Zgradba in dinamika biološke membrane

Transcript

1 BIOLOGIJA CELICE Zgradba in dinamika biološke membrane Osnovne sestavine: lipidi trdnost proteini sladkorne skupine vezane na lipide in proteine na eksoplazmatski strani membrane Ločimo dva sloja: E ali eksoplazmatski sloj (ima sladkorne komponente) P ali plazmatski sloj (na strani citosola) Naloge membrane: oviranje prehajanja vodotopnih molekul razmejevanje citoplazme v predelke/kompartmente selektivna propustnost s pomočjo prenašalnih proteinov prenos informacij hormonov v celico preko receptorjev v membrani pritrjevanje celice na podlago ali sosednjo celico Lipidi Delimo jih glede na osnovo, na katero se pritrjajo maščobne kisline: glicerol, sfingozin, holesterol SFINGOLIPIDI so derivati sfingozina (aminoalkohol z dolgo alifatsko verigo). Ločimo: ceramide (pomembni strukturni elementi celičnih membran, sodelujejo pri celičnem sporočanju) sfingomielin (najbolj pogost sfingolipid, nahaja se v zunanjem sloju plazemske membrane in mielinski ovojnici nekaterih živčnih celic, zaestren ima fosfoholin -> spada med fosfolipide!) glikolipide (vezane imajo sladkorje, nahajajo se v zunanjem sloju plazemske membrane, delimo jih na cerebrozide in gangliozide) FOSFOGLICERIDI so derivati glicerola. Vsi so diacil fosfogliceridi (imajo polarni in nepolarni del, so amfipatični, spadajo med fosfolipide, ker je ena maščoba zamenjana s fosfatom, vsebujejo nasičeno in nenasičeno maščobno kislino) Polarne glave so etanol (fosfatidiletanolamin), holin (fosfatidilholin), serin (fosfatidilserin), inozitol (fosfatidilinozitol) HOLESTEROL, čigar glavna naloga v membrani je, da zmanjša fluidnost in jo stabilizira. Ureditev lipidov v micele ali dvosloj: molekule klinaste oblike se oblikujejo v micele molekule valjaste oblike tvorijo lipidni dvosloj (ti lahko tvorijo liposome) Gibanje lipidov v membrani: lateralna difuzija

2 upogibanje in rotacija posameznih lipidov flip-flop (preskok iz enega sloja v drug, energetsko zahteven in potrebuje encim flipazo) Na fluidnost membrane vplivata: temperatura sestava membrane: dolžina repkov (daljši -> več vezi, večja stabilnost) število dvojnih vezi (ni dvojnih vezi -> lipidi so si bliže -> več vezi, večja stabilnost) vsebnost holesterola (zapolni prostore med lipidi in je tako membrana bolj rigidna) Fazna stanja membrane: tekoča neurejena faza liquid disorder, sol (malo holesterola, mnogo fosfogliceridov) tekoča urejena faza liquid order, gel (mnogo holesterola, mnogo sfingolipidov) trdna faza (malo holesterola, nogo sfingolipidov) v naravi je ni Asimetrična razporeditev lipidov: glikolipidi zunaj, fosfadil-serin znotraj (če je zunaj, je to znak smrti celice) MANJKA Membranski proteini Zaradi gibanja proteinov rečemo membrani tudi tekoči mozaik. Naloge proteinov: transport (črpalke in prenašalci) vezava (pritrjevanje celice na zunanjo ali notranjo strukturo) recepcija (obveščanje celice o signalnih molekulah) so encimi Načini vezave proteinov na membrano: integralni proteini so sestavni deli membrane transmembranski so amfipatični, pritrjujejo se lahko s pomočjo α-heliksov (ti se lahko uredijo v vodne pore, ob strani imajo hidrofobne dele, na zunanji strani pa hidrofilne) ali β-lističev (tvorijo cevaste strukture, ki omogočajo prehajanje molekul, npr. porin) lipidno vezani proteini so pripeti z povezovalni glikolipidno molekulo GPI-sidrom periferni proteini so vezani na druge komponente membrane s nekovalentnimi vezmi, pogosto so na citosolni strani membran in se pripenjajo na druge komponente citoskeleta Membranski proteini eritrocita + band 3? Omejitve lateralne difuzije proteinov pripenjanje na citoskelet pripenjanje na druge proteine (zunajcelične ali proteine sosednjih celic) tesni stiki proteini, ki združijo vrha dveh epitelnih celic in preprečujejo prehod snovi med bazolateralnim delom in aplikalnim delom Glikokaliks sladkorni plašč Glikokaliks je sladkorni plašč, ki ga tvorijo sladkorne komponente glikolipidov in glikoproteinov na E- sloju plazmaleme V membrani so različni oligosaharidi, ki z lipidi in proteini tvorijo kovalentne vezi (glikolizacija):

3 GLIKOPROTEINI so periferni, nosijo majhne sladkorne skupine sladkorni del je do 5% N-vezani oligosaharidi (sladkor se veže preko dušika na AK asparagin, razvejani so kot dreveščki) O-vezani oligosaharidi (sladkor se veže na AK serin ali treonin preko kisika, imajo manj sladkornih skupin in so nerazvejani) PROTEOGLIKANI so transmembranski, nosijo dolge sladkorje sladkorni del je do 90% so zelo velike molekule, predvsem v medceličnini, vezani vedno prek kisika, nerazvejani in dolgi, tvori jih proteinska osnova in sladkorne molekule glikozaminoglikani so polisaharidi iz ponavljajočih sladkornih se delov (ti imajo par COO - skupin, zato privlačijo katione z vodnim plaščem, ki tvorijo želatinast ovoj mehansko zaščito), ne vežejo se naravnost na protein, ampak preko povezovalnih tetrasaharidov transmembranski proteoglikan sindekan veže rastne faktorje (kot hormoni s krajšim dosegom), naprimer FGF, hidroblastni faktor za regeneracijo, ki določi, da gre celica v mitozo Pomen glikolizacije/vloge sladkornih komponent: mehanska zaščita celic (želatinast hidrofilni ovoj) kemijska zaščita (ph, encimi sladkor ovira dostop encimov in tako prepreči razgradnjo) specifično prepoznavanje med celicami (so signalne molekule za krvne skupine, Rh faktor, vezavo levkocitov pri vnetni reakciji, signal na jajčecu za spermij) Membranske domene rafti Skupek lipidov in proteinov na membrani, kjer je gibanje lipidov omejeno in se lahko premika po membrani, imenujemo raft. Sestavljajo jih predvsem sfingolipidi z dolgimi maščobnimi verigami in holesterol. Domene so aktivnejše, saj so debelejše in je več hidrofobnega dela, zato se tu segregirajo/zbirajo proteini. Lektini še dodatno stabilizirajo raft, saj povezujejo dve beljakovini. Poglavitna naloga je razvrščanje in usmerjanje molekul na določena območja membrane, s čimer je povezana diferenciacija celic. Transport ionov in molekul čez membrano prenos snovi skozi membrane lahko poteka z enostavno difuzijo ali ob pomoči membranskih transportnih proteinov s enostavno difuzijo (prehodom v smeri koncentracijskega gradienta) se prenašajo plini (O2, CO2, N2), hidrofobne molekule (benzen), majhne polarne molekule (H2O) ioni zunaj in znotraj membrane: Cl - in Na + zunaj sta si sorazmerna, Ca + je več zunaj (sekundarni prenašalec informacij v notranjost, kaže na neaktivnost/aktivnost celice) in K + je več znotraj elektrokemijski gradient: naboj in koncentracija ionov glej sliko Membranski proteini Kanalčki Prenašalci Črpalke Imajo hidrofilno notranjost, ioni prehajajo glede na premer kanalčka in jakost naboja Prenašajo specifične molekule, pri čemer se protein spremeni (gre v notranjost)

4 Potrebna W Primarni aktivni transport - ATP-črpalke ustvarjajo koncentracijski gradient med kompartmenti spreminjajo elektromagnetno ali kemično energijo v koncentracijski gradient porabljajo energijo ob hidrolizi ATP vrste ATP-črpalk: P-črpalka (v plazmalemi), V-črpalka (vakuolarna) in F-črpalka (v mitohondrijski membrani) P-črpalke fosfat ATPja se veže na protein, ki se konformacijsko spremeni in prenese ion na drugo stran membrane značilen primer je Na-K črpalka v plazmalemi evkariontov Ca 2+ ATP-aza črpa kalcijeve ione v zunanjost celice ali lumen ERja in ohranja nizko koncentracijo Ca 2+ v citosolu V-črpalke Protonski prenašalci zakisajo so v lizosomih in endosomih (veziklih), kjer je treba znižati ph Sestavljeni so iz rotorja in statorja, turbinske črpalke F-črpalke So v notranji membrani mitohondrija, poganja jih protonski gradient, proizvaja se ATP in prehajajo protoni ABC ali kasetni transporterji Ob hidrolizi ATP črpajo specifične ione Lahko prenašajo toksične snovi iz celice če so zaradi mutacije neaktivni, se pojavi bolezen cistična fibroza Sekundarni aktivni transport kotransport S prenašalci se prenašata dve snovi naenkrat Simport Obe snovi se prenašata v isto smer koncentracijska gradienta sta si nasprotna Primer: Na-glukozni simport (natrij sili v celico - dva Na + morata biti vezana na receptorski mesti, da pride do prenosa glukoze v celico), tudi Na + /aminokisline, Na + /Cl Antiport Transportirani in kotransportirani ion se prenašata v različnih smereh Primer: Na + /H +, Na + /Ca 2+, Cl - /HCO3 - (anionski antiporter) Pospešena difuzija - kanali Hitrost prenosa Pasivni transport v smeri koncentracijskega gradienta Aktivni transport 10 6 ionov/s 10 3 ionov/s 10 2 ionov/s Specifičnost Nizka Srednja Skoraj absolutna Ionske specifične pore, ki se kontrolirano prehodno odpirajo in zapirajo integralni transmembranski proteini prenašane snovi niso v stiku s hidrofobno notranjostjo membrane in je prenos hitrejši kot pri pasivni difuziji

5 Prenos poteka v skladu z gradientom, je energijsko ugoden, učinkovit in selektiven Snovi lahko prehajajo tudi direktno med dvema celicama to so koneksoni Načini reguliranja odpiranja kanalov: Električni - napetostno odvisni: odzivajo se na spremembo potenciala na membrani Kemijski ligandno odvisni: ligand vpliva na drug protein (acetilholin AcH) Mehanski stresni: odzivajo se na gibanje membrane oz. mehanski dražljaj (v Cortijevem organu) Primeri kanalov: K + kanal: selektiven v kanalčku je filter, ki sleče hidratacijski ovoj in pusti ionu skozi le, če je dovolj velik (Na + ni) Na + kanal: kanal je ozek, tako da Na + prehaja skupaj z hidratacijskim ovojem, K + pa je prevelik Ca 2+ kanal: napetostno odvisen kanal, je odprt ali zaprt, deluje v skladu z gradientom Skrčenje mišične celice: ob signalu se Ca 2+ kanal odpre in Ca 2+ vstopi, odprejo se tudi kanali v membrani ER in Ca 2+ steče v citosol Relaksacija mišične celice: Na + / Ca 2+ antiporter črpa Ca 2+ iz velice proti gradientu in vnaša Na +, kar je energijsko ugodno Cistično-fibrozni transporter Cl - kanal: pri zdravih osebah v gobletovih in žleznih celicah (izločajo mukos) skupaj z Na + kanali zagotavlja normalno hidratacijo in nizko vizkoznost migetalke v dihalnem epitelu delujejo normalno. Pri pacientih s cistično fibrozo zradi okvare CFTR kanala Cl - ne more iz celice in celica sprejema Na + in mukos postane zadebeljen, vanj se ne ujamejo bakterije, migetalke ne utripajo, celice se razgrajajo in pojavijo se kronične infekcije. Konformacijske oblike kanalčka: prost/zaprt, zaseden/zaprt in zaseden/odprt Patch clamp metoda za merjenje napetosti v kanalčku Sklopljeni transport v polariziranih celicah Sklopitev kationskih črpalk s transportom topljenca, ki poteka ob pomoči prenašalcev ATPčrpalka transportira katione skozi membrano, pri čemer se energija iz ATP-ja shrani kot koncentracijski gradient kationov in membranski potencial. Prenašalci to uporabljajo za prenos kationov proti? smeri koncentracijskega gradienta. Srčna mišica: K + kanal, Na + /K + ATP-črpalka in Na + /Ca 2+ antiporter Kotransport glukoze in Na + v črevesnih epitelnih celicah: Na + /glukozni simporter apikalno ter glukozni uniporter, Na + /K + ATP-črpalka in K + kanal bazolateralno (glukoza potrebuje pomoč Na +, da pride v celico nasproti koncetracijskemu gradientu, nato pa oddifundira skozi bazolateralno membrano, za kar potrebuje Na + pomoč ATP-črpalke) Transport soli in vode v epitelu ledvičnih kanalčkov: NaCl/KCl simporter apikalno, veliko Na + /K + ATP-az in K + in Cl + kanalčkov bazolateralno (omogoča reasorbcijo NaCl v Henleyevi zanki ATP-aze ustvarjajo gradient Na +, ki žene simporter) Transport soli in vode v epiteliju dihalnega trakta: Glej učbenik Izločanje HCl v epitelnih celicah želodca: Glej zapiske

6 Uravnavanje celičnega volumna Hipertonično okolje voda potuje iz celice; hipotonično okolje voda vdira v celico Osmoregulacija omogoča celici, da oharnja svojo obliko in velikost Pri izgubi vode celice aktivirajo Na + /H + antiporterjev, Cl - /HCO 3- antiporterjev in NaCl/KCl simporterjev, ki vanje vračajo NaCl in KCl, čemur sledi voda Pri nabrekanju celice ta aktivira K + kanale, Cl - kanale in/ali K + /Cl - simporter, zaradi česar voda in KCl izhajata iz celice Temelji medcelične komunikacije Sprejem in prevajanje sporočil imenujemo celično signaliziranje, ki je temelj celičnega komuniciranja. Vsaka celica v telesu je sposobna odgovoriti na določeno vrsto signalnih molekul. Ista signalna molekula lahko povzroči različne odgovore v različnih celicah Načini medceličnega signaliziranja 1. Parakrino in avtokrino (rastni faktorji) Glukozaminoglikani ujamejo lokalni kemični mediator (izloči ga bližnja celica parakrino ali celica sama avtokrino) 2. Endokrino (hormoni) Signalne molekule potujejo do tarčne po krvnem obtoku 3. Sinaptično (nevrostransmiterji) 4. Kontaktno odvisno signaliziranje Signalna molekula se sploh ne odcepi Pri embrionalnem razvoju se sosednje celice tako diferenciirajo Odvisnost celice od zunajceličnih signalov (simbolično) Signali 1. Lokalni kemični mediatorji Hitro delovanje v neposredni bližini celic Pomembni med razvojem celic Npr. rastni faktorji, NO, histamin 2. Hormon Počasno delovanje, na razdalji, v nizkih koncentracijah Npr. kortizol, adrenalin, glukagon, insulin, testosteron, tiroksin, 3. Nevrotransmiterji Hitro delovanje, na daljavo, visoke koncentracije Npr. acetilholin (če vpliva na srčno mišično celico, zmanjša moč kontrakcije; če vpliva na žlezno celico, sproži izločanje) Zunajcelične signalne molekule 1. Hidrofilne molekule in molekule, ki so prevelike za prehod membrane potrebujejo receptorje na membrani za prenos sporočila čez membrano 2. Hidrofobne molekule ali dovolj majhne molekule prehajajo skozi membrano in se vežejo na znotrajcelične encime ali receptorske proteine, ki regulirajo izražanje genov (npr. steroidni hormoni

7 se vežejo na jedrske? receptorje v jedru ali citosolu, ki nato delujejo kot regulatorji prepisovanja v jedu; dušikov oksid NO, plin, sproži relaksacijo gladkih mišic v žilah) Receptorji celičnih površin Receptorski proteini na zunanjosti membrane se vežejo na zunajcelično signalno molekulo in jih prenesejo v znotrajcelične signalne molekule. Ločimo tri vrste glede na mehanizem prenosa: 1. Z ionskimi kanali povezani receptorji Prepuščajo tok ionov, ki nabijejo membranski potencial in nastane električni tok Hitri odgovori sinapse v živčevju, omogočajo pretvorbo kemičnega signala v električnega Ob vezavi nevrotransmiterjev receptorji menjajo konformacijo in odprejo/zaprejo ionski kanal 2. Z G-proteini povezani receptorji oh vezavi liganda se na notranji strani spremenijo in omogočijo vezavo G-proteinov, kar vodi do prenosa znotrajceličnih sporočil do encimov ali ionskih kanalov na G-proteine so lahko veže GTP ali GDP - pri 3. Z encimi povezani receptorji Transmembranski receptorji z ligandnim vezavnim mastom zunaj in s citoplazensko domeno Najbolj pogosti so tirozin kinazni receptorji (RTK), pri katerih vezava liganda (npr. epiteljiski rastni faktor, živčni rastni faktor) povzroči njegovo dimerizacijo in avtodosforilacijo tirozinskih preostankov na citosolni domeni na fosfotirozinske aminokislinske preostanke se nato vežejo signalne molekule, vključene v nadalni prenos (npr GTP-vezujoči protein Ras, ki aktivira MAP-kinazo (ta pomaga prenesti signal iz plazemske membrane v jedro) Citokinski receptorji ob vezavi liganda stimulurajo znotrajcelične tirozin kinaze (npr. JAK), ki fosfolirijajo receptorje, ki zagotovijo vezavna mesta za druge molekule sporočanja Znotrajceličen prenos sporočil Znotrajcelične signalne poti Zunajcelična signalna molekula receptor znotrajcelični signalni proteini (lahko prenesejo, ojačajo, združijo signale in jih razdelijo) tarčni proteini odgovor (npr. aktivacija metabolnega encima, sprememba konfiguracije citoskeleta, vklop ali izklop gena) Prenos Recepcija, prenos skozi membrano, modifikacija signala sekundarni prenašalci, pomnoževanje signala - ojačevalci kinaze, multipli cilji efektorji Molekularna stikala Nekateri znotrajcelični signalni proteini delujejo kot molekularna stikala, ki so lahko aktivna ali neaktivna. To je pomembno, da se po sprejemu signala vse sodelujoče molekule vrnejo v prvotno stanje. Aktivacija z fosforilacijo: ta stikala preklapljata proteina kinaza in fosfataza; veliko je tudi stikal, ki so kinaze in sprožijo verigo fosforilacij GTP-vezujoči proteni: stanje teh stikal je odvisno od tega, ali imajo nase vezan GDP ali DTP

8 Tarčni encimi prenašajo in pomnožujejo signal adenilat ciklaza proizvede sekondarni obveščevalec ciklični adenozin monofosfat camp, ki aktivira protein kinazo A PKA, ta preide v jedro in aktivira transkripcijski regulator za prepis ustreznega gena camp tudi regulira ionske kanale odpre kanale Na + in povzroči depolarizacijo in nastanek živčnega impulza (v vohalnem epiteliju) gvanilat solfaza ob signalu (NO in peptidne signalne molekule) iz gvanozin trifosfata proizvede sekundarni obveščevalec ciklični gvanozin monofosfat cgmp deluje v fotoreceptorskih celicah in pretvarja svetlobne signale v živčni impulz fosfolipaza cepi PIP2 v plazmalemi in proizvede dva sekundarna obveščevalca, diacilglicerol in inozitol trifosfat IP3: diaglicerol aktivira protein kinazo C (in ta naslednje tarče), IP3 pa sprosti Ca + iz znotrajceličnih zalog (aktivira od Kalcija odvisne proteinske kinaze in fosfataze) Transkripcijski faktorji proteini NF-κB so vključeni v številne celične odgovore (npr. na stres, navzočnost prostih radikalov, UV sevanju, ), ob aktivaciji se prestavijo v jedro in aktivirajo prepisovanje tarčnih genov NF-κB nadzorujejo anti-apoptotske gene, gene za vnetni odziv; okvara vodi do avtoimunih bolezni ali tumorjev, tudi celično smrt MAP-kinazna pot: sistem treh kinaz, ki se medsebojno aktifirajo s fosforilacijo pomembne pri celični rasti in diferenciaciji MAP-kinaza ERK povzroča fosforilavijo transkripcijskih faktorjev v jedru to MAP-kinazno pot aktivira GTP-vezujoči Ras-protein (povezan z nastankom raka pri človeku) mutacije, ki naredijo Ras vedno aktiven, so pogoste v rakavih celicah Usoda receptorjev = kako ustaviti učinek, ki ga povzroči vezava liganda na receptor? vrnitev receptorja na svoje mesto v cel. membrani razgradnja receptorja v lizosomu inaktivacija receptorja sprememba strukture, vezava inhibitorja inaktivacija znotrajceličnega signalnega proteina Hitri in počasni odziv Hitri odziv adrenalin -> v jetrih razgradnja glikogena -> beg ali boj Počasni odziv najprej se spodbudi sinteza encimov -> več proteinov, ki so aktivni -> MOČNEJŠI ODGOVOR (spolno dozorevanje)

9 Medceličnina Zunajcelični matriks/medceličnina obdaja celice v tkivih. To je mrežje številnih makromolekul. Veliko ga je v vezivnih tkivih (kosti, veziva, dermalna plast kože), lahko je tudi v obliki bazalne lamine (d= nm). Poglavitne molekule medceličnine: fibronektin, kolagen I in IV, laminin, hialuronan, dekorin, perlekan, tenascin, agrekan Proteoglikani proteinsko polisaharidni kompleksi: protein + verige glikozanimoglikanov (GAG) GAG: ponavljujoče polisaharidne verige iz disaharidnih enot A-B-A-B-A-B (A, B sladkorja) z negativnim nabojem zaradi sulfatne ali karboksilne skupine na enem izmed sladkorjev vežejo katione (+ njihov vodni plašč) iz okolice nastane gel, ki daje oporo in ščiti pred pritiski proteoglikani plazmaleme: sindekani in betaglikani so vgrajeni v plazmalemo, ekstracelularno pa se nahaja komponenta GAG, ki se povezuje z proteini medceličnine (plazmalemska domena pa se povezuje z aktinom v citoskeletu) pomembne za prenos sporočil v celico, gibanje celic in spremembo oblike celice med diferenciacijo Laminini proteini iz treh polipeptidnih verig s specifičnimi vezavnimi mesti vežejo: celične površinske receptorje (integrini), proteoglikane (perlekan), glikoproteine (nidogen) in kolagen IV Kolageni nitasti zunajcelični glikoproteini najpogostejši določajo mehanske lastnosti medceličnine izločajo jih fibroblasti, znanih je več 10 različnih tipov zgradba: trimerne -vijačne polipeptidne verige (homotrimere ali heterotrimere) fibrilarni kolageni: tip I, II in III se urejajo v fibrile in povezujejo v kolagenska vlakna + lizinski/hidroksilizinski AK preostanki = kolagenska molekula nefibrilarni kolageni: tip IV v bazalni lamini organiziran v ploščate mreže, nanj se pripenjajo celice, gradijo ga dolge tri - vijačnice kolagenske bolezni: posledice mutacije (pogoste) določenega gena za kolagen; osteogenesis imperfecta, Ehlers-Danlosov sindrom, Alrportov sindrom, skorbut (pomanjkanje vit C, ki je potreben za sintezo kolagena prizadete dlesni, kosti, veziva, srce in ožilje, ) Fibronektini zunajcelični glikoproteini iz dveh polipeptidnih verig z vezavnimi mesti

10 vežejo: komponente medceličnine (GAG, oklagen), receptorje na površinah membrane (integrini) tredna povezava med celicami in medceličnino lahko tvori poti, po katerih se celice gibljejo med razvojem/diferenciacijo (netopne zaporedne nitaste strukture) Elastin hidrofoben neglikoziliran protein, glavna sestavina elastičnih fibril v zunajcelični prostor se izloča kot topna tropoelastinska molekula, ki se od plazmalemi ploskovito povežejo s prečnimi povezavami (fibrilin) v elastične fibrile elastina fibrile elastine so prekrite s plastjo glikoproteinskih mikrofibril (fibrilin) omogoča elastičnost in integriteto prevladujoč protein medceličnine v arterijah Marfanov sindrom: avtosomna dominantna bolezen vezivnega tkiva (mutacija fibrilinskega gena 15. kromosom) okvare oči (leča & druga vezivna tkiva), aorte in arterij, kosti Bazalna lamina tanek, gibljiv, ploskovit preplet nm lega: pod epiteliji (ločuje od vezivnega tkiva preprečuje gibanje celic) okoli mišičnih celic (ločuje membrani mišične in živčne celice v sinapsi obnova sinapse po poškodbi) okoli maščobnih in Schwannovih celic v ledvičnih glomerulih je filter med dvema ploskovitima skupinama celic preprečuje prehajanje makromolekul iz krvi v urin vloga: določa celično polarnost, vpliva na proliferacijo in diferenciacijo, je podlaga za migracijo (obnova tkiv po poškodbi) zgradba: kolagen IV, heparin sulfatni proteoglikan perlekan, glikoproteina laminin in nidogen zgradijo jo celice, ki se pripenjajo nanjo razgradnja je nadzorovana (encimi za razgradnjo: metaloproteaze ali serinske proteaze), npr. pri selitvi celic po BL; rakave celice pa jo lahko razgrajujejo in prodirajo v druga tkiva Celični stiki Povezovalne molekule CAM celične adhezijske molekule (=transmembranski proteini); na eni strani vežejo na elemente citoskeleta, z drugim na molekule izven celice KADHERINI SELEKTINI INTEGRINI IMUNOGLOBULINSKA SUPERDRUŽINA Kadherini povezujejo celice, vloga med celjenjem ran po poškodbah in pri razvoju rakave celice (E-M prehod) so dolgotrajni, omogočajo, da se prave celice povežejo 1 transmembranski del + več zunajceličnih domen KLASIČNI KADHERINI: epitelijske, živčne, placentalne, endotelijske celice povezujejo se na aktinski del citoskeleta

11 NEKLASIČNI KADHERINI: protokadherini, dezmoklini, dezmogleini povezujejo se z intermediarnimi filamenti (s citokeratini proteini, ki dajejo stabilnost) epiteljsko-mezenhimski prehod: prehod, v katerem epitelne celice izgubijo polariziranost in celične stike in nastanejo mezenhimske celice (pri npr. nastajanju mezoderma, celjenje ran, začetek rakave metastaze, ) Katenin adapterski protein, ki omogoča, da se kadherin lahko poveže z aktinom Selektini integralni membranski glikoproteini z velikim zunajceličnim delom povezujejo se heterofilno na lektin druge celice in na aktinske filamente v citoskeletu sestava: krajša citoplazemska domena, transmembranski del, velik zunajcelični del molekule vloga: pri migraciji levkocitov in strjevanju krvi -> vnetni odgovor; selektini prepoznajo sladkorne ostanke in se vežejo na oligosaharide v membrani levkocita; prehodne, šibke povezave med različnimi celicami v krvi vrste: E-selektini v endoteliju, P-selektini na trombocitih in v endoteliju, L-selektini na levkocitih Imunoglobulinska superdružina homofilna ali heterofilna povezava ena ali več peptidnih domen, značilne za protitelesa (imunoglobuline) različni integralni membranski proteini od kalcija neodvisne povezave z integrini vloga: receptorji antiteles na površini limfocitov, receptorji levkocitov icam medcelične adhezijske molekule za povezavo med limfociti in tarčnimi celicami - homofilne ncam živčne ali nevralne celične adhezijske molekule med celicami neimunskega sistema - heterofilne nektini - prisotni pri adherentnih stikih epitelija in v sinapsah MIGRACIJA LEVKOCITOV NA MESTO INFEKCIJE Levkocit (v neaktivni obliki ima integrine in sladkorne preostanke). Endotelne celice v žilni steni (I-cam in selektini). 1. FAZA: Selektini se izpostavijo na membrani. Pojavi se faktor aktivacije trombocitov, ki aktivira integrine. 2. FAZA: Ko pride levkocit blizu vnetja, se najprej povežeta SELEKTIN in LEVKOCITNI SLADKOR (šibka povezava). NAMEN: upočasniti hitrost gibanja levkocita 3. FAZA: Povezovanje preko INTEGRINOV in I-CAM molekule močna vezava. Integrin se aktivira. Levkocit lahko prehaja skozi stene žile na področje vnetja. Integrini superdružina integralnih membranskih proteinov zgradba: dve glikoproteinski podenoti, ki sta nekovalentno povezani med seboj 2 transmembranski verigi (veriga α in β), velik zunanjecelični del vezavno mesto za specifičen ligand, transmembranski proteini, ki se povežejo z molekulami v ekstracelularju heterofilno povezani za vzpostavitev povezave potrebujejo 2 valenčne elektrone Ca 2+, Mg 2+ omogočajo povezovanje celice na neko podlago (bazalna lamina) zunajcelično je vezava odvisna od zaporedja aminokislin rdg (arginin, asparaginska kislina, glicin) in od navzočnosti kalcijevih ali magnezijevih ionov

12 funkcija: trdna vezava celic na zunajcelično podlago, sodelovanje pri strjevanju krvi, metastaziranju rakavih celic in celjenju ran. vrsta stika glede na elemente citoskeleta: aktinski filamenti FOKALNI STIK intermediarni filamenti HEMIDEZMOSOM (gibanje, bolj stabilni) REGULACIJA VEZAVE INTEGRINA NA ECM Signalna molekula preko receptorja spodbudi aktivacijo integrina. Določene celice ne smejo biti vedno povezane s tarčnimi proteini. CAM molekula Odvis. od Ca KADHERINI DA HOMOFILNO dolgotrajne SELEKTINI DA HETEROFILNO na glikoproteine s sladkornimi komponentami vezave šibke, prehodne, kratkotrajne SUPERDRUŽINA IMUNO- GLOBULINOV NE Vrste povezav Sestava Funkcija Vrste HETEROFILNE povezave z integrini INTEGRINI DA HETEROFILNE zaporedje RAG (beta podenota); prisotnost kalcijevih in magnezijevih ionov (alfa podenota) en transmembranski del + več blokov 4 domene? - krajša citoplazemska domena - en transmembranski del - velik zunajcelični del povezovalni segment za določeno OH skupino LEKTIN ena ali več peptidnih domen - dve glikoproteinski podenoti, nekovalentno povezani med seboj - na površini različni heterodimeri - vezavno mesto za specifičen ligand - povezovanje celic v tkiva (trdno) - celjenje ran - razvoj rakave celice prehod E-M - pri migraciji levkocitov in strjevanju krvi - prepoznavanje sladkornih ostankov in vezava na oligosaharide v membrani levkocita - vnetni odgovori - vezava med limfociti in drugimi tarčnimi celicami - trdna povezava celic z zunajcelično podlago - sodelovanje pri strjevanju krvi, metastaziranju rakavih celic, celjenje ran KLASIČNI (P, E, N) NEKLASIČNI (protokadherini, dezmokolini, dezmogleini) L (levkociti) E (endotelijske celice) P (trombociti, endotelijske celice) I-CAM heterofilne, nahajajo z integrini N-CAM - homofilne NEKTINI Vrste medceličnih povezav in stikov 1. Neprehodne povezave Tesni stik 2. Mehanske povezave Adherentni/priležni stik Dezmosom Hemidezmosom 3. Prehodne/komunikacijske povezave Presledkovni stik vloge: prepoznavanje

13 povezovanje komuniciranje povezujejo celice med seboj in na ECM (= ekstracelularni matriks celic na vezivo) povezujejo celice v tkiva (razen v krvnem tkivu) stalno prisotne, a ne stalno aktivne - vzpostavljajo se občasno in po potrebi (npr. v črevesju, kjer se vsak dan odcepi veliko celic) so lahko komunikacijske povezave v osnovi jih gradijo CAM molekule - CAM molekule so lahko v plazmalemi ali v domenah, kjer oblikujejo stike se nahajajo na specializiranih predelih plazmaleme POLARIZIRANA CELICA je celica na meji dveh različnih kompartementov, ki razmejuje telo proti zunanjosti ali notranjim lumnom. NAMESTITEV STIKOV V PLAZMALEMI POLARIZIRANIH CELIC apikalna bazolateralna membrana Tesni stik Adherentni stik Dezmosom Presledkovni stik Hemidezmosom Stiki Lokalizacija Vloga/pomen Transmembranski proteini Tesni stik Adherentni stik Dezmosom Submembranski proteini Zo-1,2,3, cingulin Hemidezmosom Presledkovni stik Lateralna stran celice Lateralna površina, v polariziranih in nepolar. Bazalna stran - preprečevanje paraceličnega prehoda zajezitvena vloga - preprečevanje lateralne difuzije med A/BL plazmalemo - vloga zavese - nastanek in povečanje čezcelične upornosti - pečatijo epitelijske celice - zagotavljajo polarizacijo celice na A in BL del - povezava aktinskih snopov 2 sosednjih celic - omogoča mehansko trdnost, gibljivost celic, pomemben med razvojem tkiv - vezava intermediarnih filamentov 2 celic - velika mehanska trdnost - povezava intermediarnih filamentov z BL - povezava epitelov z vezivom - Omogoča prehod molekul in ionov (anorganski ioni, AK, nukleotidi, vitamini, camp) - direktna povezava med sosednjimi celicami - majhne odprtine skozi plazmalemi sosednjih celic Okludin, klavidin, jam proteini e-kadherin Kadherini (dezmoglein, dezmokolin) Integrini α6β4 Katenini α, β, γ Vinkulin, - aktin, plakoglobin Specifični katenini (plakoglobulin, dezmoplakin) Talin, α aktin, vinkulin, plektin Elementi citoskeleta aktinski intermediarni Intermediarni Zgradba: protein koneksin 4x prehaja dvosloj; 6 koneksinov tvori cilinder z poro v sredini - konekson, polkonekson se poveže z drugim polkoneksonom druge celice in skupaj tvorita presledkovni stik TESNI STIK: zatesnitev medceličnega prostora

14 med sosednjimi polariziranimi celicami (polarizacija celice) razmejitev zunajceličnega od medceličnega prostora -> specifični transepitelijski potencial transmembranski proteini: OKLUDINI, KLAVDINI, JAM proteini submembranski proteini: ZO1, ZO2, cingulin vloga: preprečitev lateralne difuzije med A/BL plazmalemo vloga ''zavese'' razlika v sestavi in delovanju apikalne in bazolateralne pov. plazmaleme v polariziranih celicah preprečevanje transporta med celicami paracelularna pot prostor med celicama bi lahko vodil snovi v notranjost nastanek ČEZCELIČNE/transepitelialne UPORNOSTI sila, značilna za posamezne tipe epitelov - > tesni stiki morajo biti zelo močni, zlasti tam, kjer je veliko odpadnih ostankov, toksičnih snovi, ki ne smejo difundirati med celicami preprečujejo izgubo tekočin iz telesa pri pojavljanju bolezni so ključni proteini KLAVDINI (hipomagneziemija, gluhost, sklerozni holangitis) mesta namestitve tesnega stika: v koži je tesni stik v vlogi bariere preprečuje vdor patogenih elementov in izgubo vode iz telesa. tesni stiki se pojavljajo na meji z lumnom nosna votlina, grlo žrela, žile (alveolarna bariera!) EPITELIJ zunanje okolje ENDOTELIJ notranji lumen Včasih so tesni stiki kontrolirano prepustni; nekatera zdravila pa spremenijo prepustnost tesnih stikov povzročajo manjšo povezanost v območju tesnega stika in nekatere učinkovine lahko vnašamo v telo. prekinitev stika: zaradi patogenov infekcije urotelij (telo takrat prekine povezave) zaradi alergenov DIHALNI EPITELIJ astma mehanske poškodbe in staranje celic PRILEŽNI/ADHERENTNI STIK: pasasti dezmosom lokacija: kot pas okrog polariziranih celic pod tesnim stikom zgradba: transmembranski protein: E-kadherini submembranski proteini: katenini (,, ) elementi citoskeleta: aktinski filamenti funkcija/pomen: mehanska trdnost gibljivost celic pomen med razvojem tkiv (poškodbe ) DEZMOSOM diskasto oblikovana adhezivna povezava ''zakovica'' med celicami v različnih tkivih (epiteliji) Zgradba: citoplazemski plak (plakoglobin, dezmoplakin) mesto sidranja intermediarnih filamentov (mehanski amortizerji) transmembranski proteini: KADHERINI (dezmogleini, dezmokolini)

15 submembranski proteini: plakoglobulin, dezmoplakin DEZMOGLEINI IN KOŽNA OBOLENJA: PEMPHIGUS FOLIACEUS Dezmoglein 1 je prisoten v vseh plasteh epidermisa. Pri tej bolezni protitelesa proti dezmogleinu 1 povzročajo izgubo adhezije keratinocitov v površinski plasti epidermisa (izgubijo povezovalne sposobnosti). Koža se zato lušči. predvsem v povezavi z epiteliji in mišičjem (srčna mišica) luščenje, mehurji, motnje srčnega ritma.. HEMIDEZMOSOM: sidranje epitelijskih celic na podlago pripenjajo bazalni del plazmaleme na bazalno lamino zgradba: elementi citoskeleta submembranski proteini: talin, a-aktinin, vinkulin, plektin transmembranski proteini: integrini pomen: povezuje celice na podlago, vezivo (ECM) povezava je regulirana (lahko se vzpostavi ali ne) preko integrinov (ali na BL ali pa pri povezavi z integrini) Hemidezmosomi in dezmosomi v kožnih celicah: Obstajajo povezave med dezmosomi in hemodezmosomi. Gre za zelo trdno povezavo. Najmočneje so razvite tam, kjer je tkivo zelo gibljivo (mišice, želodec ipd.) avtoimuno obolenje PEMPHIGUS BULLOS nastajanje protiteles proti dvema antigenoma v plaku protitelesa povzročajo lokalno RKC, ki povzroči izločanje EKE, ki cepi povezavo med plakom hemidezmosoma in bazalno lamino (luščenje) obolenja kot posledica motenj v zgradbi keratinov PRESLEDKOVNI STIK (neskus) direktna povezava: posredovanje komunikacij preko odprtin v celicah mesto, kjer se lipidni plasti plazmalem sosednjih celic približata na razdaljo 3 nm, vendar nista v neposrednem stiku kanali koneksoni (iz transmembranskih proteinov koneksinov): 6 koneksinskih molekul, urejenih v središčne pore ali anulusa s premerom 1,5 nm. skozi pore presledkovnega stika lahko prehajajo molekule, velike 1000 daltonov prehod je neselektiven, a uravnavan. kaj prehaja: anorganski ioni (zlasti Ca 2+ - krčenje srčne mišice) aminokisline nukleotidi vitamini (določeni) camp (ciklični adenozin monofosfati pomembna vloga pri prenosu sporočil) ITP inozitol trifosfat

16 deluje kot električna sinapsa (napetostno odvisni prehod) prenos vzburjenja v mišičnih in živčnih celicah hiter! Funkcija: metabolna komunikacija (glukoza -> če celici 1 zmanjka gly, jo dobi od celice 2) informacijska komunikacija (camp prenašalec informacij) prenos električnega akcijskega potenciala (brez zakasnitve v prenosu)- srčni vzpodbujevalec koordinacija peristaltičnih gibanj MEDICINSKI POMEN PRESLEDKOVNIH STIKOV med embriogenezo živčne celice komunicirajo preko presledkovnega stika. Obdajajoče ehtodermalne celice ne izražajo presledkovnih stikov s celicami nevralne cevi. Zagotavljajo normalen razvoj ovarijev in zorenje jajčnih celic. Napaka v koneksinih vodi v žensko sterilnost. MUTACIJE GENOV ZA KONEKSINE: gluhost motnje srčnega ritma (ni dobrega prevajanja električnih signalov) ženska sterilnost (koneksoni ne omogočajo prenosa hranil iz foliklovih celic v zorečo jajčno celico) karakta kožna obolenja bolezen zaradi napake v presledkovnih stikih: CMT je dedna bolezen, ki se kaže kot progresivna degeneracija perifernih živcev, počasna izguba mišičnega nadzora, razgradnja mišičnega tkiva človeški genom vsebuje 21 genov, ki kodirajo koneksine koneksinske molekule v presledkovnih stikih se urejajo v golgijevem aparatu in izločajo na ustrezne površine celice pri mutaciji ne prispejo do plazmaleme (to jim onemogoči kontrolni sistem v ergicu) Citoskelet Citosol je tekoča vsebina celice med kompartmenti. Vsebino evkariontske celce (razen jedra) imenujemo citoplazma. Preplet v obliki niti v citosolu se minuje citoskelet. Vsi 3 elementi citoskeleta (aktinski filamenti, mikrotubuli in intermediarni elementi) so polimeri, ki se razlikujejo po zgradbi, funkciji in lokaciji. Glavne naloge citoskeleta so opora in zgradba, znotrajcelični transport, oblika prostorska ureditev, krčljivost in gibanje. Aktinski filamenti Splošne značilnosti aktinskih filamentov najtanjši filamenti mikrofilamenti s premerom 5 do 7 nm aktinske molekule tvorijo filament z dvojno vijačnico osnovna zgradba; dolžina, število, stabilnost, način povezovanja pa se med celicami zelo razlikujejo dinamičen sistem filamenti se krajšajo, daljšajo, povezujejo, razpadajo: polimerizacija, depolimerizacija, hidroliza ATP nahajajo se pod plazemsko membrano

17 monomera je G-aktin, polimer pa F-aktin; vsi vsebujejo Mg 2+ in ATP/ADP najbolj množičen protein v celicah (1-5%) razen v mišičnih celicah (10% proteinov), koncentracija 0,5mM 6 izoformnih oblik: 4 -aktini (mišične celice krčenje celic), 1 -aktin (lokomocija celic) in 1 - aktin; samo 4-5 razlik v AK zaporedju lastnosti so odvisne od proteinov, ki se vežejo na aktin več kot 100 različnih proteinov funkcija: mišična kontrakcija, ameboidno gibanje, citokineza, vzdrževanje oblike, opora aktinu so zelo sorodne molekule Arp: Arp 1 se povezuje z dineinom pri prenosu veziklov/organelov vzdolž mikrotubulov, Arp2 in 3 se povežeta v Arp 2/3 kompleks, ki je pomemben pri nastajanju mikrotubulov Dinamika sestavljanja aktinskih filamentov pogoj: K +, Mg 2+, velika koncentracija G-aktina vsaka aktinska molekula je polarna (pol z ATP/ADP in pol za vezavo na drugo molekulo) celoten mikrovilament je polaren imajo hitro rastoči konec konec + (monomere se dodajajo 5-10x hitreje) in nasprotni, počasi rastoči ali konec (tu poteka predvsem depolimerizacija) tri stopnje nastajanja mikrofilamentov: 1. nukleacija G-aktin se zbira v kratke, nestabilne oligomere, ki pri dolžini 3-4 podenot delujejo kot jedro, kamor se dodajajo nove enote 2. elongacija hitro daljšanje z dodajanjem monomer na obeh koncih 3. faza ravnovesja količina aktina v filamentih je v ravnovesju z koncentracijo G-aktina ni več sprememb v dolžini kritična koncentracija monomer: 0,1 µm (višje polimerizira, nižje depolimerizira) polimerizacijo spremlja hidroliza ATPja, vezanega na monomere ATP ostane le na koncih filamenta treadmilling: premikanje monomer od + proti koncu zaradi odcepljanja na in dodajanju novih monomer na + koncu protein kofilin odceplja podenote na koncu in omogoča dehidrolizo ADP v ATP v G-aktinu Arp 2/3 stabilizira začetne oligomere in omogoča elongacijo na dinamiko sestavljanja lahko vplivamo z nekaterimi strupi, izoliranimi iz gliv: citohalazin se veže na + konec in prepreči dodajanje monomerov latrunkulin (izoliran iz spužve) se veže na monomere in onemogoči vezavo na polimer faloidin (strup iz mušnice) se veže na podenote vzdolž polimera in prepreči depolimerizacijo če s temi sredstvi delujemo na celico, se celica ne bo gibala in bo preprečena citokineza dokaz, da sta ta dva procesa odvisna tako od polimerizacije kot od depolimerizacije v celici je G-aktina več od kritične koncentracije (0,5 µm), saj se na aktin vežeta timozin in profilin, ki preprečujeta polimerizacijo (večinoma se veže timozin) profilin je edini protein, ki omogoča zamenjavoadp z ATP stimulira polimerizacijo Na aktin vezavni proteini in organizacija aktinskih filamentov a) proteini, ki se vežejo na konce filamentov pokrovni proteini z vezavo na konce filamenta ohranjanjo njegovo dolžino CapZ na konec +, tropomodulin na konec

18 b) cepitveni proteini ob vezavi na filament ga razpolovijo, kar posledično manjša viskoznost citoplazme prehod citoplazme iz gela v sol gelsolin vezan na konec + ob navzočnosti Ca + cepi filamente v kratke fragmente kofilin ob vezavo pospeši disociacijo monomer z konca, lahko tudi cepi na krajše konce; pomemben je pri obnavljanju mikrofilamentov pri hitrih spremembah v organizaciji citoskeleta c) proteini, ki aktinske filamente povezujejo med seboj zaradi večih vezavnih mest za aktin lahko aktinske filamente povežejo v snope ali mrežo (paralelna ali navzkrižna povezava) tipi povezovanja: tesno povezani snopi, filamenti z enako polarnostjo; povezovalni protein fimbrin (2 vezavni mesti) npr. v mikrovilih z proteinom vilinom (preveri!) kontraktilni snopi: večje razdalje med filamenti, kamor se vrine miozin II in z njimi reagira; povezovalni protein -aktinin mreža: elastični gel, ki se upira lokalnim mehaskim pritiskom, leži pod polazmalemo in daje oporo; vezavni protein filamin d) proteini, ki aktinske filamente povezujejo z membrano v nemišičnih celicah je večina mikrofilamentov v mreži pod plazmalemo celici dajejo obliko in so vključeni v številne aktivnosti celične površine (lokomocija, eksocitoza, citokineza,..) pri eritrocitih: ni mikrotobulov in intermediarnih filamentov, bikonkavno obliko določa kortikalni aktinski citoskelet glavni vezavni protein je spektrin, ki s svojimi konci kratke filamente povezuje v mrežo, proteini ankirin pa mrežo veže na tranmembranski protein Band 3 obstaja tudi povezava mreže preko Band 4,1 na drug transmembranski protein, glikoforin druge celice: povezava je podobna, vključeni so drugi, podobni proteini soroden protein je distrofin, ki ga kodira gen, odgovoren za mišično distrofijo veže filamente na glikoproteinski kompleks mišične celice, ki povezuje citoskelet z zunajceličnim matriksom ohranja stabilnosti celice med kontrakcijo drugi kompleksi: kartenini, vinkulin, talin, tudi v fokalnih in adherentnih stikih Miozini motorni proteini aktina povezava z miozinom omogoča aktinu različne oblike gibanja in krčenje celic miozin je motorni protein, ki energijo iz ATP spreminja v mehansko energijo: proizvaja moč in gibanje vzdolž aktinskega filamenta se premika on proti + koncu in vsak premik med podenotami hidrolizira en ATP in povzroči spremembo v miozinu obstaja družina 14 miozinov; miozin II je vključen v kontrakcije, miozin I in miozin V pa sodelujeta pri interakciji z membranami, npr. transportu veziklov zgradba: 1 ali 2 težki verigi s tremi domenami: glava z vezavnim mestom za aktin in ATP proizvaja moč za premik

19 vrat, kamor so vezane lahke verige z regulacijsko vlogo pri interakciji z aktinom, odvisne od Ca + rep, ki določa funkcijo miozina mehanizem interakcije z aktinom: v odsotnosti ATP je glava povezana z aktinskim filamentom rigor mortis, stanje, ki se pojavi tudi ob smrti po vezavi ATP se glava miozina odmakne od aktina hidroliza ATP zaradi hidrolizi se spremeni glava miozina, ki se premakne v + smeri v nov položaj po odcepitvi fosfata se glava miozina spet konformacijsko spremeni in veže na aktin po odcepitvi ADP je glava spet trdno vezana v prvotnem stanju en premik približno za 5-25 nm, hidroliza ene molekule ATP miozin v nemišičnih celicah aktinski filamenti in miozin tvorijo kontratilne snope, ki po organizaciji spominjajo na sarkomere med delitvijo se v ekvatorialni ravnini kopičita aktin in miozin II, ki okoli celice oblikujeta kontraktilni obroč, ki se krči in loči membrani pasasti adherentni stiki so organizirani kot kontraktilni obroč, ki v epiteljski celiji povzročijo kontrakcijo, celica se ugrezne, tvori žleb in nato cev nastanek živčne cevi v embrionalnem razvoju, celjenje ran?? stresne niti Zgradba sarkomere skeletne mišične celice: miofibrile - dolge cilindrične strukture s premerom 1-2 µm, sestavljene iz verig krčljivih enot, sarkomer polimeri miozina II, med sabo na sredini povezani miomezinom v M-liniji aktinski filamenti, ki so z + koncem pritrjeni na Z disk med sabo povezani z -aktininom in stabilizirani z CapZ in tropomodulinom na koncih titin je proteinska molekula med M-linijo in Z-diskom, ki ohranja miozin v središču sarkomere nebulin je povezan z aktinskimi filamenti in uravnava njihovo sestavljanje in dolžino kotrakcijo sproži živčni dražljaji, zaradi katerega se sprosti Ca 2+ iz sarkoplazemskega retikuluma tropomiozin je vezan vzdolž aktina na mestih za vezavo miozina, povezan je z troponinom (ta je sestavljen iz troponina C, ki veže Ca 2+, inhibitornega troponina I in troponina T, ki omogoča vezavo troponina na tropomiozin) če je koncentracija Ca 2+ nizka, tropomiozin preprečuje interakcijo aktina in miozina in s tem kontrakcijo POGLEJ SI ŠE! zapiski

20 Lokomocija celic gibanje celic po podlagi, pomembno pri celjenju ran, zaščiti pred okužbami, strjevanju krvi in metastaziranju rakavih celic 1. oblikovanje in iztezanje podaljška vodilnega konca 2. pritrditev na podlago, pomik celične mase v smeri podaljška 3. prekinitev stika z podlago v zadnjem delu celice hitrosti: rakave celice in celice, ki zdravijo rane 0,1-1 µm/h, nevtrofilci 1800 µm/h, fibroblasti v kulturi 40 µm/h vrste gibanja: ameboidno: spreminjanje citoplazme iz gela v sol in pretoka citoplazme v podaljšek psevdopodij višji organizmi: na vodilnem koncu se oblikujejo podaljški površine: krpasto lamelipodiji ali prstasto filipodiji, ki nastanejo z polimerizacijo aktinskih filamentov in povezavo v tesne snope/mrežo AKTIVACIJA TROMBOCITOV MANJKA? Mikrotubuli vrste: aksonemni in citosolni mikrotubuli vloga: celična oblika in polarnost celice, gibanje (bički, migetalke), transport organelov, ločitev kromosomov med mitozo Zgradba mikrotubulov tubulin: heterodimer, sestavljen iz in -tubulina tubulini se zaporedno povezujejo v dolge protofilamente, ki sestavljajo steno mikrotubula pravilno mikrotubule sestavlja 13 protofilamentov, ki so povezani lateralno z kovalentnimi vezmi (centriol in aksonemni mikrotubuli so lahko le iz protofilamentov) protofilament je polariziran ( začetek in konec), kar kaže na različno dinamiko rasti tubulin se raje veže na konec: hitro rastoči konec sestavljanje tubulina v mikrotubul: 1. nukleacija v centru za organizacijo mikrotubulov MTOC centrosomu. Centrosom leži ob jedru in vsebuje par centriolov (valjasta struktura iz kratkih mikrotubulov). Minus konci so usidrani v pericentriolarni material, ki obdaja centrosom, plus konci pa rastejo navzven torej mikrotubuli ne vdirajo v centrosom in se ne dotikajo centriolov. V pericentriolarnem materialu na obrobju centrosoma so -tubulini, ki oblikujejo obroč. 2. faza rasti: na obroč se vežejo tubulini z -enotami (od te orientacije je odvisna celotna dinamika) strukture mikrotubulov so si podobne, stabilnost pa je različna: mikrotubuli delitvenega vretena (citosolni mikrotubuli) so labilni, mikrotubuli bičkov in migetalk pa stabilni razstavljanje mikrotubulov izzvovejo Ca + in različni alkaloidi (kolhicin, vinblastin, vinkristin), taksol pa zavida depolarizacijo mikrotubulov Dinamična nestabilnost mikrotubulov pogoj za polarizacijo je vezava GTP: na -podenoti je stalno prisoten; na -podenoti pa je GTP ali GDP lahko vezan in to je odločilno za dinamiko celega mikrotubula

21 če se na + konec doda GTP v -enoti, GTP hitro hidrolizira spremeni konformacijo tubulina in oslabi vezi med tubulini posledica hidrolize GTP v -tubulinu je dinamična nestabilnost mikrotubulov, saj pospešije depolimerizacijo, odcepitev končnega dimera - hitro menjavanje rasti in krajšanja mikrotubulov če se na + konec dodajo dodatni GTP-tubulini, preden poteče hidroliza, se oblikuje zaščitna GTP-kapa, ki mikrotubul stabilizira in prepreči depolimerizacijo, v nasprotnem primeru pa se zgodi hitra depolimerizacija stabilnost mikrotubulov je torej odvisna od okoliščin v celici, ki določajo koncentracijo GTPtubulinov Pomen proteinov, vezanih na mikrotubule dinamično vedenje mikrotubulov uravnavajo proteini, ki se vežejo nanje (MAP microtubuleassociated proteins) in omogočijo celici, da mikrotubule stabilizira MAP omogočajo interakcije z drugimi mikrotubuli, intermediarnimi filamenti in membranami organelov dve domeni: globularna bazična (vezana na mikrotubul) in kisla nitasta (vezava na druge elemente) delovanje MAP je uravnavano s proteinskimi kinazami in fosfatazami protein starmin vzdržuje visoko koncentracijo nepolimeriziranega tubulina nek? MAP-protein se veže na + konec in prepreči njegovo cepljenje, catastrophin pa v istem primeru odceplja tubulin katanin preseka mikrotubule po celotni širini in nastanejo fragmenti (tako kromatide pri anafazi potujejo proti poloma preseka povezavo med inf. centrom in -tubulini) MAP-4 je navzoč v vseh neživčnih celicah vretenčarjev, MAP-1 v živčnih celicah, MAP-2 v dendritih in tau v aksonih živčne celice (najmanjši MAP protein, če pride do hiperfosfolarizacije tau, je transport po aksonu otežen in ta propade Alzheimerjeva bolezen) Motorni proteini mikrotubulov morotni proteini omogočajo transport ob mikrutubulu 2 tipa, kinezini in dineini kinezini gibljejo se proti + koncu, torej na periferijo kinezini so velika družina motornih proteinov, tetramerov: dve težki in dve lahki verigi, ki sestavljajo glavo, pecljati del in rep globularni glavi delujeta kot motor z mesti za vezavo ATP in vezavo na mikrotubul, rep pa veže tovor (tu sta lahki verigi, ki uravnavata ATP-azno aktivnost težke verige) to je anterogradni transport veziklov in organelov (lizosomi, mitohondriji) proti celični periferiji (npr. sinaptične vezikle iz telesa živčne celice v sinapso) sodelujejo pri ločevanju polov delitvenega vretena v anafazi napake v delovanju kinezinov se kažejo kot motnje v transportu celičnih komponent, patogenov in v celični delitvi dineini gibljejo se proti koncu, proti centrosomu razlikujemo citoplazemske in aksonemne dineine (v bičkih in migetalkah) citoplazemski dinein je sestavljen iz dveh težkih, treh vmesnih in štirih lahkiv verig težke verige z globularnimi glavami delujejo kot motor, lahke verige pa rep

22 to je retrogardni transport: v živčnih celicah prenašajo organele od sinaps proti telesu, v epitelijskih celica in fibrolastih prenašajo različne organele proti sredini celice (na ta način ohranjanjo lego GA ob centrosomu) sodelujejo pri ločevanju kromosomov med mitozo, povezani so z kinetohorjem in potiskajo kromosome proti koncu, proti centosomu Oblikovanje delitvenega vretena V S-fazi (replikacija DNA) se povroji centrosom, ločita se centriola in na vsakem prične nastajati hčerinski centriol na osnovi daljšajočih se mikrotubulov gre vsak centriol na svoj pol celice v mitozi iz njiju začnejo izhajati mikrotubuli: kinetohorni: pripenjajo se na kromosom oz. kromatido polni/polarni: v ekvatorialni ravnini pride do prekrivanja z naspronimi mikrotubuli kinezini jih potiskajo proti poloma astralni: razširjajo se proti plazemski membrani Bički in migetalke so izvihki plazmaleme, ki vključujejo mikrotubule in skribjo za gibanje evkarionskih celicah (bakterijski bički so le proteini, ki štrlijo iz membrane) razlika med bički in migetalkami je v dolžini in številu bički: dolgi do 200 m, 1-2 na celico (spermij) utripanje v valovih, gibanje mehanizem utripanja bička: glave dineinov se pomikajo proti koncu in namesto drsenja pride do upogibanja, saj so MT pari med seboj povezani z neksinom migetalke: 10 m, veliko število na celico gibanje skozi tekočino (paramecij), premikanje tekočine ali sluzi vzdolž epitelja (npr. dihalnega), udarjanje na koordiniran način osnovna zgradba: 9x2 mikrotubula mikrotubul A (13 protofilamento) in mikrotubul B (nepopoln, z A si deli stene in ima 10/11 protofilamentov) + 2 centralna mikrotubula za oblikovanje bička in migetalke je potrebno sodelovanje drugih proteinov: centralna nožnica (obdaja centralni par), radialne špice, neksini (povezujejo periferne mikrotubule), dineini (pritrjeni na tubule A notranja in zunanja dineinska ročica, med gibanjem se vežejo na tubul B sosednjega para) Mikrotubul A zaradi hidrolize ATP na glavi dineina drsi navzdol proti bazi mikrotubula B sosednje dvojice ker sta sosednja para povezana z neksini, pride tako do upogiba migetalke Kartagenerjev sindrom: negibljivost migetalk in bičkov (kronična respiratorna obolenja, negibljivost bičkov spermijev, moška neplodnost) Situs inversus je sprememba, kjer so organi v telesu nameščeni zrcalno zaradi motnje intraflagelarna transporta. IFT je gibanje/komunikacija proteinov znotraj bičkov in migetalk med aksonemo in membrano bička ali migetalke je prvi pogoj za pravilen potek celične diferenciacije.

23 Bazalno telo in centriol bazalno telo je sidrišče bičkov in migetalk in sproži nastajanje aksoneme, periferni mikrotubuli pri bičkih nastanejo iz dveh izmed trojice mikrotubulov bazalnega telesca; ima podobno zgradbo kot centriol centrioli so vedno v parih na sredini centrosoma, nameščeni pravokotno drug na drugega; njihova vloga je vzpostavitev ravnine delitvenega vretena zgradba: 9x3 mikrotubuli A, B in C, mikrotubul A je popoln z 13 protofilamenti in je z radialnimi ročicami povezan s središčem centriola, mikortubula B in C pa sta nepopolna z 10/11 protofilamenti ciliopatije so bolezni z okvaro bazalnega telesca in ali bičkov/migetalk (ciliarnih funkcij): sindrom Alström ALS, sindrom Meckel MKS ali ledvična displazija, Kartargenerjev sindrom, Intermediarni filamenti gladke, dolge, nerazvejane proteinske nitaste strukture (MT in A so kroglaste), debele 10nm (več kot MT & manj kot A), zelo odporne na mehanske pritiske so glavna mehanska opora celice so najbolj raznolika skupina citoskeleta in zelo tkivno specifični vloga: celična in tkivna integriteta, lokalizacija in delovanje organelov, usmerjanje proteinov na tarčna mesta tipi intermediarnih filamentov: tip 1 (kisli) + tip 2 (bazični/nevtralni) = keratinski filamenti (značilni za epitelije) trdi keratini so produkti epitelijskih celic: lasje, nohti mehki keratini oblikujejo citoskelet: citokeratini pri patologiji tumorske celice vsebujejo keratine od tam, kjer izhajajo, patologi uporabljajo protitelesa proti keratinom epidermolysis bullosa je bolezen zaradi poškodovanih keratinov, neodpornih na mehanske pritiske in razpadajo bule v koži, napolnjene z tekočino tip 3: vimetinski filamenti vimentin: mezenhimske celice v razvoju (matične celice) desmin: mišične celice, Z-linija kisli gliaproteini: glia celice (pomožne celice v centralnem živčevju) tip 4: nevrofilamenti (lahko, srednji in težki) v aksonih nevronov če so fosforilirani, so bolj stabilni in stabilizirajo nevron kopičenje in nepravilno sestavljanje nevrofilamentov v motoričnih nevronih vodijo do njihove izgube, mišične atrofije, paralize in tudi morebitne smrti tip 5: jedrni lamini (A, B, C) v jedru tvorijo mrežo znotraj jedra, so opora jedrni ovojnici, nanje je vezan kromatin ko so fosforilirani, so manj stabilni tip 6: nestin embrionalne matične celice centralnega živčnega sistema nastanek intermediarnih filamentov: vsi polipeptidi IF vsebujejo osrednjo paličasto domeno s 4 -vijačnicami in končno globularno domeno (vijačnice so si med seboj pri različnih IF podobne, globularna domena pa ne)

24 dva polipeptida se z osrednjo domeno -vijačnic paralelno povežeta v dimer, ki se na enem koncu končuje z karboksilnima skupinama, na nasprotnem pa z amino skupinama proteinov dva dimera se antiparalelno povežeta v tetramer ni več polaren (karboksi konec enega dimera je skupaj z amino koncem drugega) tetrameri se zaporedno povežejo v protofilamente, ti pa se povežejo v dokončno izoblikovane intermediarne filamente, ki niso polarni intermediarni filamenti so bolj odporni proti razgradnji, podenote vsebujejo informacijo za samosestavljanje brez ATP ali GTP, podenote se dodajajo na sredini filemanta pred celično delitvijo se IF razgradijo in nato v hčerinski celici spet sestavijo (nadzorovano s fosdorilacijo in defosforilacijo polipeptidnih podenot) Intermediarni filamenti fibrilarne podenote kemijsko heterogena skupina nepolarne strukture dodajanje podenot na sredini filamenta stabilne strukture majhna koncentracija podenot v citosolu Mikrotubuli/aktinski filamenti globularne podenote kemijsko sorodne podenote polarne strukture dodajanje podenot na koncu filamenta dinamična nestabilnost filamentov veliko podenot v citosolu Mitohondrij Zgradba dve membrani ga pregrajujeta na medmembranski prostor in notranji matriks zunanja membrana je bistveno bolj propustna, prehajajo ioni in metaboliti v obeh staneh medmembranski prostor je kemijsko podoben citoplazmi številne beljakovine porini, ki sestavljajo kanale, omogočajo tako veliko propustnost notranja membrana je najbolj neprehodna membrana v celici veliko več proteinov kot v normalni membrani (3:1 namesto 1:1) je iz fosfolipida kardiolipina, ki ima 4 maščobne kisline veliko hidrofilno področje - je manj propusten zelo je nagubana in se izteza v matriks tu poteka dihalna veriga v matriksu so encimi Krebsovega vikla in sestavine za sintezo lastnih beljakovin Metabolni procesi v mitohondriju acetil koencim A je gorivo za oksidativne reakcije: lahko nastane pri razgradnji OH (razgradnja glukoze pri procesu glikolize) ali pa razgradnji maščobnih kislin (betaoksidacija maščobnih kislin pri presnovi lipidov) krebsov/citratni cikel v matriksu mitohondrija: vstopi acetil CoA, se združi z oksalacetatom (4 C-atomi) in nastane citrat (6 C-atomov) poteka oksidacija dehidrogenacija, ko se hidridni ioni (H + in 2e - ) z nosilci NAD + in FAD odstranijo iz molekul

25 dihalna veriga v notranji membrani mitohondrija: tu se elektroni, ki jih prenašalca NADH in FADH2 prineseta iz krebsovega cikla, prenesejo na kisik in nastane H2O prenos elektronov poteka prek vrste kompleksov z vedno večjo afiniteto za elektrone do kisika, čigar afiniteta je največja (NADH: kompleksi 1, 3 in 4; FADH2: kompleksi 2, 3 in 4) daje energijo za transport protonov z matriksa v medmembranski prostor, pri čemer se koncentracija H + v matriksu zmanjša ob membrani se vzpostavi koncentracijski gradient, zaradi česar se protoni lahko prenesejo nazaj v matriks le skozi proteinske kanale, ATPsintaze (F-črpalke), kjer prehajanje protonov v smeri konc. gradienta poganja sintezo ATP krebsov cikel in dihalna veriga sta skupaj oksidativna fosforilacija, energija, ki se sprosti pri oksidaciji (prenoso elektronov na kisik), se porabi za fosforilacijo ADP v ATP Transport proteinov v mitohondrij večino proteinov za mitohondrij se sintetizira v citosolu in morajo prehajati v mitohondij kompleks TOM v zunanji membrani in kompleksa TIM 22 in TIM 23 v notranji mitohondrijski membrani sodelujejo pri prenosu 1. Prenos proteinov v matriks Protein se s sporočilnim zaporedjem pritrdi na TOM, ki ga prenese do notranje membrane, kjer se pritrdi na TIM 23 in oba kompleksa oblikujeta kanal, skozi katerega preide v matriks (takrat se mu odcepi sporočilo zaporedje) 2. Prenos proteinov v notranjo membrano Vgraditev v notranjo membrano omogočajo proteinski kompleksi OXA in TIM Prenos porinov v zunanju membrano TOM prenese porin v medmembranski prostor, kjer ga kompleks SAM vključi v zunanjo membrano in oblikuje poro Dedni material in izvor mitohondrijev Ker so mitohondriji podobni prokariontom in imajo dve membrani, predvidevajo, da so nastali s simbiozo prokariontske celice z evkariontsko celico endosimbionska hipoteza, kar je potrdila analiza DNA. Mitohondrijska DNA kodira le 13 proteinov, ki sodelujejo pri oksidativni fosforilaciji. Sintetizirajo se na ribosomih v matriksu. Spreminjanje mitohondrijske DNA, ker nima popravljalnih mehanizmov in histonov in se hitreje spreminja, omogoča študiranje zelo oddaljenih sorodstvenih zvez. Delitev mitohondrijev je delno neodvisna od delitve celice, deli se glede na potrebo celice po ATP. Peroksisomi organeli s premerom 0,1-1 m, obdani z enojno membrano in navzoči v vseh evkariontskih celicah, ki vsebujejo številne encime pomembni so pri oblikovanju in porazdelitvi organelov v celici (prehajanje metabolitov in encimov skozi proteine v membrani peroksisoma) podvajajo se z razdelitvijo prej obstoječega peroksisoma, ko ta doseže določeno velikost

26 Naloge peroksisomov V peroksisomih nastaja vodikov peroksid H2O2, s katerim se razgrajujajo toksične molekule npr. etanol odvečen H2O2 je toksičen, saj lahko oksidira elemente membrane peroksisoma, zato se razgradi z encimom katalazo nastaneta kisik in voda -oksidacija maščobnih kislin, kjer nastaja acetil CoA oksidacija razgradnja sečnine, aminokislin biosinteza lipidov katalizacija začetnih reakcij nastajanja plazmalogenov (najpogostejši fosfolipidi v mielinu) sinteza holesterola in dolihola (redek transmembranski protein) nastanek žolčnih kislin v jetrnih celicah Biogeneza peroksisomov vezikli s prenašalnimi proteini peroksini nastanejo iz dela ER in prenašajo nove peroksisomske proteine iz citosola v peroksisom (proteine prenašajo v nerazviti konfromaciji) Zellwergerjev sindrom je mutacija peroksinov, zaradi česar v peroksisomih ni encimov smrt v zgodnjem otroštvu signalno zaporedje Ser-Lys-Leu na karboksilnem koncu proteina je periksomsko sporočilno zaporedje PTS 1, ki usmerja v peroksisome večino proteinov (PTS 2 je zaporedje iz 9 AK na amino koncu proteina in usmerja manj proteinov) receptorji za PTS 1 in 2 krožijo med citosolom in peroksisomsko membrano in proteine prenesejo do translokacijskega kompleksa v membrani pri translokaciji se signalno zaporedje ne odcepi pri adrenolevkodistrofiji ALD manja en peroksisomski encim, ki oksidira določene maščobne kisline pri boleznih lahko manjkajo signalna zaporedja na proteinih in se ti ne prenašajo v peroksisome Znotrajcelični vezikularni transport Usmerjanje in razvrščanje proteinov sinteza proteinov se začne na citosolu in se nadaljuje na ribosomih ER, nato potujejo proteini v GA pred razporeditvijo na končen lokacije (lahko pa se polipeptid dokonča že v citosolu) če se polipeptid dokonča že v citosolu, se prenaša na mitohondrije, peroksisome, v jedro ali pa ostane v citosolu; sistem razporejanja temelji na signalnih zaporedjih na proteinih in njihovih specifičnih receptorjih v membranah organelov (pri vstopi v jedru signalna zaporedja ostanejo na polipeptidu) proteini iz ER potujejo v GA, lizosom, plazmalemo ali iz celic (sintetsko sekrecijska pot), imajo na aminokoncu (začetku polipeptida) specifično signalno zaporedje iz 6-12 hidrofobnih AK, ki se odstrani, ko protein vstopi v ciljni lumen Vezikularni transport membranski mešički vezikli brstijo iz doborskih membran in se zlivajo z akceptorskimi tarčnimi membranami pomembno je, da se zlivajo ustrezni vezikli imajo na citorolni strani membran v proteinskem plašču molekule s sporočili, ki zagotovijo specifiko zlivanja vezikli se formirajo s pomočjo plaščnih proteinov, ki pomagajo pri vlečenju membrane, plaščni proteini selektivno vnašajo in kopičijo molekule znotraj vezikla

27 pri odcepljanju se ohranja originalna orientacija proteinov in fosfolipidov lumenska stran je vedno na strani lumna glede na vrsto proteinov v plašču mešička ločimo več vrst plaščnih mešičkov; klatrinski in koatomerni mešički: COP 1 in COP 2 Klatrinski vezikli oblikujejo jih proteini klatrini delujejo selektivno pri transportu iz transgolgijevega mrežja v lizosome sodelujejo pri prenosu od plazemaleme do zgodnjih endosomov za nastanek morajo biti prisotni klatrini, adaptini (izbirajo receptroske molekule), G-protein, dinamin (pomaga pri odščipljanju) in receptorske molekule specifičnost klatrin je fibrilarni protein v obliki treh ročic, v njem so tri težke in tri lahke verige ko se na adapterje na membrani vežejo klatrini, se membrana začne upogibati in nastane pokrita jamica, nato brst, po odcepu pa vezikel ko se odcepi, plašč klatrina odpade in ostane le membrana, znotraj katere so proteini premer m sodelujejo pri vnosu holesterola v celico Koatomerni vezikli selektivni in neselektivni vezikularni transport plašč sestavlja 7 COP-proteinov, za njegovo oblikovanje je potreben ATP plašč je odvisen od GTP vezavnih proteinov, ki se preklapljajo med aktivnim in neaktivnim stanjem, kar nadzorujeta proteina GEF (GDPGTP) in GAP (GTPGDP) proteini ARF so GTP-aze, ki urejajo COP 1 plašče in klatrinske plašče na GA (COP 2 plašče urejajo proteini Sar 1 na ER) COP 1: transport veziklov iz cisgolgijevega mrežja na ER in transport med cisternami GA COP 2: transport iz ER na GA nastanek COP 2 plašča: GEF se poveže s citosolnim proteinom Sar 1 in ta sprosti GDP in veže GTP ter se vgradi v lipidni dvosloj rekrutira plaščne proteine na membrano in začne se brstenje razstavljanje koatomernega plašča: ko koatomerni vezikel dosteže tarčno membrani protein GAP povzroči, da se GTP, vezan s proteinom ARF, hidrolizira v GDP. Arf se zato sprosti z membrane in skupaj z njim preostali proteini plašča Sidranje in zlivanje mešičkov Tri koraki: vzpostavitev kompleksa SNARE, pri čemer sodelujejo Rab GTP-aze, zlitje membran in nato razgradnja kompleksa SNARE ob pomoči proteinov NSF/SNAP. Sidranje mešičkov faza identifikacije: preverjanje donorske in akceptorske membrane (donorska membrana mora pogosto skozi citoskelet, posebno, če se zliva z plazmalemo) zlitje se vedno zgodi po depolimerizaciji plašča

28 pod proteinskim plaščom so integralni proteini v-snare, ki omogočijo vezavo veziklov s pravo membrano, ki nosi specifične proteine t-snare sodelujejo tudi proteini Rab iz skupine Ras proteini kompleksa NSF/SNAP se zbirajo med nastankom kompleksa v-snare + t- SNARE njihova naloga je razdružitev kompleksa SNARE, kar omogoči reciklacijo teh proteinov Zlivanje membran mešičkov povečanje koncentracije Ca + na mestu zlitja porušitev zgradbe membranskega dvosloja na mestu zlitja in vzpostavitev kratkotrajne ureditve membranskih lipidov dvosloj se preoblikuje v micelno in invertno oblikovano membransko strukturo tako se oblikujejo začasne pore, skozi katere se vzpostavi stik med lumnoma mutacije, ki spremenijo zdradbo proteinov, se odražajo v številnih boleznih, motnjah transportiranja produktov v celicah (hipopigmentacije, motnje imunskega odziva, nevrološke abnormalnosti) Endoplazemski retikulum Endomembrane evkariontske celice: jedrna membrana, ER, vezikli, GA Tu poteka sinteza proteinov, gubanje, glikozilacija in oblikovanje disulfidnih vezi med AK ostanki. Produkti se nato prenašajo v GA. Zgradba ER sistem cevi in sploščenih vreč v citosolu, večina vseh membran v celici lumen ER obsega 10% volumna celice Zrnati endoplazemski retikulum na površini so ribosomi, nastajajo proteini sinteza vodotopnih proteinov (sekrecijskih in lumenskih) sinteza membranskih lipidov glicerolipidov in transmembranskih proteinov za ER, GA, lizosome, endosome, sekrecijske vezike in plazmalemo sinteza membranskih lipidov za mitohondrije in peroksisome Gladki ER prevladujoč v celicah, ki sintetizirajo steroidne hormone iz holesterola (določene endokrine celice) v hepatocitih sintetizira lipidne komponente lipoproteinov, razgrajuje strupe (detoksifikacija škodljivih učinkovin, nastalih v jetrih (Citokrom P450) v mišičnih celicah omogoči skladiščenje Ca + Signalna hipoteza Posttranslacijski transport proteinov = proteini se dokončno sintetizirajo v citosolu, nato pa preidejo v jedro, mitohondrij, kloroplast ali peroksisom

29 Kotranslacijski transport proteinov = dokončna sinteza na ER, transport v GA in od tam v lizosome, plazmalemo ali v sekrecijo Kotranslacijski transport 1. Za prenos na ER mora biti na amino koncu polipeptida signalno zaporedje (20 AK) 2. Na signalno zaporedje in aminoacilno mesto na ribosomu se veže ribonukleproteinski delec SRP in tako začasno ustavi sintezo 3. Kompleks SRP, ribosom in polipeptid se prenesejo na membrano ER na receptor za SRP, ki je ob translokacijskem kanalu 4. Receptor prepozna SRP in kompleks se namesti ob translokator 5. SRP se odcepi, ribosom se veže na translokacijski kompleks, ki oblikuje kanal in signalna sekvenca se usmeri vanj 6. Polipeptid se prenese v kanal, ki ga sestavljajo proteini Sec61 in sinteza se nadaljuje 7. Signalna sekvenca se po določenem času odcepi, polipeptid pa se po dokončani sintezi sprosti v lumen ER Posttranslokacijski transport v ER Majhno število proteinov se v ER usmeri posttranslacijsko. Signalno zaporedje pozna receptor Sec62/63, povezan z transmembranskim kanalom Sec61. Citosolni šaperoni ohranjanjo polipeptid razvit, šaperoni v lumnu ER, Bip-proteini, pa povlečejo polipeptid skozi kanal. ER-transmembranski proteini ER sintetizira proteine, ki so vgrajeni v plazmalemo, membrano ER-a, GA-ja ali lizosomov. Ti proteini ostanejo med sintezo in po sintezi vgrajeni v membrano ER-a in se prenašajo do cilja kot sestavine membrane. V membrano so vgrajeni s hidrofobnimi zaporedji, stop signalnimi zaporedji skozi membrano se raztezajo tolikokrat, kot je stop signalnih zaporedij orientacija proteinov (na kateri strani je COOH in na kateri NH2 konec) je določena že pred prenosom v ER vgraditev proteina v membrano ER z COOH koncem proti citosolu: ko stop signalno zaporedje pri sintezi proteina dospe do kanala Sec61, ustavi prehajanje proteina skozi membrano signalno zaporedje se odcepi in v lumnu se izpostavi NH2 konec polipeptida protein se umakne iz kanala in se z stop signalnim zaporedjem vgradi v membrano ER nadaljnja sinteza poteka samo na citosolni strani orientacijo proteinov lahko določa tudi posebno notranje signalno zaporedje, ki deluje kot transmembranska -vijačnica proteini, ki se skozi membrano raztezajo večkrat, imajo več notranjih signalnih zaporedij, ki se izmenjujejo s stop signalnimi zaporedji

30 notranje signalno zaporedje določi vgraditev polipeptidne verige z amino koncem na citosolni strani polipeptid prehaja skozi kanal, dokler ne pride do stop signalnega zaporedja, ki zapre signal in sinteza se nadaljuje na citosolni strani naslednje notranje signalno zaporedje zopet odpre kanal itd. Zvijanje proteinov v funkcionalno konformacijo V lumnu ER se proteini zvijejo v pravilno 3D konformacijo, sestavljajo iz večih enot, oblikujejo se disulfidni mostički in začne se glikozilacija (dodajanje sladkornih preostankov na sintetizirane osnove). proteini Bip zvijejo polipeptidno verigo če jih zvijejo nepravilno ali pa so proteini narobe sestavljeni, se skupaj z Bip proteinom razgradijo v proteasomih v ER je okolje oksidirajoče in pospešuje nastanek disulfidnih vezi med stranskimi verigami aminokislinskih cisteinskih ostankov pomembno pri sekrecijskih proteinih. Nastanek vezi katalizira encim disulfidna izomeraza. med translacijo se na aminokislinske asperaginske preostanke vežejo sladkorji oligosaharid iz 14 sladkorjev (oligosaharide sintetizira lipid dolihol fosfat, uridran v membrano ER). Encim oligosaharil tranferaza prenese oligosaharid na NH2 skupino asparagina = N-vezana glikozilacija. Pri tem se odcepijo 3 glukoze in ena manoza, glikozilirani proteini pa se prenesejo v Golgijev aparat in tam nadaljnje glikozilirajo naloga N-vezanih glikozilacij je, da se produkti pravilno gubajo, zato mora biti sladkor pravilno pripet na protein šaperonska proteina kalneksin in kalretikulin (lektina) se vežeta na oligosaharide in preprečujeta, da bi se povezali v agregate, na oligosaharidu sta vezana, dokler se ne odcepi zadnja glukoza in protein zapusti ER (poleg tega zagotavljata tudi oblikovanje disulfidnih vezi in pravilno zvijajo) encim glikozil transferaza vnovič dodaja molekule glukoze na oligosaharide, ki so pripete na še nedokončno nahubane proteine in tako proteini prehajajo skozi cikluse odvzemanja glukoz z glukozidazami in dodajanja z glikozil transferazami 80% molekul se ne naguba pravilno in ti se prenesejo v citosol v procesu retrotranslokacije, tam se deglikozirajo, ubikvitilinirajo (vežejo se molekule ubikvitini in molekulo tako označijo za razgradnjo) in se razgradijo v proteosomu (encimski kompleks za proteolitično razgradnjo) Motnje v delovanju ER in s tem povezane bolezni ER nadzoruje kakovost ceičnih produktov in ti se kopičijo v ER, kar je stresno za celico, če je to zaradi mutacij, ki jih ne more popraviti bolezni kopičenja ER ERSD, ki so zelo raznolike Cistična fibroza mutacija gena za kloridni ionski kanal, moten je transport CFTR proteina, ki ta kanal sestavlja, od ER do apikalne membrane mutacija v genu za 1-antitripsin povzroči njegovo pomanjkanje, ker se kopiči v jetrih njegova odsotnost povzroči povečano aktivnost proteaz emfemizen, hepatopatija ali prizadetost kože kongenitalni hipotiroidizem in golša sta posledici pomankanja tiroglobulina (avtosomno recesivna genska motnja), ki se kopiči v lumnu foliklov ščitnice kot zaloga tiroidnih hormonov če pa je gen mutiran, se namesto tega kopiči v ER in zato pomanjkuje tiroidnih hormonov v krvi nekatere bolezni so povezane tudi samo s stresom zaradi kopičenja: Alzheimerjeva bolezen, Parkinsova bolezen, amiotropična lateralna skleroza Gladki ER - kopičenje kalcija in razstrupljanje AER je v večini celic slabo razvit.

31 v celici spolnih žlez je intenziven metabilizem lipidov, sintetizirajo se steroidni hormoni iz holesterola v hepatocitih encimi v AER sintetizirajo lipidne komponente lipoproteinskih delcev, in encimi, ki detoksificirajo različne škodljive metabolite (encimi Citokrom P450 v vodi netopne snovi spremenijo v topne, da se lahko izločijo z urinom) proteini v lumnu mišičnega AER imajo visoko afiniteto do Ca +, imenuje se sarkoplazemski retikulum in ob pomoči Ca-ATPaze črpa Ca + iz citosola skladiščenje Ca + Sinteza lipidov v membrani ER nastaja večina lipidov za membrane, vključno z fosfolipidi in holesterolom encimi imajo aktivna mesta na citosolni strani, kjer so metaboliti novi fosfolipidi nato prehajajo v ER s translokatorji fosfolipidov skramblaze, ki zagotavljajo enakomerno razporeditev različnih fosfolipidov v obeh slojih membrane v ER se sintetizirata ceramid (v GA deluje kot prekurzor za sintezo sfingomielina in glikolipidov) in holesterol plazmalema in membrane GA, lizosomov in endosomov se z ER sporazumevajo preko veziklov mitohondriji in peroksisomi imajo drugačen sistem za vnos proteinov in lipidov: netopni fosfolipidi potujejo ob pomoči prenašačnih proteinov encimov za izmenjavo fosfolipidov (specifično vežejo fosfolipid v ER in ga prenesejo do mitohondrija/peroksisoma in ga tam vgradijo v njegovo membrano) Golgijev aparat Poglavitno mesto dodajanja oligosaharidov na proteine in lipide v celici in za razvrščanje in razporejanje veziklov iz ER. Tu nastajajo oligosaharidi in glikozaminoalkani medceličnine. Med celično delitvijo se razstavi na vezikle in se potem zopet sestavi. Zgradba in vloga GA Leži blizu jedra, gradi ga 4 do 6 sploščenih cistern, naloženih v skladovnico, med sabo povezani s cevmi. Vstopni del se imenuje cis del, izstopni pa trans (cis mrežje, cis cisterna, medialna cisterna, trans cisterna, trans mrežje) Glikozilacija oligosaharidne enote se preko aminokislinskih preostankov pripenjajo na polipeptid (preko dušika: -N glikolizacija ali preko kisika: -O glikolizacija) glikolizirani proteini z N-vezanim oligosaharidom iz ER se v GA dodatno modificirajo in nastanejo ali kompleksni oligosaharidi ali pa visoko manozni oligosaharidi (N-vezani), ki so vezani na proteine pri kompleksnih oligosaharidih se odstranijo monosaharidi z N-vezanega oligosaharida in se doda različno število npr. N-acetilglukozaminov, galaktoze, sialične kisline, fruktore visoko manoznim oligosaharidom se ne dodajo novi sladkorji in vsebujejo dva N- acetilglukozamina in manoze, dodane že v ER od lege na proteinu je odvisno, ali bo oligosaharid kompleksen ali visoko manozen: če je dostopen za encime, bo verjetno postal kompleksen oligosaharid dodajajo se tudi sladkorji na OH skupino serina ali treonina in nastajajo O-vezani glikoproteini za to so zadolženi encimi glikoil transferaze, ki dodajajo en sladkor naenkrat (najprej navadno N-aterilgalaktozamin) najmočneje so glikozilirani proteoglikani, ki se po glikozilaciji še sulfatirajo in so negativno nabiti

32 Transporti v Golgijevem aparatu V vsakem predelku GA so specifični encimi, ki proteine postopoma modificirajo. A. cis mrežje: sortiranje in fosforilacija oligosaharidov na lizosomskih proteinih B. cis cisterne: odstranjevanje manoz C. mediana cisterne: odstranjevanje manoz D. trans cisterne: dokončna glikozilacija proteinov z terminalnimi sladkorji (npr. galaktoza ali sialična kislina) E. trans mrežje: sortirni center, produkti se razvrščajo v lizosome, sekrecijske vezikle ali v plazmalemo Kako GA doseže polariziranost in kako molekule prehajajo med cisternami? model vezikularnega transporta: GA je statičen, encimi so na stalnih mestih, produkti se med cisternami prenašajo v veziklih model zorenja cistem: GA je dinamičen, cisterne se premikajo prek skladovnice v smeri cistrans, rezidentni proteini se vračajo v COP1 proteinih v predhodno cisterno v smeri transcis mikrotubuli in citosolni golgijevi matriksni proteini oblikujejo ogreodje med cisternami in dajejo GA strukturno integriteto proteini oblikujejo dolge niti in zadržujejo vezikle ob organelu tri načini izhoda iz GA: proteini, ki ne potrebujejo nobenega signala (enaka koncentracija v veziklu in v trans mrežju) konstitutivna sekrecija regulirana sekrecija: receptroji ujamejo proteine in jih zberejo v veziklu z povečano koncentracijo in se skupaj z veziklom izločijo po ustreznem signalu zbiranje lizosomskih proteinov: po signalu protein ujame receptor in odbajo se s klatrinskim plaščem Druge vloge GA sinteza proteoglikanov: sinteza GAG in njihovo dodajanje na proteine preko ksilozne vezi sulfatacije molekul, ki potujejo skozenj proteoglikani dobijo negativen naboj fosforilacije molekul, za kar je potrebna ATP, ki se vnaša v lumen GA in ga uporabijo rezidntne kinaze (npr. fosforilacija apolipoprotein, ki gradi molekulo VLDL krvni serum) Bolezni, povezane z GA Zvišanje T, sprememba ph, premalo ATP in strupi (metabolit gliv Brefeldin) začasno porušijo zgradbo in delovanja, vsaka sprememba vpliva na procese v GA in posledično na delovanje celice. Lizosomi Kroglasti organeli z encimi za razgradnjo celici lastnih molekul in molekul, sprejetih z endocitozo. Celice laho razgrajene snovi porabi kot gorivo v mitohondriju ali pa za graditev novih celičnih struktur. Snovi, ki jih ne more razgraditi, se kopičijo v lizosomih. Več takoh snovi je v starejših celicah starejših organizmov s starostjo postajajo lizosomski encimi manj dejavni. Nastanek in molekularna zgradba več kot 40 vrst hidrolitičnih encimov: proteaze, nukleaze, glikozidaze, fosfataze in sulfataze encimi so kisle hidrolaze, ki prekinjajo kemijske vezi v reakcijah ob nazvočnosti vode in imajo optimalni ph v kislem območju membrana lizosoma je pred lastnimi encimi zavarovana z intenzivno glikozilacijo na lumenski strani

33 lizosom kisli ph uravnava z protonske črpalke, ki ob uporabi ATP vanj črpajo protone (V-črpalke - v vseh organelih s kislo notranjostjo) v membrani je veliko prenašalnih molekul, ki prenašajo razgrajene produkte v citosol 0,2-0,5 m kisle hidrolaze sinetizira ER imajo poseben označevalec manoza-6-fosfat M6P, ki se dodaja v cis golgijevem mrežju in v trans mrežju ga prepoznajo M6P receptorski proteini in jih spravijo v klatrinske vezikle klatrinski vezikli se nato zlijejo z zgodnjimi endosomi, kjer se receptorji zaradi ph ločijo od encimov in vrnejo v GA Avtofagija organeli, namenjeni razgradnji, se ločijo od citoplazme z dvojno membrano, imenovano fagofor, in nastane avtofagna vakuola avtofagna vakuola se zlije u lizosomom (in lahko tudi z endosomom) in nastanejo vakuole, imenovane amfisomi, nato se vsebina razgradi nekatere bakterije vstopajo v celico in se hranijo z vsebinami anfisomov tako, da preprečijo združitev avtofagne vakuole z lizosomom (Mycobacterium tuberculosis tuberkoloza) druge so postale odporne proti kislemu okolju in lizosomskim encimov (Coxiella burneti Q mrzlica) bakterije Listeria monocytogenes (meningitis) sintetizirajo encim fosfolipazo, s katerim poškodujejo membrano lizosoma in prodrejo v citosol Lizosomske bolezni bolezen vključkov: ugotovili so, da je M6P pomembna za prehajanje encimov v lizosome, saj pri teh bolnikih encimi nimajo M6P in se namesto v lizosome izločajo iz elice (manjka encim, ki v cis mrežju fosforilira manozne preostanke) lizosomi so nefunkcionalni pri večini bolezni so odsotni ali pa nedelujoči nekateri encimi, zaradi česar se določene makromolekule akumulirajo v lizosomu (npr. Tay-Sachsova bolezen, kjer encim, ki razgrajuje pomembno sestavino membran možganskih celic G12, ne deluje ali pa Pompova bolezen, kjer je odsoten encim -glkozidaza in nerazgrajen glikogen se nabira v lizosomih) Gaucherjeva bolezen bolezen kopičenja: prirojeno pomanjanje encima glukocerebrozidaze, zaradi česar se povečajo in namnožijo lizosomi in celica propade. Pogosta je v določenih judovskih populacijah. Poznamo 3 tipe: bolezen se lahko izrazi samo v vranici, jetrih in kostnem tkivu, lahko pa so tudi nevrološki simptomi, demenca, spastičnost in pri tipu 3 nevrološke težave že v razvoju ter zgodnja smrt. glukocerebrozidaza glukocerebrozid razgraja v glukozo in ceramid odkrivajo vedno nove mutacije, ki jo povzročajo, in glede na mutacijo je mogoče določiti resnost možno jo je zdraviti z nadomeščanjem manjkajočega encima Sekrecija in endocitoza Eksocitoza Sekrecijska pot transportni vezikli, sestavljeni iz sestavin plazmaleme, nosijo topne proteine do plazmaleme in se tam z njo zlijejo. Konstitutivna in regulirana sekrecija konstitutivna sekrecija je sprotna in neselektivna

34 pri regulirani sekreciji se zlitje z membrano zgodi šele po ustreznem sporočilu (npr. hormoni, ki se vežejo na receptorje v plazmalemi) Primer: aktiviran receptor sproži začasno povečanje koncentracije ionov Ca + v citosolu, ti se vežejo na molekule v citosolu in sprožijo eksocitozo sinaptičnih veziklov živčna celica Usmerjanje produktov iz trans golgijevega mrežja produkti se usmerjajo v tri smeri: v lizosome, sekrecijske vezikle in na plazmalemo samo specializirane celice tvorijo sekrecijska zrna s klatrinskimi vezikli v polariziranih celicah obstajajo posebna razvrstilna sporočila, ki omogočijo usmeritev proteina na pravi del membrane direktno ali indirektno (prek endosoma) pomembno je, da se ohranja enaka površina membrane, torej da sta eksocitoza in endocitoza enako hitri endocitotsko-eksocitotski cikel Bolezni, povezane z motnjami eksocitoze posledice mutacij genov za proteine, vključene v premikanje in tarčenje veziklov toksin tetanus in botulinum toksin razgrajujeta proteine kompleksa, ki posreduje zlitje z tarčno membrano Endocitoza Celica sprejema snovi s pomočjo endocitoze. Ločimo dva načina, fagocitozo in pinocitozo, ki se razlikujeta po velikosti sprejetih snovi. Fagocitoza sprejem večjih delcev, mikroorganizmov, odmrlih celic preko fagosomov s premerom 250nm izvajajo jo specializirane celice fagocite: makrofagi (odstranjujejo stare in apoptotske celice), nevtrofilci (krvne celice vnetna reakcija) in dendritske celice (fagocitirajo mikroorganizme varujejo pred poškodbami) fagocitoza se prične z vezavo mikroorganizmov na receptorje, nastajati začnejo psevdopodiji, ki mikroorganizem obdajo in oblikuje se fagosom, ki se združi z lizosomom neprebavljene snovi ostanejo v lizosomih in ti postanejo rezidualna telesa sprožilci so lahko npr. protitelesa, ki se vežejo na mikroorganizme in jih prepoznajo Fcreceptorji na plazmolalemi; lahko so oligosaharidi na površini organizmov ali fosfatidilserin, ki pri apoptotskih celicah preide na zunajcelično stran lipidnega dvosloja Pinocitoza sprejem tekočine s topljencem z majhnimi pinocitotskimi vezikli velikosti 100nm uvihani deli plazmaleme, plaščne jamice (prekrite z klatrinom), se hitro odcepijo in oblikujejo plaščne vezikle, odvržejo plašč in se zlijejo z zgodnjimi endosomi globoke ugreznitve plazmaleme kaveole (bogate s holesterolom, glikolipidi in strukturnim proteinom kaveolinom) se odcepljajo od apikalne membrane in prenesejo tovor do endosomov ali bazolateralne membrane (polarizirane celice) Receptorska endocitoza sprejem specifičnih molekul iz okolja makromolekule se vežejo na receptorje in nato vstopajo v celico tako v celico prehaja holesterol (če je sprejem zavrt, pripomore k nastanku atersklerotičnih plakov ob stenah žil) holesterol je hidrofoben, v celico vstopa v lipoproteinskem kompleksu LDL jedro iz 1500 holesterolnih molekul z verigami maščobnih kislin, obdan z enojnim slojem lipidov iz 800 fosfolipidov iz 500 molekul holesterola in proteinom apoproteinom, ki ohranja strukturo delca in omogoča vezavo na LDL-receptor

35 plaščne jamice se oblikujejo po vezavi LDL na receptor, čemur sledi vezava adaptina in klatrina (s citosolne strani) na isti receptor. Jamice se oblikujejo zaradi klatrinskih molekul. LDL se v klatrinskih veziklih hitro odcepljajo od membrane in se po razgradnji klatrinskega plašča prenesejo do zgodnjih endosomov, kjer se zaradi nizke ph ločijo od receptorjev (ti potujejo nazaj na plazmalemo) preko poznih endosomov se prenesejo do lizosomov, kjer se LDL razgradi v prosti holesterol in preide v citosol če je holesterola preveč, celica preneha sintezo LDL-receptorjev znanih je več kot 25 vrst receptorjev za receptorsko endocitozo na citosolni domeni imajo različne signalni peptide za različne adaptine endosomski kompartmenti celice so v obliki heterogenih cevi od plazmaleme do jedra, blizu GA zgodnji in pozni endosomi se razlikujejo po sestavi proteinov, povezujejo se z različnimi proteini Rab in imajo različno ph (v zgodnjem 6,5, v poznem 5 aktivacija hidrolitičnih encimov) zgodnji endosomi so sortirna postaja; zaradi ph receptorji sprostijo ligande in ti se razgradijo v lizosomih, receptorji pa se ali vrnejo v plazmalemo ali razgradijo ali pa so vključeni v transcitozo receptorji za transferin (protein, ki v krvi prenaša železo) v endosomu sprostijo železo in ostanejo vezani na transferin ter se skupaj z njim vračajo na plazmalemo receptorji za epidermalni rastni faktor EGF se zberejo v klatrinski jamici le ob vezavi EGF in po endocitozi se razgradijo v lizosomu skupaj z EGF kako endocitirane molekule potujejo od zgodnjega k poznemu endosomu? zgodnji endosom potuje ob mikrotubulih proti notranjosti celice in vrača material nazaj v plazmalemo, vključuje veliko uvihane membrane in veziklov multivezikularna telesa ni jasno, ali se multivezikularna telesa združijo z poznimi endosomi ali med seboj in oblikujejo pozni endosom pozni endosom se po razgradji substrata preimenuje v lizosom bolezni: družinska hiperholestermija, genetska bolezen, kjer mutirani receptor gena LDL ne vnaša dovolj holesterola v celico Transcitoza prenašanje specifičnih molekul skozi celico iz enega zunajceličnega prostora v drugega prenos protiteles iz črevesja v kri pri novorojenčkih: v kislem ph črevesja se protitelesa vežejo na Fc-receptorje. Ti endocitirajo protitelesa in jih prek zgodnjih endosomov, od koder se kompleksi odcepljajo celi, prenesejo na bazolateralno plazmalemo, kjer se zaradi nevtralnega ph v ekstracelularni tekočini protitelesa odcepijo in preidejo v krvni obtok Vstop patogenov v celico patogene bakterije morajo za uspešno okužbo prodreti do celice in se pritrditi na primerno mesto, kjer se lahko razmnožujejo, se izogniti obrembnemu sistemu in biti sposobne celico tudi zapustiti za prenos okužbe naprej Pritrjevanje na celico vstopno mesto je pogosto epitel sluznic, ki ima plast sluzi in migetalke, ki odstranjujejo bakterije prilagojene bakterije se z proteini adhezini trdno povezejo z glikolipidi na plazmalemi celice (uropatagena E. coli vnetje sečnega mehurja) ali pa v plazmalemo vgradijo receptorski protein Tir za bakterijski membranski protein intimin, ki ob vezavi sproži fosforilacijo receptorja, vezavo Rho GTP-az in te povzročijo rast aktinskih filamentov, ki povezavo utrdijo (enteropatogena E.coli diareja pri otrocih) nekatere bakterije izločajo toksine, ki preprečujejo delovanje migetalk

36 intracelularni patogeni: bakterije, ki se prehranjujejo in razmnožujejo znotraj evkariontskih celic. Celična notranjost jih ščiti pred protitelesi in imunskimi celicami. Vstop v celico bakterije vstopajo s fagocitozo fagocitirajo pa predvsem makrofagi, specializirani za razgrajanje bakterij bakterije so se prilagodile preživetju v makrofagih vstopajo tudi v neprofesionalne fagocite, tako da se s specifičnimi proteini pritrdijo na proteine celice, s katerimi bi se ta navadno povezovala z drugimi celicami (kadherini ali integrini) in tvorijo celični stik. Celica nato celični stik obda z izvihki plazmaleme in v notranjost prenese patogeno bakterijo. Preživetje v celici (v endosomu) bakterija se lahko izogne endocitotskemu sistemu in prepreči združitev z lizosomom: zapusti endosom, preden se ph zniža lysteria monocitogenes (smrtna zastrupitev z hrano) izloča protein listeriolizin, ki naredi pore v fagosomski membrani in bakterija se izrine v citosol rikecije izločijo lipazo D in hemolizin C, ki razgradita membrano fagosoma mikobakterija tuberkulozis preprečijo zlivanje endosoma z lizosomom in preživijo v endosomu nekatere bakterije lahko preživijo celo v fagolizosomu poseben primer: Legionela pneumofila povzroči nastanek mikrovila na plazmalemi celice, ki se ovije okoli bakterije in jo endocitira, nato se bakterija z membrano ovita naseli v bližini ER in ne vstopi v lizosom Klamidija se naseli v veziklih ob endocitotski poti Gibanje po celici uporabljajo citoskelet gostiteljice veliko jih uporablja aktinske filamente, tako da inducirajo rast na enem polu aktina, kar jih potisne s hitrostjo 1 m/s (npr. listerija, šigela, rikecije) aktinski filamenti pri potujoči bakterijski celici izgledajo kot rep kometa, in ko se približajo plazmalemi, nastane izrastek z bakterijo na vrhu, ki jo potisne v sosednjo celico rast aktinskih filamentov ob bakteriji omogoča sistem ARP, ki organizira začetek vsakega aktinskega filamenta bakterije Wolbavhija uporabljajo mikrotubule in se med mitozo razporejajo s pomočjo delitvenega vretena

37 Celično jedro Je prostor, omejen z dvojno membrano z jedrnimi porami. V njem se nahaja DNA. Je razdelek namenjen hranjenju informacije, zato mora biti strogo omejen od preostalega dela citoplazme. Jedrna ovojnica predstavlja strogo regulacijo dostopa do informacijo. Ob določenem času so aktivni samo določeni geni. Transkripcija proces pretvorbe informacije iz molekule DNA v molekulo RNA Translacija proces, v katerem se določeno zaporedje baz v molekuli sporočilne RNA (mrna) med sintezo beljakovine prevede v zaporedje aminokislin v polipeptidu Vloga jedra skladišče dednega materiala prostor podvojevanja DNA mesto prepisovanja DNA sinteze DNA in procesiranja urejanje ribosomalnih podenot transportno mesto Jedro je nastalo je z uvihanjem plazmaleme okoli DNA. Prednost evkariontske celice je ločitev DNA od citoplazme. Eritrociti nastanejo z denukleacijo iz eritroblasta in so brez jeder, živijo zelo kratek čas in so zelo aktivni z veliko delitvami (povečana možnost mutacije). Tudi trombociti nimajo jeder. Več jeder imajo rakava celica, hepatociti, mišične celice srca, prečno progaste mišične celice, megakariociti, kožne celice povrhnjice. Zgradba jedra vidna z zamrzovalnim lomljenjem. jedrna ovojnica o notranja in zunanja membrana, ki je fizično povezana z ER o jedrni porni kompleksi (100 nm) nukleoplazma o kromatin o eno ali več jedrc (nukleolusov) jedrna lamina (intermediarni filamenti lamini) Jedrna ovojnica uravnavanje izražanja genov signalizacija regulacija jedrnega metabolizma lipidov prekinjena s številnimi ugreznitvami invaginacijami, ki ustvarjajo nukleoplazemski retikulum, preplet, ki sega globoko v jerdo 5 nm Kromatin EVKROMATIN svetlejši del, povečano izražanje genov HETEROKROMATIN temnejši del, nahaja ob jedrni ovojnici, je spiraliziran, manj prepisno aktiven, služi utišanju genov V fazi mitoze (10% cel. cikla) se dodatno spiralizira in nastanejo kromosomi. Lokacija kromatina v jedru vpliva na izraznost genov. Kadar je gen tik ob jedrni ovojnici, je utišan. Ob

38 signalu nastanejo prepisno aktivna območja, kjer je zbranih več proteinov, nujnih za transkripcijo v mdna (DNA polimeraze 1, 2, 3). Jedrna lamina nahaja pod notranjo jedrno membrano (tu je več proteinov porezinov LAP in laminski receptorji) gradijo jo lamini (= citoskeletni elementi) in membranski proteinski receptorji funkcija: opora, stabilnost jedrne ovojnice, posredna regulacija transkripcije genov, aktivno vključevanje v regulacijo (nastajanje in razpad jedrne ovojnice z (de)fosforilizacijo), vezava heterokromatina blizu notranje jedrne ovojnice najpomembnejši receptorji: LAP 1 in LAP 2, emerin, LBR, otefin and MAN1 kaže, da lamina in lamini sodelujejo tudi pri podvojevanju DNA lamin B ima kritično vlogo pri strukturi jedra Bolezni zaradi mutacij lamine Emery-Dreisfussova mišična distrofija propadanj mišic, mutacija proteina emerina (transmembranski protein) mišično tkivo nadomešča vezivno Hutchinson-Gilfordov sindrom sindrom prezgodnjega staranja, oslabljena lamina zaradi okvarjenega gena za lamin A; izguba heterokromatina; ''jedrne kile'', mutacija se ponavlja znova in znova (ni dednen) Jedrne pore krožno, središčno nameščeni proteini, okoli na jedroo na citopl. strani citoplazemski obroč; na jedrni strani jedrni obroč iz citoplazemskega obroča izraščajo citosolne niti (fibrile), na jedrni strani pa jedrne fibrile, ki oblikujejo jedrno košaro majhne molekule prehajajo same, transport večjih (RNA, proteini) pa omogočajo importini in eksportini hiter transport 500 mol/s v obe smeri Selektivni transport proteinov Proteini, ki potujejo v jedro, imajo v svoji zgradbi jedrni lokalizacijski signal (NLS). Sestavljen je iz specifičnega zaporedja aminokislin (lizin in arginin) s terciarno obliko. Prepoznajo ga specifični receptorji importini.

39 Ran GTP-aze omogočajo prehajanje proteinov skozi jedrne pore, imajo dve konformacijski stanji: GTP (aktivni) ali GDP (neaktivni) delujejo kot stikala. V ob prehodu v citosol se Ran GTP-aze defosfolizirajo, ob vstopu v jedru pa fosfolizirajo nazaj v GTP. S sabo prinesejo importin/eksportin in ti s sabo v pravi smeri tudi protein. Gradient dveh konformacijskih stanj Ran GTP-aze je gonilna sila jedrnega transporta v določeno smer. Jedrce Jedrca so vidna le v interfazi. Njihova velikost je odvisna od njihove aktivnosti. Celice, ki sintetizirajo veliko proteinov, imajo veliko število jedrc. Zgradba Sestava: 10% jedrni proteini, 30% RNA molekule, 3% DNA. Jedrce nima ovojnice. a) zrnati predel urejanje proteinov in rrna v podenote ribosomov procesiranje pre-rna nastajanje telomeraze, ribonukleoproteinov RNP (procesirajo mrna v jedru) in delcev SRP (signal recognition particle, sodelujejo pri translaciji v cosolu) b) nitasti predel akrocentrični kromosomi z geni za rrna (nukleolarni organizacijski center) 13, 14, 15, 21, 22 procesiranje pre r-rna molekul in urejanje rrna v ribosome mesto za usmerjen transport v citosol c) intermediarni predel Funkcija Transkripcija in procesiranje različnih nekodirajočih rrna in združitev z ribosomalnimi enotami. Tu so zapisi za 5,8S, 18S in 28S molekule rrna, ki jih prepisuje rrna polimeraza I iz 45S - predhodne molekule rrna. Evkariontski ribosomi vsebujejo poleg teh molekul še 5S RNA, ki je sintetizirana drugje in jo prepisuje rrna polimeraza III. 18S in proteini tvorijo malo podenoto ribosoma, 5,8S, 28S, 5S (pride iz jedra) in proteini pa tvorijo veliko podenoto. Skozi jedrno poro se zrineta v citosol in se tam združita v ribosom. Ribosom ima življensko dobo 4-6 dni, sestavljen je 2/3 iz rrna in 1/3 iz proteinov. Mala podenota ribosoma omogoča pravilno povezavo med kodonom in antikodonom, velika podenota pa katalizira nastanek peptidne vezi med AK. Kromosomi Zakaj je DNA nosilec genetske informacije, ne RNA? Večja stabilnost (vodikove vezi), večja učinkovitost pri popravljanju napak. Spiralizacija kromatina Kromosome sestavljajo kromatin in histoni. Histoni so evolucijsko najbolj konzervativni proteini, vsaka sprememba njihove strukture je letalna. Vrste histonov so H1, H2A, H2B, H3 in H4.

40 DNA se 1,7x (146 nukleotidov) ovije okoli histonskega oktamera (2x H2A, H2B, H3 in H4) in nastane nukleosom Vezava histonov ni odvisna od nukleotidnega zaporedja Med nukleosomi je povezovalna DNA in dodatni histon H1, ki približa sosednja nukleosoma in dodatno stabilizira. nukleosomske modifikacije: acetilacija na histonske repke vpliva na različno stopnjo spiralizacije so spontane ali pa od ATP odvisne spremembe v strukturi kromatina od ATP odvisni kromatinski preoblikovalni kompleksi vplivajo na pozicijo nukleosomov vzdolž DNA in omogočajo drsenje nukleosomov tako postane DNA dostopna za proteine spremembe vodi kodni bralno-pisalni proteinski kompleks KBPK, ki širi modifikacije še na druge nukleosome Stopnje kondenzacije kromatina kondenzini se vežejo na DNA in ga kondenzirajo, za kar je potreben ATP osnova je 2 nm široka DNA, ki se zvije v nukleosome in tvori 11 nm nit 11 nm niti se zvijajo v 30 nm nit, ki je najpogostejša oblika interfazne DNA in omogoča prepisovanje (hipotetično se histonski repki različnih nukleosomov povežejo med sabo in pomagajo pri pakiranju, pomaga tudi H1 30 nm nit se v obliki zank pritrja na nosilno ogrodje proteinov za kromosome in tvori kromatidne zanke s premerom 400 nm v metafazi je kromosom najbolj spiraliziran in ima specifično zgradbo (specifična lega telomer in centromere) kromatidi med sabo povezujejo kohezini Vrste kromatina Heterokromatin je močno kondenziran, geni so splošno neaktivni in se ponavljajo, so neinformativni podvojuje se v S-fazi interfaze v mejozi ima omejene sposobnosti prekrižanja leži ob jedrni ovojnici dve vrsti: konstitutivni vedno v obliki heterokromatina, ni genov je vedno prepisno zavrt predel, je na Y kromosomu, sestavlja α-satelitno regijo in GGGTTA zaporedja v telomerah (geni, ki so na tem območju, se ne izražajo aktivnost je odvisna od lege na kromosomu!) fakultativni ni vedno prisoten: na primer pri ženski je en kromosom X vedno fakultativen, drugi pa aktiven in despirilaziran navadno je pred heterokromatinom bariera: pregradni proteini povzročijo, da se HK ne more širiti Eukromatin sestavljen iz 30 nm niti - despiraliziran difuzno razpršen po niti Ureditev DNA v kromosomu v centromerni regiji, je veliko tandemnih ponovitev α-satelitna DNA

41 centromera so specifična zaporedja nukleotidov: 110 baznih parov dva konzervativna elementa (9 in 11 parov) in osrednji del z veliko AT bazami (80 parov), ki se močno spreminjajo skozi generacije. Centromero določajo specifični proteini, ne AK zaporedja. kromosom določajo izvori replikacij avtosomne replikacijske sekvence ARS, ki vežejo proteine na začetku replikacije v telomernih regijah so dolge ponovitve zaporedij TTAGGG, kamor se vežejo regulatorni proteini in nastane telomerni kompleks, ki omogoča razlikovanje normalnih koncev DNA od prelomitev DNA. Pripenjajo se na jedrno lamino in tako umeščajo kromosome v jedru subtelomerna regija: distalne subtelomerne sekvence (nekaj 100k parov, repetitivne in značilne za vse kromosome) intersticijska degenerativna sekvenca (ponovitve TTAGGG, pomembna pri kompartimentizaciji subtelomere) proksimalne subtelomerne sekvence (bolj specifične za vsak kromosom) subtelomerne regije so si 95% identične in pride do pogostih preureditev v subtelomerah, zato so lege homolognih sekvenc na dveh kromosomih lahko neparalelne podvojevanje se ne more končati v 3' koncu DNA, kar reši encim telomeraza, ki prinese kratko molekulo RNA, templet, in omogoči končanje sledilne strani omogoča trajno podvajanje, prepreči krajšanje telomer vsak kromosom ima določeno mesto, s katerim se pripne na določeno mesto ob membrani Gen in genom Genetske in epigenetske spremembe DNA Genetske: spremembe v zaporedju nukleotidov Epigenetske: spremembe kromatina zaradi kovalentnih modifikacij histonov ali metilacij določenih zaporedij DNA (CG otočki zaporedja CG so zelo pogosta v različnih sekvencah, tudi na področju promotorjev). Če pride do metilacije, se transkripcijski faktorji ne morejo vezati in gen je utišan. Acetilacija razmakne 2 nukleosoma, da transkripcija lažje poteče Epigenetske spremembe vplivajo na naš fenotip (npr. razlike med enojajčnimi dvojčki z istim genotipom) modifikatorji: nikotin, stres, UV sevanje, infekcije, karcinogeni, DNA acetilaze in metilaze, histon acetilace in deacetilaze naključna inaktivacija kromosoma X lionizacija (primer epigenetske spremembe zaradi kovalentne modifikacije histonov ali izražanja in vezave XIST RNA na kromosom X, ki tako prehaja v bolj zgoščeno obliko) genetske spremembe se prenesejo na naslednike, pri epigenetskih spremembah pa se lahko ponovno aktivirajo v novi celici ali pa tudi ne Zgradba evkariontskega gena na človeškem kromosomu je genov, 2% genoma je protein kodirajočega ali RNA kodirajočega, ostalo pa varuje in ščiti kodirajoči del DNA gen vključuje eksone (kodirajoči odseki) in introne (nekodirajoči odseki) če se pojavijo točkaste mutacije, so introni varovalka na mrna po izstopu iz jedra so samo eksoni

42 DNA proteine kodirajoči gen vsebuje promotor in lahko tudi druge regulatorne elemente, konča se z STOP kodonom (terminacijskim nukleotidnim trojčkom) najkrajši gen z 500 nukleotidi kodira histone, najdaljši pa 2,5 miljona nukleotidov in kodira distrofin onkogeni so geni, ki lahko povzročajo rakavo rast celic nastanejo iz proto-onkogenov z mutacijo ali pa se čezmerno izražajo (npr. preprečijo apoptozo) geni za receptorje rastnih faktorjev, tirozin kinaze, prepisnih faktorjev, regulatorje GTP-az recipročna translokacija dela kromosma 9 na 22 in povzroči izražanje onkoproteina BCR-ABL in rakavo rast celic kronično mieloično levkemijo tumor zaviralni geni al antionkogeni celice varujejo pred rakavo rastjo (celice lahko postanejo rakave samo če mutirajo ali pa je njihova vloga zmanjšana), ponavadi zavirajo celični ciklus in uravnavajo apoptozo antionkogen za Rb-protein uravnava celični cikel v interfazi in ob mutacijo povzroči rak mrežnice ohranjuje kodirajočo informacijo in jo prenaša na hčerinske celice nosi zapis za protein in RNA kodirajoče gene dvojna vijačnica, deoksiriboza, adenin se povezuje z timinom RNA nosi protein-kodirajočo informacijo in katalizira in regulira nastanek proteinov ali RNA enojna vijačnica, riboza, adenin se povezuje z uracilom Regulacija transkripcije in translacije Nastanek preiniciacijskega transkripcijskega kompleksa promotor določa začetek gena (TATA BOX (adenin in timin) je ena izmed sekvenc v promotorski regiji) na promotor se vežejo transkripcijski faktorji, proteini, ki sprožijo transkripcijo vezavo transkripcijskih faktorjev omogoči predhodna vezava specifičnih proteinov na promotor nastali kompleks omoggoči vezavo RNA polimeraze Rettov sindrom: prizadane deklice, nova mutacija gena za transkipcijski faktor, ne morejo imeti potomcev Procesiranje pre-mrna v mrna primarni prepis z DNA imenujemo pre-mrna in vsebuje eksone in introne splicing izrezovanje intronov in spajanje eksonov naredi se zanka intona, na oncu introna je adenin, ki se poveže z začetkom introna zanka introna se razgradi in iz pre-mrna nastane mrna spliceosomi so kompleksi snrnp in proetinov, ki izvajajo splicing snrnp- small nuclear ribonucleic particle deli mrna alternativni splicing v končno mrna ne pridejo vsi eksoni nastane neka različica proteina, omogča nastanek različnih variant proteinov Napake v procesiranju pre-mrna lahko vodijo v bolezen -talasemijo (napaka je lahko že v enem nukeotidu): utrujenost, infekcija, povečana rast, povečana vranica, Začetek sinteze proteinov na malo podenoto ribosoma se veže mrna elongacijski faktorji omogočajo pripeljavo trna z aminokislino do velike podenote ribosoma

43 Celični cikel 4 faze: M, G1, S, G2 faza M: delitev jedrne mase in citoplazme v zgodnjem embrionalnem razvoju (1. dan) si v ciklu sledita le faza S in faza M, ker celice po nastanku zigote ne rastejo in so vedno manjše pri jetrnih celicah traja celični cikel 1 leto, pri črevesni epiteljskih pa 12 ur (poškodbe zaradi hrane) frekvenca proliferacij je velika in možnost, da pride do napak, je večja celica v fazi G1 je najbolj dojemljiva za zdravilo najdlje je celica v fazi G1, najmanj v M v fazi G1 se celica odloča, ali bo šla v fazo S ali G0 G0 je faza, v kateri cleica izstopi iz cikla začasno (čakajo na ugodne razmere, npr. matične ali diferenciarjoče celice) ali pa dokončno (diferenciirane celice, ki pa se lahko reprogramirajo in postanejo pluripotentne (matične celice)) Nadzor celičnega cikla Kontrolne točke zagotavljajo, da si faze v celičnem siklu sledijo pod pogoji: konec G1 startna točka, če je okolje spodbudno (ustrezne zunajcelične signalne molekule, hranila), se cikel nadaljuje G2/M, preverja, če je vsa DNA podvojena in če ni poškodb na DNA metafaza/anafaza, preverja, če so kromosomi pripeti na delitveno vreteno Če te homeostaze ni, pride do razvoja raka. Mehanizmi medcelične in celične signalizacije lokalni mediatorji (rastni faktorji, mitogeni, preživetni faktorji, citokini imunski sistem) hormoni nevrotransmiterji membranski proteini Vezava na receptor v membrani kaskada dogodkov Signalne poti pri membranskih receptorjih primarni prenos: modifikacija signala, pomnoževanje signala, integracija signalov, razširjanje na več ciljev sekundarni prenašalci: molekularna stikala proteinske kinaze in fosfataze, monomerni G-proteini majhni zunajcelični molekularni označevalci lokalni mediatorji: rastni faktorji: povečajo celično rast, stimuilrajo sintezo in inhibirajo razgradnjo molekul G1 in G2 mitogeni: sprožijo celično delitev preživetveni faktorji: povečajo preživetje celic, inhibirajo programirano celično smrt sosednje celice tekmujejo za zunajcelične signalne molekule primeri RF: PDGF (izločajo trombociti ob poškodbi), NGF (živčni RF) primeri mitogenov: PDGF, EGF, HGF, eritropoietin, TGF- nekatere živali vzdržujejo normalno velikost tkiv in organov s številom celičnih delitev manjše celice, a enaka končna velikost tkiva

44 fuzija mioblastov v prečno progasto mišično celico = celična diferenciacija, miostatin je mitogen, ki ga izločajo prečnoprogaste celice in zavira diferenciacijo mioblastov (povratna zanka) Regulacija celičnega cikla celični cikel regulirajo ciklini in od ciklinov odvisne kinaze Cdk koncentracija ciklinov in posledično CDK se med celičnim ciklom spreminjajo za vsako fazo je značilen drugačen kompleks spreminjanja v aktivnosti (fosforilacija, vezava inhibitonih proteinov, proteoliza ciklinov, različno branje genov) nadzirajo dogodke v posameznih fazah celičnega cikla 1. Ciklin se veže na delno aktivno Cdk in se usmeri v tarčni protein 2. Aktivni kompleks ciklin-cdk fosfolira proteine, ki so ključni za specifično fazo celičnega cikla Mehanizmi, ki aktivirajo kompleks ciklin-cdk 1. Fosforilacija Cdk aktivirajo ga Cdk-aktivirajoče kinaze CAK inhibirajo ga inhibitrone kinaze (dodajo inhibitoren fosfat in kompleks deaktivirajo) ponovno ga aktivirajo specifične fosfataze (odstranijo inhibitoren fosfat) 2. vezava CKI inhibirajo ga CDK-inhibitorni proteini CKI, ki se vežejo na aktiven kompleks in celica gre v fazo G0 3. proteoliza (razgradnja) Cdk in ciklinov kontrola proteolize s kompleksom SCF, ki sproži fazo S (ubiksinacija vezava majhnega proteina ubiksina) kontrola proteolize s kompleksom APC/C, ki sproži anafazo (povzroči, da se razgradi) razgradnja regulatornih proteinov v končnih fazah cikla 4. regulacija transkripcije genov, ki vplivajo na delovanje Cdk mitogeni: aktivirajo proteine PAS, ki vplivajo na mitogen aktivirane MAP kinaze, ki aktivira transkripcijski proces v jedru MANJKA, glej učbenik 148 Faza G1 Najdaljše obdobje celičnega cikla, intenzivno prepisovanje genov in sinteza, povečanje velikosti celice. Rast celic sprožajo npr. mitogeni in adhezija pritrjanje celic. Kontrola G1 Najpomembnejša regulatorja sta Rb in p53. pri okvari DNA se p53 prične kopičiti in sproži prepis proteina p21, ki inhibira kompleks G1/S- Cdk, kar ustavi celični ciklus v fazi G1 če je kompleks G1/S-Cdk aktiven, je protein Rb fosforiliran (drugače je vezan na protein E2F) in E2F sproži prepisovanje genov, potrebnih za nadaljevanje celičnega cikla (fazo S) rasni faktorji navadno sprožijo fosforilacijo/aktivacijo proteina Rb pri okvari DNA je kompleks G1/S-Cdk inhibiran, zato se celični cikel ustavi Faza S sinteza DNA mora biti eksterno določena, vsak nukleotid genoma se mora podvojiti le enkrat kompleks S-Cdk (A-CDk 2,1) sproži replikacijo DNA

45 DNA ima konec 3' in 5', antiparalelno povezani verigi (veriga DNA raste zaradi dodajanja nukleotidov na 3' koncu) replikacija vedno poteka od 5' proti 3' replikacija se začne na mestu podvojevanje origo in poteka do terminacijskega mesta (nukleotidi na DNA, ki se podvajajo, tvorijo replikon lahko je enosmeren ali pa dvosmeren) kompleks ORC (orign recognition complex) prepozna origo in se veže nanj skupaj s še drugimi proteini skupaj tvorijo predreplikacijski kompleks ko se aktivira S-Cdk, fosforilira enega izmed proteinov predreplikacijskega kompleksa in nastane prediniciacijski kompleks prediniciacijski kompleks pozicira RNA polimerazo II nad origo in denaturira DNA sledi elongacija, podvajanje DNA izvori podvojevanja določajo mesto začetka podvojevanja in čas replikacije replikacija DNA je semikonzervativna (v novi DNA je ena veriga stara, ena nova) na eni verigi se sintetizira vodilna veriga, kjer se dodajajo novi nukleotidi od 5' proti 3' na drugi verigi pa sledilna, zastajujoča veriga, ki se dodaja sicer v smeri od 3' proti 5', ampak se dodajajo nepovezani fragmenti 5'-3', imenovani Okazakijevi fragmenti (njihov nastanek omogoča RNAoligonukleotid), ki jih nato spnejo ligaze) Kontrola S1 sprožijo in zavrejo S-Cdk kompleksi omogočijo odvijanje DNA in podvajanje ter preprečijo 2x podvajanje celice imajo več načinov popravila napak, nastalih pri podrojevanju npr. izrezovanje napačnih nukleotidov (če je ta proces pokvarjen, pride do bolezni kseroderma pigmentosum preobčutljivost na svetlobo in verjetnost pojava kožnega raka) Faza G2 Rast in sinteza proteinov specifičnih, potrebnih za mitozo (tubulin). Preverja se DNA in če pride do napake, se cikel ustavi in vključi se popravljalni mehanizem na osnovi homologne ali nehomologne rekoembinacije. Faza M mitoza in citokineza za prehod v fazo M je potrebna aktivnost M-Cdk, ki skrbi za potek dogodkov do konca metafaze Profaza Jedro je ohranjeno, jedrna ovojnica prisotna, kromatin se prične zgoščevati, kromosomi še niso oblikovani, delitveno vreteno se podvoji in centrosoma potujeta proti poloma. Poveča se hitrost nastajanja mikrotubulov. Kompleks M-Cdk vodi celico v mejozo, pozitivna povratna zanka - že aktivirana M-Cdk aktivira nove M-Cdk.

46 Prometafaza Razpad jedrne ovojnice. Zaporedja CEN v centromerni regiji vežejo proteine in nastane zažemek, kinetohor vsaka kromatida ima enega. Mikrotubulom je omogočen dostop do kromosomov. Aktiven kompleks M-Cdk fosforilira proteine jedrnih por in lamine. Metafaza Maksimalno kondenzirani kromosomi ležijo v ekvatorialni ravnini zaradi vlečnih sil nanje pritrjenih kinetohornih mikrotubulov. Aktiven kompleks M-Cdk in kromosmi omogočajo nastajanje delitvenega vretena in destabilizacijo mikrotubulov (preko motornih proteinov in microtubule associated proteins MAP). Kontrolna točka: Preveri, če so vsi kromosmi pripeti na mikrotubule. Anafazni promocijski kompleks APC/C omogoči ubiksinacijo M-Cdk in sekurin, ki aktivira encim separazo na meji med metafazo in anafazo. Anafaza Najkrajše obdobje mitoze. Sestrske kromatide se ločijo in potujejo proti poloma celice. Pri ločitvi kromatid (cepitev kohezinov) pomaga encim separaza. Anafazo delimo na fazo A, ločitev kromatide, in fazo B, razmik polov. Motorni proteini (posebni dineini, kinezini 4, 10, 14 in 5) vlečejo kromosome proti polu, so potisna sila za premikanje centrosomov ločevanje polov in povezujejo astralne mikrotubule s celičnim korteksom (aktinski filamenti ob plazmalemi). Inaktivacija M-Cdk sproži nasprotne procese kot pri začetku mitoze. Telofaza Kromosomi so na polih celice in se despiralizirajo. Organizirajo se jedrca, oblikuje jedrna ovojnica. Razgradi se delitveno vreteno. Tudi organi med mitozo razpadejo in se nato na lasten način spet sestavijo. Citokineza Oblikuje se brazda, zažetek citoplazme, v ekvatorialni ravnini. Aktinsko-miozinski obroč kontraktilni obroč pod plazmalemo omogoči kontrakcijo. Kontraktilni obroč nastane v zgodni anafazi, ko postanejo aktivne Rho-GTP-aze, ki preko formina polimerizirajo aktin in povzročijo aktivnost miozina za povezavo z aktinom pomembne so proteinske kinaze Aurora B, sodelujejo pri oblikovanju delitvenega vretena, kontrakrinlega obroča in brazde med citokinezo Ob porabi ATP se kontraktilni obroč krči Citokineza omogoča rast membrane z regulirano eksocitozo Citokineza ni vedno simetrična (npr. jajčna celica) Eritroblasti so predhodna oblika retikulocitov (nezreli eritrociti), ki se asimetrično delijo in izloči se jedro, ki ga odstranijo makrofagi Megakariociti ne izvedejo citokineze, vsak se lahko spremeni v številne trombocite abestoza: azbestna vlakna porušijo potek citokeneze, ko se vežejo blizu brazde nepopolna citogeneza pri spermatogenezi: nastanek kanalčkov med semenčicami

47 Motnje v celičnem ciklu 1. Ni signalov za nadaljevanje cikla, celica pa prehaja prek kontrolne točke v G1 in se deli mutacija gena za protein Rb. 2. Nadaljevanje cikla navkljub pomankanju signalov zaradi delovanja onkogenov. 3. Diferenciirana celica, ki bi morala ustaviti delitve, normalno nadaljuje ciklus mutiran inhibitor za start kinazni kompleks. Rakava celica RAK = skupina genetskih bolezni, ki prizadanejo celične funkcije (popravljanje DNA, regulacijo celičnega cikla, apoptozo, signalno transdukcijo). Dve poglavitni lastnosti rakavih celic: množijo se na nenadzorovan način in vdirajo na območja, kjer jih navadno ni. Nevarne so le, če jih naravne celice ubijalke ne prepoznajo. Do tega pride zaradi pomankanja kostimulatornih molekul, ki omogočajo interakcijo med antigeni in limfociti in so pogoj za prepoznavanje. Benigni tumor = visoka proliferacija, celice ostanejo na določenem mestu metastazira Maligni tumor = celice se premikajo, bazalna lamina ni več intaktna. Celično biološke značilnosti rakave celice navadno nastanejo iz ene same abnormalne celice, ki je nastala v multistopenjskem procesu z mutacijami v genih, ki kontrolirajo proliferacijo ali metastaziranje ženska ima v celicah vedno naključno aktiviran X-kromosom vse rakave celice imajo aktiviran isti kromosom genetske spremembe povzročajo kancerogeni (kemijski, radiacijski ali biološki), potrebno je sosledje več neodvisnih genetskih dogodkov v eni celici pogosteje pri starejših organizmih rakave celice navadno nosijo več mutacij kopičenje mutacij v številnih genih okolje v rakavih celicah je zelo drugačno od navadnega (zmanjšanje tlaka kisika, sprememba dotoka kisika, prehajanja snovi ) omogoča preživetje v spremenjenih razmerah, neugodnih za druge celice (selekcijski pritisk celice morajo biti bolj uspešne pri preživetju) za rakave celice je značilna genomska nestabilnost in dodatne epigenetske spremembe epigenetske spremembe so pojav heterokromatina, kovalentne modifikacije histonov, metilacije DNA, ki vodijo do utišanja nekaterih genov, ki bi recimo drugače ustavili rast genomska nestabilnost: spremembe se akumulirajo v času hitre rasti in pomnoževanja rakavih celic in nastajajo nove mutacije, nova populacija celic subklon genetske spremembe so v smeri povečanja preživetja in delitve, avtofagijo pa lahko nadzorujejo (da jo zmanjšajo, pomanjšajo število hranilnih snovi v okolju; da zvečajo, pa izločajo rastne faktorje, da pride do nastajanja žil ANGIOGENEZE in je povečan dotok hranilnih snovi) angiogeneza omogoča rast celic in metastaziranje maligne matične rakave celice nastanejo iz normalnih matičnih celic ali pa iz diferenciirane celice, ki so dobile lastnosti matičnih celic celica se replikativni senilnosti izogne tako, da ohranja telomerazno aktivnost (preprečuje krajšanje telomer) Značilnosti rakavih celic nekontolirana celična proliferacija Posledice avtokrina stimulacija izguba kovalentne inhibicije

48 genetska nestabilnost hipometilacija celična nesmrtnost invazivnost izogibanje apoptotskim signalom izguba presledkovnih stikov okvarjena DNA nenormalni kromosomi aktivacija telomeraze manjšanje celičnega staranja = hierarhija rakavih celic angiogeneza izogibanje imunskemu sistemu Onkogeni Onkogen je mutirana oblika protoonkogena. Klasifikacija Primer Tip raka regulatorji celičnega cikla ciklin D rak požiralnika -katenin glioblastom receptorji rastnih faktorjev EGF-R debelega črevesa, pljučni, dojk regulatorji celičnega staranja telomeraza mnogo celični signalni G-proteini Ras-protein sečnega mehurja transkripcijski faktorji myc Burkinov limfom anti-apoptotski faktorji bol2 kronična limfomična levkemija Tumor supresorski geni Potrebni sta mutaciji obeh kopij TSG (na obeh kromosomih), da TSG izgubi svojo funkcijo, poveča se proliferacija in preživetje celic. Mesto delovanja Primer Tip raka prehod G1/S protein prb kostni, pljučni kontrolna točka G1 p53 mnogo razgradnja -katenina APC (razgradi -katenin) debelo črevo kontaktna inhibicija E-kacinerin? mnogo pro-apoptotski faktorji p53, Bax mnogo Rakave celice in mitohondriji preklopijo iz oksidativne fosforilacije na glikolizo -»izklopijo«mitohondrije onemogočijo apoptozo (ključni dejavniki za sprožitev apoptoze so v mitohondrijih) in postanejo nesmrtne Matične celice Poznamo embrionalnem odrasle, amnijske in rakave matične celice ter inducirane pluripotente celice. Diferenciirane celice pa delimo glede na sposobnost delitve: nesposobne delitve (srčne mišične celice), tiste, ki se delijo, če je treba nadomestiti poškodovane/umrle celice (jetrne hepatociti, ki se normalno zelo redko delijo), in pa tiste z kratko življensko dobo, ki se nadomeščajo z na novo diferenciiranimi celicami (krvne celice, epitelne celice kože) Lastnosti matičnih celic 1. Samoobnavljanje Pri mitozi se 1 hčerinska celica diferencira, druga pa se samoobnovi.

49 2. Pluripotentnost Možnost razvoja v vse tipe telesnih celic. Velja za embrionalne matične celice in odrasle matične celice (te se defirencirajo v neko celično linijo. Multipotentne (npr. krvotvorne matične celice) Unipotentne (na nivoju nekega tkiva) Totipotentne (»med vsemi«, gradijo blastomere v moruli zgodnjem embriju) 3. Nediferenciiranost Pri embrionalni in odrasli m.c. je jedro večje od citoplazme. Matične celice se redko delijo, zaradi česar so manj verjetne mutacije. Nahajajo se v čimbolj zavarovanih delih telesa. Hipoteza nesmrtnosti matičnih celic: Matične celice vedno obdržijo origalne verige DNA, na novo sintetizirane pri podvojitvi pa sse razpršijo v druge celice. Matične celice v koži: obnova epidermisa, celic žleze lojnice in celic lasnega mešička. Matične celice in medicina Blastocite se lahko razvijejo iz jajčeca, s transplantiranim jedrom somatske celice jedro neke diferencirane celice bolnika bi uporabili za pridobitev EMC, jih vzgojili v kulturo in usmerili v razvoj želenega tipa celic. Že zdaj je možno transplatirati kostni mozeg pri zdravljenju levkemije. Zdravili bi lahko tudi infarkte, bolezni zaradi degeneracije motonih nevronov, multiplo sklerozo (avtoimuna bolezen osrednjega živčevja). Zaskrbljujoča je možnost, da bi se celice po presaditvi začele deliti in pozročile rast tumorja. Inducirane pluripotentne matične celice razvijemo iz ne-pluripotentnih celic z izražanjem določenih genov tu v postopku ni treba uničiti človeškega embrija. Staranje celic Nepovratna ustavitev rasti in celičnih delitev v stanju replikativne in celične senilnosti. Celična senilnost Matične celice se delijo v nedogled, telesne celice pa imajo omejeno število delitev glede na vrsto. zaradi spremembe v delovanju encima telomeraze nastajajo skrajšana a stabilna krajišča in celica se preneha deliti (če se še naprej deli, lahko zaradi nenormalne oblike kromosomov nastane rakasta celica) v senilnost vodijo tudi kopičenje okvar DNA, sproščanje reaktivnih kisikovih spojin ROS in aktivacija onkogenov Fenotip senilne celice podobne dokončno diferenciiranim celicam ustavitev rasti, zmanjšane apoptozne aktivnosti, spremembe v izražanju genov, spremembe kromatina -galaktozidaza je z senilnostjo povezan encim, ki se v starih celicah kopiči v lizosomih in ga uporabljajo kot markerski encim staranja celic Nepovratna ustavitev celičnega ciklusa V fazi G1 zaradi povečanega izražanja inhibitorjev cikla (kinazna inhibitorja p21 in p16 hiperfosforilacija proteina prb) in zmanjšanega izražanja regulatorjev celičnega cikla (ciklini, E2F).

50 Modifikacije kromatina med celično senilnostjo povečane metilacije privedejo do sprememb kromatina deli kromatina postanejo»senilna kromatinska območja«protein siruinus varuje celice pred starostnim slabenjem funkcij, katalizira reakcijo za spreminjanje energetskega statusa celice NAD/NADH Mehanizmi, ki vodijo v celično senilnost 1. Replikativni stres DNA Nezadovoljivo podvajanje DNA. Slabše delovanje replikacijskih faktorjev, znižana aktivnost helikaz (proteini, ki ločujejo verige nukleinskih kislin), zmanjšana vsebnost razpoložljivih nukleotidov. 2. Mitohondriji, reaktivni kisikovi radikali Sproščanje ROS v mitohondriju: znižanje oksidativne fosforilacije, mutacije mitohondrijske DNA, naključne spremembe proteinov in lipidov. 3. Prevelik vnos kalorij Manjši vnos kalorij pripomore k upočasnitvi celičnih funkcij in počasnejšemu staranju. 4. Sprememembe v matičnih celicah Zaradi staranja matične celice niso več sporobne samoobnavljanja (pri delitvi nastane diferenciirana celica in nediferenciirana celica, ki se ne obnovi). Pomembna sta tumorski zaviralni gen p53 in gen za protein inhibitor p16. Molekularni mehanizmi senilnega odgovora celic nefunkcionalne telomere + onkogeni (signali ROS) poškodne DNA povečanje koncentracije p53 prepis gena zaustavitev rasti in senilnost stren + onkogeni povečanje koncentracije p16 povečanje koncentracije prb reorganizacija kromatina zaustavitev rasti in senilost Imunski odziv Varovanje pred virusi, bakterijami, glivami in paraziti Imunski sistem se odziva na beljakovine in polisaharide patogenov Antigen je molekula, pri kateri pride do imunskega odziva (antibody generator) za imunski odziv so odgovori limfociti (B in T, dozorevajo v limfatičnih organih) limfociti B sintetizirajo imunoglobine protitelesa humoralni imunski odziv limfociti T odstranjujejo patogene, ki so že v celici celična imunost Limfatični organi: kotni mozeg, priželjc in periferni organi, kjer dozorevajo: mandlji, slepič, vranica, limfni folikli, nazofaringealno limfno tkivo, limfno tkivo v prebavilih Dozorevanje limfocitov hemopoetsko tkivo z homepoetskimi matični celicami se nahaja v kostnem mozgu, priželjcu in v feralnih jetrih limfociti B nastajajo in dozorevajo iz celic v kostnem mozgu (Bone marrow) limfociti T nastanejo v mozgu, nato se kot limfoidna zarodna celica prestavijo v priželjc in tam dozorijo (Timus) obe se nato prestavita v periferni organ, kjer lahko pričneta delovati vrste limfocitov: aktivirani B-limfociti: plazmatke, ki izločajo protitelesa

51 spominske celice B: po odstranitvi antigenov ostanejo in ob vnovični okužbi hitreje reagirajo aktivirani T-limfociti: citotoksični limfociti T (uničujejo okužene cleice) in celice pomagalke (izločajo citokine, ki aktivirajo B-limfocite in makrofage) Primarni in sekundarni imunski odziv Telo lahko zgradi do različnih protiteles. PRIMARNI ODZIV: Antigen protitelo 1-2 tedna primarni odgovor SEKUNDARNI ODZIV: veliko močnejši in hitrejši, telo se drugič sreča z istim antigenom Celično-biološki model imunskega sistema Vsak limfocit B gradi specifično vrsto imunoglobulina, ki ga kot receptor izpostavi na plazmalemi Na začetku imamo naivno celico mirujoč limfocit B, čez čas pa stik z antigenom nastanejo aktivni limfociti B, ki se namnožijo in nastanejo kloni celice, plazmatke plazmatke izločajo protitelesa (niso več vezana na membrani), so zelo sekrecijsko aktivne in kratkožive poleg tega nastajajo tudi spominske celice, ki so dolgoživeče in imajo membransko vezane Ig protitelesa se vežejo na nek antigen na patogenu (opsonizacija), nato se veže na toksin in nevtralizira njegovo delovanje (nevtralizacija) Zgradba protiteles osnova so 4 polipeptidi: 2 lahki in 2 težki verigi, ki so med seboj povezane z disulfidnimi vezmi na koncu molekule sta dve vezavni mesti za antigen in dva elastična slepa, ki omogočata premike ročic NH2 konec imenujemo Fab regija, kjer se veže antigen je ključna za prepoznavanje antigenov COOH konec imenujemo Fc del, ki se veže s specifičnimi Fc-receptorji na membrani ključen pri odstranjevanju tako lahka kot teka veriga imata na NH2 koncu variabilni ddel, na COOH koncu pa konstantni del različni konstantni deli težkih verig:, δ, γ,, ε določajo razred protiteles Imunoglobulin M pentamerni, iz 5ih monomerov in dodatno povezovalno J-verigo funkcija: tvori primarni imunski odziv (v krvni plazmi) ne morejo prehajati placente (preveliki), a so zelo učinkoviti (10 vezavnih mest) Imunoglobulin G funkcija: opsonizacija, po vezavi na patogen se z Fc-koncem poveže z makrofagom in olajša fagocitozo edini, ki lahko prehajajo preko placente do fetusa, so v krvni plazmi in ekstracelularni tekočini še posebej efektivni pri sekundarnem imunskem odzivu Imunoglobulin A najbolj dostopen za tujke: v slini, sluznici (dihalni trakt, urin, prebavni trakt)

52 je monomer, ob prehodu v kri pride do dimerizacije s posebnimi receptorji in transport skozi celice transcitoza (tako pride do lumna) Imunoglobulin D v mirujočih limfocitih, so kratkoživeči, stimulirajo limfocite B, da sintetizirajo še ostale tipe protiteles Imunoglobulin E monomer, ki se veže na Fc-receptorje tkivnih bazofilcev mastocitov, ti pa sprotstijo histamin histamin poveča permeabilnost žil in boljši dostop levkocitov Genetski vzroki za variabilnost Vzrok je predvsem veliko genskih segmentov, ki kodirajo Ig in se lahko med sabo poljubno kombinirajo. Obstajata tudi dve vrsti lahkih verig λ in κ. Variabilna regija protiteles Kodirajo 2 ali 3 genski segmenti (Variability, Junction in pri težkih verigah še Diversity segment). Med zorenjem limfocita B se DNA preoblikuje na te načine: 1. Somatična rekombinacija Naključno kombiniranje genetskih sementov, ki kodirajo Ig - na nivoju DNA. 2. Adicije in delecije nukleotidov na DNA 3. Alelno izključevanje Naključna izbira povezvanja težke verige z eno izmed lahkih verig. 4. Somatične hipermutilacije Pri oblikovanju spominskih celic B pride do točkovnih mutacij in zato do spremembe limfocita. Konstantna regija protiteles Lahke verige kodira le en gen z enim eksonom - λ ali κ. Težke verige: 4 eksoni, 3 za domene in en za del sklepa. Variabile so: a) membranske ali sekrecijske verge:, δ, γ b) tip težke verige: γ,, ε?? Mebranska ali sekrecijska protitelesa Vsako protitelo je lahko membransko vezano ali pa sekrecijsko. Razlika je v karboksilnem delu težke verige: membranska oblika ima hidrofoben konec za vključitev v membrano, sekrecijska oblika pa hidrofilni delec, da se ne ujame v membrano in se izloči iz celice. Protitelesni preklop antibody switching Variabilni del Ig se ohranja, spreminja pa se konstantni del težke verige glede na aktivnos limfocita. Ob primarni okužbi se sintetizira -veriga, nato pa se po sekundarni okužbi in stimulaciji z interlevkini (izloček celic T pomagalk) limfocit B nepovratno spremeni in sintetizira le še eno vrsto težke verige. Celični imunski odziv in limfociti T Razlika med celičnim imunskim odzivom in humoralnim imunskim odzivom: Limfociti T delujejo na kratke razdalje, le ob direktnem stiku, in prepoznajo antigen le, če mu ga predstavi celica lastnega organizma z molekulami MHC. citotoksični limfociti T (Tc) napadejo okuženo telesno celico naravne celice ubijalke (NK) ubijajo zlasti z virusi okužene lastne celice in tumorske celice celice T-pomagalke (Th) izločajo tkivne hormone citokine, ki uravnavajo odziv izvšnih celic odločajo, katera vrsta imunskega odziva bo sledila (lahko tudi tolerančni odziv)

53 T-celični receptorji TCR Limfociti T imajo proteine, ki vežejo antigene, TCR, vedno membransko vezane. TCR je zgrajen iz in podenot, povezanih z disulfidnim mostičkom vsaka podenota je zgrajena iz ene variabilne in ene konstantne domene Ig imajo samo eno vezavno mesto za antigen raznolikost zagotavljajo številni genski segmenti, ki kodireajo V, D, J in C segmente proteina razlikujemo tri oblike limfocitov T: citotoksični limfociti T (Tc): napadejo okužene celice in jih usmerijo v apoptosko smrt, (preprečijo širjenje patogenov v celici, predvsem virusov) celice pomagalke (Th): po aktivaciji z antigenim vzpodbudijo B limfocite ali makrofage k aktivnosti regulacijski limfociti T (Treg): zmanjšanje samouničujočega delovanja imunskega sistema limfociti T prepoznajo antigen le, če ga predstavi membranski proteinski kompleks MHC, ki je navzoč na plazmalemi vseh celic (neskladnost MHC je vzrok za zavrnitev tujega tkiva pri človeku se imenujejo HLA-antigeni) Proteini MHC I in MHC II MHC I: na večini telesnih celic, limfocitu Tc predstavijo delno razgrajen antigen patogena, ki je okužil celico MHC II: na plazmalemi so antigeni predstavitvenih celic, ki so fagocitirale delček patogen in predstavijo koščke patogena celicam Th proteini MHC so zgrajeni iz transmembranskega dela in zunanjega dela z domeno Ig in antigen vezavnim delom določena vrsta MHC lahko limfocitom T predstavi več različnih antigenov Predstavitev antigenov z MHC I 1. virus (vsebuje RNA, ovojnico in protein) se endocitira 2. virusna RNA in proteini izstopijo v citosol 3. proteosom razgradi virusni protein in virusni peptidi vstopijo v ER (s transporterji ABC) 4. MHC I v ER veže virusni peptid in ga prenese na površino celice 5. prepoznavanje virusa z limfocitom Tc Predstavitev antigenov z MHC II 1. celica fagocitira delno razgrajen antigen patogena 2. v poznem endosomu se srečajo v MHC II (MHC II vezavo z napačnimi antigeni preprečuje vezava neustreznih verig proteinov, ki se nato razgradijo) 3. peptid antigena se poveže z MHC II in transportira na površino 4. prepoznavanje z celico Th Proteini CD4 in CD8 So koreceptorji, ki pomagajo utrditi povezavo med TCR in MHC. CD8 jenameščen na Tc, CD5 pa na Th pomagajo tudi pri aktivaciji limfocitov T CD4 je receptor za vezavo virusa HIV in mu omogoči vstop v celico T, zaradi česar odmre, imunski sistem pa oslabi Superdružina Ig Protitelesa, MHC I in II, TCR, Fc-receptorji na makrofagih, koreceptorja CD4 in CD8 vsa vsebujejo vsaj eno Ig domeno (aminokislinski preostanki, povezani z disulfidnimi mostički). Razvili so se iz prvotnega enega gena.

54 Pomen priželjca pri imunotoleranci do lastnih molekul Najpomembnejši mehanizem imunske tolerance je odstranitev celic Tc in Th iz telesa, če bi se te drugače odzivale na lastne antigene. Izloča se jih na podlagi trdnosti vezave med TCR in MHC: če se trdno povežejo z MHC in lastnim peptidom ali pa se sploh ne morejo povezati, apototsko propadejo v procesu negativne selekcije za preživetje je potrebna šibka vezava na MHC z lastnimi peptudi zagotovljena trda vezava z tujimi antigeni (pozitivna selekcija zadnja stopnja zorenja limfocitov T) V priželjcu epitelne celice sintetizirajo in Limfocitom T predstavljajo molekule, značilne za druge dele telesa. Če so te celice inaktivirane, pride do hudih avtoimunskih bolezni. Napake v delovanju imunskega sistema Vodijo v avtoimune bolezni in rak. Imunska pomankljivost je lahko posledica genetskih bolezni ali pa so npr. posledica virusa HIV. Avtoimunost je napačno usmerjena imunost v organizmu, kjer lastne celice izzovejo imunski odgovor. Avtoimune bolezni: Hashimotov thyroidis (ščitnica se postopno razgradi), revmatoidni artritis (sistemska vnetna bolezen, ki prizadene predvsem sklepe), diabetes mellitus tip1 (okvare celic, ki proizvajajo inzulin), lupus erythermatosus (avtoimune bolezni, ki prizadanejo različne sisteme), celiakija, alergije, Celična smrt Apoptoza je programirana celična smrt, kjer se razgradijo posamezne celice. Nekroza je patološka celična smrt, kjer je prisotno vnetje in propad večih celic. Apoptoza pogojena razvojno ali z dražljaji iz okolja genetsko vodena (programirana smrt) razpad na z membrano obdana apoptotska telesca Apoptoza Nekroza poškodbeno pogojena ni genetsko vodena (patološka smrt) poškodovana membrana, vsebina celice se razlije v medceličnino odstrani odvečne celice v razvijajočem tkivu, vspostavi neko strukturo (medprstna kožica, repek paglavca) odstrani poškodovane celice v odvečnem tkivu, nastajajo nevtrofilci (tip levkocitov), ki z apoptozo propadajo apoptotska telesca fagocitirajo druge celice ali pa se izločajo v lumen Morfološke značilnosti apoptotskih celic skrčitev, kondenzacija celice prekinitev medceličnih stikov razgradnja citoskeleta, jedrne ovojnice izhajanje vode, sprememba prepustnosti membrane zgostitev membrane fragmentacija DNA na plazmalemi se izpostavi fosfatidil serin izočanje apoptotskih telesc

55 Kaspaze Kaspaze so citosolne aspartatno specifične cisteinske proteaze. Apoptoza je odvisna od znotrajcelične proteolitične kaspazne kaskade. Aktivacija iniciatorskih prokaspaz v kaspaze sprožitev apoptoze naktivne kaspaze = prokaspaze aktivirajo se v kaspaze z avtoproteolizo ali cepljenjem drugih kaspaz kaspaza 2 (proženje apoptoze iz GA), kaspaza 8 začne apoptozo po vezavi liganda (vezane na kompleks DISC), kaspaza 9 sproži apoptozo kot odgovor na sproščanje citokromov iz mitohondrijev (vezane na aspoptosom) kaspaza 10 (vezana na DISC) Aktivacija efektorskih prokaspaz v kazpaze izvedba apoptoze kaspaze 3, 6, 7 Receptorji smrti kaspaze lahko aktivira vezava liganda na celični površinski receptor TNF-družine (družina tumorski nekrozni faktor) receptorji smrti na citosolni strani imajo receptorji trimerno domeno smrti, ki sproži vezavo adapterskih proteinov in se oblikuje signalni kompleks, verižno aktiviranje različnih kazpaz Geni Bcl2 v apoptozi pospešujejo ali zavirajo potek apoptoze antiapoptotski geni družine Bcl2 (Bcl-2, Bcl-XL, ) ob čezmernem izražanju preprečujejo apoptozo proaptotski geni za Bax, Bak, Bad in Bid pa ob čezmernem izražanju apoptozo povzročajo pomembno je ravnotežje med obemi za sprožitev apoptoze morajo biti proapoptotski proteini aktivirani (Bax se ob signalu premakne iz citosola v mitohondrijsko membrano in sproži sproščanje citokroma c, Bid isto) nanje vplivajo preživetveni faktorji (IGF spodbuja, Fas-ligand inhibira preživetje), rastni faktorji in citokini (v odsotnosti se sproži apoptoza) Citokrom c citokrom c se sprošča v citosol in se veže na protein Apaf-1 (apoptotic protease activating factor), ki potem veže kaspaze 9 in datp Inhibitorji apoptoze IAP vežejo kaspaze in jih inaktivirajo. Lahko ustavijo apoprotzo, sproženo s strani kaspaz 3 in 7 ali apoptozo, povzročeno s citokromi c (preprečijo aktivacijo kasaze 9). Zunanja in notranja apoptotska pot Zunanja ali ekstrinzična pot: vezava liganda in receptor v plazmalemi Ligand Fas receptor smrti Fas DISC kaspazna kaskada apoptozna smrt Notranja ali intrizična pot: spremembe v permeabilnost mitohondrijske membrane Poškodba DNA, kipeksija, premalo hranilnih snovi in preživetnih faktorjev, Citokrom c v citosol apoptosom kaspazna kaskada apoptozna smrt Bolezni, kjer je pomembna apoptoza Srčni infarkt, možganska kap, Parkinsova bolezen, aids, Alzheimerjeva bolezen preveč apoptoze B celični limfom premalo apoptoze

56 Mejoza Razlike med mitozo in mejozo mejozo sestavljata dve celični delitvi, med katerima se DNA ne podvoji razlikujejo se končni produkti, pri mejozi so to haploidne celice, genetsko drugačne od staršev profaza v mejozi I traja zelo dolgo (tudi več kot 10 let) in je razdeljena na leptoten, zigoten, pahiten, diploten in diakinezo med leptotenom in pahitemom poteka oblikovanje oblikovanje sinaptonemskega kompleksa (triplastna proteinska struktura za paralelno lego homolognih kromosomov med rekombinacijo) v anafazi I se sprostijo kijazme in segregirajo homologi, v anafazi II pa sestrski kromatidi rekombinacija poteka v obeh, vendar je v mejozi pogostejša in pomembnejša neodvisna izbira med očetovimi in materinimi homologi (2 23 mogočih kombinacij) Rekombinacija profaza 1: združeni so homologi in znotraj bivalenta si izmenjujejo naključne dele kromosomov rezultat crossing over-ja je rekombinacija/nova kombinacija genov otroci z napačnim številom kromosomom navadno nastanejo iz gamet brez crossing overa Spolni kromosomi med mejozo X in Y se združita le na koncih, kjer imata homologen del kromosoma in poteka crossing over ta del kromosoma ni podvržen X-inaktivaciji in se dedujejo kot avtosomni aleli imenujemo ga psevdoavtosomni del (na vrhu kratkih krakov kromosmov) na vrhu dolgih krakov je še ena krajša psevdoavtosomna regija, ki pa se ne prekrža vedno Regulacija mejoze regulira Cdk1/ciklin B-kompleks, ampak malo drugače zagotavlja ustavitev v metafazi II dejavnost Cdk1 je delno zavrta, tako ostajajo oociti v metafazi, kromatin ostaja kondenziran in jedrna ovojnica se ne oblikuje vnovič najpomembnejše je zaviranje sinteze DNA med mejozo I in II v oocitih po mejozi I sinetizirajo kinaze Mos, ki ohranjajo CDK1/ciklin B.kompleks aktiven preprečena aktivacija APC/C in replikacija Napake med mejozo in pogosta obolenja pri človeku poglavni vzrok smrti zarodkov v prvem trimesečju nosečnosti trisomija 21, trisomija 18, trisomija 13, Turnerjev sindrom, Klinefelterjev sindrom Rekombinacija v mejozi med profazo se homolgi prepoznajo, povežejo in tvorijo bivalente za povzavo in pravilno lego poskrbi sinaponemski kompleks v pahitenu prenese crossing over, kar katalizira rekombinacijski nodul (proteinsko-encimsko kompleks med dvema homolognima kromosmoma v procesu sinapsis) sinapsis je proces oblikovanja sinaptoneme (proteinska struktura, sestavljena iz sredinskega in bočnega dela (kohezini) Homologna rekombinacija začne se z prelomi dvojne vijačnice v kromosomu oblikuje se Hollidayeva povezava dva homologna kromosoma sta speta zaradi recipročne izmenjave med dvema kromatidama

57 povezovalno mesto lahko drsi vzdolž kromosomov, nato pride do vrtenja (izomeracija ali rotacija) v kijazmah če se po rezanju prekrižanih kromatid povezava ne zasuče, pride do končnega produkta brez homologno rekombiniranih genov (na vsaki vijačnici je le kratek zamenjan delec) po zasuku pa pride do prekrižanja pod in nad Hollidayevo povezavo in do rekombinantne DNA = crossing over pri homologni rekombinaciji pride v 90% do genske konvercije, 10% pa do crossing over sedli obnova, poprava preloma pomembno je premikanje kinetohorov: v 1 mejotski delitvi se premakne tako, da sta obe kromatiti pripeti skupaj in se kinetohorni mikrotubuli pripnejo na obe kromatidi skupaj Medicinski pomen homologne rekombinacije in mejoze odsotnost homologne rekombinacije: Bloomov sindrom (veliko kromosomskih prelomov in preureditev, Rothmund-Thomsonov sindrom (mutiran gen za helikazo) manj homologne rekombinacije neučinkovito popravljanje napak na DNA lahko se pojavi tudi rak (rak zaradi genov BRCA1 in BRCA2) Popravljanje napak DNA možne spontane mutacije zaradi: oksidativnih poškodb, hidrolize, nekontroliranih metilacij najpogostejše mutacije v DNA: depurinizacije, deaminacije, depirimidacije, timinski dimeri Purini: adenin, gvanin; Pirimidini: citozin, uracil, timin citozin deaminacija timin ali uracil (ni prisoten v DNA zaradi uracila bi bilo veliko spontanih mutacij) RNA virusi imajo RNA prednost zaradi števičnih mutacij UV sevanje povzroči kovalentne povezave med dvema sosednjima timinoma timinski dimer med transkripcijo se RNA polimeraza na mestih z poškodbo ustavi Popravljanje DNA poškodb 1. Popravljanje z izrezovanjem baze napačni bazni par posebni encimi glikozilaze prepoznajo uracil v DNA molekuli in ga odstranijo AP endonukleaze prepoznajo mesta, kjer ni baze prednost DNA ped RNA je to, da ima še eno popravljalno matrico in endonukleaza ve, katera baza je napačna DNA polimeraza? in DNA ligaza zapolnita praznino 2. Popravljanje z izrezovanjem nukleotidov večje število nukleotidov okrog poškodbe, lezije DNA p*** specifične endonukleaze DNA polimeraza na novo sintetizira 3. Popravljanje z nehomolognim povezovanjem koncev dvojni prelom del nukleotidov se izgubi delecija dna (lahko ne zapisuje nobenega proteina ali RNA mlekule) pride do zlepljanja delov, ki prej niso bilo skupaj