد )24 2(. این فرضیه با آزمایش- های بعدی که با انتقال ریانهای ابتدایی به داخل ایداکت مش گا در قبل از سن بلغ به انجام رسیده بد به اثبات رسید. این نع از آزمایشها هم در شرایط درنتنی هم در شرایط برنتنی م آزمن قرار گرفته است )48-0(. این نکته همچنین با استفاده از سیستم همکشتی با بهره گرفتن از سللهای اپیتلیال ایداکت اندمتریم رحم که هیچگنه همزمان سازی در آنها انجام نشده است به اثبات رسیده است )21(. در اینجا باید ذکر شد که ایجاد سامانه همکشتی با استفاده از سللهای اندمتریم رحم معمال در فاز لتئال انجام میپذی در این مرحله اندمتریم رحم حای ماد سللهای مختلفی میباشد که این گناگنی تنع هیچ اثر منفی یا مثبتی در نتیجه آزمایش ایجاد نمیکند. اگرچه به صرت اضح شاهدی مبنی بر لزم حضر یک پیشنیاز هرمنی در پیشینه سللهای حمایت کننده م استفاده در سامانه همکشتی جد ندا اما مشخص شده است که تمام گنههای سللی نمیتانند به صرت یکسان با بازده باال منجر به ارتقا کیفیت کشت ریانها شند. برای مثال سلل- های فیبربالست به د دلیل اساسی نمیتانند به عنان سللهای همراه در سامانه همکشتی ایفای نقش نمایند: 4( فیبربالستها به صرت متناب تقیسم میشند با رشد بی ریه خد باعث تخلیه شدن محیط کشت از ماد مغذی میشند 433

206 همچنین این متابلیسم باالی فیبربالستها منجر به کاهش ph )اسیدی شدن( محیط کشت خاهد شد که با نیازهای ریان همخانی نداشته عاله بر این ریان تانایی الزم برای تعدیل نمدن ph کاهش یافته را ندا )24(. نکته دم کیفیت اختصاصی بدن فاکترهای رشد آد شده تسط فیبربالستها میباشد که در حقیقت هیچ گیرندهای ری ریان برای این فاکترهای رشد جد ندا. در حقیقت تانایی سللهای استفاده شده به عنان سللهای حمایت کننده در سیستم همکشتی در برقرار نمدن تسعه تکامل ریان به ناقلین مجد در سللهای اپیتلیال محدد میشد )22(. به همین منظر محققین ابتدا از سللهای Vero که یک الین سللی ثابت با ظرفیت دسترزی باال قابلیت کنترل بسیار عالی میباشند استفاده نمدند. در حقیقت این سللها آنقدر خب قابل استفاده هستند که برای انجام تحقیقات تلید اکسن م استفاده قرار میگیرند )23(. سللهای Vero را میتان از مراکزی همانند American Tissue Culture Collection یا از مخزن WHO تهیه نمد این سللها 424 بار متحمل پاساژ شدهاند. هر مجمعه سللی تهیه شده از این مسسات دارای مدارک ثبت شده تعداد پاساژ انجام شده ری این سللها میباشند. این سللها به راحتی منجمد یخگشایی شده به سادگی میتان از آنها به صرت رنه در آزمایشگاههایی که رند IVF را به انجام میرسانند استفاده نمد. خاصیت تمریی این سللها تا قبل از پاساژ 418 هرگز مشاهده نشده است )21(. بیشتر اطالعات بدست آمده در ارتباط با بالستسیست انسان برپایه اطالعات جمع آری شده از سیستم همکشتی ریان با سللهای Vero حاصل شده است. از جمله این اطالعات میتان به اثرات مادری پدری )223 22( همچنین انجماد بالستسیستها اشاره نمد )220 29(. کمی بعد از استفاده از سللهای Vero در آزمایشگاههای IVF انسانی سیستم همکشتی اتلگس با استفاده از بیپسی اندمتریم رحم )228 31( یا سللهای ایداکت در تلیدات برنتنی بالستسیست م تجه قرار گرفت. آزمایشگاهی در ارپا به نام France) Genevrier (Sophia Antipolis, در حال حاضر این امکان را فراهم نمده است که افراد متقاضی خدمات لقاح برنتنی بتانند از سامانه همکشتی اتلگس به اسطه نمنه باری از اندمتریم رحم ف متقاضی در سیکل قبل از انجام لقاح برنتنی بهرهمند شند. سریس ارایه شده تسط آنها با نام Endocell میباشد که در حقیقت شامل مجمعه سللی )آندمتریم رحم( آماده مصرف طراحی شده برای کشت ریان تا مرحله بالستسیست را در اختیار متقاضیان قرار میدهد. برای تلیدEndocell بعد از نمنه باری از آندمتریم رحم در سیکل جنسی قبل این نمنهها را منجمد نمده سپس سللهای کشت شده در ظرف مربطه در زمان انجام لقاح برنتنی برای آزمایشگاه ارسال خاهد شد )شکل (. سللهای کملس نیز به همین منظر یعنی انجام همکشتی در ریانهای انسان م تجه قرار گرفتهاند )34( اگرچه این رش به نسبت آسان جذاب میباشد اما نتایج بدست آمده هماره م انتقاد قرار گرفتهاند در حقیقت این رش هنز به طر کامل قت نگرفته است. مشکالت ایجاد شده در استفاده از سللهای حمایت کننده که به صرت الین سللی در نیامدهاند به عامل متعددی بازمیگد از جمله این مشکالت میتان به سختی استحصال سللها بعد از هر بار پاساژ به اسطه عمل تریپسینه کن پیری زدرس سللها همچنین از دست رفتن سریع تانایی تلید ماد ترفیک تسط این نع از سللها که باعث میشد این سامانه سیستمی یکبار مصرف به حساب آید چرا هنز سامانه همکشتی م تجه است شاهد متعددی جد دا که نشان میدهد استفاده از سیستم همکشتی در مقابل سیستمهای متدال کالسیک کشت ریان منجر به تلید ریانهایی با کیفیت باال همچنین نرخ بهتر آبستنی میشد )33-32(. تسعه بالستسیست با استفاده از سامانه همکشتی سریعتر رخ میدهد در این صرت رز 3/3 بعد ازلقاح شاهد تسعه بالستسیست خاهیم بد )شکل 1-41( همچنین ساخت hcg هچ شدن بالستسیست با استفاده از سللهای Vero زدتر آغاز خاهد شد )32-9(. مطالعات سیعی در م اثرات مثبت سامانه همکشتی استفاده از سللهای اندمتریم رحم سللهای Vero تسط گرههای تحقیقاتی بزرگی در نقاط مختلف دنیا در زمینه کارب این سللها دراین نع از سامانههای کشت ریان به اجرا در آمده است. از جمله این گرهها میتان به گره اسپانیایی IVI در النسیا )231 33( 231 گرهی در دانشگاه کرنل )نییرک( )232 33( اشاره نمد که 211

207 گره اسپانیایی از سللهای اتلگس اندمتریم رحم گره آمریکایی از سللهای اندمتریم رحم بدن در نظر داشتن اتلگس بدن آن استفاده نمده بدند. همچنین تیم نیسندگان این فصل از کتاب از مسسه تحقیقاتیDexeus در بارسلنا گره Servy در Agusta با استفاده از سللهای Vero به بررسی اثرات مثبت این نع از کشت ریان پاختهاند. اثر مثبت سامانه همکشتی زمانی بیشتر آشکار میشد که با مهای مطالعاتی پیچیده مشکلی ربه ر میشیم مثال زمانی که کشت ریان به اسطه استفاده از محیطهای کشت تجاری معمل امکانپذیر نمیباشد یا در مای که انتقال کشت تنها یک ریان م نظر میباشد بهرهگیری از سامانه همکشتی میتاند اثرات مثبت تقیت کننده خد را به ضح به رخ بکشد. مشخص شده است که استفاده از سللهای Vero یا سللهای اندمتریم رحم در سامانه همکشتی ریان منجر به دست یافتن به نتایج مشابهی میشد. در مطالعهای که تسط تیم تحقیقاتی به سرپرستی نیسنده مسئل این فصل به انجام رسیده است مشخص شده که در صرت نیاز به منجمد نمدن بالستسیستهای حاصل از کشت برنتنی نرخ بازیابی بالستسیستهای حاصل از سامانه همکشتی بسیار باالتر از این نرخ برای بالستسیتهای حاصل از محیطهای کشت پی در پی میباشد. )230 39(. بیشتر انتقادهایی که نسبت به سامانه همکشتی انتقال بالستسیست اعمال میشد معتبر نیستند: مثال نسبت تلد ندان نر ماده دچار تغییر نشده )4141 نر/ 813 ماده: %34/0( زن تلد ندان نیز افیشی را از خد نشان نمیدهند )238 11(. افیش زن ندان در م حیانات مزرعهای میتاند به عنان مضعی م بحث قرار بگی. مکررا ذکر شده است که افیش زمان کشت امکان برز تلد ندان دقلی همسان را افیش میدهد. تیم نیسندگان این فصل از کتاب نشان دادهاند که این افیش در نرخ دقلیی معمال به دلیل حفاظت به نسبت ضعیف سیستمهای کشت پی در پی در برابر مرگ برنامه- ریزی شده سللی القا شده به اسطه گنه اکسیژن فعال میباشد )214 12( مسلما دقلیی همسان به اسطه استفاده از سامانه همکشتی افیش نداشته است. شکل ظرف کشت چهار چاهکی استریل حای سللهای اندمتریم شکل بیپسی تازه بدست آمده از آندمتریم رحم رحم که در سیکل قبل از ف متقاضی به دست آمده است (Endocell). 214

208 شکل تصیر یکی از چاهکهای ظرف کشت که به خبی تسط سللهای اندمتریم پشش داده شده است. بیپسی 4 تا 2 ماه قبل از انجام لقاح برنتنی تهیه شده است در هنگام انجام لقاح کامال آماده مصرف میباشد. (B2 شکل د بالستسیست بدست آمده از سامانه همکشتی در رز 3 بعد از لقاح )سللهای Vero به همرا محیط کشت سلل های حمایت کننده در سامانه همکشتی ماد آنتی اکسیدانی با منشا سلفر از جمله هایپتائرین را به داخل محیط کشت آد مینمایند که به عنان از بین برنده رادیکالهای آد در محیط کشت ریان فعالیت مینمایند )213 11(. در مطالعات انجام شده تسط نیسندگان این فصل مشخص گیده است که نرخ سقط ریان حاصل از اثرات درمان نابارری برای بالستسیستهای بدست آمده از سامانه همکشتی به شدت پایین میباشد )>%4 42/4804( همچنین نرخ مه یی مرگ میر ندان در سن زیر 3 ماهگی به اسطه استفاده از سامانه همکشتی به شدت کاهش یافته است )8/4829(. در مطالعاتی که تسط Dominguez همکاران )33( با استفاده از تعداد زیادی اسیت انجام پذیرفت مشخص شد که به کارگیری سامانه هم- کشتی منجر به نرخ باالتری از تشکیل بالستسیست در مقایسه با رش کشت پی در پی میشد %32/1 در برابر %13/8 < P). ( 1/1114 در مطالعه بعدی انجام شده تسط Deminguez که با استفاده از برنامه اهدا اسیت انجام گرفت اثرات مادری به حداقل خد رسیدند تفات ذکر شده در نرخ تشکیل بالستسیست بسیار باالتر از نرخ ذکر شده در مطالعه قبلی تسط ایشان بده است: %01/3 در برابر %(1/ /1 < P). در م نرخ آبستنی النه گزینی الگی نتایج مشابه با نرخ تشکیل بالستسیست بده است: نرخ آبستنی %38/4 در برابر %20/3 نرخ النه گزینی ریان %33/3 در برابر %21/8. دباره نتایج مشابهی با به کار بن سللهای Vero در سامانه همکشتی مشاهده شده است ))13(: بیمارانی که به صرت مکرر تانایی النه گزینی ریان را نداشتهاند(: 38/3 نرخ آبستنی به ای هر بالستسیست انتقال داده شده که از سامانه همکشتی به دست آمده است. سرانجام نتایج یک )12( Meta-analysis نشان داد که استفاده از سامانه همکشتی اثرات منفی معنیداری ری نرخ النه گزینی نرخ آبستنی ادامه آبستنی نرخ تلد نداشته است. 212

209 سامانه همکشتی انجماد بالستسیست به منظر تسعه ایجاد سیستم جهانی برای محاسبه نرخ مفقیت برنامههای تلید ریان در شرایط برنتنی میبایست خرجی کلی آن برنامه به ضح تعریف شد. همانطر که نرخ تلد زنده به ای هر ریان منجمد شده میتاند اهمیت داشته باشد در نظر داشتن نرخ انجماد مفق ریانهایی که به رحم گیرندگان منتقل نشدهاند نیز به عنان یک نکته حایز اهمیت تلقی میشد در حقیقت تعریف نرخ انجماد مفق عبارت است از نرخ تلدهای اضافه شده به اسطه برنامههای انجماد ریان. این فاکتر ندرتا در مقاالت منتشر شده مدنظر قرار میگی )230 39(. معمال اینگنه فرض میشد که با افیش زمان کشت ریان- ها در شرایط برنتنی تعداد ریانهای ماد بر نیاز که برای انجام فرایند انجماد م استفاده قرار میگیرند کاهش مییابد همانطر که در قسمت قبلی تضیح داده شد استفاده از سامانه همکشتی منجر به افیش در نرخ تشکیل بالستسیست در مقایسه با رشهای کشت متدال میشد. بعاله بالستسیستهای بدست آمده از سامانه همکشتی به مراتب نسبت به بالستسیتهای حاصل شده از دیگر ر ش های کشت در مقابل فرایند انجماد از خد مقامت نشان میدهند این افیش در مقامت شاید به دلیل باالتر بدن ظرفیت حفاظتی سامانه همکشتی در برابر آسیبهای ا شده به ریانها از سی ROS می- باشد. آد شدن آنتی اکسیدانها با منشا سلفر از سی سللهای حمایت کننده در سامانه همکشتی )10( از تشکیل لیپیدهای پراکسید شده در غشا سللهای ریان جلگیری به عمل میآ. این اندپراکسیدهای شبه پرستاگلندینها باعث برهم خن شکل غشای سللهای ریان شده مناطق شکننده ای را در آن ایجاد میکنند که مقات ریان در برابر انجماد یخگشایی را کاهش میدهد )19(. افیش مین تحمل در برابر فرایند انجماد میتاند به تعداد باالتر سللهای مجد در بالستسیستهای حاصل شده از سامانه همکشتی مربط باشد )18( این افیش در تعداد سللهای بالستسیستهای بدست آمده از سامانه هم- کشتی میتاند ناشی از تلید LIF تسط سللهای حمایت کننده مجد در سامانه همکشتی باشد )31(. معنی این اتفاق شاید به این ترتیب باشد که نرخ تلد ندان زنده از ریانهای منجمد شده در مرحله بالستسیست در حدد 41 برابر بیشتر از نرخ زندهیی برای ریانهای منجمد شده در مراحل ابتدایی رشد تکین ریان باشد ( قبل از بالستسیست( )230 39(. عاله بر اثر افیش تانمندی مقامت در برابر انجماد در ریانهای رسیده به مرحله بالستسیست استفاده از بالستسیست برای انتقال ریان انجماد یک اثر مثبت انتخابی بری ریانها دا زیرا تعداد زیادی از ریانها در مراحل ابتدایی رشد دارای مشکالت کرمزمی هستند )34(. در برنامههای تلید بالستسیست با استفاده از سللهای Vero که تسط نیسندگان این فصل از کتاب به انجام رسیده است انجماد بالستسیستها منجر به افیش در نرخ تلد ندان به مقدار %23/1 در سال شده است. رشهای استفاده شده در این مطالعات در منابع )32-29( ذکر شده است. الزم به ذکر است بالستسیتهای بدست آمده در رز 0 در صرتی منجر به تلد ند زنده میشد که گیرنده به گنهای آماده شده باشد که شرایط دستگاه تلید مثلی آن منطبق با رز 3 بعد از لقاح باشد. در تجارب بدست آمده مشخص شده است که انتقال ریانهای تازه در رز 0 هرگز به آبستنی تلد منتج نخاهد شد زیرا محدده زمانی النه گزینی در این زمان به اتمام رسیده است چگنه میتانیم اثرات مثبت سامانه همکشتی را تضیح دهیم پیشنهاد شده است که سامانه همکشتی به اسطه د مکانیسم باعث ارتقای کیفیت نرخ تسعه بالستسیست میشد: الین م مربط به حذف عامل سمی از محیط کشت دمین رش مربط به تلید ماد مغذی مفید برای رشد ریان ذکر شده است. در این قسمت تالش میشد تا این د عامل مثر در سامانه همکشتی را م تحلیل بررسی قرار دهیم. متابلیسم اکسیژن یکی از مهمترین رندهای بیلژیکی برای ریان به حساب میآید. تلید ROS تسط سللهای ریان مکرارا در نتایج مطالعات محققین مختلف ذکر شده است: سه نع اصلی ROS تلید شده عبارتند از 2 H O 2-2 O OH. افیش در مقدار تلید ROS تسط ریانهای بدست آمده از رشهای متدال تلید برنتنی ریان در مقابل ریانهای بدست آمده از شرایط درنتنی گرش شده است. در ریانهای مش در زمان لقاح تلید ROS به شدت افیش مییابد که این افیش در تلید

210 ROSبه عنان عامل اصلی تقف رشد تقسیمات سللی در مرحله G2/M از دمین تقسیم سللی در زمان قع فرایند MZT در نظر گرفته شده است )33(. مسیرهای متابلیکی درندی زیادی جد دارند که منجر به تلید ROS میشند. از جمله این مسیرها میتان به فسفریالسین اکسیداتی افیش زیاد گلکز افیش NADPH گنتین اکسیدازها اشاره نمد )11(. با تجه به نتایج مطالعات متعدد ثابت شده است که اثرات مخرب ROS منجر به عدم مفقیت ریان در تکامل زندهمانی خاهد شد. ROS :منجر به ایجاد شکستگی در رشتههای DNA تغییرات در میتکندی پراکسیداسین لیپیدها میشد. عاقب اثرات مخرب ROS بسیار متفات میباشد در برخی از ما میتانند منجر به تقف تکامل رشد ریان شده که این تقف به دلیل القا مرگ برنامهریزی شده سلل میباشد. H 2 O 2 به عنان یک القا کننده قی مرگ برنامه ریزی شده سلل در ریان به حساب میآید )31(. در حقیقت آب اکسیژنه به عنان قاتل مخرب اصلی ریان شناخته میشد. گرشهای اندکی مبنی بر تانایی تلید خد به خدی ROS تسط محیط کشت فاقد سلل که به خبی فرمله نشده محافظت کافی در برابر تلید ROS در آن برقرار نشده است جد دا )33(. تفاتهای معنیدار قابل تجهی در بین محیطهای کشت مختلف در زمینه تلید خد به خدی ROS جد دا )33( عاله بر این رشها ماد محافظت کننده در برابر اثرات مخرب ROS کامال اضح آشکار نمیباشد: برای مثال گلتاتین که یک از بین برنده عممی برای ROS میباشد تانایی نفذ از عرض غشای ریان را نداشته همچنین یتامین C که به عنان یک عامل محافظت کننده شناخته میشد میتاند به عنان یک پیشساز برای اکسیدانها در نظر گرفته شد. اضح است که سللهای تغذیه کننده مجد در سامانه همکشتی تانایی تلید آدسازی آنتی اکسیدانهایی با منشا سلفر را دارا میباشند )10(. سللهای اپیتلیال ایداکت رحم سللهایVero دارای مسیر متابلیکی سیستئین سلفنیک اسید میباشند )10-13( این مسیر باعث ساخت هایپتائرین تائرین میشد که از جمله عامل مهم محافظت کننده در لله تناسلی میباشند. این محافظت خارجی باعث القا ایجاد محافظت با منشا داخلی خاهد شد. سللهای Vero میتانند اثرات مضر ناشناختهای را در سامانه همکشتی ایجاد نمایند از جمله این اثرات مضر میتان به مای شبیه به شرایط محیطی مجد در Hydrosalpinx اشاره نمد )32( فاکترهای رشد ماد حاصل از ترجمه ژنم مادری پرتئینهای به ارث رسیده از منشا مادری به اسیتها دارای مقادیر محددی می- باشند. محتای ذکر شده بستگی زیادی به سن مادر شرایط کیفیت بالغ شدن اسیتها دا. همان فاکترهای رشدی که به اسیتها اجازه میدهند که کفایت الزم برای ادامه رند بارری را بدست آرند در ایجاد تانایی عبر ریان از مرحله حیاتی MZT همچنین ایجاد تانایی تسعه تکین نهایی برای ریان نقش ایفا مینمایند. در نتیجه با تجه به اهمیت نقش این فاکترهای رشد الزم است که این فاکترها در 3 رز ابتدایی کشت ریان فعال شده حضر داشته باشند. جلگیری از برز تاخیر در رند MZT برای رشد تسعه آتی ریانها بسیار حایز اهمیت میباشد. فاکترهای رشد طی یک رند مزن با ریک تقیت اثر یکدیگر به ایجاد تقابل با مسیرهای متابلیکی به اسطه فعال سازی یا مهار این مسیرها میپازند. اگر به این نکته تجه کنیم که چه مادی از سللهای حمایت کننده در سیستم همکشتی تلید میشند تنها نتیجه حاصل این خاهد بد که فقط تعداد محددی از آنها میتانند مثر مفید اقع شند. با بهره گرفتن از رش تجزیه میکراری به سنجش حضر یا عدم حضر گیرندههای فاکترهای رشد در اسیتها )30( پاخته شده است همچنین مسیرهای پیامرسان درن سللی مرتبط با این فاکترهای رشد در اسیتها م ارزیابی قرار گرفته است. تمامی این ما در شکل 3-41 به تصیر کشیده شده است. سللهای حمایت کننده در سامانه همکشتی به تلید تراشLIF پاخته که منجر به ارتقا تانایی تسعه تکامل ریانها به مرحله بالستسیست میشد این اقعه در مش )39( گا )38( گسفند )21( به اثبات رسیده است. الزم به ذکر است که مقدار LIF درست در پیش از تخمکریزی به بیشینه خد میرسد. سللهای رحمی سللهای Vero به تلید LIF IL2 میپازند )38(. نشان داده شده است که گیرنده معمل LIF IL2 که با نام GP431 شناخته میشد به همراه گیرنده نع بتا LIF ری اسیتها بیان میشند. مسیرهای پیام رسان درن سللی برای این گیرندهها لیگاندهای اختصاصیشان نیز در 211

211 اسیتها شناسایی شدهاند. مشاهدات شبیه به این رند در م فاکتر رشد فعال کننده پالکت (PAF) فاکتر رشد مشتق شده از پالکت (PDGF) نیزدر اسیتها به اثبات رسیده است. در ریانهای مش اثر میتژنیک فاکترهای رشد مانند EGF/TGF beta به اثبات رسیده است )24( البته شایان تجه است که این فاکترهای رشد تسط سللهای Vero تلید تراش میشند اما هنز مشخص نشده است که آیا تمام اناع سللهای حمایت کننده در سامانه همکشتی تانایی تلید چنین فاکترهای رشدی را داشته باشند. گیرنده 4 TGF-beta 3 همانند تمامی Erbs ها عض خاناده گیرندههای EGF میباشند که به مقدار زیادی تسط اسیتهای انسان بیان میشند. در شرایط درن تنی عامل رشد دیگری از جمله هرمن رشد حضر دارند که گیرندههای مربط به این فاکتر نیز ری اسیتهای انسان قابل شناسایی میباشد. به هر ری حفظ همزمانی تازن عملک همچنین تنظیم رند تمایز نیازمند اثرات مثبت منفی فاکترهای رشد به صرت همزمان میباشد. فاکترهای رشد بسیار متنع بده میتانند تنظیمات ژنی بیان آنها را تحت تاثیر خد قرار دهند اما عملک دقیق هر یک از آنها هنز ناشناخته باقیمانده است. برای نمنه یکی از عملکهای مرگ برنامه ریزی شده سلل حذف سلل آسیب دیده به اسطه هر نع استرس آسیب رسان به سل میباشد. در نتیجه افزدن یک فاکتر رشد به محیط کشت به منظر جلگیری از برز مرگ برنامه- ریزی شده سلل میتاند عاقب بدی به همراه داشته باشد اگرچه با افزدن چنین فاکتر رشدی که مانع مرگ برنامهریزی شده سلل میشد تعدا سللهای بالستسیست افیش مییابد اما این افیش میتاند با خد ناهنجاریهای زیاد سیتژنتیکی را به ارمغان آ )22(. پیچیدگی ارتباطات متقاطع تکراری بدن مسیرهای مربط به سیستم پیام رسان داخل سللی فاکترهای رشد در تمامی مراحل بررسی اثرات این فاکترها ری سالمت قدرت زنده مانی ریان باید م تجه قرار بگی. بیشتر فاکترهای رشد دخیل در تنظیم تکین ریانها بعد از فعال شدن ژنم ریان در داخل آن تلید میشند اما فاکترهای رشد با منشا برن دی همچنان به عنان تنظیمگرهای مهم در رند تکین تمایز ریان نقش ایفا مینمایند )شکل 2-41(. شکل فاکترهای رشد آد شده تسط سللهای تغذیه کننده در سامانه همکشتی تاثیر آنها در تکامل ریان در مرحله پیش از النه گزینی: تصیر نشان دهنده گیرندههای فاکترهای رشد تقابل اثراین گیرنده ها لیگاندهای مربطه در رندهای پیام رسانی درن سللی که مسئل رشد سلل تمایز مرگ برنامه ریزی شده سلل هسنتد میباشد. محصالت رنیسی شده mrna برای تمامی این گیرنده ها ملکل های دخیل در مسیرهای پیام رسانی داخل سللی به اسطه تکنیک میکر اری انجام شده ری مجمعه ایاز اسیتها به اثبات رسیده است )برای آگاهی از ریه استفاده شده مرجع شماره )39( را مالحظه نمایید CREB:.(پرتئین باند شنده به عامل پاسخ دهنده به- element camp (camp-response (extracellular کیناز تنظیم شنده با پیلمها خارج سللی ERK: (TGF alpha) فکتر رشد اپیتلیال EGF: binding protein) JNK:c-Jun N- کیناز : JAKجانس اینترلکین 2 IL2: متصل شنده به هپارین HB: گلیکپرتئین 431 GP431: signalregulated kinase) MEK: کیناز فعال شده میتژنیک )پرتئین کیناز از خاناده سرین ترئنین کیناز( : MAPKپرتئین بازدارنده لسمی : LIFفاکتر terminal kinase : Erkکیناز MAP-Erk Kinase تنظیم شنده با سیگنال خارج سللی )پرتئین کیناز از خاناده سرین ترئنین کیناز( : PAFفاکتر فعال کننده پالکتی : PDGFفاکتر رشد پالکتی : PI3Kفسفاینزیتل 3 فسفات : PKAفسفکینازA : PKCفسفکینازC : RASکتاه نیس سارکمای MAD: Mothers against هملگ مگس سرکه SMADپرتئین : تیرزین کیناز : RTKگیرنده کچک GTPase نع : Ratیک Rat : STATرساننده decapentaplegic پیام فعال کننده رنیسی beta: TGFفاکتر رشد تبدیل کننده بتا. 215

212 شکل فعال کننده - مهار کننده :MZT انتقال از ابستگی به ژنم مادر به سی ابستگی به ژنم ریان EGF فاکتر رشد اپیتلیمی alpha) :bfgf (TGF فاکتر رشد فیبربالستی پایه :GH هرمن رشد :LIF فاکتر مهارکننده لسمی :PAF فاکتر فعال کننده پالکتی :PDGF فاکتر رشد مشتق شده از پالکت :TGF beta فاکتر رشد تبدیل کننده بتا :TNF alpha فاکتر از بین بنه تمر آلفا خالصه: گذشته آینده سامانه همکشتی میای استفاده از سامانه همکشتی از زمان الین استفاده از آن در کشت ریان هماره م منقاشه بده است. فارغ از اینکه چه نع سللی به عنان سلل حمایت کننده در سامانه همکشتی م استفاده قرار میگی میتان گفت که عمده انتقادات در م استفاده از این سیستم به شرح زیر میباشد: 4( خطر ابتال به آلدگی. از زمان پاستر هماره دانشمند به این نکته که هیچ گنه باکتری یا یرسی به طر خد به خدی در محیطهای کشت تلید نمیشند آگاه بدهاند. در یک آزمایشگاه استا ندا مجهز به همراه بیلژیستهای حرفهای آمزش دیده خطر ابتال به آلدگیهای مختلف با استفاده از سامانه همکشتی هرگز باالتر از رش معملی IVF نمیباشد. حتی میتان بیان داشت که این رش میتاند با تلید الینهای سللی مطمئنتر بی خطرتر از حالتی شد که سللهای حمایت کننده از منشا اتلگس باشند. الینهای سللی ثابت از کنترلهای کیفی مختلفی عبر کهاند که تسط کمپانیهای تلید کننده آنها از جمله ATCC یا WHO ضمانت شدهاند. البته آمزش بیلژیستها تکنسینها که در آزمایشگاه مشغل به کار هستند اجباری میباشد که باید به صرت رنه در هر مرحله از IVF م آمزش قرار بگی. در سال 2111 دلت فرانسه استفاده از سللهای Vero در آزمایشگاههای IVF را ممنع اعالم نمد. دلیل این ممنعیت عدم آمزش گرههای تحقیقاتی IVFبد. این ممنعیت در صرتی که سیستمهای م استفاده تکامل یابند میتاند لغ شد. طبیعتا شرکتهای تلید کننده الینهای سللی باید کنترلهای کیفی را به شدت م تجه قرار دهند که این کنترلها شامل تعداد پاساژ سابپاساژها ذخیره این الینهای سللی میباشد. همچنین آزمایشگاهی در فرانسه با نمنه باری از اندمتریم ف متقاضی در ماه قبل از انجام IVF به تلید سللهای اتلگس رحم در ظرف کشتIVF میپازد. این مجمعه کامال آماده استفاده میباشد با عنان Endoell) Sophia Antipolis, France: شکل ) شناخته میشد. 2( ایمنی در نظر داشتن سالمت ند تلید شده. الین برنامه سیع تلید بالستسیست با استفاده از سامانه همکشتی با بهره گیری از سللهای Vero به انجام رسید )23(. الین ند در فرانسه از انتقال یک بالستسیست تازه در مارچ 4899 در نامبر 4899 ند دیگری در آمریکا متلد شد Gorgia). (Augusta Reproductive Biology associates, Augusta, الین ندان حاصل از یک بالستسیست منجمد در پاییز 4899 در فرانسه همچنین در بهار 4898 در ایاالت متحده آمریکا دیده به جهان گشدند. کدکان مذکر االن 21 سال سن دارند. این کدکان به خبی دران بلغ را پشت سر گذاشته تاکنن هیچ گنه مشکلی از قبیل اضافه زن یا تغییر جنسیت نداشتهاند )238 11(. بنابراین اگرچه رش کشت بالستسیست ممکن است که م انتقاد قرار بگی اما به جرات میتان اذعان نمد که انتقال بالستسیست هیچگنه چالشی در پی ندا. 216

213 3( صرف قت زیاد. برنامهریزی در یک سیستم کشت سلل مهمترین مضع است. در حال حاضر 41 سال است که نیسندگان این فصل از کتاب مشغل به تلید ریان با بهرهگیری از سیستم همکشتی میباشند. سیستم م استفاده تسط این گره از یک دره تکمیلی در نشست American Society for Reproductive Medicine استخراج شد. البته چنانچه امکان تهیه سللهای آماده مصرف فراهم شد قت گیر بدن این رش دیگر مضع بحث نخاهد بد.به سال اصلی پیرامن مضع استفاده از سامانه همکشتی باز میگیم " آیا هنز استفاده از سامانه همکشتی میتاند مفید باشد " پاسخ به این سال مثبت است: البته این یک پاسخ مطلق نمیباشد. نتایج حاصل از تجزیه تحلیلهای دقیق نشان دهنده برتری استفاده از سامانه همکشتی میباشد. در مقایسه با سیستمهای کشت پی در پی یک سامانه همکشتی مفق دارای یژگیهایی میباشد که کامال بیهمتا بده. الین نکته در م سامانه همکشتی رفتار دگانه این سامانه به طر همزمان میباشد این رفتار به صرت فعال غیر فعال در د زمینه متفات خد را نشان میدهد: از یک س سللهای حمایت کننده سامانه همکشتی از نظر رشد ثابت بده رشد فینده از خد نشان نمیدهند که در نتیجه این فاز ثابت به عنان یک یژگی مثبت در جلگیری از تجزیه تخلیه محیط کشت از نظر ماد مغذی میباشد. از سیی دیگر این سللها در رند تلید فاکترهای رشد آنتی آکسیدانها پاکسازی محیط کشت از ماد ید حاصل از متابلیسم ریان کامال فعال پیا عمل مینمایند. در حقیقت این نع رفتار پیای سللهای حمایت کننده در سامانه همکشتی تا حدی تانایی تقلید شرایط درنتنی را برز میدهد. این نکته در جایی اهمیت خد را نشان میدهد که نتایج تحقیقات اثبات نمدهاند که محیطهای کشت پیدرپی به یژه آنهایی که از نظر محتای اسیدهای آمینه ضرری دچار کمبد میباشند باعث برز خطر ایمپرینتینگ ناهنجاریهای مرتبط به آسیبهای ا شده به DNA میشند )221 23(. اشباع شدن تانایی ترمیم آسیبهای ا شده به DNA ریان در بهترین حالت منجر تقف فرایند تسعه تکامل ریان میشد یا در بدترین حالت منجر به کاهش تانایی مقابله با جهشهای ژنتیکی شده که در نهایت میتاند منجر به آلده شدن سللها به سرطان شد. سامانه همکشتی میتاند راهگشای فهم بهتر تقابل بین ریان محیط پیرامن آن باشد. در نتیجه میتاند به عنان ابری جهت شناسایی نقاط ضعف محیطهای کشت متدال ارتقا آنها شد. تکین تکامل ریان در مراحل الیه تشکیل از دامنه فهم کامل تسط بشر فاصله زیادی دا در نتیجه انجام تحقیقات در این زمینه ارتقا دانش در این زمینه همچنان به عنان نیاز ضرری این بخش از دانش مطرح میباشد. 4. Tissue culture dishes (33 41 mm). 2. Tissue culture dishes Falcon 3112 (21 43 mm). 3. Culture plates multiwell. 1. Culture flasks. 3. Centrifuge conical graduated tubes. 2. Plastic fi lters 1 / 13 μ m. 0. B2 medium (with calf serum). 9. HEPES buffered medium Hanks balanced solution w/o Ca and Mg. در للههای مخصص در حالت منجمد با فراانی 23 میلین cells..41 Vero سلل آماده شده باشند ) 44. Trypsin. 42. EDTA. 43. Chlamydia (BioMérieux Kit 3332/4). 41. Mycoplasma (BioMérieux Kit 1211/2). 43. Liquid nitrogen. )ماشین قایل برنامه ریزی نیترژن مایع ) machine.42 Liquid nitrogen programmable ماد )باید حداقل با پاساژ شده باشند

214 40. Cryo-vials سامانه همکشتی با استفاده از سللهای اتلگس رحمی 4( به این منظر در طل سیکل جنسی ماه قبل از انجام IVF در فاز لتئال از بافت اندمتریم رحم بیپسی به مقدار 48-43mG انجام میشد )رز چرخه تلید مثل(. سپس د انتخاب در پیش ر قرار دا: الف( بیپسی را به کمک DMSOمنجمد نمده ریه انجماد تضیح داده شده است سپس نمنه را در زمان استفاده یخگشایی نمده با تریپسین مخلط مینماییم )%1/23 در TCM بافر شده با HEPES غلظت استفاده شده 41 برابر غلظتی میباشد که برای الینهای ثابت سللی استفاده میشد(. کشت سللها در ظرف کشت باید 3 تا 3 رز پیش از آغاز کشت همزمان به انجام برسد. ب( بیپسی را بالفاصله با تریپسین مخلط نمده )%1/23 درHEPES ). از رش کالسیک با %1/23 تریپسین استفاده نمایید.کشت الیه سلل بعد از قرار دادن سللها در ظرف کشت انجام میشد. زمانی که سللها تمام سطح ظرف کشت را در برگرفتند کشت الیه تحت تاثیر تریپسین قرار گرفته سللها منجمد میشند. یخگشایی سللها کشت آنها در ظرف مربط به کشت ریانها 3 رز قبل از انجام کشت ریانها باید انجام شد.2( کشت الیه را نمیتان بیش از 2 تا 3 مرتبه م استفاده قرار داد. در حال حاضر در فرانسه احدهای IVF در حال استفاده از سیستم endocell که آماده بهره باری است استفاده مینمایند. ریه کامل تمامی ماد مصرفی در مقالهای جدا تضیح داده شده است )22(. منابع 4. Camous S, Heyman Y, Meziou W, Menezo Y. Cleavage beyond the block stage and survival after transfer of early bovine embryos cultured with trophoblastic vesicles. Journal of reproduction and fertility. 4891;02(2): Heyman Y, Ménézo Y, Chesné P, Camous S, Garnier V. In vitro cleavage of bovine and ovine early embryos: Improved development using coculture with trophoblastic vesicles. Theriogenology. 4890;20(4): Gandolfi F, Moor RM. Stimulation of early embryonic development in the sheep by co-culture with oviduct epithelial cells. Journal of reproduction and fertility. 4890;94(4): Goodeaux L, Voelkel S, Anzalone C. The effect of rhesus epithelial cell monolayers on in vitro growth of Rhesus embryos. Theriogenology 4898;38(490). 3. Bongso A, Soon-Chye N, Sathananthan H, Lian NP, Rauff M, Ratnam S. Improved quality of human embryos when co-cultured with human ampullary cells. Human reproduction. 4898;1(2): Bongso A, Ng SC, Fong CY, Anandakumar C, Marshall B, Edirisinghe R, et al. Improved pregnancy rate after transfer of embryos grown in human fallopian tubal cell coculture. Fertility and sterility. 4882;39(3): Ménézo Y, Hamidi J, Khatchadourian C, Nardon C. The Murine Prepuberal Oviduct Supports Early Embryo Development In Vitro. Development, Growth & Differentiation. 4898;34(2): Menezo YJ, Guerin JF, Czyba JC. Improvement of human early embryo development in vitro by coculture on monolayers of Vero cells. Biology of reproduction. 4881;12(2): Fanchin R, Ayoubi JM, Righini C, Olivennes F, Schonauer LM, Frydman R. Uterine contractility decreases at the time of blastocyst transfers. Human reproduction. 2114;42(2): Kolibianakis E. Day 3 embryo transfer does not enhance reproductive outcome compared to D 3 transfer using the current culture systems. Berlin; Kolibianakis EM, Zikopoulos K, Verpoest W, Camus M, Joris H, Van Steirteghem AC, et al. Should we advise patients undergoing IVF to start a cycle leading to a day 3 or a day 3 transfer? Human reproduction. 2111;48(44): Papanikolaou EG, Camus M, Kolibianakis EM, Van Landuyt L, Van Steirteghem A, Devroey P. In vitro fertilization with single blastocyst-stage versus single cleavage-stage embryos. The New England journal of medicine. 2112;331(44):

215 43. Ménézo Y, Chouteau J, Veiga A. In vitro fertilization and blastocyst transfer for carriers of chromosomal translocation. European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. 2114;82(2): Fauser BC. Preimplantation genetic screening: the end of an affair? Human reproduction. 2119;23(42): Veiga A, Sandalinas M, Benkhalifa M, Boada M, Carrera M, Santalo J, et al. Laser blastocyst biopsy for preimplantation diagnosis in the human. Zygote. 4880;3(1): Veiga A, Gil Y, Boada M, Carrera M, Vidal F, Boiso I, et al. Confirmation of diagnosis in preimplantation genetic diagnosis (PGD) through blastocyst culture: preliminary experience. Prenatal Diagnosis. 4888;48(43): McArthur SJ, Leigh D, Marshall JT, Gee AJ, De Boer KA, Jansen RP. Blastocyst trophectoderm biopsy and preimplantation genetic diagnosis for familial monogenic disorders and chromosomal translocations. Prenat Diagn. 2119;29(3): Fernandez-Gonzalez R, Moreira PN, Perez-Crespo M, Sanchez-Martin M, Ramirez MA, Pericuesta E, et al. Long-term effects of mouse intracytoplasmic sperm injection with DNA-fragmented sperm on health and behavior of adult offspring. Biology of reproduction. 2119;09(1): Papaioannou VE, Ebert KM. Development of fertilized embryos transferred to oviducts of immature mice. Journal of reproduction and fertility. 4892;02(2): Thibodeaux JK, Menezo Y, Roussel JD, Hansel W, Goodeaux LL, Thompson Jr DL, et al. Coculture of In Vitro Fertilized Bovine Embryos with Oviductal Epithelial Cells Originating from Different Stages of the Estrous Cycle. Journal of Dairy Science. 4882;03(2): Dale B, Menezo Y, Cohen J, DiMatteo L, Wilding M. Intracellular ph regulation in the human oocyte. Human reproduction. 4889;43(1): Scodras JM, Pollard JW, Betteridge KJ. Effect of somatic cell type on bovine embryonic development in co-culture. Theriogenology. 4884;33(4): Simizu B, Terasima T. Vero Cells: Origin, Properties and Biomedical Applications. Department of Microbiology, School of Medicine, Chiba University; Levenbook I, Petricciani J, Elisberg B. Tumorigenicity of Vero cells in VEROcells, origin, properties and BioMedical applications. Japan: Chiba university; Janny L, Menezo YJ. Evidence for a strong paternal effect on human preimplantation embryo development and blastocyst formation. Molecular reproduction and development. 4881;39(4): Janny L, Menezo YJR. Maternal age effect on early human embryonic development and blastocyst formation. Molecular reproduction and development. 4882;13(4): Menezo Y, Nicollet B, Herbaut N, Andre D. Freezing cocultured human blastocysts. Fertility and sterility. 4882;39(3): Ménézo Y, Veiga A. Cryopreservation of blastocysts. Gomel V, Leung P, editors. Vancouver: Monduzzi; Jayot S, Parneix I, Verdaguer S, Discamps G, Audebert A, Emperaire JC. Coculture of embryos on homologous endometrial cells in patients with repeated failures of implantation. Fertility and sterility. 4883;23(4): Simon C, Mercader A, Garcia-Velasco J, Nikas G, Moreno C, Remohi J, et al. Coculture of human embryos with autologous human endometrial epithelial cells in patients with implantation failure. The Journal of clinical endocrinology and metabolis m. 4888;91(9): Quinn P, Margalit R. Beneficial effects of coculture with cumulus cells on blastocyst formation in a prospective trial with supernumerary human embryos. Journal of assisted reproduction and genetics. 4882;43(4): Barmat LI, Liu H-C, Spandorfer SD, Xu K, Veeck L, Damario MA, et al. Human preembryo development on autologous endometrial coculture versus conventional medium. Fertility and sterility. 4889;01(2):

216 33. Barmat LI, Liu HC, Spandorfer SD, Kowalik A, Mele C, Xu K, et al. Autologous endometrial co-culture in patients with repeated failures of implantation after in vitro fertilization -embryo transfer. Journal of assisted reproduction and genetics. 4888;42(3): Mercader A, Garcia-Velasco JA, Escudero E, Remohí J, Pellicer A, Simón C. Clinical experience and perinatal outcome of blastocyst transfer after coculture of human embryos with human endometrial epithelial cells: a 3-year follow-up study. Fertility and sterility. 2113;91(3): Dominguez F, Gadea B, Mercader A, Esteban FJ, Pellicer A, Simon C. Embryologic outcome and secretome profile of implanted blastocysts obtained after coculture in human endometrial epithelial cells versus the sequential system. Fertility and sterility. 2141;83(3): e Turner K, Lenton EA. The influence of Vero cell culture on human embryo development and chorionic gonadotrophin production in vitro. Human reproduction. 4882;44(8): Menezo Y. Cryopreservation of IVF embryos: which stage? Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2111;443 Suppl 4:S Menezo YJ. Blastocyst freezing. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2111;443 Suppl 4:S Ménézo YJR, Chouteau J, Torelló MJ, Girard A, Veiga A. Birth weight and sex ratio after transfer at the blastocyst stage in humans. Fertility and sterility. 4888;02(2): MénéZo YJR, Veiga A, Pouly JL. Assisted reproductive technology (ART) in humans: Facts and uncertainties. Theriogenology. 2111;33(2): Menezo YJ, Sakkas D. Monozygotic twinning: is it related to apoptosis in the embryo? Human reproduction. 2112;40(4): Cassuto G, Chavrier M, Menezo Y. Culture conditions and not prolonged culture time are responsible for monozygotic twinning in human in vitro fertilization. Fertility and sterility. 2113;91(2): Guerin P, Menezo Y. Hypotaurine and taurine in gamete and embryo environments : de novo synthesis via the cysteine sulfinic acid pathway in oviduct cells. Zygote. 4883;3(1): Guerin P, El Mouatassim S, Menezo Y. Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings. Human reproduction update. 2114;0(2): Menezo YJ, Sakkas D, Janny L. Co-culture of the early human embryo: factors affecting human blastocyst formation in vitro. Microscopy research and technique. 4883;32(4): Kattal N, Cohen J, Barmat LI. Ro le of coculture in hu man in v itro fertilization: a metaanalysis. Fertility and sterility. 2119;81(1): Ouhibi N, Hamidi J, Guillaud J, Menezo Y. Co-culture of 4-cell mouse embryos on different cell supports. Human reproduction. 4881;3(2): Pryor WA, Stanley JP, Blair E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanis m for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 4802;44(3): Vlad M, Walker D, Kennedy RC. Nuclei number in human embryos co-cultured with human ampullary cells. Human reproduction. 4882;44(9): Carnegie JA, Morgan JJ, McDiarmid N, Durnford R. Influence of protein supplements on the secretion of leukaemia inhibitory factor by mitomycin-pretreated Vero cells: possible application to the in vitro production of bovine blastocysts with high cryotolerance. Journal of reproduction and fertility. 4888;440(4): Iwarsson E, Lundqvist M, Inzunza J, Ährlund-Richter L, Sjöblom P, Lundkvist Ö, et al. A high degree of aneuploidy in frozen-thawed human preimplantation embryos. Hum Genet. 4888;411(3): Kaufman RA, Menezo Y, Hazout A, Nicollet B, DuMont M, Servy EJ. Cocultured blastocyst cryopreservation: experience of more than 311 transfer cycles. Fertility and sterility. 4883;21(2): Nasr-Esfahani MM, Johnson MH. The origin of reactive oxygen species in mouse embryos cultured in vitro. Development. 4884;443(2): Pabon JE, Jr., Findley WE, Gibbons WE. The toxic effect of short exposures to the atmospheric oxygen concentration on early mouse embryonic development. Fert ility and sterility. 4898;34(3):

217 33. Martín-Romero FJ, Miguel-Lasobras EM, Domínguez-Arroyo JA, González-Carrera E, Álvarez IS. Contribution of culture media to oxidative stress and its effect on human oocytes. Reproductive biomedicine online. 2119;40(3): Kim YB, Ahn SH, Chang DY, Chung KN, Koh JW. Vero cell co-culture counteracts the detrimental effects of hydrosalpinx fluid on the development of mouse embryos in vitro. Journal of Korean medical science. 2112;40(2): Menezo Y, Jr., Russo G, Tosti E, El Mouatassim S, Benkhalifa M. Expression profile of genes coding for DNA repair in human oocytes using pangenomic microarrays, with a special focus on ROS linked decays. Journal of assisted reproduction and genetics. 2110;21(44): Kauma SW, Matt DW. Coculture cells that express leukemia inhibitory factor (LIF) enhance mouse blastocyst development in vitro. Journal of assisted reproduction and genetics. 4883;42(2): Fukui Y, Saito T, Miyamoto A, Yamashina H, Okamoto Y. Effect of human leukemia inhibitory factor on in vitro development of parthenogenetic bovine morulae. Theriogenology. 4881;12(0): Ptak G, Lopes F, Matsukawa K, Tischner M, Loi P. Leukaemia inhibitory factor enhances sheep fertilization in vitro via an influence on the oocyte. Theriogenology. 2112;23(8): Paria BC, Dey SK. Preimplantation embryo development in vitro: cooperative interactions among embryos and role of growth factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 4881;90(42): Paula-Lopes FF, Hansen PJ. Apoptosis is an adaptive response in bovine preimplantation embryos that facilitates survival after heat shock. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2112;283(4): Menezo Y, Hazout A, Dumont M, Herbaut N, Nicollet B. Coculture of embryos on Vero cells and transfer of blastocysts in humans. Human reproduction. 4882;0 Suppl 4: Menezo Y, Elder K, Benkhalifa M, Dale B. DNA methylation and gene expression in IVF. Reprod Biomed Online. 2141;21(2): Menezo Y, Dale B, Cohen M. DNA damage and repair in human oocytes and embryos : a review. Zygote. 2141;49(1): Ouhibi N, Benet G, Menezo Y. Fetal bovine oviduct epithelial cell monolayers : Method of culture and identification. Journal of Tissue Culture Methods. 4884;43(1):

218 فصل 43 سیستمهای کشت: کشت با فشار کم اکسیژن فشار اکسیژن در ایداکت اناع مختلفی از پستانداران م سنجش قرار گرفته است مقادیر اندازهگیری شده بین 3 تا 9/0 درصد بده است اما این مقادیر در ریز محیط جد در رحم کاهش مییابد به گنهای که در گا پرایمتها این مقدار به کمتر از 2 درصد تنزل مییابد. برای کشت ریان در انسان ریه لقاح برنتنی در سطح غیر فیزیلژی آن که معادل 21 درصد اکسیژن میباشد به قع میپیندد. این م برای مدت 31 سال گذشته صادق بده هماره م استفاده قرار میگرفته است. به هر ری مطالعات متعدد انجام گرفته در حیانات نشان داده است که سطح پایین اکسیژن نقش مهم فیزیلژیی در کاهش سطح خطرناک مخرب ROS در داخل سلل به عهده دا بیان ژن در ریان را نیز تحت تاثیر خد قرار میدهد همچنین این کاهش در مقدار اکسیژن به متابلیسم گلکز تسط ریان نیز کمک مینماید تکین ریان به بالستسیست را نیز ارتقا میدهد. اما مطالعات کلینیکی در زمینه نتایج ضد نقیضی را گرش نمدهاند. با این جد در تمام گرشها مقداری ارتقا مشاهده شده است چه در تکین ریان چه در نرخ النه گزینی. همچنین هیچ نع آثار مخربی با کاهش فشار اکسیژن گرش نشده است. به همین منظر آزمایشگاه IVF زیادی به استفاده از سطح پایین اکسیژن مبادرت رزیدهاند مقدمه تجهات در رزهای آغازین برنامه IVF همگی معطف به فراهم نمدن شرایطی برای کشت ریان بد که مشابه با شرایط مجد در ایداکت رحم باشد. این مسئله منتج به مجهز نمدن آزمایشگاههای IVF به انکباتر CO 2 شد این انکباترها شرایطی را فراهم میآند که منجر به کاهش فشار اکسیژن مجد در اتمسفر میشد. به هر ری نرخ به نسبت باالی آبستنی بعد از انتقال ریانها که با مفقیت در شرایط گازی اتمسفر تلید شده بدند )فشار نزدیک به 21 درصد اکسیژن( منتهی به این نتیجه شد که برخی از تجهیت تلید کننده شرایط کم اکسیژن دست کشیده از آنها ریگان شند همچنین به این سیله از هزینه افزده شده به هزینههای آزمایشگاه در فراهم نمدن گاز نیترژن نیز رهایی یابند. در نتیجه در 31 سال گذشته انکباترهای CO 2 با مقدار 3 تا 2 درصد از این گاز در آزمایشگاههای IVF به عنان ریه استاندا م تجه قرار گرفتند. تلد بیش از 3 میلین کدک حاصل از اجرای برنامه IVF در شرایط پرفشار اکسیژن بیش از پیش نشان داد که ریان- های انسان میتانند به خبی با غلظت اکسیژن مجد در اتمسفر هماهنگ شند. اما آزمایشهای ربه افیش به بررسی آثار سطح باال پایین اکسیژن بر تکین ریان پستاندار پاخته پیشنهاد نمدهاند که کاهش سطح اکسیژن در محیط کشت ریان میتاند مثر مفید اقع شد. همانطر که م بحث قرار گرفت مطالعات حیانی زیادی مشخص نمدهاند که کاهش سطح اکسیژن دارای اثرات مفید در کشت برنتنی ریان میباشد. کشت ریان در 3 درصد اکسیژن منجر به آغاز سریعتر الین دمین سمین تقسیم کلیاژ میشد باعث کتاهتر شدن مدت زمان چهارمین چرخه سللی نیز خاهد شد همچنین مقدار 203 سللهای آپپتز شده کاهش یافته در هر یک از مراحل رشد ریان درصد کمتری از مییسم به قع میپیندد تده سللی ICM تلید شده ضعیت بهتری داشته نرخ تفریخ بالستسیست ارتقا یافته تعداد بیشتری از ریانها به مرحله بالستسیت خاهند رسید تمام این نتایج در مقایسه با کشت ریان در شرایط گازی اتمسفر به دست آمده است. اما مطالعات کلینیکی که در انسان صرت پذیرفته است نتایج متناقضی را نشان داده است که کشت ریان انسان در شرایط فشار 3 درصد اکسیژن با فشار 21 درصد تفاتی در هیچ یک از این معیارها نداشته است. دلیل این نع از یافتهها همچنان ناشناخته باقیمانده است. بنابراین بررسیهای بیشتری در م سطح پایین اکسیژن تاثیر آن بر ریان انسان میبایست به انجام برسد. نکتهای که می بایست در ذهن به خاطر سپ این است که هیچ گرشی در م اثرات مخرب سطح پایین اکسیژن در کشت برنتنی mosaicism 242

219 ریان تاکنن ارایه نشده است. در این فصل به بحث بررسی پیرامن انتقال از ریه لقاح برنتنی کننی در انسان حیان از شرایط پرفشار اکسیژن به شرایط کم فشار خاهیم پاخت. بیشتر مطالعات شامل آن دسته از مطالعات میباشند که به بررسی این مضع از منظر فیزیلژی حیانات پاخته است که به فشار اکسیژن مجد در ایداکت رحم این حیانات اشاره دا همچنین داده هایی در ارتباط بین مسیرهای متابلیک متفات در ریان گرادیان اکسیژن در دستگاه تلید مثل ماده پاخته است. با تجه به تمام مباحث مطرح شده که از مطالعات ری حیانات به دست آمد است به دلیل احتیاط در مقابل هر نعی از آثار مخرب محیطی بر ری تکین کدک که تاکنن کشف نشده است شمار رز افزنی از آزمایشگاهها هم اکنن ربه استفاده از سیستم کشت کم فشار اکسیژن آهاند. در آخرین قسمت این فصل جنبههای تکنیکی متعدد انتخابهای ممکن برای فراهم نمدن شرایط کشت کم اکسیژن در یک آزمایشگاه IVF شرح داده شده است غلظت اکسیژن در محیط فیزیلژی ریان پیش از النهگزینی فشار اکسیژن اندازهگیری شده در ایداکت گنههای متعددی از پستانداران فشاری معادل 33 تا 21 میلیمتر جیه را نشان میدهد که معادل 3-9/0 درصد فشار اکسیژن میباشد. در خرگش همستر غلظت اکسیژن مجد در رحم در محددهای مشابه با همین مقدار در ایداکت این د گنه میباشد اما مقدار اکسیژن در زمان قع النه گزینی به حدد 3 تا 3 درصد کاهش مییابد. فشار اکسیژن «در ایداکت میمن رسس در دامنه مذکر )3-9/0 درصد( میباشد درحالی که سطح اکسیژن مجد در رحم به 4/3 تا 2 درصد کاهش مییابد )4(. سطح باالتر اکسیژن در ایداکت در مقایسه با رحم پیشنهاد میکند که ریان از یک محیط با شیب کاهشی غلظت اکسیژن عبر مینماید به منطقهای با پایینترین مین اکسیژن در مرحلهای از تکین خد خاهد رسید که به آن مرحله مرال میگییم. در حقیقت زمانی که ریان در حال آغاز مرحله متراکم شدن در مرحله مرال می- باشد به کم فشارترین ناحیه دستگاه تلید مثلی از نظر اکسیژن رسیده است. این اتفاقات مصادف با تغییرات در مسیرهای متابلیک تغییر در ترجیحات ریان از ابستگی به فسفریالسین اکسیداتی برای تلید انرژی در مرحله پیش از متراکم شدن به ابستگی ربه افیش به تلید ATP به اسطه گلیکلیز در مرحله پس از تراکم ریان میباشد )2 3(. در انسانها تجهات 201 بیشتری معطف به گاز تنفسی در بافت جفت-رحم در دره آغازین آبستنی بده است گرشات نشان دادهاند که فشار اکسیژن در مایعات مجد در حفرههای بدن در نزدیکی 2/2 درصد )21 میلیمتر جیه( کمتر از 2 درصدد )43-49 میلیمتر جیه( در مایع آمنیتیک میباشد )1(. مطالعات بسیار اندکی به بررسی فشار اکسیژن در حفره رحم در زنان غیر آبستن پاخته است )3 2(. از الین مطالعه در این زمینه گرش شد که فشار اکسیژن در رحم انسان در حدد 2 درصد میباشد. فشار اکسیژن داخل رحمی در دمین مطالعه در سطح اندمتریم رحم در 24 بیمار در زمان لقاح مصنعی اندازه گرفته شد. فشار اکسیژن در هر ف به طر معنیداری با سایرین متفات بد لی میانگین آن در حدد 2 درصد تعیین شد )49/8 میلیمتر جیه(. در برخی از زنان نسانات مرتبط با زمان یا نسانات ریتمیک نیز مشاهده شده بدکه میتانست با رفتارها حرکت شبه مجی اندمتریم ارتباط داشته باشد. تاکنن هیچ مطالعهای که به دقت مین اکسیژن ایداکت انسان را اندازهگیری که باشد به انتشار نرسیده است. اسیت اگرچه مقدار اکسیژن حل شده در مایع فلیکلی به طر منفی با دفعات قع ناهنجاریهای کرمزمی سیتپالسمی اسیت مرتبط میباشد )0( همچنان نامشخص است که فشار پایین اکسیژن در زمان بلغ برنتنی اسیت مفید میباشد یا اثر خاصی نخاهد داشت. بسیاری از محققین گرش نمدهاند که غلظت اکسیژن در خن سیاهرگی تخمدان نزدیک به 0 درصد )14 میلیمتر جیه( میباشد مقدار داخل فلیکلی اکسیژن در خک معادل 9 درصد )34 میلیمتر جیه( میباشد )9( این مقادیر در انسان نیز صادق میباشد )8(. به هر رری یافتههای متضادی در م مصرف اکسیژن در داخل فلیکل تا کنن به uteroplacental 249

220 دست آمده است. در یکی از تحقیقات صرت گرفته در این زمینه بیان شده است که بیشتر این مقدار اکسیژن تسط الیه بیرنی گرانل م مصرف قرار میگی در نتیجه اسیت در شرایط کم اکسیژنی قرار دا )41( درحالی که در مطالعات دیگر پیش بینی شده است که سلل های کملس نیاز زیادی به اکسیژن ندارند مقدار عمده اکسیژن برای استفاده تسط اسیت در دسترس این سلل قرار دا )44( مصرف اکسیژن ریانها ریان تس ط مایع ایداکتی یا مایع داخل رحم دربرگرفته شده است این مایع در حقیقت فراهم کننده ماد مغذی م نیاز برای رشد ریان می باشد همچنین اکسیژن م نیاز برای ادامه حیات رشد ریان نیز از طریق همین مایعات برای ریان فراهم میشد. عمده فعالیت ریان ابتدایی در زمان تقسیمات سللی الیه تلید متابلیک انرژی فعال نمدن ژنم میباشد. درخالل این مرحله ریان از تنفس هازی به منظر بدست آن اکسیژن م نیاز برای اکسیداسین ماد انرژی از جمله پیرات اسیدهای آمینه استفاده مینماید. زمانی که ریان آغاز به رشد نم مینماید شرع به استفاده از فسفریالسین اکسیداتی گلیکلیز هازی نمده تا به نیازهای انرژی خد پاسخ دهد )2 42(. تلید ملکلهای حای انرژی ATP در مرحله تراکم بالستمرها در زمان تشکیل بالستسیست افیش مییابد همچنین انرژی تلید شده متابلیسم فعال ریان برای ساخت پرتئینها سیستم انتقا ینی م استفاده قرار میگی )43(. Byatt-Smith همکاران مدلی را پیشنهاد نمدند که به اسطه آن مدل مشخص شد که ریان کچک مش تانایی حفظ فرایند فسفریالسین اکسیداتی با مقدار 3 درصد اکسیژن را دارا میباشد. اما ریانهای بزرگ )انسان گا( در مراحل بعدی رشد نم خد یک گرادیان اکسیژن در ریان ایجاد مینمایند 203 به نعی که در مرکز ریان شرایط کم اکسیژن برقرار میباشد. مطالعاتی در تایید این مدل نشان دادهاند که 2 درصد اکسیژن بسیار کم بده به نعی غلظت آسیب رسان برای ریان مش پس از متراکم شدن بالستمرها به حساب میآید )42 43( اما این غلظت برای بالستسیست گا مناسب میباشد )40(. ریان اکسیژن م نیاز خد را به اسطه انتشار غیرفعال به دست می- آ. نرخ این نع از انتشار به اسطه فشار اکسیژن مجد در فاز گازی احاطه کننده ریان قابلیت انحالل اکسیژن در محیط الیه مرزی پیرامن ریان نرخ انتتشار اکسیژن در فضای سیتپالسم کنترل میشد. انتشار از طریق الیهای از رغن به نظر نمیرسد که محدد کننده نرخ انتشار باشد )49(. اکسیژن داخل میتکندری در ریه فسفریالسین اکسیداتی مصرف میشد نرخ مصرف اکسیژن ابسته به غلظت اکسیژن مجد در محیط پیرامنی ریان میباشد همچنین این نرخ با مین فراهمی ماد م نیاز برای فسفریالسین اکسیداتی ترکیبات آنزیمی میتکندری ارتباط ابستگی مستقیم دا. در ریان مش بیش از 01 درصد از اکسیژن به اسطه فسفریالسین اکسیداتی در مرحله بالستسیست مصرف شده کمتر از 31 درصد آن در مرحله 2 تا 1 سللی م استفاده قرار میگی )48(. الیه ترفکتدرم به طر معنیداری مقادیر بیشتری از اکسیژن را م استفاده قرار می- دهد در نتیجه این الیه مقادیر بیشتری از ATP را تلید نمده در مقایسه با ICM دارای تعداد بیشتری میتکندری میباشد. به نظر میرسد که سرنشت عمده ATP تلید شده تسط الیه ترفکتدرم استفاده در پمپ سدیم-پتاسیم- ATPase باشد که در غشا کناری سللهای ترفکتدرم قرار دارند. سللهای پرتان ICM متابلیسم خامشی از خد نشان میدهند )21( اسیت نرخ تنفسی اسیت انسان در دامنه 1/3 تا 4/4 نانلیتر بر ساعت قرار دا برای ریان انسان در رز 4 تا رز 3 نرخ تنفسی بین 1/2 تا 1/0 نانلیتر در ساعت مشخص شده است )24(. اندازهگیریهای کمی نشان دادهاند که مصرف اکسیژن در ریان ابتدایی گا بالستسیت به ترتیب 1/39 نانلیتر بر ساعت 4/3 نانلیتر برساعت میباشد که تقریبا نرخ مصرف اکسیژن anoxia basolateral membrane pluripotent 241

221 بالستسیست با این حساب 3 تا 1 برابر ریان الیه میباشد )22(. در سیستم گای بالستسیست با نرخ بسیار باال یا نرخ بسیار پایین مصرف اکسیژن زنده نخاهند ماند )23(. بیشینه مصرف اکسیژن در زمان لقاح قبل از تقسیمات کلیاژ مشاهده میشد.)21( تلید گنه اکسیژن فعال (ROS) یکی دیگر از استداللهای منطقی برای استفاده از فشار پایین اکسیژن این نکته است که اکسیژن از طریق تلید ROS میتاند برای سللها از جمله سللهای ریان سمی بده به آنها آسیب ا نماید. ROS از منابع متعددی قابلیت تلید دا منبع درندی ROS هماره ROS به عنان یک محصل جانبی در رندهای متابلیسم هازی تلید میشد. ممکن است ROS از متابلیسم ریان تلید شد / یا از محیط پیرامنی تلید در دسترس ریان قرار بگی. ROS با منشا درندی معمال در زمان احیا اکسیژن در میتکندری تلید میشد. انتقال الکترن از اکیاالن احیا کننده ) 2 (NADH-FADH به اکسیژن به اسطه اناع متفاتی از کتازها در زنجیره تنفسی میتکنریایی به انجام میرسد. این ریه معمال به اسطه ملکلهای سبک زن با منشا درندی یا با منشا برندی مانند ترکیبات آهن دار کاتالیز میشد. بسته به تعداد الکترن م نیاز برای احیای اکسیژن اناع متفاتی از گنه فعال اکسیژن تلید میشند. ازجمله رادیکالهای سپراکسید آنین( (O 2 تک الکترن پراکسید هیدرژن ) 2 H) 2 O د الکترن رادیکال هیدرکسیل (OH) سه الکترن )23(. به همراه دیگر اتمها یا ملکلها رادیکالهای دیگر می تانند به طر تصادفی تلید شند از جمله میتان به رادیکالهای آلککسیل یا پرکسیل در لیپیدها اشاره نمد )22( منابع برندی ROS منابع برندی ROS در شرایط فیزیلژی مایع فلیکلی یا مایع ایداکت رحم میباشند. اسیتها ریان در شرایط برنتنی کشت درن محیط کشت هماره در معرض محیطی قرار دارند که میتاند منبع ROS باشد. مشخص شده است که محیطهای کشت تجاری با نرخهای متفاتی به تلید ROS مبادرت میرزند نرخ تلید ROS در هر محیط کامال ابسته به ترکیبات مجد در آن محیط میباشد درحالی که مایع فلیکلی با سرعت بسیار کمتری به تلید ROS میپازد )20(. در مقایسه با اسیتهای تلید شده در شرایط درنتنی سطح باالتری از آسیبهای غشایی کاهش در ذخایر گلتاتین سیتپالسمی در اسیتهایی که در شرایط برنتنی کشت میشند به چشم میآید )20(. در شرایطی که محیط کشت در معرض نر قرار بگی بافر مجد در محیطهای کشت یا سایر ملکلهای مجد در محیطهای کشت که به نر حساس می- باشند قابلیت تلید ) _2 ROS O) را دارا میباشند. از جمله اج محیط کشت که دارای چنین یژگیهایی میباشد میتان به 291 فالینها )29( اشاره نمد که خشبختانه جز اج معمل م استفاده در محیطهای کشت تجاری ریان که امرزه تلید میشند نمیباشند. نمکهای آهن یا مس در محیطهای کشت درحالی که در معرض غلظتهای باالی اکسیژن که در شرایط گازی اتمسفر مجد است قرار بگیرند نیز تانایی تلید ROS را دارا میباشند. زمانی که H 2 O 2 با ینهای فلزی به یژه آهن مس اکنش نشان دهد گنه بسیار فعال سمی ROS را تلید نمده که همان - OH تک الکترنه میباشد )23(. در سرم یا مکملهای سرم که به کرات برای حمایت حفاظت از سلل در محیطهای کشت مصرف میشد فعالیتهای متنع اکسیدازی به قع پیسته بنابراین میتانند تلید کننده ROS باشند )23(. alkoxyl peroxyl flavins 245

222 1-43. اثرات مخرب ROS بر سلل تغییرات میتکندریایی تلید ROS در میتکندری میتاند منجر به ا آمدن آسیبهای اکسیداتی به پرتئینهای میتکندری غشا DNA میتکندری شد )28(. 2 Hمیتاند 2 O به آسانی از غشا میتکندری عبر نماید درحالی که -2 O تک الکترنه تانایی عبر از غشا را نداشته اما میتاند از کانالهای ینی عبر نمده اکثر اناع ملکلهای مجد داخل سلل از جمله لیپیدها پرتئینها اسیدهای نکلئیک در سیتپالسم را دچار تغییر نماید )31(. استرس اکسیداتی همچنین میتاند منافذ انتقتا میتکندری را بازنماید. در نتیجه این اتفاق از دست دادن تجمعی ینها متابلیتها از ماتریکس میتکندری به قع میپیندد که منجر به تغییرات میتکندری تقف سللی ریان تخلیه ذخایر ATP فعال شدن سازکار آپپتتیک سلل شد )34(. به عاله آسیبهای میتکندریایی میتاند باعث تغییر عملک میتکندری در چرخه تریکربکسیلیک اسید اکسیداسین اسیدهای چرب چرخه اره متابلیسم اسیدهای آمینه دیگر اکنشها شد )32( پرتئین ها لیپیدهای غشایی ROS ها مانند H 2 O 2 میتانند آثار مخربی بر لیپیدهای غشایی از طریق پراکسیداسین لیپیدی اعمال نمایند. پراکسیداسین لیپیدی به صرت یک اکنش زنجیرهای به قع میپیندد با فسفلیپیدهای پیرامنی در غشا سیتپالسمی اکنش میدهند )33(. این اقعه میتاند پایداری یا نفذپذیری غشا را تحت تاثیر خد قرار دهد. تقف ریان مش در مرحله 2 سللی در ارتباط با افیش در پراکسیداسین لیپیدی میباشد )31(. فرایند استرس اکسیداتی باعث افیش نرخ تشکیل پیندهای دیسلفیدی در پرتئینهای داخل سللی میشد. نشان داده شده است که ROS نسبت گلتاتین به گلتاتین دیسلفید را برهم میزند )33(. بهعاله ROS به کرات مجب غیرفعال شدن بسیاری از آنزیمها میشد )32(. از جمله دیگر اشکاالت ایجاد شده به اسطه ROS میتان به تجمع اج اسکلت سللی فشه شدن شبکه آندپالسمی اشاره نمد )30(. DNA استرس اکسیداتی ازجمله استرسهایی که به اسطه رادیکالهای هیدرکسیل ایجاد میشند باعث القا قطعه قطعه شدن DNA سلل میشد )39 28(. اکسیداسین قند داکسی ریبز DNA باعث ایجاد شکست در تک رشته DNA میشد )38(. اگر این شکست در تک رشته DNA در زمان رنیسی ایجاد شد در ننتیجه یک شکست غیرقابل برگشت در د رشته 294 DNA میتاند اتفاق بیافتد )11(. شکست تک رشته DNA همچنین در زمانی که جفت شدن اشتباه بازها در DNA در هنگام هنگام پلیمریسین DNA ایجاد میشد نیز قابل مشاهده است. برای مثال 9-oxiso-guanine یکی از محصالت اکسیداسین گانین میباشد میتاند به اشتباه با آدنین جفت شد )14(. DNA میتکندریایی نیز به طر یژهای در مقابل آسیبها حساس میباشد دلیل این آسیبپذیری نداشتن هیستنهای محافظت کننده میباشد. به همین دلیل افیش نرخ متاسین در DNA میتکندریایی قابل مشاهده است در نتیجه آنزیمهای فسفریله کننده ناهنجار به اسطه DNA میتکندریایی کد تلید میشند )12( آثار ROS بر ریان پستانداران در شرایط برنتنی ROS در رند تکین ناقص ریان پستانداران در شرایط برنتنی دخیل میباشد )13(. برخی تقفهای تکینی از جمله تقف ریان مش در مرحله 2 سللی به فعالیتهای ROS مرتبط میباشد )31(. اگرچه متابلیسم اکسیژن در مرحله بالستسیست به شدت فعال میباشد در معرض ROS قرار گرفتن اسیت در مرحله بلغ اسیت میتاند تکین ریان را دچار اختالل نماید )11(. در کنار این آثار مخرب قطعه قطعه شدن DNA در پی آن شکست غیر قابل برگشت د رشته DNA که misprinting 246

223 به اسطه ROS ایجاد می شند ممکن است در ریان در مراحل ابتدایی تکین افیش یابد دلیل این اتفاق رنیسی بسیار سریع فعال DNA دراین مرحله میباشد. تمام آسیبهایی از این قبیل که به سیله ROS به سلل ا میشند منجر به برز ناهنجاری در رند تکین ریان میشند که میتانند به صرت بالستمرهای نامسای یا سرعت پایین تقسیم سللی در مرحله کلیاژ یا تقف تکین ریان برز نمایند )13(. بهعاله H 2 O 2 که گنهای از ROS میباشد یکی از عمده اسطههای آپپتزیس همچنین قطعه قطعه شدن سیتپالسم مرتبط با مرگ برنامه ریزی شده سللی در بالستسیست به حساب میآید )12(. ارتباط بین آپپتزیس قطعه قطعه شدن سیتپالسم کامال مشخص شده است )13(. میبایست ذکر شد که ROSمی- تاند برای سلل بسیار مهم باشد. غلظتهای پایین غیر سمی ROS تانایی القا عملکها ی سللی از طریق مسیرهای پیام رسانی داخلی سللی به اسطه تغییر در ضعیت کس را دارا میباشد )10(. پالس بسیار کچکی از H 2 O 2 که به ریان گا ا شده است تانایی آن در تکین به بالستسیست را ارتقا میدهد )19(. تفریخ ریان مش نیز در ارتباط با افیش در تلید ROS میباشد )18(. ROS از جمله H 2 O 2 میتانند تنظیمات بیان ژن را نیز تحت تاثیر قرار دهند شاید بتان ذکر نمد که برای بیان ژن الزم باشند اما تنظیم بسیار دقیق مقدار آن تسط اکسیدازها به نظر مهم میباشد )23(. فعالیت این آنزیمهای تنظیم کننده از جمله NADPH اکسیداز نتین اکسیداز ابسته به غلظت اکسیژن مجد در محیط میباشد )28 31( محافظت در مقابل ROS مکانیسمهای محافظتی در برابر ROS در اسیت ریان اسیتها ریانها دارای سازکارهای درندی برای مبارزه با مقادیر باالی ROS هستند این مکانیسمها شامل فعالیت سپراکسید دسمتاز (SODs) کاتاالز پراکسیدازها میباشد. این آنزیمها با عنان به دام اندازندههای اکسیژن شناخته میشند. اسیت آد شده از فلیکل ریان الیه از نظر این آنزیمها غنی میباشند به یژه سپراکسید دسمتاز دارای 2- H O میباشد. سپس فراانی بسیار باالیی در این د سلل میباشد )34(. نقش محافظت کننده دسمتاز مربط به تبدیل به 2 O 2 کاتاالز پراکسیداز H 2 O 2 را به H 2 O O 2 تبدیل مینمایند.)32( سازکارهای حفاظتی علیه ROS در سامانه کشت ریان حفاظت از ریان اسیت در زمان کشت برنتنی به اسطه رشهای متعددی قابل اجرا میباشد. بدن شک یکی از بهترین رشها جلگیری از تشکیل ROS در محیط کشت ریان میباشد. به منظر جلگیری از تلید ROS در اسیت یا 292 ریان میبایست از همکشتی اسیت ریان به همراه بقایای سللی لکسیتها اسپرمهای مه که به عنان عمده تلید کنندگان ROS به حساب میآیند ممانعت به عمل آریم )31 33(. همچنین نشان داده شده است که جدانمدن سللهای مه قطعات سیتپالسمی که یکی از منابع احتمالی ROSمیباشند میتاند تانایی تکین ریان را ارتقا ببخشد )33(. یک دیگر از نکات بسیار مهم این است که از در معرض نر قرار دادن محیط کشت رغن پارافین به جدیت پرهیز شد )32( زیرا این امر میتاند باعث افیش H 2 O 2 در محیط کشت شد. آثار مخرب نر مرعی پراکسید هیدرژن ری ریانها میتاند به اسطه کاهش غلظت اکسیژن در فضای انکباتر کاهش یابد )30(. از دیگر رشهای م استفاده در کاهش محتای ROS میتان به زددن ماد بقایای مخرب از محیط کشت اشاره نمد. بسیاری از محیطهای کشت IVF حای غلظتهای متفاتی از آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی از جمله یتامین E C A پیرات اج دارای سلفر مانند گلتاتین سیستامین تائرین هایپتائرین میباشند. همچنین بسیاری از محیطهای کشت دارای کیالت کنندههای فلت مانند EDTA بده که میتانند به حفاظت سلل در برابر پراکسیداسین لیپیدی آسیبهای DNA کمک نماید. در نتیجه بدیهی است که محیطهای کشت تجاری متفات به مقدار زیادی از نظر تانایی محافظتی در برابر استرس اکسیداتی بر اساس محتایات مجد در آنها بایکدیگر متفات باشند )20(. یکی دیگر از راهکارها به منظر کاهش آثار مخرب اکسیژن بر ریانها در مدت کشت در شرایط برنتنی این است که ریانها را در شرایط کم فشار از نظر اکسیژن مشابه با آنچه که در دستگاه تلید مثل ماده جد دا نگهداری debris 247

224 نماییم. کشت ریان پستانداران در شرایط فشار اتمسفر اکسیژن مشخص نمده است که مقدار باالتری H 2 O 2 به ای هر ریان در مقایسه با شرایط کشت کم اکسیژن تلید مینماید )38 39(. 39 محققان در این ارتباط گرش نمدهاند که کاهش درمحتای H 2 O 2 در ریانها مرتبط با کاهش در قطعه قطعه شدن DNA است. مشابه چنین اتفاقی در اسیتهایی که در شرایط کم فشار اکسیژن بالغ شدهاند نیز مشاهده میشد. در حقیقت چنین اسیتهایی مقادیر کمتری H 2 O 2 در مقایسه با اسیتهایی که در شرایط پرفشار اکسیژن کشت داده شدهاند تلید مینمایند )21(. هنز امکان پذیر نمیباشد که نتیجه گیری نماییم که تلید ROS در شرایط گازی مشابه اتمسفر عامل اصلی تکین ضعیف ریان در شرایط برنتنی میباشد اکسیژن کم کنترل کننده بیان ژن سلل های پستانداران از سازکارهای متعددی به منظر تشخیص دادن مقدار اکسیژن تنظیم بیان ژن استفاده می- نمایند. Rinaudo همکاران )24( نشان دادند که نسانات معنی داری در الگی بیان ژن ریانهای مش کشت داده شده در شرایط گازی دارای 21 درصد اکسیژن به قع میپیندد. به هرری افیش در بیان ژنهای کد کننده آنتی اکسیدانها در شرایط دارای 21 درصد اکسیژن مشاهده نشده است. نتایج مشابهی تسط Harvey همکاران )22( برای ریانهای گا گرش شده است. همچنین اکسیژن به عنان تنظیم کننده بیان ژنهایی شناخته شده است که به اسطه فاکترهای القا شده تسط هایپکسی (HIFs) بیان میشد این فاکترها پرتئینهای متصل شنده به DNA هستند که از د زیر احد تشکیل شدهاند. یکی از زیراحدها فقط در شرایط کم فشار اکسیژن پایدار میباشد. در شرایط کم فشار اکسیژن HIFs فعال کننده ترجمه بسیاری از ژنها میباشند که مسئل تنظیم متابلیسم ریانها در مراحل پیش از پس از النه گزینی همچنین تنظیم کننده تکین ریانها میباشند )23 24(. بهعاله غلظت اکسیژن استفاده شده در زمان کشت ریان در شرایط برنتنی ممکن است که الگی بیان ژن ریان را تحت تاثیر قرار دهد. نشان داده شده است که کاهش به نسبت اندکی در مین اکسیژن از 0 به 2 درصد میتاند اثرات معنی داری بر بیان ژنهایی که در تنظیم متابلیسم ریان در مراحل پیش پس از النه گزینی دخیل میباشند همچنین در رند تکین ریان مش اعمال نماید )42(. مشابه همین نتایج کاهش در مقدار اکسیژن از 0 درصد در مرحله پیش از متراکم شدن به 2 درصد در مرحله بعد از متراکم شدن بالستمرهای ریانهای گا منجر به تغییرات تنظیمی ابسته به اکسیژن در بیان ژنها برای بسیاری از پرتیینها شامل پرتئینهای مجد در ICM پرتئینهای دخیل در متابلیسم گلکز شده است. به عنان نتیجه افیش معنیداری در نسبت سللهایی که در تشکیل ICM دخیل خاهند بد در فشار اکسیژن زیر 2 درصد به قع میپیندد که این تغییر در نسبت سللی در قیاس با اکسیژن 0 درصد بسیار مشهدتر میباشد )22(. در مطالعهای که ری الگی بیان کل ژنم ریان مش به انجام رسید مشخص شد که الگی مشابهی در ریانهایی که در شرایط درن تنی تکین یافته بدند با ریانهایی که در شرایط برنتنی با مقدار اکسیژن زیر 3 درصد تکین یافته بد قابل استخراج میباشد. به هر ری ژنهای متعددی که در رشد نگهداری سلل دخیل میباشند ژنهایی که مسئل قع گاسترالسین میباشند در زمانی که ریانها در شرایط دارای اکسیژن 21 درصد کشت شدهاند دچار اختالل در تنظیم بیان میشند )24(. نیسندگان این مقاله همچنین بیان نمدهاند که اثر محیطهای کشت متفات ری الگی کلی بیان ژن در مقایسه با اثر غلظتهای متفات اکسیژن بسیار ناچیز میباشد )24( ریان های حیانات تکین یافته در فشار اکسیژن کم در مقابل فشار اکسیژن باال بسیاری از دانشمندان آثار تغییرات در سطح اکسیژن مجد در فضای انکباتر کشت ریان بر تکین ریان پیش از النه گزینی را م بررسی قرار دادهاند. در یکی از الین گرشها در سال 4809 نشان داده شد که کشت بالستسیست مش در فشار اکسیژن 21 درصد منجر به تشکیل تعداد کمتری بالستمر در مقایسه با بالستسیستهایی که در شرایطی که فشار اکسیژن 3 درصد بد دارا میباشند. همچنین نرخ تشکیل بالستسیست به صرت خطی با افیش غلظت اکسیژن از 223 درصد تا 21 درصد کاهش یافته بد )21(. در مطالعهای مشابه در ریانهای گا گسفند که در غلظتهای متفات اکسیژن از 2 تا 21

225 درصد کشت داده شده بدند باالترین نرخ تشکیل بالستسیست در هر د گنه در شرایط دارای 0 تا 9 درصد اکسیژن تلید شده بد. همچنین این بالستسیستها در مقایسه با ریانهایی که از سایر گرههای آزمایش به دست آمده بدند بیشترین تعداد سلل را دارا بدند این نتایج درحالی به دست آمد که استفاده از شرایطی که مقدار اکسیژن آن 1 درصد بد بسیار مخرب آسیب رسان به ریان بد )23(. حتی در معرض قرار دادن ریان برای مدت کتاهی مثال 4 ساعت در شرایط حای 21 درصد اکسیژن در آغاز کشت مشخص شد که بسیار مخرب آسیب رسان برای رشد تکین ریان بعد از مرحله مرال به حساب میآید )23(. دیگر مطالعات در زمینه تغییرات مقدار اکسیژن فقط به بررسی تاثیر مقادیر 3 21 دصدی اکسیژن ری تکین ریان گنه- های مختلف پاختهاند. مطالعات انجام شده تسط گرههای مختلف نشان داده است که کشت در شرایط کم اکسیژن منجر به ارتقا تکین بالستسیست در مش )22-29( همستر )28 30( رت )01( خرگشها )04( گاها )02 02( بز )00( خک )38( میشد. ارتقا در تعداد سللهای ریان در بسیاری از گنهها در پاسخ با فشار کم اکسیژن مشاهده شده است ) (. 04 مطالعات دیگر نشان دادهاند که آثار مفید دیگری نیز از کاهش فشار اکسیژن در کشت ریان برز خاهد نمد. ریان- هایی که در مقدار اکسیژن %3 کشت داده میشند تقسیمات ال دم سم در مرحله کلیاژ را سریعتر آغاز مینمایند )29(. همچنین این ریانها دارای چرخه سللی کتاهتری برای چهارمین چرخه )تقسیم( از خد برز میدهند )08( همچنین این نع از ریانها دارای تعداد کمتری از سللهای آپپتز شده میباشند )09( از طرف دیگر این ریانها کمترین مین از پدیده mosaicism را در هر یک از مراحل تکین ریان از خد نشان میدهند )91( دیگر نکته مفید مشاهده شده نسبت ICM بهتر میباشد که در قیاس با ریانهای کشت شده در شرایط پرفشار اکسیژن قابل بیان است )94( همچنین سازماندهی ICM نیز در این ریانها بهتر است )92( این ریانها بالستسیستهایی تلید مینمایند که نرخ تفریخ باالتری را برز میدهند )09(. در مقابل برخی از مطالعات انجم شده بر ری ریانهای مش )93( گربه )91( گا نتانستهاند تفات در نرخ تکین بالستسیست تحت فشارهای متفات اکسیژن را نشان دهند )93 92(. برخی از این نسانها ممکن است که مرتبط با با گنه مش م استفاده در آزمایشها یا تفات در ترکیب محیطهای کشت استفاده شده در مطالعات متفات شامل محتای کیالت کنندههای ینهای فلزی مانند BSA EDTA باشد )90(. همچنین گرش شده است که متابلیسم اکسیداتی گلز به طر معنیداری به اسطه کاهش در غلظت اکسیژن از 21 به 3 درصد در مرال بالستسیست مش افیش مییابد )99(. اگرچه اغلب مطالعات نشان دهنده افیش در حداقل یکی از فراسنجههای مرتبط با تکین ریان به اسطه استفاده از غلظتهای پایین اکسیژن میباشند اما غلظت بهینه اکسیژن برای انجام رند لقاح برنتنی هنز مشخص نشده است. نیسندگان د مقاله پژهشی یکی با محریت استفاده از مدل حیانی )گا( دیگری با محریت استفاده از مدل انسانی نشان دادند که نرخ لقاح برنتنی در شرایط کم اکسیژن در مقایسه با نرخ لقاح برنتنی در شرایط گازی مشابه اتمسفر پایینتر میباشد )98 02( این نتایج پیشنهاد کننده این نکته است که شاید لقاح برنتنی فرایندی میباشد که نیاز به فشار به نسبت باالی اکسیژن را دارا می- باشد. در مقابل این د مطالعه Thompson همکاران )40( گرش نمدهاند که مرحله بعد از متراکم شدن ریان گا با کاهش فشار اکسیژن از 0 درصد به در مرحله پیش از تراکم به 2 درصد در دره بعد از تراکم رند تکینی بهتری را از خد نشان می- دهند )40(. چنین شیب غلظتی اکسیژن در خالل کشت برنتنی ریان میتاند منجر به تقلید از شرایط اکسیژنی مجد در دستگاه تناسلی ماده شد همانطر که فشار اکسیژن در ایداکت باالتر از فشار اکسیژن در رحم مجد ماده میباشد. مطالعات بیشتری به منظر بررسی چنین فرضیه م نیاز میباشد تاثیر غلظت اکسیژن بر ری بلغ برنتنی اسیت حیانات مطالعات متعددی نشان دهنده اثرات مفید کاهش غلظت اکسیژن از %21 به %3 برای بلغ برنتنی اسیت میباشد درحالی که دیگر مطالعات نتایج نقض کننده این مشاهدات را نشان دادهاند. فشار کم اکسیژن منجر به برز نسبت بهینه سرعت زمان برای الین تقسیم در رند کلیاژ در مقایسه با فشار 21 درصدی اکسیژن میشد. اما تکین به مرحله بالستسیست بد چشمگیری نداشته است )98(. غلظت اکسیژن در زمان IVM تاثیری ری بلغ برنتنی اسیت لقاح برنتنی کلیاژ تکین 243

226 بالستسیست النه گزینی تعداد ریانهای زنده نشده است. به هر ری زن ریان در پی بلغ برنتنی اسیت در فشار 3 درصد اکسیژن در مقایسه با فشار 21 درصدی اکسیژن کاهش معنی داری از خد نشان میدهد )81(. تکین بالستسیست خک )84( گا )82( در شرایطی که IVM در شرایط فشار اکسیژن مشابه اتمسفر به انجام رسیده است در قیاس با فشار کم اکسیژن مناسبتر بده است. در مقابل این نتایج برخی مطالعات گرش کننده نتایج مفید IVM در شرایط کم فشار اکسیژن از منظر نرخ تکین بالستسیست در خک )83 81( مش )83( اسیت گا بدهاند. از تمام نتایج ضد نقیض مطرح شده میتان اینگنه نتیجهگیری نمد که هنز اجماع در م غلظت بهینه اکسیژن حاصل نشده است. تا به امرز هیچ دادهای به انتشار نرسیده است که به نتایج تاثیر غلظتهای متفات اکسیژن در IVM با محریت مدل انسانی اشاره داشته باشد فشار پایین اکسیژن در مقایسه با فشار باالی اکسیژن اثرات آن در نتایج لقاح برنتنی در انسان در تقابل با نتایج بدست آمده از مطالعات صرت پذیرفته در حیانات که نشان دهنده اثرات مفید کاهش فشار اکسیژن در رند تکین ریان نتایج لقاح برنتنی در این گنهها میباشد 43 مطالعه مشابه که در انسان به انجام رسیده است متفقا اثرات مفید کاهش فشار اکسیژن در رند کشت برنتنی ریان انسان را نشان ندادهاند ) (. 02 عدم همگنی بین این نتایج را شاید بتان به اسطه تفاتهای بین گنهای شرح داد. به هر ری تجزیه تحلیل که ری مقاالت انتشار یافته انجام شده است نشان داده است که تا کنن فقط تعداد اندکی از دادههای مرتبط در آزمایشهای کامال تصادفی کلینیکی با تعداد کافی از بیماران در این زمینه به انجام رسیده است. به عاله مدت زمان کشت ریان انسان فقط 2 تا 3 رز میباشد اما ریان حیانات معمال تا مرحله بالستسیست کشت داده میشند. همچنین تفاتهایی در محتای محیطهای کشت م استفاده در آزمایشگاههای مختلف جد دا عاله بر این نع از تفاتها ناهمگنی بین گرههای بیمارانی که م مطالعه قرار گرفتهاند نیزبه چشم میآید. فراسنجههای کلینیکی مانند نرخ آبستنی نرخ النهگزینی یا لدات زنده که معمال م مقایسه قرار می- گیرند نمیتانند به دقت مقایسه قدرت زنده مانی ریانها را م ارزیابی قرار دهند دلیل این اقعیت انتخاب بسیار شدید دقیق ریان پیش از انتقال میباشد. 2 مطالعه از 43 مطالعه انجام شده پیرامن اثرات اکسیژن بررریان انسان با دید گذشته نگر به این مضع تجه نمدهاند )412 02(. 3 مطالعه به بررسی تکین ریان تا مرحله بالستسیست پاخته اند الزم به ذکر است که در این 3 مطالعه به طر کلی تمرکز ری نتایج کلینیکی نبده است )413 88(. 412 فقط د مطالعه از این 43 مطالعه به طر کامال تصادفی به مقایسه اسیتهای خاهر بار پاخته است ) (. در هر د این مطالعات ارتقا قابل تجهی در کیفیت ریانهای ابتدایی بالستسیست به یژه در ICM مشاهده شده است. Kovacic )412( Vlaisavljevic خاطر نشان نمدهاند که %3 اکسیژن در تکین سریعتر ریان الیه ریان در مراحل نهایی تکین دخیل میباشد به گنهای که نسبت بیشتری از ریانها تانایی تکین به بالستسیست را به دست آه بدند. به دلیل تشکیل سریعتر حفره بالستکل در ریان- های مرتبط به گره کم اکسیژن بررسی بالستسیست به یژه ریختشناسی ICM بسیار آسانتر میباشد. برخی از مطالعات کلینیکی تصادفی ری تکین ریان متمرکز شده به تجزیه تحلیل نتایج انتقال ریان در رز 3 بعد از لقاح پاختهاند )411 80(. 89 در هر د مطالعه که تسط Dumoulin همکاران )89 80( به انجام رسیده است هیچ ارتقا قابل تجهی در نرخ بارری یا کلیاژ یا در تعداد سللها در هر ریان مشاهده نشده است. همچنین مطالعات Dumoulin همکاران Bahceci همکاران هیچ کدام اثر مرتبط با فشارهای متفات اکسیژن ری نتایج کلینیکی را نشان ندادهاند. سایر مطالعات به بررسی تکین طالنیتر شده ریان پیش از النه گزینی در سطح 3 یا 21 درصدی اکسیژن مقایسه نتایج کلینیکی بعد از انتقال ریان در رز 3 بعد از لقاح پاختهاند )413 33(. 414 این مطالعات مفق به کشف پیشرفتهای متفات در یژگیهای ریان از جمله میانگین باالتر رتبه ریان در مراحل ابتدایی تکین را به ثبت رساندهاند )414(. Waldenstrom همکاران )413( Catt )33( Henman الین محققانی بدند که افیش نرخ آبستنی النه گزینی با کاهش غلظت اکسیژن در انکباتر را گرش نمدهاند. بسیار جالب است که تاثیر مذکر درباال بر نتایج کلینیکی بدست آمده تسط Kea همکاران )414( Behr همکاران )88( Nanssy همکاران مشاهده نشده است. در هر سه این مطالعات غلظت اکسیژن درخالل کشت طالنی شده ریان 221

227 یک بار در رز 3 از 21 به 3 درصد یکبار از 3 درصد به 21 درصد تغییر یافته است. Wale )29( Gardner پاسخ مقتی ریان مش پیش از النه گزینی را به مقدار اکسیژن در شرایط برنتنی را م ارزیابی قرار دادهاند. در این مطالعه مشخص شد که کشت ریانها به صرت مقتی )کشت فقط در مرحله پیش از تراکم یا در مرحله بعد از تراکم مرال( کشت به طر کامل در شرایط فشار باالی اکسیژن )اتمسفر( منجر به کاهش تعداد سللهای بالستسیست یا نرخ تکین پایینتر بالستسیست در مقایسه با گره کنترل که در شرایط کم اکسیژن کشت داده شده است. میتان از تمام این مطالعات چنین نتیجه گرفت که کشت ریان در شرایط کم فشار اکسیژن تنها زمانی مفید اقع خاهد شد که فشار اکسیژن در تمام مدت کشت برنتنی ریان در سطح 3 درصد نگه داشته شد. Meintjes همکاران )411( نشان دادند که نرخ النه گزینی الدت زنده نتایج در زنانی که ریان آنها در شرایط کم فشار اکسیژن )%3( در تمام مدت کشت برنتنی کشت داده شده بدند در قیاس با ریانهایی که در شرایط فشار اکسیژن مشابه با اتمسفر کشت داده شده بدند بسیار باالتر میباشد. به هرری زمانی که ریانها در رز 3-2 انتقال داده شدند نرخ النه گزینی در میان گرههای م مقایسه تفاتی از خد نشان نمیدهد. تفات عمده در تاثیر مقدار اکسیژن بر نتایج کلینیکی به دست آمده در گرههایی که ریان در رز 3 انتقال داده شده بد نیزمشاهده شد. نیسندگان این مقاله )411( هیچ تفاتی در نرخ لقاح برنتنی کلیاژ یا نرخ استفاده از ریان مشاهده نکهاند. در مقابل Kovacic همکاران )410( تفات بسیار قابل تجهی در نتایج تکین ریان در د حالت کشت کتاه مدت بلند مدت ریان پیش از انتقال مشاهده نمدند همچنین در این مطالعه نرخ استفاده از ریان نیز تفات قابل تجهی در د نع کشت کتاه بلند مدت از خد نشان داد. ریان- هایی که در فشار %21 اکسیژن کشت داده شده بدند در مقایسه با گرهی که در فشار %3 اکسیژن کشت داده شده بدند تاخیر 293 معنیداری در الین تقسیم کلیاژ در مراحل بعدی از جمله حفرهسازی تعداد سللهای بالستسیست تکین بالستسیست بالستسیست در رز 3 از خد نشان داده بدند. با تجه به نتایج 43 مطالعه مطرح شده میتان چنین خالصه نمد که کاهش فشار اکسیژن در شرایط کشت منجر به ارتقا معنیدار در تکین ریان میشد. اما ارتقا نرخ آبستنی فقط در 1 مطالعه از 43 مطالعه مذکر م تجه قرار گرفته بده است. هیچ کدام از محققین مرتبط با این 43 مطالعه اثر نامطلبی از کاهش فشار اکسیژن چه در نرخ تکین ریان چه در نرخ آبستنی گرش ننمدهاند. نکتهای که باقیمانده است نیاز به تحقیق بیشتر دا این است که آیا تاثیر غلظت اکسیژن ابسته به مرحله خاصی از فرایند کشت برنتنی ریان میباشد یا خیر. این تجزیه تحلیل همچنان در حال انجام تسط )419( Cochrance Collaboration میباشد. سال دیگری که باقیمانده است این است که آیا فشار 3 درصدی اکسیژن بهترین فشار برای کشت برنتنی ریان میباشد یا خیر. تا به امرز هنز مشخص نشده است که بهترین فشار اکسیژن برای کشت برنتنی ریان انسان چه مقدار میباشد. براساس مطالعات متعددی که در حیانات مختلف صرت پذیرفته است به نظر میرسد که بهترین فشا ر اکسیژن برای کشت برنتنی ریان انسان در مرحله پیش از النه گزینی همان %3 میباشد )39 میلیمتر جیه(. این مقدار در بسیاری از مطالعات برای ریان مش به عنان مقدار بهینه شناخته شده است اما این نتیجه گیری بسیار عممی مطرح شده است زیرا نتایج کافی از سایر گنهها در این زمینه به چشم نمیخ. چن اندازه ریان انسان بیشتر به ریان نشخارکنندگان نزدیک میباشد میتان این گنه بیان نمد که بر اساس مطالعات Byatt- Smith همکاران )41( مقدار %0 اکسیژن در قیاس با %3 اکسیژن بتاند برای ریان انسان نیز کارآمدتر باشد. اما اندازه گیری مقدار اکسیژن در لله تلید مثلی میمن رسس کاهش فشار اکسیژن از %9 در ایداکت به 2-4/3 درصد در رحم را نشان داده است )4(. این درست است که فشار پایین اکسیژن میتاند منجر به تکثیر سللهای ترفکتدرم بهرهمندی ICM از گلیکلیز شد اما فشارهای کمتر از 2 درصد اکسیژن در انکباتر میتاند منجر به کاهش فشار اکسیژن به یژه در قطرههای کشتی که با رغن معدنی پشانده شدهاند شد. این کاهش در نهایت منجر به کاهش فشار اکسیژن در ریز محیط در برگیرنده ریانها خاهد شد. ریان انسان در شرایط کشت ثابت میتانند با در نظر داشتن شرایط کم فشا ر اکسیژن دچار هایپکسی شده )41( درحالی که ریانهای مش به نظر میرسد که میتانند نیازهای اکسیژن خد را به اسطه انتشار دریافت نمایند. بنابراین تاکنن براساس نتایج به دست آمده از مطالعات متعدد میتان چینین نتیجه گرفته که کاهش فشار اکسیژن از مقداری که در cavitation 224

228 اتمسفر مجد میباشد میتاند باعث برز اثرات مفید در کیفت ریانهای تلید شده از انسان در شرایط برنتنی شد. اما مطالعات فیزیلژی ملکلی کلینیکی بیشتری به منظر بررسی تاثیر اکسیژن بر کشت برنتنی ریان انسان الزم به نظر میرسد ماد انتخابهای متعددی برای کاهش فشار اکسیژن در شرایط کشت برنتنی ریان در دسترس میباشد. این انتخاب ها شامل انکباترها با امکان کنترل مقدار اکسیژن میباشد )یادداشت 4 را مشاهده نمایید( همچنین میتان از خانههای ایزله شده در انکباتر به این منظر استفاده نمد. ریکهای متفات نیازهای گازی متفاتی را تقاضا مینمایند انکباترها 4. انکباترهای کالسیک. تقریبا تمام اناع انکباترهای کالسیک امرزه با امکان کاهش فشار گاز اکسیژن قابل تهیه میباشند )یادداشت 2(. این سایل دارای اتصال برای د گاز )دی اکسید کربن نیترژن( یا سه گاز )دی اکسید کربن نیترژن اکسیژن( میباشند تعدا حسگرهای مجد در این انکباترها د م میباشد یکی برای دیاکسید کربن دیگری برای اکسیژن )یادداشت 3(. 2. انکباترهای تک ظرفی. این نع از انکباترها کچک قابل نصب ری یک میز میباشند )شکل 4-43(. این نع از انکباترها خانههای متعددی داشته که برای قرار دادن یک یا د ظرف کشت در هر خانه طراحی شده است. محفظههای قابل مهر مم شدن )دسیکاتر( یا کیفهای نفذناپذیر به گاز. بعد از قرار دادن ظرف کشت در محفظه گاز پیش مخلط )%3 اکسیژن %3 دی اکسید کربن %81 نیترژن( به محفظه ا شده بالفاصله مهر مم میشد. محفظه کاری با یژگیهای انکباتر. این سیله یک هد بزرگ می باشد که به منظر ایفای نقش به عنان انکباتر هد به طر همزمان طراحی شده است )شکل 2-43( گازها غلظتهای تصیه شده برای گاز م استفاده در انکباتر با فشار کم اکسیژن معادل %3 2 O 2 %3 CO %81 2 N می- باشد. این نسبتها را میتان به اسطه اتصال یکی از منابع زیر به انکباتر فراهم نمد: 4( کپسلهای جداگانه CO 2 )گاز با درجه آزمایشگاهی با خلص 1/3( N 2 )گاز با درجه آزمایشگاهی با باالترین خلص 3/1(. 2( گاز پیش مخلط شده با نسبت های م نظر. 3( کپسل گاز CO 2 نیترژن مایع که در تانک مخصص نگهداری شده با استفاده از بخار آن گاز نیترژن م نیاز تامین میشد. شکل سیستم انکباتر ر میزی برای قرار دادن یک ظرف کشت. هر خانه درب جداگانه دا. 222

229 منابع شکل ایستگاه دسترزی گامتها ریان با کاربری مشابه انکباتر. این سیستم به طر کامل به اسطه شیشه مجد در سطح مقابل آببندی شده با استفاده از دستکشهای مخصص قرار داشتن میکرسکپ درن سیستم شرایط گازی بهینه برای کار نگهداری ریان گامتها را فراهم نمده است. ظرف کشت در تمام مدت کار کن کشت میتاند در این سیستم به طر بهینه نگهداری شد. 4. Fischer B, Bavister BD (4883) Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys, hamsters and rabbits. J Reprod Fertil 88: Leese HJ (4883) Metabolic control during preimplantation mammalian development. Hum Reprod Update 4: Thompson JG, Partridge RJ, Houghton FD, Cox CI, Leese HJ (4882) Oxygen uptake and carbohydrate metabolism byin vitro derived bovine embryos. J Reprod Fertil 412: Jauniaux E, Gulbis B, Burton GJ (2113) Physiological implications of the maternofetal oxygen gradient in human early pregnancy. Reprod Biomed Online 0: Yedwab GA, Paz G, Homonnai TZ, David MP, Kraicer PF (4802) The temperature, ph, and partial pressure of oxygen in the cervix and uterus of women and uterus of rats during the cycle. Fertil Steril 20: Ottosen LD, Hindkaer J, Husth M, Petersen DE, Kirk J, Ingerslev HJ (2112) Observations on intrauterine oxygen tension measured by fibre-optic microsensors. Reprod Biomed Online 43: Van Blerkom J, Antczak M, Schrader R (4880) The developmental potential of the human oocyte is related to the dissolved oxygen content of follicularfluid: association with vascular endothelial growth factor levels and perifollicular bloodflow characteristics. Hum Reprod 42: Knudsen JF, Litkowski LJ, Wilson TL, Guthrie HD, Batta SK (4809) Concentrations of hydrogen ions, oxygen, carbon dioxide and bicarbonate in porcine follicularfluid. J Endocrinol 08: Shalgi R, Kraicer PF, Sofermanm N (4802) Gases and electrolytes of human follicular fluid. J Reprod Fertil 29: Gosden RG, Byatt-Smith JG (4892) Oxygen concentration gradient across the ovarian follicular epithelium: model, predictions and implications. Hum Reprod 4: Clark AR, Stokes YM, Lane M, Thompson JG (2112) Mathematical modelling of oxygen concentration in bovine and murine cumulus oocyte complexes. Reproduction 434: Martin KL (2111) Nutritional and metabolic requirements of early cleavage stage embryos and blastocysts. Hum Fertil (Camb) 3: Thompson JG, Sherman ANM, Allen NW, McGowan LT, Tervit HR (4889) Total protein content and protein synthesis within pre-elongation stage bovine embryos. Mol Reprod Dev 31: Byatt-Smith JG, Leese HJ, Gosden RG (4884) An investigation by mathematical modelling of whether mouse and human preimplantation embryos in static culture can satisfy their demands for oxygen by diffusion. Hum Reprod 2:

230 43. Feil D, Lane M, Roberts CT, Kelley RL, Edwards LJ, Thompson JG, Kind KL (2112) Effect of culturing mouse embryos under different oxygen concentrations on subsequent fetal and placental development. J Physiol 302: Kind KL, Collett RA, Harvey AJ, Thompson JG (2113) Oxygen-regulated expression of GLUT- 4, GLUT-3, and VEGF in the mouse blastocyst. Mol Reprod Dev 01: Thompson JG, McNaughton C, Gasparrini B, McGowan LT, Tervit HR (2111) Effect of inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylation during compaction and blastulation of bovine embryos culturedin vitro. J Reprod Fertil 449: Baltz JM, Biggers JD (4884) Oxygen transport to embryos in microdrop cultures. Mol Reprod Dev 29: Trimarchi JR, Liu L, Porterfield DM, Smith PJ, Keefe DL (2111) Oxidative phosphorylation-dependent and -independent oxygen consumption by individual preimplantation mouse embryos. Biol Reprod 22: Houghton FD (2112) Energy metabolism of the inner cell mass and trophectoderm of the mouse blastocyst. Differentiation 01: Scott L, Berntsen J, Davies D, Gundersen J, Hill J, Ramsing N (2119) Human oocyte respiration-rate measurement potential to improve oocyte and embryo selection? RBM Online 40: Lopes AS, Larsen LH, Ramsing N, Lovendahl P, Raty M, Peippo J, Greve T, Callesen H (2113) Respiration rates of individual bovine in vitro-produced embryos measured with a novel, non-invasive and highly sensitive microsensor system. Reproduction 431: Lopes AS, Madsen SE, Ramsing NB, Løvendahl P, Greve T, Callesen H (2110) Investigation of respiration of individual bovine embryos produced in vivo and in vitro 3 Culture Systems: Low-Oxygen Culture 22 and correlation with viability following transfer. Hum Reprod 22: Lopes AS, Lane M, Thompson JG (2141) Oxygen consumption and ROS production are increased at the time of fertilization and cell cleavage in bovine zygotes. Hum Reprod 23: Guerin P, El Mouatassim S, Menezo Y (2114) Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings. Hum Reprod Update 0: Bielski BH, Arudi RL (4893) Preparation and stabilization of aqueous/ethanolic superoxide solutions. Anal Biochem 433: Martín-Romero FJ, Miguel-Lasobras EM, Domínguez-Arroyo JA, González-Carrera E, Alvarez IS (2119) Contribution of culture media to oxidative stress and its effect on human oocytes. Reprod Biomed Online 40: Grzelak A, Rychlik B, Bartosz G (2114) Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radic Biol Med 31: Halliwell B, Aruoma OI (4884) DNA damage by oxygen-derived species. Its mechanism and measurement in mammalian systems. FEBS Lett 294: Batty E, Jensen K, Freemont P (2118) PML nuclear bodies and their spatial relationships in the mammalian cell nucleus. Front Biosci 41: Murphy MP (2118) How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J 140: Kowaltowski AJ, Vercesi AE (4888) Mitochondrial damage induced by conditions of oxidative stress. Free Radic Biol Med 22: Tappel AL (4891) Vitamin E and selenium protection from in vivo lipid peroxidation. Ann N Y Acad Sci 333: Nasr-Esfahani M, Johnson MH, Aitken RJ (4881) The effect of iron and iron chelators on the in-vitro block to development of the mouse preimplantation embryo: BAT2 a new medium for improved culture of mouse embryosin vitro. Hum Reprod 3: Orrenius S, Burkitt MJ, Kass GE, Dypbukt JM, Nicotera P (4882) Calcium ions and oxidative cell injury. Ann Neurol 32(Suppl): S Halliwell B, Gutteridge JM (4881) Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview. Methods Enzymol 492:

231 30. Tarín JJ (4882) Potential effects of age-associated oxidative stress on mammalian oocytes/embryos. Mol Hum Reprod 2: Kwon HC, Yang HW, Hwang KJ, Yoo JH, Kim MS, Lee CH, Ryu HS, Oh KS (4888) Effects of low oxygen condition on the generation of reactive oxygen species and the development in mouse embryos cultured in vitro. J Obstet Gynaecol Res 23: Salgo MG, Stone K, Squadrito GL, Battista JR, Pryor WA (4883) Peroxynitrite causes DNA nicks in plasmid pbr322. Biochem Biophys Res Commun 241: Cox MM, Goodman MF, Kreuzer KN, Sherratt DJ, Sandler SJ, Marians KJ (2111) The importance of repairing stalled replication forks. Nature 111(2003): Marnett LJ (2111) Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis 24: Taanman JW (4888) The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochim Biophys Acta 4141: Johnson MH, Nasr-Esfahani MH (4881) Radical solutions and cultural problems: could free oxygen radicals be responsible for the impaired development of preimplantation mammalian embryosin vitro? Bioessays 42: Blondin P, Coenen K, Sirard MA (4880) The impact of reactive oxygen species on bovine sperm fertilizing ability and oocyte maturation. J Androl 49: Yang HW, Hwang KJ, Kwon HC, Kim HS, Choi KV, Oh KS (4889) Detection of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis in human fragmented embryos. Hum Reprod 43: Pierce GB, Parchment RE, Lewellyn AL (4884) Hydrogen peroxide as a mediator of programmed cell death in the blastocyst. Differentiation 12: Harvey AJ, Kind KL, Thompson JG (2112) REDOX regulation of early embryo development. Reproduction 423: Morales H, Tilquin P, Rees JF, Massip A, Dessy F, Van Langendonckt A (4888) Pyruvate prevents peroxide-induced injury of in vitro preimplantation bovine embryos. Mol Reprod Dev 32: Thomas M, Jain S, Kumar GP, Laloraya M (4880) A programmed oxyradical burst causes hatching of mouse blastocysts. J Cell Sci 441: Nasr-Esfahani MM, Johnson MH (4884) The origin of reactive oxygen species in mouse embryos culturedin vitro. Development 443: B. Kovačič 34. El Mouatassim S, Guerin P, Menezo Y (4888) Expression of genes encoding antioxidant enzymes in human and mouse oocytes during the final stages of maturation. Mol Hum Reprod 3: Fridovich I (4883) Superoxide radical and superoxide dis mutases. Ann Rev Biochem 21: Catt J, Henman M (2111) Toxic effects of oxygen on human embryo development. Hum Reprod 43(Suppl 2): Enkhmaa D, Kasai T, Hoshi K (2118) Longtime exposure of mous embryos to the sperm produces high levels of reactive oxygen species in culture medium and relates to poor embryo development. Reprod Domest Anim 11: Alikani M, Cohen J, Tomkin G, Garrisi GJ, Mack C, Scott RT (4888) Human embryo fragmentationin vitro and its implications for pregnancy and implantation. Fertil Steril 04: Otsuki J, Nagai Y, Chiba K (2110) Peroxidation of mineral oil used in droplet culture is detrimental to fertilization and embryo development. Fertil Steril 99: Nakayama T, Noda Y, Goto Y, Mori T (4881) Effects of visible light and other environmental factors on the production of oxygen radicals by hamster embryos. Theriogenology 14: Goto Y, Noda Y, Mori T, Nakano M (4883) Increased generation of reactive oxygen species in embryos culturedin vitro. Free Radical Biol Med 43: Kitagawa Y, Suzuki K, Yoneda A, Watanabe T (2111) Effects of oxygen concentration and antioxidants on thein vitro developmental ability, production of reactive oxygen species (ROS), and DNA fragmentation in porcine embryos. Theriogenology 22:

232 21. Hashimoto S, Minami N, Takakura R, Yamada M, Imai H, Kashima N (2111) Low oxygen tension duringin vitro maturation is beneficial for supporting the subsequent development of bovine cumulus oocyte complexes. Mol Reprod Dev 30: Rinaudo PF, Giritharan G, Talbi S, Dobson AT, Schultz RM (2112) Effects of oxygen tension on gene expression in preimplantation mouse embryos. Fertil Steril 92 (1 Suppl): Harvey AJ, Kind KL, Thompson JG (2110) Regulation of gene expression in bovine blastocysts in response to oxygen and the iron chelator desferrioxamine. Biol Reprod 00: Semenza GL (2111) Expression of hypoxiainducible factor 4mechanis ms and consequences. Biochem Pharmacol 38: Quinn P, Harlow GM (4809) The effect of oxygen on the development of preimplantation mouse embryosin vitro. J Exp Zool 212: Thompson JG, Simpson AC, Pugh PA, Donnelley PE, Tervit HR (4881) Effect of oxygen concentration onin-vitro development of preimplantation sheep and cattle embryos. J Reprod Fertil 98: Pabon JE, Findley WE, Gibbons WE (4898) The toxic effect of short exposures to the atmospheric oxygen concentration on early mouse embryonic development. Fertil Steril 34: Umaoka Y, Noda Y, Narimoto K, Mori T (4882) Effects of oxygen toxicity on early development of mouse embryos. Mol Reprod Dev 34: Wale PL, Gardner DK (2141) Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reprod Biomed Online 24: McKiernan SH, Bavister BD (4881) Environmental variables influencingin vitro development of hamster 2-cell embryos to the blastocyst stage. Biol Reprod 13: Kishi J, Noda Y, Narimoto K, Umaoka Y, Mori T (4884) Block to development in cultured rat 4-cell embryos is overcome using medium HECM- 4. Hum Reprod 2: Li J, Foote RH, Simkin M (4883) Development of rabbit zygotes cultured in protein-free medium with catalase, taurine, or superoxide dis mutase. Biol Reprod 18: Fukui Y, McGowan LT, James RW, Pugh PA, Tervit HR (4884) Factors affecting the invitro development to blastocysts of bovine oocytes matured and fertilizedin vitro. J Reprod Fertil 82: Takahashi Y, Kanagawa H (4889) Effect of oxygen concentration in the gas atmosphere duringin vitro insemination of bovine oocytes on the subsequent embryonic development in vitro. J Vet Med Sci 21: Olson SE, Seidel GE (2111) Reduced oxygen tension and EDTA improve bovine zygote development in a chemically defined medium. J Anim Sci 09: Van Soom A, Yuan YQ, Peelman LJ, de Matos DG, Dewulf J, Laevens H, de Kruif A (2112) Prevalence of apoptosis and inner cell allocation in bovine embryos cultured under different oxygen tensions with or without cysteine addition. Theriogenology 30: Higdon HL 3rd, Blackhurst DW, Boone WR (2119) Incubator management in an assisted reproductive technology laboratory. Fertil Steril 98: Batt PA, Gardner DK, Cameron AW (4884) Oxygen concentration and protein source affect the development of preimplantation goat embryosin vitro. Reprod Fertil Dev 3: Yuan YQ, Van Soom A, Coopman FO, Mintiens K, Boerjan ML, Van Zeveren A, dekruif A, Peelman LJ (2113) Influence of oxygen tension on apoptosis and hatching in bovine embryos culturedin vitro. Theriogenology 38: Lequarre AS, Marchandise J, Moreau B, Massip A, Donnay I (2113) Cell cycle duration at the time of maternal zygotic transition for in vitro produced bovine embryos: effect of oxygen tension and transcription inhibition. Biol Reprod 28: Bean CJ, Hassold TJ, Judis L, Hunt PA (2112) Fertilizationin vitro increases nondisjunction during early cleavage divisions in a mouse model system. Hum Reprod 40: Harvey AJ, Kind KL, Pantaleon M, Armstrong DT, Thompson JG (2111) Oxygen-regulated gene expression in bovine blastocysts. Biol Reprod 04:

233 92. Enders AC, Boatman D, Morgan P, Bavister BD (4898) Differentiation of blastocysts derived fromin vitro-fertilized rhesus monkey ova. Biol Reprod 14: Nasr-Esfahani MH, Winston NJ, Johnson MH (4882) Effects of glucose, glutamine, ethylenediaminetetraacetic acid and oxygen tension on the concentration of reactive oxygen species and on development of the mouse preimplantation embryoin vitro. J Reprod Fertil 82: Johnston LA, Donoghue AM, O Brien SJ, Bildt DE (4884) Influence of temperature and gas atmosphere on in-vitro fertilization and embryo development in domestic cats. J Reprod Fertil 82: Betterbed B, Wright RW Jr (4893) Development of one-cell ovine embryos in two culture media under two gas atmospheres. Theriogenology 23: Khurana NK, Niemann H (2111) Effects of oocyte quality, oxygen tension, embryo density, cumulus cells and energy substrates on cleavage and morula/blastocyst formation of bovine embryos. Theriogenology 31: Orsi NM, Leese HJ (2114) Protection against reactive oxygen species during mouse preimplantation embryo development: role of EDTA, oxygen tension, catalase, superoxide dis mutase and pyruvate. Mol Reprod Dev 38: Khurana NK, Wales RG (4898) Effects of oxygen concentration on the metabolis m of (U 41 C)glucose by mouse morulae and early blastocystsin vitro. Reprod Fertil Dev 4: Bermejo-Alvarez P, Lonergan P, Rizos D, Gutiérrez-Adan A (2141) Low oxygen tension during IVM improves bovine oocyte competence and enhances anaerobic glycolysis. Reprod Biomed Online 21: Banwell KM, Lane M, Russell DL, Kind KL, Thompson JG (2110) Oxygen concentration during mouse oocytein vitro maturation affects embryo and fetal development. Hum Reprod 22: Park JI, Hong JY, Yong HY, Hwang WS, Lim JM, Lee ES (2113) High oxygen tension duringin vitro oocyte maturation improves in vitro development of porcine oocytes after fertilization. Anim Reprod Sci 90: Oyamada T, Fukui Y (2111) Oxygen tension and medium supplements forin vitro maturation of bovine oocytes cultured individually in a chemically defined medium. J Reprod Dev 31: Karja NW, Wongsrikeao P, Murakami M, Agung B, Fahrudin M, Nagai T, Otoi T (2111) Effects of oxygen tension on the development and quality of porcinein vitro fertilized embryos. Theriogenology 22: Booth PJ, Holm P, Callesen H (2113) The effect of oxygen tension on porcine embryonic development is dependent on embryo type. Theriogenology 23: Eppig JJ, Wigglesworth K (4883) Factors affecting the developmental competence of mouse oocytes grownin vitro : oxygen concentration. Mol Reprod Dev 12: Corrêa GA, Rumpf R, Mundim TC, Franco MM, Dode MA (2119) Oxygen tension duringin vitro culture of bovine embryos: effect in production and expression of genes related to oxidative stress. Anim Reprod Sci 411: Dumoulin J, Vanvuchelen R, Land J, Pieters MH, Geraedts JP, Evers JL (4883) Effect of oxygen concentration on in-vitro fertilization and embryo culture in the human and the mouse. Fertil Steril 23: Dumoulin J, Meijers C, Bras M, Coonen E, Geraedts JP, Evers JL (4888) Effect of oxygen concentration on human in-vitro fertilization and embryo transfer. Hum Reprod 41: Behr B, Pool TB, Milki AA, Moore D, Gebhardt J, Dasig D (4888) Preliminary clinical experience with human blastocyst developmentin vitro without co-culture. Hum Reprod 41: Bahceci M, Ciray HN, Karagenc L, Ulug U, Bener F (2113) Effect of oxygen concentration during the incubation of embryos of women undergoing ICSI and embryo transfer: a prospective randomized study. Reprod Biomed Online 44: Kea B, Gebhardt J, Watt J, Westphal LM, Lathi RB, Milki AA, Behr B (2110) Effect of reduced oxygen concentrations on the outcome ofin vitro fertilization. Fertil Steril 90:

234 412. Kovačič B, Vlaisavljevič V (2119) Influence of atmospheric versus reduced oxygen concentration on development of human blastocysts in vitro: a prospective study on sibling oocytes. Reprod Biomed Online 40: Ciray HN, Aksoy T, Yaramanci K, Karayaka I, Bahceci M (2118)In vitro culture under physiologic oxygen concentration improves blastocyst yield on sibling oocytes. Fertil Steril 84(1 Suppl): Meintjes M, Chantilis SJ, Douglas JD, Rodriguez AJ, Guerami AR, Bookout DM, Barnett BD, Madden JD (2118) A controlled randomized trial evaluating the effect of lowered incubator oxygen tension on live births in a predominantly blastocyst transfer program. Hum Reprod 21: Waldenstrom U, Engstrom A, Hellberg D, Nilsson S (2118) Low-oxygen compared with high-oxygen atmosphere in blastocyst culture, a prospective randomized study. Fertil Steril 84: Nanassy L, Peterson CA, Wilcox AL, Peterson CM, Hammoud A, Carrell DT (2141) Comparison of 3 % and ambient oxygen during days 3 3 of in vitro culture of human embryos. Fertil Steril 83: Kovačič B, Sajko MC, Vlaisavljevič V (2141) A prospective, randomized trial on the effect of atmospheric versus reduced oxygen concentration on the outcome of intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril 81: Bontekoe S, Mantikou E, van Wely M, Seshadri S, Repping S, Mastenbroek S (2144) Low oxygen concentrations for embryo culture in assisted reproductive technologies. Cochrane Database Syst Rev 4. Art. No.: CD

235 فصل 42 سیستم کشت: تراکم ریان تراکم ریان به عنان نسبت ریان کشت شده به حجم م استفاده از محیط کشت برای قطرههای کشت برنتنی ریان تعریف میشد. به زبان دیگر تراکم ریان عبارت از تعداد ریانهای کشت شده در حجم مشخصی از محیط کشت می- باشد. یک تراکم مشابه از ریان به اسطه دستکاری تعداد ریان در حجم مشخصی از محیط کشت یا نغییر محیط مشخصی از محیط کشت برای تعداد مشخصی از ریان قابل دست یابی میباشد. برای مثال یک ریز قطره با تعداد 3 ریان در حجم 31 میکرلیتر پشانده شده تسط رغن معدنی دارای نسبت مشابهی از تراکم ریان معادل 4 به 41 میکرلیتر میباشد که در سیستم کشت با یک ریان کشت شده در 41 میکرلیتر محیط کشت قابل مشاهد میباشد. افیش تراکم ریان میتاند منجر به ارتقا رند تکین برنتنی ریان شد به هر ری سازکار)ها( مسل چنین ارتقایی در رند تکین برنتنی ریان ممکن است که با تجه به نع رش بهکار رفته برای افیش تراکم ریان متفات باشد. پتری دیشهای استاندا کفه تخت بسیار متدال در رند کشت برنتنی ریان میباشند به عنان رشهای سنتی در کشت برنتنی ریان م تجه هستند. از ریز قطرههای پشانده شده تسط رغن معدنی میتان برای کنترل نمدن تراکم ریان استفاده نمد اما این نکته که آماده سازی ظرف با ریهای ثابت انجام شد بسیار حیاتی تعیین کننده میباشد در حقیقت باید از رشی استفاده شد که از تبخیر ریز قطرهها تغییرات در اسمالریته قطرهها جلگیری به عمل آ امکان بازسازی شرایط آزمایش جمعآری دادههای قابل تکرار قابل مقایسه را فراهم نماید. ظرف جدیدی تسط کارخانههای متعددی تلید رانه بار شدهاند که به طر یژه برای کشت برنتنی ریان طراحی شدهاند اکثر این ظرف آماده استفاده به منظر کشت برنتنی ریان انسان میباشند. ایده طراحی این ظرف برپایه طراحی چاهکهای بسیار کچک با کف مقعر میباشد که امکان ایجاد قطرات بسیار کچک را برای ما فراهم مینمایند بنابراین با استفاده از این ظرف کشت ریانها در انتهاییترین نقطه چاهک قرار خاهند گرفت در نتیجه عامل ترفیک تلید شده تسط ریانها در این نقطه انتهایی که ریانها در آنه مستقر میباشند متراکم خاهند شد. تراکم ریان به خدی خد به عنان یک رش در رند کشت برنتنی ریان تسط ریانشناسان در نظر گرفته نمیشد در حقیقت اینکه ریانها فی کشت داده شند یا به صرت گرهی مربط به ریه انتخابی در راستای تلید برنتنی ریان میباشد همچنین این م بیشتر به راحتی رند کشت اینکه آیا نیاز با جمع آمری دادهها به صرت فی میباشد یا خیر مرتبط است. تراکم ریان قابل کنترل می باشد تاکنن تانسته به عنان یک ابر تانمند در ارتقا رند تکین برنتنی ریان انسان به حساب آید. 223 مقدمه درخالل درمان نقیصههای بارری با استفاده از IVF ریانهای بدست آمده به صرت انفرادی یا به صرت گرهی کشت داده میشند. اینکه چند ریان با هم کشت داده شند یا اینکه ریانها به صرت انفرادی کشت داده شند نکتهای است که تسط هر آزمایشگاه بنا به دالیل عملی یا سابق گذشته آزمایشگاه انتخاب میشد. مباحثی مبنی بر اینکه ریانهایی که به صرت گرهی کشت داده میشند به اسطه تراش ماد مغذی ریان پیامهای مثبت از کیفیت باالتری برخار هستند هماره در جامع علمی مطرح میباشد برخی دیگر بر این اعقاد هستند که ریانهایی که به صرت گرهی کشت داده میشند ممکن است که منجر به تخلیه ماد مغذی محیط کشت شده یا اینکه به اسطه ارسال پیامهای منفی منجر به تخریب تعیق در رند تکین ریانهای کناری خد شند. در بیشتر ما ریانها به صرت انفرادی کشت داده شده تا بتان به طر پیسته تغییرات ظاهری برخی ماد مترشحه از ریان در محیط کشت را م بررسی قرار داد. ریان پستانداران به طر شگفت انگیزی مقام میباشند. ریان پستانداران میتانند اناع متفاتی از شرایط محیط کشت برنتنی را که نسبت به آنچه در شرایط برن- تنی جد دا متفات میباشد را تحمل نمایند. رشهای سنتی برای کشت برنتنی ریان میتانند به سادگی قرار دادن ریان در یک لله آزمایشگاهی حای محیط کشت ریان نگهداری این لله در محیطی باشد که دما مین گاز دیاکسید-

236 کربن آن تنظیم شده باشد یا میتان ریهای پیچیده را شامل استفاده از قطعات آگار انتقال آن با استفاده از رش جراحی به ایداکت گیرندهای غیر همخاناده را برگزیند در زمان مناسب ریان را از ایداکت مجد پذیرنده بازیافت نمد برای منظر خاصی م استفاده قرار داد. با تجه به استثناهای بسیار اندک رشهای کشت برنتنی ریان کامال دست نخه باقیماندهاند )3-4(. این فصل به بررسی استفاده از تراکم ریان به عنان رشی ساده لی کاربی به منظر ارتقا کیفی ریان انسان در شرایط کشت برنتنی میپازد. این فصل شامل 4( مرری برمنابع به منظر ارتقا افیش دانش برای فهم بهتر این که چرا تراکم ریان در کیفیت تکین برنتنی ریان مثر میباشد 2( معرفی ظرف کشت در بخش 2 که به منظر کشت تخصصی ریان طراحی شدهاند 3( رشهای آمادهسازی ظرف کشت برای استفاده یا مطالعه تراکم ریان که اشاره به هر د نسل سنتی نین ظرف کشت ریان خاهد داشت تراکم ریان کشت برنتنی ریان شاهدی جد دا مبنی بر اینکه کشت برنتنی ریان به اسطه افیش تراکم ریانهای کشت داده شده در یک ریز قطره ارتقا خاهد یافت این یافته اشاره به این نکته دا که 4( این امکان جد دا که ماد مغذی مفیدی در اثر حضر ریان ها در کنار یکدیگر در محیط تراش شده تجمع یابند که به اسطه اثرات اتکراین پارارکراین جاکستاکراین با ریانها ارتباط برقرار نمده / یا 2( افیش تراکم ریان کشت داده شده در شرایط برنتنی میتاند انتشار عامل مثب مغذی ریانها به نقاط درتری از ریان در محیط کشت را در مقایسه با محیط کشت حجیمتر محدد نمده / یا 3( افیش تراکم ریانها در محیط کشت مناطق مثر تغذیهای متابلیتها اکسیژن در اطراف ریان یا ریانها را تسهیل مینماید. تراکم ریان به عنان نسبت تعداد ریان کشت داده شده به حجم محیط کشت استفاده شده تعریف شده است. این نسبت با تغییرات در تعداد ریانها یا حجم م استفاده از محیط کشت قابل تغییر میباشد. برای مثال یک ریزقطره با 3 ریان در محیط کشت با حجم 31 میکرلیتر که تسط رغن معدنی پشانده شده است دارای تراکم نسبی معادل کشت یک ریان در ریز قطره 41 میکرلیتری پشانده شده تسط رغن معدنی میباشد. درحالی که هر د رش به منظر افیش تراکم ریان ممکن است که منجر به ارتقا بازده کشت برنتنی ریانها شد اثرات حقیقی یا بازده هر یک از این د ریک ممکن است که متفات باشد این تفاتها در سطح ظاهری قابل تشخیص نمیباشند بلکه در سطح فعالیت بیان ژنها قابل ارزیابی میباشند. نکته قابل تجه در م تراکم ریان این است که مانند بسیاری دیگر از عامل مثر در رند IVF ممکن است که اثرات چشمگیری بر رند طبیعی اپیژنتیکی داشته باشد )برای مطالعه بیشتر مرجع شماره 42-2 را مطالعه نمایید(. برای مثال Dumolin همکاران )43( محیط کشت از د کمپانی مختلف را به منظر کشت برنتنی ریان بعد از IVF م ارزیابی قرار دادند یک مطالعه مقایسهای ساده که برای تمام آزمایشگاههای IVF شناخته شده میباشد. ریانهای منف در محیطهای کشت به حجم 3 میکرلیتر زیر پششی از رغن معدنی کشت داده شد )این نسبت به عنان تراکم باال برای کشت ریان به حساب میآید( مدت زمان کشت 2 تا 3 رز بعد از بازیافت اسیتها بد ( ریانها در رز 2 یا 3 بعد از لقاح منتقل شدند(. نتایج این مطالعه نشان داد که تکین ریان مطابق یا انتخاب یژگیهای ظاهری به طر معنیداری بین د گره تیمار علیرغم مشابهت نسبی ترکیبات د محیط کشت به طر معنی داری متفات میباشد. جالب اینکه نتایج همین مطالعه مشخص نمد که زن تلد ندان به طر معنیداری بستگی به این داشت که کدام محیط کشت در کشت برنتنی ریان م استفاده قرار گرفته بده است. افیش در تراکم ریان مترادف با تاثیر حاصل از استفاده از سامانه همکشتی با سللهای سماتیک نمیباشد جایی که ارتباط ریان با سلل همراه ممکن است که به عنان عاملی اثرگذار شناخته شد یا متراداف با استفاده از محیط کشت شرایط پذیر شده به اسطه عامل تراش شده تسط اناع سللهای سماتیک نمیباشد )41 43(. کشت ریانها با زیکل- های ترفبالستیک با استفاده از گا به عنان مدل حیانی برای مثال به عنان شیهای جهت مقایسه در مطالعات تراکم ریان قابل استناد میباشد )49-42( در این مطالعه ریان انفرادی در حضر ریانهای کمکی مستقر شده در آگارز کشت داده شده است )8(. یکی از گرشات ابتدایی در زمینه کنترل تراکم نسبی ریان با این قصد که کیفیت تکین ریان کشت داده شده در 291

237 شرایط برنتنی را ارتقا دهند کشت ریان د سللی همستر بد که در آن زمان به دلیل تقف تکین در مرحله 2 سللی دست نیافتنی بد )21(. ریان 2 سللی از ایداکت همستر ماده جفتگیری که جمعآری شده در یک ریز قطره به صرت گرهی کشت داده شدند سپ س محیط کشت آسپیره شد تا مقداری کمتر از یک میکرلیتر محیط کشت باقی ماند مقداری که فقط بتاند ریانها را بپشاند. در این مطالعه تقسیمات سللی از مرحله 2 سللی به بعد آغاز شد اما ادمه رند تکین امکانپذیر نشد. در این مطالعه در پایان ریانها در مرحله 1 سللی متقف شدند. تا همین ااخر اطالعات بسیار اندکی در زمینه کنترل تراکم ریان در کشت برنتنی ریان انسان در مقایسه با حجم زیاد مطالعات در این راستا در دامهای اهلی صرت گرفته است )24(. کشت ریانها در گرهها )که به عنان کشت تجمعی نیز نامیده میشد( یک ریه معمل میباشد در حقیقت مطالعه کتاهی که اخیرا در زمینه ریههای آزمایشگاهی در 41 کلینیک برتر مفق IVF صرت پذیرفته است نشان داده است که 8 م از این 41 آزمایشگاه ریانها را به صرت گرهی کشت میدهند )22(. از دیدگاه عملی استفاده از کشت ریانها به صرت گرهی اگر جمعآری داده برای ریانها به صرت انفرادی الزم نباشد منطقی به نظر میرسد با فشار کاری مجد در آزمایشگاهها همس بده هزینهها فشار بر کارمندان آزمایشگاه را کاهش میدهد. ریانشناسانان زیادی جد دارند که با ریه کشت گرهی برنتنی ریان احساس راحتی بیشتری میکنند این ریانشناسان با استفاده از تخمدانهای بیش تحریک شده یا حیاناتی که در هر دره جنسی تعداد زیادی اسیت آد مینمایند تعلیم دیدهاند استفاده از چنین رشی منجر به افزدن احتمال خطر داشتن تعداد زیادی اسیت یا ریان در یک ظرف کشت میشد. همچنین کشت انفرادی ریان در مقادیر مشخصی از محیط کشت نیز به عنان ریهای معمل به حساب میآید اما بیشتر این آزمایشگاهها به شدت عالقهمند به جمع آری دادهها در زمینه ارزیابی یژگیهای ظاهری ریانها به صرت انفرادی در زمان مشخصی بعد از ICSI جمعآری محیط کشت در زمان مشخصی پس از لقاح به منظر ارزیابیهای مرتبط با اسیدهای آمینه یا سایر متابلیتها یا برای یابی ریان به صرت انفرادی برای ارزیابیهای ژنتیکی میباشند. رشهای یابی ریان غالبا شامل ریان در نقاط عالمتگذاری شده در ظرف کشت یا کشت به صرت انفرادی در چاهک ظرف کشت کشت در لله آزمایشگاهی یا در لله میینه میباشد. اگرچه اخیرا یک پیشرفت شگفت انگیز در این زمینه صرت پذیرفته که در آن ریان مش با استفاده از تزریق یک میله سیلیکنی کدگذاری شده به فضای پیش یتلین که بالستمرها را در بر گرفته است م یابی قرار میگی )23(. در این قسمت از بحث شایسته است که به اژه- شناسی ارتباطات سللی اشاره نماییم: اتکراین پاراکراین جاکستاکراین که نشان دهنده رشهای متفات ایجاد ارتباط بین سللها یا در ریان پیش از النهگزینی بین هر بالستمر با بالستمرهای دیگر بین تمام ریانها بین سللها در یک ریان میباشند. ارتباط اتکراین به عنان تراشهایی از ماد شیمیایی یا عاملی که تسط یک سلل تلید شده ری همان سلل 291 تاثیر میگذا تعریف میشد. ارتباطات پاراکراین را میتان به این صرت تعریف نمد که یک ماده شیمیایی یا فاکتری خاص از یک سلل تراش شده تاثیر خد را بر سللی غیر از سلل تراش کننده که در نزدیکی سلل تراش کننده قرار دا 293 اعمال نماید. ارتباطات جاکستاکراین را میتان به این صرت تعریف نمد که یک ماده شیمیایی یا فاکتری خاص از یک سلل تراش شده تاثیر خد را بر فرایند خاصی در سللی که در اتصال فیزیکی با سلل تراش کننده میباشد اعمال مینماید. این سلل ثانیه که تحت تاثیر این فاکتر قرار میگی میتاند هم نع با سلل تراش کننده باشد یا از نع دیگری باشد. ارتباطات اتکراین پاراکراین در حقیقت به طر عممی به عنان ارتباطات سللی ابسته به گیرنده شناخته میشند. این تعاریف ممکن است که به گنهای دیگر نیز بیان شند به صرتی که نع سلل تراش کننده سلل گیرنده در تعیین تعریف این مصادیق م تجه قرار بگیرند. به طر یژه ارتباطات اتکراین ممکن است که برای تعریف ارتباط بین سللهای هم نع تعریف شد که در فاصله بسیار نزدیکی از هم قرار گرفتهاند درحالی که ارتباطات پاراکراین اشاره به این دا که نع سلل تراش کننده ماده شیمیایی با نع سلل دریافت کننده این ماده متفات بده درحالی که این د سلل در فاصله بسیار نزدیکی از یکدیگر قرار گرفتهاند. امکان تلید عامل بالقه اتکراین / پاراکراین / جاکستاکراین تسط ریان / یا ایداکت بافت رحم Paracrine communication Juxtacrine communication 294

238 جد دا. تاثیر این عامل ممکن است که ابسته به هدف م نظر مکان تلید آنها باشد برای مثال نقشهای مغذی برای 292 ریان تعدیل عملکهای ایداکت دخالت در ریه النه گزینی ریان نام ب. برای گنههایی که در سیکل تلید مثلی تخمک به صرت انفرادی آد میشد منطقی به نظر میرسد که سلل تخم لقاح تکین پیش از النهگزینی را بدن بهرهمند شدن از حضر دیگر سللهای تخم پشت سر بگذا به عنان مثال میتان به پرایمتها اسب گا اشاره نمد. 298 عامل مغذی ریان میتانند به صرت اتترفیک عمل نمده همچنین میتانند از محیط دستگاه تناسلی مادر نیز منشا 281 بگیرند. برای گنههایی که چند تخمک به صرت همزمان آد مینمایند مانند جندگان خک گربهسانان سگسانان امکان بهرمند شدن سلل تخم حداقل برای مدت زمانی کتاه از عامل مغذی ریان تلید شده از سلل تخم لقاح یافته مجار جد دا. شایان ذکر است که بیشتر تقابلها ممکن است بین ریان)ها( محیط دستگاه تلیدمثلی مادر به قع بپیندد. تراشات حاصل از سلل تخم لقاح یافته میتاند منجر به تغییر در عملک ایداکت )21 23( شد تراشات حاصل از ایداکت میتاند تکین تخم لقاح یافته را تحت تاثیر قرار دهد )22 20(. مانند بسیاری از هرمنها عامل رشد تراش گش این عامل ممکن است که بسیار گسته باشد به گنهای که عملک بافت هدف فقط به حضر گیرنده مخصص آن عامل ری سلل یا بافت هدف ابسته است )برای مطالعه بیشتر به منابع )13-29( مراجعه نمایید(. برای بسیاری از آزمایشگاههای IVF انسانی ر ش های پیچیده ارزیابی ریان فراتر از ارزیابیهای ریختشناسی به سادگی امکانپذیر نمیباشد / یا محددیتهای هزینهای این امکان را فراهم نمیکند. بهترین حالت در این راستا امکان استفاد از یک دستگاه تجزیه تحلیل کننده است که برای تجزیه تحلیل محیط کشت مصرف شده م استفاده قرار میگی. مطالعات زیادی در زمینه ارزیابی مقدار اسیدآمینه مصرف شده / یا ماد مغذی تسط ریان بعد از گذشت 21 ساعت از کشت برنتنی ریان به منظر انتخاب ریان مناسب برای انتقال منتشر شده است. با استفاده از این رش امکان تهیه پرفایلی از تغییرات ایجاد شده در محیط کشت فاقد ریان از نظر تخریب تجزیه اسیدهای آمینه تلید پرتئین اسیدهای آمینه مصرف اسیدهای آمینه برای هر ریان به دست میآید. با استفاده از تطبیق دادن این دادهها با یافتههای حاصل از بررسیهای ظاهری ریان این امکان فراهم میشد که با اطمینان بیشتری بتانیم از تانایی ریان برای طی نمد مراحل نهایی تکین النهگزینی اطمینان حاصل نماییم )34-11(. تطابق دادن پرفایل ماد تراش شده 284 از ریان متابلیتها دادههای حاصل از ارزیابی ظاهری ریانها به منظر انتخاب ریان ممکن است که مسالهای چالش برانگیز باشد به هر ری چن عامل متغیر بسیاری در ارتباط با کشت برنتنی ریان انسان میباشند ممکن است که تسعه ایجاد معیاری جهانی به منظر انتخاب ریان امری سخت باشد. این امکان که تراکم ریان اثر مثبتی بر سیستم کشت ریان انسان بگذا به نعی هم جد دا هم جد ندا بسیاری از آزمایشگاهها همانطر که در باال اشاره شد دسترسی سریع آسان به فنآریهای نین نداشته میبایست به دادههای حاصل از مشاهدات خد یا معیارهای به نسبت کیفی بسنده نمایند. در نتیجه انتخاب معیار مناسب یا نقطه عطف قابل اتکا در ارزیابیهای ریان امری ضرری تعیین کننده به حساب میآید. معیارها میتانند به سادگی بررسی ظاهری ریان سرعت تکین ریان نسبت ریانها با کیفیت خب در هر فاصله زمانی یا رشهای پیچیدهتر شامل بررسی عملکهای پرتئمیک متابلیک باشد. بنابراین تانایی جمعآری دادههای مشاهدهای باتجه به هر نع اثری ابسته به حساسیت رش انتخاب شده نقطه عطف انتخاب شده اندازه جمعیت مد مطالعه به منظر ارزیابی ریان میباشد. برای مثال فرضیه صفر در م تاثیر حساسیت نرخ تکین ریان به تراکم نسبی ریان در محیط کشت به منظر نشان دادن تفاتهای احتمالی به حساسیت انتخاب نقطه عطف انتخاب شده که در اینجا نرخ تکین ریان میباشد ارایه شده است. این فرضیه صفر نشان میدهد که رسیدن به مرحله بالستسیست هیچ گنه ابستگی یا حساسیتی به تراکم ریان ندا همچنین تاثیری بر تعداد کل سللهای بالستسیست نیز اعمال نکه است. embryotrophic monoovulatory ova autotrophic polyovulatory species secretome 292

239 مرر منابع مطالعات ابتداییتری که تسط Moessner )32( Dodson منتشر شده است نشان دهنده اثرات مثبت کشت گرهی ریان انسان میباشد. ریانها در این مطالعه در حجمی معادل 4 میلیلیتر از محیط کشت -F Ham s که با سرم انسانی فرآری شده غنی شده بد کشت داده شدند. ریانهای بدست آمده از 33 بیمار م مطالعه به صرت انفرادی ( =n( یا به صرت گرهی ( =n به صرت 3-2 ریان در هر گره( کشت داده شدند. در رز 2 ریانها م ارزیابی قرار گرفته منتقل شدند )رز 1= رز بازیافت اسیت(. نیسندگان این مقاله به این جمعبندی رسیدهاند که کشت گرهی تعداد سللهای بالستسیست متسط درجه بندی ریان )ترکیبی از ارزیابی کیفی ظاهری تعداد سللهای کل بالستسیست( را افیش داده است. Almagor همکاران )33( گرشی از ارتقا بازده آبستنی در ریانهای کشت شده به صرت گرهی را گرش نمدهاند. کشت ریانها در این مطالعه در حجمی از محیط کشت -F Ham s معادل 1/0 میلیلیتر که با سرم نخاعی انسان غنیسازی شده بد انجام گرفت در این مطالعه ریانها در رز 2 منتقل شده بدند. نرخ آبستنی )کیسه ریان قلب ریان( به مین معنی- داری در بیمارانی که ریانهایشان به صرت گرهی کشت داده شده بد باالتر بد اگرچه تعداد کل سللهای بالستسیست درجه آنها از نظر ظاهری با گره کنترل مشابه بده است. این د گرش به نعی منحصر به ف میباشند در این مطالعات به نسبت حجمهای باالیی از محیط کشت مصرف شده است )تراکم ریان 4:4111 تا 4:442 میکرلیتر بد( داشتن تعداد زیادی از ریان در فاصله نزدیک به یکدیگر در این مطالعه با جد تراکم کم ریان منجر به ارتقا نرخ تکین ریانها شده بد. درمقابل Spyropoulou همکاران )31( نشان دادند که تفاتی بین هیچ یک از معیارهای م ارزیابی برای بیمارانی که در هر یک از گرههای کشت گرهی کشت انفرادی ریان قرار گرفته بدند مشاهده نشد. در این مطالعه ریانها در محیط کشت EBSS که با جایگزین سرم آلبمین انسانی غنیسازی شده بد در حجم 21 میکرلیتر م استفاده قرار گرفته بد کشت داده شدند. تخصیص بیماران )نه ریانها در بیماران مختلف( به هر یک از گرههای کشت انفرادی ریان )تعداد 09 بیمار( یا کشت گرهی ریان )تعداد 94 بیمار 3-3 ریان در هر گره( به صرت کامال تصادفی صرت گرفت ریانها در رز 2 بعد از بازیافت اسیتها به رحم منتقل شدند. هیچ تفات معنیداری بین د گره مطالعاتی برای هیچ کدام از پارامترهای تکینی م مطالعه مشاهده نشد. همچنین مطالعه انجام شده تسط Rijnders )33( Jansen هیچ تفات معنیداری در نرخ تشکیل بالستسیست تقف در مرحله کلیاژ تخریب ریان یا نرخ آبستنی النه گزینی را بین 1 رش کشت م مطالعه نشان نداد. به هرری این گره تحقیقاتی رندی برای افیش نرخ تکین بالستسیست در شرایطی که ریانها به صرت انفرادی در حجمی از محیط کشت به اندازه 3 میکرلیتر کشت داده شدند را نشان داد. این مطالعه به بررسی مقایسه اثرات کشت گرهی کشت انفرادی ریان اثرات حجم محیط کشت بر رند تکین ریان پس از رز 3 بعد از بازیافت اسیت پاخته بد. ریانها در مخلطی از محیطهای کشت Earle -F Ham s که با پالسمای فراری شده غنیسازی شده بدند کشت داده شدند. ریانها از 23 بیمار بدست آمد شامل )321 ریان( که به صرت گرهی در گرههای 1-2 ریانی در حجمی معادل میکرلیتر تا رز 3 کشت داده شدند سپس به طر تصادفی به 4( گرههای کم حجمتری از محیط کشت انتقال داده شدند )حجم معادل 3 میکرلیتر به ای هر ریان 42-9 ریان در هر گره در یک قطره محیط کشت کشت داده شدند( 2( ریانها به صرت انفرادی در حجم 3 میکرلیتر از محیط کشت کشت داده شدند 3( ریانها به صرت انفرادی در حجمی از محیط کشت به اندازه 421 میکرلیتر کشت داده شدند 1( ریانها به صرت گرهی در قطرههایی از محیط کشت به حجم 421 میکرلیتر کشت داده شدند )تعداد 00 ریان در این قسمت م اتفاده قرار گرفت متسط تراکم ریان مشخص نشده بد(. ارزیابی ریان جایگزینی در رز 3 بعد از بازیافت اسیت از تخمدانها انجام گرفت. کشت گرهی ریان انسان تسط Jones همکاران )32( نیز م مطالعه قرار گرفت. 33 بیمار در طل این مطالعه م استفاده قرار گرفتند در این تحقیق 9 سیستم کشت م ارزیابی قرار گرفت. ریانها )3-2 ریان( در قطرههای کشت به حجم 41 تا 21 میکرلیتر تا رز 3 پس از بازیافت اسیتها از بیمارن به صرت گرهی کشت داده شدند. در رز 3 ریانها یا 299

240 در همان سیستم گرهی که از ابتدا در آن قرار داشتند نگهداری میشدند یا در گرههایی با تعداد مشابه سلل در حجم 41 یا 31 میکرلیتر از محیط کشت منتقل نگهداری میشدند. دستندی ریانها به گرههایی با تعداد مشابه ریان به عنان یک پرتکل استاندا به حساب میآید. Behr همکاران )30( برای ارزیابی افیش زمان کشت برنتنی ریان انسان تا رز 3 بدن استفاده از سامانه همکشتی از سیستم کشت گرهی ریان استفاده نمدند. ریانها در ابتدا در ریز قطرههایی به حجم 431 میکرلیتر از محیط کشت P که با جایگزین سنتز شده سرم غنیسازی شده بدند کشت داده شدند )3-3 ریان در هر قطره دامنه تراکم ریان 4:31 تا 4:31 میکرلیتر به ای هر ریان بد( در ادامه در رز 3 بعد از بازیافت اسیتها از تخمدان بیماران ریانها جایگزین میشدند تا رز 3 رند تکین آنها م ارزیابی قرار میگرفت. ریانهای کم کیفیتتر از حد معمل )939 ریان از 391 بیمار( در یک قطره 431 میکرلیتری از محیط کشت بالستسیست غنیسازی شده با جایگزین سنتز شده سرم کشت داده شدند. 31 درصد از این ریانها با کیفیت کم تا رز 3 به مرحله بالستسیست تکین یافتند برای انجماد م استفاده قرار گرفتند. تراکم ریان برای بخش دم مطالعه بیان نشده بد. استفاده از تراکم بسیار باالی ریان: به این منظر Ali 282 همکاران )39( به مقایسه کشت در فق ریز قطره کشت ادامهدار در فق ریز قطرهها برای کشت ریانهای انسان به منظر استاندا نمدن ریه کشت در ریز قطرهها پاختند. ریانها به صرت انفرادی در ریزقطرهها زیر پششی از رغن معدنی به حجمهای میکرلیتر یا در فق ریز قطرهها به حجم 4/3 تا 2 میکرلیتر کشت داده شدند. انتقال ریان در رز 2 به قع پیست. همچنین نسازی ریزقطرههای محیط کشت به صرت رنه در مقابل کشت ادامه یابنده بدن نسازی محیط کشت تا رز پایانی کشت برنتنی ریان م ارزیابی قرار گرفت. هر د رش استفاده از فق ریز قطرهها چه به صرت ادامه یابنده چه به صرت استفاده از ریک نسازی رنه محیط کشت دارای برتری در مقایسه با رش استفاده از ریز قطرهها را نشان داد. برتری استفاده از فق ریزقطرهها در زمینه آبستنی کلینیکی نرخ النهگزینی ریان در زنان کمتر از 30 سال در مقایسه با استفاده از ریز قطرهها قابل مشاهده بد. تراکم بسیار باالی ریان همزمان با عدم تعیض محیط کشت به صرت رنه به اعتقاد این گره تحقیقاتی این امکان را که ماد مغذی ریان در محیط کشت تجمع یابند را فراهم نمده منجر به ارتقا بازده نهایی کشت برنتنی ریان انسان شده است. یک تضیح قابل ارایه در م بد رند تکین ریان با افیش تراکم ریان در محیط کشت میتاند به تجمع فینده ماد یا عامل مثبت مثر تراش شده از ریانها باشد که به منظر برقرار نمدن رابطه با محیط دستگاه تناسلی مادر تلید میشد باشد. در حقیقت این تجمع فینده عامل مترشحه از ریانها به طر مثری مجب شرایطپذیر شدن تقیت محیط کشت خاهد شد. Kapiteijn همکاران )38( محیطهای کشت را پس از در معرض قرار گرفتن با ریانهای درحال تکین جمعآری نمده تمام نمنههای حاصل را باهم مخلط کند )محیط کشت شرایط پذیر شده با ریان( این گره تالش نمدند تا با مشخص نمدن عامل اتکراین / پارارکراین / جاکستاکراینی که می- تانستند در رند تشکیل عرق در زمان النه گزینی مثر باشند اقدام نمایند. سه محیط کشت مخلط شده )A-C( به عنان محیطهای کشتی که در معرض ریانهای درمرحله کلیاژ قرار گرفته بدند مشخص شدند ( محیطهای کشت در معرض ریان 9-2 سللی رز 3-4 رز 1 معادل رز بازیافت اسیتها در نظر گرفته شده است( یک محیط کشت به عنان محیطی که در معرض ریان تا تکین تا مرحله بالستسیست )محیط D( بد )رز 3 تا 3( م استفاده قرار گرفت. مدل م استفاده برای این 283 مطالعه الین سللی مربط به سللهای ریز عرق اندتلیال بافت آندمتریم رحم بد این الین سللی در شرایط برنتنی از طریق فعالیتهای عرقسازی بعد از در معرض قرار گرفتن با VEGF-A hcg پاسخ میدهند. در حضر محرکهای فعال کننده تلید عرق سللهای اندتلیال از ساختارهای کاپیالری یا للهها به سمت ماتریکس فیبرین مهاجرت مینمایند. سیستم سللی hemvec در معرض محیطهای کشت شرایطپذیر شده مذکر در باال قرار داده شدند. مخلط A محیطهای کشت تکثیر سللی را در مقایسه با گره کنترل ارتقا داد )گره کنترل محیط کشت شرایط پذیر شده نبد(. مخلط,B,C D محیط- های کشت شرایطپذیر شده نشان دادند که عامل محلل مجد دراین محیطهای کشت شرایطپذیر شده قادر به تحریک Ultramicrodrop (UMD) hemvec 291

241 تشکیل لله در قیاس با گره کنترل بدند. به چالش کشیدن محیطهای کشت شرایطپذیر شده به سیله VEGF-A محلل ابسته به دز نشان داد که قدرت فعالیت عرق سازی محیط کشت شرایط پذیر شده در قیاس با گره کنترل بسیار بیشتر می- باشد. در نهایت نتایج این مطالعه نشان داد که VEGF-A در محیط کشت شرایطپذیر شده حضر دا. با تجه به جمیع جهات این دادهها نشان داد که ریانهای در مرحله کلیاژ VEGF-A زیست فعال شده را در شرایط برنتنی از خد تلید مینمایند. اگرچه این مطالعه تالشی در راستای ارزیابی تراکم ریان به عمل نیاه بد اما نشان داد که عامل ارتباطی مثبت با اسطه ریانهای انسان در شرایط برنتنی تراش تجمیع میشند. به منظر بهره جستن از عامل مضعی تلید شده تسط ریانها Vajta همکاران )21( با استفاده از ظرف کشت WOW در رند کشت برنتنی ریان که در آن حفرهای بسیار کچک در کف ظرف کشت ایجاد شده است برای کشت ریان انسان استفاده میشد فراهم کننده ریز محیط انحصاری برای ریان میباشد تانست هر عامل مثبت تراش شده تسط ریان را به طر مستقیم در اطراف ریان تغلیظ تجمیع نماید. قطر WOW استفاده شده در این مطالعه تقریبا در حدد 231 میکرمتر بد عمقی در حدد 211 میکرمتر داشت از نظر شکل کامال مقعر بد. ریزچاهکها با استفاده از فشار مکانیکی تلید شده بدند. اینکار با استفاده از یک سزن ته گ استریل که از داخل رغن معدنی محیط کشت عبر داده شده به کف ظرف برخد نمده انجام شده است. در نهایت پس از برخد به کف چاهک اصلی با نیری چرخشی ریز چاهک م نظر تلید شده است. دراین رابطه 2 مطالعه ارایه شده است. در مطالعه ال از ریانهای خاهر برادر استفاده شده که در نهایت 423 اسیت لقاح یافته به ظرف کشت معمل کشت انفرادی ریان یا استفاده از WOW م کشت برنتنی ریان قرار گرفتند. هیچ تفات معنیداری بین گرهها در زمینه تعداد ریانها با 0 سلل یا بیشتر در رز 3 یا درجه کیفی ریان در رز 3 مشاهده نشد ( رز 1 رز بازیافت اسیت از تخمدان بیماران میباشد(. مشاهدات در رز 3 2 نشان داد که تکین ریانها به بالستسیست به طر معنیداری در ریانهایی که در سیستم WOW کشت داده شده بدند در مقایسه با گره کشت معمل باالتر بده است. در مطالعه دم تمام اسیتهای لقاح یافته )310 اسیت( در WOW کشت داده شدند. نرخ تشکیل بالستسیست در این گره %18/9 در رز 3 بد در کل 81 ریان از مجمع 310 ریان به پذیرندهها انتقال داده شدند که در نهایت منتج به آبستنی کلینیکی با نرخی معادل %19/8 با نرخ النه گزینی %30 به ای هر ریان انتقال داده شده بد. محیطهای کشت پیدرپی معمال برای کشت ریان پستانداران م تجه قرار دا در این سیستم از کشت برنتنی ریان الین سری از محیط کشت برای کشت برنتنی ریان از مرحله لقاح برنتنی تا رز 3 بعد از لقاح دمین سری از محیطهای کشت برای کشت ریان از رز 3 تا رز 3 یا 2 م استفاده قرار میگی. منطق استدالل تجیح کننده استفاده از محیطهای کشت پیدرپی نیازهای تغذیهای اختصاصی ابسته به مرحله رشد تکین ریان / یا نیازهای متغیر ابسته به مرحله تکین ریان میباشد نکته قابل سال این است که آیا این امکان که تراکم ریان نیز مانند نیازهای تغذیهای به مرحله تکین ریان ابسته باشد نیز جد دا یا خیر Rebollar-Lazaro Matson )24( به ارزیابی کشت ریان با استفاده از د سیستم کشت که عبارت است از 4( کشت گرهی تا رز )3-3 3 ریان در هر گره( در پی کشت انفرادی تا مرحله بالستسیست تا رز 3 2 2( کشت انفرادی برای تمام طل دره کشت ریان پاختند. حجم محیط کشت برای این مطالعه 43 میکرلیتر بد که به صرت ریزقطرههای پشانده شده تسط رغن معدنی م استفاده قرار گرفت ( تراکم ریان به ترتیب 4:3 تا 4:3 در مقایسه 4:43 میکرلیتر برای کشت گرهی انفرادی(. نتایج این مطالعه هیچ تفات معنیداری بین د گره تیمار برای آبستین کلینیکی نرخ النهگزینی نشان نداد فقط در بیماران کمتر از 33 سال نرخ تکین ریان تا مرحله بالستسیست در گره کشت جمعی ریانها به چشم آمد. د سیستم کشت دیگر که شامل کشت گرهی ریان برای تمام مدت کشت برنتنی ریان کشت انفرادی تا رز 3 سپس کشت گرهی تا رز 3 یا 2 بد متاسفانه در این مطالعه م بررسی قرار نگرفته بد. لازم کالسیک معمل م استفاده در کشت برنتنی ریان از جمله ظرف پتری کف صاف چاهکهای ته صاف یا ته گ للههای آزمایشگاهی میباشند. شایان ذکر است که محصالت جدید بسیار اندکی در این راستا تلید شدهاند که تانایی بهرهمند شدن از میای افیش تراکم ریان در مرحله کشت برنتنی را داشته باشند. در مطالعه اخیر با استفاده از 295

242 ریانهای انسان Ebner همکاران )22( ریانهای خاهر برادر را با استفاده از سه ریه کشت برنتنی ریان با بهره گرفتن از ظرف Embryo Corral کشت دادند. در این مطالعه ریانها به صرت انفرادی-گرهی اما به صرت جداشده تسط مانع یژه گرهی بدن مانع حایل کشت داده شدند. تراکم ریان بر پایه 31 میکرلیتر حجم ریزقطره محیط کشت تراکم ریان معادل 4:023 4:31 4:023 برای سیستمهای کشت مذکر در نظر گرفته شد. استفاده از ریان در مرحله بالستسیست به منظر انتقال به رحم پذیرنده فارغ از نع سیستم کشت به کار گرفته شده بهترین نتایج را در پی داشت. به ضح نشان داده شد که افیش تراکم ریان بدن در نظر داشتن اینکه مانع حایل بین ریانها قرار دا یا خیر منجر به افیش معنی داری در تمامی معیارهای بنا شده به منظر ارزیابی ریان شد بیشینه تعداد ریان به ای حجم محیط کشت در مقابل کمترین حجم محیط کشت برای کشت انفرادی ریان سال این است که بهترین تراکم ریان برای کشت برنتنی چه مقدار میباشد آیا کشت جمعی ریان بهتر است بدتر است یا با کشت انفرادی زمانی که تراکم ریان در این د نع سیستم کشت مشابه است تفاتی ندا چه حجمی از محیط کشت حجم بهینه برای کشت گرهی یا انفرادی ریان تعریف میشد آیا امکان برزآثار مخرب درصرت کاهش حجم محیط کشت به زیر آستانه تعریف شده جد دا با کشت گرهی ریانها با تراکم بسیار باال تجمع عامل منفی از جمله آمنیم درصرتی که در محیط کشت گلتامین حضر داشته باشد به قع میپیندد همچنین تخلیه محیط کشت از منابع انرژی نیز به عنان یکی دیگر از عاقب کشت ریان با تراکم بسیار باال میباشد. سال نهایی این است که چه زمانی تعادل بین عامل مثبت منفی از بین میرد یک تصیه در این راستا این است که ریانهای انسان در تراکم باالتر از 4 : 2/23 میکرلیتر کشت داده نشند )یا به عبارت دیگر بیش از 1 ریان در هر 23 میکرلیتر از محیط کشت قرار داده نشد( این کار به منظر ممانعت از کاهش ماد مغذی تجمیع عامل منفی در ریز قطرهها میبایست انجام شد )23(. کسانی که این تصیه را انجام دادهاند در ادامه تصیه خد را تعدیل نمده بیان کهاند که )21( بیشترین تراکم ریان به منظر انجام یک رند کشت استاندا معادل 4:4223 میکرلیتر است )بیشتر از 1 ریان در 31 میکرلیتر محیط کشت مجاز نمیباشد به عاله محیط کشت میبایست هر 19 ساعت یکبار تعیض شد(. جایگزین نمدن گلتامین با یک دیپتیتد مانند آالنین-گلتامین این تضمین را ارایه مینماید که مقدار تلید آمنیم در محیط کشت به کمترین مین خد کاهش یابد )1-4(. نمنههای اندکی جد دا که با استفاده از 3 میکرلیتر محیط کشت کشت انفرادی ریان اثرات مخربی مشاهده ننمدهاند )43 33(. Ali )39( از محیط کشت به کمی میکرلیتر استفاده نمد.در این مطالعه نیز هیچ اثر مخربی مشاهده نک )انتقال ریان در رز 2 انجام گرفته بد(. بنابراین مشخص است که کمینه حجم محیط کشت برای کشت انفرادی ریان هنز به طر قطعی مشخص نشده است افیش تراکم ریان کشت گرهی چند ریان را میتان با همدیگر در حجم مشخصی از محیط کشت نگهداری نمد آیا نقطهای جد دا که تراکم ریان بیش از آن حد منجر به کاهش تانایی محیط کشت از حمایت پیشب تکین ریان شد یا مقدار تراکم بهینه که دراثر آن عامل منفی حاصل از ریانهای کشت داده شده تانایی غلبه بر آثار مفید عامل مثبت تراش شده از ریانها را نداشته باشند چقدر است de Oliveira همکاران )23( به ارزیابی رند تکین اسیت بالغ شده در شرایط برنتنی همچنین درپی آن لقاح یافته در شرایط برنتنی پاختند در این مطالعه به بررسی ریانها در گرههای یا 31 ریان که در 411 میکرلیتر محیط کشت نگهداری میشدند پاخته شد. معیارهای اندازگیری شده شامل نرخ کلیاژ تکین در رز 9 )بالستسیست تسعه یافته( بیان - HSP Glut- بد. نرخ کلیاژ تکین ریان به مرحله بالستسیست تسعه یافته به سرحد ممکن خد خاهد رسید درحالی که این معیارها به طر معنیداری برای ریانهای کشت داده شده در گرههای 31 تایی در مقایسه با گرههای 21 تایی یا گرههای کچکتر کمتر باشد. بیان Glut-4 بین گرههای مختلف تفاتی نداشت. درحالی که بیان 01-4 HSP به طر معنی داری با افیش تعداد ریانها در هر ریز قطره افیش مییابد این افیش تا زمانی که 296

243 تراکم ریانها به بیش از 21 ریان در هر ریز قطره برسد ادامه دا اما کاهش در بیان 01-4 HSP در تراکم ریان 31 ریان در هر ریز قطره به کاهش تکین ریانها در این تیمار مرتبط میباشد. با استفاده از ریان گای کشت آن در ریز قطرههای 31 میکرلیتری که در شرایط برنتنی بالغ تلقیح شده بدند Nagao همکاران )22( نشان دادند که کشت ریان تا 411 عدد در هر قطره بدن هیچ نع اثر مخرب بر تکین ریان امکانپذیر است. همچنین این گره نشان داد که تغییرات در حجم ریز قطرهها نیز منجر به تحت تاثیر قرار گرفتن رند تکین ریان نشد. این مطالعه همچنین به بررسی غلظت اکسیژن افزدن یا حذف نمدن فسفات معدنی از محیط کشت پاخته بد. برای ریانهای کشت داده شده در ریز قطرههایی به حجم 31 میکرلیتر که به صرت انفرادی یا به صرت گرههای متشکل از 3 ریان کشت داده شده بدند رند تکین با کاهش فشار اکسیژن حذف فسفات معدنی به طر معنی داری افیش یافت. این مطالعه همچنین نشان داد که بین محیط کشت ترکیب گازی م استفاده در انکباتر تراکم ریان ارتباط معنی داری جد دا. با تجه به کشت برنتنی ریان انسان تراکم 31 ریان در هر قطره 411 میکرلیتری یا 411 ریان در هر قطره 31 میکرلیتری بهنظر امری صحیح نمیباشد. اما در مطالعهای که تسط Ali همکاران )39( انجام شد تراکم ریان تا 8 ریان در هر 4/3 میکرلیتر از محیط کشت افیش یافته بد این مساله از دیگاه تکنیکی میتاند چالش برانگیز باشد به نعی بیان کننده این باشد که میتان 311 ریان را در ریز قطره 31 میکرلیتری کشت داد. اینکه محیط کشت رنه تعیض میشد یا اصال تا پایان کشت تغییری در آن ایجاد نمیشد این نکته که انتقال ریان در رز 2 اتفاق افتاده است از جمله نکاتی میباشد که میبایست م تاکید قرار بگی. کشت ریان در این مین از تراکم میبایست با در نظر داشتن احتیاطهای الزم صرت بگی زیرا مصرف ماد مغذی تلید متابلیتها به طر کامل تعریف مشخص نشده است. آیا این امکان جد دا که در کشت گرهی ریان ریانهایی با کیفیت پایین یا تخریب شده بتانند آثار منفی مخربی از خد بر مجمعهای از ریانهای سالم باکیفیت اعمال نمایند در مطالعهای با استفاده از ریانهای مشی حاصل از لقاح برنتنی به بررسی تضیح در این رابطه پاخته شده است. در مطالعه 4 Salahuddin همکاران )20( به ارزیابی مضع تراکم ریان پاختهاند )تعداد ریانها به ای حجم محیط کشت( جایی که یا 21 ریان به صرت گرهی در محیط کشت به حجم 21 میکرلیتر زیر پششی از رغن معدنی کشت داده شدند. آثار مفید کشت گرهی ریان به اسطه نرخ باالتر ریان های تکین یافته به مرحله بالستسیست کاهش زمان الزم برای تفریخ ریان با افیش تراکم ریان افیش یافت. در مطالعه 2 به بررسی اهمیت کشت ریانهای درحال تکین در محیط کشت به حجم 21 میکرلیتر با تعداد مسای از ریانهای بارر نشده پاخته شد. نسبت ریانهای تکین یافته به مراحل باال )گذر از مرحله مرال رسیدن به بالستسیست م نظر میباشد( به طر معنیداری با حضر سللهای تخم لقاح نیافته یا در حال تخریب در مقایسه با گره کنترل کاهش یافت. آزمایش 3 به بررسی تکین ریان به صرت انفرادی 41 ریان در هر قطره از محیط کشت 41 ریان به همراه 41 سلل تخم لقاح نیافته در ریزقطرههایی به حجم 21 میکرلیتر پاخت. مجدادا افیش تراکم ریان نرخ تکین را افیش داد. درحالی که همکشتی ریانها با سللهای تخم لقاح نیافته نرخ تکین ریانها را دچار کاهش نمد. آیا این امکان که تاثیرات بر تکین ریان به دلیل تفات در مراحل متفات تکین تفات در تعداد سللهای ریان زمانی که به صرت گرهی کشت داده میشند باشد لقاح تقسیمات سللی پیآیند آن فرایندهایی نیستند که در تمام ریانها در یک زمان به قع بپیندد. حتی در شرایطی که برای کاهش اختالف زمانی بین قع لقاح از رند ICSI استفاده میشد. Jones همکاران )32( از سیستم کشت گرهی ریان با تجه به دسته بندی دقیق ریانها مطابق با مرحله تکین ریانها استفاده نمدند. ریانها در دستههای )3-2( تایی در ریزقطرههای 41 یا 21 میکرلیتری تا رز 3 )رز 1 رز بازیافت اسیت در نظر گرفته میشد( کشت داده شدند در این رز ریانها یا در همان دسته خد نگداری شده یا براساس مرحله تکین ریانهای یکسان از نظر تعداد سلل در یک دسته قرار داده شده کشت ادامه پیدا میکند. حجم محیط کشت م استفاده در این رش 41 یا 31 میکرلیتر بد. دستندی ریانها به گرههایی با ریانهایی دارای تعدا مشابهی از سلل بعد از سپری نمدن 2 دره تکرار استاندا شد. هیچ آبستنی مفقی از تکرارهای ابتدایی بدست نیامد نگرانی جد داشت که ریانها با تعداد سلل کم ممکن است که به طر منفی بر ریانهای با 297

244 کیفیت بهتر تاثیر گذار باشند. با استفاده از تعداد زیادی از ریانهای گای حاصل از کشت برنتنی Larson Kubisch سال مشابهی را مطرح نمدند. آیا این امکان جد دا که ریانهای پیشرفتهتر از منظر سپری نمدن رند تکین برای مثال ریان در مرحله بالستسیست از تکین ریانهای مراحل ابتداییتر از نظر تکین برنتنی ممانعت به عمل آرند در یکی از تیمارها ریانهایی که به مرحله بالستسیست رسیدهاند از قطره کشت خارج شده به قطره کشت مجیی منتقل میشند تا ادامه رند کشت را در آن سپری نمایند. البته با تجه به حضر همزمان ریانهای درحال تکین دیگر که در مرحله یکسانی از نظر تکین قرار دارند این امر باعث میشد تا اثرات محتمل این ریانها بر ریانهایی که سرعت تکین آهستهتری دارند حذف شده این ریانها به تنهایی در ریزقطرههایی که برای کشت در نظر گرفته شده بدند ادامه رند تکین رشد خد را سپری نمایند. در دمین تیمار تمام ریانها بدن در نظر داشتن مراحل متفات تکین در سیستم کشت گرهی نگهداری میشند. نیسندگان این مقاله چنین نتیجه گیری نمدن که هیچ تاثیر منفی ممانعت کننده از ریانهای پیشرفتهتر در مراحل تکین در سیستم کشت گرهی به ریانهایی که از نظر سپری نمدن رند تکین آهنگ کندتری دارند اعمال نمیشد. حضر ریانهایی که نتانستهاند تکین یابند نسبت ریانهای تکین یافته به مرحله بالستسیست را تغییر نمیدهند از رند تفریخ بالستسیست نیز ممانعت به عمل نمیآرند. این نکته نیز نشان میدهد که ریانهایی که با سرعت کمتری رند تکین را سپری مینمایند از رند تکین ریانهایی که در مراحل پیشرفتهتری حضر دارند ممانعت به عمل نمیآرند. در حقیقت بالستسیستهایی که در ریزقطرههای خد از ابتدا نگهداری میشند به قطرههای دیگر منتقل نمیشند نرخ باالتری از تفریخ بالستسیستها را در مقایسه با آنهایی که به قطرههای دیگر منتقل شدهاند را از خد برز میدهند. اگرچه مای که در ادامه مطرح میشد ارتباطی به تراکم ریان به معنی سنتی آن ندا 3 نکته حایز اهمیت از یافتههای مطالعات مرتبط در این زمینه به شرح زیر است 4( اثر 281 بالستمرهایی که لیز شدهاند بر تکین سایر بالستمرهای سالم قابل ذکر میباشد )28( 2( اثر الگی بخشبخش شدن میای خارج نمدن رنه این بخشها بر رند تکین ریان )01( 3( اثر مفید خارج نمدن بالستمرهای تخریب شده از ریانهای یخگشایی شده در مرحله کلیاژ )04(. این مطالعات به طر بسیار قاطع پیشنهاد مینماید که نزدیکی ماد درحال تخریب یا اج تخریب شده از سلل میتاند به صرت منفی بر رند تکین بالستمرهای سالم تاثیر بگذا افیش تراکم ریان کشت انفرادی ریان کمترین حجم محیط کشت ریان که به منظر کشت انفرادی ریان میتاند م استفاده قراربگی چه مقدار میباشد آیا ماد مغذی دسترس باگذشت زمان به طر معنی داری دچار نقصان کاهش میشد آیا ریانها کشت داده شده به صرت انفرادی تحت تاثیر احتمل برز خطر عامل منفی بیشتری قرار میگیرند در مطالعهای که تسط )39( Ali به انجام رسید استفاده از فق ریزقطرها کشت ادامه یابنده در فق ریز قطرهها در دستر کار قرار داشت. ریانها به صرت انفرادی در قطرههای بزرگ با اندازه میکرلیتر زیر پششی از رغن معدنی کشت داده شدند یا در فق ریزقطرههایی به حجم 2-4/3 میکرلیتر کشت داده شدند. به عاله نسازی محیط کشت در مدت کشت برنتنی ریان به صرت رنه با شرایط کشت ادامه یابنده بدن نسازی محیط کشت تا رز آخر کشت برنتنی ریان م مقایسه قرار گرفت. هر د رش استفاده از فقریزقطرهها کشت با فقریزقطرهها به صرت ادامه یابنده به عنان رشهایی که بهترین نتایج را در باشتند معرفی شدند. این رشها منجر به افیش نرخ آبستنی کیلینیکی باالتر نرخ النهگزینی بیشتری برای ریانهای بدست آمده از زنان کمتر 30 سال در مقایسه با کشت در قطرههای کشت متدال شد. تراکم بسیار باالی ریان در ترکیب با عدم تغییر در محیط کشت این امکان را فراهم نمده که عامل اتکراین تلید شده از ریانها متراکمتر شده در نتیجه بتانند با مقدار بیشتری در دسترس ریان قرار بگیرند. استفاده از ریزقطرهها به حجم 3 میکرلیتر تسط Dumoulin همکاران )43( مشخص نمد که انتخاب محیط کشت )د محیط کشت م بررسی قرار گرفت( به طر معنیداری تکین برنتنی ریان در رز 2 تا 3 را تحت تاثیر قرار میدهد )رزهای انتقال ریان(. همچنین زن تلد نتاج نیز به این سیله تحت تاثیر قرار خاهد گرفت. درحالی که این fragmentation 298

245 مطالعه به طر یژه به منظر مطالعه بررسی تراکم ریان طراحی نشده بد استفاده از 3 میکرلیتر محیط کشت برای کشت انفرادی ریان مفقیت آمیز بد. اگرچه ممکن است که فرمالسین محیط کشت با تراکم ریان به عنان عامل مرتبط با هم 283 باشند. سیستم ریز سیال اخیرا تلید شده م استفاده قرار گرفته است. این سیستم تانایی تلید برقرار نمدن محیطهای کشت در حجمهای بسیار کچک در مقیاس میکرلیتر را دا. Melin همکاران )02( خانههای کشت برای کشت نگهداری ریان در شرایط برنتنی را طراحی نمدند که دارای دریچههایی میباشند که در هر یک از طرفین محفظه قابلیت بسته شدن را دارا میباشند این سیستم به طر بهینه تانایی تبدیل به محیط کشت ثابت را دارا میباشد این اتفاق تبدیل شدن سیستم به محیط ثابت زمانی به قع میپیندد که ریانها به محفظه ا شده یا جریان محیط کشت به محفظهها سرازیر شده است. در این سیستم 1 محفظه با حجمهای نانلیتر طراحی شده است. برای این مطالعه ریانهای مش در مرحله 2 سللی برای کشت رشد در محفظههای 411 نانلیتری انتخاب شد. تراکم ریان در این مطالعه معادل 2 ریان بهای 411 نانلیتر محیط کشت میباشد. گره کنترل از ریانهای مش 2 سللی که در سیستم کشت سنتی با ظرف عادی کشت مراحل تکین را سپری مینمدند تشکیل شده بد. در این بخش 2 ریان در قطرههای 3 میکرلیتری 2 ریان در قطرههای 21 میکرلیتری 41 ریان در قطرههای 21 میکرلیتری کشت داده شده بدند. تکین ریانهایی که در گرههای 2 تایی در قطره 411 نانلیتری کشت داده شده بدند به مرحله بالستسیست کامال مشابه نرخ تکین ریانهایی بد که در گرههای دتایی در قطره 21 میکرلیتری کشت داده شده بدند )94/9 %93/3 به ترتیب( درحالی که تکین ریانهایی که در قطرههای 3 میکرلیتری کشت شده بدند به طر معنی داری پایینتر بد که مقداری معادل %3/3 از ریانها به مرحله بالستسیست تکین یافته بدند. تبخیر محیط کشت در زمان آماده سازی ظرف کشت به عنان عامل مشکک در این کاهش نرخ بالستسیست در نظر گرفته شده است. در مطالعاتی که تسط Vutyavanich همکاران )03( انجام شده بد تراکمهای متغیر ریان به اسطه تغییر در 4( تعداد ریانها در هر ریزقطره استاندا 2( تغییر حجم محیط کشت استاندا به ای تعداد استاندا ریان م ارزیابی قرار گرفت. ریانهای د سللی به دست آمده از شرایط درن تنی حاصل از اجرای برنامه سپراالسین از مشهای نژاد ICR برای انجام 3 آزمایش م استفاده قرار گرفت. معیارهای م بررسی در این آزمایش ارزیابیهای ظاهری افتراقی تعداد کل سللهای ریانها بدند. برای الین آزمایش ریان در ریزقطرههایی به حجم 41 میکرلیتر کشت داده شدند. هیچ تفات معنی داری در زمینه معیارهای ظاهری ابتدایی بین تراکمهای متفات ریان مشاهده نشد. اما تعداد سللهای ICM ترفکتدرم برای ریانهایی که به صرت انفرادی کشت داده شده بدند بسیار پایین- تر بد )کمترین تراکم ریان( این مقدار در مقایسه با باالترین تراکم ریان که 43 ریان در 41 میکرلیتر محیط کشت بد در کمترین مین قرار گرفته بد. در آزمایش شماره 2 تکین تعداد سللهای ریان کشت داده شده به صرت انفرادی در قطره- های میکرلیتر م ارزیابی قرار گرفت. معیارهای تکین ظاهری جالب تجه اینکه تعداد سللهای ICM به طر معنی داری بین تیمارهای مختلف تفات نداشت. در آزمایش شماره 3 به ارزیابی کشت 2 ریان در هر قطره با حجمهای 4 1/3 2 میکرلیتر پاخته شد. در این گره نیز هیچ تفات ظاهری یا تفات در تعداد سللهای ریان در 3 گره کشت با حجمهای مذکر مشاهده نشد. الگهای مشاهده شده ازنتایج این مطالعه مشخص نمد که دبرابر نمدن تراکم ریان در به اسطه کشت گرهی ریانها منجر به افیش تعداد سللهای ریان برای هر سه حجم از محیط کشت میشد. در نتیجه افیش تراکم ریان به اسطه افیش در تعداد ریان در حجم ثابتی از محیط کشت نسبت به افیش تراکم ریان در کشت انفرادی از طریق کاهش حجم محیط کشت کاربیتر بد قابل تصیه میباشد. Hughes همکاران )01( نشان دادند که کشت گرهی ریانها منجر به برز آثار حفاظت کننده میشند این آثار به یژه در کاهش سمیت هیدرپراکسیدهای معمل که به محیطهای کشت افزده میشند مشاهده میشد. ریانهایی که به صرت انفرادی کشت داده میشند به طر معنیداری در قیاس با ریانهایی که به صرت گرهی کشت داده میشند نرخ تکین کمتری را نشان میدهند. اما حتی اثرات محافظت کننده ریانها در سطح باالی ماد سمی کاهش مییابد. microfluidic platform 293

246 .3-42 کشت پیای ریان اگرچه بیشترین تاکید در این بحث بر محر تراکم ریان استفاده از سیستم کشت ثابت ریان بده است کشت در چاهک لله آزمایش کشت پیا کشت در ظرف کشت ساده سیستم ریزسیال نیز به عنان ریکهای جایگزین م تجه در این بخش بیان شده است. درحال حاضر سیستم کشت ریزسیال به سادگی آسانی در آزمایشگاههای معمل IVF دخیل نمی- باشند. اگرچه در این زمان این سیستم از کشت به عنان یک سیستم کاربی عملی به اثبات رسیده است در این سیستم همانند سیستم معمل گذشته نیازی به جابهجایی اسیت بالغ شده افزدن اسپرم به آن سپس خارج نمدن اسیت لقاح یافته افزدن محیط مربط به کشت برنتنی ریان نمیباشد بکله همه این اتفاقات به صرت برنامهریزی شده در یک ظرف اتفاق میافتد بدن اینکه نیازی به جابهجایی سلل تخم ریان لقاح یافته یا تعیض ظرف به منظر تغییر محیط کشت احساس شد )03(. سیستم کشت خدکار این امکان را فراهم میآ که محیط کشت در اطراف ریانها به صرت پالسی یا به طر مدام درحال چرخش بده ماد یا عامل خاص م نیاز در هر زمانی از تکین ریان به صرت اتماتیک به محیط کشت افزده شد. سیستم کشت ریزسیال میتاند همچنین به منظر مطالعه رشهای کشت ثابت پیا م استفاده قرار بگی به گنهای که نیاز به جابهجا نمدن ریان نباشد. همچنین میتان این سیستم را به گنهای طراحی نمد که محیط کشت مصرف شده از اطراف ریان خارج شد محیط تازه به آن افزده شد. یکی دیگر از رشهای کاربی به منظر دستیابی به سیستم کشت پیا شامل قرار دادن ظرف کشت ری صفحهای میباشد که درحال چرخش / یا دارای شیب کم درجه قابل کنترل باشد. شیبدار نمدن / یا چرخش ظرف کشت ممکن است که منجر به این شد که محیط کشت در نزدیکترین ناحیه به ریانها که محل تجمع عامل منفی حاصل از متابلیسم ریانها میباشد هماره درحال گش یکناخت نمدن محیط شد. اما همچنین این تحرک ممکن است که ریان را در معرض فشارها نیرهای مکانیکی قرار دهند که ممکن است در شرایط درنتنی نیز با آن ماجه شند )09-02(. سیستم کشت ریزسیال همچنین میتاند با سیستم شیبدار نمدن ظرف کشت ادغام شده تا بتاند حرکات مجی مجد در ایداکت را شبیه سازی نماید این مسئله تسط Kim همکاران نشان داده شده است )08(. در این مطالعه تکین ریانهای گا با استفاده از 2 رش کشت بررسی شد. این د سیستم عبارت بدند از 4( سیستم کشت پیا که دارای سیستم شیبدار نمدن ظرف کشت دارای ریزکانلهای حای محیط کشت میباشد 2( ریز قطرههای استاندا. تکین ریانها با استفاده از کشت پیا در قیاس با رش کشت معمل برتری قابل تجهی داشت. استفاده از ریان در حجم 41 میکرلیتر از محیط کشت تسط Heo همکاران )91( به عنان محیط کشت ثابت در مقایسه با سیستم کشت میکرفانل ثابت )سیستمی که هیچ تحرکی از محیط کشت در ریزللههای آن ایجاد نمیشد( همچنین در قیاس با سیستم ریزللهای پیا )حرکت پالسی محیط کشت در ریزللها ایجاد میشد( م ارزیابی کیفی قرار گرفت. استفاده از سیستم- های میکرفانل منجر به افیش در کینتیک تکین ریان مش به دست آمده از شرایط درنتنی میشد. همچنین تعداد سللهای بالستسیست تلید شده در سیستم میکرفانل با تحرک فعال محیط کشت به طر معنی داری باالتر از تعداد سلل- های بالستسیست به دست آمده از سیستم کشت ساده میباشد سیستم کشت ساکن سایل کشت ریان از ظرف شیشهای به ظرف پالستیکی یکبار مصرف استریل گرایش پیداکهاند البته الزم به ذکر است که در بخشی از ما هنز ظرف شیشهای استفاده میشد. للههای آزمایش چاهک ظرف کشت بافت پیپت پاستر لله میینه شیشهای ظرف چاهک دار سلل ظرف پتری در سایزهای متفات در رند کشت برنتنی ریان استفاده میشد. جه مشترک تمام این سایل این است که ریان در تمام مراحل کشت به صرت ساکن در جایگاه خد در انکباتر نگهداری میشد در تمام مدت کشت بدن محمت در جایگاه خد نگهداری میشد. به جز برخی ما نادر تمام آزمایشگاههای IVF از ظرف پتری کف صاف استریل پالستیکی استفاده مینمایند در این رش از ریزقطرههایی با حجمهای متفات که با رغن 211

247 معدنی پشانده میشند استفاده میشد. استفاده از ظرف چاهک دار ظزف کشت بافت با ته صاف یا ته گ با در نظر داشتن استفاده از رغن معدنی یا بدن پشش رغن معدنی نیز معمل میباشد. نسلهای جدید متنعی از ظرف کشت طراحی شده که به طر یژه برای کشت برنتنی ریان م استفاده قرار میگی. بیشتر این ظرف ارن دسترس میباشند به گنهای که تانایی اجرای کشت گرهی انفرادی ریان با این ظرف برای تمام آزمایشگاهها جد دا. بحث مطرح شده در ادامه متمرکز بر جنبههای فیزیکی تراکم ریان شامل کشت گرهی یا انفرادی ریان میباشد تاییدیه اصل الیه این مباحث در این بخش م اشاره قرار گرفته است ناحیه مثر در برگیرنده ریان در کشت ساکن فاکترهای رشد محلل قابل اندازهگیری سایر ماد تراش شده تسط ریانها برای رند تکین ریان بسیار حایز اهمیت میباشند )ترفیک( ارتباط بین ریانهای درحال تکین محیط پیرامنی آنها در دستگاه تلید مثلی مادر نیز از جمله مای است که تسط این عامل به انجام میرسد. همچنین شاهد مستقیمی جد دا که اج محیط کشت تا حددی به سیله خد ریان م تغییر تبدیل قرار میگی از جمله این تغییر تبدیلها تغییر در اسیدهای آمینه در طل مدت زمان 21 ساعت بعد از آغاز کشت میباشد. با تجه به ریک کشت ساکن ریان شاهد کافی مبنی بر جد ناحیه مثر یا گرادیانی از اکسیژن محلل پتاسیم کلسیم در پیرامن ریان جد دا. این گرادیان به سیله انتشار حفظ شده تا محددهای در حدد 31 میکرمتر از اطراف ریان قابل اندازهگیری میباشد. )94 92(. Lopes همکاران )93( نشان دادند که )با استفاده از )EmbryoSlide گرادیان اکسیژن به اسطه انتشار نگهداری شده میتان با استفاده از ریانهای گای کشت داده شده به صرت انفرادی در چاهکهای 21 میکرلیتری آن را اندازهگیری نمد. تصر بر این است که یک ناحیه ساکن یا شیب غلظت در اطراف ریان که شامل عامل مثبت منفی میباشد در نزدیکترین بخش به ریان شکل میگی. آیا امکان محدد نمدن رند انتشار به سیله ظرف کشت متعدد به منظر بهره مند شدن از میای این عامل جد دا یا اینکه آیا این امکان که حضر ماد عامل مثبت در اطراف ریان به همراه مقدار کافی از محیط کشت حفظ شد جد دا یا خیر برخی مقایسات کامال مشهد است که استفاده از ریزچاهکها در مقابل چاهکهای بزرگتر ظرف کشت کف صاف چاهکهای مقعر قطرههای بزرگتر در مقابل ریزقطرهها کیفیت بهتری دا. از زمان به کار بن ریزقطرهها که به اسطه رغن معدنی نفذپذیر به گاز پشانده شده بدند تسط Ralph Brinstre در دهه 4821 میالدی )با استفاده از ریان مش( این رش در تمام آزمایشگاههای IVF به عنان رش غالب به کار گرفته شد در حقیقت گی سبقت را از چاهکهای کشت بافت لله آزمایشگاهی ربد. قطرههای محیط کشت زیر پششی از رغن معدنی تمایل به تشکیل ساختاری نیمکره مانند داشته که ارتفاع نک آن بیشترین مقدار بده به تدریج که به سمت کنارها پیش میرد از ارتفاع آن کاسته میشد. ارتفاع ریزقطرهها بستگی به کف ظرف پشش کف ظرف درصرت جد زن رغن معدنی که برای پشاندن قطرهها استفاده میشد دا. از میای سیستم کشت ریانها در ریزقطرهها میتان به حرکت آهسته ظرف کشت در زمانهای جابهجا نمدن ظرف کشت اشاره نمد که منجر به حرکت آهسته ریانها به سمت یکدیگر تمایل به تجمع در گرههای نزدیک به هم میشد. ظرف کشت متعددی طراحی شدهاند که امکان حفظ ثبات ریانها در یک منطقه مج در کف ظرف را فراهم نمده تا ریانها بیشترین بهره را از تراشات مثبت حاصل از تراکم ریان را ببرند. طراحی این ظرف کشت نین همچنین برای کاربهایی مانند تصیر باری Time-laps از ریانها در طل رند تکین را فراهم میآ )90-91( بنابراین کارخانههای تلید کننده زیادی جد دا که برای تصیر باری از ریان رندتکین آن دست به تلید ظرف کشت مناسب زدهاند از جمله این محصالت میتان به ما زیر اشاره نمد: USA; Olympus America Inc Olympus VivaView Cryo Innovation Ltd Primo Vision FertilTech A/S Unisense EmbryoScope اشاره نمد. اما سال اینجاست که چقدر الزم است که ریانها به یکدیگر نزدیک باشند تا بتانند از آثار مفید اتکراین/پاراکراین/جاکستاکراین یا اثرات ناحیهای بهرهمند شند همچنین تا چه اندازه 214

248 ریزقطره محیط کشت میبایست کچک باشد یا چاهک محیط کشت چه اندازهای باشد کشت داده میشند بتانند از میای ناحیه اثر مفید بهرهمند شند تا ریانهایی که به صرت انفرادی فاصله بین ریانها د مطالعه به منظر بررسی دقیق مفهم اثر احتمالی ناحیه فعال پیرامن ریان این نکته که ماد مثر برای رشد تکین ریان در این ناحیه محدد تلید نگهداری میشند طراحی اجرا شده در آن سعی شده است که ماد مجد در این ناحیه اندازهگیری شناسایی شد. الین مطالعه شامل کشت ریانهای خکی حاصل از لقاح برنتنی لقاح درنتنی بد. Stokes همکاران )99( ریانها را به صرت انفرادی کشت داده به گنهای که فاصله مناسب بین ریانها حفظ شد. در این مطالع نقطه پایانی م ارزیابی تشکیل بالستسیست بد سپس تعداد کل سللهای مجد در هر بالستسیست حجم بالستسیست م محاسبه قرار میگرفت. ریانهای حاصل از لقاح برنتنی زمانی بهترین نتیجه را تلید نمدن که فاصله بین ریانها میکرمتر بد زمانی که فاصله ریانها به بیش از 211 میکرمتر رسید تانایی آنها در رسیدن به بالستسیست محدد شد. ریانهای بدست آمده از شرایط لقاح درنتنی به مرحله بالستسیست تکین یافتند چه آنهایی که گرهی کشت داده شده بدند چه آنهایی که به صرت انفرادی کشت داده شده بدند حساسیت کمتری به فاصله مجد بین ریانها از خد نشان دادند. اما نکته مهم این بد که در فاصل کمتر از 194 میکر متر سرعت رند تکین ریانها باالتر بد. در مطالعه مشابه دم که تسط Gopichandran Leese انجام شده بد )98( ریانهای حاصل از لقاح برنتنی گا م استفاده قرارگرفتند. ریانها مجداد در شرایط انفرادی مج کشت داده شدند به گنهای که این فاصل قابل اندازهگیری باشد. فاصله بین ریانها دارای تاثیر معنیداری بر رند تکین ریان بد بهترین رند تکین زمانی رخ داد که فاصله بین ریانها از 423 میکرمتر بیشتر نبد. میتان چنین بیان نمد که نتایج این مطالعه نیز مانند مطالعه پیشین بد. اثرات مفید کشت گرهی زمانی که فاصله ریانها به بیشتر از 311 میکرمتر افیش یافت کاهش معنیداری از خد نشان داد. در این حالت هیچ بالستسیستی تلید نشد. شاخصهای متابلیکی )باشت گلکز باشت پیرات تلید پیرات( با دادههای حاصل از تکین برابری مینماید. نشان داده شد که با افیش فاصله بین ریانها بازده متابلیکی ریانها نیز کاسته میشد. در ظرف کشت سنتی کف صاف ریزقطره لقاح تشکیل ساختاری نیمکره مانند ری سطح صاف کف ظرف کشت مینماید ریانها با برخی حرکات چرخشی به هم نزدیکتر شده هرچه قطره بزرگتر شد تمایل ریانها به فاصله گرفتن از یکدیگر بیشتر میشد. یکی از راههای ممانعت از پخش شدن ریانها استفاده از ظرف کشت ته گ یا چاهکهای مقعر میباشد ظرف کشت با مانع گربهسانان اهلی به طر سیعی م مطالعه قرار گرفته بنابراین تکنیکهای کمکی تلید مثل ممکن است که به صرت بهتری در تحقیقات مرتبط با گنههای تحت خطر م استفاده قرار بگیرند. د مطالعه منحصر به ف به بررسی تانایی بالقه کشت گرهی ریانها پاخته: 4( استفاده از ریانهای یک گنه در شرایطی که شاخصهای متابلیکی آنها اندازهگیری شده ریانهای مشابه در یک گره قرار داده شدهاند 2( استفاده از کشت گرهی ریانهای گربه با ریانهای غیر همگنه مانند مش ریانهای گا. آنچه که در م این مطالعه منحصر به ف میباشد استفاده از مانع نایلنی به منظر محصر نمدن ریانها بداینکار به این منظر انجام شد که بین ریانها تماس برقرار نشد. درعین حال ریانها بتانند به صرت آدانه تحرک داشتاشند ماد محلل مجد در محیط کشت درعین حال این امکان را داشته تا بتانند به سادگی در بین بخشهای مختلف بین ریانهای متفات جابهجا شند. در مطالعه ال Spindler )81( Wildt ریانهایی با کیفیت متسط را به صرت انفرادی کشت داده این کشت به این صرت بد که ریانهای گربه تلید شده در شرایط برنتنی با ریانهای کم کیفیت متسط با کیفیت باال به صرت گرهی کشت داده میشند )این تعیین کیفیت با استفاده از مین باشت گلکز تسط اسیت انجام میپذی( یا در بخش دم گرههای ریانها از سنین متفات تشکیل میشد. یک طری نایلنی به عنان 212

249 مانع برای جداسازی فیزیکی ریانهای متسط از تیمارهای ریانهای همراه استفاده میشد کشت در قطرههای 21 میکرلیتری انجام میشد. در الین گره تیمار به نسبت به طر معنیداری بخش بزرگی از ریانهای انفرادی که با مانع فیزیکی از هم جدا شدهاند به مرحله بالستسیست تکین یافتهاند در این گره تعداد سللهای بالستسیست نیز به بیشترین مین خد تلید شده است. تمام این اتفاقات زمانی رخ داده که ریانهای گنه کناری )مش یا گا( از اسیتهای باکیفیت انتخاب شده باشند. ریانهایی که از اسیتهای کم کیفیت تلید شدهاند تانایی حمایت از تکین ریانهای گربه را نداشته است. در گره تیمار دم ریانهای همراه )مش یا گا( که سن باالتری نسبت به ریانهای گربه داشتهاند تانایی بیشتری برای حمایت از تکین ریان گربه را نسبت به ریان همراه کم سن یا هم سن با ریانهای گربه را داشتهاند. در دمین مطالعه Spindler همکاران )84( نشان دادند که ریانهای مش گا تانایی تلید فاکترهای ارتقا دهنده تکین ریان غیر ابسته به گنه را داشته که تانستهاند تکین ریانهای جداشده در این سیستم را افیش دهند. در تیمار ال هر ریان گربه با 41 ریان گربه یا با ریان مش کشت داده شدند. کشت با 41 ریان گربه یا با 21 ریان مش در فراهم نمدن حمایت از تکین ریان انفرادی گربه مفق بدند. در تتیمار دم ریانهای منف با 41 ریان گربه 21 ریان مش یا 41 ریان گا کشت داده شدند. هر یک از عامل متغیر در این بخش از آزمایش مفق به ارتقا حمایت از رند تکین ریانهای منف کشت داده شده به صرت همراه را داشتهاند. Neal همکاران )82( با استفاده از سیستم کشت ریانهای خاهر برادر از 11 بیمار داطلب برای انجام لقاح برنتنی که در آنها ریانها به صرت تصادفی برای هر یک از بیماران به صرت فی یا گرهی به بررسی رند تکین ریانهای کشت داده شده پاختند. این کشت در ظرف کشت EmbryoCorral انجام شد. انتقال ریان در این آزمایش در رز 3 انجام شد جایی که ریانها براساس درجه بندی ترکیبی ریانها م انتخاب قرار میگرفتند. شایان ذکر است که انتقال ریان بدن در نظر گرفتن رش کشت انجام میشد. هیچ تفات معنیداری بین گرههای کشت با تجه به رتبههایی که به ریانها اختصاص د اده شده است مشاهده نشده به هر ری باالترین نرخ آبستنی زمانی به دست آمد که ریانها به طر یژه از تیمار کشت گرهی انتخاب شده بد. اگرچه تعداد بیماران محدد بد این مطالعه الیه نشان داد که افیش تراکم ریان میتاند منجر به ارتقا زندهمانی ریان شد این ارتقا بدن تجه به تفاتهای ابتدایی در یژگیهای ظاهری ریانها حاصل شد. در یک مطالعه که در اخیرا صرت پذیرفته کشت انفرادی ریان انسان با کشت گرهی ریان با استفاده از ظرف کشت EmbryoCorral انجام شد. Enber همکاران )22( به مطالعه ریانهای خاهر برادر پاختند. در این مطالعه کشت ریانها با سه ریک به انجام رسید کشت به صرت انفرادی کشت گرهی با تجه به جدا بدن ریانها با استفاده از مانع یژه کشت گرهی بدن جداسازی ریانها از یکدیگر. تراکم ریان بر اساس حجم 31 میکرلیتر محیط کشت به اندازههای 4:31 4 : 0/3 4 : 0/3 برای تیمارهای سه گانه به ترتیب در نظر گرفته شد. نتایج به اسطه بررسی رند تکین ریان نرخ النه- گزینی تلد زنده ریان م ارزیابی قرار گرفت. با استفاده از انتقال یک بالستسیست به بدن پذیرنده با تجه به انتخاب بهترین ریان بدن در نظر داشتن تیمار م استفاده در کشت ریان رند انتقال ریان به انجام رسید. نتایج نشان داد که ریانهایی که به صرت گرهی کشت داده شده بدند بدن تجه به اینکه ریانها درکنار هم بدند یا از هم جدا نگهداری میشدند از سایر ریانها در حصل نتیجه مفقتر بدند. این مطالعه نشان داد که استفاده از کشت گرهی ریان با تجه به کارب ظرف نین کشت نه تنها امکان کشت گرهی جد دا بلکه این امکان نیز فراهم شده که از میای کشت گرهی به نعی که کشت انفرادی ریان در حال جریان است نیز بهرهمند شیم. همچنین استفاده از چاهکهای Slant-wall این امکان را فراهم نمده که از انتشار ماد مغذی ریان نیز جلگیری به عمل آید. درم مضع تعیض نسازی محیط کشت Gardner )21( Lane نشان دادند که نهتنها نیازی به تعیض محیط در هر 19 ساعت یکبار نیست بلکه این تعیض با خارج نمدن فاکترهای رشد تلید شده تسط ریانها از دسترس ریانهای در حال تکین باعث برز آثار مخرب بر رند تکین ریان می- شد به نعی آثار مفید اتکراین/پاراکراین/جاکشتاراین را از بین خاهد ب. کشت ادامه یابنده ریانهای ریان بدن نسازی محیط کشت نتنها امکانپذیر میباشد بلکه از دیگاه تاثیر مثبت ماد مغذی تراش شده از ریان میتاند باعث ارتقا رند تکین ریانها شد )83(. 219

250 3-42. تراکم ریان اندازه ریزقطرهها شکل آمادهسازی Moessner )32( Dodson Almagor همکاران )33( از حجمهای 4 1/0 میلیلیتر به منظر کشت ریان در ظرف چاهک دار بدن پشش استفاده نمدند. این حجمها از محیط کشت در مقایسه با اندازه ریان بسیار زیاد میباشند ایجاد کننده تراکم بسیار پایینی از ریان میباشند. در مقابل )81 O Neill 83( از تراکم ریان به کچکی 4:4 میکرلیتر از محیط کشت استفاده نمد )41 ریان در 41 میکرلیتر از محیط کشت( Melin همکاران )02( محفظههایی تلید نمدند که برای کشت ریان استفاده میشد حجمهایی به کچکی نانلیتر به منظر کشت ریان را فراهم مینمد. از دیگاه نظری شکل چاهک )مقعر در مقابل کف صاف گ در مباقل طیل( اندازه چاک )بزرگ در مقابل کچک در مقابل ریزچاهک( حجم محیط کشت تماما مای هستند که میتانند در افیش یا کاهش انتشار عامل میتژنیک اتکراین / پاراکراین / جاکستاکراین مثر باشند. استفاده از چاهک در چاهک (WOW) 282 به عنان سیستم کشت به این منظر طراحی شد که بتان به به کمک آن ریانها را در حجمهای بسیار اندکی از محیط کشت به کچکی 1/43 1/11 میکرلیتر مشاهده ارزیابی نمد )82(. نکته حایز اهمیت در م سامانه WOW این است که چاهکها در حقیقت فشگیهای بسیار کچکی هستند که بسیار نزدیک به هم قرار گرفتهاند در کف ظرف کشت معمل که برای کشت برنتنی ریان استفاده میشند یا در کف چاهک ظرف چاهک دار ایجاد میشند. این امر امکان اینکه ریان به صرت انفرادی در کف ظرف کشت داده شد را فراهم میآ. به عاله هر نقطه کچک ایجاد شده در این سیستم این امکان را فراهم نمد که حجم اندکی از محیط کشت به کچکی 1/43 میکرلیتر از محیط کشت ایجاد شده تسط رغن معدنی پشانده شند اما استفاده معمل کاربی این سیستم در این است که تعداد زیادی از این نقاط فررفتگی ایجاد شده سپس محیط کشت به حجم 311 تا 211 میکرلیتر ری آن ریخته شد با رغن معدنی پشیده شده در نهایت ریانها در هر فررفتگی به صرت جدا از سایر ریانها کشت داده شند. هر یک از این نقاط فررفته امکان افیش تراکم عامل اتکراین / پاراکراین / جاکستاکراین را به اسطه ممانعت از انتشار این عامل در نهایت ممانعت از تغییرات متابلیک در اطراف ریان را فراهم میآرند. شکل WOW به شکل میله ظریفی که برای ایجاد آنها بهکار میرد بستگی دا. اما سال این است که آیا شکل این چاهکها بر رند تکین ریان میتاند تاثیر گذار باشد یا خیر Feltrin همکاران )80( رش WOW را تعدیل نمد تا بتاند ریزچاهکهای بسیار باریک تلید نمده تا به کمک آن بتان ریان کشت داد. WOWهای معمل ریزچاهکهای مقعری بدند که در این مطالعه م مقایسه با ریزچاهکهای بسیار ظریف با استفاده از ریان کلن شده گا قرار گرفتند. نرخ کلیاژ تکین ریان کلن شده به طر چشمگیری در ریزچاهکها باالتر بد. یژگیهای فیزیکی )حجم فطر عمق( WOW تسط Hoelker همکاران )89( با استفاده از فررفته نمدن کف ظرف کشت با دقت بسیار باال کشت ریانهای حاصل از لقاح برنتنی گا به صرت انفرادی م بررسی قرار گرفت. قطر عمق این چاهکها به طر معنیداری نرخ تکین ریان را تا رسیدن به مرحله بالستسیست تحت تاثیر قرار داد اما تعداد سللها در بالستسیستها تغییر معنیداری از خد نشان نداد. کشت در چاهکها در قیاس با رش سنتی کشت ریان )42 ریان در هر چاهک کشت( برتری قابل مشاهدهای از خد نشان داد. نسبت بهینه ریان به ای هر WOW در مقیاس 4 : 1/20 میکرلیتر تعیین شد. با تجه به فعالیت بیان ژن ریانهای گای کشت داده شده در افیش تراکم ریان چه به صرت کشت گرهی چه به صرت کشت WOW آثار سدمند تراکم باالی ریان بر رند تکین فراانی عامل مربط به بیان ژنهای کلیدی در هر د رش در مقایسه با گره کنترل افیش یافت )88(. همچنین فعالیت بیان ژن با تجه با رش کشت م استفاده در بیان PLAC ATP A KRT به سیله ریان در کشت گرهی بسیار شبیه به بیان ژن ریانهای بدست آمده از شرایط درنتنی بد بیان S A ZP در ریانهایی که به صرت انفرادی در سیستم WOW کشت داده شده بدند بسیار مشابه آن چیزی بد که در ریانهای حاصل از لقاح درنتنی به دست آمده بد این نتایج مشخص نمد که افیش تراکم ریان با تجه به رش م استفاده در کشت ریان میتاند تانایی رند تکین ریان را افیش دهد. یک رش پیشنهاد شده well of the well 211

251 جایگزین برای کشت ریان به جای کشت در چاهکها یا ریزقطرهها استفاده از للهای میینه میباشد. در گرشهای الیه در م تاثیر حجم قطره کشت تراکم ریان Lane )411( Gardner نگرانی خد در م کشت رشد ریان در شرایطی که افیش نسبت مساحت قطره کشت به حجم آن بد بیان نمدند برای ارزیابی این م ریانها به صرت انفرادی در للههای میینی میکرلیتری کشت داده شدند در مقابل به منظر مقایسه ریانها به صرت انفرادی در ریز قطرههایی به اندازه میکرلیتر نیز کشت داده شدند. ریانهایی که در لله میینه به حجم 3 میکرلیتر کشت داده شده بدند بالستسیستهایی با تعداد سلل به مراتب باالتری در مقایسه با بالسیتسیتهای به دست آمده از ریانهای کشت داده شده در قطره 3 میکرلیتری تلید نمدند. تعداد سللها به ای هر بالستسیست همچنین برای ریانهای تکین یافته در قطرههای میکرلیتری در للهای میینه مشابه بد. چنین اثر مشابهی برای ریان- هایی که در قطرههای میکرلیتری کشت داده شده بدند مشاهده نشد در در حقیقت شاهد افیش تعداد سللهای بالستسیست برای ریانهای کشت داده شده در قطرههای میکرلیتری بدند. این گره از محققین پیشنهاد نمدند که عامل ترفیک مغذی تراش شده تسط ریانها ممکن است که به اسطه استفاده از رغن معدنی به اسطه پدیده استخراج چربی دست از دسترس محیط کشت خارج شند یا اینکه این عامل ممکن است که در این حالت به اسطه نزدیکی زیاد با رغن معدنی در صرت کم بدن حجم ریز قطره به اندازه 3 میکرلیتر راحتتر دناتره شند. در یک مطالعه مشابه ریانهای مش در دستههای دتایی در لله میینه بسیار کچک که به عنان ایداکت شیشهای شناخته میشد کشت داده شدهاند )این سیستم با نام GO شناخته میشد(. Thousa همکاران )414( ریانها را در لله میینه با حجم 4 میکرلیتر به صرت عمدی درحالی که دهانه آن باز بد برای مدت 82 ساعت کشت دادند. معیارهای م بررسی شامل تکین ریانها به مرحله بالستسیست تفریخ کامل یا نسبی در شرایط برنتنی تعداد سللهای درنی ترفبالست نرخ النه گزینی 4123 رز بعد از لقاح بد. سیستم GO تانایی حمایت از تکین ریان در شرایط مشابه با کشت در ریز قطرهها با تراکم باال را از خد نشان داد )تراکم 21 ریان در هر 41 میکرلیتر( این نتایج بهتر از نتایج بدست آمده از گره کنترل بد )41 ریان در 21 میکرلیتر(. به هرری النه گزینی بعد از کشت برنتنی در گرههای تیمار مشابه بد. نکته خاص این سیستم مقیعت عمدی لله میینه بد. لله میینه به عنان للهای در نظر گرفته میشد که قطر داخلی آن 211 میکرمتر باشد کمی کمتر از 2 برابر ریان مش در مرحله کلیاژ اگرچه در متن مقاله مذکر ذکر نشده است این انتظار میرد که به دلیل مقعیت عمدی این لله ریانها در لله ته نشین شند در نهایت از انتشار عامل مثبت بیشتر ممانعت به عمل آ. رش م استفاده در آمادهسازی ظرف کشت معمال م غفلت اقع شده به طر نقادانه م ارزیابی قرار نگرفته است اما در نظر داشتن رش م استفاده در آمادهسازی ظرف کشت از عامل مهم میباشد به یژه زمانی که حجمهای کچکی از محیط کشت به منظر قطره گذاری استفاده میشد. Swain همکاران )412( با استفاده از مطالعه چند عاملی به اندازهگیری اسمالریته ریزقطرهها بعد از تغییر در فاکترهای متفاتی در راستای آماده سازی ظرف کشت پاختند از جمله این فاکترها میتان به حجم ریزقطرهها ) میکرلیتر( دمای سطح آماده سازی ظرف )دمای اتاق در برابر دمای 30 درجه سانتیگراد ریختن رغن قبل یا بعد از قطرهگذاری محل ظرف کشت در ارتباط با جریان ها )رشن بدن هد در مقابل خامش بدن هد(. فشار اسمزی 3 دقیقه بعد از آمادهسازی 21 ساعت بعد از آن دباره اندازهگیری شد )فشار اسمزی بین این د زمان تفاتی نداشت(. ترکیب کاهش حجم ریزقطره افیش دمای سطح آماده سازی ظرف کشت قبل از ریختن رغن معدنی منجر به افیش فشار اسمزی شد مقدار فشار اسمزی 11 میلیاسمل کاهش از خد نشان داد. رشن یا خامش بدن جریان های هد به تنهایی تاثیری بر اسمالریته محیط کشت نداشت. اما ارتباط متقابل معنیداری بین جریان ها کاهش حجم محیط م استفاده برای کشت افیش دما سطح آماده سازی ظرف کشت ریختن رغن معدنی ری قطرههای کشت بعد از پیپت نمدن جد داشت. 215

252 2-42 خالصه نکات مهم تکین ریان پستانداران در شرایط برنتنی میتاند به اسطه تراکم م انتخاب برای کشت ریان تحت تاثیر قرار بگی این آثار میتاند مثبت منفی باشد. میایی برای کشت انفرادی ریان ذکر شده است به یژه زمانی که جمعآری داده برای ریانها به صرت انفرادی م نظر باشد. همچنین کشت ریان به صرت گرهی نیز میتاند آثار مفیدی دربر داشته باشد. شاهد بدست آمده از مقاالت نشان داده است که تراکم ریان میتاند بر کیفیت رند تکین ریان اثرگذار باشد همچنین شرایط کشت نیز این تانایی را داشته که بر رند تکین ریان همچنین ریههای سللی بیان ژنها نیز اثرگذار باشد. مطالعات نشان داده است که فاکترهای رشد اتکراین / پاراکراین / جاکستاکراین تراش شده به سیله ریان انسان سایر پستانداران میتاند بر ایداکت رحم بافت تخمدان اثر که رند تکین ریان را تحت تاثیر قرار دهد. در شرایط برنتنی این عامل بالقه به نظر میرسد که دارای آثار یژه عممی مثبت بر رند تکین ریان هستند اگرچه با استفاده از سیستم کشت ساکن عامل منفی مانند سمم سللی ماد یید حاصل از متابلیسم گنه اکسیژن فعال سایر ماد اینگنهای ممکن است که به صرت مضعی تجمع پیداکه منجر به برز آثار مخرب بررند تکین ریان شد. با استفاده از سیستم کشت ساکن در شرایط برنتنی چالش پیش ر بیشینه نمدن تجمع ماد ترفیک با آثار مثبت بررند تکین ریان میباشد به گنهای که باعث تجمع مضعی ماد مضر عامل منفی برای رند تکین ریان نشد. سالهای یژه در زمینه کشت برنتنی ریان همچنان پاسخ نداده شده باقی ماندهاند که از جمله میتان به ما زیر اشاره نمد کمینه حجم محیط کشت قابل استفاده برای کشت انفرادی ریان چه مین است تعداد بیشینه ریان که میتان در محیط کشت به صرت گرهی کشت داده شد چه تعداد است آیا تفاتی بین رند تکین ریان در کشتهای گرهی انفرادی با مین تراکم برابر ریان جد دا یا خیر تقابل بین اج مجد در محیط کشت زمان کشت ph محیط کشت ترکیب گازی م استفاده در انکباتر دمای انکباتر تراکم بهینه برای کشت ریان چیست شاید چالش برانگیزترین سال برای کشت ریان انسان این است که: عاقب تکینی اپیژنتیکی کشت برنتنی ریان انسان چیست اینکه رشهای م استفاده برای کشت ابر کشت تراکم ریان اج محیط کشت دما ترکیب گازی محیط چگنه باشد که شرایط تکینی اپیژنتیکی ریان تلید شده در شرایط برنتنی را با ریان به دست آمده از شرایط درنتنی مشابه نماید. منابع.Pool TB ( ) An update on embryo culture for human assisted reproductive technology : media, performance, and safety. Sem Reprod Med :.Lane M, Gardner DK ( ) Embryo culture medium: which is the best? Clin Obstet Gynecol :.Gardner DK ( ) Dissection of culture media for embryos: the most important and less important components and characteristics. Reprod Fertil Dev :.Biggers JD, Summers MC ( ) Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril :.Vajta G et al ( ) Embryo culture: can we perform better than nature? Reprod Biomed Online :.Khosla S et al ( ) Epigenetic and experimental modifications in early mammalian development: Part II. Culture of preimplantation embryos and its long-term effects on gene expression and phenotype. Hum Reprod Update :.Longergan P et al ( ) Effect of postfertilization culture environment on the incidence of chromosome aberrations in bovine blastocysts. Biol Reprod :.Fleming TP et al ( ) The embryo and its future. Biol Reprod :.Fernandez-Gonzalez R et al ( ) Suboptimal in vitro culture conditions: an epigenetic origin of long-term health effects. Mol Reprod Dev :.Giritharan G et al ( ) Effect of in vitro fertilization on gene expression and development of mouse preimplantation embryos. Reproduction :.Thompson JG, Mitchell M, Kind KL ( ) Embryo culture and long-term consequences. Reprod Fertil Dev : 216

253 .Morgan HD et al ( ) The culture of zygotes to the blastocyst stage changes the postnatal expression of an epigenetically labile allele, Agouti Viable Yellow, in mice. Biol Reprod :.Dumoulin JC et al ( ) Effect of in vitro culture of human embryos on birthweight of newborns. Hum Reprod :.Orsi NM, Reischl JB ( ) Mammalian embryo co-culture: trials and tribulations of a misunderstood method. Theriogenology :.Guerin P, Menezo Y ( ) Review: role of tubal environment in preimplantation embryogenesis: application to co-culture assays. Zygote :.Stojkovic M et al ( ) Secretion of biologically active interferon tau by in vitro-derived bovine trophoblastic tissue. Biol Reprod :.Stojkovic M et al ( ) Support for the development of bovine embryos in vitro by secretions of bovine trophoblastic vesicles derived in vitro. J Reprod Fertil :.Hashiyada Y, Okada M, Imai K ( ) Transition of the pregnancy rate of bisected bovine embryos after co-transfer with trophoblastic vesicles prepared from in vivo-cultured in vitro-fertilized embryos. J Reprod Dev :.Senatore EM et al ( ) Improved in vitro development of OPU-derived bovine (Bos taurus) embryos by group culture with agaraose-embedded helper embryos. Theriogenology : Culture Systems: Embryo Density.Schini SA, Bavister BD ( ) Development of golden hamster embryos through the twocell bloc k in chemically defined medium. J Exp Zool :.Reed ML ( ) Communication skills of embryos maintained in group culture the autocrine/paracrine debate. Clin Embryol :.Van Voorhis GJ et al ( ) What do consistently high-performing in vitro fertilization programs in the U.S. do? Fertil Steril :.Novo S et al ( ) A novel embryo identification system by direct tagging of mouse embryos using silicon-based barcodes. Hum Reprod :.Georgiou AS et al ( ) Gametes alter the oviductal secretory proteome. Mol Cell Proteomics :.Georgiou AS et al ( ) Modulation of the oviductal environment by gametes. J Proteome Res :.Lee K-F, Yeung WSB ( ) Gamete/ embryo-oviduct interactions: implications on in vitro culture. Hum Fertil :.Aviles M, Gutierrez-Adan A, Coy P ( ) Oviductal secretions: will they be key factors for IVF? Mol Hum Reprod :.Paria BC, Dey SK ( ) Preimplantation embryo development in vitro : cooperative interactions among embryos and role of growth factors. Proc Natl Acad Sci USA :.Dardik A, Smith RM, Schultz RM ( ) Colocalization of transforming growth factor- α and a functional epidermal growth factor receptor (EGFR) to the inner cell mass and preferential localization of the EGFR on the basolateral surface of the trophectoderm in the mouse blastocyst. Dev Biol :.Stoddart NR, Roudebush WE, Fleming SD ( ) Exogenous platelet-activating factor stimulates cell proliferation in mouse preimplantation e mbryos prior to the fourth cell cycle and shows isoform-specific stimulatory effects. Zygote :.Terada Y et al ( ) Expression of growth hormone receptor in mouse preimplantation embryos. Mol Hum Reprod :.Paria BC, Song H, Dey SK ( ) Implantation: molecular basis of embryouterine dialogue. Int J Dev Biol :.Sher G et al ( ) Expression of shla-g in supernatants of individually cultured -h embryos: a potentially valuable indicator of embryo competency and IVF outcome. Reprod Biomed Online :.Purnell ET et al ( ) Influence of the preimplantation embryo development (PED) gene on embryonic platelet-activating factor (PAF) levels. J Assist Reprod Genet :.O Neill C ( ) The potential roles for embryotrophic ligands in preimplantation embryo development. Hum Reprod Update :.Richter KS ( ) The importance of growth factors or preimp lantation embryo development and invitro culture. Curr Opin Obstet Gynecol :.Roberts RM et al ( ) Interferons and the maternal-conceptus dialog in mammals. Semin Cell Dev Biol :.Bazer FW et al ( ) Interferons and progesterone for establishment and maintenance of pregnancy: interactions among novel cell signaling pathways. Reprod Biol :.Contramaestre AP et al ( ) Secretion of stem cell factor and granulocyte macrophage colonystimulating factor by mouse embryos in culture: influence of group culture. Zygote : 217

254 .Banerjee P, Fazleabas AT ( ) Endometrial response to embryonic signals in the primate. Int J Dev Biol :.Siemieniuch MJ et al ( ) Are glucocorticoids auto- and/or paracrine factors in early bovine embryo development and implantation? Reprod Biol :.Cerkiene Z, Eidukaite A, Usoniene A ( ) Immune factors in human embryo culture and their significance. Medicina (Kaunas) :.Neira JA et al ( ) Effect of the association of IGF-I, IGF-II, bfgf, TGF-beta, GM -CSF, and LIF on the development of bovine embryos produced in vitro. Theriogenology :.Houghton FD et al ( ) Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo developmental capacity. Hum Reprod :.Houghton FD, Leese HJ ( ) Metabolis m and developmental competence of the preimplantation embryo. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol ( Suppl ):S S.Brison DR et al ( ) Identification of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover. Hum Reprod :.Booth PJ et al ( ) Amino acid depletion and appearance during porcine preimplantation embryo development in vitro. Reproduction :.Nagy ZP ( ) Non-invasive assessment of embryo viability by metabolomic profiling of culture media ( metabolomics ). Reprod Biomed Online :.Seli E et al ( ) Noninvasive metabolomic profiling as an adjunct to morphology for noninvasive embryo assessment in wo men undergoing single embryo transfer. Fertil Steril :.Seli E et al ( ) Noninvasive metabolomic profiling of embryo culture media using proton nuclear magnetic resonance correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril :.Marhuenda-Egea FC et al ( ) A crucial step in assisted reproduction technology: human embryo selection using metabolomic evaluation. Fertil Steril :.Moessner J, Dodson WC ( ) The quality of human embryo growth is improved when embryos are cultured in groups rather than separately. Fertil Steril :.Almagor M et al ( ) Pregnancy rates after communal growth of preimplantation human embryos in vitro. Fertil Steril :.Spyropoulou I, Karamalegos C, Bolton VN ( ) A prospective randomized study comparing the outcome of in-vitro fertilization and embryo transfer following culture of human embryos individually or in groups before embryos transfer on day. Hum Reprod :.Rijinders PM, Jansen CA ( ) Influence of group culture and culture volume on the formation of human blastocysts: a prospective randomized study. Hum Reprod :.Jones GM et al ( ) Evolution of a culture protocol for successful blastocyst development and pregnancy. Hum Reprod :.Behr B et al ( ) Preliminary clinical experience with human blastocyst development in vitro without co-culture. Hum Reprod :.Ali J ( ) Continuous ultra micro-drop (cumd) culture yield higher pregnancy and implantation rates than either larger-drop culture or fresh-medium replacement. Clin Embryol :.Kapiteijin K et al ( ) Human embryoconditioned medium stimulates in vitro endometrial angiogenesis. Fertil Steril (Suppl ):.Vajta G et al ( ) The well-of-the-well system: an efficient approach to improve embryo development. Reprod Biomed Online :.Rebollar-Lazaro I, Matson P ( ) The culture of human cleavage stage embryos alone or in groups: effect upon blastocyst utilization rates and implantation. Reprod Biol :.Ebner T et al ( ) Group culture in human is superior to individual culture in terms of blastulation, implantation and life birth. Reprod Biomed Online :.Gardner DK, Lane M ( ) Embryo culture. In: Gardner DK, Weissman A, Howles CM, Shoham Z (eds) Textbook of assisted reproductive techniques. Laboratory and clinical perspectives. Martin Dunitz Ltd, The Livery House, London, UK.Gardner DK, Lane M ( ) Culture of the mammalian preimplantation embryo. In : Gardner DK, Lane M, Watson AJ (eds) A laboratory guide to the mammalian embryo. Oxford University Press, Oxford, New York, USA.de Oliveira ATD, Lopes RFF, Rodrigues JL ( ) Gene expression and developmental competence of bovine embryos produced in vitro under varying embryo density conditions. Theriogenology :.Nagao Y, Iijima R, Saeki K ( ) Interaction between embryos and culture conditions during in vitro development of bovine early embryos. Zygote : 218

255 .Salahuddin S et al ( ) Fertilization and early embryo logy: effects of embryo density and co-culture of unfertilized oocytes on embryonic develop ment of in-vit ro fertilized mouse embryos. Hu m Reprod :.Larson MA, Kubisch HM ( ) The effects of group size on development and interferon-τ secretion by in-vitro fertilized and cultured bovine blastocysts. Hum Reprod :.Alikani M, Olivennes F, Cohen J ( ) Microsurgical correction of partially degenerate mouse embryos promotes hatching and restores their viability. Hum Reprod :.Alikani M et al ( ) Human embryos fragmentation in vitro and its implication for pregnancy and implantation. Fertil Steril :.Rienzi L et al ( ) Developmental potential of fully intact and partially damaged cryopreserved embryos after laser-assisted removal of necrotic blastomeres and post-thaw culture selection. Fertil Steril :.Melin J et al ( ) In vitro embryo culture in defined, sub-microliter volumes. Dev Dyn :.Vutyavanich T et al ( ) Effect of embryo density and microdrop volume on the blastocyst Culture Systems: Embryo Density development of two -cell embryos. Fertil Steril :.Hughes PM et al ( ) Mouse embryo assay (MEA): group versus individual culture effects on the sensitivity for peroxides in mineral oil. Fertil Steril (Suppl):S.Smith GD, Swain JE, Bormann CL ( ) Microfluidics for gametes, embryos, and embryonic stem cells. Sem Reprod Med :.Matsuura K et al ( ) Improved development of mouse and human embryos using a tilting embryo culture system. Reprod Biomed Online :.Isachenko E et al ( ) Mechanical agitation during the in vitro culture of human preimplantation embryos drastically increases the pregnancy rate. Clin Lab :.Koike T et al ( ) In-vitro culture with a tilting device in chemically defined media during meiotic maturation and early development improves the quality of blastocysts derived from in-vitro matured and fertilized porcine oocytes. J Reprod Dev :.Kim MS et al ( ) A microfluidic in vitro cultivation system for mechanical stimulation of bovine embryos. Electrophoresis :.Heo YS et al ( ) Dynamic microfunnel culture enhances mouse embryo development and pregnancy rates. Hum Reprod :.Trimarchi JR et al ( ) A non-invasive method for measuring preimplantation embryo physiology. Zygote :.Trimarchi JR et al ( ) Noninvasive measurement of potassium efflux as an early indicator of cell death in mouse embryos. Biol Reprod :.Lopes AS, Lane M, Thompson JG ( ) Oxygen consumption and ROS production are increased at the time of fertilization and cell cleavage in bovine zygotes. Hum Reprod :.Pribenszky C et al ( ) Prediction of invitro developmental competence of early cleavage-stage mouse embryos with compact time-lapse equipment. Reprod Biomed Online :.Wong CC et al ( ) Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predicts development to the blastocyst stage. Nat Biotech :.Sugimura S et al ( ) Time-lapse cinematography-compatible polystyrene based microwell culture system: a novel tool for tracking the development of individual bovine embryos. Biol Reprod :.Pribenszky C et al ( ) Pregnancy achieved by transfer of a single blastocyst selected by time-lapse monitoring. Reprod Biomed Online :.Stokes PJ, Abeydeera LR, Leese HJ ( ) Development of porcine embryos in vivo and in vitro; evidence for cross talk in vitro. Dev Biol :.Gopichandran N, Leese HJ ( ) The effect of paracrine/autocrine interactions on the in vitro culture of bovine preimplantation embryos. Reproduction :.Spindler RI, W ildt DE ( ) Quality and age of companion felid embryos modulate enhanced development by group culture. Biol Reprod :.Spindler RE et al ( ) Improved felid embryo development by group culture is maintained with heterospecific companions. Theriogenology :.Neal MS, et al. ( ) Sibling zygote comparison to determine the effect of group culture on human embryos. Poster presentation for the annual Canadian fertility and andrology (CFAS) meeting. Calgary, Alberta Nov. and.reed ML et al ( ) Continuous uninterrupted single medium culture without medium renewal vs. sequential media culture: a sibling embryo study. Fertil Steril : 213

256 .O Neill C ( ) Evidence for the requirement of autocrine growth factors for development of mouse preimplantation embryos in vitro. Biol Reprod :.O Neill C ( ) Autocrine mediators aren required to act on the embryo by the -cell stage to promote normal development and survival o f mouse preimplantation embryos in vitro. Biol Reprod :.Vajta G et al ( ) New method for culture of zona-included or zona-free embryos: the well of the well (WOW) system. Mol Reprod Dev :.Feltrin C et al ( ) In vitro bovine embryo development after nuclear transfer by handmade cloning using a modified WOW culture system. Reprod Fertil Dev :.Hoelker M et al ( ) Effect of embryo density on in vitro developmental characteristics of bovine preimplantation embryos with respect to micro and macroenvironments. Reprod Domest Anim : e e.hoelker M et al ( ) Effect of the microenvironment and embryo density on developmental characteristics and gene expression profile of bovine preimplantative embryos cultured in vitro. Reproduction :.Lane M, Gardner DK ( ) Effect of incubation volume and density on the development and viability of mouse embryos in vitro. Hum Reprod :.Thouas GA, Jones GM, Trounson AO ( ) The GO system a novel method ofmicroculture for in vitro development of mouse zygotes to the blastocyst stage. Reproduction :.Swain JE et al ( ) Environmental factors and manual manipulations during preparation influence embryo culture medium osmolality. Fert Steril :S 251

257 2 فصل 40 سیستم کشت: کیفیت ها کیفیت بد ها در آزمایشگاهها به عنان یک عامل خطرناک برای گامتها ریانهای انسانی شناخته شده است. ریان- شناسان شیمیدانها رشهای تحلیلی برای شناسایی اندازهگیری کلی جز نگر آالیندههای ها در جهت ارزیابی خطر ا شده به سیستم کشت ریان مطرح کهاند. با این جد کمتر به تضیح غلظت آالیندههایی که منجر به آلدگی گامتها ریان میشد پاخته شده است. مبارزه با آثار منفی کیفیت های بد نیاز به درک درستی از چگنگی عملک سمم در قدرت نفذ به آزمایشگاه انکباتر در نهایت محیط کشت دا. درک بیشتر از کیفیت های محدده آزمایشگاه میتاند منجر به تجه در طراحی دقیق آزمایشگاه مدیریت رای در زمینهی به حداقل رساندن اثرات زیانبار آلدگی ها بر رشد نم الیه در شرایط آزمایشگاه شد مقدمه اهمیت کیفیت ها در کشت گامت ریانهای انسانی از دهه 4881 میالدی پدیدار شد زمانی که زیست شناسان بارری لقاح آزمایشگاهی در انسان را )IVF( آغاز نمدند. همزمانی انجام لقاح برنتنی با ساخت ساز یا نسازیهای انجام گرفته در داخل یا نزدیک آزمایشگاه منجر به کاهش درهای در بازده لقاح برنتنی شد. دادههای اثبات نشده حاصل از مطالعات الیه منجر به بیان نظریهای مبنی بر اینکه های آزمایشگاه میتاند با ترکیبات عالی فرار یا ذرات مشتق شده از فعالیتهای ساخت ساز گازهای منتشر شده از ماد جدید یا منابع دیگر آلده شد شد. این آلدگیها در نهایت به محیط کشت ا میشند که منجر به تداخل در تسعهی گامت ریان خاهد شد. در الین تحقیقات منتشر شده در ارتباط باکیفیت ها در آزمایشگاههای IVF دانشمندان علم آزمایشگاهی شیمیدانها رشهای کمی برای اندازهگیری ترکیبات عالی فرار از جمله الکلها گالیکلها فنلها آمین آلدئیدها کتنها کلر ترکیبات معطر طراحی کند. این مطالعات در ااخر دهه 4881 میالدی نشان داد که های انکباتر آزمایشگاه اکثر تجهیت IVF شامل ماد مضر فراری بد که در اماکن فضاهای تجاری در مقادیر باال یافت میشد ( 4(. اگرچه این نتایج به طر مشخص دلیلی برای تجه بیشتر محققینIVF است اما این دالیل به آسانی قابل تفسیر نمیباشند. اثرات جمعی یا منحصر به ف آلدگی ها در تسعه گامت ریان هنز به طر کامل شناخته نشده است. قرار گرفتن ریانهای انسانی در معرض ترکیبات عالی فرار به صرت کنترل شده امری غیر اخالقی بده همچنین اطالعات محدد در ارتباط با مطالعات حیانی )2 3( به آسانی باسیستمهای متنع کشت ریان انسان که در ترکیبات حجم محیط پشش رغن سایر راها متفات هستند قابل قیاس نمیباشد. با این جد با تجه به نتایج برگرفته از گرشات مطالعات کنترل نشده چند مفهم کلی پیشنهاد شده است. مجمع غلظت ترکیبات عالی فرار به عنان یک پیش بینی در جهت سندرم ابتال به بیماری در تمام سنین sick( )building syndrome میباشد )1( همچنین با نتایج حاصل از IVF آزمایشگاهی رابطهی منفی داشت )4 3(. خاناده مشخصی از ملکلها از جمله آلدئیدها برای تمامی سللهای حیانی بسیار سمی هستند )2( یژگی انحالل پذیری آلدئیدها به آنها اجازه رد به داخل محیط کشت از طریق پشش رغنی را می- دهد. در نهایت ذرات متشکل از ماد عالی فرار ماد معدنی یا ماد بیلژیکی باقی مانده به عنان یک تهدید جدی در آزمایشگاه IVF به حساب میآید )0 9(. با جد عدم قطعیت علمی در ارتباط با اهمیت کیفیت ها دانشمندان IVF کارشناسان های داخل ساختمان در حدد اایل سال 2111 به گسترش طرح مفاهیمی با هدف کاهش جذب تزیع آلدگی ها پاختند. بسیاری از یژگیهای م نظر در این زمینه برگرفته از طراحی اتاقهای تمیز در سایر صنایع بده است )4 8(. 0 هماکنن راه حلهای مهندسی برای حذف طیف گستهای از گازهای فرار از های آزمایشگاه به صرت تجاری در دسترس قرار دا. خالصهی نتایج مقاالتی که در آن بد نتایج IVF حاصل شده است شامل استفاده از هر د رش طراحی مجدد سیستم- های تهیه آزمایشگاه یا نصب راه اندازی سیستمهای تهیه غیر فعالسازی VOC است )41-41(. اما این تجربه همگانی 254

258 نبده است )43-42(. عاله بر این بسیاری از این خالصههای منتشر شده جزییات کم غیر قابل تضیحی برای ارزیابی فضاهای جدید یا بازسازی شده که اغلب با سایر تغییرات عملیاتی مانند: یک انکباتر جدید همراه است ارایه دادهاند. این فصل به بیان این که چگنه افراد شاغل در آزمایشگاه میتانند با کمک تکنلژیهای نین کیفیت هارا با تجه به طیف سیعی از گزینهها در جهت حمایت از گامت ریان در مقابل پتانسیلهای سمی مجد در ها ارزیابی کنند پاخته شده است خصصیات ارزیابی آالیندههای ها های مجد در فضای بیرن آزمایشگاه کیفیت ها در فضای بیرنی درنی هر د با عملک آزمایشگاه ART در ارتباط است. های مجد در فضای بیرن یکی از منابع الیه ها برای آزمایشگاه است. آژانس حفاظت از محیط زیست ایاالت متحده )EPA( تحت قانن های پاک در دهه 4881 میالدی استانداهای ملی کیفیت های محیط )40( برای های مجد در فضای بیرن را بنا نهاد. هفت آالینده شاخص الیه )مناکسید کربن سرب دی اکسید نیترژن دی اکسید گگ ازن ذرات معلق با اندازهی )2/3-41µm به عنان معیارهای حفاظتی کیفیت ها که سالمت انسانها را تحت تاثیر قرار میدهد شناخته شدهاند. عاله بر این حدد 498 آالینده خطرناک ها )HAPS( تحت عنان ماد سمی های شهری نام به شده است )49(. آالیندههای شاخص آالیندههای های شهری )HAPS( در حال حاظر مضع برنامههای نظارتی سازمان حفاظت محیط زیست در ایستگاههای سراسر ایاالت متحده امریکا میباشد. فعالیت این ایستگاهها در ارتباط با های بیرن )محیط( حضر نسبی صنایع سنگین )استخراج تلید( امکانات تلید برق فعالیتهای کشارزی )دام یا سمم دفع آفات( مراکز جمعیت )تلید گزهای گلخانه ای از احتراق سخت- های فسیلی( است. دادههای حاصل از برنامههای نظارتی سازمان حفاظت از محیط زیست میتاند یک نقطه شرع خب برای ارزیابی کیفیت های فضای بیرن باشد. بیژه زمانی که ایستگاههای نظارتی از لحاظ جغرافیایی با محل آزمایشگاه IVF در ارتباط باشد )9(. اطالعات EPA در ارتباط با ضابط آالیندهها HAPS به صرت رنه به شکل خالصه انتشار یافت. در اغلب ما بررسی کن های محدده آزمایشگاه برای دستیابی به درک دقیقی از کیفیت های قابل دسترس آزمایشگاه م نیاز است های داخلی سازمان حفاظت محیط زیست (EPA) از تحقیقات گسته در ارتباط با کیفیت های درن آزمایشگاه انجام یک برنامه تحقیقات درن آزمایشگاهی برنامه تحقیقاتی مدیریت خطر ملی در ایاالت متحده آمریکا )NRMRL) پشتیبانی میکند. اما تا به امرز استانداهای کیفیت در همه جا تسعه نیافته است. سازمان بهداشت جهانی )WHO( اداره ایمنی بهداشت شغلی آمریکا )OSHA( تنها مجمعهی محددی از آالیندههای های محیط درن آزمایشگاه را برای در معرض قرار گرفتن افراد مجاز دانستهاند )48 21(. دسترالعملهای مرتبط با کیفیت ها در محیط درن آزمایشگاه استانداهای مرتبط تا حدد زیادی بر اساس مطالعات اپیدمیلژیک در ریانها ندها کدکان افراد بالغ میباشد. این نع از مجدات ارتباط مشخصی با گامتهای کشت شده ریانها در مرحله پیش از النه گزینی ندارند زیرا گامتها فاقد مکانیسمهای دفاعی مجد در یک جاندار پیشرفته میباشند. بنابراین برای آزمایشگاههای IVF الزم است که دانش سایل الزم به منظر سنجش مدیریت کیفیت ها با تجه به تنظیمات مربط به هر آزمایشگاه بدست آید. برخی از آزمایشگاهها بامتخصصان های درن آزمایشگاه که در حال حاظر به تعداد کافی در سازمانهایی مانند انجمن بین الملی کیفیت ها کیفیت آب های درن آزمایشگاه )ISIAQ) که در سال 4884 به سازماندهی کنفرانسها انتشار مجلهی )های درن آزمایشگاه( فعالیت دارند همکاری میکنند. 252

259 2-40. معرفی آلدگیهای انتقال یافته از ها به درن آزمایشگاه IVF عمده مسیرهای انتقال آلدگی ها به درن آزمایشگاه IVF عبارتند از: )4( های انتقال یافته از سایل گرمایش تهیه یا سیستم )2( HVAC انتشار ماد فرار به آزمایشگاه از اتاقهای مجار راهرها )3( گاز خرجی از ماد تجهیت افراد در آزمایشگاه )1( گازهای طبی که ا محفضه انکباتر میشد های HVAC منبع های رسیده به دستگاه HVAC میتاند %411 از های بیرن منشا گرفته یا از چرخش های مجد در محیط داخلی یا ترکیبی از هر د باشد. دستگاه HVAC خد میتاند منبع ذرات گازهای فرار باشد. رغن گریس فن پشش کانال یا سایلی که در جهت مهر مم کن استفاده میشد سایر ترکیبات میتانند منجر به خرج گاز برای مدت زمان بیشتری شد. سیستمهایی با آببندی نامناسب میتاند ذرات معلق میکربها ترکیبات فرار از فضاهای کنترل نشده را به محیط آزمایشگاه تزریق کند. سیستم HVAC که اغلب در محیطهای مرطب کار میکنند بدن تجه به بهداشت میتاند از رشد میکربهای تلید کننده اسپر ذرات ترکیبات فرار به ها پشتیبانی کند ترکیبات فرار عالی )VOC( آد شده در آزمایشگاه IVF گازهای فرار داخل آزمایشگاه در ابتدا به دنبال عملیات ساختمانی بازسازی همچنین از طریق گازهای منتشر شده از حاللها رنگها چسبها مصالح ماد ساختمانی کابینت مبلمان )اثباب اثاثیه( تجهیت جدید آد میشند. فرمآلدئید مجد در برخی از ماد کامپزیت چسبهایی با قدرت تبخیر کم ( / )Torr که در دمای اتاق به آسانی جش آمده با تجه به مساحت مجد منتشر خاهد شد. در بررسی مشخص شد که غلظت الیه آلدئید مجد در آزمایشگاه ملف به دنبال ساخت ساز به طر معنیدار افیش مییباد )بیشتر از 40 میکرگرم بر مترمکعب(. اما پس از حرارت دهی فضا در )81 32 C درجه فارنهایت( به مدت پانزده رز این آلدگی تا ده برابرکاهش یافت. در آزمایشگاههای در حال کار آد شدن مستمر گازهای فرار از ماد مصرفی همانند: ظرف کشت ماد بسته بندی کاغذ تنر جهر کارتریج نشانگرها غیره صرت میگی. بسته- های مقایی اگر ا آزمایشگاه شند به عنان ناقل ماد شیمیایی ذرات آلدگیهای میکربی به شمار میرند. کارکنان نیز از طریق سایل شخصی لباس بیرن دادن تنفس تلید کننده ترکیبات فرار میباشند گازهای فرار فضاهای مجار گازهای فرار میتانند از طریق فضاهای مجار در اتصاالت دیار سقف سایل رشنایی سیستمهای آبپاش cutouts غیره ا آزمایشگاه شند. سیستمهای هاساز چرخشی میتاند این نع جذب از آالینده را تشدید کند. آزمایشگاههای IVF اقع در محیطهای جراحی میتانند به دلیل استفاده مجار ذخیرهسازی ماد تمیز کننده قی استریل کننده )اغلب حای آلدئیدها( ماد مصرفی اتاق عمل گازهای بیهشی بسیار آسیب پذیر باشند انکباتر انکباترها تجهیت آنها با تجه به نزدیکی به محیط کشت میتانند از منابع مهم ماد فرار ذرات باشند. انکباترهای جدید احتماال به علت درزبندها قطعات پالستیکی ران کنندههای فن غیره میتانند تا صد برابر بیشتر تلید کننده ماد فرار نسبت به انکباترهای قدیمی باشند )24(. جایگاه للههای آزمایشگاهی تجهیت ظرف کشت یا هر می که درن انکباتر قرار داده میشد میتاند منشا گازهای خرجی باشد. 259

260 یاهگ یبط ناگدنشرف یاهگ یبط درم هدافتسا یاههاگشیامزآ IVF تلاایا هدحتم یاهدرادناتسا انب هدش یارب نییعت صلخ هک طست یهمانراد تلاایا (USP) هدحتم لمعلارتسد یلم نیعت دناهدش تیعبت.دننکیم ریداقم دییات هدش طست یاربUSP ید دیسکا نبرک نژیسکا نژرتین NF دیاب شیب لقادح حطس صلخ %88 بسحرب مجح.دنشاب اما بلغا حطس صلخ %88/23-%88/83.دنسریم لمیش ناراکمه تیهام یاههدنیلاآ گ یبط ار درم یسررب رارق دنداد رضح نزنب نیرف 280 اهلکلا اهنتسا اهدیئدلاتسا دام رادرلک ار یاهنلیس CO 2 گ دییات هدش طست USP شرازگ دندرک.)24( یخرب ناگدنشرف گ یکشزپ زین یاهتست لمعم یارب ییاههدنیلاآ نچ کاینمآ دیفلس نژیه دیسکا کیرتین نبرک دیسکانم نژرتین ید دیسکا رفلس ید دیسکا ار ماجنا.دنداد تاعلاطم یرتشیب طابترا اب یاهلسپک هدشرپ گ هک نکمم تسا ثعاب یگدلآ متسیس تشک نایر دش هژیب طابترا اب هنیمز لاقتنا نژیسکا مک یاههنمن طیحم تشک هک نآ تمسق نیرتشیب طیحم ین یاضف رتابکنا یاهگ یبط رپ هدش تسا درم ین.تسا.3-40 ذفن دام یمس دجم اه طیحم تشک ذفن دام یمس رارف ن طیحم تشک یگتسب یاهیگژی تظلغ یت للاح نآ بیرض.دراد یسادج 289 لکلم رایعم شجنس تافت تیللاح بیکرت نیب د ف.دشابیم یاهمتسیس تشک ب ییاهطیحم( هک ضرعم سامت میقتسم اب اه )دنتسه ذفن ممس ن یاهطیحم تشک اب هجت بیرض یسادج اه اب ترص بآ.دریگیم عقا رثکا یاههنگ یلکلم رارف ات یددح ن یاهطیحم تشک یبآ لقتنم دنهاخ.دش یاهمتسیس تشک ب تبسن دام یمس دجم اه رایسب بیسآ رتریذپ.دنشابیم هلمج یاهراکهار یکمک ناتیم ندناشپ طیحم تشک اب یاهنغر یندعم ای نیفاراپ هراشا درک هک عنام للاحنا یریذپ رتشیب نیب طیحم تشک اه.دش اب هافتسا شر مه یناشپ اب نغر اهیگدلآ دیاب نغر بآ لباق لح هدب ات طیحم تشک درا.دنش تیمس لکلم اه ار ناتیم بیرض یسادج اه ات نغر ( نغر )یهایگ نغر )لناتکا( ات بآ درآرب.درک نیا تاعلاطا بلغا CRC قیرط باتک یامنهار یمیش کیزیف لباق سرتسد دنشابیم.)22( هچرگا بیرض یسادج دناتیم ییاسانش لماع دیدهت یهدننک دجم اه هک لامتحا دایز لخاد طیحم تشک ذفن دننکیم کمک.دنک اما حطس هناتسآ هک نآ یگدلآ ثعاب بیسآ یاهللس تشک هدش دشیم بلغا درام لباق ساحم.تسین یریذپشنکا زج رصحنم درف کی بیکرت رایعم شجنس یدیفم ییانات ماجنا بیسآ یللس هدب هک شخب همین رمع لکلم طابترا.دراد هچره همین رمع کی لکلم شنکا هدنهد رتهاتک دشاب لامتحا دایز اب یاهدنیارف ییایمیشیب للس رتشیب لخادت.دراد تاعلاطا شنکا ییایمیش یارب شیب 3111 بیکرت یسررب تلااقم دجم هاگیاپ یتاعلاطا دام کانرطخ یرآدرگ هدش هک یهلیس هناخباتک یلم اکیرمآ هرادا دنشیم.)23( یاهشر یمک یارب هعلاطم یاهیگدلآ دجم اه یاهنمزآ ریز هلمج دنتسه یبایزرا یاهشر هک ترص جیار یارب یبایزرا تیفیک اه هدافتسا.دنشیم شجنس تابیکرت هدنیلاآ رارف اممع دنمین تازیهجت صصخت تسا هک یاههاگشیامزآ عجرم دییات هدش.دنشاب نیا تامدخ دناتیم ترص میقتسم ای اب کمک ناراشم تیفیک اه هیارا.دش Freons partition coefficient

261 نامس تظافح طیحم تسیز (EPA TO-43) EPA TO-43 فیط یاهدرتسگ شیامزآ تابیکرت رارف دنشابیم هک اق فشک 80 درم 410 درم هدنیلاآ کانرطخ اه دجم EPA تسیل تسا.)21( یاهگ رارف اجنیا نانع تابیکرت یلاع هک یاراد راشف راخب رتشیب torr 41-4 یامد 23 C راشف mmhg 021 تسا فیرعت.دناهدش یهنمن عمج یرآ هدش یتحار طست نانکراک هاگشیامزآ اب هدافتسا هیلخت ندرک کی فرظ لیتسا یراع یاهیگدلآ ییایمیش ماجنا.دشیم کی لرتنک هدننک نایرج یارب بذج 2 رتیل اه لط 9-21 تعاس هدافتسا.دش یطق رهم مم هدش بسچرب هدرخ اب یاهلسلس کرادم عمج یرآ هدش هاگشیامزآ عجرم لاسرا.دشیم رتشیب یاهگ رارف یامد قاتا یارب دنچ هتفه رادیاپ دنشابیم یهنمن اه سپ اب ظیلغت دامجنا شر ضرعم یسادج یفارگتامرک یگ رارق.تفرگ اهرثکادح هلیسب فیط یجنس یمرج صخشم اب هرگ دهاش لرتنک -1( رلفمرب )نزنب درم هیزجت لیلحت رارق دهاخ.تفرگ EPA TO-44 EPA TO-44 یشیامزآ تسا هک رط صخشم یارب زیلانآ مرف دیئدلآ 41 درم درم رگید هداناخ اهدیئدلآ اهنتک )لینبرک( یحارط هدش تسا.)23( کی پمپ نایرج هلل هیفصت یارب ربع اه قیرط یاههلل هدیشپ هدش اب ید لینفرتین نییه (DPNH) اب تعرس 1/3-4ربع رتیل هقیقد تدم تعاس هدافتسا.دش یاههلل هنمن سپ هکنیا ناشیا هتسب دش بسچرب هدرخ اب هتسد DPNH یاههلل تفج هدش لط کی بش هاگشیامزآ عجرم هداتسرف.دش کیکفت زیلانآ تابیکرت نیه رادیاپ قتشم هدش طست ف سکعم کیتارکزیا یفارگتامرک عیام اب درکلمع (HPLC) لااب اب UV صیخشت هدافتسا دهاش لرتنک ماجنا.دشیم تارذ تارذ یاههدنا 1/3 ات 23 رتمرکیم لامعم طست یتازیهجت هک راشتنا رن دازآ هدش رزیل ار یریگهدنا دنکیم درم زیلانآ رارق.تفرگ لباقرازبا بیقعت اب NIST یاهدرادناتسا نکمم تسا نیا رظنم یحارط هدش.دنشاب تامدخ شرامش تارذ قیرط ناسانشراک یاه طیحم هاگشیامزآ ن بلغا یهلیسب دییات ناگدننک هاگتسد ده هاگشیامزآ ترص -یم.دریگ اهرگشرامش دیاب هدنا یفاک دادعت تارذ یراجم لیحت یهدنهد یاه لخاد هاگشیامزآ ار درم هیزجت لیلحت رارق.دنهد تارذ لاعف یتسیز ار ناتیم عمج یرآ یر یاهتیلپ راگآ ینخ تشک.داد ینلک یرتکاب ای چراق رضاح تاحفص دناتیم یهلیسب صصختم هاگشیامزآ عجرم یژلیبرکیم درم صیخشت رارق.دریگ یاههاگتسد یتسد یاههاگتسد یتسد یحارط هدش یارب صیخشت شجنس هدت تابیکرت یلاع رارف ای تارذ ترص یراجت سرتسد.تسا.0-40 ییاههس یارب لرتنک یگدلآ دجم اه یحارط تیریدم IVF هاگشیامزآ متسیس تشک دناتیم بیسآ یریذپ اهتماگ یاهنایر تشک هدش ار ربارب یاههنگ یمس دجم اه شهاک.دهد یسادج تاسیسات کی IVF هاگشیامزآ هک یتس یحارط هدش یاراد یاهراید ینریب تلااصتا فک فقس ا رباعم ذفانم دجم یاهراید شیپ هتخاس هک لاماک یگمه رهم مم دناهدش.دشابیم نیا رما ببس دشیم یاه لقتنم هدش تدش

262 256 یهلیسب متسیس HVAC اهیجرخ لرتنک هدش ندب هکنیا یگدلآ یسسحم یاهاضف راجم بذج.دش تلااقم یتاقیقحت ار ناتیم یارب یبایزرا تاج یسادج هاگشیامزآ ای ریثات یارجا تاریمعت درم هدافتسا رارق داد.)22( HVAC یرایسب رصانع HVAC یحارط دناتیم تیفیک اه ار حن یبلطم تحت ریثات رارق.دهد اما نینچمه دناتیم نایم یرازبا هک طبرم تیفیک اه دنشابیم زج نیرتنارگ.دنش یدنب هقبط اهرازبا یرایسب میهافم ریز لماش ییاهدربهار یارب IVF هاگشیامزآ تسا هک طست نمجنا بط دیلت لثم اکیرمآ )20( نمجنا دیلت لثم یناسنا یسانش نایر اپرا رشتنم هدش.تسا.9-40 عبنم اه یاه نریب بلغا لیلد هد لماع ای رتشیب رتکاپ یاه ن.تسا تست تیفیک اه ار ناتیم یاهتیاس یهاگشیامزآ دجم ای داهنشیپ هدش یارب دییات نیا لصا یلک یارب رارق نداد نیرتبسانم هاگیاج نانع یاه یدر HVAC متسیس ماجنا.داد هیهت %411 یاه نریب ندب تفایب یاه لخاد دنچره یخرب درام دمآراکان هدب رثکا درام نیرتلااب تیفیک یاه هاگشیامزآ ار مهارف.دنکیم ییانات لیدبت دص یدص یاه ین شدرگ هدمآ دناتیم ینامز دیفم دشاب هک یاه نریب رضم دشاب ش ( تآ یزس.(هریغ.8-40 راشف تبثم هیهت اب راشف تبثم ینامز داجیا دشیم هک یاهرین HVAC نف اه ار ن کی قاتا اب یتعرس هک فلاتخا راشف اب یاضف راجم داجیا دنک درا.دننکیم دحا هدنا یریگ لماش یراشف تسا هک یارب اج ییاج یدمع کی نتس بآ ( لباقم )شنارگ دحا.دشابیم مزلا چنیا راشف تبثم دناتیم اب در یاه لرتنک هدشن قیرط رهار ریاس عبانم یریگلج.دنک راشف داجیا هدش اب ریاس لماع دناتیم یارب یسادج طیحم یسانش نایر رثکادح( )راشف رگید اهاضف ( لقادح )راشف رایسب دیفم.دشاب هجیتن نیا حرط هتفریذپ هدش تسا هک هدافتسا یاهفرعم یق ییاضف رتنییاپ رتابکنا دشر نایر ترص.دریذپ تعرس شدرگ یاه هت نازیم تعرس شدرگ یاه هت لماش تدم نامز مزلا یارب ینیزگیاج مجح یاه دجم قاتا اب یاه هت یاه( )نریب.دشابیم نیا فیرعت دیابن اب هرابد ندشرپ طیحم لخاد اب یاه یبیکرت یاه نریب یاه لخاد تفایب هدش هابتشا هتفرگ.دش نیا ثحب جیار تسا هک نازیم شدرگ رادقم یاه یاهت هک ره تعاس ضیعت دشیم هتفگ.دشیم یحارط متسیس HVAC هیهت اب تعرس شدرگ یلااب یاه هت دناتیم تارثا دیدش یاهگ رارف عستم هدش لخاد هاگشیامزآ ار شهاک.دهد تعرس شدرگرتلااب اه لباق سرتسد هدب نکمم تسا شیازفا تیفیک اه رجنم.دش شزرا شیازفا شدرگ اه نکمم تسا اب شیازفا بسانتم یتص یگدلآ یاضف عبطم هارمه.دش یاهرتلیف هیفصت هدننک تارذ اه اب نامدنار لااب یاهرتلیف هیفصت هدننک تارذ اه اب نامدنار (HEPA)لااب لکشتم فایلا هتفاب یاهدش تسا هک تارذ طست -مسیناکم ییاه ماد هتخادنا.دنشیم HEPA یاهرتلیف رط لمعم یاهمتسیس HVAC هیهت IVF هاگشیامزآ هدافتسا -یم دنش رط لمعم تیرثکا تارذ )<%88/8( اب هجت هدنا تارذ هتسب هقبط لامعم 3/1یهدنا رتمرکیم ار فذح.دننکیم

263 بصن هار یدنا دیدج بصن هار یدنا یهیلا HVAC یاهمتسیس ابلاغ طیحم اب یاهگ جراخ هدش اهریگز شکر یاههلل کچک تارذ یکیژلیب هدلآ.دنشیم زیمت ندرک قیقد یتشاد لابند ژاتنم لابند ندنازس یاهامد لااب نکمم تسا تلاکشم طبترم اب دام دیدج ار شهاک.دهد هار یدنا HVAC یاهمتسیس دیدج ای یسب هدش دیاب رظن تابیکرت یلاع رارف تارذ یاهیگدلآ یکیژلیب شیامزآ.دنش تشاد تشاد HVAC یاهمتسیس دجم نکمم تسا لط نامز شهاک.دبای کی سرت لباق لبق طابترا اب -هعمجم ی یگدلآ ارکیم لخاد متسیس لماع اب حطس بسانم تبطر یبسن )%31-31( دج.دراد شیامزآ مظنم یاه هیهت هدش تارذ یاهیگدلآ یکیژلیب کی لمع هنلاقاع.دشابیم هدنرامش تارذ یاهتیلپ راگآ ینخ نکمم تسا یارب یبایزرا یاه یرآرف هدش درم هدافتسا رارق.دنریگ ناحارط ناراکنامیپ یارب تخاس س هاگشیامزآ دیدج ای یسن دیاب ناحارط ناراکنامیپ یکیناکم نیمات ناگدننک دام هجت تشاد هک طابترا اب تیفیک یاه لخاد نامتخاس یهاگآ یفاک رادرخرب.دنشاب فیعضت تابیکرت ات رارف هار یاهلح یسدنهم لاکشا فلتخم یارب VOC فذح ای ریغ لاعف ندرک تابیکرت نیا یاههاگشیامزآ IVF نایب هدش.تسا لابرغ یلکلم یبیکرت (HEPA) یاهجیرتراک لابرغ یلکلم یارب یخرب اهرتابکنا Thermo Fisher طست یحارط -نف یاه هیهت اه رارق هداد.دش یاهلاغز لاعف میساتپ تانگنمرپ یارب نیسارتلیف طیحم یاهتیلپ یاح یاهلاغز لاعف هتخیمآ اب تانگنمرپ میساتپ رظنم فذح یاهگ رارف شخب یاهسیرس طبرم یاه هاگشیامزآ دناتیم درم هدافتسا رارق.دریگ لاعف ندرک لاغز گنس رجنم شیازفا بیرض لخلخت نآ هدش هک هجیتن رجنم شیازفا حطس بذج ییایمیش اهنبرکیه ریاس تابیکرت ات رارف.دشیم تانگنمرپ میساتپ لماع هدننکدیسکا یق تسا هک مرف تیبثت هدش رجنم لزنت یرایسب اههدنیلاآ هدش یاراد تارثا یطستم یثنخ یس هداناخ لینبرک.تسا دیلت یراجت یاهطیحم یاح لاغذ KMnO 1 ای هک تهج هیفصت اه HVAC یاهمتسیس یارب یاه طیحم قاتا لخاد رتابکنا نینچمه ططخ هضرع گ یبط یحارط.دش نیسارتلیف ای لاغذ KMnO 1 یارب طیحم لخاد رتابکنا کی هعلاطم هک ترص یفداصت دب درم یسررب رارق تفرگ.)43( تفرشیپ یرادینعم خرن یاهیرراب یکینیلک اب هدافتسا هاگتسد رتلیف شرازگ دش %32(.)%31لباقم اب نیا لاح نیا هلصاف ینامز ) ( کی متسیس تشک ب طست نافلم درم هدافتسا رارق.تفرگ مدع دج ششپ نغر نکمم تسا رب تارثا دیفم نیب ندرب یگدلآ اه هظفحم رتابکنا دیکات.دنک شیامزآ یفداصت اب نامه هاگتسد لحم یرگید اما اب رضح ششپ هیلا نغر ماجنا دش هک هنگچیه تارثا یدب هدید دشن.)43( رتسب یاهرتلیف نبرک لاعف هدش تانگنمرپ یاراد رمع یدیفم هدب هک یاهرتکاف

264 258 یرایسب هلمج بیکرت تدم نامز تنکس یاه یربع راب هدنیلاآ هلمج یدرام دنتسه هک اهنآ یگتسب.دراد طیحم رتسب رتلیف ار ناتیم یارب یریگراب هدنیلاآ رتسب نبرک فرصم KMnO 1 رظنم داجیا همانرب یسب طیحم هاگشیامزآ درم یبایزرا رارق.داد شیامزآ شهاک ای نبرک KMnO 1 طست ناراشم تیفیک اه ای طست یاههاگشیامزآ یلیلحت صصختم یبایزرا تیفیک اه ماجنا.دشیم هعشا ءارام شفنب UV رن نانع یاهلیس تهج شهاک یگدلآ تابیکرت یلاع رارف داهنشیپ هدش هار ییاهلح ینبم رب هدافتسا یاربUV یاه ب شخرچ هدش طست HVAC متسیس داهنشیپ هدش.تسا طیحم تشک رتابکنا IVF یاهرتابکنا هژی ینامز هک دیدج دنتسه نانع کی عبنم یق VOS رامش.دنریم شیامزآ نایر شم یاهرتابکنا دیدج بلغا نایب هدننک ین کی هرد burn-in period یارب ییانات رتابکنا تهج تیامح جیاتن بلطم طیحم تشک.دشابیم هر یرادرب یاهرتابکنا دیدج یامد رثکادح کی ناکم رد طیحم تشک نایر لاح تفرشیپ نکمم تسا رجنم هاتک ندش burn-in period هرد.دش نزخم بآ یکی عبانم یق عستم هدننک گ تسا هک یگتسب تیفیک بآ.دراد هدافتسا بآ رابد ریطقت هدش ای بآ اب یهج تیفیک لااب یارب یاهرتابکنا بطرم یرما جیار.تسا نینچمه رصت دشیم هک فرظ بآ نانع ینزخم یارب یاهلکلم تسدبآ دجم اه هلمج هداناخ اهلکلا.دشاب یهجیتن یگدلآ یبرکیم فرظ بآ دناتیم دناتیم راشتنا تابیکرت یلاع رارف.دشاب یتامادقا تهج هلباقم اب یگدلآ لماش ضیعت ررکم بآ هفاضا ندرک دام کیتاتسایرتکاب رط میقتسم بآ دننام نی سم یهعطق( یهاتک هلل )سم ترص EDTA ای.دریذپیم ششپ نغر نیلا طخ یعافد اهتماگ ای یاهنایر لاح دشر ربارب ممس دجم اه هدافتسا کی ششپ )هیلا( نغر رب یر طیحم تشک.تسا تعیبط زیرگبآ نغر عنام راشتنا یاهگ رارف تسدبآ تابیکرت یکیژلیب )یتسیز( تارذ رط میقتسم ن طیحم تشک یبآ.دشیم نینچمه ناتیم نغر ار نانع کی نزخم یارب یاههدنیلاآ زیرگبآ فرظ طیحم تشک راک.درب نریاتسا هگژنک هدشن )رمنم( نانع مس نایر فرظ یلپ نریاتسا هک رط لمعم IVF هدافتسا دشیم دازآ ددرگیم.)28( بیرض یسادج نغر بآ یارب نریاتسا 3/13 )یمتیراگل( هدب نیا انعم هک لکلم نریاتسا 4111 ربارب لامتحا یرتشیب دراد هک نغر ار ن طیحم تشک ادج.دنک یاهنایر شم ضرعم طیحم -تشک ییاه اب تظلغ ممسم هدننک نایر رمنم نریاتسا )2( ای ریاس ممس للحم نغر )34 31( رارق هداد.دش دشر من اهنآ فقتم تشگ اما اب رضح ششپ نغر تاجن.دنتفای یخرب IVF یاههاگشیام دمع ریاخذ نغر ار رتابکنا رارق هداد نینچمه کی نزخم هفاضا یارب تابیکرت رارف للحم نغر هک یاه رتابکنا رضح دنراد رظن هتفگ.دش دنچره نکمم تسا نیا رما درم دیدجت رظن رارق دریگب اریز فلم نیا درم چیه هنگ یتاعلاطا.درادن دنچره هک دج یاهنغر یندعم عافد لباقم تابیکرت یلاع رارف زیاح تیمها دنتسه اما دنناتیم نانع کی عبنم هتساخان یگدلآ.دنشاب هاگدنشرف یراجت بلغا یاههدنیلاآ للحم بآ ار یاهنغر یندعم دجم طیحم IVF تشک طست لمع تسش ش رظنم لقادح ندناسر راشتنا یاههدنیلاآ هتساخان ن طیحم تشک جارختسا دندرک.)32( یخرب ناگدنشرف اب ماجنا ییاهشیامزآ تهج هج صلخ یراصحنا لصحم دخ یاهیرظن ار ینبم رب هریخذ یس نغر یاه درس 1( )دارگیتناس هج رظنم یریگلج نیسادیسکارپ نغر هک دخ دناتیم تارثا یفنم رب یر تماگ نایر هتشاد دشاب نایب دندرک.)31 33(

265 طر قابل تجهی بسیلهی اعمال برخی از شیههای ساده رش عممی آزمایشگاه بار زیست محیطی از سمم مجد در آزمایشگاه میتاند به انجام کار کاهش یابد قفسه بندیها قفسه بندی بیرن آزمایشگاه میتاند برای جداسازی ماد آزمایشگاهی از بسته بندیها یا ظرفشان استفاده شد. بسیاری از کارکنان آزمایشگاه مجدی کاالهای خد را در مقادیر اندازه گیری شده از محیط بیرن که ذخیره شده به درن آزمایشگاه منتقل میکنند تا مین گازهای خارج شده از ماد جدید به حداقل برسد. این امر به یژه برای استریل کن عاملی که اغلب ترکیبات آلدئیدی (Cidex) تثبیت کنندهها که در برخی از رشهای تشخیص ژنتیکی پیش از عمل النه گزینی صرت میگی استفاده شده است دسترسی به آزمایشگاه رد به آزمایشگاه میتاند به صرت کنترل شده تنها برای کارکنان ضرری محدد شد. قبل از رد کارکنان ضرری است که : 4( محصالت شخصی استفاده شده را به حداقل رسانده محصالتی که دارای حداقل ترکیبات فرار است استفاده شد. 2 ( لباس تمیز که مخصص آزمایشگاه است را پشیده مهای خد را بپشانند. 3 ( پشیدن کفش مخصص آزمایشگاه که یه طر منظم ضدعفنی شند 1( تجهیت نیز قبل از رد باید در معرض اعمال بهداشتی قرار گیرند عامل شینده از جمله عاملی که قابل دسترس بده منطبق بر اصل بهداشت میباشد میتان به آب مالیم هیدرژن پراکسید اشاره ک. خمیر سدیم بی کربنات آب یک پاک کننده ساینده بسیار عالی است. بسیاری از آزمایشگاهها از معرفهای قیتری که دارای فراریت کم قدرت حاللیت باال )شست شی آسان( هستند برای تمیز کن انکباترها استفاده میکنند. استفاده از معرفهای فرار مانند الکل باید در مناطق در از انکباتر یا در طل درهای که ریان در محیط کشت نیست استفاده شد. منابع.Cohen J et al ( ) Ambient air and its potential effects on conception in vitro. Hum Reprod :.Hall J et al ( ) The origin, effects and control of air pollution in laboratories used for human embryo culture. Hum Reprod (Suppl ):.Johnson JE, Boone WR, Bernard RS ( ) The effects of volatile compounds (VC) on the outcome of in vitro mouse embryo culture. Fertil Steril (Suppl ):S S.Anderson K et al ( ) TVOC and health in non-industrial indoor environments. Indoor Air :.Colonna-Worrilow K et al ( ) A retrospective analysis: the examination ofa potential relationship between particulate and volatile organic compound (VOC) levels in a class IVF cleanroom laboratory (CR) and specific parameters of embryogenesis and rates of implantation (IR). Fertil Steril (Suppl ):S.Committee on Aldehydes, Board of Toxicology and Environmental Hazards, National Research Council ( ) Formaldehyde and other aldehydes. National Academy Press, Washington, DC.Boone WR et al ( ) Control of air quality in an assisted reproduction laboratory. Fertil Steril :.Legro RS et al ( ) Effect of air quality on assisted reproduction. Hum Reprod :.Gilligan AV ( ) Establishing the IVF laboratory: a systems view. In: Carrell DT, Petersen CM (eds) Reproductive endocrinology and infertility: integrating modern clinical and laboratory practice. Springer, New York, NY 253

266 .Dickey RP et al ( ) Effect of IVF laboratory air quality on pregnancy success. Fertil Steril (Suppl ):S.Higdon HL, Blackhurst DW, Boone WR ( ) Incubator management in an assisted reproductive technology laboratory. Fertil Steril :.Esteves SC, Gomes AP, Verza S ( ) Control of air pollution in assisted reproductive technology laboratory and adjacent areas improves embryo formation, cleavage and pregnancy rates and decreases abortion rate: comparison between a Class (ISO ) and a Class (ISO ) cleanroom for micromanipulation and embryo culture. Fertil Steril (Suppl ):S.Mayer JF et al ( ) Prospective randomized crossover analysis of the impact of and incubator airfiltration system on IVF outcomes. Fertil Steril (Suppl ):S.Merton JS et al ( ) Carbon-activated gas filtration during in vitro culture increased pregnancy rate following transfer of in vitroproduced bovine embryos. Theriogenology :.Battaglia DE et al ( ) Prospective randomized trial of incubator CODAfiltration units revealed no effect on outcome parameters for IVF. Fertil Steril (Suppl ):S.Souza MCB et al ( ) Evaluation of two incubation environment class versus class on intracytoplasmic sperm injection (ICSI) cycles outcome. Fertil Steril (Suppl ):S.Federal Register CFR part.federal Register : no..world Health Organization ( ) WHO guidelines for indoor air quality: selected pollutants ( data/ assets/pdf_file/ / /e.pdf).us Occupational Safety and Health Administration ( ) Indoor air quality in commercial and institutional buildings, OSHA -.Schimmel T et al ( ) Removal of volatile organic compounds from incubators used for gamete and embryo culture. Fertil Steril (Suppl ):S.Linde D (ed) ( ) Handbook of chemistry and physics, th edn. CRC, Boca Raton, FL. htmlgen?hsdb.mcclenny WA, Holdren MW ( ) Compendium method to TO-. Compendium of methods for the determination of toxic organic compounds in ambient air, nd edn. (EPA/ /R- / b) gov/ttnamti /files/ambient/airtox/to- r. pdf, pp.winberry WT Jr et al ( ) Compendium method to TO- A. Compendium of methods for the determination of toxic organic compounds in ambient air, nd edn. (EPA/ /R- / b) /files/ambient/ airtox/to- ar.pdf, pp.grieve PW ( ) Measuring ventilation using tracer gases. Bruel & Kjaer, Denmark.Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine, Practice Committee for the Society for Assisted Reproductive Technology ( ) Revised guidelines for human embryology and andrology laboratories. Fertil Steril :S.Committee of the Special Interest Group on Embryology for the European Society for Human Reproduction and Embryology ( ) Revised guidelines for good practice in IVF laboratories. Hum Reprod :.Gilligan A et al ( ) Release of volatile organic compounds such as styrene by sterile Petri dishes andflasks used for in vitro fertilization. Fertil Steril (Suppl ):S.Miller KF, Goldberg JM, Collins RL ( ) Covering embryo cultures with mineral oil alters embryo growth by acting as a sink for an embryotoxic substance. J Assist Reprod Genet ( ):.Miller KF, Pursel VG ( ) Absorption of compounds in medium by the oil covering microdrop cultures. Gamete Res :.Morbeck DE et al ( ) Washing mineral oil reduces contaminants and embryotoxicity. Fertil Steril : 261

267 فصل 49 سیستمهای کشت: الیه رغن معدنی به طر معمل از الیهای از رغن معدنی برای پشاندن محیط کشت در ریه لقاح برنتنی استفاده میشد. اگرچه به نظر میرسد که رغن معدنی ترکیبی همگن میباشد اما این ماده به نعی محصلی تعریف نشده میباشد که میتاند از نظر کیفیت نسان زیادی داشته باشد. در اینجا به تضیح تاریخچه شیمی فراری مصرف بهینه رغن معدنی برای لقاح برنتنی کشت ریان پاخته میشد مقدمه از ابتدای دهه 4821 میالدی رغن معدنی به عنان یکی از اج استاندا کشت برنتنی ریان به حساب میآید. درپی مفقیت ابتدایی کشت ریان از مرحله کلیاژ به سمت تکین به مرحله بالستسیست در لله آزمایش )2 4( د دانشج در آزمایشگاه John Biggers در دانشگاه پنسیلانیا به نامهای )3( Ralph Gwatkin )1( Ralph Brinster رشی را ابدا نمدند که این امکان را فراهم نمد که به اسطه استفاده از یک الیه رغن معدنی ری محیط کشت محیط لقاح برنتنی بتان به دفعات بیشتری ریانها را خارج از انکباتر زیر میکرسکپ م بررسی قرار داد )3(. اگرچه کشت در لله آزمایشگاهی همچنان به عنان یک انتخاب قابل قبل میباشد ایجاد استفاده از این ریزقطرهها با استفاده از الیه پشاننده رغن معدنی تنع در ریکهای م استفاده در ظرف کشت به عنان قدم اصلی به سمت تعریف نیازمندیهای کشت برای ریانهای مرحله کلیاژ به حساب میآید. استفاده از ریز قطرههای پشانده شده با رغن معدنی به عنان معملترین رش کشت برنتنی ریان در حال حاضر به حساب میآ ید. عاله بر اینکه استفاده از ریز قطرهها در کشت برنتنی ریان امکان ارزیابی ریانهای کشت داده شده را فراهم میآ استفاده از رغن معدنی امکان به کار گرفتن مقادیر بسیار کچکی از محیط کشت را فراهم آه این نکته درحالی اتفاق میافتد که نسان در دما ph فشار اسمزی به حداقل رسیده است )2 3(. همچنین ممکن است که رغن معدنی جاذب آلدگیهای آبگریز یا ترکیبات عالی فرار از محیط کشت نیز به حساب آید )9 0(. به هر ری علیرغم این میا استفاده از رغن معدنی میتاند به عنان مضعی مشکل ساز نیز به حساب بیاید اناع رغن رغن معدنی از رغن خام به دست میآید در حقیقت ماد آغازگر تلید رغن معدنی همان مادی است که برای تلید gasoline سخت دیزل ماد شیمیایی از جمله بنزن استفاده میشد بنزن یکی دیگر از ماد شیمیایی مرتبط با IVF میباشد که برای به دست آن پلی استرن م نیاز برای ساخت پتری دیش م استفاده قرار میگی. رغن معدنی به عنان یکی از بخشهای حاصل از تقطیر رغن خام میباشد. این ماده با نام petrolatum معدنی رغن پارافین رغن معدنی سفید یا رشن نامیده میشد. سه نع از هیدرکربنها در رغنهای معدنی تصفیه شده جد دا: هیدر کربنهای راست زنجیر حلقی آرماتیک. برخی از شرکتها ادعا میکنند پارافین معدنی متفات از رغن معدنی میباشد. دلیل این ادعا این است که پارافین معدنی تنها از هیدرکربنهای اشباع راست زنجیر تشکیل شده است. در حقیقت به دلیل سختی در جداسازی تصفیه این اج مشابه رغنهای معدنی سبک رغن پارافین در اقع ترکیبی از هیدرکربنهای راست زنجیر همچنین برخی از هیدرکربن- های حلقی آرماتیک میباشد. رغن معدنی به عنان ران کننده رده یا برای کشت ریان در دارنامه ایاالت متحده )USP( م تایید قرار گرفت. از جمله شرایط الزم برای تایید درجه رغن در USP میتان به اندازهگیری یسکزیته زن مخصص گگ مین غیر اشباع بدن هیدرکربنهای چندحلقه ای )آرماتیک( اشاره ک. اما به نظر نمیرسد نیازی به اندازه گیری مین استریل بدن یا اندازه گیری مقدار آالیندههایی که ممکن است برای ریان خطرناک هستند باشد. زن مخصص رغن معدنی میتاند با تجه به طل مختلف زنجیرههای هیدرکربنها )41-31 کربن( برای درجهی شفافیت 264

268 262 نغر یندعم g/ml 1/991-1/949 تافتم.دشاب دیلت ناگدننک نغر یندعم یارب هاگشیامزآ IVF نغر اب نیرتنییاپ دح فیط نز صصخم ار باختنا دننکیم ات یلصحم اب لقادح رادقم هتیزکسی ار هیارا.دنهد دنچره اهنت کی تکرش نغر نیفاراپ اب د هتیزکسی تافتم ( نز صصخم g/ml 1/91 )1/92 ار.دشرفیم هلاع رب نیا نیا اهتکرش نکمم تسا یاهتسد اهنغر ار تهج ماجنا یاهتست یفاضا یارب نازیم اههدنیلاآ یارب لصح نانیمطا تهج هدافتسا نآ هاگشیامزآ IVF باختنا.دننک نغر اهیگدلآ نغر یندعم هلمج یازجا طیحم تشک نایر دشابیم هک نیرتشیب لیسناتپ یارب داجیا یگدلآ ار.دراد نیا تیعض طست یخرب تادیلت یاهشرازگ دییات هدشن یمس ندش نایر طست یخرب اههدنیلاآ هدهاشم هدش.تسا نیلا شرازگ یمس ندش نایر )8( عن مس صخشم دشن اما ییاهریغتم هک تیمس ار تحت ریثات رارق دندادیم دننام هدنا -هرطقزیر اه نادقف ادیسلپانز صخشم.دندش درام تیمس هتخانشان رگید دجم نغر یط لرتنک یفیک هناخراک (QC) اب ماجنا شیامزآ رب یر یاهنایر شم )41( طیحم تشک نایر اگ )44( زب )42( شم )43( شرازگ.دش ییاسانش ییایمیشدام دجم نغر یندعم یارب ییاسانش یریگلج یگدلآ یررض رتشیب.تسا رصنع یر )41( نتیرت اهدیسکارپ -40( )43 نغر درم هدافتسا طیحم تشک نایر ننکات درم ییساسانش رارق هتفرگ.دنا نتیرت X-411 هلمج یاهتنجرتد ریغ ینی درم هدافتسا تاقیقحت نینچمه نانع یکی یازجا هتفرراک دیلت تلاصحم هدنیش تعنص دربراک.دراد دج نیا هدام ییایمیش یرطبد فلتخم نغر یندعم هک یناپمک امگیس درم تست هنیمز تشک ینتنرب نایر شم رارق هتفرگ دب رجنم داجیا یخرب تلااس بلاج.دش نیا نغر یارب یاهنایر شم رایسب یمس :دب سپ هنگچ یهناخراک هدنس لحارم شیامزآ ار یط هدرک تسا هدهاشم هکنیا یکی اهیرطب نازیم نتیرت 41 ربارب یرطب رگید دب ناشن هدنهد سنایرا تیفیک نغر کی یرطب یرطب رگید.دشابیم ییاجنآ هک یهمه اهیرطب لابق شیامزآ دندشن نیا لامتحا دج دراد هک یرطب هدلآ هدشن یارب شیامزآ لرتنک تیفیک درم هدافتسا رارق هتفرگ.تسا یلاح هک -نغر یاه یندعم امگیس USP هج دنشابیمن نیا هتکن هک ایآ رگا اهیرطب درم USP تست رارق دنتفرگیم نیا اهیگدلآ صخشم دشیم یاج ثحب.دراد عبنم نتیرت دج یریغتم ریداقم نآ اهیرطب رجنم زرب تلااس فلتخم طابترا اب لحارم تخاس هتسب یدنب اهیرطب.دش فلاخرب دیلتریاس ناگدننک نغر درم هدافتسا IVF هیر اب هج یفیک USP هک ار نغر یاهیرطب یاهشیش ای PET یکیتسلاپ یب رثا یرادهگن دنیامنیم تکرش امگیس عبانم نغر دخ ار یاهیرطب یلپ نلیپرپ یرادهگن.دنکیم نیا ناکما دج دراد هک یگدلآ عبنم ینغر هدبن یرطب رضح هتشاد.دشاب هنمن یاهیگدلآ ادج هدش لط دیلت یتسیاب رایسب ان هدب دنشاب اما صیخشت اهنآ لط یاهشیامزآ لرتنک تیفیک رایسب راشد.دنشابیم دیاش اهدیسکارپ ار ناتب نانع نیرتیدج یاههدنیلاآ دجم یاهنغر یندعم.تسناد نیا اهدیسکارپ نیسادیسکا یاهدناب هناگد اهلکلم نغر دیلت.دنشیم نیمه لیلد یاهنغر یندعم عابشا حیجرت هداد هدش لامتحا دایز دیفم.دنشابیم لیلد هکنیا اهدیسکارپ هجیتن نیسادیسکا دنتسه اهنآ دنناتیم ره نامز لط رمع دیفم نغر دیلت هعست دنبای.)43-40( نیاربانب کی هدننکدیلت دناتیم تست لرتنک تیفیک ار اب هدافتسا شر نایر شم )MEA( یتق هک نغر یرطب تسا ماجنا هداد یل نیا نیمضت هدننک تملاس نغر دشابیمن نیا ناکما دج دراد هک نغر ادعب یمس.دش Otsuki ناراکمه یگدلآ دیسکارپ نغر یندعم اب هج یهاگشیامزآ ار شرازگ دندرک دنتفای هک تاج نیسادیسکارپ هتسبا رارق نتفرگ ضرعم امرگ UV رن یسهریخذ تدم ینلاط دیلت هدننک رامش یرایسب لماع رگید تسا.)42-40( هلاع رب اهدیسکارپ هک رجنم دیلت یاههنگ لاعف نژیسکا )ROS( دنشیم ینغر هک رظن تیفیک لزنت هتفای تسا زین هدننکدیلت اهلانکلآ alkenals اهدیئدلآ( )عابشا اهدیئدلآ )43(.دشیم نیا تابیکرت ینامز هک طیحم تشک اه دج دنراد رجنم تیممسم نایر دنشیم.)49( نچ تیفیک نغر دناتیم تحت ریثات ییاجاج

269 269 هریخذ یس دشاب هجیتن فرصم ناگدننک ییاهن دیاب بقارم سنایرا یفیک نغر کی یرطب یرطب رگید دنشاب تبقارم دنیامن هک تارثا رضم یطیحم رب نغر لقادح نکمم لیلقت.دبای.3-49 هریخذ یس نغر تلع تیهام هقلاب یریذپشنکا یاهنغر یندعم ناگدننکدیلت یاهنغر یندعم هیصت دننکیم هک نغر یامد 1 دارگیتناس هج یکیرات قلطم یارب ددحم ندرک امرگ داجیا نیسادیسکا یرادهگن.دنش رمع دیفم نغر 3 هتفه ات لاسد هیصت.دشیم یلاح هک رمع دیفم رتهاتک هنلاقاع رظن دسریم تقیقح تاعلاطا لصاح هعلاطم Otsuki ناراکمه )42( ناشن دنداد هک نغر یندعم اب تیفیک بخ دیاب تدم د لاس رادیاپ.دشاب رگا نغر دقاف لکلم عابشاریغ دشاب یرادگن یامد 1 دارگیتناس هج یکیرات قلطم یررض.دشابیمن اب نیا لاح ات ینامز هک ناگدننکدیلت دناتب یاهنغر یندعم اب هج صلخ رتلااب دیلتار دننک نیا تامادقا یطایتحا یارب هریخذ یس دیاب تیاعر.دش.1-49 یشتسش نغر هچرگا یهمه یاهنغر یندعم لاامتحا تست تیفیک هتفریذپ دناهدش اما ام مینادیمن هک تست ماجنا هدش یهدنا یفاک لحارم هیلا نیسادیسکارپ ساسح هدب تسا ای هکنیا یاههیصت یسهریخذ بسانم دناهدب ای.ریخ Sifer ناراکمه )48( کی شیامزآ یفداصت لرتنک هدش یارب یاهنغر یندعم دیلت هدش طست راهچ تکرش فلتخم Vitrolife, )CryoBioSystem,Medicult, Nidacon) ار ماجنا.دنداد ره هرگ شیامزآ کیدزن 421 رفن رامیب هک درم IVF نام رارق هتفرگ دندب تکرش دنتشاد تیاهن یتافت خرن ینتسبآ هنلا ینیزگ هدهاشم دشن اما تیفیک نایر لصاح نغر تکرش Vitrolife s Ovoil رتلااب د تکرش Medicult CryoBioSystem.دب نیا اهشیامزآ نامز طیارش یرادهگن نغر طست عیزت ناگدننک هطبرم لبق لمح هاگشیامزآ IVF صخشمان هدب.تسا نیکت نایر طیحم ییاهتشک هک نغر Ovoil تکرش اهنآ هدافتسا هدش دب اب تیفیک نایر لصاح نغر Nidacon s Nidoil تکرش یتافت تشادن یلاح هک رمع دیفم نیا اهنغر 21 هام هدب.تسا لباق هجت تسا خرن تیستسلاب هعست هتفای اب هدافتسا نغر Nidacon تکرش شیامزآ لرتنک تیفیک MEA تکرش %81 هدب تسا یلاح هک نیا خرن اب هدافتسا نغر ریاس اهتکرش طیحم تشک هناتسآ 01 ات %91.دیسر نکمم تسا تکرش Nidacon ینغر اب تیفیک رتلااب ینبم رب یاهدرادناتسا لرتنک تیفیک ناشدخ باختنا.دنکیم یلاح هک رثکا دیلت ناگدننک یاهنغر یندعم ار لبق هتسب یدنب تسش ش دنهدیم یشتسش نغر عضم یخرب اهثحب هدب.تسا ثحب Embryomail یکاح مدع قفات هدافتسا نغر یندعم هتسش هدش نیب نایر ناسانش هدب.تسا Fleming ناراکمه )8( نایب دناهدمن هک یاهنغر یندعم هک یاراد تیمس یارب نایر دنشابیم ار ناتیم اب لمع تسش ش مس ییادز.درک رط اشم Lee ناراکمه )43( هعست نایر شم اب هدافتسا نغر هتسش هدش ار هدهاشم.دندرک Morbeck ناراکمه )43( ناشن دنداد هک رادقم نتیرت سپ لمع شتسش شهاک هتفای نینچمه نغر یاح دیسکارپ رثا نیا شتسش یاراد نازیم تیمس یرتمک.دشیم درم ینغر ییلااب ریداقم یتحمهک دیسکارپ دشابیم صخشم تسین هک ایآ نیا شهاک تیمس رثا شتسش لیلد شهاک رضح کی ای یهمه ممس دشابیم ای ریخ تیلاعف( اهدیسکارپ اهدیئدلآ.)اهلانکلآ یلاح هک یاهشر یفلتخم یارب تسش ش طست هاگدننکدیلت فرصم ناگدننک ییاهن هدافتسا دشیم اما زنه کی شر دحا یارب تسش ش صخشم هدشن.تسا Otsuki ناراکمه )40( ناشن دنداد هک نیمبلآ دناتیم نانع کی لابرغ یارب یریگلج در یگدلآ نغر طیحم لمع.دیامن نیاربانب نیئترپ دناتیم نیب ندرب یاههدنیلاآ نغر ماگنه تسش ش دیفم.دشاب هچرگا هراشا هدش تسا هک نیمبلآ دناتیم نیسادیسکارپ نغر میهس دشاب نیاربانب هیصت دشیم هک نیمبلآ یاهللحم تسش ش فذح دنش.)40( Otsuki ناراکمه یهلاقم دخ نغر هدلآ هدش اب اهدیسکارپ نتیرت ار شتسش دنداد Morbeck ناراکمه )43( بآ طیحم HTFتشک HTF HSA یاح نانع لماع شتسش درم هدافتسا رارق دنداد ره د شیامزآ یامد قاتا یامد 30 دارگیتنسا هج تدم 21 تعاس درم یسررب.تفرگرارق تسش ش ماجنا هدش اب بآ ییاهنت ای اب هدافتسا

270 261 طیحم تشک ای طیحم تشک هارمه نیئترپ کی نازیم رثم عقا.دش امد رب یهجیتن شتسش ریثات راذگ هدبن.تسا یارب فادها یملع یرایسب ناگدننکدیلت تسش ش اب بآ ار باختنا دننکیم دننام ییاههاگشیامزآ هک یاهطیحم فلتخمرایسب هدافتسا دننکیم لاقتنا یگدلآ ریاس اهطیحم هشیمه نانع کی عضم نارگن هدننک حرطم.دشابیم.3-49 دام هدافتسا- 4 یاهنغر یندعم اب هج یاهطیحم- 2 USP تشک ندب هدافتسا نیئترپ ای بآ رطقم.2-49 اهشر یمامت لحارم یامد قاتا ماجنا دش.دش دهاخ هراشا ترصنیا ریغ -4 بآ ای طیحم تشک ( اب هجت هتکن هرامش 2 ) ار اب نغر تبسن 3 طلخم4.دینک تلاح هدیا لآ یرطب نغر هضرع هدش طست هدننکدیلت یاراد یاضف یفاک تمسق رس یرطب یارب هفاضا ندش مجح نغر ات %21 یماگنه هک تلاح قیقر دیآیم.دشابیم یارب یرطب 231 ml 31ml بآ هفاضا.دش -2 رب د یرطب ار مکحم هدرک یمارآ 21 ترم هنرا.دینک -3 هریخذ یس تدم 21 تعاس لبق هدافتسا اب لمعلارتسد هناخراک هدنس اب( هجت هتکن )3هرامش )فلا نغر یندعم ناتیم ار یارب ششپ اههرطق ای مجح یرتشیب طیحم هدافتسا.دمن هنماد دناتیم رادقم نیا 1/3 ات 4 هک دشاب رتیلیلیم فرظ organ تشک ای فرظ.دشیم هتخیر یکهاچ1تشک )ب تبسن نغر طیحم یگتسب عن فرظ.دراد یارب فرظ تشک organ ml 4 نغر ml 4 طیحم ار ششپ.دهدیم Four well فرظ ml نغر1/3 ml 1/3 طیحم ار ششپ.دهدیم لامعم فرظ 33 ای 21 یرتمیلیم یارب اههرطق هدافتسا.دشیم یارب ییاههرطق اب مجح رتیلرکیم 1/3 رتیل یلیم نغر فرظ رطق اب 33 یرتمیلیم دش هدافتسا ای 8 ml نغر 21 mm فرظ هدافتسا دشیم هتکن( 1.)دش هدهاشم )ج هرطق یراذگ ار ناتیم لبق ای دعب هفاضا ندرک نغر هجتاب عن فرظ.داد ماجنا اههرطق سپ هفاضا ندرک نغر اب هدافتسا رلپمسرس ای تپیپ یارب یاهللس تشک هدش هدامآ دشیم نکلاف( یرس.)3111 نیا لمع ار ناتیم اب کی تپیپرکیم ای تپیپ رتساپ ماجنا.داد نیا شر رتناسآ تسا هک اههرطق لبق هفاضا ندش نغر فرظ untreated plasticware داجیا.دنش اب هجت یکچک هدنا اههرطق هتیرلامسا اههرطق ار اب نتفرگرارق ضرعم یاه قاتا تدم ینلاط رییغت.تفای دهاخ هجیتن نیا هلحرم دیاب تعرس ماجنا دش لقادح یدادعت فرظ دیاب کی نامز هتخاس.دنش لحم فرظ رتابکنا زر لبق هدافتسا رظن هتفرگ دنش هتکن( 3.)دش هدهاشم ماجنا تست لرتنک تیفیک یرایتخا.دشابیم هتکن( 2 )دش هدهاشم.0-49 تاکن -4 هدافتسا کی فرظ رگید ریغ ییرطب هک نآ نغر هضرع دشیم یم دنات دیفم دشاب رگا یاضف یفاک تمسق ییلااب یارب هفاضا ندرک بآ ای طیحم ار هتشادن.دشاب نینچمه تبسن یلااب ف یبآ ینغر رظن یرئت دناتیم دنیارف تسش ش ار دب.دشخبب -2 تاعلاطم طبرم تسش ش )43( رثا یشخب یاشم نیب HTF بآ HTF + HSA ار ناشن.داد هچرگا دیاب تقد دش هک ماگنه pipeting گنیتپیپ کی یرطب نغر یاح ف یبآ نیساریپسآ )شکم( یقافتا عیام یریز نغر یریگلج.دش رگا انایحا بآ فرظ تشک هفاضا دش دناتیم اب کی هرطق کچک طیحم بیکرت هدش رجنم تفا لباق هجت هتیرلامسا ای تظلغ یحلاما دش هک یارب نایر یمس.دنشابیم

271 3- درحالی که برخی از گرشات مدافع این میباشند که بطری رغن باید در طل دره مصرف در داخل انکباتر به تعادل در آید اما عاقالنهتر این است که در دمای 1 درجه سانتیگراد در تاریکی نگهداری شد. ذخیرهسازی به مدت طالنی در درجه حرارت باال میتاند پراکسیداسین را تسهیل کند. 1- اگر اندازهی قطرهها کمتر از 21 µl باشد میتان حجمهای کمتری از رغن را استفاده ک میکرلتر قطره نیازمند 9 ساعت تعادل برای رسیدن به ph منظر است. 2- با تجه به گرایش طبیعی رغن برای سمی شدن بسته جدیدی از رغن معدنی باید با رش زیست سنجی مناسب م آزمن کنترل کیفی اقع شد حتی اگر این عمل تسط تلیدکننده انجام شده باشد. یک مقایسه مستقیم از رشهای کنترل کیفیت نشان داد که ریان مش یک سللی در آزمن MEA نسبت به ریان د سللی MEA یا آزمن به کار رفته در سنجش بقای اسپرم در برابر پراکسیدهای مجد در رغن بسیار حساستر میباشند )21(. عاله براین تصیه میشدکه در کلینیک ها قبل از استفاده از بسته جدید رغن معدنی یک مقایسه با رغن قبلی که عملک آن م تایید بده است انجام شده نتایج مقایسه شند.. Hammond J Jr ( ) Recovery and culture of tubal mouse ova. Nature :. Whitten WK ( ) The effect of progesterone on the development of mous eggs in vitro. J Endocrinol :. Gwatkin RB ( ) Effect of viruses on early mammalian development. I. Action of Mengo encephalitis virus on mouse ova cultivated in vitro. Proc Natl Acad Sci USA :. Brinster RL ( ) A method for in vitro cultivation of mouse ova from two-cell blastocyst. Exp Cell Res :. Biggers JD ( ) Pioneering mammalian embryo culture. In : Bavister BD (ed) The mammalian preimplantation embryo: regulation of growth and differentiation in vitro. Plenum Press, New York/London, pp. Bavister BD ( ) Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts. Hum Reprod Update :. Miller KF, Go ldberg JM, Collins RL ( ) Covering embryo cultures with mineral oil alters embryo growth by acting as a sink for an embryotoxic substance. J Assist Reprod Genet :. Miller KF, Pursel VG ( ) Absorption of compounds in medium by the oil covering microdrop cultures. Gamete Res :. Fleming TP, Pratt HP, Braude PR ( ) The use of mouse preimplantation embryos for quality control of culture reagents in human in vitro fertilization programs: a cautionary note. Fertil Steril :. Gardner DK, Reed L, Linck D, Sheehan C, Lane M ( ) Quality control in human in vitro fertilization. Semin Reprod Med :. Van Soom A, Mahmoudzadeh AR, Christophe A, Ysebaert MT, de Kruif A ( ) Silicone oil used in microdrop culture can affect bovine embryonic development and freezability. Reprod Dom Anim :. Shimada M, Kawano N, Terada T ( ) Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction :. Lee S, Cho M, Kim E, Kim T, Lee C, Han J et al ( ) Renovation of a drop embryo cultures system by using re fi ned mineral oil and the effect of glucose and/or hemoglobin added to a serum-free medium. J Vet Med Sci :. Erbach GT, Bhatnagar P, Balt z JM, Biggers JD ) ( Zinc is a possible toxic contaminant of silicone oil in microdrop cultures of preimplantation mouse embryos. Hum Reprod :. Morbeck DE, Khan Z, Barnidge DR, Walker DL ( ) Washing mineral oil reduces contaminants and embryotoxicity. Fertil Steril :. Otsuki J, Nagai Y, Chiba K ( ) Peroxidation of mineral oil used in droplet culture is detrimental to fertilization and embryo development. Fertil Steril :. Otsuki J, Nagai Y, Chiba K ( ) Damage of embryo development caused by peroxidized mineral oil and its association with albumin in culture. Fertil Steril :. Hall J, Gilligan A, Schimmel T, Cecchi M, Cohen J ( ) The origin, effects and control of air pollution in laboratories used for human embryo culture. Hum Reprod : 265 منابع

272 . Sifer C, Pont JC, Porcher R, Martin-Pont B, Benzacken B, Wolf JP ( ) A prospective randomized study to compare four different mineral oils used to culture human embryos in IVF/ICSI treatments. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol :. Hughes PM, Morbeck DE, Hudson S, Fredrickson J, Walker DL, Coddington CC ) ( Peroxides in mineral oil used for in vitro fertilization: defining limits of standard quality control assays. J Assist Reprod Genet : 266

273 فصل 48 سیستمهای کشت: عامل محیطی فیزیلژیی مثر بر مفقیت رشهای درمان نابارری انسان 288 عامل مجد در محیط کشت ریان تاثیر زیادی در رند تکین آن مین مفقیت رشهای درمان نابارری انسان دارند. نقش ریدادها شرایطی که تخمک اسپرم حتی مدتها قبل از جمعآری انتقال به آزمایشگاه با آن ربه ر بدهاند در رشد نم ریان رز به رز رشنتر میشد. از جمله این عامل میتان به رژیم غذایی اختالالت متابلیسمی سالمت عممی بیماری فشارهای جسمی رحی عامل محیطی از قبیل استرژنها سایر سمم دارها استعمال الکل سیگار ماد مخدر اشاره ک. در این قسمت راجع به اثرات بالقه شناخته شدهی فصل سال )تغییرات دما( آلدگی های محیط بر مین مفقیت رشهای درمان نابارری پاخته میشد. شاید بتان با در نظر گرفتن عارض جانبی ناشی از دمای باال آلدگی ها در برنامههای درمانی به نتایج بهتری رسید. همچنین تاثیر این عامل نتایج آن برای ریان شناسان به عنان امری مهم بده به تجزیه تحلیل دادههای حاصل مدیریت کیفیت رشهای درمانی کمک خاهد ک مقدمه 311 مضع تاثیر محیط کشت ریان بر فرآیند تکین آن در محیط کشت آزمایشگاهی رشد نم ریان همچنین مین مین بقا ادامه رشد ند تازه متلد شده امری اثبات شده است )4-9(. با این حال اضح است که قع ریدادهای نامطلب محیطی حتی قبل از لقاح میتاند فرآیند تکین ریان را تحت تاثیر قرار دهد. در یک آزمایش Lee )8( Zucker گنهای 314 مش صحرایی ماده )مش علفر( را از زمان تلد تا فصل تلیدمثل در معرض درههای مختلف نری قرار دادند. سیکل نری نری در گرههای مختلف به این ترتیب بد گره LD 41 ساعت نر 41 ساعت تاریکی گره SD- ابتدا 41 ساعت نر 41 ساعت تاریکی تا 2 هفته قبل از شرع تلیدمثل سپس 41 ساعت نر 41 ساعت تاریکی تا زمان تلیدمثل. تمام مشها بعد از فصل تلیدمثل در کل زمان بااری در شرایط 41 ساعت نر 41 ساعت تاریکی نگهداری میشدند ندان آنها نیز از زمان تلد به بعد در شرایط 41 ساعت نر 41 ساعت تاریکی قرار میگرفتند. تنها تفات بین گرههای تیمار از لحاظ طل مدت زمان چرخه نر تاریکی در د هفته قبل از لقاح بد. شکل 4-48 نتایج حاصل از تاثیر درههای مختلف نری در در ه زمانی قبل از لقاح را بر ندان نر نشان میدهد. مشهای 18 رزهی نر از لحاظ زن بدن زن بیضهها شاخص اسپرماتژنز تفات معنی- داری داشتند. شکل تاثیر درههای در معرض نر قرار گرفتن مادر پیش از النه گزینی ریان بر زن بدن شاخص اسپرم سازی زن بیضهها در نتاج نر Assisted reproductive technology In Vitro Meadow voles 267

274 312 شکل 2-48 مثال دیگر مربط به انسان )41( را نشان میدهد در این مطالعه که به شیهی هم گرهی انجام شد جمعیتی از زنان انتخاب شدند. گره A افرادی که بااری یمان آنها بالفاصله قبل از دران قحطی هلند در فاصلهی سال- های 4811 تا 4813 بد. گره D افرادی که سه ماهه دم سم آنها همزمان با قحطی بد افراد گره D فقط طی سه ماهه ال در قحطی بدند زنان گره E بالفاصله بعد از قحطی باار شدند. در شکل 2-48 زن تلد طل مدت بااری 313 شاخص طل سر-دم ندان گرههای مذکر نشان داده شده است که بیانگر اثرات زیانبار شرایط قحطی طی سه ماهه دم سم )گره D( بر شاخصهای تکین ند میباشد. شکل زن تلد طل مدت بااری شاخص طل سر-دم ندان مکانیسم دقیقی که منجر به ایجاد این عاقب در د مطالعه مذکر شد به طر کامل مشخص نبده بدن شک بسیار پیچیده است. با این حال انجام این مطالعات نشان داد عامل یا ریدادهایی که قبل حتی مدتها قبل از لقاح رخ میدهند ممکن است در رند تکین ریان تاثیر بسیی داشته باشند. قتی این نتایج را به پیامدهای حاصل از رشهای درمان نابارری یعنی مین لقاح تکین ریان در محیط آزمایشگاه النه گزینی ریان مین بااری مین تلد ادامهی رشد تعمیم میدهیم میتان گفت که تمامی شاخصهای فق ممکن است تحت تاثیر عامل ریدادهایی باشند که حتی مدتها قبل از جمعآری تخمک اسپرم قرار گرفتن آنها در محیط آزمایشگاه رخ دادهاند. در قدرت بارری همچنین تانایی تکین ریان فاکترهای بسیار زیادی مثر بدهاند. از جمله این عامل میتان به اختالالت متابلیکی رژیم غذایی سالمت عممی بیماری فشارهای جسمی رحی قرار گرفتن در معرض استرژنهای محیطی سایر سمم دارها الکل سیگار ماد مخدر )44( اشاره ک. این فصل به صرت اجمالی به بررسی شاهد مجد در زمینهی عامل مثر بر قدرت بارری انسان به یژه مین مفقیت رشهای درمان نابارری میپازد. این عامل عبارتند از 4. تغییرات فصل یا دمای ها 2. آلدگی ها فیزیلژی سللهای جنسی ارتباط آن با فرآیند تکین ریان برای قع تلید مثل جنسی قبل از هر چیزی بایستی اسپرم تخمک به سمت همدیگر آمده طی فرآیند لقاح پیش هستهها تلید شده تا سلل تخم تشکیل شد تسهیم را آغاز نماید. تکین الیه ریان در مراحل تسهیم تسط فاکترهای مجد در تخمک کنترل میشد که منشا آنها کامال مادری است. اما با فعال شدن ژنم ریان کنترل ادامه تکین 312 عملکهای فیزیلژی آن بر عهده سلل تخم است )که منشا مادری پدری دا(. هدف این قسمت معرفی سلل جنسی از لحاظ عملک فیزیلژی ارتباط آن با تکین ریان ادامه رشد نم مجد زنده است. رشد بلغ تخمک در داخل فلیکل ابسته به محیطی است که تسط سللهای کملسی اطراف فراهم میشد. ماد غذایی م نیاز تخمک از شبکهی Cohort Crown-rump length Embryo development in vitro Implantation Gamete 268

275 عرقی اطراف ا مایع فلیکلی شده تسط سللهای کملسی اطراف تخمک جذب میشد. تشکیل اتصاالت منفذدار بین سللهای کملس تخمک همچنین بین خد سللهای کملسی تبادل ملکلهای پیامرسان ماد مغذی را امکانپذیر میسازد. به این ترتیب نعی هماهنگی بین عملک این سللها رشد بلغ تخمک برقرار میشد )42(. اهمیت ارتباط بین کملس تخمک در مطالعات زیر نشان داده شده است. Van Blerkhom همکاران )43( غلظت فاکتر رشد 310 اندتلیال اکسیژن محلل در مایع فلیکلی مجمعه تخمکهای انسانی همچنین جریان خن مجد در فلیکلهای مربطه را اندازه گرفتند. مقدار اکسیژن مجد با مین قع ناهنجاریهای کرمزمی رابطه معکس با جریان خن اطراف فلیکل درصد تکین ریان رابطه مستقیم داشت. اندازهگیری بیان یک سری از ژنهای مجد در سللهای فلیکلی حاصل از مجمعه تخمکهای انسانی تسط Hamel همکاران )41( نیز نشان داد که مقدار mrna این ژنها در سللهای کملسی مربط به تخمکهایی که تلقیح آنها مفق بد به مین چشمگیری باالتر بد. این ژنها عبارت بدند از : 3 -بتا هیدرکسی استرئید دهیدرژناز 4 فکسین 4 مهار کننده سرین )سیستئین( پرتئیناز E2 341 سیتکرم P131 آرماتاز 342 پرتئین مربط به چرخه تقسیم سللی. Adriaenssens همکاران نیز در پژهشی مشابه )43( دریافت که تکین ریان در محیط آزمایشگاه ابسته به 343 Gremlin د م از ملکلهای مربط به سللهای کملس مسم به ملکل چسبنده سللی لکسیت mrnaی است. اندازه گیری مین mrna کانکسین پرتئینهای کانکسین سللهای کملس تخمک انسانی همچنین مین رسانایی اتصاالت منفذدار تسط Wang همکاران )42( نشان داد که mrnaی Cx13 پرتئین Cx13 در این سللها مین رسانایی اتصاالت منفذدار بین آنها با مین تکین ریان النه گزینی بااری تخمکهای مربطه در ارتباط مستقیم است. بنابراین به ضح میتان گفت که یکی از عامل مهم تعیین کننده مفقیت رشهای درمان نابارری تانایی سللهای فلیکلی اطراف در جهت حمایت از فرآیند بلغ سالمت تخمک است. مطالعات زیادی در سطح آزمایشی نشان دادهاند که تیمار افراد اهدا کنندهی تخمک / یا مجمعه سللهای کملس تخمک در شرایط آزمایشگاهی میتاند بر بلغ تخمک یا ریان حاصل رشد نم بعدی آن تاثیر چشمگیری داشته باشد )40(. هرچند که به دلیل کمبد رشهای غیر تهاجمی در بررسی عملک تخمک درباره ارتباط مستقیم عملک این سلل در افراد مختلف رند تکین ریان حاصل از آن اطالعات زیادی مجد نیست. البته بررسی دک تقسیم میزی زنا پلسیدای تخمک با استفاده از میکرسکپ پالرین تا حددی این مشکل را حل که است. بعضی مطالعات )نه همه آنها( مشاهدهی دک تقسیم به همراه طرز قرار گرفتن آن نسبت به الین جسم قطبی را نشانهی تانایی تخمک برای ادامهی تکین تشکیل ریان میدانند )49(. مطالعهی Shen همکاران نشان داد که ضخامت الیه داخلی زنا پلسیدا در تخمکهایی که قابلیت بارری داشتند به طر قابل تجهی باالتر بد. فعالیت متابلیک 343 تخمک نیز با قابلیت تکین آن رابطه مستقیم دا. Nagy همکاران )21( در یک پژهش تخمکهای انسانی برهنه را به مدت 3 ساعت قبل از تزریق اسپرم انکبه کند. اندازه گیری پرفایل متابلیک محیط کشت این تخمکها با رش 342 اسپکترسکپی نزدیک به مادن قرمز بیانگر ارتباط معنادار پرفایل متابلیک تخمک با مرفلژی ریانهای حاصل همچنین مین مفقیت یا شکست انتقال ریان از لحاظ حصل بارری بد. همزمان با بلغ تخمک فعالیت آنزیمی گلکز فسفات دهیدرژناز کاهش مییابد. آبی کریزل رنگی حیاتی است که برای سنجش مین بلغ تخمک حیانات اهلی Vascular endothelial growth factor (VEGF) -beta-hydroxysteroid dehydrogenase Ferredoxin Serine (or cysteine) proteinase inhibitor clade E member Cytochrome P aromatase Cell division cycle Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule Connexin (Cx) Denuded Near -infrared (NIR) spectroscopy G6PDH 948 Brilliant cresyl blue (BCB) 263

276 استفاده میشد. این ماده در حضر آنزیم گلکز 2 فسفات دهیدرژناز احیا بی رنگ میشد. بنابراین فقط تخمکهای بالغ BCB + هستند چن در حضر این ماده به رنگ آبی در میآیند )24(. مطالعات اخیر نشان دادهاند که تخمکهای BCB + حیاناتی مانند گا ) ( بفال )21( خک )23( قابلیت تکینی باالتری در مقایسه با تخمکهای BCB- یعنی نابالغ دارند. مقایسه مین رنیسی ژنم میتکندری در تخمک BCB- خک با تخمک بالغ تسط Spikings همکاران )22( بیانگر به تاخیر افتادن فرآیند رنیسی در گره BCB- به همراه کاهش مین لقاح قابلیت تکین ریان بد. بررسی سیتژنتیک اجسام قطبی مقیاسی در سنجش تانایی کلی تخمک برای ادامه تکین است. Munne همکاران 348 )20( تاثیر رش تشخیص ژنتیکی قبل از النه گزینی را بر درصد عدم مفقیت بااری در بیماران تحت لقاح آزمایشگاهی ارزیابی کند. این مین در بیمارانی که ریان آن ها به عنان ناهنجار ژنتیکی تشخیص داده شده منتقل نشده بدند به مقدار چشمگیری نسبت به بیماران هم سنی که ریان آنها PGD نشده بدند پایینتر بد. بنابر شاهدی که Kuliev همکاران )29( به دست آند حداقل 83 درصد آنیپلئیدیهای ریان منشا مادری دارند. بنابراین میتان اغلب نه همه مای را که بااری به دلیل تشکیل ریان آنیپلئید با مفقیت همراه نیست به تخمک نسبت داد. چرا که قتی در بیماران 33 تا 38 ساله جسم قطبی تخمکهای آنیپلئید از طریق بررسیهای سیتژنتیک حذف شد درصد النه گزینی به طرز چشمگیری افیش مین سقط کاهش یافت )28(. تا کنن ارزیابی عملک خاص اسپرم که این سلل را قادر به بارر کن تخمک میسازد امکانپذیر نبده است. البته سنجش برخی از شاخصهای طبیعی بدن جمعیت اسپرمی که منشا اسپرم بارر کننده بده است نشان دهنده ارتباط آن با تکین ریان حاصل میباشد. به نظر میآید که مرفلژی اسپرم در پیش بینی بارری ارزش زیادی نداشته باشد )31( با این جد مطالعات Salumets همکاران )34( اثبات ک که تنها مرفلژی اسپرم بر مین تسهیم ریان تاثیر میگذا نه غلظت اسپرم یا حرکت پیش رنده آن. مقایسه درصد تشکیل ریانهای سه رزه دارای مرفلژی طبیعی 321 تسط Dubey همکاران )32( در د گره بیماران طبیعی تراتاسپرمیک نتایج حاصل از تزریق درن سیتپالسمی 324 اسپرم بیانگر باالتر بدن درصد ریانهای طبیعی همچنین افیش قابل تجه مین النه گزینی بااری در بیماران دارای اسپرم طبیعی بد. یکی از شاخصهای تعیین کننده تاثیر مرفلژی اسپرم در تکین ریان نع رش درمانی است. مطالعه Check همکاران )33( نشان داد که تاثیر مرفلژی اسپرم بر مفقیت آن در بارر کن تخمک تنها در تکنیک لقاح 322 آزمایشگاهی نه رش تزریق درن سیتپالسمی دیده میشد. به طر کلی در تکنیک تزریق درن سیتپالسمی مین لقاح در رش لقاح آزمایشگاهی درصد النه گزینی به طر قابل تجهی باالتر بد که نشان میدهد بخشی از سهم اسپرم در تکین ریان تحت تاثیر رش تزریق قرار میگی. مهمترین قسمت اسپرم که ا تخمک میشد DNA آن است. در نتیجه یکی از معیارهای مهم در ارزیابی بارری مان سنجش مین آسیب ماده ژنتیک اسپرم میباشد )31(. برخی مطالعات نشان دادهاند که آسیب DNAی اسپرم بر کیفیت ریان مین النه گزینی بااری تاثیر منفی دا )33(. Zini همکاران اخیرا در یک مطالعه مرری حاصل 29 پژهش )32( نتیجه گرفتند که اگرچه در کل بین آسیب DNAی اسپرم کیفیت ریان رابطهی پایداری جد ندا اما احتماال این مضع در رش تزریق درن سیتپالسمی اسپرم اهمیت بیشتری از IVF دا. بنابراین با در نظر گرفتن نقش احتمالی آسیب DNA اسپرم در کیفیت ریان در ادامه به بحث پیرامن مطالعاتی میپازیم که این مضع را بررسی که اند. یک نمنه پژهش Virro همکاران )30( است. بر اساس نتایج این مطالعه هنگامی که مقدار شاخص قطعه 323 قطعه شدن DNA اسپرم 31 یا بیشتر از 31 درصد باشد اگرچه بر مین لقاح تاثیری نمی گذا لی باعث کاهش مین تشکیل بالستسیست بارای متعاقب آن خاهد شد. در مطالعهای مشابه Seli همکاران )39( مین قع شکستگی رشته DNA اسپرم را با استفاده از تست تانل اندازه گیری ک که منجر به کاهش قابل تجه مین بالستسیست میشد. همچنین preimplantation genetic diagnosis (PGD) Teratospermic Intra cytoplasmic sperm injection(icsi) In Vitro Fertilization)IVF( DNA fragmentation index (DFI) 271

277 321 سنجش مین قطعه قطعه شدن DNA اسپرم در مطالعه Nasr-Esfahani همکاران )38( نشان دهنده نقص پرتامین اسپرمهای دارای فرگمنتاسین بیشتر کاهش تانایی تسهیم ریانهای د سه رزه حاصل بد. پژهش Meseguer همکاران )11( نیز بیانگر تاثیر اکسیداسین DNA اسپرم بر فرگمنتاسین ریان د سه رزه تقف رشد ریان شش رزه بد. بر اساس یافتههای Avendano همکاران )14( فرگمانتاسین DNA در نمنه اسپرمی که منجر به بااری شده بد به مقدار زیادی باالتر از گرهی بد که بارری نداشتند. جالبتر اینکه مطالعات همین گره در مان نابارر افرادی که قدرت بارری کم داشتند حاکی از این حقیقت بد که درصد باالیی از اسپرمهای دارای شکل ظاهری طبیعی حای DNA آسیب دیده هستند )12(. Sousa همکاران )13( نیز در ارزیابی ضعیت کرماتین هسته آسیب DNA اسپرمهایی که قرار بد برای رش 323 ICSI IVF استفاده شند با استفاده از تست تانل دریافتند که مین تیرگی هسته اسپرم با کیفیت ریان مین بارری حاصل از آنها رابطه منفی دا. در نهایت Meseguer همکاران )11( در پژهشی به مقایسه مین بارری تخمکهای اهدایی تخمک بیماران پاختند. اگرچه در تخمکهایی که با رش تزریق درن سیتپالسمی تلقیح شدند افیش فرگمانتاسین DNA اسپرم منجر به کاهش مین بارری شد لی برای تخمکهای اهدایی چنین ارتباطی جد نداشت. بنابراین به ضح میتان گفت که کیفیت تخمک میتاند تشدید یا تضعیف کننده اثرات منفی ناشی از آسیب DNA اسپرم باشد. به گنهای که تلقیح تخمک های اهدایی با اسپرم دارای آسیب ماده ژنتیک به دلیل دارا بدن کیفیت بهتر نسبت به تخمک بیماران عاقب کمتری را از لحاظ بارری ایجاد میکند. برای دسترسی به اطالعات بیشتر درباره مکانیسم پیامدهای آسیب 322 DNA اسپرم به مرجع 13 مراجعه شد. همچنین اندازه گیری برخی شاخصهای بیلژی اسپرم مانند گنههای فعال اکسیژن مجد در مایع منی )12( بیان ژنها فعالیت گلتاتین پراکسیداز اسپرمی )10( اتصال هیالرنیک اسید )19( نشان دهنده ارتباط مستقیم این عامل با ریان تکین آینده آن است. در مطالعات Urner )18 Sakkas 31( به محض رد اسپرم به تخمک مش گا مین متابلیسم گلکز افیش یافت. مخصصا اینکه همزمان با شرع الین فاز s سلل تخم متابلیسم 320 گلکز از مسیر پنتز فسفات انجام میشد که بیانگر نقش مهم اسپرم در شرع تکین ریان میباشد. مضع مهمتر اینکه اگرچه مین لقاح رشد ریان تا مرحله 42 تا 32 سللی تحت تاثیر این مسیر متابلیکی قرار نمیگی لی تشکیل بالستسیست به شدت ابسته به فعالیت مسیر پنتزفسفات است. همانطر که در باال گفته شد معمال در ارزیابی مرفلژی 329 اسپرم گرهی از اسپرمها در نظر گرفته میشد. البته در حال حاضر میتان با استفاده از رش انتخاب اسپرم با بزرگنمایی باال 329 باال که الین بار تسط Bartoov همکاران تصیف شده است )34( یک اسپرم خاص را قبل از تزریق به داخل تخمک از لحاظ یژگیهای ظاهری بررسی ک. یژگیهای ظاهری اسپرم مانند شکل اندازهی سر حضر آکرزم فقدان قطعه میانی یا نقایص دم بر مین لقاح النه گزینی تلد زنده مثر لی بر مرفلژی ریان سه رزه تاثیری نداشت )32(. تلقیح تخمک با استفاده از اسپرمهای دارای هسته طبیعی )کنترل( اسپرمهایی که هسته طبیعی لی اکئلهای بزرگ داشتند )33( نشان داد اگرچه حضر اکئلهای بزرگ بر مین لقاح یا کیفیت ریان سه رزه تاثیری ندا لی درصد بااری را کاهش مین سقط را افیش میدهد. Antinori همکاران )31( برای تلقیح تخمک از د دسته اسپرم استفاده کند. گرهی که انتخاب آنها بر اساس شکل طبیعی سر دارا بدن حداکثر یک اکئل بد ( با رش ) IMSI گرهی که شاخصی برای انتخاب آنها در نظر گرفته نشده بد ( ایکسی(. از لحاظ مین لقاح تفاتی بین این د جد نداشت. لی مین بااری النه گزینی در گره IMSI خیلی باالتر از گره ایکسی بد. همچنین گرشی که Vanderzwalmen همکاران )33( ارایه دادند به چند دلیل حای اطالعات مفید است. اسپرمهایی که قرار بد به تخمک تزریق شند به 1 گره تقسیم شدند )بهترین به بدترین( درجه I اصال اکئل هستهای نداشتند درجه II حداکثر د اکئل کچک درجه III بیشتر از د اکئل کچک یا حداقل یک اکئل بزرگ درجه IV اکئلهای بزرگ اشکال غیر طبیعی سر یا اختالالت دیگر داشتند. شکل 3-48 نشان دهنده تاثیر تزریق اسپرم درجه Comet assay Tunnel assay Reactive Oxygen Species(ROS) 927 Pentose-phosphate pathway (PPP) MSOME, IMSI)high magnification sperm selection( 274

278 I/II یا درجه III/IV به داخل تخمکهایی با منشا یکسان بر تکین آینده ریان است. این مطالعه مانند مطالعات قبلی ) 32 33( نشان داد که نع اسپرم بر مین لقاح تکین ریان تا رز سم تاثیری ندا لی بر تشکیل بالستسیست همچنین کیفیت آن مثر است. علت این است که ژنم ریان انسان تا مرحله 1 تا 9 سللی بیان نمی شد )32( در اقع تکین ریان تا این مرحله تحت کنترل تخمک با منشا مادری است اما پس از اینکه ماده ژنتیک ریان شرع به بیان شدن میکند عامل مربط به اسپرم با منشا پدری نیز میتانند بر ادامه تکین اثر بگذارند. شاید بتان این مضع را به این طریق تجیه ک که حضر اکئلهای بزرگ هستهای )30( در اسپرم به دلیل فرگمنتاسین DNA آن بده ممکن است منجر به برز نقایص ریان در نتیجه نقص در بیان ژنهای دخیل در تشکیل بالستسیست ادامه تکین شد. یک اصل کلی در دامپزشکی این است که "س م 328 درکار نباشد اسبی نیز درکار نیست" مفقیت هر فرآیند زیستی به پایه ای زیربناییترین اصل آن ابسته است. مطالعاتی که در باال به آن استناد شد نشان میدهد که نقش سللهای جنسی فراتر از شرکت آنها در فرآیند لقاح است به این معنی که سالم بدن عملک طبیعی گامتها نقش مهمی در ادامه رند تکین ریان دا. با جد اهمیت این مضع شاید در بحث کلینیکی تحقیقاتی رشهای درمانی زیاد م تجه قرار نمیگی. سللهای جنسی ممکن است ظاهری طبیعی داشته باشند عمل لقاح تشکیل تخم هم انجام شد اما تشکیل سلل تخم نمیتاند تضمین کننده قطعی ادامه رشد تکین ریان حاصل تا زمان تلد حتی پس از آن باشد. شکل تاثیر ضعیت اسپرم از نظر ظاهری بعد از تزریق به داخل د تخمک خاهری اثر دما بر سللهای جنسی تکین ریان بارری در خیلی از پستانداران تلید مثل به صرت فصلی انجام میشد تا در زمان تلد ند از لحاظ شرایط محیطی تغذیه- ای بهترین ضعیت را داشته باشد )39(. در بعضی گنهها زمان تلیدمثل تسط عاملی مانند طل رز دما بارندگی تغذیه غیره تنظیم میشد )38(. اگرچه تلیدمثل فصلی در انسان دیده نمیشد اما یک سری الگهای فصلی مشخص پایدار در بارری جمعیتهای انسانی سرتاسر دنیا جد دا )21-22(. به نظر میآید که در ناحی استایی نیمه استایی تغییرات دمای محیط طی فصل مختلف تاثیر چشمگیری بر بارری انسان دا احتماال گرمای تابستان منجر به کاهش قدرت بارری می- شد. اما در مناطق با عرض جغرافیایی باالتر تاثیر فصل مختلف بر قدرت بارری ابسته به تغییرات طل رز است نه دما )21(. در یک آمیزش طبیعی منطقی به نظر میرسد که ارتباط بین تغییرات فصل قدرت بارری انسان به تعداد دفعات مقاربت سایر عامل اجتماعی بستگی داشته باشد لی در م لقاح آزمایشگاهی این عامل نقش مهمی ندارند. البته مطالعه تغییرات فصل بر نتایج لقاح آزمایشگاهی متناقض هستند. برخی مطالعات بیانگر تاثیر قابل تجه فصل سال بر مین لقاح تکین بااری النه گزینی میباشند )23-29(. درحالیکه بقیه نتایجی غیر از این دارند )28-02(. دلیل این تناقضات مشخص نیست اما ممکن است منعکس کننده تفاتهای فی در کیفیت اسپرم تخمک بیماران مختلف باشد. اکنن این سال باقی میماند که آیا اسپرم تخمک یا هر د تحت تاثیر فصل قرار میگیرند با چه مکانیسمی. در اقع پاسخ دادن به این سال در م انسان به دالیل no hoof, no horse 272

279 اخالقی عملی مشکل است اما میتان پاسخ آن را در بین گنههای دیگر به یژه دام جستج ک. بارری گا ماده نیز مانند انسان در فصل گرما چه در تلیدمثل طبیعی چه لقاح مصنعی به طر قابل تجهی کاهش پیدا میکند )03-02(. همچنین تاثیر فصل سال بر تکین آزمایشگاهی ریان گا )00 09( پارتنژنز اثبات شده است )08( اثر دما فصل سال بر تخمک مطالعات نشان میدهد که قرار گرفتن تخمک در گرما حتی مدتی کتاه در شرایط داخل بدن یا داخل آزمایشگاه میتاند تاثیر قابل تجهی بر قابلیت تکین ریان داشته باشد )91(. در یک مطالعه گاهای ماده پس از شرع فاز استرس به مدت 41 ساعت در دمای 21 درجه سانتی گراد )حرارت معملی( یا 12 درجه سانتی گراد )شک گرمایی( قرار گرفتند. بعد از تلقیح مصنعی ریانها در رز 0 جمع آری شدند. کیفیت تعداد سللهای ریان حاصل در اثر شک حرارتی به مین زیادی کاهش یافت. همچنین جمع آری تخمکها در فصل س یا گرم سال منجر به برز نتایج مشابهی در تکین ریان حاصل یا پارتنژنز شد ) (. نتایج مطالعه Gendelman همکاران )09( در شکل 1-48 نشان داده شده است. دقت کنید که هیچ تاثیری از گرمای محیط بر تسهیم الیه دیده نمی شد اما تشکیل بالستسیست بطر چشمگیری کاهش یافته است. شکل تاثیر فصل سال بر تکین ریان گا در شرایط برنتنی هنگامی که تخمک گا )92 93( مش )91( طی بلغ آزمایشگاهی تحت تاثیر گرما قرار گرفتند اثرات مخربی بر تکین دیده شد. البته با اینکه در این مطالعات گرما منجر به کاهش تکین ریان از مرحله تسهیم تا بالستسیت شد لی دمای 14 درجه نسبت به 39/3 درجه سانتیگراد )کنترل( باعث تسریع بلغ هستهای )تشکیل متافاز 2 ( بلغ سیتپالسمی تخمک شد که مشخصه آن تزیع گرانلهای قشری بد )93(. در این شرایط باال بن زمان لقاح باعث حذف تاثیر دمای 14 درجه سانتی- گراد بر تکین ریان شد. در یک مطالعه )91( بلغ آزمایشگاهی تخمک مش در دماهای مختلف از 30 تا 14 درجه سانتیگراد انجام شد. سپس تخمکهای بالغ با رش شیمیایی فعال شدند. حساسیت ریان حاصل نسبت به دما در مراحل متالی تکین افیش یافت. بهطری که مین بلغ تخمک در 11/0 درجه سانتیگراد مین تشکیل ریان 2 سللی در 11 درجه سانتی گراد تشکیل بالستسیست در 39/3 درجه سانتیگراد رند کاهشی داشت. انتقال دکهای تقسیم از تخمکهای گرما دیده به تخمکهایی که در داخل بدن بالغ شده بدند اثر گرما را بر تکین ریان حاصل حذف ک. به عاله در م تخمک مش هم مانند تخمک گای اثر گرما بر تزیع گرانلهای قشری دیده شد. سایر اثرات گرما بر تخمک عبارت بدند از : تغییر تجمع 331 کنفرماسین دکهای تقسیم )91-92( افیش قطعه قطعه شدن DNA فعالیت کاسپاز )92( کاهش نسبت گلتاتین )91( کاهش بیان )09( POU3F4 تغییر در ترکیب لیپیدی غشا دمای تغییر فاز غشای تخمک )08(. GSH/GSSG Oct 4 transcription factor Phase transition temperature 279

280 تاثیر دما تغییرات فصل سال بر اسپرم در جانرانی که بیضهها خارج از بدن قرار گرفتهاند افیش دما اثرات مخربی بر مرفلژی عملک سللها همچنین 333 عملک ترشحی فیزیلژی این اندام دا. حتی اگر دما فقط تا حد درجه حرارت مرکزی بدن باال رد این اثرات به خبی مشهد است. اگرچه تاثیر افیش درجه حرارت بر مراحل الیه بلغ اسپرم بیشتر دیده میشد لی در نهایت به دلیل اثر منفی 331 که گرما بر تعداد مرفلژی اسپرمهای مجد در مایع منی میگذا قدرت بارری کاهش یافته یا منجر به نابارری خاهد 333 شد. مطالعاتی که به بررسی تاثیر افیش درجه حرارت بیضه بر قابلیت زندهمانی تکین ریان جندگان خرگش حیانات 332 اهلی )90-81( پاختهاند حاکی از افیش مرگ ریان در مراحل الیه سقط مهیی برز ناهنجاریهای ریان هستند. در م انسان نیز کاهش شاخصهای طبیعی بدن اسپرم یعنی غلظت تحرک مرفلژی آن طی فصل گرم سال اثبات شده است )84 82(. هنگاهی که مشهای نر حتی به مدت کتاه در معرض گرما قرار میگیرند اثرات سریع طالنی مدتی بر مین لقاح بقای ریان حاصل دیده میشد. Burfening همکاران )83( در یک مطالعه مشهای نر را به مدت 21 ساعت در دمای 24 درجه )کنترل( یا 32 درجه سانتی گراد قرار دادند پس از 4 تا 31 رز آنها را برای جفت گیری با مشهای ماده رها کند. مین لقاح کاهش یافت در گرهی که 42 تا 21 رز پس از تیمار گرمایی جفت گیری که بدند به پایینترین حد خد رسید. افت درصد النه گزینی ریان رشد آن از کاهش لقاح بیشتر بد. همچنین قتی مشهای نر به مدت 21 ساعت در دمای 32 درجه سانتی گراد قرار گرفتند پس از 24 0 یا 33 رز جفت گیری کند )81( اگرچه مین لقاح تغییری نداشت لی قابلیت تکین به یژه تشکیل بالستسیست به طر چشمگیری کاهش یافت. گرما میتاند حتی در زمانی خیلی کتاه اثرات 330 بارزی بر تکین ریان )83(. داشته باشد. به عنان مثال در یک مطالعه اسکرتم )کیسه بیضه( مشها به مدت 31 دقیقه در حمام آب 12 درجه سانتی گراد قرار گرفت. پس از 42 ساعت یا 23 رز اسپرمها جمع آری برای لقاح آزمایشگاهی استفاده شدند. نتیجه این بد که حرارت اگرچه هیچ تاثیری بر ریان مرحله 2 یا 1 سللی نداشت اما تشکیل بالستسیست به طر چشمگیری کاهش یافت. بنابراین نکته حایز اهمیت که در د مطالعه اخیر مطرح شد این است که گرما تا مرحله تشکیل بالستسیست اثری بر رشد ریان ندا. عاله بر مطالعاتی که تاثیر افیش درجه حرارت اسپرم مجد در بیضه محیط داخلی بدن را بررسی میکنند گرما میتاند در محیط آزمایشگاه نیز بر اسپرم تکین ریان حاصل تاثیرگذار باشد. در یک مطالعه 339 مایع منی خرگش قبل از اینکه برای تلقیح درن رحمی استفاده شد به مدت 3 ساعت در 39 یا 11 درجه سانتی گراد انکبه 338 شد ) بر اساس درجه حرارت ناحیه مقعدی حیان به ترتیب در 24 یا 32 درجه نگهداری شد( )82(. افیش دما تاثیری بر مین لقاح نداشت لی درم اسپرمهایی که در 11 درجه سانتیگراد انکبه شده بدند مین بقای ریان به طر قابل تجهی پایینتر از گره دیگر بد. چنین نتایجی درباره اسپرم مش هم اثبات شده است )80(. ابتدا تعدادی از اسپرمهای مشی در 30/3 درجه سانتی گراد قرار گرفتند یا به مدت 31 دقیقه تا 32 درجه سانتی گراد گرم شدند. سپس ریانهای حاصل از رش تزریق درن سیتپالسمی این اسپرمها به منظر ارزیابی قابلیت تکین در محیط آزمایشگاه به مدت 421 ساعت کشت داده شد تعدادی ریان 2 سللی هم به داخل رحم منتقل شدند. باز هم گرما تاثیری بر مین لقاح مراحل الیه تسهیم نداشت اما تشکیل بالستسیست به طر چشمگیری در ریانهای حاصل از لقاح اسپرمهایی که 32 درجه حرارت دیده بدند کمتر بد. اگرچه درصد النه گزینی هم در این گره کمتر بد اما به نظر میآید که در اینجا علت اصلی کاهش درصد تکین ریان قبل از مرحله النه گزینی در رحم باشد. از مطالعات انجام شده در این زمینه میتان اینگنه استباط ک که احتماال افیش دما بر ساختار DNA کرماتین اسپرم اثر میگذا ) (. عاله بر این استرس گرمایی میتاند از طریق کاهش تمایل Endocrine Semen Laboratory rodents Domestic Scrotum Intrauterine insemination(iui) Rectal temperature 271

281 اسپرم گای برای اتصال هپارین که شاخص انسجام غشای این سلل است منجر به ایجاد اشکال غیر طبیعی اسپرم شد )414(. 311 افیش دما در م همستر )412( نیز با تاثیر بر غشای اسپرم سبب کاهش زمان الزم برای ظرفیت پذیری این سلل در اسپرم گراز )413( منجر به آگلتیناسین اسپرم کاهش اسپرمهای دارای اکرزم سالم شده است. به طر کلی تمام این مطالعات نشان میدهند که تغییرات دما / یا فصل سال عملک زیستی اسپرم تخمک را به شدت تحت تاثیر قرار میدهند. بنابراین به ضح میتان گفت که قرار گرفتن سللهای جنسی در درجه حرارت باال بر تکین ریان اثرات زیانباری دا تاثیر آلدگی ها بر سللهای جنسی تکین ریان بارری یکی از دغدغههای اصلی سالمت انسان به یژه در ارتباط با بیماریهای قلبی ریی آالیندههای مجد در ها هستند ) (. عاله بر آلدگی ها که تاثیر منفی آن بر قدرت بارری طبیعی انسان اثبات شده است ) ( مضع قابل تجه تجمع غلظت آالیندههای ناشی از مصالح ساختمانی مبلمان مادی از این قبیل میباشد )442(. از این ر یکی از ما مهم در آزمایشگاههای درمان نابارری طراحی استفاده از فیلترهای ها سیستمهای تصفیه بده است )443(. اهمیت این مساله در پارهای از مطالعات اثبات شده است. استفاده از فیلترهای مخصص به منظر حذف ذرات ترکیبات عالی فرار از فضای آزمایشگاه انکباترها سایر تجهیت آن منجر به بد قابل تجه نتایج رشهای درمانی میشد ) (. این مطالعات بیانگر تاثیر آالیندههای مجد در آزمایشگاه بر رند تکین ریان هستند. شاهد بیشتر نشان میدهند که آالیندههای ها حتی قبل از تشکیل ریان یعنی قبل از رد سللهای جنسی به آزمایشگاه تاثیر عمدهای بر قابیلت تکین دارند. از جمله این پژهشها مطالعه Perin همکاران بد که تاثیر مین آالیندههای ها در سائپائل برزیل را در دره قبل از حاملگی بر مین بارری با رش طبیعی یا رشهای درمانی بررسی ک. همچنین Legro همکاران ارتباط بین غلظت, SO 2,NO 2 O 3 مجد در های منطقه ی مسکنی بیماران یا کلینیک بارری در شمال شرقی ایاالت متحده آمریکا بارری حاصل از لقاح آزمایشگاهی را به طر مشابه ارزیابی ک. نتایج این مطالعه نشان داد که با افیش NO 2 در این ناحی شانس بارری تلد زنده کاهش می یابد هرچه مین ریزگها در منطقه کلینیک درمانی بیشتر باشد درصد بارری کمتر خاهد بد. مطالعه دقیقتر در سائپائل )424( نشان داد که درصد بلغ تخمک لقاح تسهیم یا تشخیص بااری در مراحل الیه با مین آالیندههای ها قبل از باار شدن ارتباطی ندا لی بر حصل بارری تاثیر مستقیم میگذا. این نتایج نشان میدهد که تاثیر آلدگی های محیطی بر سللهای جنسی ممکن است همیشه مشهد نباشد. از نتایج این مطالعات مشخص نیست که آلدگی ها بر اسپرم تخمک یا هر دی اینها تاثیر میگذا. البته مطالعهای دیگر که در سائپائل انجام شد بیانگر تاثیرات منفی آلدگی ها بر تخمک بد مشهای ماده قبل از بااری طی بااری یا در ه زمان در معرض های فیلتر شده یا فیلتر نشده محیط قرار گرفتند )422(. مشهایی که قبل از حاملگی در های آلده )فیلتر نشده( بدند تغییراتی در جفت داشتند زن ریان آنها کاهش یافت. در یک مطالعه دیگر گرهی از مشها قبل بعد از تلد گرهی فقط بعد از تلد در های فیلتر شده یا فیلتر نشده سائپائل قرار گرفتند )423(. در سن 2 هفتگی انتهای تیمار تحریک تخمک گذاری مشهای ماده انجام شد سپس تخمکها جمع آری شدند بعد از تلقیح در آزمایشگاه کشت ریانها به مدت 421 ساعت انجام شد. هیچ یک از گرهها از 313 لحاظ مدت زمان بااری تعداد نتاج در هر شکم یش زن تلد یا مین تحریک پذیری تخمدان تاثیر نپذیرفتند. همچنین مین لقاح تشکیل بالستسیست بعد از 82 ساعت کشت یا تعداد کلی سللهای بالستسیست در 421 ساعت کشت تغییری 311 نشان نداد. تنها تغییر مربط بد به تعداد سللهای تده سللی داخلی نسبت آنها به ترفکتدرم که به مین زیادی کم شده بد. در نتیجه این نتایج به ضح نشان میدهند که آلدگی های محیط میتاند حتی قبل از تلد از طریق تاثیرات منفی که بر تخمک میگذا ریان حاصل را تحت تاثیر قرار دهد. در زمینه تاثیر آلدگی های محیط بر مرفلژی ) ( Capacitation Boar Agglutination Litter size Inner cell mass(icm) 275

282 آسیب DNA اسپرم انسان نیز مطالعاتی انجام شده است ) (. همانطر که قبال ذکر شد شاهد مجد بیانگر تاثیر منفی آسیب DNA اسپرم بر تکین ریان بارری میباشند. بنابراین نمیتان تاثیر منفی های آلده محیط بر اسپرم در نتیجه نتایج رشهای درمان نابارری را نادیده گرفت. با این جد در زمینه ارتباط مستقیم آلدگی ها بر خد اسپرم دادههای زیادی مجد نیست. برخی شاهد نشان دهنده اثر منفی سیگار کشیدن پدر بر مین مفقیت رشهای درمانی بده است )431(. مطالعاتی نیز جد دارند که نشان دهنده تغییر نسبت جنسی دهها تحت تاثیر آالیندهها هستند Lichtenfels همکاران مشهای ماده را 1 ماه قبل از جفتگیری در های آلده یا فیلتر شدهی سائپائل قرار دادند. اگرچه آلدگی ها هیچ اثری بر تعداد نتاج در هر شکم یش نداشت لی نسبت دههای نر به ماده به طر چشمگیری کاهش یافت. نسبت جنسی ندان انسانی نیز با غلظت آالیندههای مجد در های سائپائل در ارتباط بد. بنابراین شاید بتان گفت که آلدگی ها ممکن است از طریق تاثیر بر اسپرم بر قابلیت تکین ریان مثر باشد اما مکانیسم آن هنز معلم نیست مفاهیم شاهد اپیدمیلژیک کلینیکی تحقیقاتی آزمایشی همه نشان میدهند که قتی الدین زیستی ( سللهای جنسی اسپرم تخمک( در معرض گرما / یا آلدگی ها باشند اثرات منفی بر مین مفقیت رشهای درمان نابارری خاهد داشت. بنابراین یکی از راهکارهای مثر در رشهای درمانی میتاند تصیه به بیماران در دری کن از این عامل باشد. متاسفانه این امر همیشه امکانپذیر نیست چرا که این افراد ممکن است مدتها قبل ازینکه برای درمان مراجعه کنند در معرض این عامل آسیب رسان قرار گرفته باشند. با این جد اگاه بدن ریان شناسان پزشکان از اثرات احتمالی دما آلدگی ها بر فرآیند درمان میتاند نقش مثری در مدیریت کیفیت آزمایشگاه داشته باشد. برای مثال تغییرات فرضی در مین مفقیت رشهای درمانی یک آزمایشگاه را در نظر بگیرید. همانطر که مالحظه میشد اگرچه متسط مین لقاح تسهیم تشکیل بالستسیست در بلند مدت رضایت بخش به نظر میرسد با جد اینکه در هفته آخر هم درصد لقاح تسهیم ریان مناسب است لی مین تشکیل بالستسیست بسیار بد بد. در یک تجیه سطحی شاید بتان این نتایج را به جد اشکال در سیستم کشت ریان نسبت داد حال آنکه چنین نتیجه گیری کامال غیرمعمل است. به گفته H.L. Menken )رزنامه نگار طنز پاز امریکایی( "همیشه برای هر مشکلی یک راه حل ساده اما اشتباه جد دا". همانطر که گفتیم شکل 3 نشان میداد که تفات در کیفیت مرفلژیک اسپرمهای فی م استفاده در تزریق بر تکین آزمایشگاهی ریان تاثیر میگذا. در نتیجه کامال منطقی است که فرض کنیم علت کاهش قابلیت تکین ریان تفات خصصیات فی اسپرم یا فرآیند پازش آن به عنان یکی از مشکالت سیستم کشت باشد. شاید هم علت باال رفتن دمای محیط قبل از لقاح باشد همانطر که در شکل نشان داده شد. در نتیجه تکنیک درمان نابارری انسان فرآیندی بسیار پیچیده است مین مفقیت آن میتاند تحت تاثیر ریدادهای متعددی از جمله ضعیت مجد در آزمایشگاه همچنین شرایط قبل از جمع آری سللهای جنسی باشد. بنابراین یکی از مضعات ضرری مهم در ارزیابی مین مفقیت رشهای درمان نابارری در هر کلینیکی در نظر گرفتن تمامی فاکترهای احتمالی مثر مانند دمای محیط آلدگی ها قبل از انجام پدیده لقاح است. منابع 4. Seamark RF, Robinson JS (4883) Potential health hazards of assisted human reproduction. Potential health problems stemming from assisted reproduction programmes. Hum Reprod 41: Rieger D (4889) Effects of the in vitro chemical environment during early embryogenesis on subsequent development. Arch Toxicol Suppl 21: Pool TB (2113) An update on embryo culture for human assisted reproductive technology: media, performance, and safety. Semin Reprod Med 23: Gardner DK, Lane M (2110) Embryo culture systems. In : Gardner DK (ed) In vitro fertilization: a practical approach. Informa Healthcare, New York, London, pp

283 3. Leese HJ, Sturmey RG, Baumann CG, McEvoy TG (2110) Embryo viability and metabolism: obeying the quiet rules. Hum Reprod 22: Thompson JG, Mitchell M, Kind KL (2110) Embryo culture and long-term consequences. Reprod Fertil Dev 48: Duranthon V, Watson AJ, Lonergan P (2119) Preimplantation embryo programming: transcription, epigenetics, and culture environment. Reproduction 433: Vajta G, Rienzi L, Cobo A, Yovich J (2141) Embryo culture: can we perform better than nature? Reprod Biomed Online 21: Lee TM, Zucker I (4899) Vole infant development is influenced perinatally by maternal photoperiodic history. Am J Physiol 233:R934 R Lumey LH (4882) Decreased birthweights in infants after maternal in utero exposure to the Dutch famine of Paediatr Perinat Epidemiol 2: Sharpe RM, Franks S (2112) Environment, lifestyle and infertility an inter-generational issue. Nat Cell Biol 1(Suppl):s33 s Swain JE, Pool TB (2119) ART failure: oocyte contributions to unsuccessful fertilization. Hum Reprod Update 41: Van Blerkom J, Antczak M, Schrader R (4880) The developmental potential of the human oocyte is related to the dissolved oxygen content of follicular fl uid : association with vascular endothelial growth factor levels and perifollicular blood fl ow characteristics. Hum Reprod 42: Hamel M, Dufort I, Robert C, Gravel C, Leveille MC, Leader A, Sirard MA (2119) Identi fi cation of differentially expressed markers in human follicular cells associated with competent oocytes. Hum Reprod 23: Adriaenssens T, Wathlet S, Segers I, Verheyen G, De Vos A, Van der Elst J, Coucke W, Devroey P, Smitz J (2141) Cumulus cell gene expression is associated with oocyte developmental quality and influenced by patient and treatment characteristics. Hum Reprod 23: Wang HX, Tong D, El-Gehani F, Tekpetey FR, Kidder GM (2118) Connexin expression and gap junctional coupling in human cu mulus cells: contribution to embryo quality. J Cell Mol Med 43: Smitz JE, Thompson JG, Gilchrist RB (2144) The promise of in vitro maturation in assisted reproduction and fertility preservation. Semin Reprod Med 28: Heindryckx B, De Gheselle S, Lierman S, Gerris J, De Sutter P (2144) Ef fi ciency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Hum Reprod 22: Shen Y, Stalf T, Mehnert C, Eichenlaub-Ritter U, Tinneberg HR (2113) High magnitude of light retardation by the zona pellucida is associated with conception cycles. Hum Reprod 21: Nagy ZP, Jones-Colon S, Roos P, Botros L, Greco E, Dasig J, Behr B (2118) Metabolomic assessment of oocyte viability. Reprod Biomed Online 49: Goovaerts IG, Leroy JL, Jorssen EP, Bols PE (2141) Noninvasive bovine oocyte quality assessment: possibilities of a single oocyte culture. Theriogenology 01: Sugulle A, Dochi O, Koyama H (2119) Developmental competence of bovine oocytes selected by brilliant cresyl blue staining: effect of the presence of corpus luteum on embryo development. J Mamm Ova Res 23: Bhojwani S, Alm H, Torner H, Kanitz W, Poehland R (2110) Selection of developmentally competent oocytes through brilliant cresyl blue stain enhances blastocyst development rate after bovine nuclear transfer. Theriogenology 20: Manjunatha BM, Gupta PS, Devaraj M, Ravindra JP, Nandi S (2110) Selection of developmentally competent buffalo oocytes by brilliant cresyl blue staining before IVM. Theriogenology 29: Wongsrikeao P, Otoi T, Yamasaki H, Agung B, Taniguchi M, Naoi H, Shimizu R, Nagai T (2112) Effects of single and double exposure to brilliant cresyl blue on the selection of porcine oocytes for in vitro production of embryos. Theriogenology 22: Spikings EC, Alderson J, St John JC (2110) Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biol Reprod 02:

284 20. Munne S, Fischer J, Warner A, Chen S, Zouves C, Cohen J (2112) Preimplantation genetic diagnosis signi fi cantly reduces pregnancy loss in infertile couples: a multicenter study. Fertil Steril 93: Kuliev A, Zlatopolsky Z, Kirillova I, Spivakova J, Cieslak Janzen J (2144) Meiosis errors in over oocytes studied in the practice of preimplantation aneuploidy testing. Reprod Biomed Online 22: Montag M, van der Ven K, Rosing B, van der Ven H (2118) Polar body biopsy: a viable alternative to preimplantation genetic diagnosis and screening. Reprod Biomed Online 49(Suppl 4): Lewis SE (2110) Is sperm evaluation useful in predicting human fertility? Reproduction 431: Salumets A, Suikkari AM, Mols T, Soderstrom- Anttila V, Tuuri T (2112) Influence of oocytes and spermatozoa on early embryonic development. Fertil Steril 09: Dubey A, Dayal MB, Frankfurter D, Balazy P, Peak D, Gindoff PR (2119) The influence of sperm morphology on preimplantation genetic diagnosis cycles outcome. Fertil Steril 98: Check JH, Bollendorf A, Wilson C, Summers- Chase D, Horwath D, Yuan W (2110) A retrospective comparison of pregnancy outcome following conventional oocyte insemination vs intracytoplasmic sperm injection for isolated abnormalities in sperm morphology using strict criteria. J Androl 29: Barratt CL, Aitken RJ, Bjorndahl L, Carrell DT, de Boer P, Kvist U, Lewis SE, Perreault SD, Perry MJ, Ramos L, Robaire B, Ward S, Zini A (2141) Sperm DNA: organization, protection and vulnerability: from basic science to clinical applications a position report. Hum Reprod 23: Lewis SE, Simon L (2141) Clinical implications of sperm DNA damage. Hum Fertil (Camb) 43: Zini A, Jamal W, Cowan L, Al-Hathal N (2144) Is sperm DNA damage associated with IVF embryo quality? A systematic review. J Assist Reprod Genet 29(3): Virro MR, Larson-Cook KL, Evenson DP (2111) Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril 94: Seli E, Gardner DK, Schoolcraft WB, Moffatt O, Sakkas D (2111) Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization. Fertil Steril 92: Nasr-Esfahani MH, Salehi M, Razavi S, Anjomshoa M, Rozbahani S, Moulavi F, Mardani M (2113) Effect of sperm DNA damage and sperm protamine de fi ciency on fertilization and emb ryo development post- ICSI. Reprod Biomed Online 44: Meseguer M, Martinez-Conejero JA, O Connor JE, Pellicer A, Remohi J, Garrido N (2119) The signi fi cance of sperm DNA oxidation in embryo development and reproductive outcome in an oocyte dona tion program: a new model to study a male infertility prognostic factor. Fertil Steril 98: Avendano C, Franchi A, Duran H, Oehninger S (2118) DNA fragmentation of normal spermatozoa negatively impacts embryo quality and intracytoplasmic sperm injection outcome. Fertil Steril 81: Avendano C, Franchi A, Taylor S, Morshedi M, Bocca S, Oehninger S (2118) Fragmentation of DNA in morphologically normal human spermatozoa. Fertil Steril 84: Sousa AP, Tavares RS, Velez de la Calle JF, Figueiredo H, Almeida V, Almeida-Santos T, Ramalho- Santos J (2118) Dual use of Diff- Quik-like stains for the simultaneous evaluation of human sperm morphology and chromatin status. Hum Reprod 21: Meseguer M, Santiso R, Garrido N, Garcia- Herrero S, Remohi J, Fernandez JL (2144) Effect of sperm DNA fragmentation on pregnancy outcome depends on oocyte quality. Fertil Steril 83: Aitken RJ (2111) Founders Lecture. Human spermatozoa: fruits of creation, seeds of doubt. Reprod Fertil Dev 42: Zorn B, Vidmar G, Meden-Vrtovec H (2113) Seminal reactive oxygen species as predictors of fertilization, embryo quality and pregnancy rates after conventional in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Int J Androl 22: Meseguer M, de los Santos MJ, Simon C, Pellicer A, Remohi J, Garrido N (2112) Effect of sperm glutathione peroxidases 4 and 1 on embryo asymmetry and blastocyst quality in oocyte donation cycles. Fertil Steril 92:

285 19. Parmegiani L, Cognigni GE, Bernardi S, Troilo E, Ciampaglia W, Filicori M (2141) Physiologic ICSI : hyaluronic acid (HA ) favors selection of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus, resulting in improvement of embryo quality. Fertil Steril 83: Urner F, Sakkas D (4888) Characterization of glycolysis and pentose phosphate pathway activity during sperm entry into the mouse oocyte. Biol Reprod 21: Comizzoli P, Urner F, Sakkas D, Renard JP (2113) Up-regulation of glucose metabolism during male pronucleus formation determines the early onset of the s phase in bovine zygotes. Biol Reprod 29: Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F (2114) Selection of spermatozoa with normal nuclei to improve the pregnancy rate with intracytoplasmic sperm injection. N Engl J Med 313: De Vos A, Van De Velde H, Joris H, Verheyen G, Devroey P, Van Steirteghem A (2113) Influence of individual sperm morphology on fertilization, embryo morphology, and pregnancy outcome of intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 08: Berkovitz A, Eltes F, Ellenbogen A, Peer S, Feldberg D, Bartoov B (2112) Does the presence of nuclear vacuoles in human sperm selected for ICSI affect pregnancy outcome? Hum Reprod 24: Antinori M, Licata E, Dani G, Cerusico F, Versaci C, d Angelo D, Antinori S (2119) Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection: a prospective randomized trial. Reprod Biomed Online 42: Vanderzwalmen P, Hiemer A, Rubner P, Bach M, Neyer A, Stecher A, Uher P, Zintz M, Lejeune B, Vanderzwalmen S, Cassuto G, Zech NH (2119) Blastocyst development after sperm selection at high magni fi cation is associated with size and number of nuclear vacuoles. Reprod Biomed Online 40: Telford NA, Watson AJ, Schultz GA (4881) Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: a comparison of several species. Mol Reprod Dev 22: Oliveira JB, Massaro FC, Baruf fi RL, Mauri AL, Petersen CG, Silva LF, Vagnini LD, Franco JG Jr (2141) Correlation between semen analysis by motile sperm organelle morphology examination and sperm DNA damage. Fertil Steril 81: Betteridge KJ, Rieger D (4883) Embryo transfer and related techniques in domestic animals, and their implications for human medicine. Hum Reprod 9: Bronson FH (2118) Climate change and seasonal reproduction in mammals. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 321: Lam DA, Miron JA (4881) Global patterns of seasonal variation in human fertility. Ann N Y Acad Sci 018: Rojansky N, Brzezinski A, Schenker JG (4882) Seasonality in human reproduction: an update. Hum Reprod 0: Smits LJ, Zielhuis GA, Jongbloet PH, Straatman H (4889) Seasonal variation in human fecundability. Hum Reprod 43: Stolwijk AM, Reuvers MJ, Hamilton CJ, Jongbloet PH, Hollanders JM, Zielhuis GA (4881) Seasonality in the results of in-vitro fertilization. Hum Reprod 8: Rojansky N, Benshushan A, Meirsdorf S, Lewin A, Laufer N, Safran A (2111) Seasonal variability in fertilization and embryo quality rates in women undergoing IVF. Fertil Steril 01: Weigert M, Feichtinger W, Kulin S, Kaali SG, Dorau P, Bauer P (2114) Seasonal influences on in vitro fertilization and embryo transfer. J Assist Reprod Genet 49: Vahidi A, Kalantar SM, Soleiman M, Hossein M, Arjmand A, A fl atoonian A, Karimzadeh MA, Kermaninejhad A (2111) The relationship between seasonal variability and pregnancy rates in women undergoing assisted reproductive technique. IJRM 2: Chang SY, Lan KC, Chen CW, Huang FJ, Tsai MY, Chang CY (2113) The influences of weather on patients with different ovarian responses in the treatment of assisted reproductive technology. J Assist Reprod Genet 22: Wood S, Quinn A, Troupe S, Kingsland C, Lewis-Jones I (2112) Seasonal variation in assisted conception cycles and the influence of photoperiodism on outcome in in vitro fertilization cycles. Hum Fertil (Camb) 8:

286 28. Fleming C, Nice L, Hughes AO, Hull MG (4881) Apparent lack of seasonal variation in implantation rates after in-vitro fertilization. Hum Reprod 8: Saltz-Greco SM, Schinfeld J, Somkuti S, Smith S, Barmat L (2111) Seasonality of spontaneous and IVF pregnancy rates, and temperature/humidity effect on IVF. Fertil Steril 92(Suppl 2):S483 (Abstract P-401) 04. Revelli A, La Sala GB, Gennarelli G, Scatigna L, Racca C, Massobrio M (2113) Seasonality and human in vitro fertilization outcome. Gynecol Endocrinol 24: Wunder DM, Limoni C, Birkhauser MH (2113) Lack of seasonal variations in fertilization, pregnancy and implantation rates in women undergoing IVF. Hum Reprod 21: Fuquay JW (4894) Heat stress as it affects animal production. J Anim Sci 32: Hansen PJ, Arechiga CF (4888) Strategies for managing reproduction in the heat-stressed dairy cow. J Anim Sci 00(Suppl 2): Jordan ER (2113) Effects of heat stress on reproduction. J Dairy Sci 92(E. Suppl): E411 E Hansen PJ (2118) Effects of heat stress on mammalian reproduction. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 321: Al-Katanani YM, Paula-Lopes FF, Hansen PJ (2112) Effect of season and exposure to heat stress on oocyte competence in Holstein cows. J Dairy Sci 93: Gendelman M, Aroyo A, Yavin S, Roth Z (2141) Seasonal effects on gene expression, cleavage timing, and developmental competence of bovine preimplantation embryos. Reproduction 411: Zeron Y, Ocheretny A, Kedar O, Borochov A, Sklan D, Arav A (2114) Seasonal changes in bovine fertility: relation to developmental competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition of follicles. Reproduction 424: Putney DJ, Mullins S, Thatcher WW, Drost M, Gross TS (4898) Embryonic development in superovulated dairy cattle exposed to elevated ambient temperatures between the onset of estrus and insemination. Anim Reprod Sci 48: Rocha A, Randel RD, Broussard JR, Lim JM, Blair RM, Roussel JD, Godke RA, Hansel W (4889) High environmental temperature and humidity decrease oocyte quality in Bos Taurus but not in Bos indicus cows. Theriogenology 18: Roth Z, Hansen PJ (2111) Involvement of apoptosis in disruption of developmental competence of bovine oocytes by heat shock during maturation. Biol Reprod 04: Edwards JL, Saxton AM, Lawrence JL, Payton RR, Dunlap JR (2113) Exposure to a physiologically relevant elevated temperature hastens in vitro maturation in bovine oocytes. J Dairy Sci 99: Wang JZ, Sui HS, Miao DQ, Liu N, Zhou P, Ge L, Tan JH (2118) Effects of heat stress during in vitro maturation on cytoplasmic versus nuclear components of mouse oocytes. Reproduction 430: Ju JC, Jiang S, Tseng JK, Parks JE, Yang X (2113) Heat shock reduces developmental competence and alters spindle con fi guration of bovine oocytes. Theriogenology 21: Ju JC, Tseng JK (2111) Nuclear and cytoskeletal alterations of in vitro matured porcine oocytes under hyperthermia. Mol Reprod Dev 29: Ulberg LC, Burfening PJ (4820) Embryo death resulting from adverse environment on spermatozoa or ova. J Anim Sci 22: Setchell BP (4889) The Parkes Lecture. Heat and the testis. J Reprod Fertil 441: Thonneau P, Bujan L, Multigner L, Mieusset R (4889) Occupational heat exposure and male fertility: a review. Hum Reprod 43: Paul C, Melton DW, Saunders PT (2119) Do heat stress and de fi cits in DNA repair pathways have a negative impact on male fertility? Mol Hum Reprod 41: Ossenbuhn S (4889) Exogenous influences on human fertility: fl uctuations in sperm parameters and results of in-vitro fertilization coincide with conceptions in the normal population. Hum Reprod 43: Chen Z, Toth T, Godfrey-Bailey L, Mercedat N, Schiff I, Hauser R (2113) Seasonal variation and agerelated changes in human semen parameters. J Androl 21:

287 83. Burfening PJ, Elliott DS, Eisen EJ, Ulberg LC (4801) Survival of embryos resulting from spermatozoa produced by mice exposed to elevated ambient temperature. J Anim Sci 31: Zhu BK, Setchell BP (2111) Effects of paternal heat stress on the in vivo development of preimplantation embryos in the mouse. Reprod Nutr Dev 11: Paul C, Murray AA, Spears N, Saunders PT (2119) A single, mild, transient scrotal heat stress causes DNA damage, subfertility and impairs formation of blastocysts in mice. Reproduction 432: Burfening PJ, Ulberg LC (4829) Embryonic survival subsequent to culture of rabbit spermatozoa at 393 and 113C. J Reprod Fertil 43: Cozzi J, Monier-Gavelle F, Lievre N, Bomsel M, Wolf JP (2114) Mouse offspring after microinjection of heated spermatozoa. Biol Reprod 23: Sailer BL, Sarkar LJ, Bjordahl JA, Jost LK, Evenson DP (4880) Effects of heat stress onmouse testicular cells and sperm chromatin structure. J Androl 49: Love CC, Kenney RM (4888) Scrotal heat stress induces altered sperm chromatin structure associated with a decrease in protamine disul fi de bonding in the stallion. Biol Reprod 21: Perez-Crespo M, Pintado B, Gutierrez-Adan A (2119) Scrotal heat stress effects on sperm viability, sperm DNA integrity, and the offspring sex ratio in mice. Mol Reprod Dev 03: Ax RL, Gilbert GR, Shook GE (4890) Sperm in poor quality semen from bulls during heat stress have a lower af fi nity for binding hydrogen- 3 heparin. J Dairy Sci 01: Bedford JM, Yanagimachi R (4884) Epididymal storage at abdominal temperature reduces the time required for capacitation of hamster spermatozoa. J Reprod Fertil 84: Murase T, Imaeda N, Yamada H, Miyazawa K (2110) Seasonal changes in semen characteristics, composition of seminal plas ma and frequency of acrosome reaction induced by calcium and calcium ionophore A23490 in Large White boars. J Reprod Dev 33: Bernstein JA, Alexis N, Barnes C, Bernstein IL, Nel A, Peden D, Diaz-Sanchez D, Tarlo SM, Williams PB (2111) Health effects of air pollution. J Allergy Clin Immunol 441: Kampa M, Castanas E (2119) Human health effects of air pollution. Environ Pollut 434: Dejmek J, Solansk I, Beneö I, Lenicek J, Sram RJ (2114) Air pollution and pregnancy outcome. In: Sram RJ (ed) Teplice program: impact of air pollution on human health. Academia, Prague, pp Maroziene L, Grazuleviciene R (2112) Maternal exposure to low-level air pollution and pregnancy outcomes: a population-based study. Environ Health 4: Sram RJ, Binkova B, Dejmek J, Bobak M (2113) Ambient air pollution and pregnancy outcomes: a review of the literature. Environ Health Perspect 443: Ritz B, Wilhelm M, Hoggatt KJ, Ghosh JK (2110) Ambient air pollution and preterm birth in the environment and pregnancy outcomes study at the University of California, Los Angeles. Am J Epidemiol 422: Brauer M, Lencar C, Tamburic L, Koehoorn M, Demers P, Karr C (2119) A cohort study of traf fi c- related air pollution impacts on birth outcomes. Environ Health Perspect 442: Green RS, Malig B, W indham GC, Fenster L, Ostro B, Swan S (2118) Residential exposure to traf fi c and spontaneous abortion. Environ Health Perspect 440: Bernstein JA, Alexis N, Bacchus H, Bernstein IL, Fritz P, Horner E, Li N, Mason S, Nel A, Oullette J, Reijula K, Reponen T, Seltzer J, Smith A, Tarlo SM (2119) The health effects of non-industrial indoor air pollution. J Allergy Clin Immunol 424: Hall J, Gilligan A, Schimmel T, Cecchi M, Cohen J (4889) The origin, effects and control of air pollution in laboratories used for human embryo culture. Hum Reprod 43(Suppl 1): Cohen J, Gilligan A, Esposito W, Schimmel T, Dale B (4880) Ambient air and its potential effects on conception in vitro. Hum Reprod 42: Forman M, Polanski V, Horvath P, Gilligan A, Rieger D (2111) Reductions in volatile organic compounds, aldehydes, and particulate air contaminants in an IVF laboratory by centralized and stand -alone air fi ltration systems. Fertil Steril 92(Suppl 2):S321 (Abstract P-333) 284

288 442. Merton JS, Vermeulen ZL, Otter T, Mullaart E, de Ruigh L, Hasler JF (2110) Carbonactivated gas fi ltration during in vitro culture increased pregnancy rate following transfer of in vitro -produced bovine embryos. Theriogenology 20: Racowsky C, Jackson KV, Nurredin A, Balint C, Shen S, de los Santos MJ, Kely JR, Pan Y (4888) Carbon-activated air fi ltration results in reduced spontaneous abortion rates following IVF. In : Proceedings of the 44th world congress on in-vitro fertilization and human reproductive genetics, pp O 138 (Abstract), Sydney, Australia Younis A, Carnovale D, Butler W (2118) Improvement in IVF outcome after change of CO 2 supplies to incubators. Fertil Steril 82(Suppl):S433 (Abstract P-214) 448. Perin PM, Maluf M, Czeresnia CE, Nicolosi Foltran Januario DA, Nascimento Saldiva PH (2141) Effects of exposure to high levels of particulate air pollution during the follicular phase of the conception cycle on pregnancy outcome in couples undergoing in vitro fertilization and embryo transfer. Fertil Steril 83: Legro RS, Sauer MV, Mottla GL, Richter KS, Li X, Dodson WC, Liao D (2141) Effect of air quality on assisted human reproduction. Hum Reprod 23: Perin PM, Maluf M, Czeresnia CE, Januario DA, Saldiva PH (2141) Impact of short-term preconceptional exposure to particulate air pollution on treatment outcome in couples undergoing in vitro fertilization and embryo transfer (IVF/ET). J Assist Reprod Genet 20: Veras MM, Damaceno-Rodrigues NR, Caldini EG, Maciel Ribeiro AA, Mayhew TM, Saldiva PH, Dolhnikoff M (2119) Particulate urban air pollution affects the functional morphology of mouse placenta. Biol Reprod 08: Maluf M, Perin PM, Foltran Januario DA, Nascimento Saldiva PH (2118) In vitro fertilization, embryo development, and cell lineage segregation after pre- and/or postnatal exposure of female mice to ambient fi ne particulate matter. Fertil Steril 82: Boggia B, Carbone U, Farinaro E, Zarrilli S, Lombardi G, Colao A, De Rosa N, De Rosa M (2118) Effects of working posture and exposure to traf fi c pollutants on sperm quality. J Endocrinol Invest 32: De Rosa M, Zarrilli S, Paesano L, Carbone U, Boggia B, Petretta M, Maisto A, Cimmino F, Puca G, Colao A, Lombardi G (2113) Traffic pollutants affect fertility in men. Hum Reprod 49: Hansen C, Luben TJ, Sacks JD, Olshan A, Jeffay S, Strader L, Perreault SD (2141) The effect of ambient air pollution on sperm quality. Environ Health Perspect 449: Rubes J, Rybar R, Prinosilova P, Veznik Z, Chvatalova I, Solansky I, Sram RJ (2141) Genetic polymorphis ms influence the susceptibility of men to sperm DNA damage associated with exposure to air pollution. Mutat Res 293: Rubes J, Selevan SG, Evenson DP, Zudova D, Vozdova M, Zudova Z, Robbins WA, Perreault SD (2113) Episodic air pollution is associated with increased DNA fragmentation in human sperm without other changes in semen quality. Hum Reprod 21: Rubes J, Selevan SG, Sram RJ, Evenson DP, Perreault SD (2110) GSTM 4 genotype influences the susceptibility of men to sperm DNA damage associated with exposure to air pollution. Mutat Res 223: Waylen AL, Metwally M, Jones GL, Wilkinson AJ, Ledger WL (2118) Effects of cigarette smoking upon clinical outcomes of assisted reproduction: a meta-analysis. Hum Reprod Update 43: Lichtenfels AJ, Gomes JB, Pieri PC, El Khouri Miraglia SG, Hallak J, Saldiva PH (2110) Increased levels of air pollution and a decrease in the human and mouse male-to-female ratio in Sao Paulo, Brazil. Fertil Steril 90:

289 فصل 21 محیطهای کشت: مایع پیا محیطهای کشت ریان)میکرفلئیدها( لله مجرای رحم یک محیط پیا برای اسیت سلل تخم ریان الیه ارایه که است که در آن نیرهای مختلفی تسط مژکها جریان مایع داخل للهها فراهم میشد. حرکت سیال مایع للهای / رحمی تفاتهای شیمیایی اثر متقابل آنها یک محیط منحصر به ف را برای حمایت از تسعه ریان متناسب کن بیان ژن فراهم میکند. اگرچه کشت ریان در شرایط شیمیایی با پیچیدگی کم ساکن قابل اجرا می باشد استفاده از محیط کشت پیا به رند ر به رشد در زمینه تکنلژی تلید مثل کمک که تامنجر به بد کیفیت نتایج حاصل از به کار گرفتن این پیشرفت فنارانه به مدت تقریبا یک دهه شد. تالشهای متعددی در جهت ساخت دستگاههایی که قادر به تسهیل لقاح کشت ریان بشد صرت پذیرفته است اما هنز دستگاههای مربط به پیا ساختن مایع )محیط کشت ریان( برای استفاده به مقیاس انبه در آزمایشگاههای کلینیکی تحقیقاتی ریانشناسی ساخته نشده است. در اقع چنین دستگاهی برای کشت ریان ساخته شده است تحت ارزیابی مطالعات IRB تایید شده است لی هنز این سیله به تلید انبه نرسیده است. به نظر میرسد دستگاههای ایجاد کننده حرکت مایع به منظر ارتقای تسعه ریان باشند ممکن است که این تکنلژی از منابع ابتکاری برای آزمایشگاههای ریانشناسی کلینیکی تحقیقاتی تجربی تشکیل شده باشند. در این فصل به بررسی اصل نتایج حاصل از سیستمهای پیاسازی مایع ماد رش م نیاز برای ایجاد جریانات ریز للهای سیستمهای کشت در جهت استفاده ریان پاخته شده است مقدمه مجرای ایداکت محیط پیچیدهای است که از لقاح تخمک تسعه ریان الیه سهلت انتقال ریان به رحم پشتیبانی میکند. این انتقال با تجه به جریان ایجاد شده تسط مژکها حرکات انقباضی الیهی عضله صاف رخ میدهد. ترکیبی از فعالیت عضالنی مژکها در طل حفره لله ایداکت جریان آشفتهای را به سی شاخ رحم ایجاد میکند )4(. این حرکت پیش رنده آشفته مسئل ترشح همگن در لله رحمی رقیق سازی متابلیتهای نامطلب منجر به تسهیل در فعل انفعاالت گامت میشد )4(. سرعت جریان لله رحمی فرکانس حرکت مژگانی به ترتیب در محدده 2/3-28 µm/s 3-21 Hz برآ شده است )2(. این ریز محیط پیا ایجادکننده تحریکات مکانیکی ریان میباشد )3(. با این جد که هنز درک درستی از اینکه چه طر حساسیت مکانیکی ریان در رند رشد تکین ریان ایفای نقش مینماید در دسترس نیست ممکن است که در سلل- های دیگر تحریک مکانیکی تنظیم کننده بیان ژن سرنشت سلل باشد )1 3(. حتی اگر در داخل بدن رشد ریان دریک محیط پیا رخ دهد کشت ریان در شرایط ایستا )ساکن( امکان پذیر است. در اقع سیستمهای ایستا )ساکن( برای کشت ریان در شرایط آزمایشگاهی به عنان رشهای معمل برای رشد ریان پستانداران به طر گسته برای درمان نابارری انسان تلید دام به تصیب رسیدهاند. با این حال مطالعات با استفاده از مدلهای حیانی نشان میدهد که ریانهای رشد یافته در شرایط آزمایشگاهی دارای کیفیت پایینتر نرخ آبستی کمتر از ریانهای رشدیافته در داخل بدن هستند. مشخص شده است که قرار گرفتن در معرض محیط للههای رحمی / رحم در طل تسعه الیه ریان تنظیم مسیرهای متابلیکی ریان )2-8( در ارتقا رند تکین ریان مثر میباشد. محیطهای ایستا که به طر معمل در آزمایشگاه م استفاده قرار میگیرند ممکن است یک محیط کشت ایده آل برای کشت ریان را ارایه ندهند. با تجه به اختالف آشکاری که بین محیط کشت ایستا محیط للههای رحمی/ رحم جد دا محققان استدالل کهاند که سیستمهای کشت ریان با استفاده از ریه کشت پیا میتاند شرایط مفید تحریکات برگرفته از ریان در شرایط داخل بدن را تکرار کند. در این فصل به بررسی چندین رش برای بدست آن محیط با یژگی پیایی محیط کشت ماد رشهای منیاز برای تلید تجهیت funnel پیا برای محیط کشت با استفاده از این ریک نآرانه پاخته شده است. 289

290 تلید محیط کشت با یژگی پیایی محیط مقاالت متعددی کاربهای بالقه میای استفاده از محیطهای پیا در جهت کشت ریان که بسیله میکرفلئیدها ایجادشدهاند را م بحث قرار دادهاند )41-41(. اگرچه این گرشات خش بینانه بده چشم انداز امیدارکنندهای را به خد جلب که اما تعداد محددی از نشریات به بررسی اثرات محیط پیا برای تسعه ریان پاخته اند )43-48(. به طر کلی رش- هایی که برای ایجاد حرکت سیال مایع پیشنهاد شده به سه دسته تقسیم ششده است: 4- حرکت پلت فرم کشت 2- حرکت مجی محیط کشت 3- طراحی حرکت سیال تصیب هریک از این رشها بستگی به هدف اصلی م تجه دا. اهداف اصلی میتانند شامل ما زیر باشند: 4( کشت ریان به همراه فاید اضافه شده مانند بد رشد یا 2( تلید فرزندان سالم. برای مثال تلید محیط مایع پیا با پلت فرم سیال تصادفی ممکن است برای تلید ریان مناسب باشد )42-40(. اما ارزیابی ریان به طری که فراتر از ارزیابی معمل مرفلژیک انجام میشد ممکن نخاهد شد. انتخاب یک رش برای ایجاد محیط مایع پیا بستگی به نیازها اهداف هریک از آزمایشگاههای ریان شناسی دا حرکت پلت فرم محیط در سیستمهای کشت ریان سنتی در ظرف پالستیکی که با رغن برای جلگیری از تبخیر پشش داده شدهاند نگه داری میشدند. استراتژی کشت پیا از سیستم ظرف کشت مشابه استفاده که اما از کشت سنتی ایستا متفات بده است درحالی که در انکباتر چرخش یا کج کن پلت فرم که در آن ظرف کشت نگه داری میشند منجر به ایجاد جنبش محیط کشت میشد )40(. استفاده از رش ایجاد جنبش در ظرف برای ایجاد یک محیط پیا برای کشت ریان بیش از 33 سال پیش گرش شد )24( اگر چه نیسندگان از یک دره کتاه کشت استفاده کند مطالعه الیه با شکست ربر شد که منجر به برز تنش برشی در ریان شد. تحمل ریان انعطاف پذیری به تنش برشی اخیرا در یک مطالعه مشخص شد )22(. جنبش پلت فرم برای تلید مایع پیا در کشت ریان انسان به تازگی تسط Matsuura همکاران م بررسی قرار گرفت )40(. مایع پیا تسط کج کن پلت فرم برای تلید ریان یا حرکت مایع با سرعت شعاعی 4 در هر ثانیه تا 41 رسید. اگرچه افیش قابل تجهی در نرخ تشکیل بالستسیت جد نداشت اما شمار بالستمرها در ریانهای کشت شده در سیستمهای کشت ریان که به صرت کج )قابل چرخش( قرار داشتند ازسیستم کشت ایستا بیشتر بد. این که آیا افیش تعداد بالستمر در ریان انسان در معرض کج قراادن محیط کشت منجر به افیش نرخ بااری میشد هنز هم نیازمند این است که در مطالعات کلینیکی تحقیقاتی تعیین شد. اثرات مشابه کج قرار دادن سیستم کشت ریان بر شمار بالستمرهای هر بالستسیست در ریان خک مش مشاهده شد )42 40(. پلت فرم قابل چرخش نیز برای حرکت ریان در دستگاههایی که دارای کانالهای باریکی هستند م استفاده قرار گرفت )49(. تجهیت دارای کانالهای باریک با ایجاد یک سری از انقباضات مرب منجر به حرکت ریان گا در قسمتهایی با عرضهای مختلف شدند. بیان شد که این ضعیت نیرهای پریستالتیک در ریان حرکات حلقی مجاری راشبیه سازی میکند. این سیستم به منظربهینه سازی آزمایش تعیین محدده نیرهای مفید اعمال شده به ریان باقی ماند )49( حرکت مجی محیط کشت به نظر میرسد محرکهای مکانیکی از طریق لرزش منجربه افیش نرخ تکثیر حرکت برخی از اناع سللهای سماتیک میشند )23-23(. ارتعاش پلت فرم میتاند برای زیر بم کن تسعه ریان در شرایط آزمایشگاهی از طریق حرکت مایع ریان م استفاده قرار گی )22 20(. تخمکهای بالغ شده خک در شرایط آزمایشگاهی تحت ارتعاش )21 هرتز( به مدت 3 ثانیه در هر 21 دقیقه نرخ بالستسیست باالتری از محیط کشت ایستا تلید ک با این حال اثرات سدمند ارتعاش ریان زمانی که ریانها از تخمکهای بالغ شده در شرایط ایستا تلید شده بدند مشاهده نشد )22(. این نشان میدهد 281

291 که حداقل برای این گنهها حرکت ارتعاشی ممکن است تاثیر مثبتی در طل بلغ تخمک داشته باشد )22(. اخیرا حرکت مجی محیط مایع در یک رش مشابه اما با فرکانس باالتر )11 هرتز( برای ریان انسان نیز استفاده شد )20(. نیسندگان این مقاله تصریح کهاند که در آزمایش خد از 11 هرتز ارتعاش برای 41 ثانیه در هر 21 دقیقه استفاده کند که باعث افیش نرخ تشکیل بالستسیست بااری شد )20(. مکانیسمهای زیربنایی از اثرات اعمال شده تسط تحریکات ارتعاشی هنز هم ناشناخته هستند طراحی حرکت سیال دینامیک سیاالت از طریق فشار مایع که در یک منطقهی میکرسکپی هندسی محدد شده که معمال از طریق کانال 313 ایجاد میشند طراحی شده است. در دستگاههای ریزسیال که برای کشت ریان تصیف شدهاند مای مانند: )عنان تیتر ( شیب گرانش) ( سرنگهای پمپ کننده )28( یا )عنان تیتر ( حرکت پریستالتیک ایجادشده تسط Braille pins که دارای بیش از یک صفحه قابل انعطاف هستند )43( استفاده شده است شیب گرانش سرنگ پمپ کننده شیب گرانش سرنگهای پمپ کننده در محیط کشت که از طریق میکرکانالها ایجاد میشد رش سادهای برای ایجاد پیایی ریزسیال هستند. به طر کلی تجهیت طراحی شده برای کشت ریان در سیستمهای دینامیکی سیال دارای یک کانال تنها با مانع بده )31 34( یا آرایشهای )به نظم در آن( سادهای که میتاند از طریق طرحنگار نری یا قالبهای ریزی که از عناصر ضخیم یا سخت تلید شده است میباشد. به دلیل اینکه این رشها به غشاهای انعطاف پذیر نیازی ندارند قابل تصیف هستند )29(. معمال ساخت بهره باری آنها به نسبت ساده بده میتاند بیش از یک عملک را در خد جای دهد. در اقع دستگاه ریزکانال برای حذف سللهای کملس زنا پلسیدا کشت ریان استفاده شده است )41(. مزیت بزرگ این دستگاهها سادگی آنها است اما ما مهمی مانند تلید تنش برشی شست شی بیرنی عامل اتکرین مطلب همچنین خطر به دام افتادن ریان درن سیستم جد دارند که باید به آنها تجه ک. ریان محدد شده در میکر کانالها ممکن است با جریان یک سیه تا 411 nl/s با میانگین سرعت )29( 2 mm/s فشاری بیش از 0-41N ماجه شد. شبیه سازی بیشتر این نع کانالها نشان میدهد که ریانها در این نع تجهت با تنش برشی شست شی فاکترهای رشد سایتکین ترشح شده تسط ریان ماجه شدهاند )43(. اثرات مخرب ابسته به زمان تنش برشی در ریانها به بصرت بسیار دقیق تسط Xie همکاران نشان داده شد )22(. این اثرات پس از 2 ساعت از اگذاری به نیری برشی قابل تجه بد. در این مرحله چند ریان قادر به بد استرس بدند. با این حال نسبت ریانهایی که در بد استرس پس از ماجه با نیرهای برشی مفق نبدند به صرت ابسته به زمان افیش یافت پس از 42 ساعت هچ یک از ریانها قادر به بد استرس نبدند )22(. Xie همکاران رشد ریان در دستگاه های میکرکانال با جریان مایع در معرض مقادیر کمتری از نیرهای برشی از آن را گرش کند )22(. تشخیص اینکه جد دره ماجهه به طر قابل تجهی طالنیتر بده مهم است بنابراین ممکن است بر تنش برشی مین رشد به خطر افتاده اثربگذا )48 29(. در برخی ما گرشات افیش تلید بالستسیست در سیستمهای کشت میکرکانال را نشان میدهند )48 32( هنز اطالعاتی در ارتباط با نرخ بااری تعداد بالستمر در ریان تغییرات در ریز ساختار سلل مانند افیش فعالیت در / MAPK م نیاز است. Microfluidics 285

292 حرکات ددی 312 برنامه نیسی به منظر ایجاد حرکت میلههای بریل به صرت پیدرپی اعمال فشار در برابر کانالهای میکرفلئید که با غشای انعطاف پذیر پشش داده شده است تانایی ایجاد اناع مختلفی از جریان ددیدر سرتاسر کانالها را دا )33(. این نع تلید جریان اجازه میدهد که فرکانس جابهجایی سرعت سیال تحت کنترل باشد. در بسیاری از ماقع ماد م استفاده در 310 تجهیت میکرفلئیدی پلیمر پلیدیمتیلسیلکسان میباشد زیرا این ماده به راحتی قابل جایگزین شدن میباشد همچنین نسبت به گاز نفذ پذیر بده انعطافپذیر است خاص نری آن اجازه میدهد مشاهده میکرسکپی بدن مانع انجام شد )43 33( بااین حال شرایط الزم برای یک غشای انعطاف پذیر م نیاز برای به حرکت درآن میله بریل میتاند منجر به تبخیر قابل تجهی از محیط تغییرات در اسماللیته محیط شد )32(. برای جلگیری از تبخیر افیش در اسماللیته ضخامتهای مختلف غشا 1/4-4( mm( PDMS تیمارهای نفذ ناپذیر مختلفی م بررسی قرار بگیرند. غشای ضخیمتر PDMS دارای تبخیر کمتر بد درحالی که در ضخامت غشا 1/4 mm mm 1/2 حداکثر تبخیر افیش اسماللیته حاصل شد که برای تسعه ریان مضر بدند. تغیرات اسماللیته بیشتر از 311 mosm/kg در دستگاههای میکرفلئیدی با کف متشکل از میکرتنلهای PDMS با ضخامت 1/4 mm مشاهده شد که منجر به اختالل در تسعه ریان به مرحله بالستسیت در مقایسه با دیارههای ضخیمتر PDMS 4 mm = %02( PDMS % 20 = mm ) PDMS41 دستگاههای کنترل با کف شیشهای )%20( شدند )32(. این معضل نیازمند الیهی نازکی برای تحریک میلههای بریل میباشد در عین حال نیازمند جلگیری از زیانهایی مانند تبخیر تغیرات اسماللیته بده که از تسعه ریان حمایت نمیکند. بنابراین نیاز به استفاده از PMDS که دارای غشای انعطاف پذیر در عین حال نفذ ناپذیر است احساس میشد. مشخص شده است که در دستگاه- های ایجاد کننده جریان سیال محیط کشت دیارههای نازک PMDS را با نارهای 2/3 µm از parylene پشاندهاند تا مانع از تغیرات اسماللیته درنتیجه افیش نرخ تشکیل بالستسیست در مقایسه با دستگاههای بدن پشش شد )32(. شکل میکرفنل مجد در داخل دستگاه میکرفلئید با جریان پریستالتیک که برای نگهداری ریان میباشد بسیله مدل سازیهای شبیه سازیهای گستهای م آزمایش قرار گرفته است. کشت ریان در میکرفنلها تنش برشی را در مقایسه با ریانهای کشت شده در میکرکانالهایی که دارای جریان ایستا بدند کاهش داد. عاله بر این میکرفنلها منجر به افیش تجمع عامل اتکرین اطراف ریان تحریکات مکانیکی میشند )43(. میای بدست آمده از میکرفنلهای پیا را میتان در ریانهای کشت شده مش که تحت جنبش ضربانی با فرکانس 1/4 Hz در نمنههای الیه دستگاه میکرفنل مشاهده نمد. درصد بالستسیتهای هچ شده شمار بالستمرهای هر ریان پس از اینکه ریانها درسیستمهای میکرفنل پیا کشت شدند در مقایسه با ریانهای کشت شده در سیستمهای کشت میکرفنل یا پتریدیشهای ایستا بیشتر بد. عاله بر این مطالعاتی که در ارتباط با النهگزینی آبستنی انجام شد نشان داد نرخ النه گزینی آبستنی تدام یافته در ریانهای کشت شده در سیستمهای میکرفنل پیا در مقایسه با سیستمهای ایستا افیش یافته است. این نتایج نزدیک به نرخ حاصل از ریانهایی بد که در داخل بدن تشکیل شده اند )43(. نمنههای الیه از دستگاههای کشت میکرفنل پیا در ایاالت متحده برزیل م ارزیابی قرار گرفت )30( گرش الیه نشان میدهد که رشد ریان در دستگاه میکرفنل پیا تا رز سم رشد دارای نرخ قطعه قطعه شدن کمتر در مقایسه با آن دسته از ریانهایی بد که در شرایط سنتی ایستا نگه داری شدند. عاله براین ریانهای انسانی کشت شده در میکرفنلهای پیا به ریانهایی با کیفیت خب تسعه یافتند )بیش از شش بالستمر با %21 قطعه قطعه شدن کمتر ریان در رز سم( نسبت به آنهایی که در شرایط سنتی ایستا کشت شده بدند )30(. اثر دستگاه میکرفنل پیا درتسعه ریان انسان به مرحله بالستسیست تاثیر این فنآری در مین آبستنی النهگزینی در تحقیقات آینده باید م تجه قرار گی. Braille PDMS 286

293 3-21. نکات پایانی تجهیت سیستمهای محیط کشت سیال پیا را میتان برای عملکهای مختلف در یک آزمایشگاه ریانشناسی طراحی ک. همچنین چندین گرش اناع مختلف دستگاههای تلید محیطهای سیال پیا افیش تلید ریان را نشان می- دهد. اضح است هدف کتاه مدت این آزمایش ارایه سیستمهای کشت کارآمدتر برای آزمایشگاه IVF کلینیکی تحقیقاتی نشان دادن میایی است که از طریق راههای فنی متعدد به دست آمده است. ازجمله فاید بزرگ ادغام تکنلژی با یک دستگاه احد نقش کمک کننده آن در آزمایشگاه فنآری تلید مثل کلینیکی تحقیقاتی است. یک سیستم کشت پیا که طراحی برنامه ریزی شده به منظر تسهیل جنبههای متعدد کشت دستکاریهای آزمایشگاهی ریان گامت همچنین تاناییهای 319 جدیدی مانند بیآنالیز در لحظه که همگی در مجمع منجر به بد نتایج در درمان نابارری خاهد بد. این نع از دستگاه ممکن است برنامه فق العادهای در محیط ریانشناسی کلینیکی تحقیقاتی برای کمک به انتخاب ریان با معیارهایی که به تنهایی مبتنی بر عملک فیزیلژیی به جای معیارهای مرفلژی هستند داشته باشد. در اقع همان یژگی است که دستگاه میکرفلئید که منجر به جذاب شدن آن در آزمایشگاه ریانشناسی کلینیکی تحقیقاتی شد ممکن است این دستگاه را برای آزمایشگاه ریان شناسی تجربی جالب که باشد. تانایی تلید انتقال ماد شیمایی به صرت پیدرپی یا ایجاد یک شیب غلظت از ماد شیمیایی مجد در محیط کشت را میتان برای تلید طرحهای آزمایشی مشخصی ماستفاده قرار داد. که ممکن است منجر به بد بیشتر در زمینههایی مانند تسعهی محیط کشت زیست شناسی انجماد بشد ماد ماد رشهای زیر مربط به استفاده از یک نمنه سیستم الیه از یک دستگاه میکرفنل پیا برای کشت ریان است. تنظیمات تغییرات برای کارک صحیح این نمنه الیه در آزمایشگاه همچنین برای استفاده از دیگرسیستمهای کشت ریان که بر اساس میکرفلئید پیا بده داخل آزمایشگاه ساخته شدهاند باید به این پرتکل افزده شند )43 39( ماد برای ساخت دستگاه میکرفنل پیا -4 پری پلیمرPDMS )Sylgards, Dow Corning( 2- C Parylene )به نکته 4 تجه کنید( 211 میکرمتر 3- اسالید شیشهای SU- -1 Trideca fluoro- -tetrahydrooctyl- -trichlorsilane صفحه نمایش بریلها تجاری ماد برای کشت ریان در دستگاه های میکرفنل پیا 4- جریان آرام هد 2- انکباتر برای ریانها 3- صفحه میلههای بریل )تجه به نکته 2( 1- دستگاه میکرفنل پیا 3- محیط کشت ریان 2- پیپت برای حجم تا 4 میلی لیتر. 0 سرپیپتهای دارای مانع 9- پیپتهای دارای منفذکچک 8- دستگاه پیپتینگ برای پیپتهای دارای منفذکچک 41- میکرسکپ اینرت 44- استریمیکرسکپ رشها ساخت دستگاه میکرفنل پیا ط- 4 راحی مدل دستگاه )تجه به نکته 3 ( Real time bioanalysis 287

294 2- درست کن ساختار کانالهای م نظر که از SU- تشکیل شده ساخت آنها با یک glass wafer باریک با استفاده از دستگاه طرح نگار نری که از قسمت پشتی نر پخش میکند انجامی میشد. 3 -خارج کن حبابهای تحت خالء برای 4 ساعت ) 211 میلی متر جیه( )تجه به نکته 1 ( 1 -قراادن رقههای 9 میلیمتر از پری پلیمر PDMS که به فرم قالب در آمده )casted( در دمای 21 درجه سانتیگراد برای 421 دقیقه دمای 421 درجه سانتی گراد به مدت 31 دقیقه 3- قالب غشاهای PDMS 1/4 mµ همانطر که در باال شرح داده شد. 2- گذاشتن / µm( parylene C ~( در قسمت پشتی غشاهای 1/4 mm ساخته شده از PDMS با استفاده PDS.PDMS با well پس از پشاندن کنارههای Labcoater 0- اتصال رقهی PDMS به یک PDMS-parylene-PDMS membrane باریک راه اندازی دستگاه میکرفنل پیا کشت ریان 4- دستگاه میکرفنل پیا برای کشت ریان به صرت صفحات نفذپذیرنسبت به گاز هستند که آنها را باید در انکباتر در دمای 30 c به مدت حداقل 1 ساعت قبل از پر کن با محیط کشت قرار داد. )تجه به نکته 3 ( 2- دستگاه میکرفنل پیا میتاند از د میکرفنل که تسط میکرکانالها به هم صل شدهاند تشکیل شده باشد. محیط کشت درن میکرفنلها قرااده شده. محیط کشت ا میکرکانالها شده از طریق کانالها حرکت که ا میکرفنل دیگر می- شد. 3- در زیر میکرسکپ اینرت یا استری میکرسکپ حبابهای ها را در ه میکرفنل متصل مخزن میکرفنل کشت جستج که )تجه به نکته 2(. میکرکانالها باید عاری از حبابهای ها باشند. 1 - اگر میکرکانالها دارای حباب ها باشند با یک میلهی پالستیکی دستگاه میکرفلئید را به آرامی از سمت پایین فشار داده میله را به سمت میکرفنلها هدایت که تا حبابهای ها از درن میکرکانالها خارج شند. 3- هنگامی که دستگاه میکرفنل پیا عاری از حبابهای ها است باید آن را در باالی پلت فرم میلههای بریل ذخیره شده در داخل انکباتر محکم ک )تجه به نکته 0 (. 2- پلت فرم میلههای بریل باید برای رد جریان محیط کشت رشن باشد کل سیستم در طل شب قبل از قراادن ریانها در کشت آغاز به کار که باشد. 0 -کارتریج دستگاه میکرفنل را دباره برای جد حبابهای ها قبل از قرار دادن یگتها درن میکرفنل کشت چک کنید )تجه به نکته 9(. 9 -یگتها را به سیلهی استری میکرسکپ پیپتهای دارای منفذ کچک از درن سیستم کشت ایستا خارج کنید. تا پنج ریان را در میکرفنل کشت قرار دهید. کارتریج میکرفنل پیا را بر ری پلت فرم میله- های بریل جایگزین که قالبهای ایمنی را پیش از گذاشتن به درن انکباتر فعالسازی تحرک میلههای بریل قفل کنید. 8 -ریانها باید در رز سم یا رزهای پنجم ششم کشت ارزیابی شند نکات 4 -پشش Parylene تسط شرکتهای متخصص در تلید پشانندههای شیمیایی به عنان سیستم پشاننده یژه تلید میشند. 2- استفاده تجاری در دسترس پلت فرم میلههای بریل برای خاندن ایمیل: ( F.H. Braillex Tiny from -3 )Papenmeier GmbH & Co. KG, Germany مدل سازی تئری دستگاههای میکرفنل باید قبل از قالب بندی نمنه- های الیه انجام شد تا اطمینان حاصل شد که تنش برشی انتشارهای شیمیایی از قبل در نظر گرفته شده است. دستگاه استفاده شده در مطالعه Heo همکاران به ابعاد زیر بده است: الف( میکرکانالها: طل 4/3 میلیمتر عرض 1/4 میلی متر ارتفاع 1/44 میلی متر است. ب( فنل)قیف( : شعاع پایین 1/23 میلی متر شعاع باال 4/00 میلی متر ارتفاع 2/23 میلی متر یهی مربط به انتهای صاف قیف جلگیری از قرار گرفتن در معرض بیش از حد خالء برای جلگیری از عمل آری زدرس. 3- قرار دادن دستگاه میکرفلئید حداقل به مدت 1 ساعت در انکباتر در دمای 30 C اجازه میدهد که پیش از قرار دادن محیط دستگاه منبسط شد. این به عنان یک استراتژی برای جلگیری از تشکیل حبابهای ها در میکرکانالها استفاده 288

295 میشد. 2- این رش باید به دقت زیر استریمیکرسکپ انجام شد. از حضر حبابهای ها باید جلگیری شد چرا که آنها تحرک محیط در میکرکانالها را مسدد که پانسیل مفید محیط کشت پیا را خنثی میکنند. 0- انکباتر باید براساس شیههای استاندا هر آزمایشگاه ریانشناسی کلینیکی تحقیقاتی راه اندازی دما گاز مجد در محیط آن تنظیم بشد. 9- تلقیح تخمک تعیین لقاح باید رش استاندا دسترالعملهای هر آزمایشگاه ریانشناسی کلینیکی تحقیقاتی تعیین شد.. Muglia U, Motta PM ( ) A new morphofunctional classi fi cation of the Fallopian tube based on its three-dimensional myoarchitecture. Histol Histopathol ( ):. Paltieli Y, Weichselbaum A, Hoffman N, Eibschitz I, Kam Z ( ) Laser scattering instrument for real time in-vivo measurement of ciliary activity in human fallopian tubes. Hum Reprod ( ):. Fauci L, Dillon R ( ) Bio fl uidmechanics of reproduction. Annu Rev Fluid Mech :. Schumann D, Kujat R, Nerlich M, Angele P ( ) Mechanobiological conditioning of stem cells for cartilage tissue engineering. Biomed Mater Eng ( Suppl):S S. James JL, Whitley GS, Cartwright JE ( ) Shear stress and spiral artery remodelling: the effects of low shear stress on trophoblastinduced endothelial cell apoptosis. Cardiovasc Res ( ):. Pontes JH, Nonato-Junior I, Sanches BV, Ereno-Junior JC, Uvo S, Barreiros TR, Oliveira JA, Hasler JF, Seneda MM ( ) Comparison of embryo yield and pregnancy rate between in vivo and in vitro methods in the same Nelore (Bos indicus) donor cows. Theriogenology ( ):. Gil MA, Cuello C, Parrilla I, Vazquez JM, Roca J, Martinez EA ( ) Advances in swine in vitro embryo production technologies. Reprod Domest Anim (Suppl ):. Lonergan P, Pedersen HG, Rizos D, Greve T, Thomsen PD, Fair T, Evans A, Boland MP ( ) Effect of the post-fertilization culture environment on the incidence of chromosome aberrations in bovine blastocysts. Biol Reprod ( ):. Gad A, Besenfelder U, Rings F, Ghanem N, Salilew-Wondim D, Hossain MM, Tesfaye D, Lonergan P, Becker A, Cinar U, Schellander K, Havlicek V, Holker M ( ) Effect of reproductive tract environment following controlled ovarian hyperstimulation treatment on embryo development and global transcriptome profile of blastocysts: implications for animal breeding and human assisted reproduction. Hum Reprod ( ):. Smith GD, Swain JE, Bormann CL ( ) Micro fl uidics for gametes, embryos, and embryonic stem cells. Semin Reprod Med ( ):. Krisher RL, Wheeler MB ( ) Towards the use of micro fl uidics for individual embryo culture. Reprod Fertil Dev ( ):. Smith GD, Takayama S ( ) Gamete and embryo isolation and culture with micro fl uidics. Theriogenology (Suppl ):S S. Suh RS, Phadke N, Ohl DA, Takayama S, Smith GD ( ) Rethinking gamete/embryo isolation and culture with microfluidics. Hum Reprod Update ( ):. Beebe D, Wheeler M, Zeringue H, Walters E, Raty S ( ) Micro fl uidic technology for assisted reproduction. Theriogenology ( ):. Heo YS, Cabrera LM, Bormann CL, Shah CT, Takayama S, Smith GD ( ) Dynamic microfunnel culture enhances mouse embryo development and pregnancy rates. Hum Reprod ( ):. Koike T, Matsuura K, Naruse K, Funahashi H ( ) In-vitro culture with a tilting device in chemically de fi ned media during meiotic maturation and early development impro ves the quality of blastocysts derived from in-vitro matured and fertilized porcine oocytes. J Reprod Dev ( ):. Matsuura K, Hayashi N, Kuroda Y, Takiue C, Hirata R, Takenami M, Aoi Y, Yoshioka N, Habara T, Mukaida T, Naruse K ( ) Improved development of mouse and human embryos using a tilting embryo culture system. Reprod Biomed Online ( ):. Kim MS, Bae CY, Wee G, Han YM, Park JK ( ) A micro fl uidic in vitro cultivation system for mechanical stimulation of bovine embryos. Electrophoresis ( ):. Raty S, Walters EM, Davis J, Zeringue H, Beebe DJ, Rodriguez-Zas SL, Wheeler MB ( ) Embryonic development in the mouse is enhanced via microchannel culture. Lab Chip ( ):. Demming S, Vila-Planas J, Aliasghar Zadeh S, Edlich A, Franco-Lara E, Radespiel R, Buttgenbach S, Llobera A ( ) Poly(dimethylsiloxane) photonic microbioreactors based on segmented waveguides for local absorbance measurement. Electrophoresis ( ):. Hoppe PC, Pitts S ( ) Fertilization in vitro and development of mouse ova. Biol Reprod ( ): 283 منابع

296 . Xie Y, Wang F, Zhong W, Puscheck E, Shen H, Rappolee DA ( ) Shear stress induces preimplantation embryo death that is delayed by the zona pellucida and associated with stress activated protein kinase-mediated apoptosis. Biol Reprod ( ):. Kaupp JA, Waldman SD ( ) Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proc Inst Mech Eng H ( ):. Ito Y, Kimura T, Nam K, Katoh A, Masuzawa T, Kishida A ( ) Effects of vibration on differentiation of cultured PC cells. Biotechnol Bioeng ( ):. Wolchok JC, Brokopp C, Underwood CJ, Tresco PA ( ) The effect of bioreactor induced vibrational stimulation on extracellular matrix production from human derived fibroblasts. Biomaterials ( ):. Mizobe Y, Yoshida M, Miyoshi K ( ) Enhancement of cytoplasmic maturation of in vitro-matured pig oocytes by mechanical vibration. J Reprod Dev ( ):. Isachenko V, Maettner R, Sterzik K, Strehler E, Kreinberg R, Hancke K, Roth S, Isachenko E ( ) In-vitro culture of human embryos with mechanical micro-vibration increases implantation rates. Reprod Biomed Online ( ):. Glasgow IK, Zeringue HC, Beebe DJ, Choi SJ, Lyman JT, Chan NG, Wheeler MB ( ) Handling individual mammalian embryos using micro fl uidics. IEEE Trans Biomed Eng ( ):. Hickman DL, Beebe DJ, Rodriguez-Zas SL, Wheeler MB ( ) Comparison of static and dynamic medium environments for culturing of pre-implantation mouse embryos. Comp Med ( ):. Wheeler MB, Walters EM, Beebe DJ ( ) Toward culture of single gametes: the development of microfluidic platforms for assisted reproduction. Theriogenology (Suppl ): S S. Clark SG, Haubert K, Beebe DJ, Ferguson CE, Wheeler MB ( ) Reduction of Polyspermic penetration using biomimetic micro fl uidic technology during in vitro fertilization. Lab Chip ( ):. Wheeler MB, Clark SG, Beebe DJ ( ) Developments in in vitro technologies for swine embryo production. Reprod Fertil Dev ( ):. Gu W, Zhu X, Futai N, Cho BS, Takayama S ( ) Computerized micro fl uidic cell culture using elastomeric channels and Braille displays. Proc Natl Acad Sci USA ( ):. Park TH, Shuler ML ( ) Integration of cell culture and microfabrication technology. Biotechnol Prog ( ):. Tung YC, Torisawa YS, Futai N, Takayama S ( ) Small volume low mechanical stress cytometry using computer-controlled Braille display micro fl uidics. Lab Chip ( ):. Heo YS, Cabrera LM, Song JW, Futai N, Tung YC, Smith GD, Takayama S ( ) Characterization and resolution of evaporationmediated osmolality shifts that constrain micro fl uidic cell culture in poly(dimethylsiloxane) devices. Anal Chem ( ):. Alegretti JR, Motta ELA, Sera fi ni P, Rocha AM, Criscuolo T, Smith GD ( ) Development of human embryos in a dynamic micro fl uidic culture system: results from a prospective randomized study. Hum Reprod (Suppl ):i. Heo YS, Jovic A, Cabrera LM, Smith GD, Takayama S ( ) Osmolality control for microfluidic embryo cell culture using hybrid polydimethylsiloxane (PDMS)-parylene membranes. In: Nahmias Y, Bhatia SN (eds) Methods in bioengineering: microdevices in biology and medicine. Artech House, Boston 231

297 فصل 24 مقایسات محیط کشت ریان انسان تالش ریههای به کار رفته در ART به منظر به حداکثر رساندن بازده نتایج آبستنی حاصل از لقاح برنتنی انتخاب محیط کشت ریان یا انتخاب مجمعهای از محیطهای کشت به انجام رسیده است. این تالشها به گنهای بده است که نتایج با نرخ باالی مفقیت با قابلیت تکرار با بازده مشابه را فراهم نمده است. رش معمل به منظر جایگزین نمدن محیط کشت م استفاده با محیط جدید به این صرت است که محیط کشت مجد را با یک محیط جدید در سیستم کشت برنتنی ریان با انجام تعداد کافی از سیکلهای لقاح برنتنی م مقایسه قرار داده در مقیاس آزمایشگاهی نتایج آبستنی حاصل را ارزیابی نمده سپس محیط جدید م تایید یا قرار خاهد گرفت. این رش ممکن است به یک آزمایشگاه اجازه دهد که یک محیط کشت را نسبت به دیگر محیطها انتخاب نماید. اما نتایج تنها به آن برنامه ارتباط داشته باید تجه داشت که بیش از 211 متغییگر ممکن است که در نتایج سیکل IVF تاثیر گذار باشد. نع طراحی یک مطالعه اجازه خاهد داد که استفاده کلیتر از نتایج IVF صرت بگی یکی از اناع طراحی به این صرت پیشنهاد شده است که فقط یک متغیر مثال ترکیبات محیط کشت در یک زمان م بررسی قرار بگی. برای انجام بررسی این طرح مرکز باید دارای حجم مناسبی از بیماران با یژگیهای م ناسب قابل قبل برای رد به برنامه تحقیقی م نظر باشد همچنین نرخ مفقیت برنامه لقاح برنتنی میبایست به اندازه کافی باال باشد که درصرت جد هرگنه تفات بتان تفات یا تفاتهای احتمالی را به آسانی م شناسایی قرار داد. همچنین جد برنامه قی برای تضمین کیفیت کنترل در ریههای آزمایشگاهی کلینیکی از سایر المات در این راستا می- باشد. اسیتهای به دست آمده از هر اهداکننده به صرت د دسته جداگانه در یک مطالعه کامال تصادفی تفکیک شده ریانهای بدست آمده از هر کدام به منظر سنجش کیفیت در رز 3 م ارزیابی قرار میگیرند. مشاهدات درنی بیرنی از تفاتها تسط ریه آماری kappa م ارزیابی قرار میگی برآ قدرت آماری اندازه مطالعات تانایی تفکیک کننده مطالعه را به همراه دا. در نهایت مشخص شد نتیجهی تعمیم دادن چنین آزمایشی تلید بالستسیت در رزهای 3 یا 2 میباشد مقدمه تلید محیط کشت برنتنی مغذی به منظر بهینهسازی شرایط نتایج حاصل در برنامهه یا ART به عنان یکی از عاملی شناخته شدهای است که دارای اهمیت بسیار زیادی میباشد. سیستم تلید محیط کشت بهینه به گنهای است که اثر متقابل بین عناصر ضرری م استفاده در یک محیط کشت یا در محیطهای کشت در سیستم کشت پیدرپی درنهایت باعث تلید تسعه یک سیستم کشت کاربی خاهد شد. تجه فراانی به فرمالسین محیط کشت به طر خاص از ااسط دهه 4891 میالدی برای تکثیر ریانهای انسان همچنین حضر رز افزن فرمالسین محیطهای IVF تجاری صرت پذیرفته است. تلید تجاری فرش محیط کشت ریان انسان عاله بر آسدگی در مصرف برای کاربران ارتقا کیفیت را حتی در کچکترین آزمایشگاهها باعث شده است. در اصل محیطهای تلید شده تسط آزمایشهای زیست سنجی به منظر اثبات کیفیت م ارزیابی post hoc قرار میگیرند. اغلب این ارزیابیها شامل تست کیفیت آب ارزیابی مناسب بدن اج مجد در ترکیب محیط کشت دقت در فرمله شدن محیط کشت میباشند. فرشندگان محیطهای کشت تجاری در حال حاضر از استانداهای صنعتی به منظر عملکهای تلیدی با کیفیت استفاده مینمایند از جمله ارزیابیهای استانداها میتان استفاده از اج قابل یابی تایید شده در تلیدات با استفاده از پرتکلهای دقیق م تصیب قرار گرفته اشاره نمد. اگرچه استفاده از محیطهای کشت تجاری تلید شده در دسترس باعث ایجاد راحتی کیفیت در ریههای آزمایشگاهی شده است اما این مسئله نیاز به انتخاب از بین دامنه سیعی از گزینهها باتجه به اینکه آزمایشگاه از استراتژی سیستم کشت یک مرحلهای یا سیستم کشت متالی استفاده میکند را افیش داده است. در اکثر آزمایشگاهها تافق در رابطه با استفاده از محیط یا محیطهای کشت م استفاده در تلید برنتنی ریان انسان مستلزم سنجش معیارهای آزمایشگاهی است. این معیارها به عنان نقطه 234

298 عطف در ارزیابی کیفی ریان به حساب میآیند همچنین شاخص بارری به عنان حکم نهایی در رند ارزیابی محیط یا محیط- های کشت در نظر گرفته میشد. مقاالت زیادی شامل نمنههای بسیاری از این مقایسات میباشند. هنز هم انجام آزمایشات در مراکز بزرگ برای نتیجهگیری علمی معتبر در این راستا ر به رشد میباشد. تمام این المات مطالعات مقایسهای پیچیدگی- های آنها به دلیل پیچیدگیها متغیرهای زیادی میباشد که در ریه IVF مثر میباشد. همچنین مسایل تدارکاتی در این مطالعات تنع ذاتی مرتبط با افراد متفات م درمان نیز از جمله سایر مای است که منجر به برز پیچیدگی در این مطالعات مقایسهای میشد. هدف این فصل انتقاد بر نتایج مقاالت مجد نیست بلکه عدف اصلی ارایه یک رش معتبر برای مقایسهی د محیط کشت مشخص نمدن متغیرهای درنی میباشد که این قبیل مطالعات مقایسلت را پیچیده مینمایند چرا نیاز است فرملهای تجاری مقایسه شند محیط کشت تنها یک جز از سیستم کشت است. یژگیهای عملکی محیط کشت میتاند به طر چشمگیری تسط سایر اج مانند: فاز گازی ظرف کشت پشش رغن عملک انکباتر ریه بازیافت گامتها تحت تاثیر قرار بگی. تاکنن بیشتر مطالعات به دنبال شناسایی بهترین محیط کشت در مقایسات بین د محیط کشت بدهاند. درحالی که هیچ تالشی مبنی بر شناسایی جداسازی عامل تاثیرگذار مجد در داخل یا خارج از آزمایشگاه یا بهینهسازی عملک محیط آزمایشی با آزمایشهای الیه صرت نگرفته است. این مطالعات فقط شرایط کشت به کار گرفته شده در آزمایشگاه را م سنجش قرار داده است در این نع ارزیابیها در صرت مشاهده تفاتها ادامه رند مطالعه متقف میشد. با تجه به ماهیت این مقایسات تیدی در ارتباط با ارزشمندی این رش برای آزمایشگاه یا بیارزش بدن آن جد ندا. در نهایت پس از اتمام ارزیابی معمال یک برنده در این رش ارزیابی جد خاهد داشت. آیا چنین مطالعاتی میتاند مطالعات منتر شده را تایید نماید ایننکته که آیا امکان تکرار دقیق تمام عامل دخیل در یک آزمایش در آزمایش دم نیز امکان پذیر میباشد یا خیر جای مناقشه دا در بسیاری از ما این نتایج فقط برای یک آزمایش کلینیکی منحصر به ف قابل تصیه میباشد. مسئله بسیار پیچیده در تنظیمات ART انسانی مضع فرمالسین محیط کشت است. چرا محیط کشت A بهتر ازمحیط کشت B است به علت اینکه اجی مجد در محیط کشت A در غلظتهای خاصی ارایه شدهاند یا اینکه استفاده از محیط کشت A نسبت به محیط کشت B به دلیل حمایت از مکانیسمهای مناسب بیشیمیایی فیزیلژیی منجر به تکین بهتر در ریه کشت برنتنی ریان انسان می- شد. در اقع بخش عمدهای از مقاالت شامل مقایسات الیهای از تالشهایی هستند که برای حصل نتیجه صرت میگی که تنها میتاند از طراحی اجرای مقایسات با سال دم در ذهن مشتق شده باشد. پیچیدگی مقایسات فرملهای خاص محیط کشت در ایجاد ریانهای انسان به ضح در مقاالتی که ماهیت استداللهایشان بر پایه حمایت از یک فرمل در برابر دیگری است ایجاد شده است. آیا محیطهای فرمله شدهای که سعی در شبیهسازی اناع مقادیر متابلیتهای مجد در دستگاه تلید- مثلی را دارند عملک بهتری نسبت به محیط کشت فرمله شدهای دا که فقط پاسخهای ایجاد شده از سی ریان در محیط کشت مربط به دستکاری در یک ملفهی خاص را م تجه قرار میدهد آیا محیطهای تسعه یافته در یک سیستم با ریک استفاده از مدل حیانی برای تعمیم نتایج به ریانهای انسان قابل اعتماد است دلیل برجسته برای مطرح نمدن چنین مضعی این است که تاکنن هیچ محیط کشت مشخصی به طر اختصاصی از همان ابتدا برای رشد برنتنی ریان انسان فرمله نشده است بلکه تمامی محیطهای کشت ابتدا برای استفاده در مدلهای حیانی طراحی شده سپس در مدل انسانی م استفاده قرار گرفته است. هدف این فصل تمرکز بر مطالعاتی است که بسیاری از ساالت کلی در ارتباط با شناسایی فرمالسین محیط کشت با در نظر داشتن شبیهسازی شرایط فیزیلژی طبیعی را مد نظر داشته منجر به زنده ماندن ریان انسان پس از انتقال به رحم پذیرندگان شده است. 232

299 3-24. چه ضررتهایی دریک مرکز ART برای مقایسه معتبر د محیط کشت جد دا بسیاری از مراکز ART در مقعیتی نمیباشند که بتانند مقایسهی معنیداری ازفرمالسین د محیط کشت داشته باشند. مفقیت در ریه تلیدات برن تنی ریان انسان شامل تعامل پیچیده ای از انتخاب بیمار تصمیمگیری کلینیکی تحقیقاتی تجربه تخصص کلینیکی عاله بر تجربه آزمایشگاهی است. برنامهها با نرخ مفقیت متسط یا کمتر از متسط به احتمال زیاد فاقد قدرت افتراقی برای شناسایی چنین تفاتهایی هستند. بنابراین آیا مرکزی که به طر مدام دارای نرخ مفقیت باال است نشان دهنده کیفیت کلی مرکز است اگر پاسخ بله است آیا مرکز دارای حجم کافی جهت تامین تعداد مناسبی از بیماران با تجه به ضابط م نظر در مطالعه است به گنهای که بتان در یک بازه زمانی منطقی به طر تقریبا همزمان بررسی مطالعه را انجام داد. آیا پرتکلهای تحریک تخمدان به طر مشابه تسط کارکنان کلینیک تجیز شدهاند آیا تضمین کیفیت کلینیکی مدام کنترل کیفیت برای مدرک بررسی ریه ثابت م نیاز در درمانگاه جهت نشان دادن اختالفات با تجه به ملفههای آزمایشگاهی در طل مدت مطالعه جد دا نکته مهم دیگر این است که چگنه محیط کشت مجد در مرکز آزمایش نسبت به عملک گذشته آن در مقاالت م مقایسه قرار میگی. برای مثال اگرنرخ عملک محیط کشت B در مطالعه صرت گرفته تسط شما به عنان مرکز %21 ART بد اما از نظر تاریخچهای در مطالعات دیگر %23 بده آیا این اختالفات در عملک A B در آزمایش شما بازتاباننده نامطمئنی از ترکیبات محیط کشت است در حقیقت این احتمال جد دا که این تفات بنا به دالیلی غیر از ترکیبات فرمالسین محیطهای کشت م آزمن باشد. مرکز آزمایش کننده تنها در صرتی باید اقدام به مقایسه محیط A B کند که نشان دهد بهینهسازی الیه در هر د محیط کشت با تانایی بالقه مربط به د محیط کشت که در مقاالت ثبت شده است انجام شده دقیقا تمامی استانداهای ریه ART منطبق بر ما مذکر در مقاالت مرتبط میباشد. اگر یک فرمل جدید که به صرت تجاری در دسترس نیست با محیط کشت کنترل مجد که به صرت تجاری قابل دسترس است م مقایسه قرار گی عملک محیط کشت کنترل باید برابر با عملک مطلب آن در مطالعات قبلی ثبت شده باشد. اضح است که مقایسه یک محیط کشت جدید با محیط کشت کنترل مجد در شرایطی که محیط کشت کنترل مجد به صرت نامناسب م استفاده قرار گرفته هیچ ارزشی نخاهد داشت. این به عنان یکی از مشکالت مکرر در گرشهای منتشر شده از مقایسات محیط کشت است که تا به امرز همچنان ادامه دا عناصر طراحی یک پژهش معتبر برای مقایسه د محیط کشت چه چیزهایی هستند جداسازی فرمالسین محیط کشت به عنان تنها متغیر مسئل برای یک نتیجه کامال متفات در ART انسانی حتی اگر امری ممکن باشد اما کاری بسیار دشار است. برخی از فاکترهایی که تحت تاثیر پیامدهای بیرنی آزمایشگاه IVF هستند در جدل )4-24( قرار داده شدهاند )تقریبا 21 فاکتر(. عامل درن آزمایشگاه که درهمه ما IVF حضر دارند در جدل )24-2( قرار داده شده اند )تقریبا 99 فاکتر( رشهای کمکی مخصص آزمایشگاه برای انجام IVF معمل در جدل )3-24( آه شده است )تقریبا 93 فاکتر(. خارج از 233 فاکتری که میتاند بر نتایج تاثیر بگذا فرمل محیط کشت ریان یکی از عامل مثر است. طراحی مطالعه برای برقرار شدن ثبات در بین تعداد زیادی متغیر امکانپذیر میباشد البته در رند طراحی چنین مطالعهای میبایست ما زیر را در نظر گرفت: الف( معیارهای مربط به بیمار: معیارهای محدد کنندهای مانند سن تشخیص بیماری BMI ذخایر تخمدانی اقدامات قبلی صرت گرفته در نتایج IVF برای کاهش تغییرات بسیار ضرری است. در اقع این معیارها نه تنها باید زنان بلکه مان را نیز شامل شد چرا که پارامترهای اسپرم نیز ممکن است بر ریانهای حاصل مثر باشد. ب( آیا تخمکهای اهدا شده شامل مطالعه خاهند شد بسیاری از مراکز احساس میکنند که تخمکهای اهدا شده دارای بهترین سابقه )پیشینه( هستند که برای انجام چنین مطالعاتی تهیه شدهاند اما آیا آنها شاخص مناسبی از جمعیت جهت آشکارسازی تفاتهای بسیار جزیی که بین زجهای نابارر جد دا هستند ریانها زمانی که از بسترهای متابلیکی متناب مسیرهای تحت شرایط بهینه استفاده میکنند رشد انعطاف پذیر قابل تجهی را نشان میدهند. ممکن است که ریانهای مشتق شده )ایجاد شده( از تخمکهای اهدا کنندگان جان دارای ظرفیت بیشتری برای شکل پذیری باشند در نتیجه به دقت 239

300 نمیتان ضعیت فیزیلژیی به خطر افتادهی ریانها را به عنان شاخصی از اناع مختلف نابارری درنظر گرفت. به همین دلیل اگر تخمکهای اهدایی مد نظر است باید به عنان زیر مجمعهای از شاخصهای م نظر در مطالعات مقایسهای پیش از تعمیم دادن نتایج با تجه به محیط کشت ساخته شده به دقت م بررسی قرار بگیرند. ج( عملک کلینیکی یکسان شامل محددیت در تعداد پرتکلهای محرک تخمکریزی به کار گرفته شده اتخاذ استراتژی احد برای اجرای پرتکل معیارهای خاص برای تحریک تخمکگذاری استفاده از پرتکل مناسب محرکهای استاندا شده یکسانسازی منابع دار باشد. عاله بر این میتان با محدد کن تعداد پزشکان در این مرحله از پژهش مین تغییرات در تخصص انتقال ریان را به حداقل رساند. د( ثبات یکناختی در دیگر اجی سیستم کشت از جمله حجم کشت زمان تعادل محیط کشت ph رطبت فاز گازی بازکن یا بستن انکباتر حجم هر انکباتر پشش رغن تراکم ریان تغییرات محیط کشت فاصله تلقیح تراکم تلقیح نیز به عنان معیارهای تاثیر گذتر میبایست م تجه قرار بگیرند. ( مهارتهای فنی آزمایشگاهی: نباید تصر ک که مهارتهای فنی کارکنان آزمایشگاه یکسان است مگر اینکه آنها از طریق تستهای مهارت مستند در مراحل خاصی از کشت ریان که آن ها در آن قسمت دخیل هستند مانند محیط کشت یا آماده سازی کشت اندازه گیری شند. ه( دره پژهش: یکی از بهترین راهها برای محدد کن متغیرهای معرفی شده در کلینیک آزمایشگاه برای یک آزمایش تصادفی آیندهنگر استفاده از ریانهای هم نژاد در طی یک دره تحقیقاتی کتاه مدت است. درههای طالنی به خصص در ترکیب با آنالیزهای گذشته 318 نگر به ناچار متغیرهای کنترل نشدهای را ا نتایج میکند که میتاند به راحتی اختالفات کچک در نتایج را از بین ب. ی( آیا پژهش باید شامل عملکهای بیشتر ریانهایی که در معرض انجماد ذب انتقال قرار گرفته اند باشد چنین پژهشهایی بسیار سدمند بده اثرات کلی محیط کشت را بر رند تکین ریان را منعکس مینمایند. اعتبار صحت نتایج تنها زمانی میتاند م تایید باشد که تمام ارزیابیهای مربط به نقاط عطف تکین ریان به درستی تنظیم شده باشند. صحت اعتبار سنجی نتایج چنانچه نقاط عطف ارزیابی تکین ریان فقط شامل معیارهای ظاهری مرتبط با تکین ریان باشد دارای اهمیت بسیی خاهد بد. اگرچه این نقاط عطف میتاند به عنان تافق خبی در ارزیابی- های مرفلژیکی از سی ریانشناسان به حساب آید )4( لی نباید به عنان معیارهای نهایی م تایید پذیرفته شند. ظاهرا ارزیابیهای مرفلژیکی ساده میتانند کامال بطر متفات بین ریانشناسان دیده شد )2 3( که به اشتباهات نع I نع II در آنالیز دادهها منجر میشد. اگر ادعا میشد که یژگیهای خاص مرفلژیکی یا طبقه بندیهایی از این قبیل میتانند نشان دهنده میای کلینیکی در رند تلید برنتنی ریان باشند اقدامات آماری جهت تعیین اعتبار این نتیجهگیریها میبایست اجرا شد. در نهایت آزمنهای آماری مناسب برای ماهیت دادههای منتشر شده در مطالعه باید به کار گرفته شد. برای ایجاد قدرت آماری بیشتر الزم است که تعداد بیماران بیشتری ثبت نام شند ماد تسهیالت م نیاز در زمینه طب تلید مثل 4- خدمات کامل ارایه شده مرکز لقاح آزمایشگاهی با حجم کافی برای ثبت نام بیماران منطبق با معیارهای م نظز در آزمایش 2 - التراسنگرافی 3- امکان دسترسی به سنجش هرمنها آزمایشگاه را قادر میسازد که مقادیر FSH استرادیل پرژسترن بتا hcg سرم را اندازه گیری کنند. 1- امکانات بازیابی تخمک با داشتن میز مناسب جهت اقدامات الیه ری اسیتها التراسنگرافی پمپ مکش بلکهای گرمایشی یا سطحهای گرم از جمله تجهیت الیه الزم مراکز مربط میباشد. 3- تجهیت الزم برای تجیز آرام بخش داخل ریدی که شامل اسطههای مناسب تزریق مانند )Midazolam( defibrillator Diprivanpulse oximeter benzodiazepine میباشد. 2- سزنهای بازیابی تخمک راهنمای نمنه باری برای مبدل ترانس اژینال سند انتقال ریان 0- دسترسی به هیئت داران به منظر تایید تحقیقاتی که م آزمایشی در آن تحقیق انسان میباشد. این م فقط زمانی الزم است که کشت برنتنی ریان م نظر باشد. retrospective analyses 231

301 2-24. تسهیالت م نیاز آزمایشگاه IVF 4- کلیهی خدمات آزمایشگاه IVF هفت رز هفته تسط کارمندان مجهز ارایه شد. 2- یخچال هد المینار / جایگاه انجام کار انکباترهای سه گازه یا ارتقا انکباتر به گنهای که بتاند از گاز پیش مخلط استفاده نماید اسممتر ph متر منبع گاز دیاکسیدکربن نیترژن یا ترکیبی از گازهای سه گانه با در صدهای %3 CO %3 ها %81 2 N. 3- کنترل ظرف پالستیکی یکبار مصرف برای کشت ریان که شامل ظرف 21 mm 411 mm ظرف کشت )ظرف مخصص کشت ریان ظرف با چاهک در مرکز ظرف چهار چاهکی غیره( پیپتهای 41 ml پیپت پاستر پیپتهای انتقال پیپتهایی با منافذ کچک با دستگاه تزیع. 1- کنترل محیطهای کشت ذخیرهسازی آنها در دمای مناسب تصیه شده. 3- کنترل مکملهای پرتئینی ذخیرهسازی آنها در دمای مناسب تصیه شده تسط کارخانه سازنده. 2- کنترل رغن استریل شده برای کشت ریان 0- میکرسکپ استری جهت بارگیری بازیابی اسیت 9- میکرسکپ اینرت با کنتراست تلفیقی Hoffman یا میکرسکپهای اپتیکی )نری( معادل میکرسکپها باید قابلیت گرفتن تصایر را داشته باشند. 8- دسترسی به دادههای ردی/ مدیریت/ ذخیره سازی تجهیت. 41- دسترسی به نرم افرهای آماری برای خدمات تحلیلی آماری رشها یک آزمایش ساده )شکل 4-24( برای مقایسه تمام تفاتهای تزیعی درجات کیفیت ریانهای کشت داده شده در محیط کشت کنترل )A( در مقایسه با محیط کشت آزمایشی )B( در رز سم رشد پس از تلقیح طراحی شد. عاله بر این چندین گزینه برای محاسبه اندازه اثر تخمین اندازه نمنه در آنالیزهای قی آماری داده شده است. همچنین گزینههایی برای تخمین اثرات درجه کیفیت بر بااری کلینیکی به دنبال انتقال ریان در رز سم )شکل 2-24( یا براساس تزیع درجه کیفیت بااری پس از تسعه یافتن ریانه یا کشت شده در رزهای پنجم یا ششم )شکل 3-24( طراحی سپس گسترش یافته است. پیشنهاداتی برای اندازه گیری تغییرات مشاهدات درنی بیرنی تسط ریه آماری کاپا )kappa( معرفی شده است بیماران 4- مادران کمتر از 33 سال سن که تحت درمان IVF ابتدایی برای نابارری ناشی از اختالل در تخمک گذاری فاکترهای لله رحمی فاکتر مانه قرار گرفتند. 2- زنان با FSH باال در رز سم 41mIU/mL( >( تخمدانهای پلی کیستیک اندمتریز عامل نابارری رحمی از مطالعه حذف شدند همچنین مانی که دارای مجمع اسپرمهای متحرک کمتر از در هر میلی لیتر بدند از مطالعه حذف شدند. 3- همهی بیمارها میبایست رضایتنامه را امضا کنند کمیسین بررسی سازمانی مجاز تمامی پرتکلهای م استفاده در محیطهای کشت پژهشی را تایید نماید )مشاهده نکته 4( طراحی پژهش 4- مطالعه باید یک مقایسه آیندهنگر از ریانهای تک سللی همنژاد به صرت تصادفی در یک یا د محیط کشت )A کنترل B آزمایشی( بعد از بررسی لقاح در ساعت 49 پس از تلقیح یا پس از تزریق داخل سیتپالسمی اسپرم )ICSI( باشد )مشاهده نکته 2(. 2- اسیتها در یک محیط استاندا لقاح برنتنی را سپری مینمایند محیط کشت لقاح حای بافر بیکربنات مقادیر حداقل گلیسین تائرین فاقد EDTA باشد. مکمل پرتئین میبایست فقط آلبمین باشد یا با ترکیبی از آلفا بتا گلبلین با غلظتهای نهایی 3-3 میلی گرم در هر میلیلیتر در کل پرتئین باشد. تلقیح با تقریبا اسپرم دارای حرکت پیش رنده در هر میلیلیتر انجام میشد. تخمک ICSI شده در محیط کشت مشابه با محیطی که رند ICSI در آن انجام شده است پس از تزریق تا بررسی لقاح کشت داده خاهد شد. برای این مثال تنها بیمارانی که ده یا بیش از د پیش هسته یگت را تلید میکنند م مطالعه قرار داده شدند. به طری که حداقل پنج یگت به هر محیط کشت اختصاص داده شد. مراکزی که بیماران را برای پژهش انتخاب میکنند اگر دارای بیمارانی باشند که یگتهای کمتری تلید میکنند باید تنظیماتی را ایجاد کنند که حجم نمنهها را برآ که دارای قدرت تجزیه تحلیل باشد. 3- سطح CO 2 انکباتر باید با 235

302 تجه به مقادیر ph منظر که با هر محیط کشت سازگار است با تجه به تصیههای سازنده تنظیم شد یا از مقادیری از گاز دیاکسیدکربن استفاده شد که در مطالعات الیه رشد ریانی بهینه شده در آنها بدست آمده باشد. برای اطمینان از مسای بدن تعداد ردیهای انکباتر در طل دره مطالعه تعداد مسای از اتاقکها باید به هر محیط کشت اختصاص داده شد. فشار اکسیژن در تمامی اتاقکها در %3 تنظیم شد. مراحل کنترل کیفیت آزمایشگاه استاندا شامل چک کن عملک رنه تمامی تجهیت انکباترها باید در طل دره مطالعه انجام شد. مهارت فنی کارکنان آزمایشگاه برای کشت ریان باید قبل در طل مطالعه اندازه گیری شد. 1- ریانها براساس درجه کیفیت در رز سم کشت در یکی از چهار گره امتیاز بندی شدند. ممکن است مراکز شخصی این دسته بندی را با استفاده از معیارهای انتخابی خد اما نه محدد به آن تعریف کنند که شامل: مرحله سلل تقارنسللی اثر متقابل سلل با سلل ضح سیتپالسمی تکه تکه شدن دانه دانه بدن سیتپالسم غیره است. نمنههای تصیری از طراحی مطالعات در شکل )4-24( که نشان دهندهی تشخیص چهار درجه کیفیت متمایز ریانها در رز سم است اما معیاری برای هر درجه تعیین نشده است آمار 4- قدرت آماری تخمین حجم نمنه. استفاده مناسب از رشهای آماری برای قدرت مقایسات آنالیز دادههای بدست آمده شامل استفاده از یک مجمعه خاص از مفرضات است. برخی از افراد ممکن است در برخی از تنظیمات نسبت به دیگران اقع بینانهتر عمل کنند. به همین دلیل ما د راه جایگزین برای برآ حجم نمنه اهمیت نتایج ارایه داده ایم. 2- درجه بندی تغییرات مشاهده شده با آمار کاپا. تعیین کمیت تکرارپذیری سیستم درجه بندی چهار سطح کیفیت برای تصایر ریانها تیمار شده که در رز سم به کار گرفته شده تسط آمار کاپا محاسبه میشد )1(. برای کنترل گرایش آزمنگر یک سیستم باید تسط ارزیاب الیه برای سلسله ارزیابیهای اضافه ایجاد شد. اگر چه د محقق برای تایید اعتبارات ارزیاب الیه کافی خاهند بد سه محقق ترجیح داده میشد زیرا یک مقدار تافق برای هر درجه از تصیر میتان دید. برای تعیین اینکه هر ارزیاب برای آزمن ارزیابی به درستی تعلیم داده شده است از تصایر ریانها که برای درجندی م استفاده قرار گرفتهاند باید دبار با استفاده ازد ترتیب تصادفی مختلف تسط هر ارزیاب م بررسی قرار بگی. برای هر جفت از درجات آزمنگر آزمنگر داخلی کاپا باید محاسبه شده برای هر جفت از آزمنگرها آزمنگرهای میانی کاپا براساس مجمعه الیه درجات تسط هر آزمنگر باید محاسبه شد. برای مقایسه تزیع درجات کیفیت محیطهای کشت A B آزمن Mann Whitney U استفاده شد. برای مقایسهی نسبت یگتهای محیط کشتهای A B که سرانجام به تلد زنده ختم شدند آزمن Z نسبت انجام میشد. 3- محاسبات قی برای تعیین دقت ارزیابی نمنهها برای شماری از زجهای م نظر با استفاده از نرم افر PASS 44 انجام شد UT(.)NCSS Inc., Kaysville, این محاسبات بر پایه فرضیه زیر استار است: )4( هر زج ده یگت خد را اهدا کند. )2( چهار درجه کیفیت به همان اندازه برای کل مجمعه تصایر یگت رز 3 تقسیم شد. )3( برای جمعیت محققین تصایر رز 3 یگت تحت آزمنگر داخلی کاپا تحت فرضیه صفر برابر با 1/8 آزمنگر میانی کاپا تحت فرض صفر برابر با 1/9 است. )1( برای آزمن Mann Whitney U استفاده از درجات کیفیت برای محیط کشتهای A B تحت فرض صفر مسای است. )3( برای آزمن Z نسبت محیطهای A B تحت فرضیه صفر دارای نسبتهای برابری از یگتهایی بدند که منجر به تلد زنده میشدند. )0( تان )قدرت( در 1/8 تنظیم شده )0( آلفا )شرع( در 1/0 تنظیم شده است. جدل 1-24 فهرستی از حد پایین فاصله اطمینان %83 براساس برآهای نقطه ای از 1/8 برای اعتبار آزمنگر داخلی 1/9 برای آزمنگر میانی است. جدل 24-3 فهرستی از تفاتهای معنی دار بین محیطهای A B است که تسط آزمن Mann Whitney U اختالف نسبت بین محیطهای A B تسط آزمن Z نسبتها قابل تشخیص است. همانطر که دیده میشد نمنهی استفاده شده از پنج زج برای تشخیص آزمنگر داخلی کاپا از 1/0 که پایینتر از 1/8 است کافی نبده برای تشخیص تفات نسبت تلد زنده که کمتر از 1/1 است کافی نمیباشد. در مقابل مزیت کم یا هیچ مزیتی برای افیش نمنههای به کار گرفته شده از 31 نمنه به 11 نمنه جد ندا. 1- د متغیر طبقه ترتیبی احتماالت نسبی. هنگام آنالیز دادههای طبقه ترتیبی اگر دسته بندیها دارای د 236

303 بخش هستند باید رشهای آماری برای د نسبت م استفاده قرار بگی. در حضر بیش از د دسته منظم شده دادهها را می- تان با استفاده از آزمن Z نسبت یا بسیلهی رگرسین لجستیک یا آزمن Mann Whitney با فرض احتماالت نسبی م آنالیز قرار داد. مدل احتماالت نسبی فرض میکند که لگاریتم نسبتهای احتماالت کالسهای تجمعی که همگی با چند ثابت مشترک که ʎ گفته میشد در عرض کالسها جد دا برابر هستند. از این ر بدن در نظر گرفتن تعداد دستهها تنها پارامترʎ کل الگی تفاتهای اکنشی بین گره کنترل )به عنان مثال محیط کشت A( گره آزمایشی )به عنان مثال محیط کشت B( را خالصه که است. به عنان مثال مقدار مثبت ʎ نشان میدهد که گره آزمایشی نتایج بهتری را نسبت به گره کنترل ارایه میدهد. درحالی که مقدار منفی نشان دهندهی عکس قضیه است. از آنجا که کمیتهای ʎ مزیت گره آزمایشی برگره کنترل است مقدار آن نیز اندازه اثر شناسایی شده به منظر قدرت آنالیز را نشان میدهد. در م منابع برای 331 محاسبهی حجم نمنه همچنین آنالیز جامع اطالعات دسته بندی شدهی گرهی خانندگان عالقه مند باید به Whitehead )3( Agresti )9( Machin 0( )2 )8( Julious رجع کنند. 3- قدرت آماری حجم نمنه. برای فرملهای آماری این پژهش در فرضیه صفر است که اثرات د محیط کشت مختلف با هم برابر هستند )یعنی = l H( :. به این معنا که اثر متفات د محیط کشت در به ثمر رسیدن ریانها در رز سم اثری ندا. همچنین آلفا )α( که به عنان سطح معنیدار شناخته شده به طر قرار دادی 1/3 در نظر گرفته شده است به این معنی که تقریبا یک آزمن از بیست آزمن به اشتباه فرضیه صفر را خاهد ک. این نشان دهنده احتمال خطای نع ال بده زمانی رخ میدهد که یک فرضیه صفر درست را ک. مجمعه آلفا حداکثر خطری است که یک محقق برای آزمایش فرضیه صفر در آزمایشات خد متحمل میشد. برای یک رش محافظه کارانه دقیقتر آلفا را میتان در 1/14 تنظیم ک که در این آنالیز نیز در نظر گرفته شد. از طرف دیگربتا )β( احتمال خطای نع دم است هنگامی رخ میدهد که فرضیه صفر نادرست بده نیز نمیشد. قدرت احتمال یک فرضیه صفر غلط است برابر با β-4 است. د مقدار متفات قدرت 1/9 1/8 در این آنالیز )جدل 2-24( در نظر گرفته شد. عاله براین مشخص شده است که نسبت پاسخ گره کنترل )به عنان مثال محیط کشت A( حدد %31 در درجه یک %31 در درجه د %21 در درجه سه %21 در درجه چهار است جایی که کچکترین مقدار درجه بهتر است. از آنجا که مطالعات بر شناسایی بین درجات کیفیت ریانه یا د محیط کشت مختلف متمرکز شده است نتایج برای یک آزمن د طرفه در جدل زیر با طیف سیعی از مقادیر برای لگاریتم نسبت احتماالت ʎ از 1/3 تا 4/3 نشان داده شده است. برای راحتی کار فرض میشد که تعداد برابری )n( از ریان در هر د محیط جد دا. در جدل 0-24 نسبتهای پاسخ فرضی گره آزمایشی )به عنان مثال محیط کشت B( تصیف شده که منجر به نسبت لگاریتمی احتماالت ʎ میشد. از جدل 2 میتان دید که برای تشخیص اندازه اثر )یا لگاریتم نسبت احتماالت( حداقل 1/3 در سطح %3 معنی داری با قدرت % ریان برای هر محیط کشت منیاز خاهد بد یا 142 ریان برای هر د محیط کشت نیاز است. در این شرایط از 14 زجی که در آزمایش شرکت داده شدند از هر زج ده یگت جمع آری شد. اگر در عض از آزمن یکطرفه استفاده شد اندازه نمنهها کمی کچکتر خاهد شد به طر کلی به عنان یک محقق که در آرزی تشخیص یک اندازه اثر کچک میباشد اندازه بزرگتر نمنهها برای رسیدن به قدرت منظر سطح ثابت معنیداری م نیاز است. باید تجه داشت که این متن ساده شده آنالیزها براساس فرضیات خاص است که در جهت تایید اعتبار رشهای آماری میباشد. با این جد اگر این آزمایش شامل فرضیههای متعدد با پارامترهای بیشتر برای انعکاس تنظیمات تجربی با لحن بهتری باشد سپس اندازه بزرگتر نمنهها از آنچه که در جدل 3-24 ارایه شده است قطعا برای کنترل کل سطح معنی داری α ضرری خاهد بد. 2- تخمین قدرت آنالیز اندازه نمنهها برای یک مطالعه گسترش یافته به منظر تشخیص اختالفات کلی در نرخ ندان زنده متلد شده در میان چهار درجه کیفیت ریان. قطعا قابل تصر است که ترکیب محیط کشتهای مختلف منجر به تزیع متفات درجات کیفیت در رز کشت شده است اما به هیچ عنان به این معنا نیست که انتقال ریانهای تلید شده در یک محیط کشت نرخ آبستنی متفاتی از انتقاالت ریان از سایر محیطهای کشت دا. باید نشان داد که انتقال یک ریان یا تعداد برابری از ریانها با درجه کیفیت یکسان که نرخ آبستنی به عنان تابعی از درجه ordered categorical 237

304 کیفیت متفات است. در زیر این نع آنالیزها م تجه قرار گرفته است. برای یک نتیجه گیری ریاضی فرض بر این است که تمامی یگتها بدن در نظر گرفتن زجین از یک جمعیت مشابه به طر جداگانه نمنه باری شدند. در رز سم کیفیت هر ریان در یکی از چهار درجه کیفیت طبقه بندی مجمعه ای از انتقاالت ریانهای تکی به هر درجه انجام شد. سپس مشاهده شد که آیا زنان باارهستند یا نه اگر باار هستند آیا بااریشان همچنان ادامه دا. نرخ النه گزینی)درصد( بسیله نسبت تعداد کیسههای داخل رحمی )النه گزینی( به کل تعداد ریانهای انتقال داده شده به هر گره از درجات کیفیت تخمین زده 2 میشد. 0 -آزمن کای اسکار برای GOF اندازه اثر. آزمن مجذر کای ( χ( یکی از محببترین آزمنهای آماری برای آنالیز دادههای طبقهای بده معمال برای تست اینکه آیا مجمعهی فراانیها نسبتها الگی خاصی را دنبال میکند انجام میشد. به منظر برآ حجم نمنه م نیاز برای رسیدن به یک قدرت آماری خاص مفهم اندازه اثر ɛ معرفی شده است. میتان گفت که آن مقدار آماره آزمن را اندازه گیری میکند. برای آزمن کای اسکار )41( Cohen فرمل اندازه اثر را معرفی ک که به اندازه نمنهها بستگی نداشته دارای مقدار کچکی 1/4 ɛ مقدار متسط 1/3 مقدار بزرگتر یعنی 1/3 را تعیین ک. از آنجا که آزمن کای اسکار بر اساس تزیع آماری کای اسکار تسعه یافته است درجه آدی )df( برای تزیع صفر نیز 334 مشخص شده است. برای آزمدن تناسب شایستگی درجهی آدی یکی کمتر از تعداد طبقات یا دسته است. خانندگان عالقهمند برای محاسبه اندازه نمنه همچنین آنالیز جامع اطالعات طبقهای میتانند )2 0( Agresti را مطالعه کنند. 9- قدرت آماری حجم)اندازه( نمنه. برای فرمل آماری این پژهش فرضیه صفر است که مین ندان زنده متلد شده در ریانهای انتقتا در هر چهار درجه کیفیت ثابت میماند )یعنی H(. 1 π4: = π 2 = π 3 = π1 به این معنی که اثر دیفرانسیلی)تفاتی( برای ایجاد تلد زنده مفقیت آمیز جد ندا. سطح معنی داری برای آلفا )α( به طر قراادی 1/13 در نظر گرقته شده است به این معنی که یک آزمن از بیست آزمن فرضیه صفر را به غلط میکند. این ضعیت نشان دهنده احتمال خطای نع I بده هنگامی رخ میدهد که یک فرضیه صفر درست را ک. مجمعه آلفا حداکثر خطری است که یک محقق برای آزمایش فرضیه صفر در آزمایشات خد متحمل میشد. برای یک رش محافظه کار دقیقتر آلفا را میتان در 1/14 تنظیم ک که در این آنالیز نیز در نظر گرفته شد. از طرف دیگر بتا )β( احتمال خطای نع دم است هنگامی رخ میدهد که فرضیه صفر نادرست بده نیز نمی شد. قدرت احتمال یک فرضیه صفر غلط است برابر با β-4 است. د مقدار متفات قدرت 1/9 1/8 در این آنالیز )جدل 2-24 ( در نظر گرفته شد. نتایج حاصل از آنالیز در جدل نشان دهنده طیف سیعی از اندازه اثر ɛ از 1/4 تا 1/3 است. تعداد نمنهها )n( نشان دهنده تعداد کل ریانهایی که در رز سم به چهار درجه کیفیت منتقل شده بسیله 2 2 نسبت کای اسکار ( χ( به جذر اندازه اثر ( ɛ( محاسبه میشد. از جدل 9-24 میتان دید که اندازه اثر 1/4 در سطح معنی داری 1/13 با قدرت %91 در کل 4184 انتقال ریان م نیاز است. در ادامه محیطهای کشت در رزهای 3 2 به منظر ارزیابی تلید بالستسیت عمق پیچیدگیهای کیفی قدرت تخمین اندازه نمنه مقایسه شدند تغیرات مشاهده شده با سیستم آماری کاپا ارزیابی شد بررسی دقیق از نتایج بااری انجام شد. شکل 3-24 این نکته را نشان میدهد. سیستم درجه بندی گانر )به نکته 3 نگاه کنید( بیش از بیست درجهی کیفیت را میتاند از طریق رتبه بندی مین تشکیل تده سللی داخلی ترفبالستهای حاصل در مرحله گسترش یافته در حال هچ شدن مشخص میکند. جدل 8-24 نتایج آنالیز با فرض یک طبقه بندی )ه بندی( دقیقتر ریانها به یکی از هفت گره النه گزینی قبل از انتقال رانشان میدهد. با طبقه بندی بهتر اندازهی )حجم( نمنه افیش قابل مالحضهای به منظرتشخیص اندازهی اثر داشت نتیجه گیری اضح است که جداسازی آزمایشی فرمل محیط کشت به عنان تنها متغیر مثر برای تغییر در نتایج IVF بسیار دشار بده به احتمال زیاد در شرایط کلینیکی تحقیقاتی غیر ممکن است. هدف از ارئه این رش شناختن بسیاری از عامل مداخله گر که اغلب نادیده گرفته میشند میباشد ( نکته 1 مشاهده شد(. با تجه به دالیلی که در اینجا ارایه شده است بسط دادن Goodness of fit 238

305 پژهشی که شامل نتایج بااری است اغلب سریعتر آسانتر است که ارزیابی ساده اثرات بالقه محیط کشت پس از اقدامات آزمایشگاهی همانند مین تشکیل سلل درجه مرفلژیکی باشد. تا به امرز هیچ مطالعه ای در این زمینه که شامل محاسبات کاپا برای تغیرات مشاهدات درنی بیرنی باشدبه انجام نرسیده است. رشهای متعدد در دسترس برای محاسبه قدرت برآ حجم نمنه جد دا که همچنین به عنان یک کار اساسی قبل از انجام مقایسه محیطهای کشت م استفاده قرار میگی نکات 4. شرایط الزم برای بیماران جهت تلید ده یگت به منظر رد به مطالعه تضمین خاهد ک که بیشتر بیماران در یک پرتکل طالنی خاهند بد با استفاده از آگنیست هرمن آد کننده گنادترپین )GnRH( در فاز لتئال قبلی یا با استفاده آنتاگنیستهای GnRH در فاز فلیکلی Gardner.2 )44( Lane سیستم درجه بندی بالستسیت در فاز تسعه یافتن را بیان کند. این سیستم حرفی-عددی که با استفاده از یک شماره شکل گیری گسترش حفره بالستسیتی همچنین مرحلهی بالستسیست در مرحله هچ شدن را نشان میدهد. به سیله د حرف )A B یا C( که به ترتیب تصیفی از نظر مین تشکیل سلل در تده سلل خطی ترفبالستهای حاصل است را نشان میدهد. هر بالستسیتی که در درجه C برای هر نع سلل درجه بندی شده کیفیت پایین در نظر گرفته شده است. 3. احتساب تمام متغیرها ابسته عاله برفرمل محیط کشت میتاند بر نتایج سیکل IVF مثر باشد که این امر تصر الیه دکتر Don Rieger ازگئلف کانادا بده همچنین بخشهای زیادی از محتای جدال 4-3 را بیان که که از بابت این کمک به ایشان مدین هستیم. جدل عاملی که خارج از آزمایشگاه بر نرخ مفقیت لقاح برن تنی تاثیر گذار هستند. نع عامل بیمار زن م بیمار م بیمار زن عامل مثر سن سالمت عممی سابقه پزشکی مصرف الکل سیگار سمم محیطی که در تماس با بیماران است دار مصرف شده میل جنسی فاصله بین نزدیکی ضعیت هرمنی دستگاه تلید مثل دره چرخه جنسی ذخیره تخمدانی تالشهای پیشین برای انجام لقاح برنتنی سابقه جراحی دسترسی به تخمدان برای سزن نمنه باری آناتمی رحم سریکس کیفیت جسم ز تحریک تخمدان اتاق عمل انتقال ریان پرتکل م استفاده برای تحریک تحمدان از نظر طل دره نع دارهای م استفاده در پرتکل مین افیش استرادیل نع سزن آسپیره کننده فلیکل لله جمعآری اسیت صهحه بلکهای گرم کننده طل مدت بازیافت اسیت ماد ضد عفنی کننده م مصرف ماده م استفاده برای القای رند بیهشی کیفیت ها تخصص جراح ماد ضد عفنی کننده لله انتقال ریان مدت زمان ضعیت مثانه رحم از نظر انقباضات مهارت جراح حمایت جشم ز از آبستنی جدل عاملی که داخل آزمایشگاه بر نرخ مفقیت لقاح برن تنی تاثیر گذار هستند. نع عامل محیطهای کشت تجهیت دسترزی کیفیت ها عامل مثر محیط کشت صحیح برای هد ف م نظر استریل بدن محی ط کشت آزمن سنجش اندتکسینها آزمنهای زیست سنجی کیفیت محیط کشت شرایط ذخیره سازی محیط کشت مقدار نع آنتی بیتیک م استفاده مقدار نع پرتیین م استفاده در محیط کشت مین متعلدل نمدن محیط کشت در انکباتر پیش از مصرف ph اسمالریته محیط کشت دما استریل بدن نشت گاز آزمن سنجش اندتکسینها آزمنهای زیست سنجی کیفیت های بیرن آزمایشگاه کیفیت های داخل آزمایشگاه کیفیت های انکبات ر جمعآری منی آمادهسازی اسپرم لله جم عآری شرایط انتقال نمنه زمان دما آلدگی محیط شستشی اسپرم پیپت آماده سازی جمع آری اسپرم للههای سانتریفیژ محی ط جداسازی اسپرم )اسمالریته ph غلظت ( زمان نیری استفاده شده در سانتریفیژ محیط استفاده شده برای Swim up لله استفاده شده برای Swim up دم ای انکبات ر 233

306 جمعآری اسیت آمادهسازی اسیت کشت ریان انتقال ریان کیفیت فاز گازی انکباتر مهارت فنی اپرات ر محیط شستش فالشینگ اسیت هپارین ظرف جستجی اسیت صفحه گرم هد زمان مهارت فنی محیط شستشی اسیت صفحه گرم هد نر م استفاده در آزمایشگاه پیپت ظرف کشت عملک انکبات ر )دما فاز گازی سرعت بازیابی شرایط بهینه در انکباتر بعد از باز بست نمدن درب آن( محیط کشت اسیت رغن معدنی استفاده شده هیالرنیدا ز پیپت لخت کننده اسیت مهارت فنی محیط کشت برای مرحله کلیاژ ظرف کشت ریان رغن معدنی عملک انکباتر )دما فاز گازی سرعت بازیابی شرایط بهینه در انکباتر بعد از باز بست نمدن درب آن( مین قرار گرفتن ریان در معرض نر مدت زمان نگهداری ریان خارج از انکباتر برای ارزیابیهای احتمالی ظرف کشت بالستسیست نع محیط کشت بالستسیست محیط شستش دسترزی ریان محیط انتقال صفحه گرم لله انتقال ریان تعداد ریان بارگیری شده تعداد انتقال داده شده مدت زمان ریه جدل عاملی که داخل آزمایشگاه بر نرخ مفقیت لقاح برن تنی تاثیر گذار هستند برای برخی از ما رشهای تکمیلی. نع عامل تفریخ کمک شده منجمد نمدن ریان منجمد نمدن اسپرم عامل مثر پیپت دسترزی محیط کشت استفاده شده ظرف م استفاده در این ریه رغن معدنی لازم ریز دسترزی ابر شیشهای محیط اسید تایرد کالیبراسین لیز عملک آن مهرات فنی مدت زمان انجام ریه صفحه کار با ریان محیط کشت شستش دسترزی ریان پیپت صفحه گرم ظرف منجمد نمدن ریه انجماد آهسته یا ریه شیشه سازی محللهای م استفاده در ریه انجماد استرا یال کالیبراسین عملک فریزر مدت انجام ریه منجمد سازی مهارت فنی ریه یح گشایی محللهای استفاده شده به منظر یخگشایی محیطهای شستش دسترزی مدت زمان یخگشایی شمارش اسپرمها ارزیابی مین تحرک ارزیابی ظاهری مدت سپری شده از زمان جم عآری نمنه ریه انجماد مح للهای منجمد سازی کالیبراسین عملک فریزر شرایط ذخیره سازی مهارت فنی ریه یخ گشایی منجمد اسیت نمدن پیپت دسترزی محیط کشت استفاده شده صفحه گرم منبع ن ر کالیبراسین عملک فریزر مهارت فنی ریه انجماد ریه یخگشایی مدت زمان انجماد یخگشایی مدت زمان انکباسین پس از یخگشایی ICSI صفحه کار با ریان پیپت دسترزی محیط نمنه باری ظرف نمنه باری رغن کشت ریبر دسترزی رش نمناری تعداد سلل باشته شده در هربار نمنه باری مدت زمان انجام نمنه باری نمنه باری PGS /PGD شکل مسیر طراحی مطالعه به منظر ارزیابی تفات در تضیع ریانها بر اساس درجه کیفی )1-4( در رز 3 رشد ریانها در گره کنترل A یا در محیط کشت م ارزیابی B. ارزیابی ه انحراف درن بین مشاهدات در ارزیابی کیفی ریانها با ریه آماری کاپا شکل مسیر مطالعاتی در شکل 4-24 بره منظر ارزیابی نرخ آبستنی النهگزینی تلد زنده بعد از انتقال ریانهای بدست آمده است. 911

307 شکل مسیر طراحی مطالعه تسعه یافته به رز 3 2. بالستسیستها درجه بندی شده در گرههایی که به نظر ظرفیت یکسانی برای النه گزینی دارند قرار داده میشند. آماره کاپا در رز 3 یا 2 م ارزیابی قرار گرفته. جدل باند پایینی برای %83 CI تعداد زج تعداد زج تعداد زج تعداد زج جدل باند پایینی برای %83 CI تعداد زج 3 تعداد زج تعداد زج تعداد زج جدل قدرت اندازه نمنه تخمین زده شده به منظر تشخیص تفات اثر د محیط کشت آلفا 1/14 بتا 1/4 قدرت )بتا -4( 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 اندازه نمنه در هر محیط /2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/14 1/13 1/13 1/14 1/14 1/13 1/13 1/14 1/14 1/13 1/13 Effect size (ʎ ) 1/3 1/3 1/3 1/3 4/1 4/1 4/1 4/1 4/3 4/3 4/3 4/3 914

308 جدل تضیع.نسبت پاسخ برای هر تاثیر اندازه درجه یک درجه د 1/3111 1/2891 1/2218 1/2428 درجه سه 1/2111 1/4323 1/4420 1/1020 درجه چهار 1/2111 1/4340 1/1912 1/1329 1/3111 1/1411 1/3394 1/2302 Effect size (ʎ ) 1/1 1/3 4/1 4/3 آلفا بتا جدل قدرت اندازه نمنه تخمین زده شده به منظر تشخیص تفات نرخ الدت زنده بین چهار گره کیفی ریان قدرت )بتا -4( کای اسکر اندازه نمنه در هر محیط /23 43/12 41/49 41/84 48/22 43/19 41/22 41/89 48/23 43/31 41/23 44/11 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/14 1/14 1/13 1/13 1/14 1/14 1/13 1/13 1/14 1/14 1/13 1/13 Effect size (ɛ ) 1/4 1/4 1/4 1/4 1/3 1/3 1/3 1/3 1/3 1/3 1/3 1/3 جدل قدرت اندازه نمنه تخمین زده شده به منظر تشخیص تفات نرخ الدت زنده بین چهار گره کیفی ریان اندازه نمنه در هر محیط قدرت )بتا- 4 ( کای اسکر بتا ) (ɛ Effect size آلفا /48 49/99 40/12 43/23 23/22 49/81 40/12 43/29 23/23 48/11 40/31 43/03 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/8 1/9 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/14 1/14 1/13 1/13 1/14 1/14 1/13 1/13 1/14 1/14 1/13 1/13 1/4 1/4 1/4 1/4 1/3 1/3 1/3 1/3 1/3 1/3 1/3 1/3 منابع. Arce JC et al ( ) Interobserver agreement and intraobserver reproducibility of embryo quality assessments. Hum Reprod :. Baxter AE et al ( ) Interobserver and intraobserver variation in day embryo grading. Fertil Steril :. de Assin R ( ) Comparison of methods to determine the assigned value in an external quality control programme for embryo 912

309 evaluation. Reprod Biomed Online :. Rosner B ( ) Fundamentals of biostatistics, th edn. Wadsworth, Belmont, CA. Whitehead J ( ) Sample size calculations for ordered categorical data. Stat Med :. Agresti A ( ) Categorical data analysis, nd edn. Wiley, New York. Agresti A ( ) Analysis of ordinal categorical data, nd edn. Wiley, New York. Machin D, Campbell M, Fayers P, Pinol A ( ) Sample size tables for clinical studies, nd edn. Blackwell Science, Malden. Julious SA ( ) Sample sizes for clinical trials. Chapman & Hall, Boca Raton. Cohen J ( ) Statistical power analysis for the behavioral sciences. Lawrence Erlbaum, Hillsdale, NJ. Gardner DL, Lane M ( ) Embryo culture systems. In: Trounson AO, Gardner DK (eds) Handbook of in vitro fertilization, nd edn. CRC Press, Boca Raton 919

310 911 لصف 22 تشک:تشک یاهمتسیس نایر ناسمه ییازلقد عق ییازلقد ناسمه ییاهیرادراب هک اب یاهشر ینام لصاح اهدش دن رایسب رتلااب یاهیرادراب یعیبط.تسا زنه تلع هکنیا هنگچ یاهشر نام یررابان نایر هیلا ار دعتسم عق تسکش میسقت دنکیم رط قیقد صخشم هدشن.تسا اب نیا لاح ییاهشر دننام کمک جراخ ندش نایر انز ادیسلپ (A.H) تشک ینلاط تدم نایر طیحم تشک نانع د لماع لماع لیخد عق ییازلقد ناسمه رظن هتفرگ هدش.دنا نیا لصف اهشر یاهراکهار یریگلج عق نیا عن ییازلقد درم ثحب رارق.دریگیم.4-22 همدقم یاهیگلماح لقدنچ یکی نیرتجیار نیرتمهم یاهدمایپ یاهشر نام یررابان.تسا رثکا نیا اهیرادراب لیلد لاقتنا دنچ نایر بقاعتم هنلا نآ ینیزگ.تسا اهنایر یکی یاهراکهار یلامتحا یارب شهاک رطخ عق نیا هنگ -یرادراب اه باختنا لاقتنا کی نایر دحا دشابیم هتبلا ینارامیب مه هک تحت نیا شر ینام رارق دنریگیم لیلد زرب یاهدیدپ مسم ییازلقد ناسمه رطخ عق یرادراب ییاتدنچ رط لماک نیب.دریمن نیا هدیدپ ان ینامز خر دهدیم هک کی نایر دحا د نایر ای رتشیب میسقت.دش لامتحا عق نیا عن ییازلقد ددح 1/1 دص لک نادازن لصاح یاهیرادراب سپ یرادراب اب کمک ART دشابیم.)4( رب ساسا اهشرازگ نازیم عیش ییازلقد ناسمه ییاهیرادراب هک اب یاهشر کمک یرراب لصاح دناهدش 2 ات 42 ربارب شزیمآ یعیبط تسا.)2-1( یاههتفای رکذم رگنایب تیمها دایز نیا عضم لیلد شیازفا لامتحا گرم ریم لبق دلت تلاکشم نامیاز یاهیراجنهان یدام دنتسه.)3-9( هکنیا ارچ هنگچ یاهشر ینام رجنم شیازفا عق ییازلقد ناسمه دنشیم حض ملعم.تسین هچ یلماع ثعاب دشیم کی نایر رتشیب دعتسم عق د مین ندش لیاا نارد نیکت.دشاب خساپ نیا لاس لیلد عنت یاهلکترپ ینام یاهکینکت کمک یرراب تیعمج نارامیب زکارم فلتخم ینام عانا یاهشر درم هدافتسا یارب ییاسانش یاهلقد ناسمه لکشم.تسا نینچمه للس مخت نکمم تسا یاهنامز فلتخم یط نیکت نایر هتفاکش دش هک ثعاب لیکشت عانا فلتخم یاهاشغ نرب ینایر تفج.دشیم نیا لصف هس هتسد یاهشر نام یررابان صتخم تشک نایر یراکتسد نآ هکنیا هنگچ ناتیم اهنآ یارب شهاک عق ییازلقد ناسمه هدافتسا درک درم ثحب رارق.دنریگیم هتبلا عضم رتمهم نیا تسا هک نیا هدیدپ تلایکشت رصحنم درف یاههدرپ فارطا نایر تفج هنگچ لیکشت دنشیم ره کی اهنآ هچ یاهدمایپ.دراد ییاسانش قیقد نیا عن اهیرادراب زین یکی رگید یاهشلاچ درم ثحب.تسا.2-22 نامتخاس یدنبرکیپ ت ج ف یاهلقد ناسمه هدیدپ د مین ندش مخت نکمم تسا یلیخ دز ینعی نامه زر حاقل )رفص( ای هلصاف ینامز 42 زر دعب حاقل ماجنا.دش هتفاکش ندش لحارم یدعب رجنم لیکشت یاهلقد م هدیبسچ دهاخ دش.)8( عن نامتخاس یتفج لیکشت هدش هتسبا هرد ینامز تسا هک نآ نایر د مین دشیم هک ن دخ رب نازیم تارطخ بقاعتم نآ گرم ریم نایر ریثات.دراذگیم کی عن تلایکشت یاههدرپ نرب ینایر راتخاس د -نیرک د نینمآ تسا هک لصاح هتفاکش ندش مخت زر حاقل ات زر مس ددح( هلحرم تشه )یللس تسا ره کی اهنایر کی هدرپ نیرک کی نینمآ ازجم دنهاخ.تشاد صیخشت نیا عن ییازلقد یرادراب هک رجنم لیکشت یاهلقد ناسمهان دشیم لکشم تسا نچ ره د ظاحل نیرک نینمآ اشم.دنا نینچمه نازیم گرم ریم ینایر یارب نیا هتسد یاهلقد ناسمه د( -نیرک د )نینمآ لداعم یاهلقد ناسمهان -نیرکد ینینمآد تسا 41(.)44 یماگنه هک هدیدپ هتفاکش ندش مخت نیب لحارم لارم زر(تسیستسلاب مراهچ ات متشه سپ )حاقل خر دهد یاهلقد ناسمه یاراد کی نیرک کرتشم د نینمآ ازجم دنهاخ

311 915 یک (دب -نیرک د نینمآ.) نیا تلاح رطخ عق تلاکشم لبق دلت لثم دشر نزمان نایر منس نایرج نخ بسانمان نیب د نایر سران ندب نایر گرم نآ رتشیب تلاح (D-D) لا تسا 0( 8.)42 یتق هک نایر زر مهن ات مهدد سپ حاقل د مین دش یاهلقد یناسمه لصاح دنهاخ دش هک دره کی نینمآ کی نیرک کرتشم.دنراد ینتسبآ کت ک -ینیرک ت ینینمآ نیرتلااب رطخ عق گرم ریم ینایر ار نیب هس هرگ تلایکشت ییاشغ تفج دنراد هک لیلد نآ نیا تسا هک نینمآ کرتشم چیه یعنام یارب یریگلج ندیچیپ دنب فان رد نایر ار دج درآیمن 43(.)8 طقف رتمک د دص نیا هرگ اهلقد هدنز دلتم دنشیم.)8(.3-22 صیخشت یاهلقد ناسمه رطنامه هک نایب دش ماجنا یاهشر نام یررابان رطخ زرب ییازلقد ناسمه ار شیازفا.دهدیم اب نیا لاح دیاش ناتب تفگ لیلد یتافت هک تاشرازگ فلتخم عجار نازیم عق نیا هدیدپ دج دراد ات یددح هتسبا یشر تسا هک یارب نییعت هج یناسمه اهلقد هدافتسا.دشیم نینچمه صیخشت هلحرم عق هتفاکش ندش مخت نامز یدنب طبرم نیا رما ریثات ییازسب دراد به ( نانع لاثم هکنیا نیا هدیدپ نامز دلت خر هداد تسا ای لیاا هس ههام.)لا اهنت سپ نییعت یاهرتکاف ییایمیشیب طبرم یرادراب ای صیخشت هسیک یرادراب لخاد یمحر ناتیم عجار ینیزگهنلا کی نایر سپ میند ندش نآ تاضق.درک نیمخت عق ییازلقد ناسمه سپ هکنیا کی جز تحت نام اب یاهشر نام یررابان رارق دنریگیم لامعم اب ریصت یرادرب یفارگنس یمحر یط هس ههام لا ریذپناکما.تسا یتق هک یفارگنس دادعت نایر رتشیب یاهنایر لقتنم هدش دشاب ناتیم عق یگتفاکش مخت یپ.درب هتبلا ناتیمن رط لماک عجار صیخشت یفارگنس نئمطم دب نچ ینامز هک رتشیب کی نایر کی لکیس لقتنم هدش دشاب نکمم تسا عق هدیدپ میند ندش مخت صیخشت هداد.دشن هلاع دیاش اب نیا شر ناتن عجار شقن یلامتحا یاهیرادراب سپ نام یط لکیس ینام تاضق.درک اب دج نییاپ ندب عیش ییازلقد ناسمه یتاشرازگ ینبم رب عق نآ سپ لاقتنا یاهنایر ریغ دمجنم دمجنم بذ هدش سرتسد تسا.)41 43( یارب شهاک رطخ یرادراب هتساخان نامز نام یررابان یتسیاب نارامیب هیصت دش هک یط لکیس ینام تبراقم زیهرپ.دننک اب ماجنا یفارگنس یادتبا هس ههام لا یرادراب ناتیم ابیرقت د مس یاهلقد ناسمه ار رط قیقد ییاسانش.درک هج لا ییاهنآ هک راتخاس یاشغ M-D یتفج M-M دنراد یاهلقد D-D ناسمه ار مه سپ لاقتنا کی نایر دحا ناتیم اب نیا شر صیخشت داد.)42-49( هتبلا نیرتقیقد یبایزرا میند ندش نایر D-D یگلا نامز دلت ماجنا دشیم هک نیا رظنم یتسیاب یاهلقد مه سنج هنمن DNA هیهت دش یارب هسیاقم رثا DNA تشگنا ره کی اهلق یاسچرب یکیتنژ درم یسررب رارق.دریگ.1-22 لماع داجیا هدننک ییازلقد ناسمه یاهشر نام یررابان نیا هلاسم هک هچ یلماع سپ نام اب یاهکینکت کمک یرراب رجنم شیازفا عق ییازلقد ناسمه دشیم هرامه درم ثحب هدب.تسا هراب مسیناکم قیقد هتفاکش ندش مخت قافتا رظن یعماج دج درادن یل نیدنچ هیرظن لیبق یاقلا کمخت یراذگ )48-24( یراکتسد نایر ای کمخت 42( )22-21 تشک ینلاط تدم نایر 1( )23-29 یاهیرادراب ییاتدنچ هدر لااب 2( 28 )31 داهنشیپ هدش.تسا یخرب تاشرازگ ناشن دنهدیم هک یاقلا کمخت یراذگ رجنم شیازفا عیش ییازلقد ناسمه دشیم نیا بیترت هک رب ساسا هیضرف Blickstein Keith )24( کیرحت ینادمخت لاامتحا ثعاب -یم دش دادعت یرتشیب یاهکمخت دعتسم ماجنا هدیدپ تفاکش هریخذ ینادمخت درف راک هتفرگ.دنش یرانف (A.H) Assisted Hatching زین هک یارب کمک جراخ ندش نایر انز ادیسلپ هدافتسا دشیم لامتحا لیکشت یاهلقد ناسمه ار لاب.دربیم تاقیقحت Alikani ناراکمه )42( رگنایب نیا دب هک تارییغت انز ادیسلپ A.H کینکت لبق لیکشت تلااصتا رادذفنم نیب یاهرمتسلاب نایر نکمم تسا رجنم ادج ندش نیا اهرمتسلاب لیکشت نیدنچ نایر.دش یکی نیرتمهم لماع لیخد ییازلقد ناسمه تشک دنچ هزر نایر ات هلحرم تسیستسلاب.تسا نیا هنیمز نیدنچ مسیناکم

312 916 دج دنراد هک نایر تشک هدش نیا طیارش ار دعتسم عق میند ندش.دننکیم دننام عق زتپپآ یتارییغت هک سپ نآ رجنم میسقت هدت یللس یلخاد نامز جرخ مخت انز ادیسلپ )23(.دشیم نینچمه تخس ندش انز ادیسلپ هک ثعاب دشیم ماگنه اهر ندش تیستسلاب انز هدت یللس یلخاد نیح ربع ییاضف کیراب ترص هناج نریب دنزب.)22( تیاهن نازیم عق ییازلقد ناسمه یاهیرادراب هناگدنچ هدر لااب یشان هنلا ینیزگ د نایر اب یکی د نایر همین هدش رایسب لااب هدب تسا.)2( رب ساسا Tummers شرازگ ناراکمه )34( ینامز هک ییازلقد لصاح لاقتنا نیدنچ نایر دشاب تبسن ینامز هک اهنت یکی یاهنایر لقتنم هدش محر نیزگیاج دشیم رطخ طقس یدخبدخ هس ههام لا رتنییاپ تسا نیا لیلد هک ییاهنایر اب تیفیک رت ترص ییاتد هنلا ینیزگ.دننکیم یترص هک دنر هنلا ینیزگ یاهنایر د یکمخت لک هدد هتفه لا یرادراب همادا هتشاد دشاب دیاش صیخشت یاهلقد ناسمه لصاح یکی د مخت تنلپمیا هدش شیازفا.دبای اب هکنیا لرتنک یمامت لماع یلامتحا لیخد شیازفا عق ییازلقد ناسمه کی هاگشیامزآ نام یررابان ریذپناکما دشابیمن ناسانش نایر دنناتیم اب رظن نتفرگ نیدنچ هتکن ظفح ماجسنا نایر لقادح ندناسر راشف هدرا طیحم تشک یهاگشیامزآ نانیمطا لصاح.دننک همادا ثحب نماریپ نیا عضم تسا هک هنگچ اب هچ ییاهشر ناتیم ریثات لماع لیخد عق ییازلقد ار یاهشر نام یررابان لقادح.دناسر.3-22 دام یمامت دام یاهطیحم تشک یتسیاب لبق هدافتسا ظاحل تاریثات یمس رب نایر طست شر شجنس یتسیز یسررب.دنش ریز یخرب دام یصاصتخا درم ین یاهلمعلارتسد نام یررابان تسیل هدش.دنا هتبلا ره یهاگشیامزآ دیاب هتسب طیارش زکرم ینام نیرت جیاتن طبرم نیا درام ار باختنا.دنک A.H: کینکت کمک جراخ ندش نایر انز ادیسلپ -4 پکسرکیم سکعم زهجم اب متسیس یراکتسد هدننک نایر هگن هدنراد هحفص تپیپرکیم مرگ اب یامد 30 هج یتناس دارگ یاهیسدع یمشچ داجیا هدننک تسارتنک نمفاه ای لخادت یقارتفا اب ییامنگرزب یاهیسدع ییش اب.11X ییامنگرزب -2 طیحم بسانم یارب تشک یراکتسد یاهللس یسنج نایر ندب ین نیسابکنا اب گ ید نبرکدیسکا یاراد 3 دص نیمبلآ ای 41 دص مرس نانع عبنم نیمات هدننک نیئترپ -3 نغر یندعم هتسش هدش ای نیفاراپ -1 تپیپ لیرتسا اب رطق یلخاد 431 نرکیم ای رتشیب یارب اج اج ندرک نایر هلحرم میهست تپیپ اب رطق یلخاد 311 نرکیم ای رتشیب یارب اج اج ندرک.تسیستسلاب -3 رتپیپ تپیپ لیرتسا یارب نتشادرب طیحم -2 شیدیرتپ 21 یلیم یرتم ب شیدیرتپ ای فرظ رابکی فرصم لیرتسا بسانم یارب یراکتسد نایر -0 تپیپ کن هگن هدنراد سنج تاکیلیس رب هک طست ترارح هلعش هدنا رطق درم رظن شرب هداد هدش.تسا اب رطق یلخاد رتمرکیم رطق یجراخ رتمرکیم یگدیمخ اب هیاز هج هلصاف 1/3 یرتمیلیم یاهتنا.تپیپ -9 )فلا دام مزلا یارب ماجنا A.H کینکت قیرط :ییایمیش طیحم یدیسا (ph=2/9-2/2( تپیپ بسانم هک هلل یگریم اب سنج تاکیلیس رب هتخاس هدش تسا یاهتنا نآ یاراد میخض ل اب رطق یلخاد 42-9 نرکیم.تسا یاهتنا 1/3 یرتمیلیم تپیپ کی یگدیمخ اب هیاز هج دیاب داجیا )ب.دش دام مزلا یارب ماجنا A.H کینکت اب هدافتسا متسیس :یرزیل رزیل اب تق 4/19.دید نازیم سلاپ هدرا یتسیاب بسانتم اب هلحرم ینیکت نایر میظنت دش یاهنگ هک دشر نیکت نایر سپ جرخ نآ انز ادیسلپ لتخم.دشن

313 اهشر A.H: کینکت کمک جراخ ندش نایر انز ادیسلپ کینکت کمک جراخ ندش نایر انز ادیسلپ ار ناتیم هلحرم د یللس ات تسیستسلاب ماجنا.داد شزرا یتاقیقحت یکینیلک نیا شر نانع یکینکت تهج دب نازیم هنلا ینیزگ نایر نانچمه درم ثحب.تسا هتبلا نیا کینکت یارب لصح مسج یبطق کمخت یاهرمتسلاب ینایر لحارم میهست ای یاهللس متکفرت تسیستسلاب تهج صیخشت یکیتنژ لبق هنلا ینیزگ زین درم هدافتسا.دشابیم فده نیا شخب هیارا نیرت شر ماجنا نیا کینکت یاهنگ تسا هک شیازفا رطخ ییازلقد ناسمه یریگلج.دش ماجنا AH کینکت اب شر ییایمیش یارب نایر هلحرم میهست شیدیرتپ. 4 بسانم ار هتشادرب تارطق 41 یرتیلرکیم طیحم یراکتسد نایر نآ.دیراذگب ره هرطق ار کی نایر هک رارق تسا خیرفت دش صاصتخا.دیهد تارطق دیاب هدیشک دنشاب نیا رظنم ماگنه جراخ ندرک طیحم کن تپیپ ار دادتما فک شید.دیشکب کی هرطق 41 یرتیلرکیم طیحم یدیسا هدش ار مه رد تارطق طیحم یراکتسد نایر دیراذگب هتکن( 4 ار.)دینیبب هلصافلاب تارطق طیحم ار اب نغر یندعم هتسش هدش ای نیفاراپ دیناشپب نئمطم دیش هک تارطق لاماک اب نغر هدیشپ هدش.دنا لقادح 43 هقیقد لبق عرش راک شید ار یر حطس 30 هج دارگیتناس. دیراذگب کی. 2 نایر ار یاهتنا کی هرطق زیمت لقتنم دینک هتکن(.)2 تپیپ. 3 صصخم خیرفت ار درا طیحم یدیسا.دینک طیحم. 1 یدیسا هدش ار ن شید اب تپیپ لااب.دیشکب اب. 3 ییامنگرزب نییاپ یر نایر سکف دینک تپیپ هگن هدنراد ار درا تارطق طیحم یراکتسد. دینک تیعقم. 2 نایر ار تبسن تپیپ هگن هدنراد یرط میظنت دینک هک کی هیحان قبطنم رب فاکش میهست ای یاضف گرزب رد هدرز یا لباقم تپیپ عقا دش لامعم( تیعقم تعاس.)3 ینامز هک دیراد یسپیب رمتسلاب ماجنا دیهدیم تیعقم نایر ار یرط میظنت دینک هک رمتسلاب درم رظن یاهیحان هک امش دصق دیراد خیرفت ماجنا دهد لباق ندید. دشاب تپیپ. 0 خیرفت ار درا هرطق طیحم یراکتسد.دینک اب هدافتسا یسدع ییش 11 کن تپیپ ار اب هیحان یا انز هک رارق تسا لح دش سکف.دینک تپیپ ار یمارآ اب انز سامت دیهد اب تقد طیحم یدیسا هدش ار اب کی تکرح تفر یتشگرب یر هددحم 21 ات 31 یرتمرکیم نیا هیحان دیمدب هتکن( )1 کی هرفح 23 ات 31 یرتمرکیم انز داجیا.دییامن. 9 ضحم هکنیا انز خارس دش شکم تپیپ هدننک خیرفت ار ماجنا دیهد ات ره هنگ طیحم یدیسا فارطا خارس هت لیکشت هدش فذح.دش هلصافلاب نایر ار یاهتنا لباقم هرطق لقتنم.دینک اب. 8 هدافتسا کی تپیپ اب رطق یلخاد رتشیب 431 نرکیم نایر ار نیا یرتپ شید.دیرادرب تپیپ رتگنت نکمم تسا نایر راشف درا هدرک ثعاب جرخ اهرمتسلاب انز.دش یمارآ نایر ار دنچ هرطق طیحم تشک هک لبق لداعت هدیسر دییشب نآ ار هرطق تشک ییاهن یارب همادا نیسابکنا دینادرگرب هتکن(.) ماجنا AH کینکت اب هدافتسا رزیل یارب نایر هلحرم میهست -4 شیدیرتپ بسانم ار هدامآ دینک طیحم تارطق 41 یرتیلرکیم.دیراذگب هلصافاب تارطق ار اب نغر یندعم ای نیفاراپ دیناشپب نئمطم دیش هک تارطق لاماک اب نغر هدیشپ هدش.دنا لقادح 43 هقیقد لبق عرش راک شید ار یر حطس 30 هج دارگیتناس رارق دیهد هتکن(.)2-2 )اه(نایر ار تارطق طیحم.دیراذگب

314 918-3 اب ییامنگرزب لااب )11 ( یر نایر سکف هدرک تهج نایر ار یارب خیرفت یرط رارق دیهد هک هلصاف نیب اهرمتسلاب ای یر کی هیحان فاکش میهست.دشاب ره تق یسپیب رمتسلاب ار ماجنا دیهدیم نایر ار یرط رارق دیهد هک رمتسلاب درم رظن یاهیحان هک رارق تسا خیرفت دش لباق یسرتسد.دشاب -1 نیمه تلاح هک نایر هرطق درم رظن رارق هتفرگ یسدع ار ییش یرزیل رییغت تیعض.دیهد -3 یر ل یجراخ انز ادیسلپ زکرمتم دیش رزیل ار.دیناباتب نمض تکرح لخاد ندنابات ار همادا دیهد ات ینامز هک کی خارس 21 ات 23 یرتمرکیم انز داجیا دش هتکن(.)0-3 اب هدافتسا کی تپیپ اب رطق یلخاد رتشیب 431 رتمرکیم نایر ار شیدیرتپ یراکتسد.دیرادرب تپیپ رتگنت نکمم تسا نایر ار تحت راشف رارق هداد ثعاب جرخ اهرمتسلاب انز.دش لبق ندنادرگرب نایر تارطق طیحم تشک یلصا یمارآ نایر ار نیدنچ هرطق طیحم لبق لداعت هدیسر شتسش دیهد هتکن(.) ماجنا A.H کینکت اب هدافتسا رزیل یارب تسیستسلاب هتکن(.)9-4 دننام کینکت لبق شیدیرتپ بسانم ار اب تارطق 41 یرتیلرکیم هدامآ.دینک هلصافلاب تارطق ار اب نغر یندعم ای نیفاراپ دیناشپب نئمطم دیش هک تارطق لاماک اب نغر هدیشپ.دناهدش لقادح 43 هقیقد لبق عرش شید ار یر حطس 30 هج دارگیتناس رارق دیهد هتکن(.)2-2 )اه(نایر ار تارطق طیحم.دیراذگب -3 اب ییامنگرزب لااب )11 ( یر نایر زکرمت دینک تسیستسلاب ار تیعقم بسانم رارق دیهد هتکن(.)8 نیا تلاح یسدع ار ییش یرزیل رییغت تیعض.دیهد -1 یر انز ادیسلپ زکرمت دینک رزیل ار دیناباتب ات کی هرفح 21 یرتمرکیم انز داجیا.دش -3 اب هدافتسا کی تپیپ اب رطق یلخاد رتشیب 231 رتمرکیم نایر ار یش دیرتپ یراکتسد.دیرادرب تپیپ رتگنت نکمم تسا نایر ار تحت راشف رارق هداد ثعاب جرخ اهرمتسلاب انز.دش لبق ندنادرگرب نایر تارطق طیحم تشک یلصا تهج همادا نیسابکنا یمارآ نایر ار نیدنچ هرطق طیحم لبق لداعت هدیسر شتسش دیهد هتکن(.) تشک نایر اب هجت هچنآ هک هراب یاهشر تشک نایر یاهلصف یلبق هیارا دش ناتیم تفگ هک هنگچ ناسانش نایر دنناتیم طیارش هنی تشک ار هاگشیامزآ مهارف.دننک تاعلاطم ناشن دهدیم هک رارق نتفرگ ینلاط تدم نایر طیارش بسانمان دناتیم ثعاب شیازفا نازیم عق ییازلقد ناسمه سپ لاقتنا تسیستسلاب دش 2( )22 عقا لیلد مدع دج ییاهرازبا بسانم یارب ییاسانش باختنا یاهنایر دنچ یللس هک تیحلاص ینیکت لااب هتشاد دنشاب اهکینیلک حیجرت دنهدیم صصخ درام لاقتنا کی نایر دحا تسیستسلاب ار لقتنم.دننک رگا Tummers یرئت ناراکمه )34( ینبم رب هطبار تبثم هنلا ینیزگ ییاتد شیازفا رطخ ییازلقد ناسمه تس دشاب ناتیم باختنا لاقتنا کی نایر ار نانع یشر یارب شهاک عق نیا هدیدپ رظن.تفرگ لاقتنا کی نایر یباختنا یریگمیمصت یارب یارجا نیا کینکت یتسیاب رب ساسا طیارش نارامیب یاههداد ره زکرم ینام ماجنا.دش اجنیا رکذ ییاهشر میدرپیم هک یاهرایعم درم رظن یارب ماجنا ESET ناتسرامیب کینیلک ایآ ار نایب.دنکیم -4 نامز یدنب نارامیب رب ساسا :نس نانز ریز 33 لاس شش کمخت حیقلت هدش ای رتشیب نانز 33 ات 30 لاس تفه کمخت حیقلت هدش ای.رتشیب لاقتنا نایر لصاح نیا اهکمخت زر مجنپ ای هلحرم تسیستسلاب ماجنا.دشیم

315 913-2 متسیس تشک :یاهلحرمدنچ یاهنایر لصاح ار یاههرگ 3 ای 1 ییات تارطق 31 یرتیلرکیم طیحم تشک ینغ هدش اب 41 دص نیئترپ ریز نغر تشک.دیهد طیارش نیسابکنا 3 ات 2 دص ید نبرکدیسکا یامد 30 هج یتناس دارگ هتکن(.)41-3 هج یدنب :اهنایر ددح 441 تعاس سپ حیقلت اهنایر ار یبایزرا دینک رب ساسا تیفیک هج یدنب.دییامن دج لکتسلاب هک مجح نآ لقادح فصن لک تیستسلاب دشاب نیدنچ للس هدت یللس یلخاد اب تلااصتا تسس ای مکحم یپا میلت تسس ای هتسیپ متکفرت نانع یاهرایعم صخاش تسیستسلاب اب تیفیک بخ رظن هتفرگ -یم.دنش -1 لاقتنا :نایر ینارامیب هک لقادح کی تسیستسلاب اب تیفیک بخ هتشاد دنشاب هقباس یلبق مدع تیقفم لاقتنا نایر هت نیمه کینیلک هتشادن دنشاب درا دنر لاقتنا نایر دحا.دنشیم رگا چیه یتسیستسلاب اب تیفیک بخ دج هتشادن دشاب رامیب نکمم تسا یارب لاقتنا کی ای د نایر هدیزگرب. دش -2 باختنا :نایر ییاهنایر هک نیرتلااب هج یفیک ار رب ساسا یاهرایعم رکذم هتشاد دنشاب یارب لاقتنا باختنا -یم.دنش یاهتسیستسلاب طسبنم هدش یفاضا اب تیفیک بسانم ار ناتیم اب تقفام دخ رامیب درا دنیآرف ظفح یدامجنا.درک ییاهتسیستسلاب هک رهاظ یاراد د هدت یللس یلخاد دنتسه ای هدت یللس یلخاد اهنآ رهاظ لپ دننام دراد دیابن لاقتنا.داد ینامز هک چیه ینایر اب تیفیک بخ لیکشت دشن رامیب یتسیاب ظاحل لامتحا رطخ ییازلقد ناسمه درم هراشم رارق دریگ هتکن( 44.) تاکن مهم -4 رظنم لااب ندرب تقد راک کی هریاد فارطا هرطق طیحم یدیسا تمس نیریز شید دیشکب ات یاههرطق طیحم یراکتسد نایر لباق صیخشت.دشاب -2 اجنآ هک طیحم یط لمع خیرفت یدیسا دشیم ره هرطق طقف دیاب کی راب هدافتسا دش ینعی( نایر مد دیابن لخاد هرطق یا هک لابق ضرعم طیحم یدیسا هدب رارق.)دریگ یترص هک ماجنا لمع خیرفت ندب یسپیب رمتسلاب دشاب ناتیم رتشیب کی نایر ار لخاد شید رارق داد یل لط تدم ینامز هک اهنایر طیحم یدیسا رارق دنریگیم دیاب لقادح.دسرب -3 هدنا هرفح داجیا هدش انز ادیسلپ مهم تسا نچ خارس 21 رتمرکیم ای رتکچک نکمم تسا جرخ نایر تعنامم دنک ای رجنم جرخ نایر ترص هناج انز لیکشت ییازقد ناسمه.دش یاههرفح رتگرزب 31 رتمرکیم مه نکمم تسا ثعاب دش هک اهرمتسلاب لبق هلحرم شیپ یگدرشف نیب دنرب.)32( -1 رشق یجراخ انز ادیسلپ لامعم رتدز هیلا یلخاد نآ هک لاامتحا تیصاخ یعاجترا هتشاد طیحم یدیسا ماقم تسا لح.دشیم نیاربانب مزلا دیاش دشاب اب تپیپ ترص یکیناکم هیلا هرفح یلخاد ار ب.مینک هتبلا یتسیاب رظن تشاد هک رگا نایر دایز ضرعم طیحم یدیسا دشاب نکمم تسا نیکت نآ لتخم. دش -3 یتق هک نایر سانش دراد اب یاهنایر خیرفت هدش راک دنکیم دیاب بقارم هلصاف داجیا هدش انز ادیسلپ لک تدم تشک نایر لاقتنا ای ظفح یدامجنا نآ.دشاب هشیمه یتپیپ ار باختنا دینک هک ذفنم نآ یارب نایر نیح لاقتنا ییاجباج بسانم.دشاب -2 A.H کینکت اب رزیل فلاخرب شر یکیناکم هک طیحم یدیسا هدافتسا دشیم بیکرت ییایمیش ph طیحم رییغت یمن دنک نیاربانب اههرطق ار ناتیم نیدنچ راب یارب هگن یراد نایر هدافتسا.درک هلاع یتق رارق تسین یسپیب نایر ماجنا دش ناتیم ادتبا تپیپ هگن هدنراد هدافتسا.درک -0 هتسب تماخض انز ادیسلپ رط لمعم هس ات راهچ سلاپ یارب خارس ندرک لماک مزلا انز.تسا

316 9- تا به امرز هیچ گرشی مبنی بر مرتبط دانستن افیش خطر دقلیی همسان با انجام عمل A.H بالستسیست منتشر نشده است. دقت بیشتر آسیب کمتر تکنیک A.H تسط لیزر را به عنان سادهترین رش برای ایجاد سراخ در زنا پلسیدای نازک ریان در مرحله بالستسیست در نظر گرفته میشد. 8- در هنگام نمنه باری از ترفکتدرم بالستسیست بایستی طری قرار گی که تده سللی داخلی آن در جهت مقابل ناحیه ایجاد حفره باشد تا سللهای تده سللی داخلی از دست نرند. لی بهترین ضعیت برای بالستسیستهایی که نمنه باری از آنها انجام نمی شد مشخص نیست. در مطالعات اخیرا نشان داده شده است که قتی زنا در نزدیکی تده سللی داخلی سراخ شد احتمال تفریخ کامل بالستسیستهای منجمد ذب شده بیشتر بد )33(. 41 سپ- از تایید قع لقاح )رز 4( ریانها در محیط بدن گلکز فسفات کشت میشند. در اغلب سیستمهای کشت پیدرپی )چندمرحله ای( ریان به محیط کشت بالستسیست که برای ریان سه رزه بعد از مرحله فشگی طراحی شده است منتقل میشد لی در اینجا ابتدا ریان رز سم را به قطره تازه محیط تسهیم منتقل که پس از آن صبح رز چهارم به محیط کشت بالستسیست میبریم. 44- درباره د نیم شدن ریان قبل از انتقال آن در رز پنجم شاهد زیادی جد ندا (31 33). مطالعه Meintjes همکاران )33( نشان میدهد که انتقال یک بالستسیست با د تا تده سللی داخلی منجر به قع بااری با سه قلهای همسان شد. 42- استراتژی انتقال ریان احد به مدت شش سال در این مرکز درمانی برقرار بده است. در سه سال ال مین دقلیی همسان برای بیمارانی که تحت انتقال ریان احد قرار گرفتند باال 329 درصد بد )8 تا از 433(. اما در سه سال بعدی که مکان آزمایشگاه تغییر ک این مین به 220 درصد رسید )2 تا از 222(. در این تجربه که مشابه آن تسط Moeyeri همکاران گرش شده بد )32( پرتکل محیط کشت ثابت فقط مکان عض شده بد. منابع 4. Bulmer MG (4801) The biology of twinning in man. Oxford University Press, Oxford 2. Jain JK et al (2111) Monozygotic twins and triplets in association with blastocyst transfer. J Assist Reprod Genet 24: Blickstein I, Verhoeven HC, Keith LG (4888) Zygotic splitting following assisted reproduction. N Engl J Med 311: M ilki AA et al (2113) Incidence of monozygotic twinn ing with blastocyst transfer compared to cleavagestage transfer. Fertil Steril 08: Harkness UF, Crombleholme TM (2113) Twin-twin transfusion syndrome: where do we go from here? Semin Perinatol 28: Vela G et al (2144) Monozygotic pregnancies conceived by in vitro fertilization: understanding their prognosis. Fertil Steril 83: Dube J, Dodds L, Armson BA (2112) Does chorionicity or zygosity predict adverse perinatal outcomes in twins? Am J Obstet Gynecol 492: Schinzel AGL, Smith DW, Miller JR (4808) Monozygotic twinning and structural defects. J Pediatr 83: Hall J (2113) Twinning. Lancet 322: Carroll S et al (2113) Is zygosity or chorionicity the main determinant of fetal outcome in twin pregnancies. Am J Obstet Gynecol 483: Lee A et al (2141) The frequency and clinical signi fi cance of twin gestations according to zygosity and chorionicity. Twin Res Hum Genet 43:

317 42. Sebire N et al (4880) The hidden mortality of monochorionic twin pregnancies. Br J Obstet Gynaecol 411: Paek B, Shields LE (2113) Twin-to-twin transfusion syndrome: diagnosis and treatment. Curr Women Health Rev 4: Mains L et al (2118) Sextuplets: an unusual complication of single embryo transfer. Fertil Steril 84(3):832.e4 832.e2 43. Van der Hoorn ML et al (2144) Dizygotic twin pregnancy after transfer of one embryo. Fertil Steril 83:913.e4 913.e3 42. Alikani M et al (4881) Monozygotic twinning in the human is associated with the zona pellucida architecture. Hum Reprod 8: Vitthala S et al (2118) The risk of monozygotic twins after assisted reproductive technology: a systematic review and meta-analysis. Hum Reprod Update 43: Blickstein I (2113) Estimation of iatrogenic monozygotic twinning rate following assisted reproduction: Pitfalls and caveats. Am J Obstet Gynecol 482: Derom C et al (4890) Increased monozygotic twinning rate after ovulation induction. Lancet 4: Derom C et al (2112) High frequency of iatrogenic monozygotic twins with administration of clomiphene citrate and a change in chorionicity. Fertil Steril 93: Blickstein I, Keith LG (2110) On the possible cause of monozygotic twinning: lessons from the 8- banded armadillo and from assisted reproduction. Twin Res Hum Genet 41: Slotnik R, Ortega J (4882) Monoamniotic twinning and zona manipulation: a survey of U.S. IVF centers correlating zona manipulation procedures and a high-risk twinning frequency. J Assist Reprod Genet 43: Yakin K, Balaban B, Urman B (2113) Risks of monochorionic pregnancies after assisted hatching. Fertil Steril 08: Skiadas C et al (2119) Risk factors associated with pregnancies containing a monochorionic pair following assisted reproductive technologies. Hum Reprod 23: Menezo Y, Sakkas D (2112) Monozygotic twinning: is it related to apoptosis in the embryo? Hum Reprod 40: Behr B et al (2111) Blastocyst-ET and monozygotic twinning. J Assist Reprod Genet 40: Chang HJ et al (2118) Impact of blastocyst transfer on offspring sex ratio and the monozygotic twinning rate: a systematic review and meta-analysis. Fertil Steril 84: Kawachiya S et al (2144) Blastocyst culture is associated with an elevated incidence of monozygotic twinning after single embryo transfer. Fertil Steril 83(2): doi: /j.fertnstert Sills ES, Tucker MJ, Palermo GD (2111) Assisted reproductive technologies and monozygous twins: implications for future study and clinical practice. Twin Res 3: Knopman J et al (2118) Monozygotic twinning: an eight-year experience at a large center. Fertil Steril 81: Tummers P, De Sutter P, Dhont M (2113) Risk of spontaneous abortion in singleton and twin pregnancies after IVF/ICS. Hum Reprod 49: Veeck LL (4888) An Atlas of human gametes and conceptuses. Parthenon Publishing, New York 33. Miyata H et al (2141) Relevance of the site of assisted hatching in thawed human blastocysts : a preliminary report. Fertil Steril 81: Meintjes M et al (2114) Prospective identi fi cation of an in vitro-assisted monozygotic pregnancy based on a double-inner-cell-mass blastocyst. Fertil Steril 02:S402 S Payne D et al (2110) Time-lapse recording identi fi es human blastocysts at risk of producing monozygotic twins. Hum Reprod 22(Supp 4):i8 32. Moayeri SE et al (2110) Risk of monozygotic twinning with blastocyst transfer decreases over time: an 9-year experience. Fertil Steril 90:

318 فصل 23 کشت برنتنی ریان اپیژنتیک 332 عمده تغییرات اپی ژنتیک در دران قبل از النه گزینی ریان رخ میدهد. در این زمان است که برچسبهای اپی ژنتیک سللهای جنسی پاک شده طی یک برنامه ریزی مجدد تغییراتی جدید در سطح اپی ژنتیک ریان رخ میدهد. این تغییر تبدیل های اپی ژنتیک ماهیتی انعطاف پذیر دارند به همین دلیل طی رند درمان نابارری تسط عامل مختلف مانند سیستم کشت ریان مستعد اختالل میباشند. در این فصل به بررسی شاهد مربط به اثرات کشت ریان بر کل تغییرات هیستنی متیالسین DNA خامشی رتریرسی غیرفعال شدن کرمزم X 339 نشانه گذاری ژنمی می- پازیم. تمام مستندات مجد در این زمینه به چند نکتهی مهم اشاره دارند اال سیستم رش کشت ریان تحت شرایطی میتاند منجر به اختالالت بی نظمیهایی در سطح اپیژنتیک شد. دما تمام محیطهایی که اکنن برای کشت ریان جد 321 دارند استاندا نیستند سم اینکه پاسخ ریان به شرایط کشت در آزمایشگاه اتفاقی تصادفی میباشد. فرضیه ما این است 324 که در این شرایط ریان از طریق مکانیسم سازگاری اپی ژنتیک خد را با محیط کشت تطبیق میدهد. به عاله ریانهای 322 خامش از نظر اختالالت اپی ژنتیک ناشی از شرایط کشت کمترین احتمال آسیب را دارند مقدمه اپی ژنتیک به مطالعه تغییرات برگشت پذیر قابل تارث کرماتین میپازد. این تغییرا ت بر دسترسی عامل رنیسی به ژنها تاثیر گذاشته به این ترتیب فرآیند رنیسی را تنظیم میکنند )4(. آنچه که در اینجا بر بیان ژنها تاثیر میگذا 323 تغییرات در ل تای DNA نیست بلکه این تنظیمات اپیژنتیک از طریق فعال یا سرکب کن ژن منجر به تنع فنتیپ نهایی 321 سلل میشند. د تا مکانیسم اصلی اپیژنتیک متیالسین DNA تغییرات پس از ترجمه پرتئینهای هیستنی هستند که طی دران تشکیل ریان در ایجاد حافظه سللی رند تمایز نقش مهمی دارند )2(. مکانیسمهای اپیژنتیک مذکر ماهیتی 320 ماهیتی تغییر پذیر دارند به همین دلیل هر گنه اختلتا که با رند درمان نابارری ایجاد میشد میتاند بر ریان تاثیر بگذا. 329 بازبرنامهریزی اپیژنتیکی طی دران تکین پستانداران در د مرحله اصلی رخ میدهد هنگام تشکیل سللهای جنسی پس از لقاح )2 3(. ابتدا همهی عالئم اپیژنتیک که قبال یک گامت به عنان سلل تمایز یافته کسب که بد پاک میشند 328 سلل بار دیگر یژگی همه تانی خد را باز مییابد پس از آن عالئم اپیژنتیک خاص اسپرم تخمک ایجاد میشند. بعد از Preimplantation Reprogramming Epigenetic modifications Histone modifications DNA methylation Retroviral silencing X-inactivation Genomic imprinting Stochastic Epigenetic adaptations quiet embryos Repression 961 Histone posttranslational modifications Embryogenesis Cellular memory ARTs Gametogenesis Totipotency 942

319 لقاح نیز دمین مرحلهی تنظیمات اپیژنتیک در ریان الیه ایجاد میشد که شامل تغییرات پس از ترجمهی هیستنی متیالسین DNA هستند )شکل 4-23( تغییرات هیستنی احد سازنده کرماتین نکلئزم است. نکلئزم متشکل از د رشته DNA میباشد که اطراف پرتئینهای هیستنی پیچیده شده اند. این پرتئینها به صرت احدهای هشت تایی )اکتامر هیستنی( آرایش یافتهاند )1(. این نع بسته بندی 301 کرماتین ساختاری پیا را ایجاد میکند که میتاند دستخش تغییر شده بر مین در دسترس بدن ژنها تاثیر بگذا )3(. بنابراین کرماتین در بخشهای مختلف ژنم ساختاری متفات دا. ناحی خامش به صرت هترکرماتین هستند که ساختاری فق العاده متراکم است لی در ناحی یکرماتین که ساختاری با تراکم کمتر است ژنها فعال بده بیان میشند. عاملی که باعث تبدیل ضعیت خامش به فعال کرماتین برعکس میشد تغییرات پس از ترجمهای است که در دم پرتئین- های هیستنی همراه DNA رخ میدهد )3(. خامش یا فعال شدن بیان ژنها ابسته به نع تغییرات دم هیستنی یعنی استیالسین متیالسین همچنین باقی مانده آمیناسیدی است که دستخش این تغییرات میشد. کمی بعد از لقاح در بخش پدری ژنم سلل تخم تغییرات گستهای انجام میشد به عنان مثال پرتئینهای هیستنی جایگزین پرتامینها همچنین هیستن شماره چهار استیله لیزین 1 هیستن سه متیله میشد که هر دی اینها ساختار فعال هیستنی را ایجاد میکنند )2( )شکل 4(. اما بار دیگر در اایل دران ریانی ژنم پدری دستخش یک سری تغییرات ایجاد کننده ساختار 303 خامش هیستنی میشد. مانند متیالسین لیزین 8 لیزین 20 هیستن سه. در ژنم مادری هر د نع تغییرات ساختار 302 هیستنی رخ میدهد فعال کننده مانند متیالسین لیزین 1 هیستن 3 استیالسین هیستن 1 خامش کننده مانند 300 متیالسین لیزین 21 هیستن 1 لیزین 8 هیستن. 3 نظر بر این است که تغییرات هیستنی مذکر باعث شرع رنیسی 309 ژنهای خامش میشد که این زمان مقارن است با فعال شدن ژنم ریانی. بنابراین برچسبهای سرکب کننده فعال کننده 308 ژن میتانند ری یک قطعه کرماتین باشند این ضعیت د ظرفیتی کرماتین احتماال عامل اصلی ایجاد پرفایل بیان ژنی طی تکین ریان است )0(. تغییر ضعیت بین حالت فعال خامش کرماتین نیز تسط الحاق اریتههای خاص هیستنی 391 پرتئینهای تغییر شکل دهنده کرماتین ایجاد میشد. یکی از این اریتههای هیستنی هیستن ( 3/3. H( است. این اریتهی هیستنی همزمان با سه مج فعال شدن ژنهای ریانی ابتدا در پرنکلئس نر مش بعد از تعیض پرتامینها بعدا در ریان 2 سللی 1 سللی بالستسیست تشخیص داده شد )9(. جایگزینی هیستن 3 با. H باعث تشکیل ناحی فعال رنیسی میشد )8(. عاله بر اریتههای هیستنی پرتئینهای تغییر شکل دهنده نیز میتانند بر ساختار کرماتین اثر داشته 394 باشند )غیر کاالنسی(. این پرتئینها گاهی به صرت آنتاگنیست عمل میکنند. مثال کمپلکس سرکب کننده polycomb 392 باعث ایجاد ضعیت خامش اما پرتئینهای Trithorax باعث ایجاد حالت انتخابی در کرماتین میشند )41(. کمپلکس 393 PRC4 PRC2 در پیش هستهی ماده در اایل مرحله پیش هستهای )PN1-3( در پیش هسته نر در ااخر مرحله پیش Dynamic Acetylation Methylation H4Ac H3K4me1 975 H3K9me2, H3K22me2,H3K22me3 H4Ac, H3K4me1 H3K9me2, H3K9me3, H4K22me3 Embryonic Genomic Activation(EGA) Chromatin bivalency Chromatin remodeling proteins 984 PRC1 and PRC2 Permissive Pronucleus 949

320 391 هستهای )PN3( زیگت مش مشاهده میشند. حضر این مجمعهی پرتئینی منجر به تشکیل هترکرماتین ساختاری در ژنم پدری مادری سلل تخم آغاز مسیرهای خامشی بیان ژن در ریان میشد )44(. بنابراین هیستنها در اایل تکین ریان دستخش یک باز برنامهریزی گستهی اپیژنتیک قرار گرفته ساختار کرماتین نیز تغییر میکند. شکل a) بازبرنامه نیسی اپیژنتیکی درزمان تکین ریان در مرحله پیش از النهگزینی. درپی لقاح ژنم مادری ژنم پدری میبایست از نظر اپی ژنتیکی م بازبرنامه ریزی قرار بگیرند این باز برنامه ریزی به منظر انتقال از ضعیت مرتبط با مرحله گامتی به مرحله ریانی انجام میشد. بازبرنامه ریزی در مرحله پیش هسته آغاز میشد در تمام مدت مراحل تکین ریان در زمان پیش از النهگزینی ادامه مییابد. ژنم گامتی مربط به مادر )قرمز( ژنم گامتی مربط به پدر )آبی( ژنم ریانی )سبز(. )b( مدیفیکاسین هیستنی. پرتامینها به صرت فعاالنه از ژنم پدری جداشده )سایههای آبی( این اتفاق بالفاصله پس از لقاح به قع میپیندد. فعال شدن مدیفیکاسین هیستنی در مراحل آغازین پیش هسته تنظیم شده است )H1Ac/H3K1me4( که در پی مدیفیکاسین هیستنی )H3K1me3/H3K8me2/HeK20me2/3( به دست میآید. مدیفیکاسین هیستنی فعال کننده (H1Ac/H3K1me4( ممانعت کننده (H3K8me2/3/H3K20me4/H1K21me3) در ژنم مادری )صرتی( در زمان مرحله پیش هسته به فر یافت میشد. (c) متیالسین.DNA ژنم پدری )آبی( متحمل دیمتیالسین فعال بالفاصله پس از لقاح میشد درحالی که ژنم مادری )قرمز( به صرت غیر فعال درپی به قع پیستن تقسیمات کیلاژ متحمل دیمتیالسین میشد. )d( غیرفعال شدن کرمزم X. آبشاری از مدیفیکاسینهای بازدارنده ری کرمز X پدری در ریانهای ماده در زمان پیش از النه گزینی به قع میپیندد این پدیده با بیان ژن Xist منحصر به پدر به قع میپیندد متیالسین DNA یکی از اناع رایج تغییرات اپی ژنتیک که منجر به خامشی ژنها میشد متیالسین DNA است. جایگاه قع متیالسین ناحی حای دی نکلئتیدهای سیتزین گانین میباشد. آنزیمهای DNMT3A DNMT3B DNMT3L از جمله آنزیمهای متیل ترانسفراز هستند که گره متیل را به DNA میافیند به عنان راه انداز در متیالسین د رشتهای 393 DNA عمل میکنند. این آنزیمها در تشکیل الگی متیالسین DNAی سللهای جنسی طی رند بلغ آنها نقش دارند که در الد نر ماده به طریقی متفات انجام میشد )42 43(. دستهی دم متیل ترانسفرازها در حفظ الگی متیالسین ایجاد شده تسط گره ال قبل از النه گزینی ریان نقش دارند مانند DNMT4 که رشته DNA متیله شده را شناسایی میکند. Constitutive heterochromatin De novo methyltransferase 941