PREHºAD ANALYTICK CH MET D NA STANOVENIE POLY TEROV CH ANTIBIOTÕK

Transcript

1 PREºAD ANALYTICK C MET D NA STANVENIE PLY TERV C ANTIBITÕK MILä BLAZSEK sek v skumu a v voja, Biotika a.s., Slovensk ºupËa, Slovensk republika blazsek@biotika.sk Doölo , prepracovanè , prijatè Kæ ËovÈ slov :prehæad, polyèterovè antibiotik, salinomycìn, narazìn, monenzìn, lasalocid, analytickè stanovenie, mikrobiologickè stanovenie, spektrofotometria, kvapalinov chromatografia, TLC, PLC, ELISA bsah 1. vod 2. MikrobiologickÈ stanovenie 3. SpektrofotometrickÈ stanovenie 4. Tenkovrstvov chromatografia (TLC) 5. Vysoko Ëinn kvapalinov chromatografia (PLC) 5.1. PLC s pokolûnovou derivatiz ciou 5.2. PLC s predkolûnovou derivatiz ciou 5.3. PLC s hmotnostnou detekciou 6. ImunochemickÈ metûdy ñ ELISA 7. Z ver 1. vod SalinomycÌn, narazìn, monenzìn a lasalocid (obr. 1) patria medzi polyèterovè antibiotik (PA), ktorè reprezentuj v znamn skupinu ionofûrnych zl ËenÌn, produkovan ch kmeúmi Streptomyces. Ich antimikrobi lne vlastnosti sa vyuûìvaj vo veterin rnej praxi pri lieëbe a prevencii kokcidiûzy u hydiny a tieû pùsobia ako stimul tory rastu u dobytka. Ako ich pomenovanie napoved, z kladom chemickej ötrukt ry t chto zl ËenÌn s cyklickè ÈterovÈ skupiny:tetrahydrofur novè a tetrahydropyr novè kruhy, ktorè s navz jom spojenè uhæovodìkov m reùazcom, priamou CñC v zbou, alebo spoloën m Ël nkom ñ spiroatûmom. SpoloËnou vlastnosùou PA je prìtomnosù voænej karboxylovej skupiny na konci molekuly, prevl daj ci poëet naviazan ch nepol rnych etyl- a metylskupìn, ako aj prìtomnosù pol rnych kyslìkov ch skupìn, umoûúuj cich vznik elektroneutr lnych pseudo-makrocyklick ch komplexov s monovalentn mi a divalentn mi katiûnmi. Komplexy s tvorenè intramolekulovou vodìkovou v zbou medzi karboxylovou skupinou na jednom konci a hydroxylovou skupinou na druhom konci molekuly (obr. 2). V Ëöina PA s biele kryötalickè zl Ëeniny s molov mi hmotnosùami v rozmedzì 600 aû 900 a s teplotami topenia okolo 100ñ120 C (cit. 1 ). Z chemickèho hæadiska ich moûno zaradiù medzi slabè karboxylovè kyseliny s lipofiln mi vlastnosùami. S nerozpustnè vo vode, ale rozpustnè vo v Ëöine organick ch rozp öùadiel. Ich soli vykazuj podobn rozpustnosù ako voænè kyseliny. C C C 3 C 2 5 C 3 C 3 C 3 C 2 5 salinomycìn br. 1. Chemick ötrukt ra karboxylov ch polyèterov ch antibiotìk C 3 C2C3 C 2 5 C C 3 3 C C C 3 monenzìn C C 3 C C2 C 3 C 3 C 2 5 narazìn CC 3 2 lasalocid C 2 5 C C 2 3 C C

2 br. 2. SchÈmatickÈ zobrazenie ötrukt ry sodnèho komplexu monenzìnu Tabuæka I Toxicita polyèterov ch antibiotìk (v mg.kg ñ1 v hy zvieraùa) podæa AmerickÈho v boru pre veterin rnu toxikolûgiu Antibiotikum C 3 C 3 CC 3 2 Na + C 3 C- 3 Toxicita kone hov dzì ovce kurat dobytok MonenzÌn 2 ñ3 20ñ SalinomycÌn 0,6 ñ ñ 44,3 Lasalocid 21,5 50ñ150 75ñ350 71,5 PolyÈterovÈ antibiotik s charakteristickè biologickou aktivitou proti baktèri m kmeúa kokcìdia (druh protozoa baktèrii), ktorè parazituj na epiteli lnych bunk ch zaûìvacieho traktu vt kov a cicavcov 1. PrÌËinou biologickej aktivity PA s ich iûnofûrne vlastnosti, to znamen schopnosù vytv raù s iûnmi alkalick ch kovov voænè komplexy, ktorè potom mùûu pren öaù cez bunkovè steny baktèrii, a tak nar öaù rovnov hu medzi vonkajöìm prostredìm a vn trom bunky. PrÌprava a vlastnosti prv ch polyèterov ch antibiotìk boli popìsanè uû v 50. rokoch 20. storoëia (nigericìn). V s Ëasnosti sa odhaduje, ûe bolo pripraven ch asi 80 rùznych polyèterov ch antibiotìk, z ktor ch vöak len malè mnoûstvo naölo praktickè uplatnenie pri lieëbach chorùb hospod rskych zvierat. Medzi komerëne najv znamnejöie patrì:salinomycìn, monenzìn, narazìn a lasalocid. Z t chto antibiotìk salinomycìn a monenzìn maj v s Ëasnosti aû 65ñ75 % podiel na celosvetovej spotrebe polyèterov ch antibiotìk. V Ëöina PA je pripravovan fermentaën m procesom, salinomycìn je produkovan kult rou Streptomyces albus a monenzìn kult rou Streptomyces cinnamonensis. Do medikovan ch k mnych zmesì sa prid vaj na koncentraënej rovni 60ñ120 mg.kg ñ1. UrËitÈ obmedzenie klinickèho pouûìvania PA je spùsobenè ich toxick mi vlastnosùami (hodnota LD 50 sa pohybuje v rozmedzì 1ñ60 mg.kg ñ1 ). V tabuæke I s uvedè toxickè koncentr cie monenzìnu, salinomycìnu a lasalocidu pre kone, dobytok, ovce a kurat podæa AmerickÈho v boru pre veterin rnu toxikolûgiu 2. SalinomycÌn je uû v malej koncentr cii toxick pre kone a morky, a negatìvne ovplyvúuje rast hydiny 3 pri koncentr - ci ch vyööìch ako 100 mg.kg ñ1. Z tohoto hæadiska je prirodzen potreba identifik cie a kvantitatìvneho stanovenia polyèterov ch antibiotìk v medikovan ch krmiv ch. V dostupnej literat re je popìsan pomerne veæk poëet biologick ch a chemick ch analytick ch metûd pre stanovenie komerëne pouûìvan ch polyèterov ch antibiotìk. NajËastejöÌmi aplik ciami je anal za PA vo veterin rnych produktoch, k mnych zmesiach a premixoch k mnych zmesì. PresnÈ stanovenie obsahu v t chto zmesiach je dùleûitè vzhæadom na spomenutè toxickè Ëinky vyööìch koncentr cii PA. Na druhej strane nadmernè pouûìvanie PA mùûe viesù nielen k vzniku bakteri lne rezistentn ch kmeúov, ale aj k environment lnemu zneëisteniu v podobe ich reziduì v ûivoëìönych produktoch. Moûno preto oëak vaù stupúuj ci sa tlak kontroln ch radov na sledovanie reziduì PA v spotrebn ch produktoch. NaprÌklad v s Ëasnosti je v Japonsku stanoven maxim lny povolen limit 0,05 µg salinomycìnu v jednom grame ûivo- ËÌöneho tkaniva 4. V poslednej dobe sa aj z tohto dùvodu st le viac publikovan ch pr c zameriava pr ve na rieöenie problèmov spoæahlivej anal zy rezìduì PA v ûivoëìönych produktoch (v m se, peëeni, vajciach, mlieku, krvnej plazme a podobne). 2.MikrobiologickÈ stanovenie MikrobiologickÈ stanovenie predstavuje pùvodn, historicky najstaröiu metûdu stanovenia PA. Biologick Ëinosù antibiotika sa stanovuje porovnanìm inhibìcie rastu citliv ch mikroorganizmov spùsobenej zn mymi koncentr ciami testovanèho antibiotika v analyzovanej vzorke. Stanovenie sa vykon va dif znou, alebo turbidimetrickou metûdou. Pri stanovenì PA dif znou platúovou metûdou sa pouûìva kmeú Bacillus subtilis. V tomto prìpade sa Ëinnosù antibiotika vyhodnocuje na z klade priemerov inhibiën ch zùn na platni s naoëkovanou ûivnou pùdou 5. PrincÌpom turbidimetrickej metûdy je zase sledovanie z kalu naoëkovanej ûivnej pùdy po urëitom Ëase inkub cie. Pri stanovenì PA sa pouûìva kmeú Streptococcus faecalis 6. oci sa mikrobiologickè stanovenia vyznaëuj mnoûstvom nedostatkov (nìzkou selektivitou, pr cnosùou, dlh m Ëasom anal z) st le patria medzi metûdy stanovenia Ëinnosti mnoh ch komerëne pouûìvan ch PA v krmiv ch poûadovanè öt tnymi autoritami a s uvedenè medzi metûdami AAC, ale aj naprìklad vo VestnÌku Ministerstva pùdohospod rstva SR (cit. 7 ). Postupom Ëasu s nahr dzanè modernejöìmi metûdami poskytuj cimi spoæahlivejöie v sledky za kratöì Ëas (napr. kvapalinov chromatografia). 3.SpektrofotometrickÈ stanovenie SpektofotometrickÈ stanovenie monenzìnu bolo Golabom a spol. 8 navrhnutè ako n hrada mikrobiologickèho stanovenia. MetÛda je zaloûen na chemickej reakcii monenzìnu s vanilìnom (4-hydroxy-3-metoxybenzaldehyd) v kyslom prostredì za vzniku intenzìvne sfarbenèho produktu (λ max = 520 nm). T to farebn reakcia je oznaëovan ako KomarovskÈho a obecne ide o reakciu vyööìch alkoholov s aromatick mi aldehydmi za vzniku farebn ch aldolov ch kondenzaën ch produktov. Pri stanovenì autori 8 pouûili 3% metanolov roztok vanilìnu 147

3 okyslen kyselinou sìrovou. Analyt extrahovali zo vzoriek k mnych zmesì, premixov a fermentaën ch pùd do metanolu. Autori popisuj dobr korel ciu nameran ch hodnùt s mikrobiologick m stanovenìm. Minim lny limit stanovenia monenzìnu je uveden na rovni 1 µg.ml ñ1. SpektrofotometrickÈ stanovenie salinomycìnu v k mnych zmesiach je uvedenè vo VestnÌku ministerstva pùdohospod rstva SR (cit. 7 ) ako alternatìvna metûda mikrobiologickèho stanovenia. SpektrofotometrickÈ stanovenie m oproti mikrobiologick m metûdam v hodu predovöetk m vo svojej r chlosti, no taktieû ako mikrobiologickè stanovenie m nìzku öpecificitu, takûe nie je vhodnè pri anal zach vzoriek, ktorè obsahuj viacero PA. V tomto prìpade je potrebnè pouûitie selektìvnejöìch technìk. 4.Tenkovrstvov chromatografia (TLC) Technika TLC predstavuje r chlu a selektìvnu moûnosù identifik cie a semikvantitatìvneho stanovenia PA a prìbuzn ch l tok v rùznorod ch matriciach. Na ich detekciu sa vyuûìva predovöetk m bioautografia a chemick reakcia s vanilìnom poskytuj ca farebn deriv t. Martinez a Shimoda v roku 1983 pouûili techniku TLC na semikvantitatìvne stanovenie monenzìnu vo vzork ch krmìv 9 a kuracej a hov dzej peëeni 10. PrÌprava vzorky spoëìvala v extrakcii monenzìnu do vodnèho roztoku metanolu (80 % v/v), ktor bol n sledne Ëisten na kolûne naplnenej oxidom hlinit m (alumina). Analyt bol reextraktrahovan do dichlûrmet nu a preëisten na kolûne naplnenej Sephadexom L-20. Takto pripraven vzorku Martinez a Shimoda analyzovali na silikagèlovej platni K-6 Whatman mobilnou f zou dichlûrmet nñmetanol (9:1). PouûitÌm bioautografickej detekcie kmeúom Bacillus subtilis dosiahli detekën limit 10 ng.g ñ1 (ppb). V tom istom obdobì popìsal poæsk autor Karkocha TLC stanovenie monenzìnu s vanilìnovou detekciou v ûivoëìönych vzork ch, v m se hydiny 11, vo vajciach 12 a v mlieku 13. PouûitÌm dvojrozmernej eluënej techniky, keô silikagèlov platúu vyvìjal najprv zmesou chloroform:etanol:benzèn (36:1:4) a n sledne etylacet tom, sa mu podarilo v t chto vzork ch detegovaù monenzìn na rovni 4ñ5 ng.g ñ1. Simult nna detekcia prìtomnosti monezìnu, narazìnu, salinomycìnu a lasalocidu na TLC platni s nanesen m oxidom hlinit m (alumina) vo vzork ch premixov a krmìv je popìsan v pr ci wlesa 14. Bioautografickou detekciou (Bacillus subtilis) sa mu podarilo 10 n sobne znìûiù detekën limit na hodnotu 3 µg.g ñ1 (ppm), porovnanìm s detekciou pomocou vanilìnovèho Ëinidla (30 µg.g ñ1 ). JaponskÌ autori Asukabe a spol. publikovali v roku 1987 veæmi citlivè PTLC stanovenie deriv tov salinomycìnu, monezìnu a lasalocidu 15. FluorescenËne aktìvne pyrènacyl estery polyèterov ch antibiotìk pripravili pomocou 1-brÛmacetylpyrÈnu. Na separ ciu esterov autori pouûili vysoko ËinnÈ silikagèlovè a reverznè C18 f zy. Spoæahlivosù stanovenia zv öili pouûitìm intern ch ötandardov, 18,19-dihydrosalinomycÌnu a 18,19-dihydro-20- -ketosalinomycìnu, ktorè boli synteticky pripravenè zo salinomycìnu. FluorescenËn detekcia umoûnila stanovenie antibiotìk v rozsahu 2ñ14 ng, priëom hmotnostn detekën limit antibiotìk bol len 100 pg. krem uveden ch detekën ch spùsobov navrhli Blomkvist a spol. pri TLC stanovenì monenzìnu off-line detekciu hmotnostnou spektrometriou 16. Po separ cii vzorky na silikagèlovej TLC platni izolovali ökvrnu monenzìnu a analyt vymyli do metanolu. Antibiotikum ionizovali bombardovanìm r chlymi atûmami xenonu s energiou 6 kev, priëom sa sledoval vznik iûnov pri m/e = 693 a 694. MonenzÌn bol touto technikou stanoven na rovni 10 ng.g ñ1. TakÈ prednosti tenkovrstvovej chromatografie, ako s r chlosù a dostupnosù anal z, zabezpeëili jej vyuûìvanie aj v s Ëasnosti, hlavne pri identifik cii a monitorovanì prìtomnosti polyèterov ch antibiotìk v krmiv ch 17ñ19 a ûivoëìönych tkaniv ch 20. V roku 1998 Landgraf a Ross pouûili TLC metûdu na dùkaz prìtomnosti monenzìnu vo vzork ch krmìv urëen ch pre kone 17. Z metanolovèho extraktu krmiva monenzìn reextrahovali do hex nu, a reextrakt preëistili na silikagèlovej SPE kolûnke. PreËisten vzorku analyzovali na silikagèlovej TLC platni, pouûitìm etylacet tu, dichlûrmet nu a amoniaku ako mobilnej f zy (17:3:0,5). MonenzÌn detegovali chemicky benzaldehydov mi Ëinidlami. Autori boli navrhnut m postupom schopnì pozitìvne dùk zaù prìtomnosù monenzìnu v krmiv ch s minim lnou koncentr ciou 10 µg.g ñ1, priëom so stanovenìm neinterferovalo 36 in ch antibiotìk. DetekËn limit na tejto rovni prezentoval aj Gafner, ktor ale prìtomnosù salinomycìnu, narazìnu a monenzìnu v krmiv ch a v k mnych premixoch detegoval bioautograficky, pouûitìm kmeúa Bacillus subtilis 18. Vyuûitie TLC metûdy pri sledovanì prìtomnosti reziduì salinomycìnu, monenzìnu a lasalocidu vo vzork ch tkanìv hydiny popìsali vo svojej pr ci VanderKop a MacNeil 20. SledovanÈ antibiotik extrahovali zo vzoriek tkaniva do metanolu a na preëistenie pouûili reextrakciu do chloridu uhliëitèho. Reextrakty analyzovali na silikagèlovej platni s mobilnou f zou etylacet t:acetonitril (1:1). Antibiotik detegovali bioautograficky kmeúom Bacillus subtilis. Uveden m postupom sa im podarilo dok zaù prìtomnosù salinomycìnu a lasalocidu na rovni 1 µg.g ñ1 a monenzìnu 0,45 µg.g ñ1. lavnè obmedzenie tenkovrstvovej chromatografie je predovöetk m v nìzkej spoæahlivosti pri kvantifik cii analytov. Preto sa v prìpade potreby presnej kvantifik cie pouûìvaj spoæahlivejöie metûdy (napr. kolûnov kvapalinov chromatografia). 5.Vysoko Ëinn kvapalinov chromatografia (PLC) Technika PLC patrì v s Ëasnosti medzi najrozöìrenejöie metûdy pouûìvanè na potvrdenie prìtomnosti a kvantitatìvne stanovenie polyèterov ch antibiotìk v komplexn ch matriciach. Separ cia sa v Ëöinou robì na analytick ch kolûnach naplnen ch silikagèlom s chemicky viazanou nepol rnou oktylovou (C8) alebo oktadecylovou skupinou (C18). Vzhæadom na lipofiln charakter PA sa pri anal zach pouûìvaj mobilnè f zy s vysok m obsahom organickej zloûky (>90 obj.% metanol, acetonitril). Kedûe v Ëöina PA vo svojej ötrukt re neobsahuje v raznè chromofûry ani elektrochemicky Ëi fluorescen- Ëne aktìvne skupiny (okrem lasalocidu), na zv öenie citlivosti detekcie sa pouûìvaj pred- alebo pokolûnovè derivatizaënè reakcie. Cieæom vyuûitia t chto reakciì je prìprava deriv tu s vyööou odozvou v UV alebo VIS oblasti, resp. deriv tu s fluorescenëne aktìvnou skupinou. œalöìm rieöenìm je on-line spojenie kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou (LC-MS). V niektor ch typoch vzoriek bola odsk öan aj priama detekcia antibiotìk refraktometricky alebo 148

4 spektrofotometricky v UV oblasti pri nìzkych vlnov ch dâûkach (neöpecifick detekcia pri 200ñ220 nm). Refraktometrick (RI) detekciu pouûili pri stanovenì salinomycìnu PLC vo vzork ch krmìv a biomasy Dimenna a spol. 21 AcetonitrilovÈ extrakty vzoriek analyzovali na analytickej kolûne s reverznou f zou C8. Ako mobiln f zu pouûili zmes acetonitrilu a vody okyslenej kyselinou fosforeënou (85:15). AnalyzovanÈ vzorky obsahovali salinomycìn na koncentraënej rovni r dovo g.kg ñ1. V roku 1993 porovn vali Beran a Zima priamu UV detekciu pri 210 nm s RI detekciou pri stanovenì monenzìnu PLC v produkën ch fermentaën ch pùdach kult ry Streptomyces cinnamonensis 22. Na separ ciu pouûili kolûnu s reverznou f zou C18, analyty eluovali 88% metanolom. Priama UV detekcia sa za pouûit ch podmienok uk zala m lo vhodn, kvantitatìvne stanovenie ruöilo mnoûstvo interferuj cich zloûiek, ktorè mali absorbciu v sledovanej oblasti. Na druhej strane tieto l tky mali nìzku odozvu pri detekcii RI, Ëo umoûnilo kvantitatìvne stanovenie monenzìnu A a monenzìnu B. Koncentr cia monenzìnu v stanovovan ch vzork ch sa takisto pohybovala na rovni g.kg ñ1, priëom detekën limit metûdy bol 1 µg.ml ñ1. oci uvedenè typy detekcie nenaöli v s Ëasnosti öiröie uplatnenie, predovöetk m kvùli ich neöpecificite a malej citlivosti, predstavuj jednoduch alternatìvu derivatizaën ch metûd, predovöetk m pri analyzovanì vzoriek s vyööìm obsahom PA PLC s pokolûnovou derivatiz ciou PokolÛnov derivatiz cia umoûúuje zv öenie citlivosti a öpecifickosti detekcie analytov po ich separ cii na analytickej kolûne. proti beûnej PLC inötrument cii si t to technika naviac vyûaduje samostatn pumpu pre detekënè Ëinidlo, zmieöavaciu komoru a temperovan reakën celu (obr. 3). Pouûitie pokolûnovej derivatiz cie pri stanovenì salinomycìnu PLC v krmiv ch navrhli v roku 1984 Goras a Lacourse 23. Analyty separovali na silikagèlovej kolûne s pouûitìm zmesi etylacet tu, izookt nu, kyseliny octovej a trietylamìnu (75:25:0,4:0,2) ako mobilnej f zy. PokolÛnovÈ derivatizaënè Ëinidlo pozost valo z etanolovèho vanilìnovèho roztoku s prìdavkom kyseliny sìrovej. V prezentovanej pr ci je veæk priestor venovan optimaliz cii pokolûnovej detekcie z hæadiska pomeru prietoku mobilnej f zy a vanilìnovèho reagentu ako aj z hæadiska teploty reakënej cely. Je preuk zanè, ûe so zvyöuj cim sa prietokom reakënèho Ëinidla odozva salinomycìnu st pala, aû dosiahla maximum pri pomere prietokov mobilnej f zy a reakënèho Ëinidla 2:1. œalöìm zvyöovanìm prietoku odozva klesala. Tento jav je pripìsan nepriazniv m pomerom koncentr ciì Ëinidla a analytu pri niûöìch prietokoch a skr tenìm pobytu reagentov v reakënej cele, a t m aj Ëasu potrebnèho na ukonëenie reakcie pri vyööìch prietokoch. Podobn z vislosù bola popìsan aj pri sledovanì vplyvu teploty reakënej cely, keô maxim lna odozva salinomycìnu bola pri 95 C. Pri niûöìch teplot ch bola farebn reakcia nedokonal a pri vyööìch doch dzalo k rozkladu farebnèho produktu a tieû k splyneniu reakënej zmesi. Autori za uveden ch podmienok dok zali za 15 min t separovaù salinomycìn od prìbuzn ch l tok 20-deoxysalinomycÌnu a 20-oxosalinomycÌnu a monenzìnu pri limite detekcie 10 µg.g ñ1. Na t to pr cu nadviazali o rok neskùr Blanchflower a spol. 24, mobiln f za detekënè Ëinidlo pumpa 1 pumpa 2 autoinjektor analytick kolûna integr tor zmieöavacia odpad cela termostat s reakënou celou detektor br. 3. SchÈma PLC prìstroja s detekciou pokolûnovou derivatiz ciou ktorì vo svojej pr ci vyuûili pokolûnov detekciu pri PLC stanovenì monenzìnu, narazìnu a salinomycìnu vo vzork ch krmìv. Na rozdiel od predch dzaj cich autorov Blanchflower a spol. pouûili na separ ciu analytov kolûnu s reverznou f zou C18 a ako mobiln f zu pouûili zmes metanolu, vody a kyseliny octovej (94:5,9:0,1). SledovanÈ antibiotìka detegovali pri 520 nm. PokolÛnov reakcia prebiehala pri 70 C poëas 2 min t, trvanie reakcie ale vzhæadom na rozm vanie pìkov v dlhej pokolûnovej reakënej cele neskùr znìûili na 1,1 min ty. Vyööiu citlivosù stanovenia autori dosiahli zv öenìm koncentr cie vanilìnu na 100 g.l ñ1 oproti 30 g.l ñ1 pouûit m Gorasom a Lacoursom. Vyööiu citlivosù dosiahli aj pouûitìm vyööej koncentr cie kyseliny sìrovej v detekënom Ëinidle; na druhej strane t to koncentr cia (40 ml koncentrovanej 2 S 4 na liter) rapìdne znìûila stabilitu reakënèho Ëinidla, preto sa autori vr tili k pùvodnej koncentr cii 20 ml.l ñ1. krem optimaliz cie detekën ch podmienok sa Blanchflower a spol. zamerali na optimalizovanie podmienok prìpravy vzorky (extrakcia PA zo vzoriek krmìv). Antibiotik boli v analyzovan ch krmiv ch prìtomnè v koncentr ci ch 50ñ100 µg.g ñ1. Na ich extrakciu autori odsk öali nasledovnè organickè rozp öùadl :metanol, acetonitril, etanol, propanol, acetûn a zmesi metanolu s vodou (50ñ90 % v/v). Najlepöie v sledky dosiahli pouûitìm ËistÈho a 90% roztoku metanolu, keô sa v ùaûky extrakcie uveden ch analytov pohybovali v rozmedzì 98ñ100 %, resp. 96ñ100 %. Ako autori uv dzaj, danou metûdou dosahovali spoæahlivè v sledky stanovenia PA v koncentraënom rozsahu 0,5ñ 125 µg.g ñ1. Technika PLC na reverzn ch f zach s pokolûnovou derivatiz ciou vanilìnov m reagentom sa stala v 90. rokoch 20. storoëia jednou z najpouûìvanejöìch metûd na stanovenie veterin rne pouûìvan ch PA vo vzork ch produkën ch fermentaën ch pùd 25ñ27, krmìv a premixov 24,28ñ31. V pr cach z tohto obdobia s v Ëöinou uvedenè optimaliz cie separaën ch podmienok a podmienok pokolûnovej reakcie z hæadiska aplik cie metûdy na stanovovanè l tky a druh vzorky. Podmienky pouûitè pri anal ze PA v jednotliv ch publikovan ch pr cach s zhrnutè v tabuæke II. MetÛda PLC s pokolûnovou derivatiz ciou s vanilìnom bola v roku 1997 na z klade spoloënej pr ce desiatich laboratûriì akceptovan ako ofici lna metûda AAC na stanovenie monenzìnu v krmiv ch a premixoch k mnych zmesì 32. Pod- 149

5 Tabuæka II Podmienky niektor ch PLC stanovenì polyèterov ch antibiotìk s pokolûnovou derivatiz ciou Analyt a Matrica PrÌprava vzorky Eluent; prietok Analytick kolûna PokolÛnovÈ Ëinidlo; Podmienky b Lit. prietok SAL krmivo extrakcia: etanol:propan-2-ol, acetonitril:voda:k. octov, 24,4 0,4 cm, Lichrospher DMABA c :2S4:metanol, 85 C ; 10 m 0,5 mm; 3 15:2; mikrovln. 2 8 s 960:38:2; 0,5 ml.min ñ1 100 RP-18, 5 µm 7,5:5,5:94,5 (w/v/v); 592 nm 0,4 ml.min ñ1 SAL krmivo extrakcia: hex n, mix. 2 h etylacet t:izookt n:k. octov : 25 0,46 cm, Zorbax SIL vanilìn:2s4:etanol, 95 C ; 7,5 m 0,25 mm; 23 trietylamìn, 750:250:4:2; 15:10:490 (w/v/v); 527 nm 0,54 ml.min ñ1 0,27 ml.min ñ1 MN, krmivo extrakcia: metanol, mix. 1 h metanol:voda:k. octov, 25 0,46 cm, Partisil vanilìn:2s4:metanol, 70 C ; 7,6 m 0,5 mm; 24 NAR, 940:59:1; 0,7 ml.min ñ1 DS-3, 5 µm 10:2:98 (w/v/v); 520 nm SAL 0,7 ml.min ñ1 MN fermentaën extrakcia:metanol N42P4 (p 3,0):metanol, 5 0,45 cm, Regis Little vanilìn:2s4:metanol, 120 C ; 3,05 m 0,25 mm; 26 pùda 3:17; 1,5 ml.min ñ1 Champ DS, 3 µm 3:3:100 (w/v/v); 520 nm 1ml.min ñ1 MN krmivo extrakcia: metanol:voda, metanol:voda:k. octov, 25 0,46 cm, Partisil vanilìn:2s4:metanol, 98 C ; 2 ml; 28 9:1; mix. 1 h 960:60:1; 0,7 ml.min ñ1 DS-3, 5 µm 3:2:95 (w/v/v); 520 nm (AAC 0,7 ml.min ñ1 metûda) MN, krmivo extrakcia: hex n:etylacet t, metanol:5% k. octov, 9:1; 6 0,46 cm, C18 (P) vanilìn:2s4:metanol, 95 C ; 1,5 ml; 520 nm 29 SAL, 9:1; mix. 2 h 0,5 ml.min ñ1 2:10:490 (w/v/v); NAR 1,0 ml.min ñ1 MN mlieko, extrakcia: metanol:voda; metanol:voda:k. octov, 25 0,46 cm, Partisil vanilìn:2s4:metanol, 98 C ; 6,1 m 6,1 mm; 35 tkanivo reextrakcia:dichlûrmet n; 960:60 :1; 0,7 ml.min ñ1 DS-3, 5 µm 3:2:95 (w/v/v); 520 nm SPE Si 0,7 ml.min ñ1 MN, tkanivo extrakcia: izookt n:etylacet t, metanol:0,01 M octan 25 0,32 cm, Inertsil vanilìn:2s4:metanol, 100 C ; 150 4,6 mm; 36 SAL, 9:1, mix. 5 min; SPE Si amûnny (p 4,0), 94:6; DS-3, 5 µm 9,5:2,5:125 (w/v/v); n plú 75 µmsklen. NAR 0,5 ml.min ñ1 0,3 ml.min ñ1 guliëky; 520 nm MN tkanivo extrakcia:85% metanol; methanol:voda:3p4, 30 0,39 cm, vanilìn (30 mg.ml ñ1 ) 90 C;3m 1mm; 37 5 min ultrazvuk; 940:60:1; 0,7 ml.min ñ1 µbondapaktm, 5 µm v 2% 2S4 v metanole; 520 nm reextrakcia:dichlûrmet n; C18 0,7 ml.min ñ1 SPE Si MN, ñ ñ metanol:0,1% k. octov, 55 0,1 cm, Separon 0,5 M-DMABA c 75 C ; mm; 38 NAR, 94:6; 20 µl.min ñ1 C18, 5 µm v metanole:n plú 40ñ70 µmsklen. SAL 0,75 M-2S4;5µl.min ñ1 guliëky; 592 nm a SAL ñ salinomycìn, MN ñ monenzìn, NAR ñ narazìn, b teplota; reakën cela; vlnov dâûka, c DMABA ñ 4-(dimetylamino)benzaldehyd 150

6 mienky metûdy AAC pre stanovenie PA boli aplikovanè Rodewaldom a spol. aj pri stanovenì narazìnu v krmiv ch 30 a taktieû aj pri stanovenì monenzìnu v kuracìch tkaniv ch 33. V tomto prìpade bol zvolen in postup prìpravy vzorky, keô metanolov extrakt tkaniva bol eöte preëisten reextrakciou do tetrachlûrmet nu s jeho n sledn m preëistenìm na silikagèlovej SPE kolûnke pred anal zou PLC. krem stanovenia PA vo fermentaën ch pùdach a medikovan ch krmiv ch naöla metûda PLC s pokolûnovou derivatiz ciou 33ñ37 svoje uplatnenie aj pri stanovovanì rezìduiì PA v ûivoëìönych produktoch. Vzhæadom na nìzku koncentr ciu stanovovanèho analytu v t chto vzork ch je veæmi dùleûit m krokom prava vzorky, ktor zah Úa zakoncentrovanie analytu a odstr nenie moûn ch interferuj cich zloûiek. Pre tento Ëel sa pouûìva viacn sobn kvapalinov extrakcia do rozp öùadiel s rùznou polaritou 34, zakoncentrovanie a preëistenie extraktov na SPE kolûnkach 36, alebo kombin cia oboch t chto technìk 33,35,37. Gerhard a spol. prezentovali aplik ciu metûdy PLC na sledovanie reziduiì monenzìnu, salinomycìmu, narazìnu a lasalocidu v ûivoëìönych tkaniv ch 36. Separ ciu antibiotìk robili na kolûne s reverznou f zou C18, ako mobiln f zu pouûili zmes metanolu a 0,01 M octanu amûnneho (94:6). Na detekciu antibiotìk aplikovali du lny detekën systèm, keô lasalocid detegovali priamo fluorescenën m detektorom (excit cia pri 300 nm, emisia pri 420 nm) a zvyönè antibiotik detegovali pokolûnovou derivatiz ciou s vanilìnom. PrÌprava vzorky spoëìvala v extrakcii analytov do zmesi izookt nñetylacet t a preëistenì extraktu na silikagèlov ch SPE kolûnkach. Uveden m spùsobom sa im v priebehu 16 min. podarilo detegovaù lasalocid, salinomycìn a narazìn na rovni 5 ng.g ñ1 a monenzìn 2 ng.g ñ1. krem vanilìnu boli pre pokolûnov derivatizaën reakciu testovanè aj inè benzaldehydovè Ëinidl. Fejglov a spol. 38 porovn vali pri stanovenì monenzìnu, narazìnu a salinomycìnu nasledovnè detekënè Ëinidl :vanilìn, 4-dimetylaminobenzaldehyd, 3,4-dimetoxybenzaldehyd a salicylaldehyd. Z t chto 4-dimetylaminobenzaldehyd v porovnanì s vanilìnom poskytoval citlivejöiu reakciu so salinomycìnom a narazìnom. PraktickÈ vyuûitie 4-dimetylaminobenzaldehydu pri stanovenì salinomycìnu v k mnych zmesiach 3 a v kuracom m se a vajciach popìsali Akhtar a spol. 34 Na extrakciu antibiotika pouûili mikrovlnov extrakën jednotku, ËÌm sa im podarilo v razne znìûiù potrebn Ëas extrakcie (2 8 sek nd), v porovnanì s klasick mi spùsobmi (0,5ñ1 hod) PLC s predkolûnovou derivatiz ciou œalöìm moûn m spùsobom zv öenia citlivosti detekcie PA je prìprava vhodn ch deriv tov pred samotnou separ ciou. V prìpade polyèterov ch antibiotìk bolo odsk öan ch viacero reakciì na zìskanie deriv tov aktìvnych v UV oblasti, ako aj fluorescenëne aktìvnych deriv tov. V roku 1986 Dimmena a spol. navrhli detekciu salinomycìnu po oxid cii hydroxylovej skupiny na tetrahydropyr novom kruhu na ketoskupinu, ktor v konjug cii so susednou nenas tenou v zbou d va siln absorbciu ûiarenia pri 225 nm (cit. 39 ). Ako oxidaënè Ëinidlo pouûili dvojchroman pyridìnia. L tky, ktorè pri stanovenì interferovali, odstr nili pouûitìm techniky prep jania kolûn (column-switching), samotn separ ciu robili na kolûne s reverznou f zou. Ako mobiln f zu pouûili zmes acetonitrilu, tetrahydrofur nu, vody a kyseliny fosforeënej (900:40:60:0,1). DosiahnutÈ medze stanovenia salinomycìnu vo vzork ch tkanìv boli na rovni 100 ng.g ñ1. MetÛda bola neskùr aplikovan aj na stanovenie salinomycìnu vo vzork ch æudskej plazmy 40. V polovici 90. rokov popìsal Mathur 41 PLC stanovenie salinomycìnu v krmiv ch. Na zv öenie citlivosti detekcie vyuûil reakciu 2,4-dinitrofenylhydrazÌnu s voænou karbonylovou skupinou salinomycìnu v prostredì kyseliny chlûrovodìkovej 41. Produktom reakcie bol farebn hydrazûn salinomycìnu s absobën m maximom pri 419 nm, ktor bol separovan od Ëinidla na kolûne s reverznou f zou C18. Modifikovan postup bol pouûit aj na stanovenie salinomycìnu, narazìnu a monenzìnu v krmiv ch 42. Stanovenie veæmi nìzkych koncentr ciì (ng.g ñ1 ) polyèterov ch antibiotìk umoûúuje pouûitie fluorescenënej detekcie. V druhej polovici 80. rokov boli publikovanè pr ce, ktorè popisovali PLC stanovenie fluorescenëne aktìvnych deriv - tov PA pripraven ch pomocou 9-antryldiazomet nu 43ñ46.MetÛda bola pouûit na stanovenie samotnèho monenzìnu 44ñ46, alebo zmesi monenzìnu, salinomycìnu, narazìnu a lasolocidu v ûivoëiön ch vzork ch 43. V pr ci MartinÈza a Shimodu je popìsan prìprava deriv tu lasalocidu priamou esterifik ciou s 9-antryldiazomet nom a prìprava deriv tu monenzìnu, salinomycìnu a narazìnu, ktorè najprv acylovali anhydridom kyseliny octovej a aû potom esterifikovali 9-antryldiazomet - nom 43. Deriv ty boli n sledne preëistenè na silikagèlovej kolûne, separovanè na analytickej kolûne s reverznou f zou C8 a detegovanè pri 418 nm (exit cia pri 365 nm). StanovovanÈ koncentr cie uveden ch analytov vo vzork ch tkanìv sa pohybovali na rovni 0,15 µg.g ñ1. ZaËiatkom 90. rokov bolo popìsanè japonsk mi autormi Asukabe a spol. 47 a Miyakawa a spol. 48 pouûitie 1-(brÛmacetyl)pyrÈnu pri prìprave fluorescenëne aktìvnych deriv tov polyèterov ch antibiotìk. PripravenÈ pyrènacyl estery salinomycìnu a monenzìnu boli po preëistenì na SPE kolûnke (Florisil) analyzovanè na analytickej kolûne s reverznou f zou C18 za pouûitia 94 obj.% metanolu ako mobilnej f zy. Deriv ty detegovali pri 450 nm (excit cia pri 360 nm). Dosiahnut limit detekcie salinomycìnu a monenzìnu vo vzork ch kuracieho m sa 48 bol len 0,05 µg.g ñ1. Medzi hlavnè nedostatky predkolûnovej derivatiz cie patrì hlavne pr cnosù a Ëas spojen s prìpravou a ËistenÌm deriv tov, ako aj moûnosù nereprodukovateænosti derivatiz cie stopov ch koncentr ciì analytov. Moûnou alternatìvou stanovenia nìzkych koncentr ciì bez potreby derivatiz cie je spojenie kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou detekciou PLC s hmotnostnou detekciou Spojenie kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou detekciou on-line spùsobom sa v posledn ch desiatich rokoch stalo öiroko pouûìvanou technikou na identifik ciu a stanovenie rùznych antibiotìk 49. Tento rozvoj bol umoûnen v vojom pomerne jednoduch ch a robustn ch LC-MS rozhranì (interface) zaloûen ch na ioniz cii analytu pri atmosferickom tlaku, ktorè umoûúuj aplikovanie LC-MS techniky v rùznych analytick ch oblastiach. Svoje uplatnenie naöla t to technika aj pri sledovanì stopov ch koncentr ciì polyèterov ch antibiotìk v ûivoëìönych produktoch 50ñ51 a v krmiv ch 52ñ54. Medzi prvè pr ce popisuj ce vyuûitie LC-MS pri identifik cii monenzìnu, salinomycìnu, 151

7 narazìnu 50 a lasalocidu 51 v svalovine, peëeni a vajciach dom - cej hydiny patria publik cie Blanchflowera a Kennedyho z roku 1996, resp V pr ci z roku 1996 sa popisuje prìprava vzorky extrakciou analyzovan ch l tok do zmesi metanolñvoda (13:2) pomocou ultrazvuku. Po preëistenì analytov reextrakciou do zmesi hex nñtoluèn (2:1) boli tieto separovanè na kolûne s reverznou f zou s pouûitìm mobilnej f zy pozost vaj cej z acetonitrilu, metanolu, tetrahydrofur nu, kyseliny trifluoroctovej a vody (67:10:10:0,1:13). Na monitorovanie a kvantifik ciu antibiotìk autori pouûili ich [M+ Na] iûny, pripravenè technikou elektrosprejovej ioniz cie. Autori popisuj line rnu z vislosù stanovenia sledovan ch antibiotìk v oblasti 4ñ160 ng.g ñ1, s detekën m limitom 0,5ñ1 ng.g ñ1. dva roky neskùr navrhli Volmer a Lock r chle stanovenie (~4 min) salinomycìnu, lasalocidu, monenzìnu A, monenzìnu B a narazìnu A a narazìnu I na kr tkej kolûne s reverznou f zou (DS 3 µm, 50 4 mm) (cit. 52 ). Na kompletn separ ciu vöetk ch zloûiek pouûili tern rny gradient pozost vaj ci z okyslenej vody (3% kyselina mravëia), acetonitrilu a metanolu. PolyÈterovÈ antibiotik vo forme sodn ch komplexov fragmentovali elektrosprejovou ioniz ciou, priëom pouûitìm nìzkoenergetickej kolìzne-indukovanej disoci cie (CID) zìskali v ËöÌ poëet diagnostick ch iûnov. Vyööiu öpecificitu detekcie sa im podarilo dosiahnuù pouûitìm tandemovej MS/MS techniky. Moûnosti navrhnutej metûdy autori demonötrovali pri stanovenì salinomycìnu vo vzork ch potravy pre maëky. K vzorke pridali koncentr ciu salinomycìnu 1 µg.g ñ1,naextrakciu analytu aplikovali postup podæa Akhtara a Croteaua (mikrovlnov extrakcia) 3 a pouûitìm tandemovej MS detekcie dok zali selektìvne stanoviù aj tieto nìzke koncentr cie. arris a spol. separovali salinomycìn, monenzìn, narazìn a lasalocid na kolûne s reverznou f zou za cca 18 min t, keô ako mobiln f zu pouûili zmes acetonitrilu, 20 mm octanu ammûnneho a metanolu (3:1:1) (cit. 53 ). Pri elektrosprejovej kvadrupûlovej MS detekcii analytov pouûili techniku kûnicko nap ùovo-riadenej fragment cie, ËÌm tieû vytvorili viacero diagnostick ch iûnov, ktorè umoûnili spoæahlivejöiu identifik ciu antibiotìk. Z prezentovan ch v sledkov vypl va, ûe spojenie kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou detekciou je vhodnè na sledovanie reziduì polyèterov ch antibiotìk vo vzork ch ûivo- ËÌönych produktov a krmìv. Na rozdiel od fluorescenën ch metûd, ktorè sa na tento Ëel taktieû pouûìvaj, prìprava vzoriek pre hmotnostn detekciu je jednoduch, nevyûaduje si derivatiz ciu a n roënè Ëistiace kroky. V hodou hmotnostnej detekcie je aj vyööia öpecifickosù, ktor umoûúuje identifik ciu a potvrdenie prìtomnosti antibiotika vo vzorke na z klade jeho hmotnostnèho spektra. 6.ImunochemickÈ metûdy ñ ELISA ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) patrì medzi imunochemickè metûdy, ktorè s zaloûenè na selektìvnej, revezibilnej a nekovalentnej v zbe medzi antigènom a protil tkou. V imunochemick ch metûdach sa striedaj dva z - kladnè prìstupy. KompetitÌvny prìstup vyuûìva s ùaû nezn - mèho mnoûstva antigènu (napr. polyèterovèho antibiotika) so zn mym mnoûstvom antigènu znaëenèho enz mom o v zobnè miesta na protil tke viazanej v jamk ch mikrotitraën ch platniëiek 55. NekompetitÌvny (tzv. sendviëov ) prìstup vyuûìva v zbu stanovovanèho antigènu na dve protil tky, z ktor ch jedna je viazan na pevnom nosiëi (napr. stena mikrotitraënej platniëky), a druh prolit tka znaëen enz mom je naviazan na antigèn 55ñ65. Posledn m krokom v oboch prìpadoch je naviazanie substr tu, ktor spùsobì merateæn zmenu vlastnostì reakënèho systèmu, naprìklad zmenu absorbancie, chemiluminiscencie Ëi fluorescencie. Pr ce zaoberaj ce sa öt diom pouûitia metûd pri stanovenì polyèterov ch antibiotìk boli v Ëöinou publikovanè v druhej polovici dev ùdesiatych rokov, no prvè pr ce sa objavili uû koncom 80. rokov. Autori v publik ci ch z tohto obdobia popisuj stanovenie monenzìnu 55,59ñ61,63ñ64, salinomycìnu 4,56ñ58 a lasalocidu 65 v biologick ch vzork ch, vyuûìvaj c v prevaûnej miere nekompetitìvny, sendviëov typ anal zy. Popisuje sa taktieû prìprava polyklon lnych a monoklon lnych protil - tok, ich znaëenie enz mami, z ktor ch najëastejöie sa vyskytuje chrenov peroxid za 4,57ñ60,63 a v menöej miere alkalick fosfat za 64. Enzymatick aktivita sa stanovuje viacer mi spùsobmi, z ktor ch sa popisuj spektrofotometrickè 4,57ñ60,63,65 fluorescenënè 56,62 a chemiluminiscenënè metody 61. PrÌprava vzorky v metûdach ELISA spoëìva v jej homogeniz cii v biologick ch pufroch (napr. TRIS), priëom sa supernatant priamo analyzuje. Typick mi analyzovan mi matricami s tkaniv hydiny a dobytka, krvn plazma a mlieko. Koncentr cie PA stanovovanè vo vzork ch sa beûne pohybuj na rovniach µg.g ñ1 aû ng.g ñ1. Elissalde a spol. 58 vypracovali metûdu ELISA, pri ktorej extrahovali salinomycìn zo vzoriek peëene z hydiny do tlmivèho roztoku TRIS (p 7,2), k extraktu pridali pripraven protil tku a po hodinovej inkub cii reakën platniëku premyli antisèrom znaëen m peroxid zou. Po hodinovej inkub cii platúu premyli 0,5% roztokom tenzidu Tween 20 a enz mov aktivitu stanovovali spektrofotometricky pomocou 2,2í-azinobis(3-etylbenztiazolÌn-6- -sulfûnovou kyselinou). Stanovenie bolo citlivè na prìtomn salinomycìn v koncentr cii 1,25ñ5 ng.g ñ1 s n vratnosùou 87 %. krem salinomycìnu bola pripraven monoklon lna protil tka citliv aj pre narazìn o koncentr cii 0,34ñ1,17 ng/jamku. In typ prìpravy vzorky pouûili Crooks a spol. 60, keô monenzìn vo vzork ch peëene hydiny extrahovali do acetonitrilu, extrakt zmieöali s 0,2 M-Na, a tento reextrahovali do zmesi hex nñdietylèter (1:1). Po odparenì organickej zloûky vzorku na anal zu pripravili rozpustenìm v zmesi etanolu a 100 mm octanu sodnèho (2:18). Stanovenie prebiehalo v mikroplatniëk ch, ktorè mali na steny naviazan protil tku. Na platniëky sa pridala stanovovan vzorka a monenzìn znaëen chrenovou peroxid zou a zmes sa inkubovala 90 min pri 37 C. Enzymatick aktivita peroxid zy sa stanovovala spektrofotometricky pomocou tetrametylbenzidìnu. Pri stanovenì autori popisuj line rnu kalibraën krivku v rozmedzì 1ñ50 ng.g ñ1, s limitom detekcie 2,91 ng.g ñ1. Crooks a spol. 55 vyuûili metûdu ELISA pri stanovenì rezìduì monenzìnu v krvnej plazme dobytka; na stanovenie enzymatickej aktivity vyuûili fluorescenciu, dosiahnut limit detekcie a kvantifik cie bol 14 a 26 ng.ml ñ1. äiröie pouûitie stanovenia polyèterov ch antibiotìk metûdou ELISA umoûnilo uvedenie komerënej s pravy urëenej na sledovanie prìtomnosti salinomycìnu v krmiv ch a tkaniv ch 66 na trh v roku 1996 spoloënosùou ARS & Neogen Corp. Kedûe metûdy ELISA patria medzi najcitlivejöie metûdy stanovenia PA, ich hlavnè uplatnenie je pri stanovenì stopov ch koncentr ciì PA v biologick ch a krmovin rskych matriciach. 152

8 7.Z ver Vzhæadom na st paj ci trend pouûìvania PA vo veterin rnej medicìne vznikla potreba ich sledovania v medikovan ch krmiv ch a vo vzork ch biologick ch produktov. Tento cieæ je moûnè dosiahnuù viacer mi analytick mi postupmi, ktorè mùûu byù zaloûenè na rozdielnych princìpoch, z ktor ch najv znamnejöie s stanovenia mikrobiologickè, spektrofotometrickè, imunochemickè alebo separaënè. MikrobiologickÈ stanovenia s st le pouûìvanè pri urëenì Ëinnosti antibiotika, ale postupom Ëasu s nahr dzanè Ëasovo menej n roën mi metûdami. Techniky TLC a ELISA s vhodnè predovöetk m na Ëely zistenia prìtomnosti a identifik cie PA. Technika kvapalinovej chromatografie sa presadila ako metûda pre potvrdenie prìtomnosti analytu (confirmation) a v spojenì s pokolûnovou derivatiz ciou benzaldehydov mi Ëinidlami sa v s Ëasnosti stala najpouûivanejöou metûdou pri anal zach krmìv, premixov a biologick ch produktov. Takisto rozvoj techniky LC-MS v posledn ch rokoch umoûnil jej öiröie pouûitie pri identifik cii a kvantifik cii PA na rovniach ng.g ñ1. LITERAT RA 1. Berdy J., Aszalos A., Bostian M., McNitt K. L.: CRC andbook of Antibiotic Compounds, zv. V. CRC Press, Boca Raton, Florida The American Board of Veterinary Toxicology (ABVT): 3. Akhtar. M., Croteau L. G.: Analyst 121, 803 (1996). 4. Watanabe., Satake A., Kido Y., Tsuji A.:Anal. Chim. Acta 437, 31 (2001). 5. Kline R. M., Stricker R. E., Coffman J. D., Bikin., Rathmacher R. P.: J. AAC Int. 53, 49 (1970). 6. Kavanagh F. W., Willis M.:J. AAC Int. 55, 114 (1972). 7. VestnÌk Ministerstva pùdohospod rstva Slovenskej republiky,»iastka 11, Golab T., Barton S. J., Scroggs R. E.:J. AAC Int. 56, 171 (1973). 9. Martinez E. E., Shimoda W.:J. AAC Int. 66, 1506 (1983). 10. Martinez E. E., Shimoda W.:J. AAC Int. 67, 845 (1984). 11. Karkocha I.:Rocz. Panstw. Zakl. ig. 34, 281 (1983). 12. Karkocha I.:Rocz. Panstw. Zakl. ig. 35, 247 (1984). 13. Karkocha I.:Rocz. Panstw. Zakl. ig. 36, 310 (1985). 14. wles P. J.: Analyst 109, 1331 (1984). 15. Asukabe., Yoneyama., Mori Y., arada K.-I., Suzuki M.:J. Chromatogr. 396, 261 (1987). 16. Blomkvist G. B., Jansson K. M., Ryhage E. R., sterdahl, B.-G.:J. Agric. Food Chem. 34, 274 (1986). 17. Landgraf W. W., Ross P. F.:J. AAC Int. 81, 844 (1998). 18. Gafner J. L.: J. AAC Int. 82, 1 (1999). 19. Schwaiger I., orner.:wien. Tierarztl. Monatsschr. 79, 365 (1992). 20. VanderKop P. A., MacNeil J. D.:J. Choromatogr. 508, 386 (1990). 21. Dimenna G. P., Creegan J. A., Turnbull L. B., Wright G. J.: J. AAC Int. 70, 504 (1987). 22. Beran M., Zima J.: Chromatographia 35, 206 (1993). 23. GorasJ.T.,LacourseW. R.:J.AACInt.67, 701 (1984). 24. Blanchflower J. W., Rice D. R., amilton J. T. G.: Analyst 110, 1283 (1985). 25. Sokolic M., Pokorny M.:J. Pharm. Biomed. Anal. 9, 1047 (1991). 26. Neely F. L.: J. Liq. Chromatogr. 15, 1513 (1992). 27. Neely F. L.: Chromatographia 31, 277 (1991). 28. Bridges D. A., Roth D. M., Cleveland C. M., Moran J.W., Coleman M.R.: J. AAC Int. 79, 1255 (1996). 29. Lapointe M. R., Cohen.:J. AAC Int. 71, 480 (1988). 30. Rodewald J. M., Moran J. W., Donoho A. L., Coleman M. R.: J. AAC Int. 77, 821 (1994). 31. Rodewald J. M., Moran J. W., Donoho A. L., Coleman M. R.: J. AAC Int. 75, 272 (1992). 32. Coleman M. R., Moran J. W., Mowrey D..:J. AAC Int. 80, 693 (1997). 33. Moran J. W., Rodewald J. M., Donoho A. L., Coleman M. R.: J. AAC Int. 77, 885 (1994). 34. Akhtar M.., El-Sooud K. A., Shehata M. A. A.:Food Addit. Contam. 13, 897 (1996). 35. Moran J. W., Turner J. M., Coleman M. R.:J. AAC Int. 78, 668 (1995). 36. Gerhardt G. C., Salisbury C. D. C., Campbell. M.:Food Addit. Contam. 12, 731 (1995). 37. Chen X. M., Shi X. X.:Sepu 17, 77 (1999); Analytical WebBase (ISSN ); CFAA/ 38. Fejglova Z., Dolezal J., rdlicka A., Frgalova K.:J. Liq. Chromatogr. 17, 359 (1994). 39. Dimenna G. P., Creegan J. A., Turnbull L. B., Wright G. J.: J. Agric. Food Chem. 34, 805 (1986). 40. Karnes. T., Wei A. T., Dimenna G. P.:J. Pharm. Biomed. Anal. 11, 823 (1993). 41. Mathur A. K.: J. Chromatogr., A 664, 284 (1994). 42. Dusi G., Gamba V.: J. Chromatogr., A 835, 243 (1999). 43. Martinez E. E., Shimoda W.:J. AAC Int. 69, 637 (1986). 44. Martinez E. E., Shimoda W.:J. AAC Int. 68, 1149 (1985). 45. oshino Y., orie M., Nose N., Iwasaki.:Shokuhin Eiseigaku Zasshi 26, 585 (1985); Analytical WebBase, Takatsuki K., Suzuki S., Ushizawa I.:J. AAC Int. 69, 443 (1986). 47. Asukade., Murata., arada K.-I., Suzuki M., ka., Ikai Y.:J. Agric. Food Chem. 42, 112 (1994). 48. Miyakawa., orii S., Kokubo Y.:J. Food yg. Soc. Jpn. 36, 725 (1995); Chem. Abstr. 124, (1996). 49. Niessen W. M. A.: J. Chromatogr., A 812, 53 (1998). 50. Blanchflower J. W., Kennedy G. D.:J. Chromatogr., B 675, 225 (1996). 51. Blanchflower J. W., Kennedy G. D.:Analyst 120, 1129 (1995). 52. Volmer D. A., Lock C. M.:Rapid Commun. Mass. Spectrom. 12, 157 (1998). 53. arris J. A., Russell C. A., Wilkins J. P.:Analyst 123, 2625 (1998). 54. ormaz bal V., Yndestad M.:J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 23, 1585 (2000). 55. Crooks S. R.., Fodey T. L., Gilmore G. R., Elliott C. T.: Analyst 123, 2493 (1998). 153

9 56. Kennedy G. D., Blanchflower J. W., ídornan B. C.: Food Addit. Contam. 12, 93 (1995). 57. Muldoon M. T., Elissalde M.., Beier R. C., Stanker L..: J. Agric. Food Chem. 63, 1745 (1995). 58. Elissalde M.., Beier R. C., Rowe L. D., Stanker L..: J. Agric. Food Chem. 41, 2167 (1993). 59. Watanabe., Satake A., Matsumoto M., Kido Y., Tsuji A., Ito K., Maeda M.: Analyst 123, 2573 (1998). 60. Crooks S. R.., Traynor I. M., Elliott C. T., McCaughey W. J.:Analyst 122, 161 (1997). 61. Godfrey M. A. J., Luckey M. F., Kwasowski P.:Food Addit. Contam. 14, 281 (1997). 62. Pauillac S., almos T., Labrousse., Antonakis K., Avrameas S.: J. Immunol. Methods 164, 165 (1993). 63. Mount M. E., Failla D. L.:J. AAC Int. 70, 201 (1987). 64. eitzman R. J., Carter A. P., Cottingham J. D.:Br. Vet. J. 142, 516 (1986). 65. Kennedy D. G., Blanchflower W. J., ídornan B. C.: Food Addit. Contam. 12, 83 (1995). 66. Stanker L..: Agric. Res. 44, 23 (1996). M.Blazsek (Research and Development Section, Biotika Co., Slovensk ºupËa, Slovak Republic): Review of Analytical Methods of Determination of Polyether Antibiotics A review is presented on the current state of analytical techniques used for determination of significant veterinary polyether antibiotics (salinomycin, narasin, monensin and lasalocid) in various matrices by spectrophotometric, microbiological, enzyme-immobilized immunosorbent and chromatographic methods. In particular high-performance liquid chromatography is discussed with special emphasis on various detection methods for these antibiotics. PZV NKA Katedra biochemie P ÌrodovÏdeckÈ fakulty Univerzity Karlovy v Praze srdeënï zve na vïdecko-pedagogickè odpoledne konanè u p Ìleûitosti 50. v roëì zaloûenì katedry ve st edu 28. kvïtna 2003od 13hodin v posluch rnï C1 a v prostor ch katedry biochemie P F UK Albertov 2030, Praha 2 ostè vìt ni PotvrÔte laskavï svoji Ëast: Tel.: biochem@natur.cuni.cz 154