I.6. Arhitectura componenților macromoleculari ai materiei vii

Transcript

1 I.6. Arhitectura componenților macromoleculari ai materiei vii Dacă se analizează natura moleculelor din care sunt compuse celulele oricărui organism, se găsește o mare proporție de micromolecule (în primul rând apă) și de ioni anorganici. Referitor însă la componenții organici, care sunt cei specifici materiei vii, aceștia se prezintă majoritar, sub formă de molecule uriașe macromolecule cu masa cuprinsă între 10 3 și 10 9 u. Fără a intra în detalierea structurii chimice a acestor componenți (ceea ce face obiectul altor discipline) studierea organizării materiei vii impune ca etapă esențială cunoașterea arhitecturii componenților ei macromoleculari. O macromoleculă (sau un polimer) este un ansamblu de atomi legați covalent, constituit dintr-un număr mare de molecule mici asemănătoare între ele (monomeri) care reprezintă unitățile de bază din a căror legare chimică rezultă macromolecula. Dacă este un singur tip de unitate monomerică (de ex. A ), polimerul rezultat este un homopolimer (A-A-A- -A), iar dacă monomeri sunt de mai multe tipuri (A, C, G), rezultă un heteropolimer (A-G-A-A-C-G- -G-A). Este evident faptul că, pentru a se lega într-un lanț polimeric, unitățile monomerice trebuie să posede cel puțin două grupări funcționale care să permită formarea de legături. Lanțurile polimerice pot avea conformații cu diferite grade de ordonare (deci cu entropii diferite), variind între structură rigidă, așa cum este faza cristalină și ghem haotic, în care monomerii au libertate de rotație reciprocă. Conformația depinde atât de natura monomerilor, cât și de parametrii ambianți: temperatură, natura solventului, tăria ionică, ph-ul etc. Marea majoritatea a biopolimerilor sunt heteropolimeri constituiți din monomeri diferiți, dar evident, aparținând aceleași clase de substanțe. Principalele tipuri de unități monomerice sunt aminoacizii, nucleotidele și monozaharidele, cărora le corespund, respectiv, polimerii: polipeptide (conținute în proteine), polinucleotide (ADN și ARN) și plizaharide. La acestea se mai adaugă și unii polimeri hidrocarburici, cum ar fi cauciucul natural. Formarea biopolimerilor din unitățile monomerice de bază reprezintă o scădere a gradelor de libertate de mișcare, deci a entropiei, pe măsura creșterii cantității de informație structurală. Acest proces de ordonare nu se limitează doar la formarea lanțului polimeric cu o anumită structură chimică, structura primară, ci continuă cu stabilirea unei succesiuni de structurări ierarhizate. Următorul nivel de structurare îl constituie structura secundară care implică formarea de zone ordonate într-un lanț biopolimeric, datorate, atât forțelor London van der Waals (stabilirea de punți de hidrogen), cât și interacțiunilor hidrofobe. Deși punțile de hidrogen sunt slabe, ele joacă un rol important, pentru că numărul lor este de același ordin cu al unităților monomerice. Astfel, structura secundară depinde în special de posibilitatea formării de punți de hidrogen între diferitele grupări de pe lanțul polimeric, această structură fiind, deci, determinată de atomii componenți ai lanțului, cu alte cuvinte, depinde direct de structura primară. I.6.1. Structura proteinelor și a acizilor nucleici Această problemă a fost clarificată de Pauling și Corey. După cum se cunoaște, proteinele reprezintă catene lungi de molecule formate prin polimerizarea aminoacizilor. În lungul legăturilor peptidice apare o mezomerie 1, în care o parte a legăturii duble se repartizează orbitalului atomului de oxigen, iar o parte se repartizează grupării NH și astfel apare un plan determinat de atomii care au creat mezomeria. Pattern-ul de împachetare al lanțului polipeptidic poate fi descris prin prisma unghiurilor de rotație internă în jurul legăturilor existente în catena principală. Atât între atomul de azot (N) și atomul de carbon (C α ), cât și între 1 Mezomeria sau rezonanța reprezintă un mod de a descrie electronii delocalizați în cadrul anumitor molecule sau ioni poliatomici unde legătura nu mai poate fi exprimată doar cu ajutorul unei formule de tip Lewis. O moleculă sau un ion cu electroni delocalizați sunt reprezentate cu ajutorul mai multor structuri de rezonanță cunoscute și sub denumirea de forme canonice. 40

2 atomul C α și atomul C, implicați în constituția catenei polipeptidice se realizează întotdeauna legături simple. Rotația internă în jurul acestor legături nu este restricționată de structura electronică a legăturii ci, doar de posibilele coliziuni sterice 1 ale conformației rezultate. Spre deosebire de cele două legături simple, legătura peptidică are un caracter parțial de dublă legătură cu un unghi de rotație internă restricționat. Acest aspect a fost pentru prima dată identificat de către Linus Pauling. Astfel, grupul peptidic poate lua o conformație cis sau trans, izomerul trans fiind mult mai stabil. Pentru toți aminoacizii, cu excepția prolinei, diferența energetică dintre conformațiile cis și trans este foarte mare. În cazul prolinei, diferența energiei conformaționale este de doar 5 kj mol -1 (1,2 kcal mol -1 ). Teoretic, din această cauză, în structura proteinelor toate peptidele cis apar între prolină și un rest ce o precede în catenă. La modul general, din punct de vedere geometric, catena principală a unei proteine reprezintă o succesiune de puncte în spațiu: C α C N C α C N. Pentru o cât mai bună aproximare, lungimea legăturilor și a unghiurilor (distanța dintre fiecare punct succesiv și a unghiurilor determinate de fiecare trei puncte succesive) este considerată constantă. Astfel, gradele de libertate ale catenei implică patru atomi succesivi și sunt influențate de posibilitatea de rotație a primilor trei atomi (ce constituie planul legăturii peptidice C α i-1 Ci-1 Ni) în raport cu al patrulea C α i. Prin convenție, unghiul de rotație Ni C α i este denumit phi (φ) iar unghiul de rotație C α i Ci este denumit psi (ψ). Unghiul omega (ω) este chiar legătura peptidică Ci Ni+1 care este restricționat la o valoare de 180 (trans) sau 0 (cis). Figură 8. Unghiurile conformaționale ce descriu plierea lanțului polipeptidic. Deoarece în lungul lanțului polipeptidic se găsesc multe grupări NH și CO, între care se pot forma legături prin punți de hidrogen, molecula va căpăta structura care să prezinte un maxim de punți de hidrogen posibile, ceea ce înseamnă că se tinde spre o conformație cu energie internă minimă. Catenele polipeptidice ale proteinelor pot avea, două forme de bază ca structură secundară: a) structură secundară în care legăturile de hidrogen se formează între catene diferite; b) structură secundară în care legăturile de hidrogen sunt intra-catenare. Primul tip se datorează posibilității de rotire liberă a legăturii de la atomul C α. La acest nivel, planul legăturii peptidice se poate frânge și astfel, apare structura secundară de tip foaie pliată (foaie beta pliată sau β-pliată), având legături de hidrogen inter-catenare. Al doilea tip de structură secundară apare datorită numărului mare de punți de hidrogen ce se pot forma în cadrul aceleași catene (intra-catenare). În acest caz se formează ca structură secundară un alfa helix (α-helix). Distanța la care aceeași grupare moleculară (structurală) se repetă în cadrul unui lanț macromolecular cu structură secundară se numește perioadă de identitate. În cazul acizilor nucleici (ADN), moleculele au tot o structură spiralată ca variantă a structurii secundare numită helix Watson-Crick (helix-adn). Acest helix este compus din 1 Efectele de natură sterică sunt o cauză indirectă a spațiului ocupat de care fiecare atom din cadrul unei molecule. Astfel, apropierea atomilor constituenți este asociată cu un cost energetic (creșterea entropiei) cauzat de suprapunerea norilor electronici (repulsie Pauli sau repulsie Born). Acest aspect, afectează, într-o mai mică sau mai mare măsură, conformația și reactivitatea moleculei. 41

3 două catene lungi, torsionate împreună. În acest caz structura este stabilizată prin punți de hidrogen, care realizează legături între bazele componente ale dublei spirale. Această structură spiralată spre dreapta are 34Å și conține 10 nucleotide pentru fiecare pas al spiralei. Un alt nivel de structurare întâlnit la proteine este structura terțiară. Structura terțiară a unei proteine reprezintă forma geometrică finală pe care aceasta o poate lua o catenă polipeptidică. Această structură este determinată de o varietate de punți și legături care pot să apară între diferite porțiuni ale lanțului de aminoacizi. Ca rezultat al acestor interacțiuni dintre diferite porțiuni ale lanțurilor de aminoacizi se formează pliuri și bucle în lanțul proteic, astfel încât fragmente diferite ale aceluiași lanț pot ajunge să fie legate împreună. Structură terțiară au absolut toate proteinele (și cele constituite dintr-un singur lanț polipeptidic, și cele cu multiple lanțuri polipeptidice) în timp ce structură cuaternară au doar proteinele multimerice (cu cel puține două lanțuri polipeptidice). În stabilitatea structurii terțiare se manifestă patru tipuri de interacțiuni care pot să apară între diverși radicali ai aminoacizilor din componența lanțului peptidic: punți de hidrogen, punți disulfidice, punți saline și interacțiunea hidrofobă. Punțile de hidrogen, se formează într-o varietate de circumstanțe. Ele contribuie atât la stabilitatea structurii secundare cât și la stabilitatea celei terțiare. Cele mai uzuale cazuri implică punți de hidrogen între grupările alcoolice, între grupări acide, între o grupare alcoolică și una acidă sau între o grupare alcoolică și o amină sau o amidă. Punțile disulfidice, se formează între atomii de sulf aparținând la două molecule de cisteină prin oxidarea grupărilor sulfhidril (-SH) ale acesteia, cisteina fiind singurul aminoacid care are în componență așa ceva. Aceste legături pot să apară într-un singur lanț polipeptidic sau între două lanțuri complet diferite. O O O punte disulfidică O HO SH HS OH HO NH 2 NH 2 NH 2 S S NH 2 OH Rolul punților disulfidice constă în creșterea stabilității mecanice a structurii proteice. Acestea determină și o serie de proprietăți chimice prin stabilirea conformației active, iar la unele proteine pot să joace un rol catalitic. Punțile saline sau punțile ionice (interacțiuni puternice de natură columbiană), rezultă din neutralizarea unui acid cu o amină. Interacțiunea propriu-zisă este de natură ionică și are loc între gruparea pozitivă amoniu și gruparea negativă acidă. H 3 N + R CH C O O - H 3 N + R CH C O O - R H 3 N + CH C O R O - H 3 N + CH C punte salină O O - Interacțiunile hidrofobe, reprezintă un alt factor important care contribuie la stabilitatea structurii terțiare a proteinelor. Atât timp cât în componența unei proteine intră atât lanțuri polare cât și nepolare, într-o soluție apoasă moleculele se comportă ca picăturile de ulei, cu grupările polare la exterior în contact cu soluția (apa) și grupările nepolare la interior. De asemenea și moleculele solventului din imediata vecinătate a proteinei se ordonează în funcție 42

4 de grupările polare. Astfel, față de grupările nepolare, moleculele solventului contribuie în mod negativ la energia entropică, favorizând astfel structura împachetată (terțiară) în detrimentul stării denaturate (primară). Foarte multe proteine, în forma lor activă (funcțională), există sub forma unor agregate cu mai mult de un lanț polipeptidic împachetat, această agregare determină structura cuaternară. Structura cuaternară este rezultatul interacțiunii a mai mult de o moleculă proteică (lanț polipeptidic), denumită în acest context subunitate proteică și care este parte integrantă din ansamblul complexului proteic. Cu alte cuvinte, o subunitate proteică reprezintă o singură moleculă proteică care se asamblează cu alte molecule proteice pentru a forma o proteină multimerică sau oligomerică. Proteinele, în general și enzimele, în special, au o structură multimerică. Exemple de proteine cu structură cuaternară: ADN-polimeraza 1, hemoglobina 2, nucleosomul 3, canalele inionice 4, microtubulii, proteinele care intră în structura citoscheletului etc. Structură cuaternară (1bpd), ADN-polimeraza de la șobolan. Culorile reprezintă prin convenție structurile secundare: α-helix cu roșu, β-pliată cu albastru. Sursă: RCSB Protein Data Bank Structură cuaternară (1aoi), complexul nucleosom-adn. În centru sunt reprezentate componentele nucleosomale (H2a, H2b, H3, H4, reprezentate în culori diferite) înconjurate de un fragment de ADN cu lungimea de 146bp. Sursă: RCSB Protein Data Bank La unele ansambluri proteice o anumită subunitate poate avea rol de subunitate reglatoare, iar alta funcționează ca subunitate catalitică. O enzimă care deține ambele tipuri de subunități este numită holoenzimă. La majoritatea proteinelor multimerice, numărul de subunități variază între 2 și 12, cele mai multe având 2 sau 4. Excepție fac însă, complexele enzimatice și virusurile care pot avea mult mai multe subunități. În proteinele cu puțini monomeri sau cu un număr mic de subunități, toate interacțiunile care sunt posibile în cadrul unei subunități trebuie să fie îndeplinite în totalitate, doar astfel, pot să apară agregate moleculare foarte mari. Proteinele 1 ADN-polimeraza este o enzimă care catalizează polimerizarea dezoxiribonucleotidelor într-o catenă de ADN. Aceasta are un rol deosebit în replicarea macromoleculei de ADN când citește o catenă intactă de ADN, considerată matriță, în scopul de a sintetiza o nouă catenă. ADN-polimeraza poate să adauge noi nucleotide libere doar la capătul 3 terminal a noii catene în formare. Acesta fapt determină direcția de elongare care este întotdeauna 5-3. Nu este clarificat încă motivul pentru care ADN-polimeraza este capabilă să înceapă sinteza unei noi catene (de novo). Structura acestei enzime este înalt conservată, ceea ce implică diferențe mici de la o specie la alta. 2 Hemoglobina este o proteină tetramerică ce are în componență două lanțuri, fiecare cu câte două polipeptide diferite (lanțul-α și lanțul-β). Fiecare subunitate include o grupare hem care conține un atom de Fe capabilă să lege oxigenul. 3 Nucleosomul constituie unitatea fundamentală care stă la baza cromatinei eucariotelor. 4 Canalele ionice sunt proteine formatoare de pori care sunt implicate în determinarea și controlul variației tensiunii de-a lungul membranei plasmatice la toate celulele, prin controlul concentrației ionilor de o parte și de alta a membranei celulare, facilitând trecerea lor împotriva gradientului electrochimic. 43

5 multimerice posedă un punct al simetriei de grup, constând în una sau mai multe axe care se intersectează. O simetrie tetraedrică este pusă în evidență acolo unde monomerii sunt în vârfurile unui tetraedru. Proteinele hexamerice pot forma prisme triunghiulare (trigonale), iar cele octamerice, cuburi sau prisme pătratice. Pentru a atinge o anumită funcție specifică, există mai multe argumente care demonstrează de ce un ansamblu de subunități împachetate în diferite conformații tridimensionale este mult mai avantajos din punct de vedere al evoluției materiei vii, față de o moleculă gigantică asamblată doar prin legături covalente. Unul din motive este acela că pentru codificarea unei astfel de proteine (cu structură cuaternară) este nevoie de o cantitate mult mai mică de ADN, deoarece monomerii dețin ei înșiși informația de auto-asamblare în configurații multimerice. De asemenea, subunitățile cu funcții particulare pot fi combinate cu alte subunități în scopul realizării de proteine cu complexitate foarte mare și cu funcții noi, diferite de cele ale subunităților din care au luat naștere. Structură cuaternară (1a3n), deoxi-hemoglobina umană. În culori diferite sunt evidențiate cele patru subunități proteice globulare (ce au în componență numai α-helix-uri): două subunități α și două subunități β. Sursă: RCSB Protein Data Bank. Structură cuaternară (1k4c), complexul kcsa-fab al canalului de K voltaj-dependent în situația unei concentrații foarte mari de K +. Culorile evidențiază subunitățile proteice. Sursă: RCSB Protein Data Bank. I.6.2. Structura și rolul membranelor vii Membrana este un constituent celular căruia multă vreme i s-a acordat un rol mai mult sau mai puțin pasiv în viața celulei, în special rolul de izolare și de apărare față de mediu. În schimburile cu mediul, dictate de caracterul de sistem deschis al celulei, membrana era privită ca un fel de barieră mecanică, asemănătoare unei site. Astăzi este cunoscut faptul că membrana plasmatică, ca și alte membrane vii, au o structură complexă și îndeplinesc numeroase funcții, majoritatea legate de procese metabolice fundamentale. Prezența membranelor este strâns legată de necesitatea existenței unor compartimente, în vederea dirijării și controlului fluxului de substanțe și energie. Membranele vii au proprietăți de semipermeabilitate și de selectivitate. Transportul selectiv de substanțe din celulă și către celulă este în general un proces activ, adică are loc cu consum de energie metabolică, fiind mijlocit de anumite structuri ale membranei (transportori specifici). În același timp, membranele constituie sediul unor enzime sau complexe funcționale cu rol important în inter-conversia și stocarea diferitelor tipuri de energii, în desfășurarea și controlul unor reacții biochimice, în recunoașterea unor molecule cu rol de stimuli etc. 44

6 Figură 9. Structura membranei celulare. Cercetările au dovedit că membranele sunt formate, în esență, din lipide (mai ales fosfolipide) și proteine. Moleculele fosfolipidice sunt dispuse într-un strat dublu, astfel încât părțile lor hidrofobe vin în contact unele cu altele formând interiorul izolat al membranei, iar extremitățile polare rămân descoperite spre exteriorul și, respectiv, interiorul celulei. Poziția proteinelor în cadrul membranelor este încă un subiect de discuție, dar cele mai multe observații experimentale sunt în concordanță cu așa-numitul model al mozaicului fluid (fluid-mosaicmembrane). Acest model se bazează pe cercetări moderne de microscopie electronică, mai ales prin folosirea tehnicii de fracturare prin înghețare 1 (freeze-fracture-technique). Combinate cu alte cercetări, asemenea observații confirmă ideea stratului dublu și indică faptul că printre moleculele fosfolipidice, sau la suprafața lor, se află molecule proteice (din loc în loc). Unele dintre ele traversează complet membrana, iar altele numai parțial. Printre acestea se află complexe lipoproteice cu rol enzimatic sau de transport, molecule glicoproteice cu rol antigenic etc. 1 Această tehnică constă în examinarea unei replici fine (obținută cu ajutorul unor electrozi platină-carbon) a suprafeței descoperite în urma fracturării pieselor înghețate. Constatarea care s-a făcut este că fracturarea are loc, de preferință, între cele două straturi lipidice, astfel că este dezvăluită tocmai structura internă a membranei. 45

7 În ceea ce privește atribuirea însușirii de fluid, aceasta rezultă, de asemenea, din observații experimentale, care atestă faptul că există o mișcare laterală continuă în planul membranei, la care participă nu numai fosfolipidele, ci și proteinele. În schimb, mișcarea în plan perpendicular, adică schimbul de fosfolipide între stratul intern și cel extern al membranei, este extrem de rară. Toate aceste observații indică faptul că membrana este un fluid structurat care își păstrează forma și integritatea generală și ai cărui componenți individuali sunt într-o continuă mișcare. Multe din cunoștințele despre structura și funcționarea membranelor au rezultat din studiul unor membrane artificiale, adică a unor membrane model. Din multitudinea de variante, două modele sunt deosebit de importante, ele fiind modele artificiale, cu ajutorul cărora au putut fi reproduse și studiate anumite funcții, exact ca în cazul membranelor naturale. În ambele cazuri este vorba despre membrane lipidice (în particular, fosfolipidice), cu strat dublu ( bilayer lipid membranes ). Primul model este vezicular, cunoscut și sub numele de liposom 1, iar celălalt este plan, cunoscut sub numele de membrană lipidică neagră. Secțiuni prin structuri care pot fi formate de moleculele de fosfolipide în soluții apoase. Avantajul liposomilor constă în faptul că pot fi formați într-o anumită soluție, iar apoi, prin metode de filtrare pe coloane speciale, se poate schimba complet mediul lor de suspensie. În felul acesta se realizează o diferență de concentrație sau/și de compoziție între interior și exterior, iar apoi se urmăresc schimburile ce au loc spontan sau prin mijlocirea unor transportori specifici, mai cu seamă așa numiții ionofori 2 (transportori de ioni). Cea de a doua categorie de membrane model (membranele lipidice negre) se deosebesc de liposomi prin faptul că sunt plane și au încorporat în structura lor un solvent organic (de ex. acetonă), în care au fost dizolvate inițial lipidele. Membrana se formează în mod spontan în urma întinderii soluției de lipide peste un orificiu de aproximativ 1mm 2, practicat în peretele unei despărțituri sau al unui vas mic de teflon sau polietilenă. Aceste membrane par negre deoarece, la dimensiunile lor de aproximativ 50Å nu reflectă razele luminoase. Avantajul îl constituie dimensiunile relativ mari ale celor două compartimente pe care le desparte membrana, ele fiind astfel direct accesibile unor măsurători macroscopice cu ajutorul electrozilor de ph sau a celor specifici pentru diverși ioni, precum și măsurătorilor electrice de conductibilitate și capacitate specifică. În cazul ambelor modele, dar mai ales în cazul liposomilor, au fost puse la punct tehnici pentru încorporarea unor proteine (de ex. complexe enzimatice sau de transport), astfel încât au putut fi realizate și studiate anumite funcții, exact ca în cazul membranelor naturale, dar cu avantajul simplității și al posibilităților multiple de manipulare și control pe care le oferă membranele model. 1 Există diferite modele de a obține liposomi, dintre care cea mai rapidă și sigură este cea a ultrasonării. Materialul fosfolipidic, extras chiar din membrane naturale, este suspendat într-o soluție apoasă și supus acțiunii ultrasunetelor. La început, prin dispersarea lipidelor, se obține o soluție lăptoasă, în care predomină vezicule cu mai multe straturi duble, între care a fost închisă o cantitate oarecare de solvent. Pe măsura dispersării tot mai accentuate, soluția se clarifică complet. În acest moment, s-a atins stadiul de liposom propriu-zis (veziculă cu un singur strat dublu). Compoziția, structura și comportarea cestei vezicule este foarte apropiată de cea a membranei plasmatice. 2 Ionoforii sunt transportatori mai mult sau mai puțin specifici pentru anumiți ioni. Ei pot fi folosiți pentru transportul unor ioni prin membrane naturale sau artificiale și, din studiul caracteristicilor de transport, se pot face anumite deducții referitoare la mecanismul transportului și structura membranei. Cei mai cunoscuți ionofori fac parte din grupul antibioticelor, fiind molecule polipeptidice. 46

8 Biofizică celulară Problema generală a organizării materiei vii (din orice organism) include biosinteza multitudinii de componenți moleculari și asamblarea acestor molecule în structuri ordonate formând organitele, celulele și, în ultimă instanță, întreg organismul. Asamblarea moleculelor biopolimerice în structuri de nivel superior este un proces de auto-asamblare, care decurge din tendința fiecărei molecule de a ajunge în poziția minimului de energie liberă posibilă în condițiile date. Deși viața este un ansamblu de procese care sunt îndepărtate de starea de echilibru termodinamic iar entitățile biologice sunt structuri disipative, ansamblurile moleculare tind să se găsească în starea cu energie minimă compatibilă cu barierele energetice existente în sistem. Ansamblul acestor bariere definește caracterul disipativ al structurii. Celulele reprezintă un sistem termodinamic deschis. În relațiile cu mediul înconjurător, celula recepționează mesajele sub formă de cuante de energie, substanță sau informație pe care le recunoaște, le interpretează și le apoi le prelucrează. Coordonându-și activitatea în funcție de particularitățile mediului ambiant, celula este capabilă de a comunica cu structurile în anturajul cărora se află. Comunicarea dintre celule se face pe cale chimică, prin intermediul mediatorilor chimici sau a neurotransmițătorilor. Un mesaj chimic este reprezentat printr-o moleculă care este recunoscută de către o altă moleculă sau fracțiune moleculară numită moleculă receptoare, localizată în structura biomembranelor. Moleculele receptoare, constituie din acest punct de vedere adevărate antene moleculare, adevărate platforme pentru chemo-recepție. Molecula mesaj, numită moleculă agonist, dacă este hidrofilă, nu poate pătrunde în interiorul celulei, datorită faptului că nu poate traversa membrana lipidică. În acest caz, mesajul lor trebuie prelucrat, adică este codificat și apoi este transmis în interiorul celulei. Exemplu: (vezi Figură 10) receptorul membranar ocupat de o moleculă mesageră activează o enzimă membranară (adenilatciclaza). Aceasta scindează molecula de ATP la camp, moleculă care face parte din grupul nucleotidelor ciclice cu rol de mesager secundar intracelular. La rândul său, camp activează în continuare o altă enzimă, proteinchinaza, care mai departe, fosforilează unele proteine din citosol, transformându-le în enzime capabile să modifice o proteină X într-o proteină Y. În acest mod are loc codificarea mesajului inițial, în mesaje intracelulare care sunt în același timp și amplificate numeric. Receptorii sunt, de regulă, proteine, deoarece numai acestea pot prezenta structuri tridimensionale suficient de complexe și variate pentru a se asigura o mare specificitate de recunoaștere între molecula mesageră și cea receptoare. Când are loc o astfel de cuplare, se inițiază un lanț de reacții fizico-chimice. În primul rând, prin cuplarea dintre molecula mesageră și cea receptoare, se modifică dipol-momentul structurii nou create și prin interacțiuni cu dipol-momentele moleculelor vecine, se modifică întreg dipol-momentul membranar. În consecință, au loc, în primul rând, reacții de orientare și reorientare a structurilor moleculare ale membranei, caracterizate prin apariția unor mișcări moleculare de mai mult tipuri: - de translație moleculară în porțiunile superficiale interne sau externe a membranei celulare. - mișcări flip-flop de migrare a unei molecule de pe o parte pe cealaltă a membranei celulare. 47

9 48 Figură 10. În relațiile oricărei celule cu mediul extern, un rol esențial îl au receptorii din membrană Aceste mișcări vor conduce la o reorganizare și o remaniere a structurilor membranare care au drept consecință deschiderea sau închiderea porilor membranari precum și modificarea dimensiunilor porților ionice și moleculare. Farmacologi au constat că unele produse farmaceutice sunt capabile să se lege specific de unii receptori naturali, dar sunt incapabile să producă un efect fiziologic indiferent de concentrație. Aceste substanțe au fost numite substanțe antagoniste față de un anumit receptor, pentru că blochează receptorul, acesta devenind incapabil de a mai primi mesajul molecular natural. În reacțiile receptor-agonist, pe de o parte, și receptor-antagonist, pe de altă parte, se disting următoarele particularități funcționale: - efectul de competitivitate; - efectul de saturație; - efectul de reversibilitate; Din considerente insuficient elucidate, se constată că într-o situație de tipul: receptor-agonistantagonist, probabilitatea de cuplare a receptorului cu antagonistul este mai mare decât cea de

10 cuplare cu agonistul. Deoarece densitatea de receptori pe unitatea de suprafață membranară este limitată, în mecanismul de cuplare a receptorului se va manifesta și efectul de saturație, acest efect fiind la fel de important ca și caracterul de competitivitate dintre agonist și antagonist. Întotdeauna, cuplarea receptorului cu agonistul va fi urmată de o decuplare naturală, datorită existenței cel puțin a unui sistem enzimatic de decuplare. Acesta va duce la eliberarea moleculei receptoare și la reluarea ciclului funcțional. Deoarece, pentru moleculele antagoniste nu se cunoaște un mecanism enzimatic de decuplare, sistemul receptor-antagonist cuplat prezintă o mai mare stabilitate, deci o reversibilitate scăzută, ceea ce are ca efect scoaterea temporară (sau totală) din circuitul funcțional al unui număr mai mic sau mai mare de receptori membranari. Printr-o comparație forțată, se poate afirma că, atunci când antagonistul ocupă locul agonistului, se petrece un fenomen similar cu situația în care într-un lacăt se introduce un obiect care împiedică cheia să pătrundă și să-l deschidă. Acest fapt are o importanță farmacologică deosebită pentru că s-au elaborat multe medicamente cu acțiune antagonistă. Astfel de medicamente sunt antihistaminele menite să blocheze efectul patogen al histaminelor 1 în producerea ulcerelor gastrice. Tot asemănător acționează medicamentele beta-blocante, care în mod specific, împiedică noradrenalina să se fixeze pe receptorii ei cardiaci, prevenind instalarea unor afecțiuni cardiovasculare (hipertensiune sau infarct miocardic). II.1. Fenomene de transport prin biomembrane Existența celulei vii ca sistem termodinamic deschis impune prezența unui schimb permanent de substanțe între mediul extern și cel intern. Acest lucru poate fi realizat atât prin distrugerea locală a integrității membranei, cum este cazul proceselor de fagocitoză (înglobarea unor particule relativ mari prin emiterea de pseudopode) și pinocitoză (înglobarea unor picături mici ce conțin anumite substanțe prin formarea unei invaginații locale), sau cu păstrarea integrității membranei prin procese de difuzie și transport activ, adică prin procese bazate pe permeabilitatea membranei. II.1.1. Transportul pasiv. Considerând faptul că atât mediul intern cât și cel extern sunt constituite din soluții apoase, procesul fizic primordial care stă la baza schimbului de substanță între celulă și mediu este difuzia. Întrucât, în acest caz, gradientul de concentrație se stabilește, practic, pe o distanță egală cu grosimea membranei, legea întâi a lui Fick 2 poate fi scrisă astfel: dddd = PP AA (cc dddd 1 cc 2 ) FFFFFFFF = PP AA (cc 1 cc 2 ) (2.1) Unde: c1 și c2 reprezintă concentrațiile substanței considerate de o parte și de alta a membranei, P reprezintă coeficientul de permeabilitate (viteza de pătrundere prin membrană pentru diferite substanțe în anumite condiții date ale diferenței de concentrație - m/s) și A reprezintă aria suprafeței de difuziune (m 2 ). Asemenea coeficienți pot fi calculați doar dacă se măsoară fluxurile de substanță (influxul sau/și efluxul), adică cantitatea de substanță care intră sau iese din compartimentul considerat în unitatea de timp. Desigur, pentru calcul este nevoie să se cunoască suprafața de schimb și diferența de concentrație a substanțelor. Cele mai moderne 1 Histamina este o substanță biologică implicată atât în răspunsul imun cât și în reglarea fiziologică a funcțiilor tubului digestiv (stomac, intestin) unde acționează ca un neurotransmițător. Aceasta se găsește aproape în toate celulele organismului animal. Noi investigații indică că histamina joacă un rol important și în chemotaxia celulelor albe din sânge. Celulele parietale produc acid gastric (acid clorhidric) ca răspuns la cuplarea cu: histamina (agonist) prin intermediul receptorilor H2-histaminici, cu acetilcolina prin intermediul receptorilor M2 și cu gastrina prin intermediul receptorilor CCK2. Receptorii histaminici acționează prin creșterea camp intracelular în timp ce receptorii muscarinici și gastrinici induc creșterea Ca 2+ intracelular. Atât camp cât și Ca 2+ intervin prin intermediul proteinchinazelor în intensificarea transportului acidului în stomac. 2 Adolf Eugen Fick (1 aprilie august 1901), fiziolog german creditat pentru invenția lentilelor de contact și pentru legile difuziei (două principii), legi care guvernează difuzia unui gaz printr-o membrană fluidă (1855). 49

11 metode de măsurare a fluxurilor se bazează pe folosirea izotopilor radioactivi. Prin folosirea lor, s-a putut determina cu precizie valoarea coeficienților de permeabilitate pentru diferite membrane și substanțe. Dacă luăm în considerare compoziția chimică (predominant lipidică) a membranelor biologice, este de așteptat ca substanțele liposolubile să aibă coeficienți mari de permeabilitate. De fapt, pentru multe asemenea substanțe permeabilitatea lor este proporțională cu coeficientul de partiție ulei/apă (raportul dintre concentrația substanței în ulei și apă, după stabilirea echilibrului de o parte și de alta a unei interfețe ulei/apă). Interesant este însă faptul că unele substanțe care nu se dizolvă în lipide (apă, ioni, aminoacizi, glucoză etc.) pătrund relativ ușor prin membrană. În acest caz, se consideră că există structuri specifice, anumiți pori sau chiar transportori, care facilitează pătrunderea acestor substanțe. Mecanismul, evident, nu este același pentru toate categoriile de substanțe. În unele cazuri pătrunderea poate să fie pasivă, în conformitate cu anumite forțe fizico-chimice, iar în alte cazuri poate fi activă, cu consum de energie metabolică. În conformitate cu ecuația (2.1), s-ar părea că singura forță care determină difuzia este diferența de concentrație. Nu trebuie uitat însă că, în cazul membranelor vii, există și o polarizare electrică a acestora. Potențialul de membrană constituie și el o forță importantă de difuzie. Vorbind în termeni termodinamici, energia liberă utilizată în procesul de difuzie este dată de un potențial electrochimic. În sens mai general, este posibil să intervină și un gradient de presiune și chiar unul de temperatură, dar aceștia nu constituie factori de importanță universală în sistemele biologice și, de aceea, nu vor fi luați în discuție. Substanțele cu sarcină electrică nu se distribuie în conformitate cu gradientul de concentrație (în cazul de față, cu diferența de concentrație între cele două fețe ale membranei), deoarece ele sunt supuse ambelor componente (și electrică și de concentrație) ale gradientului electrochimic. În felul acesta, ele se pot acumula împotriva diferenței de concentrație, pe seama potențialului electric. De exemplu, pătrunderea unui cation (C + ), a cărui concentrație este inițial la echilibru chimic, va fi favorizată de existența unui potențial de membrană cu polaritatea (+) la exterior și (-) la interior și va fi frânată de un potențial cu polaritate inversă. Concentrația finală a ionului în fiecare compartiment va fi dictată de legea echilibrului electrochimic. Valoarea potențialului la echilibru este dată de legea lui Nernst 1. În cazul în care este vorba de mai mulți ioni, se scrie o ecuație de tip Nernst pentru fiecare din ei, iar potențialul total va fi o sumă de potențiale. Pentru ioni monovalenți forma ecuației este: NN EE mm = RRRR FF llll ii PP MM ii +[MM + ii ] eeeeee + MM jj PP AAii [AA jj ] iiiiii NN ii PP MMii +[MM + ii ] iiiiii + MM PP AAii [AA jj jj ] eeeeee Dacă se explicitează pentru ionii monovalenți care sunt implicați în potențialul de repaus a membranei celulare (Na +, K +, Cl - ) atunci ecuația de mai sus se poate scrie: EE mm KKxx NNNN 1 xx CCCC = RRRR FF llll PP NNNN+[NNNN + ] eeeeee + PP KK+[KK + ] eeeeee + PP CCCC [CCCC ] iiiiii PP NNNN +[NNNN + ] iiiiii + PP KK +[KK + ] iiiiii + PP CCCC [CCCC ] eeeeee Ca regulă generală, orice transport care se face conform gradientului electrochimic este considerat drept transport pasiv. Există, însă, și un caz special de transport pasiv, așa-numita difuzie facilitată. Și în acest caz, procesul se supune regulii de mai sus, dar se desfășoară cu o 1 Walther Hermann Nernst (25 iunie noiembrie 1941), fizician-chimist german cunoscut pentru teoriile privitoare la calcularea afinității chimice, concretizate în al treilea principiu al termodinamicii și pentru care a primit premiul Nobel pentru chimie în Nernst a contribuit la stabilirea unor noi direcții în chimia-fizică aducându-și aportul în electrochimie, termodinamică, chimia stării solide și fotochimie. De asemenea este cunoscut pentru ecuația care-i poartă numele: EE = RRRR llll cc 1 unde: E este potențialul redox, R este constanta universală a gazelor nnnn cc 2 (8,3143 J/mol K = 0,082 L atm/k mol = cm 3 mmhg/k mol), T este temperatura absolută exprimată în grade Kelvin, n reprezintă numărul sarcinilor electrice ale ionului considerat, F este constanta lui Faraday (9, C/mol), c1 și c2 reprezintă concentrațiile ionului considerat în compartimentul 1 respectiv 2. 50

12 viteză mult mai mare decât o difuzie simplă. Cu alte cuvinte, exact ca în cazul reacțiilor catalizate, nivelul echilibrului final nu este afectat, dar se atinge mult mai repede. De aceea, acest tip de transport poate fi descris, formal, printr-o cinetică de tip Michaelis-Menten 1 (valabilă pentru reacțiile enzimatice). Ca exemple de difuzie facilitată pot fi amintite: transportul glucozei prin membrana hematiei, transportul ionilor K + în prezența valinomicinei (prin membrane naturale și artificiale) și transportul apei. În condiții de echilibru osmotic, apa se supune legilor obișnuite ale difuziei. În condiții de dezechilibru osmotic, apa este transportată mult mai rapid, ca și cum trecerea unor molecule de apă ar antrena trecerea altora. Acest aspect implică existenței unor structuri speciale (pori sau transportori) care să favorizeze trecerea apei în anumite condiții, așa cum se pare că există în cazul altor procese de difuzie facilitată. Este important de subliniat că transportorul glucozei din hematii a fost izolat și reconstituit în liposomi, realizându-se fenomene de transport specifice (sensibile la aceiași inhibitori ca și procesul natural). II.1.2. Transportul activ. Ideea care a stat inițial la baza acordării numelui de transport pasiv a fost aceea a neintervenției active a celulei (fără consum de energie metabolică). La o analiză mai atentă, acest lucru pare să fie adevărat în toate cazurile definite ca transport pasiv. De exemplu, potențialul de membrană, care permite acumularea unor substanțe împotriva gradientului de concentrație, dar în conformitate cu gradientul electrochimic (deci, după regula transportului pasiv), este în fond menținut pe bază de consum metabolic. Chiar și în cazul difuziei facilitate se ridică problema originii și întreținerii structurilor specifice (a transportorilor) care participă în acest proces. Din acest punct de vedere este evident că, pentru sinteza și întreținerea lor, s-a consumat și se consumă energie. În opoziție cu transportul pasiv, transportul activ se definește ca fiind acea formă de transport care necesită energie metabolică. După cum s-a prezentat mai sus, această condiție este însă foarte relativă, deoarece multe din transporturile calificate ca pasive necesită, în ultimă instanță, energie, ele fiind cuplate (chiar dacă în mod indirect și îndepărtat) cu un proces metabolic furnizor de energie. În unele cazuri, această cuplare este evidentă, imediată, și, ca atare, au fost catalogată drept transport activ. Există diferite metode de a decide asupra caracterului activ sau pasiv al unui anumit fenomen de transport. Se poate aminti, în acest sens, așa numita metodă a curentului de scurtcircuit care se aplică numai în cazul membranelor mari (epitelii). Aceasta constă în aplicarea unui potențial care să anuleze gradientul de concentrație și potențialul electric ce determină fluxurile pasive și măsurarea consecutivă a curentului electric dintre cele două compartimente, curent care se datorează fluxului activ de ioni (vezi Figură 11). O metodă mai simplă și cu aplicabilitate generală este cea a utilizării unor agenți blocanți specifici și, respectiv, a unor agenți inhibitori ai proceselor generatoare de energie (în primul rând al oxidării fosforilante). Din prima categorie face parte glicozidul cardiac numit ouabaină, care blochează pompa de Na/K din membrana celulară, așa cum se va descrie mai jos. Din a doua categorie face parte cianura și azida ca inhibitori ai respirației și oligomicina care blochează formarea și (sau) utilizarea legăturilor fosforice macroergice. Întrucât caracteristica principală a transportului activ este aceea a cuplării cu un proces furnizor de energie, acest proces va fi detaliat în cele ce urmează. Se știe că forma chimică esențială de înmagazinare a energiei în celulă este ATP-ul. Dacă transportul se efectuează ca o consecință directă a utilizării energiei eliberate prin hidroliza moleculei de ATP, atunci se vorbește despre un cuplaj direct (transport activ primar). 1 Ecuația de cinetică Michaelis-Menten (după numele celor care au dezvoltat-o, Leonor Michaelis și Maud Menten) descrie în mod aproximativ cinetica multor enzime. Modelul cinetic este relevant însă, doar în situațiile în care se admit fenomene de cinetică simplă, adică nu intervin fenomene de alostericitate sau cooperativitate. vv 0 = vv mmmmmm[ss] unde v0 reprezintă rata inițială de reacție raportată la o concentrație a substratului KK MM +[SS] notată cu [S]. vmax reprezintă rata maximă de reacție, iar KM este constanta Michaelis-Menten. 51

13 V = 0 A1 K1 K2 A2 agar agar Membrană (Epiteliu) Soluție fiziologică Figură 11. Schema dispozitivului de determinare a transportului activ de Na+ prin pielea de broască: K1, K2 sunt electrozi de calomel; A1, A2 sunt electrozi de argint - argint clorurat. Așa se pare că este cazul unor pompe de ioni de tipul celei de Na/K și a celei de Ca 2+. În ceea ce privește ionii de Na + și K +, concentrațiile lor, de o parte și de alta a membranei, sunt menținute de pompa de Na/K care, în acest caz, reprezintă mecanismul activ de menținere a asimetriei ionice a membranei celulare. Prin acțiunea ei se menține o concentrație ridicată de Na + la exterior și K + la interior, fapt care reprezintă o condiție esențială a tuturor manifestărilor electrice ale celulei. NaE1~P oligomicina NaE1~P NaE1 Na + Ext. E2-P ADP ATP K + Na + Pa H2O Int. K + MEMBRANA CELULARĂ ouabaină KE2 KE2-P Enzima (ATP-aza) are două forme; E1 și E2 care funcționează ciclic, transformându-se una în alta, în urma unor schimbări conformaționale dictate de prezența ionilor implicați și a energiei furnizate de ATP. Pentru o înțelegere mai ușoară a schemei, se va porni cu forma fosforilată E2-P la exterior. Această formă este sensibilă la ionul K + pe care îl fixează, formând complexul KE2-P ce traversează membrana spre interior (conform gradientului de concentrație a acestui compus), unde fosfatul (Pa) este eliberat sub acțiunea unei enzime hidrolizante. Complexul rămas (KE2) este sensibil la ionul Na + care determină o schimbare conformațională cu eliberare de K + și fixare de Na +. Forma NaE1 determină hidroliza unei molecule de ATP și formarea complexului macroergic fosforilat (NaE1~P) care traversează membrana spre exterior (tot conform gradientului de concentrație), unde eliberează ionul Na +, având loc o schimbare la forma E2-P (cu care s-a început descrierea ciclului). Figură 12. Modelul schematic al funcționării pompei de Na+/K+, ca ATP-ază dependentă de acești ioni Întrucât o astfel de pompă este dependentă de energia furnizată de hidroliza ATP-ului, se poate spune că, de fapt, este vorba despre o enzimă (ATP-ază) dependentă de Na + și K +. Bazat pe observațiile din literatură și pe experimentele proprii, Robert L. Post (1974) a propus o anumită schemă (vezi Figură 12) a funcționării acestei enzime ca sistem biochimic. Rezultatele acestei scheme sunt transpuse la situația concretă a membranei ca să se poată înțelege funcționarea acestui complex ca sistem biofizic de transport. Organizarea ciclului, conform figurii menționate, se bazează, printre altele, pe următoarele observații: KE2-P - Na + trebuie să se afle la interior și K + la exterior pentru a determina activarea enzimei și a transportului acestor ioni; - ouabaina blochează funcționarea pompei numai dacă se află la exterior; 52

14 - oligomicina împiedică eliberarea ionului de Na + din complexul NaE1~P; - locul de acțiune al ATP-ului este la interior (citoplasmă). În alte cazuri, hidroliza ATP-ului este cuplată cu transportul unor ioni diferiți de cei în cauză, în special cu transportul de protoni (H + ), prin care se realizează un gradient electrochimic a cărui energie este folosită, în final, pentru transportul ionului considerat (vezi Figură 13). ATP H + int. A - int. Oxidare, etc. ADP+Pa H + ext. A - ext. Figură 13. Cuplaj indirect al transportului de substanțe, cu degradarea ATP ului (simport sau cotransport al unui anion A - cu protonul H + ). II.2. Canale ionice Canalele ionice reglează fluxul ionilor prin membrană la toate celulele vii. Acestea sunt proteine membranare integrale sau mai precis un ansamblu format din mai multe proteine. Astfel de ansambluri proteice cu multe subunități implică de regulă un aranjament circular a mai multor proteine identice sau omoloage, împachetate foarte aproape una de alta, formând un por prin bistratul lipidic al membranei. Subunitatea (subunitățile) care formează porul reprezintă subunitatea (subunitățile) α, iar subunitățile auxiliare sunt notate cu β, γ, δ ș.a.m.d. În timp ce unele canale permit trecerea ionilor doar pe baza sarcinii lor electrice, majoritatea canalelor sunt reprezentate de pori cu o deschidere egală în dimensiune cu diametrul a 1-2 atomi în locul cel mai îngust. Acești pori permit trecerea doar a unui tip de ion, cum ar fi Na + sau K +, transportându-l prin membrană cu o viteză similară celei cu care acesta se mișcă liber într-o soluție (milioane de ioni pe secundă). La unele canale ionice, trecerea prin por este facilitată de o poartă care poate fi deschisă sau închisă de un semnal chimic sau electric, de temperatură sau de presiune. Ca rol biologic, canalele ionice sunt foarte importante în cadrul sistemului nervos, unde au rol în generarea și transmiterea impulsului nervos și unde se găsesc în număr foarte mare. În consecință, multe toxine ofensive sau defensive, întâlnite la o gamă largă de specii de animale (veninul șerpilor, scorpionilor, păianjenilor etc.) acționează prin blocarea acestor canale. În plus, canalele ionice figurează ca facilitând o mare varietate de procese biologice ce presupun schimbări în celulă, cum ar fi: contracția mușchiului neted, cardiac și scheletic, transportul epitelial al nutrienților și al ionilor, activarea celulelor T (limfocite) sau eliminarea insulinei de către celulele beta din pancreas ș.a.m.d. În căutarea unor noi medicamente, ținta principală o au aceste canale ionice. Canalele ionice sunt clasificate, fie după natura factorului implicat în deschiderea/închiderea porții, fie după tipul ionilor pe care îi transportă sau după numărul de pori. După factorul implicat în deschiderea sau închiderea porții, canalele ionice se pot grupa: II.2.1. Canale ionice voltaj dependente (voltage-gated) II Canale de Na + voltaj dependente. Acest tip cuprinde nouă subtipuri și sunt răspunzătoare de generarea și propagarea potențialului de acțiune. Canalul este format dintr-o subunitate α de dimensiune foarte mare (aprox aminoacizi) asociată cu alte proteine drept subunități β (vezi Figură 14). Subunitatea α este alcătuită din patru domenii omoloage (I-IV), fiecare domeniu fiind alcătuit, la rândul lui, din 6 segmente (S1-S6) transmembranare, deci în total de 24 de segmente transmembranare. La acestea se mai coasamblează o serie de subunități β care traversează 53

15 membrana. Atât subunitățile α cât și β sunt puternic glicozilate (adiția zaharidelor la proteine și lipide). Sit de legare a neurotoxinei TTX capabilă să inactiveze funcționalitatea canalului D IV D I EXTRACELULAR Filtru pentru selectivitatea ionului Senzorul de voltaj al domeniului IV D III D IV D III Subunitatea α a canalului de Na + voltaj-dependent văzută din exteriorul membranei celulare. Prin culori diferite sunt reprezentate cele 4 domenii, fiecare fiind constituit din 6 segmente transmembranare. Segmentul colorat cu negru din cadrul fiecărui domeniu este senzorul de voltaj. D II INTRACELULAR Secțiune transversală prin subunitatea α a canalului de Na + voltaj-dependent. Prin culorile roșu și verde sunt evidențiate domeniile III respectiv IV. Cu negru este evidențiat segmentul cu rol de senzor de voltaj. Figură 14. Modelul schematic al canalului de Na + voltaj dependent. Poartă de inactivare II Canale de Ca 2+ voltaj dependente. Acest tip cuprinde zece subtipuri. Canalele de Ca 2+ sunt alcătuite din 4 tipuri de subunități: α1, α2-δ, β și γ (vezi Figură 15). Subunitatea α1 conține și filtrul canalului ionic având proprietăți de poartă. În cadrul acestei subunități sunt 4 domenii omoloage conținând 6 helixuri transmembranare. Patru dintre aceste șase helixuri formează un senzor electric (de voltaj). Subunitatea β este formată din proteine hidrofile care nu sunt glicozilate și de aceea este situată în mediul intracelular și este răspunzătoare de traficul efectuat prin subunitatea α1. Subunitatea γ este o glicoproteină cu patru segmente transmembranare situată pe partea laterală subunității α1. Subunitatea α2 este o proteină extra celulară, înalt glicozilată, atașată subunității δ prin punți disulfidice. În timp ce unitatea α2 are rol structural, subunitatea δ modulează activarea sau inactivarea voltaj-dependentă a canalului. Canalele de Ca 2+ voltaj-dependente joacă un rol important atât în corelarea depolarizării celulei musculare cu contracția cât și în corelarea excitării celulei nervoase cu eliberarea neurotransmițătorului. II Canale de K + voltaj dependente. Aceste canale sunt esențiale în structura membranelor excitabile. Ele joacă un rol deosebit în timpul desfășurării potențialului de acțiune, mai ales în scopul restabilirii potențialului de repaus. Canalele de K + reprezintă o familie compusă din 12 subfamilii ce reunesc 40 de variante. Canalele de K + voltaj-dependente sunt structuri tetramerice cu subunitatea α constituită din 4 domenii cu câte 6 segmente transmembranare. Cele 6 segmente ce compun domeniul sunt omoloage unui domeniu întâlnit la canalele de Na +. Corespunzător canalelor de Na +, canalele de K + se asamblează sub formă tetramerică, formând un canal ionic funcțional. (6TM-1P). 54

16 II Canale de protoni (H + ) voltaj dependente. Aceste canale se pot deschide în timpul depolarizării, însă ele depind foarte mult de ph (phsenzitive). În consecință, aceste canale se deschid doar atunci când gradientul electrochimic este orientat către exterior, adică, deschiderea lor va permite protonilor (H + ) doar să părăsească celula. Funcția lor este să oprească instaurarea unei mediu acid în celulă. Un rol important îl au și în cazul fagocitelor (euzinofile, neutrofile, macrofage). Când o bacterie este înglobată de către fagocit, NADPH-oxidaza (nicotinamid adenin dinucleotid phosfat oxidaza) generează superoxizi prin transferul de electroni de la NADPH în interiorul celulei și îi cuplează cu oxigenul molecular formând superoxidul (O2 - ) vezi Figură 15. Acesta este un radical liber extrem de reactiv care distruge bacteria. NADPH-oxidaza este electrogenă pentru că transportă electroni prin membrană, iar canalele protonice (H + ) se deschid pentru a permite contrabalansarea sarcinilor negative prin fluxul de protoni (H + ). EXTRACELULAR Subunitatea α1 constituită din 4 domenii transmembranare omoloage reprezentate prin culori diferite (roșu, verde, albastru și galben) Subunitatea α2 Punte disulfidică Subunitatea γ Subunitatea δ Subunitatea β INTRACELULAR Figură 15. Modelul schematic al canalului de Ca2+ voltaj dependent (stânga). Implicarea canalelor de protoni (H+) voltaj dependente în fagocitoză (dreapta) II.2.2. Canale ionice ligand-dependente (ligand gated) Aceste canale se activează sau inactivează în prezența unui ligand 1. Canalele ionice ligand-dependente sunt cunoscute și sub numele de receptori ionotropi. Aceste canale se închid sau se deschid ca răspuns la unirea cu un mesager chimic (Figură 16). Acești receptori sunt selectivi pentru mai mulți ioni (Na +, K +, Ca 2+ sau Cl - ). Astfel de receptori sunt localizați la nivelul sinapselor unde transformă semnalul chimic presinaptic, reprezentat de eliminarea neurotransmițătorului, într-un semnal electric postsinaptic. Canalul are, de regulă, o structură tetramerică sau pentamerică, fiecare subunitate având în structură un domeniu extracelular la care se leagă ligandul și un domeniu transmembranar format, în funcție de tip, dintr-un număr variabil de helixuri. 1 Un ligand poate fi un atom/ion sau moleculă care în general donează unul sau mai mulți electroni prin intermediul unei legături covalente coordinative sau pune în comun electroni printr-o legătură covalentă unuia sau mai multor atomi/ioni centrali. 55

17 Figură 16. Reprezentare schematică, generală, a porțiunii transmembranare a unui canal ionic neurotransmițător-dependent, în acest caz ligandul fiind reprezentat de un neurotransmițător. II Receptori pentru acetilcolină 1 (AChR). Acești receptori sunt reprezentați de proteine membranare integrale care răspund la unirea cu neurotransmițătorul acetilcolină (Ach). Categorisirea lor este făcută în funcție de afinitatea lor relativă la diferite molecule. Prin definiție, toți acești receptori răspund la acetilcolină, dar s-a constat că o pot face și la alte tipuri de molecule. Din acest punct de vedere se deosebesc două grupe: - nachr, receptori nicotinici pentru acetilcolină (receptori ionotropi), aceștia sunt deosebit de receptivi la nicotină. - machr, receptori muscarinici pentru acetilcolină (receptori metabotropi 2 ), aceștia sunt deosebit de receptivi la muscarină. II Receptori pentru glutamat. Aceștia sunt localizați în membrana neuronală, glutamatul fiind cel mai răspândit neurotransmițător din corp este prezent în peste 50% din țesutul nervos. Glutamatul a fost inițial descoperit la insecte în Cei doi receptori primari pentru glutamat au fost denumiți după substanțele agoniste pentru care au o înaltă specificitate: AMPA (α-amino-3-hidroxil-5- metil-4-izoxazol-propionat) și NMDA (N-metil-D-aspartat). Una din funcțiile de bază a receptorilor pentru glutamat o reprezintă modularea plasticității sinapsei, o proprietate a creierului considerată vitală pentru funcția de învățare și memorie. O creștere sau o descreștere a numărului de receptori pentru glutamat, la o celulă postsinaptică, poate conduce la potențarea, respectiv inactivarea celulei, pe termen lung. Modularea plasticității sinapsei se realizează prin reglarea sintezei proteice postsinaptice prin intermediul sistemului de mesageri secundari. Receptorii pentru glutamat sunt împărțiți în două grupe, funcție de mecanismul care stă la baza activării lor și dă, astfel, naștere impulsului postsinaptic: - receptori ionotropi pentru glutamat (iglur) la care porul canalului ionic este activat direct de legarea receptorului cu glutamatul. - receptori metabotropi pentru glutamat (mglur), aceștia activează indirect canalele ionice din membrană prin intermediul unei secvențe de reacții ce implică proteine G 3. 1 Acetilcolina este un neurotransmițător prezent atât în sistemul nervos periferic cât și în sistemul nervos central. 2 Receptorul metabotrop este un tip de receptor prezent la celulele eucariote care se comportă asemenea unui mesager secundar, putând fi localizat la suprafața celulei sau în vezicule. Spre deosebire de receptorii ionotropi care formează un canal ionic cu un por diferențiat, receptorii metabotropi nu au por. Aceștia sunt, mai degrabă, legați indirect cu canalele ionice din membrana celulară prin mecanisme de transducție a semnalului adesea mediată de proteine G. Din această cauză ei sunt cunoscuți și ca receptori cuplați cu proteine G. 3 Proteinele G (guanine nucleotide-binding proteins) (proteine cu specificitate de legare la guanină) reprezintă o familie de proteine implicate în transmiterea semnalelor chimice în exteriorul celulei dar și cu rol în inducerea unor modificări în interiorul celulei. Acestea sunt implicate în transducția semnalelor chimice provenite de la mulți hormoni, neurotransmițători dar și de la alți factori de semnalizare. Astfel, proteinele G funcționează ca și întrerupătoare moleculare. Atunci când leagă GTP, ele sunt pe poziția activ (on), iar când leagă GDP sunt pe poziția inactiv (off). Proteinele G reglează enzime implicate în metabolism, transportori, canale ionice și alte componente ale mecanismelor celulare (controlul transcripției, motilitate, contractilitate, secreție ș.a). 56

18 II Receptori P2X ATP-dependenți (ATP-gated) Receptorii P2X (purinoreceptori) sunt o familie de canale ligand-dependente, permeabile pentru diverși cationi, care se deschid ca răspuns la legarea ATP extracelular. Acești receptori fac parte dintr-o familie mai mare a receptorilor purinergici implicați în diverse funcții celulare cum ar fi reactivitatea vasculară, apoptoza și secreția de citochine 1. ATP-ul se atașează la o buclă (subunitate proteică) extracelulară a receptorului P2X după care are loc o schimbare conformațională în structura canalului ionic ce determină deschiderea porului. Aceasta permite trecerea cationilor de Na + și Ca 2+ în interiorul celulei determinând depolarizarea membranei și activând diverse procese intracelulare Ca 2+ -senzitive. Durata de deschidere a canalului diferă. La tipurile P2X1 și P2X3, această durată este foarte scurtă, închiderea canalului se face foarte repede chiar dacă ATP-ul este încă legat de bucla extracelulară. Spre deosebire de acestea, tipul P2X2 rămâne deschis atât timp cât ATP-ul rămâne legat. Pentru ca un canal P2X să fie activat sunt necesare trei molecule de ATP. Studii recente par să indice faptul că fiecare din cele trei subunități, pe care le are în constituție canalul, trebuie să lege câte o moleculă de ATP pentru a se iniția deschiderea porului. Cu toate acestea, mecanismul precis prin care se deschide porul, la această categorie de canale, nu este pe deplin clarificat. II Receptori GABA Aceștia reprezintă o clasă de receptori care răspund la neurotransmițătorul GABA (acid gamma-amino-butiric), inhibitor principal în sistemul nervos central al vertebratelor. Există două categorii de receptori: GABAA și GABAB. În timp ce categoria GABAA reunește receptori ionotropi, categoria GABAB sunt metabotropi având afinitate de cuplare cu proteine G. II.2.3. Canale ionice dependente de alți factori. II Canale ionice dependente de lumină (light-gated). În această categorie intră un grup de proteine transmembranare care formează canale ionice (pori) ce se închid sau se deschid ca răspuns la prezența luminii. Aceste canale se comportă într-o manieră similară cu alte canale ionice. În cazul specific al celor dependente de lumină, proteinele transmembranare sunt, de regulă, cuplate cu o moleculă care funcționează ca un comutator fotosensibil. O astfel de proteină este retinalul întâlnit la canalele de rodopsină. Această proteină este capabilă să absoarbă energia unui foton cu o anumită lungime de undă și, astfel, să-și schimbe conformația determinând indirect schimbări conformaționale ale proteinelor transmembranare ce se concretizează în deschiderea sau în închiderea porului. II Canale nucleotid-ciclic-dependente. Aceste canale sunt activate de către un ligand chimic care este, în acest caz particular, reprezentat de o nucleotidă ciclică intracelulară, camp sau cgmp, și sunt permeabile cationilor monovalenți (Na +, K + ), foarte rar celor bivalenți (Ca 2+ ). Aceste canale au zone încărcate negativ sau pozitiv care răspund la modificări apărute la nivelul potențialului de membrană. Canalele nucleotid-ciclic-dependente joacă un rol important în funcționalitatea diverselor sisteme, cum ar fi cel olfactiv sau sistemul vizual. În cadrul analizatorului vizual, canalele cgmp-dependente au fost identificate la nivelul membranei externe a celulelor fotoreceptoare de la nivelul retinei. Ca răspuns la un nivel ridicat de cgmp, canalele sunt deschise și permit cationilor să pătrundă în celulă, cauzând o depolarizare (-40mv, dark current). Dacă, în acest stadiu de întuneric, un foton lovește fotoreceptorul, în celulă se produce o reacție în lanț care are ca rezultat scăderea concentrației de cgmp cauzând o hiperpolarizare. Astfel, aceste celule sunt mai mult active decât inactive. Etapele prin care se generează informația vizuală sunt următoarele: - rodopsina și iodopsina de pe partea exterioară a membranei absorb un foton schimbând astfel conformația cofactorului retinal de la conformația cis la conformația trans. 1 Termen generic pentru molecule semnal utilizate în comunicarea celulară, ex. hormoni și neurotransmițători. 57

19 - stadiul 1 de amplificare - fiecare astfel de modificare are ca rezultat o serie de intermediari instabili, ultimul legându-se de o proteină G în membrană care activează transducina (o proteină din interiorul celulei). În acest stadiu fiecare rodopsină foto-activată determină, la rândul ei, activarea a aproximativ 100 de transducine. Fiecare moleculă de transducină activează ulterior o moleculă de fosfodiesterază. - stadiul 2 de amplificare - o singură moleculă de fosfodiesterază este capabilă să hidrolizeze aproximativ 1000 de molecule de cgmp. Întrucât concentrația de cgmp scade, canalele nucleotid-ciclic-dependente se închid. Ca urmare a acestui fapt Na + nu mai poate pătrunde în celulă și fotoreceptorul se hiperpolarizează (încărcarea electrică de pe fața internă a membranei devine tot mai negativă). Hiperpolarizarea încetinește mult eliberarea glutamatului (neurotransmițător capabil să excite sau să inhibe celulele bipolare postsinaptice). Astfel reducerea glutamatului se va traduce în celule bipolare hiperpolarizate și celule bipolare depolarizate, în funcție de natura receptorilor (ionotropi sau metabotropi) prezenți în terminalul postsinaptic. În acord cu mecanismul descris se poate afirma că un fotoreceptor elimină mult mai puțin neurotransmițător când este stimulat de lumină decât la întuneric. Acest mecanism particular are două avantaje: - în primul rând, fotoreceptorii cu bastonașe sau cu conuri sunt depolarizați la întuneric, ceea ce înseamnă că, în acest caz, mulți ioni de Na + pătrund în celulă. Astfel, deschiderea sau închiderea întâmplătoare a canalelor de Na + nu va afecta potențialul membranei. Numai închiderea unui număr foarte mare de canale, datorat absorbției unui foton, va modifica potențialul și va semnaliza prezența luminii. Prin urmare sistemul este imun la zgomot. - în al doilea rând, amplificarea foarte puternică în două etape creează o sensibilitate deosebită, prin faptul că un singur foton va afecta potențialul membranar și va fi perceput de creier ca stimul luminos. Prin această caracteristică se diferențiază celulele cu bastonașe de cele cu conuri. Cele cu bastonașe sunt foarte sensibile, ele fiind utile în vederea pe timp de noapte, iar cele cu conuri manifestă o cinetică foarte mare a reacțiilor chimice. II Canale de K + redresoare (inward 1 rectifier potassium channels, 2TM-1P) Aceste canale sunt reunite sub această denumire întrucât ele permit trecerea mai multor sarcini pozitive K + înspre interiorul celulei decât înspre exteriorul celulei. Din punct de vedere funcțional au în componență o subunitate α formată din 4 domenii, fiecare domeniu având în componență 2 segmente transmembranare care formează și porul. II Canale de K + cu doi pori identici (twin-pore domain K + channels, 4TM-2P) Acestea sunt alcătuite dintr-o subunitate α care are în componență 4 domenii transmembranare, fiecare domeniu fiind constituit din 2x2 segmente transmembranare care formează 2 pori identici. Canalele de K +, atât cele redresoare cât și cele cu 2 pori identici, au fost identificate în foarte multe tipuri de celule (macrofage, celulele mușchiului cardiac, leucocite, neuroni și celulele endoteliale). II.3. Bioenergetică Bioenergetica este o știință complexă a cărei origine și apartenență este disputată deopotrivă de biochimie și biofizică. Implicațiile ei sunt esențiale în toate ramurile dinamice ale biologiei, în 1 Termenul de inward se referă la caracteristica de a permite sarcinilor pozitive să treacă mult mai ușor în direcția internă (înspre interiorul celulei). Prin convenție inward current este considerat negativ în timp ce outward current (sarcinile pozitive se mișcă spre exteriorul celulei) este considerat pozitiv. 58

20 special în fiziologie și ecologie. Obiectul acestei științe îl constituie fenomenele energetice din biosferă, respectiv schimbul de energie dintre organism și mediu și transformările energetice care au loc la diferite niveluri de organizare. Există, în principal, două tendințe în bioenergetică: una ecologică și alta celulară. Anumite aspecte ale acestor tendințe, în special a celei ecologice țin de termodinamica biologică. Alte aspecte sunt legate de biochimie, fiziologie și ecologie. De aceea, în prezentarea ce urmează, se va insista în special asupra unor aspecte preponderent biofizice de nivel celular și subcelular. II.3.1. Originea energiei în biosferă și cuplajul în bioenergetică Sursa inițială a fenomenelor energetice din biosferă este Soarele, respectiv energia sa radiantă. Ceva mai puțin decât a mia parte din energia solară ajunsă la suprafața Pământului este preluată de către plantele verzi, singurele viețuitoare care dispun de structuri specializate capabile să capteze energia luminoasă și să o convertească în energie chimică. Cea mai importantă și mai comună formă de stocare a energiei care este și ușor convertibilă sub formă chimică, este reprezentată de legăturile macroergice din molecula de adenozintrifosfat (ATP). Prin hidroliza acestei molecule rezultă adenozindifosfat (ADP), fosfat anorganic (Pa) și energie: Structura moleculei de ATP. Este de remarcat faptul că la un ph=7 molecula este disociată, având, practic, 4 sarcini negative. (Simbolul ~ reprezintă legătura macroergică). AAAAAA + HH 2 OO AAAAAA + PP aa Reacția se desfășoară spre dreapta, cu o variație relativ mare de energie liberă: ΔGG = 7,3 kkkkkkkk/mmmmmm (llll tt = 25 CC șii pppp = 7). Multe tipuri de travaliu biologic depind de cedarea energiei înmagazinată în molecula de ATP unor reacții care se desfășoară cu consum de energie. Cu alte cuvinte, reacțiile consumatoare de energie sunt cuplate cu cele furnizoare de energie. Această idee a cuplajului constituie un punct central în bioenergetică. Pentru o mai bună înțelegere, considerăm următoarele reacții: Condiția ca reacția globală: AA ΔGG 1 BB + CC; BB + CC ΔGG 2 DD + EE AA ΔGG DD + EE să se desfășoare în sensul indicat de săgeată este: ΔGG 1 + ΔGG 2 = ΔGG < 0 adică să existe o scădere netă a energiei libere (condiția de spontaneitate). De exemplu, dacă pentru prima reacție variația energiei libere standard este: ΔGG 1 = 7 kkkkkkkk/mmmmmm iar pentru a doua este: ΔGG 2 = +4 kkkkkkkk/mmmmmm atunci reacția globală se va desfășura în sensul indicat de săgeată, cu o variație negativă de energie liberă: ΔGG = ( 7 + 4) kkkkkkkk/mmmmmm = 3 kkkkkkkk/mmmmmm După cum se poate observa, condițiile de desfășurare a unei reacții în care are loc o variație pozitivă de energie liberă sunt: 59

21 - existența unei alte reacții, care se desfășoară cu o variație negativă de energie liberă, mai mare în valoare absolută; - cele două reacții trebuie să aibă intermediari comuni. Ideea cuplajului a două reacții, și în general a două procese, poate fi redată și grafic (vezi Error! Reference source not found.). Un mod foarte sugestiv de reprezentare este cel al roții dințate. AA BB + CC ΔGG 1 < 0 ΔGG 2 > 0 BB + CC DD + EE Cuplarea unei reacții care se desfășoară cu o scădere mare a energiei libere ( G1<0) cu o reacție ce se desfășoară cu consum de energie ( G2>0), dacă G1+ G2<0. II.3.2. Stocarea și utilizarea energiei la nivel celular La nivelul celulei, problema centrală a bioenergeticii este aceea a mecanismului prin care energia este înmagazinată sub forma unor compuși macroergici (bogați în energie) și apoi utilizată. La acest nivel are loc un proces de transducție (sau conversie) a unei forme de energie în alta. Procesele de acest tip au următoarele caracteristici: a) sunt procese cuplate; b) sunt procese enzimatice vectoriale, localizate în majoritatea cazurilor la nivelul membranelor care le oferă condițiile organizatorice necesare caracterului lor vectorial; c) din punct de vedere termodinamic, sunt procese izoterme de joasă temperatură (37 C), astfel că, randamentul lor mare (40-50%) poate fi explicat numai prin natura lor chimică și particularitățile de organizare amintite mai sus. Ideea cuplajului în procesele energetice este aplicabilă nu numai în fazele de utilizare a energiei, ci și în explicarea mecanismului de conservare a energiei, ca legătură macroergică, în molecula de ATP. În cloroplastele plantelor verzi procesul poartă numele de fotofosforilare, deoarece se produce cu ajutorul luminii solare, iar în mitocondrii și bacterii aerobe se numește fosforilare oxidativă, deoarece are loc cu participarea oxigenului. Există însă și anumite căi anaerobe de sinteză ale ATP-ului, care însă nu vor fi descrise aici, ele fiind mai mult de competența biochimiei. Fosforilarea oxidativă reprezintă fenomenul de conservare (stocare) a energiei eliberată în urma oxidării diferitelor substraturi respiratoare, ca energie chimică de legătură a fosfatului în molecula de ATP. În celula animală acest proces are loc la nivelul membranei mitocondriale interne unde se află dispuși, atât componenții lanțului respirator, cât și complexul enzimatic care participă la sinteza ATP-ului (ATP-aza mitocondrială sau complexul F1-F0). La nivelul acestei membrane are loc, deci, un proces de cuplare energetică, respectiv cuplarea oxidării cu fosforilarea. Din punct de vedere biofizic, se obișnuiește să se vorbească despre un fenomen de transducție energetică, ce constă într-o convertire a potențialului oxidoreducător a substraturilor respiratoare în energie chimică de legătură. Conform transportului activ, cuplarea reacțiilor de oxidoreducere cu cea de fosforilare poate avea loc numai dacă cele două tipuri de reacții posedă intermediari comuni. În funcție de natura intermediarului primar al acestor reacții există diferite ipoteze ale cuplării energetice. Va fi luată mai întâi în considerare și dezvoltată ipoteza care pare a fi cea mai susținută de datele experimentale și care poate fi considerată chiar teorie. 60

22 II Teoria chemiosmotică a cuplării energetice Conform acestei teorii, fenomenul de transducție energetică este mijlocit de un gradient electrochimic de protoni. Această ipoteză a fost formulată de savantul englez Peter Mitchell 1 și îmbogățită foarte mult în ultimii 20 de ani. În contrast cu o ipoteză mai veche, care postulează existența unor intermediari chimici între oxidare și fosforilare, teoria chemiosmotică postulează existența unui intermediar fizico-chimic, fiind în esență o teorie fizică a cuplării energetice, fapt ce justifică tratarea ei într-un curs de biofizică. Se va considera mai întâi cazul conservării energiei la nivelul mitocondriei, care a fost și cel mai mult studiat, urmând ca apoi problema să fie extinsă la bacterii și cloroplaste. Figură 17. Schema energeticii lanțului respirator. NAD nicotinamid-adenin-dinucleotid; CoQ coenzima Q; cyt a, b, c reprezintă citocromii respectivi. În cele trei locuri indicate (H + in H + ext) diferența de energie este suficient de mare pentru sinteza ATP. Conservarea energiei în mitocondrii. Mitocondriile sunt organite celulare prezente în toate celulele eucariote aerobe. Cele din ficatul de șobolan, care au fost foarte mult studiate, au o formă relativ ovală, cu cele două diametre de aproximativ 1 µm și, respectiv, 2 µm. Mitocondriile au două membrane: o membrană exterioară netedă care este permeabilă la substanțe cu greutate moleculară mică, și o membrană internă care are o serie de pliuri numite criste și care este impermeabilă pentru majoritatea substanțelor (Figură 18). Prezența acestor pliuri este legată de necesitatea unei suprafețe mărite, la nivelul căreia sunt dispuse o serie de complexe enzimatice, în primul rând cele legate de transportul electronilor și al protonilor dar și cele legate de fosforilare. În compartimentul intern (delimitat de membrana cristelor) se află citoplasma acestui organit, constituind așa-numita matrice. Această matrice este structurată, iar în interiorul ei au loc unele procese biochimice importante, cum ar fi oxidarea acizilor grași și ciclul acizilor tricarboxilici (Krebs) (vezi cursul de biochimie). 1 Peter Dennis Mitchell (29 septembrie aprilie 1992), biochimist britanic laureat al premiului Nobel pentru chimie, distincție care i-a fost acordată pentru descoperirea mecanismului chemiosmotic a sintezei ATP. Prin cercetările sale, el a adus contribuții importante la înțelegerea transferului energetic biologic prin formularea teoriei chemiosmotice. 61

23 Figură 18. Secțiune schematică printr-o mitocondrie. Ciclul Krebs 1 este parte din calea metabolică implicată în transformarea chimică a carbohidraților, grăsimilor și a proteinelor în CO2 și apă în scopul obținerii de energie. Dintre reacțiile relevante care preced ciclul amintim glicoliza și oxidarea piruvatului, iar dintre cele care urmează acestuia este fosforilarea oxidativă. Astfel, etapele procesului de respirație celulară implică: - activarea produșilor de metabolism prin formarea de acetil-coa, - ciclul acizilor tricarboxilici care este un generator de atomi de hidrogen, - fosforilarea oxidativă asociată energiei eliberate la nivelul lanțului respirator. Trei perechi de atomi de hidrogen vor fi preluați de nicotinamid-adenin-dinueleotidul oxidat (NAD + ), iar o pereche de coenzima Q, aceste molecule constituind punctele de intrare în lanțul respirator și totodată punctele de ieșire din ciclul acizilor tricarboxilici (Figură 19). Ordinea în care sunt aranjați componenții lanțului respirator este dictată de valoarea potențialului lor reducător, astfel că, este ușor de înțeles de ce electronii curg prin acest lanț către acceptorul final (oxigenul). Un atom de oxigen acceptă doi electroni și doi protoni, dând naștere unei molecule de apă. Teoria chemiosmotică postulează că energia eliberată în urma curgerii electronilor prin acest lanț este însoțită de o translocare de protoni din matricea mitocondrială către exterior, astfel că, energia, înmagazinată inițial ca potențial oxidoreducător, este conservată într-un gradient electrochimic de protoni. Acesta este primul pas în transducția energetică. Cel de al doilea constă în utilizarea gradientului protonic pentru sinteza ATP-ului. Acest fapt este realizat prin intermediul complexului ATP-azic care funcționează ca o pompă de protoni, cuplând translocarea acestora, înapoi în matrice, cu sinteza moleculei de ATP. În continuare va fi prezentat, în mod concret, modul în care se realizează gradientul protonic și condițiile necesare pentru convertirea energiei sale în energia unor legături chimice. Organizarea lanțului respirator în translocarea de protoni. După cum rezultă din Figură 20, lanțul respirator este organizat sub forma unor bucle (sau în zigzag) ce traversează membrana de două ori. Pentru o translocare de protoni din matrice către exterior, este necesar ca în etapele în care transportul este direcționat către exterior să existe și un transportor de protoni. Există, 1 Sir Hans Adolf Krebs (25 august noiembrie 1981), fizician și biochimist german cunoscut pentru identificarea a două cicluri metabolice importante: ciclul ureei și ciclul acidului citric. Mai târziu, secvența metabolică a reacțiilor chimice care produc energie celulară, este cunoscută sub numele de ciclu Krebs, pentru această descoperire a fost recompensat cu premiul Nobel în anul 1953 pentru fiziologie și medicină. 62

24 în acest sens, atât dovezi de ordin funcțional, cât și structural. Astfel, ejecția de protoni, în urma inițierii respirației, este un fapt cert. S-a măsurat chiar și stoichiometria acestei ejecții și s-a constatat că pentru fiecare pereche de electroni transportată de-a lungul lanțului respirator, de la NAD la O2, sunt translocați 6 protoni, adică H + /2e - (sau H + /O) = 6. Figură 19. Schema de cuplare a oxidării cu fosforilarea în mitocondrie conform teoriei chemiosmotice. Figură 20. Organizarea lanțului respirator în translocarea de protoni: FMN reprezintă flavinmononucleotid care, prin forma sa redusă (FMNH2), transportă doi protoni și doi electroni; Fe/S reprezintă o proteină sulfoferică (transportoare de electroni); QH și QH2 reprezintă forma semiquinonică și, respectiv, forma deplin redusă a coenzimei Q (ubiquinona); cyt a, b, c sunt citocromii respectivi. 63

25 64 Figură 21. Ciclul acizilor tricarboxilici (Ciclul Krebs). Dovezile de ordin structural care vin în sprijinul ideii de organizare asimetrică, în bucle, au fost obținute prin studiul poziției diferitelor componente ale lanțului respirator (metoda agenților marcanți impermeanți), precum și în urma unor studii referitoare la accesibilitatea substratului (de exemplu, NAD-ul este accesibil respirației numai dacă se găsește în matrice).

26 În Figură 20 este prezentată dispunerea concretă a componenților lanțului respirator, așa cum reiese din datele experimentale și unele raționalizări făcute de susținătorii teoriei chemiosmotice. S-ar părea, din figură, că există numai două bucle, cea de a treia fiind mai curând funcțională decât structurală. Aranjamentul a fost impus de lipsa unui al treilea transportor de protoni și de comportarea cinetico-enzimatică particulară a citocromilor-b și, mai ales, a coenzimei Q, ceea ce sugerează că aceasta ar putea transporta protoni în 2 trepte (așa-numitul ciclu Q, propus de P. Mitchell), prin intermediul formelor QH și QH2. Dovezi importante în sprijinul teoriei chemiosmotice provin și din domeniul sistemelor reconstituite. Prin incorporarea diferitelor segmente ale lanțului respirator în liposomi, s-a pus în evidență formarea unui gradient de protoni, în urma inițierii procesului de respirație. Mai mult, prin incorporarea ATP-azei mitocondriale, împreună cu un anumit segment al lanțului respirator, s-a reușit chiar reconstituirea actului oxidării fosforilante. În toate cazurile, s-a pus în evidență necesitatea unei membrane intacte (vezicule închise) și a unei anumite asimetrii în dispunerea componenților pentru obținerea gradientului protonic și a fosforilării. Pentru a înțelege mai bine semnificația acestui fapt, va fi prezentat modul în care este înmagazinată energia în gradientul protonic. Ca orice gradient electrochimic, acest gradient este alcătuit din două componente: una chimică și una electrică. Pentru simplitate, se va scrie formula sub forma unei diferențe finite a potențialului electrochimic de protoni ( µh+), așa cum se obișnuiește în teoria chemiosmotică: Δμμ HH + = Δψψ ZZΔpppp unde ψ reprezintă componenta electrică (o diferență de potențial electric), ph reprezintă componenta chimică (o diferență de ph), iar Z=2,3 RT/F are valoarea de aproximativ 59 mv la temperatura de 25 C (R, T și F au semnificațiile uzuale, vezi fenomene de transport). Pentru menținerea unei valori ridicate a potențialului electrochimic, este absolut necesară existența unei membrane intacte care să nu permită scurgerea necontrolată a protonilor sau a altor ioni. Efectul agenților decuplanți (decuplarea oxidării de fosforilare), conform teoriei chemiosmotice, este, deci, o consecință a disipării gradientului protonic (agenții decuplanți sunt protonofori) în lipsa căruia n-ar mai exista energia necesară fosforilării. ATP-aza mitocondrială. Sinteza ATP-ului ca proces vectorial. Având un gradient protonic realizat și menținut de o membrană intactă, mai există o singură cerință esențială în vederea sintezei de ATP: prezența unui mecanism care să poată converti energia acestui gradient în energie chimică de legătură. Acest rol îl joacă complexul ATP-azic mitocondrial 1 (Figură 22). Mecanismul intim de cuplare al gradientului protonic cu sinteza de ATP nu este încă perfect elucidat. Există mai multe ipoteze asupra cărora nu se va insista aici. În schimb, se impune prezentarea unei justificări de ansamblu a posibilităților de cuplare a celor două reacții în condițiile concrete din mitocondrie. După cum s-a mai arătat, teoria chemiosmotică se bazează pe ideea unui metabolism vectorial în care forța capabilă de a produce o reacție este determinată de orientarea spațială a unor factori fizico-chimici de-a lungul unui drum determinat de către organizarea fizică a sistemului. În cazul mitocondriei, este vorba despre direcționarea ejecției de protoni, datorită structurii și aranjamentului componenților lanțului 1 Descoperirea acestui complex și, mai ales, a așa-numitului factor F1, care constituie partea catalitică a complexului, este legată în primul rând de numele savantului american Efraim Racker și a colaboratorilor săi. Factorul F1 se observă în anumite preparate electronomicroscopice sub forma unor butoni cu diametrul de circa 9 nm, atașați de membrană printr-un peduncul relativ scurt care se continuă în membrană printr-un set de proteine ce constituie așa-numitul factor F0. Din acest motiv, complexul ATP-azic mitocondrial este desemnat de obicei F1-F0.Chiar izolat din membrană, F1 poate cataliza hidroliza ATP-ului. Este evident că, în aceste condiții, când lipsește gradientul protonic, F1 nu poate funcționa în sensul sintezei de ATP. Pe de altă parte, componenta F0 care rămâne în membrană după îndepărtarea lui F1, nu prezintă activitate catalitică. Îndepărtarea lui F1 face ca membrana să devină foarte permeabilă la protoni, fapt ce poate fi remediat prin refixarea lui F1. Aceste observații sunt considerate ca indicii cu privire la faptul că F0 reprezintă un fel de canal prin care protonii traversează membrana pentru a ajunge la centrul activ din F1. 65

27 respirator, precum și canalizarea acestor protoni în sens invers, prin componentul F0 al complexului enzimatic. 66 Figură 22. Complexul ATP-azic din membrana mitocondriei foarte asemănător cu cel din membrana cloroplastului. Datorită acestui fapt, centrul activ din F1 se află în condiții cu totul speciale de desfășurare a unei reacții. Pentru a înțelege, în principiu, felul în care un gradient protonic poate afecta sinteza ATP, se va porni de la premisa că reacția catalizată de o ATP-ază: AAAAAA + HH 2 OO AAAAAA + PP aa devine, practic, reversibilă numai în prezența unui al treilea component participant la reacție care poate împinge echilibrul spre stânga (în sensul sintezei de ATP). Acest al treilea factor este reprezentat tocmai de către gradientul protonic. Stoichiometria translocației de protoni prin ATP-aza mitocondrială este 2H + pentru fiecare moleculă de ATP sintetizată. Cu alte cuvinte, reacția de mai sus ar trebui scrisă astfel: AAAAAA + HH 2 OO + 2HH + + iinn AAAAAA + PP aa + 2HH eeee unde H + in și H + ex reprezintă concentrația de protoni la interior și, respectiv, la exterior. Considerând constanta de echilibru (în care se include și concentrația apei, ca factor constant): KK = [AAAAAA][PP aa] [AAAAAA] [HH+ ] eeee [HH + ] iinn se poate observa că echilibrul reacției depinde de concentrația protonilor pe cele două fețe ale membranei și că o concentrație ridicată de H + în exterior va deplasa echilibrul acestei reacții în sensul sintezei de ATP. Considerând valorile de echilibru (steady state) pentru ATP, ADP și Pa, se poate calcula că un raport ATP/ADP=1 poate fi menținut printr-un ph=3,5 unități, un ψ=210 mv, sau orice combinație a celor două potențiale care să totalizeze 210 mv. Măsurătorile făcute în mitocondrie estimează valoarea potențialului electrochimic la circa 240 mv, adică suficient pentru sinteza de ATP. Există experimente care dovedesc că și din punct de vedere cinetic, adică al vitezei de formare și al evoluției sale, un gradient electrochimic este compatibil cu rolul de intermediar primar în procesul fosforilării oxidative. Transducția energiei în bacterii și cloroplaste. Teoria chemiosmotică prezintă un mare grad de universalitate, ea aplicându-se deopotrivă mitocondriei, bacteriilor și cloroplastelor. Asemănarea mare care există între cele trei sisteme din punct de vedere funcțional, alături de

28 asemănările structurale și biochimice, constituie argumente în favoarea originii lor comune. Mai exact, se crede că atât mitocondria cât și cloroplastul ar fi evoluat din bacterii parazite sau simbionte care, ulterior, au fost incorporate ca organite indispensabile. În bacteria Escherichia coli, lanțul respirator este ceva mai simplu decât în mitocondrie, dar orientarea lui în raport cu cele două fețe ale membranei este identică. Din punct de vedere funcțional, diferența majoră constă în faptul că pentru fiecare pereche de electroni ce trece prin lanțul respirator sunt eliminați doar 4 protoni (și nu 6 ca la mitocondrie). Rezultatele experimentale indică lipsa ciclului Q. În schimb, ca și în cazul mitocondriei, doi protoni sunt utilizați pentru sinteza unei molecule de ATP. Rotația flagelului bacterian se pare că folosește direct energia gradientului protonic, cu alte cuvinte, rotorul acestui flagel este o turbină protonică. La fel, transportul de Na + și Ca 2+, ca și transportul unor aminoacizi și zaharuri, este cuplat cu transportul protonilor (fapt dovedit experimental). În cloroplaste (Figură 23), lanțul transportor de electroni are unii componenți asemănători cu cei întâlniți la bacterii și mitocondrii dar mișcarea electronilor ca și pomparea protonilor se face în sens invers, respectiv, electronii trec de la apă către nicotinamid-adenin-dinucleotid-fosfat (NADP), iar protonii sunt pompați din afară către interior (stromă). Transportul de electroni se face, deci, în sens invers celui determinat de potențialul oxidoreducător al reactanților ceea ce înseamnă că necesită energie din exterior. Această energie provine din fotonii absorbiți în două puncte sau fotocentre din lanț prin aranjamentele moleculelor de clorofilă numite complexeantenă. Figură 23. Organizarea transportului de electroni și de protoni în membrana cloroplastului. În ceea ce privește complexul ATP-azic din cloroplaste (desemnat CF1-F0, Figură 22), acesta este foarte asemănător din punct de vedere structural cu cel din mitocondrie, dar se pare că folosește 3 protoni pe molecula de ATP sintetizată. Energia înmagazinată în ATP și produși reducători de tipul NADPH este folosită în procesul de fotosinteză propriu-zis. Acesta constă din reducerea, deci fixarea CO2, cu formarea unor compuși organici hidrocarbonați (de exemplu, glucoza). Reacția globală a fotosintezei ar putea fi scrisă astfel: 67 6CCOO 2 + 6HH 2 OO + hνν CC 6 HH 12 OO 6 + 6CCOO 2