Εξελικτική Οικολογία - Διάλεξη 3. Γενετικοί δείκτες και Φυλογεωγραφία. Εισηγητής Επικ. Καθ. Πουλακάκης Νίκος poulakakis@nhmc.uoc.

Transcript

1 Εξελικτική Οικολογία - Διάλεξη 3 Γενετικοί δείκτες και Φυλογεωγραφία Εισηγητής Επικ. Καθ. Πουλακάκης Νίκος poulakakis@nhmc.uoc.gr

2 Μικροδορυφορικές αλληλουχίες ή μικροδορυφορικά Είναι τμήματα DNA που αποτελούνται από μικρές, επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες μήκους 1-6bp Ως δείκτες εμφανίζουν υψηλά επίπεδα ενδοειδικού πολυμορφισμού και δεδομένου ότι ο αριθμός των αλληλομόρφων ανά μικροδορυφορικό τόπο είναι μεγάλος (10-100), οι γονότυποι των ατόμων ενός πληθυσμού (γενεαλογικές γραμμές) είναι πολύ πληροφοριακοί για την απάντηση σημαντικών οικολογικών ερωτημάτων.

3 Τα μικροδορυφορικά οφείλουν την ποικιλότητά τους στον αυξημένο ρυθμό μεταλλαγής. Ο ρυθμός αυτός έχει εκτιμηθεί σε μεταλλαγές ανά τόπο και ανά αντιγραφή στις ζύμες και στα ποντίκια, που είναι κατά πολύ υψηλότερος από τον συνολικό ρυθμό μεταλλαγής του γονιδιώματος, που εκτιμάται στα Ο υψηλός μεταλλακτικός ρυθμός αποδίδεται στο «γλίστρημα» (slippage) της αλυσίδας DNA κατά τη διάρκεια της αντιγραφής. Το φαινόμενο αυτό, επειδή μπορεί να οδηγήσει στην απώλεια ή στην εμφάνιση μιας νέας επανάληψης, ονομάστηκε Stepwise Mutation Model (SMM, Kimura and Ohta 1978). Κάποια από τα λάθη που δημιουργούνται από το γλίστρημα μπορεί να διορθωθούν από τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του πυρήνα, όμως πολλά «δραπετεύουν» από τη διόρθωση.

4 Τα μικροδορυφορικά δεν είναι ιδιαίτερα χρήσιμα για την εκτίμηση εξελικτικών γεγονότων που συνέβησαν στο μακρινό παρελθόν. Ο υψηλός ρυθμός μεταλλαγής και η τάση τους να αυξάνουν ή να μειώνονται σε μέγεθος σηματοδοτεί μεγάλη πιθανότητα ομοπλασίας, όπως η ομοπλασία μεγέθους. Αλληλόμορφο με 17 επαναλήψεις Προσθήκη 1 επανάληψης Αλληλόμορφο με 19 επαναλήψεις Απώλεια 1 επανάληψης Αλληλόμορφο με 18 επαναλήψεις Αλληλόμορφο με 18 επαναλήψεις Αν και έχουν διαφορετική προέλευση (ιστορία), τα δύο αλληλόμορφα θα εμφανίζονται ως δύο αντίγραφα της ίδιας προγονικής αλληλουχίας

5 Ένα θηλυκό για τον Μοναχικό Γιώργο (Lonesome George); Russello et al Current Biology

6 H ιστορία του Lonesome George

7 mtdna Φυλογενετικό δέντρο Myr LG Pinta ESP Española SCR San Cristobal CF Santa Cruz PBL Isabela: V.Wolf PBR ML δέντρο 4.5 Kb 161 άτομα 21 πληθυσμοί PZ CM CRU AGOS. Salvador Pinzon Santa Cruz Santa Cruz Isabela Pinta Myr Isabela: V. Darwin Isabela: V. Alcedo Isabela: S. Negra CR CC LC LP Isabela: C. Azul LT PEG chilensis carbonaria denticulata VD VA CPA CAZ RU St Salvador Pinzón St Fé St Cruz St Cristóbal Floreana Española Caccone et al Evolution

8 Lonesome George Espanola Male

9 Χρησιμοποιώντας μουσειακά δείγματα έγινε προσπάθεια κατανόησης εάν ο LG ανήκει στο πληθυσμό της Pinta 962 bp του 16S ribosomal και cyt b mtdna Caccone et al PNAS

10 354 άτομα από όλους τους αρτίγονους πληθυσμούς των χελωνών 10 μικροδορυφορικούς τόπους Russello et al Current Biology

11 H εύρεση ατόμων στο Volcano Wolf της Isabela με γενεαλογία του πληθυσμού της Pinta υποδεικνύει ότι ο Μοναχικός Γιώργος δεν είναι ο μόνος επιζών του του είδους τους (σήμερα Chelonoidis abingdoni μέχρι πρόσφατα Geochelone abingdoni. Ίσως επιστρέψει το χαμόγελο στα χείλη του. Ίσως τελικά να καταφέρει να διαιωνιστεί και να μην παραμείνει στην ιστορία ως ο Μοναχικός Γιώργος.

12 Εκτίμηση της ποικιλότητας των αλληλουχιών DNA Αλληλούχιση DNA

13 Αν και όλοι γενετικοί δείκτες ποσοτικοποιούν (άμεσα ή έμμεσα) την ποικιλότητα σε επίπεδο DNA, η αλληλούχιση είναι η μόνη μέθοδος που επιτρέπει τον ακριβή προσδιορισμό των βάσεων που διαφέρουν μεταξύ των ατόμων. Η πιο παλιά μέθοδος: ραδιοσημασμένες αντιδράσεις αλληλούχισης Τα βέλη υποδεικνύουν διαφορές μεταξύ 3 αφίδων

14 DNA sequencing Αυτοματοποιημένη μέθοδος πολύ κακό για τον προϋπολογισμό ενός εργαστηρίου

15 Η πιο δημοφιλής μέθοδος για την αλληλούχιση DNA είναι γνωστή ως διδέοξυ μέθοδος ή μέθοδος τερματισμού της αλυσίδας (Sanger et al. 1977) Το κλειδί της μεθόδου είναι η χρήση διδέοξυ-νουκλεοτιδίων (ddntps) για τον τερματισμό της αλυσίδας του DNA. Τα ddntps στερούνται της 3'-OH που απαιτείται για το σχηματισμό του φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ δύο νουκλεοτιδίων

16 Εάν ο λόγος φυσιολογικών προς διδέοξυ νουκλεοτιδίων είναι αρκετά υψηλός, πολλές DNA αλυσίδες θα πετύχουν να προσθέσουν αρκετά νουκλεοτίδια πριν την προσθήκη ενός διδέοξυ που θα σταματήσει την διαδικασία

17 Αυτοματοποιημένος αλληλουχητής -Automated sequencer Ένα gel ή capillary μηχάνημα διαχωρίζει τα παραγόμενα θραύσματα βάσει μεγέθους. Βάσει αυτών μπορούμε να «διαβάσουμε» την αλληλουχία από κάτω προς τα πάνω

18 Αυτό είναι μία ιδανική εικόνα αλληλούχισης από ένα αυτοματοποιημένο αλληλοχητή ABI Τα trace files (dye signals) αναλύονται και οι καθορίζονται οι βάσεις (bases called) για την δημιουργία των χρωματογραφημάτων. 2. Χρωματογράματα από τις συμπληρωματικές αλυσίδες ευθυγραμμίζονται με την βοήθεια υπολογιστικών προγραμμάτων.

19 Καλής ποιότητας αλληλουχία Χαρακτηριστικό πρόβλημα των αλληλουχιών που παράγονται είναι η χαμηλή ποιότητα των παραγόμενων αλληλουχιών στα πρώτα νουκλεοτίδια (εικόνα 12) και η χειροτέρευση της ποιότητάς της μετά τα νουκλεοτίδια.

20 Next Generation Sequencing

21

22

23 Πρόγραμμα ανθρώπινου γονιδιώματος Έναρξη 1990 Αναμενόμενο χρονικό πλαίσιο: 15 χρόνια Αναμενόμενο κόστος: 5-10 δις USD Πραγματικός χρόνος: 13 χρόνια Πραγματικό κόστος: 3 δις USD

24 Το 1965 ο συνιδρυτής της εταιρείας κατασκευής μικροεπεξεργαστών Intel, ο Gordon Moore, προέβλεψε ότι ο αριθμός των τρανζίστορς σε ένα μικροεπεξεργαστή θα διπλασιάζεται κάθε περίπου δύο χρόνια. Η πρόβλεψη αυτή επαληθεύθηκε από την πραγματικότητα: Ο αριθμός των τρανζίστορς στους μικροεπεξεργαστές πράγματι διπλασιάζεται μέσα σε χρονικό διάστημα περίπου δεκαοκτώ μηνών (Moore s law).

25

26

27 Αρχικά με ραδιενέργεια

28 Αρχικά με ραδιενέργεια

29 Αρχικά με ραδιενέργεια Χρειάζονταν 2 ημέρες για να διαβαστούν 200bp

30 Αρχικά με ραδιενέργεια

31

32 Από τη ραδιενέργεια στον φθορισμό και από τα πηκτώματα στα τριχοειδή

33 Από τη ραδιενέργεια στον φθορισμό και από τα πηκτώματα στα τριχοειδή

34 Tα πρώτα συστήματα ηλεκτροφόρησης με τριχοειδή απέδιδαν 300bp ανά τρέξιμο και περίπου 4 τρεξίματα ανά φόρτωμα (shift). Με 3 φορτώματα / ημέρα = 3600 bp/μηχάνημα/ημέρα Αυτό αυξήθηκε κατά 10 φορές στα επόμενα 5 χρόνια

35 2003, η χρονιά που ολοκληρώθηκε το πρόγραμμα της αλληλούχισης του ανθρώπινου γονιδώματος, ήταν μία δύσκολη και περίπλοκη χρονιά

36 Next Generation Sequencing

37 Next Generation Sequencing Η πλατφόρμα 454-GS έχει την ικανότητα να διαβάζει 1 δις βάσεις/ημέρα. Συγκρίνετε αυτό με τις 200 βάσεις του 1995 ή τις 3600 βάσεις του 2001 Χρειαζόμαστε απλά 3 συσκευές και 1 ημέρα ή 1 συσκευή και 3 ημέρες για την αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδώματος. Κόστος: χιλιάδες αντί εκατομμύρια δολάρια

38 Η γαλάζια γραμμή δείχνει τον αριθμό των βάσεων του DNA που διαβάζονται ανά λεπτό. Η σκούρο μπλε γραμμή δείχνει το νόμο του Moore. Από τις 200bp/ημέρα στο 1δις bp/ημέρα. Αυτό είναι πάνω από το διπλό ανά έτος!

39 Pyro-Sequencing 454 GS

40 Pyro-Sequencing 454 GS Βήμα 1 O εκκινητής υβριδοποιείται στην απλή αλυσίδα του DNA που λειτούργει σαν μήτρα (καλούπι), επωάζεται με τα απαραίτητα ένζυμα (DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, και apyrase) και τα υποστρώματα (adenosine 5' phosphosulfate (APS) και luciferin). Βήμα 2 Το πρώτο νουκλεοτίδιο (dntp) προστίθεται στην αντίδραση. Η DNA πολυμεράση καταλύει τη σύνδεση του νουκλεοτιδίου στην νέο-συντιθέμενη αλυσίδα του DNA, βάσει του κανόνα της συμπληρωματικότητας. Κάθε εισαγωγή συνοδεύεται από την απελευθέρωση μια πυροφοσφωρικής ομάδας (PPi) σε ποσότητα ίση με την ποσότητα των νέο-εισαγμένων νουκλεοτιδίων.

41 Βήμα 3 Το ένζυμο της ATP sulfurylase μετατρέπει το PPi σε ATP παρουσία της adenosine 5' phosphosulfate (APS). Το ATP προκαλεί τη μετατροπή της luciferin σε oxyluciferin, παράγοντας ορατό φως σε ποσότητα ανάλογη της ποσότητας του ATP. Το φως που παράγεται από την παραπάνω αντίδραση διαβάζεται από μια συσκευή (κάμερα, CCD) και γίνεται ορατό σαν μια κορυφή στο παραγόμενο αποτέλεσμα (Πυρόγραμμα). Το ύψος της κορυφής είναι ανάλογο του αριθμού των νουκλεοτιδίων που εισέρχονται. Βήμα 4 Η Apyrase, ένα ένζυμο που αποικοδομεί νουκλεοτίδια, συνεχώς αποικοδομεί τα αχρησιμοποίητα νουκλεοτίδια και το ATP. Όταν ολοκληρωθεί αυτό, προστίθεται ένα άλλο νουκλεοτίδιο.

42 Βήμα 5 Η προσθήκη νoυκλεοτιδίων dntps γίνεται αλληλουδιάδοχα. Αξίζει να σημειωθεί ότι αντί για το νουκλεοτίδιο (datp) χρησιμοποιείται το deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (datp S), αφού το πρώτο αν και είναι αυτό που χρησιμοποείται και αναγνωρίζεται από την πολυμεράση, δεν αναγνωρίζεται από τη luciferase. Καθώς η διαδικασία συνεχίζεται, δημιουργείται η συμπληρωματική αλυσίδα και η σειρά των νουκλεοτιδίων καθορίζεται από τις κορυφές στο πυρόγραμμα.

43 Pyro-Sequencing 454 GS

44 Next Generation Sequencing

45 Next Generation Sequencing

46 Old Generation Sequencing

47 Next Generation Sequencing Κέντρο αλληλούχισης για την αλληλούχιση γονιδιωμάτων θηλαστικών το οποίο είναι σαν εργοστάσιο που απασχολεί πολυάριθμους ερευνητές. Η τελευταίας γενιάς συσκευή αλληλούχισης μπορεί να παράγει σε 24 ώρες όσα δεδομένα παράγουν μερικές εκατοντάδες αλληλουχητές τύπου Sanger, με τη βοήθεια ενός μόνο ερευνητή..

48 Next Generation Sequencing

49 Αρχαίο DNA (αdna) Εφαρμογές Μίγμα DNA από τα οικοσυστήματα (μεταγενωμική)

50 Επαναφορά αρχαίων γονιδιωμάτων Αλληλούχιση mtdna Πυρηνικά γονιδιώματα εξαφανισμένων οργανισμών: αρκούδα των σπηλαίων, μαμούθ, άνθρωπος του Νεάντερνταλ Προβλήματα: μόλυνση από σύγχρονους ανθρώπους και συν-απομόνωση βακτηριακού DNA

51 Αρχαίο DNA (adna) Η αλληλούχιση 28 εκατομμυρίων βάσεων του μαμούθ (Μ. Primigenius) Poinar et al Science

52 Η αλληλούχιση 1 εκ. βάσεων του Νεάντερταλ Green et al Nature Αρχαίο DNA (adna) Η αλληλούχιση βάσεων του Νεάντερταλ Noonan et al Science "Illustration by Knut Finstermeier; Neanderthal reconstruction by the Reiss-Engelhorn-Museum Mannheim"

53 Αρχαίο DNA (adna) H πλήρης αλληλούχιση του mtdna του Νεάντερταλ Green et al CELL Φυλογενετικό δέντρο και χρόνοι απόκλισης των mtdna αλληλουχιών του Νεάντερταλ και των σύγχρονων ανθρώπων

54 Μεταγενωμική Χαρακτηρισμός της βιοποικιλότητας του πλανήτη

55 Μεταγενωμική

56 ΠΛΑΤΦΟΡΜΕΣ Roche/454 FLX: 2004 Illumina Solexa Genome Analyzer: 2006 Applied Biosystems SOLiD TM System: 2007 Helicos Heliscope TM : recently available Pacific Biosciencies SMRT: launching 2010

57 Νέας γενιάς αλληλούχιση DNA Παραπλανητική προβολή Πραγματική εφαρμογή Έλεγχος της πραγματικότητας Βαθμός διέγερσης Ενθουσιασμός Αρχική ιδέα Συνειδητοποίηση της πραγματικότητας Χρόνος

58 PCR γνωστών περιοχών DNA που παράγουν αλληλουχίες οι οποίες συγκρίνονται ως προς το μήκος τους και την φύση των βάσεων που διαθέτουν Παραδείγματα πυρηνικών περιοχών που μπορούν να διερευνηθούν: 1- γνωστές κωδικές περιοχές (γονίδια), όπως γονίδια ενζύμων ή δομικών πρωτεϊνών. Αυτά χρησιμοποιούνται κυρίως στην φυλογένεση, αφού τείνουν να είναι σχετικά σταθερά. 2- πυρηνικά εσώνια (μη κωδικές περιοχές μέσα σε γονίδια). Γίνεται χρήση της αρχής συντηρημένων εκκινητών, οι οποίοι υβριδοποιούνται στα εξελικτικά συντηρημένα εξώνια, ενώ τα κομμάτια που πολλαπλασιάζουν (στόχος) είναι μεταξύ αυτών και τα οποία είναι λιγότερο «περιορισμένα» από την επιλογή και συνεπώς πιο πολυμορφικά

59 Πολλαπλασιασμός εσωνίων! EPIC-PCR = exon-primed intron-crossing PCR H EPIC-PCR έχει εφαρμοστεί επιτυχώς σε πληθυσμιακές μελέτες θηλαστικών, πτηνών, ασπόνδυλων αλλά και φυτών

60 Παράδειγμα μελέτης: Πυρηνικά εσώνια για την μελέτη της δομής της φάλαινας (humpback whale) Palumbi &Baker (1994) Molecular Biology and Evolution 11(3):

61 Το mtdna δεν έδειξε γονιδιακή ροή μεταξύ των πληθυσμών της Χαβάης και της Καλιφόρνιας Η χρήση ενός πυρηνικού δείκτη ήταν απαραίτητη για σύγκριση και επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων

62 Μία από τις πρώτες εφαρμογές εσωνίων σε μελέτες πληθυσμιακής γενετικής Έψαξαν σε γενετικές βάσεις δεδομένων για γονίδια με εσώνια που να έχουν παρόμοιο μέγεθος και θέση μεταξύ διαφορετικών ειδών Σχεδίασαν συντηρημένους εκκινητές για το γονίδιο της ακτίνης

63 Επέλεξαν την ακτίνη γιατί πρόκειται για γονίδιο με εξώνια (κωδικές περιοχές), που είναι σχετικά συντηρημένες σε ένα μεγάλο εύρος οργανισμών, ενώ διαθέτει και εσώνια, η θέση και το μήκος των οποίων, είναι σχετικά σταθερά σε όλα τα είδη Σχεδίασαν εκκινητές στις περιοχές των εξωνίων με στόχο να πολλαπλασιάσουν τις ενδιάμεσες περιοχές των εσωνίων Το εφάρμοσαν στις φάλαινες

64 Πέντε άτομα από κάθε πληθυσμό αλληλουχήθηκαν για το εσώνιο της ακτίνης Οι δέκα αλληλουχίες αποκάλυψαν 8 διαφορετικά αλληλόμορφα (απλότυπους), όπου δημιουργούν ομάδες που δεν σχετίζονται με την γεωγραφική προέλευση των δειγμάτων Ακτίνη D-loop H έλλειψη γεωγραφικού προτύπου είναι ένδειξη παρουσίας γονιδιακής ροής

65 Όμως το mtdna έδειξε δύο διακριτές ομάδες Ωστόσο τα αντίθετα αποτελέσματα των δύο τύπων γονιδιωμάτων δεν είναι παράδοξο Οι θηλυκές φάλαινες είναι λιγότερο κινητικές από τις αρσενικές και έτσι το μητρικά κληρονομήσιμο mtdna δείχνει ισχυρό γεωγραφικό πρότυπο, ενώ το πυρηνικό όχι, υποδεικνύοντας γονιδιακή ροή μεταξύ των θηλυκών και ιδιαίτερα κινητικών αρσενικών ατόμων

66 Παράδειγμα μελέτης Φυλογένεση και έλεγχος της συστηματικής κατάταξης των σαυρών του γένους Podarcis στην περιοχή της Βαλκανικής χερσονήσου Poulakakis et al Molecular Phylogenetics and Evolution 37,

67 Συνδυασμένη ανάλυση των 3 γονιδίων

68 Παραφυλετικότητα του P. ehardii σε σχέση με την P. peloponnesiacus

69

70 Τεχνικές ελέγχου του σχήματος (μορφής) των μορίων του DNA Σχετικά φθηνή μέθοδος Αρκετά ακριβής

71 Single-Strand Conformational Polymorphism 1. Πολλαπλασιασμός αλληλουχίας στόχου 2. Αποδιάταξη προϊόντος με θέρμανση και φορμαμίδη 3. Ανάλυση σε πήκτωμα πολυακρυμαμίδης 4. Η αλληλουχία των βάσεων καθορίζει την 3-διάστατη διαμόρφωση του μορίου και το ρυθμό μετακίνησης στο πήκτωμα Πολύ ευαίσθητη: μπορεί να διακρίνει μόρια DNA που διαφέρουν σε μία βάση Απλή διαδικασία όμως δύσκολο να επαναληφθεί

72 Automatic Sequencing ~ $2,000 experiment costs ~ $90,000 set up costs SSCP ~ $500 experiment costs ~ $300 equipment costs

73 Παράδειγμα μελέτης: εκτίμηση της γενετικής ποικιλότητας στις γιγάντιες χελώνες των Γκαλάπαγκος Έλεγχος της περιοχής ελέγχου του mtdna σε 802 άτομα!!! Beheregaray et al. (2004) PNAS Beheregaray et al. (2003) Science

74 SSCP στην περιοχή ελέγχου του mtdna στον πληθυσμό Volcano Alcedo 30 χελώνες, 2 απλότυποι

75 Μη αναμενόμενα χαμηλά επίπεδα γενετικής διαφοροποίησης σε έναν από τους μεγαλύτερους πληθυσμούς των γιγάντιων χελωνών (Volcan Alcedo).

76 Γενετική ποικιλότητα στο νησί Isabela Διαφοροποίηση σε επίπεδο απλοτύπων V. Wolf h = 0.69 V. Darwin h = 0.50 V. Cerro Azul h = 0.87 V. Sierra Negra h = 0.83 V. Alcedo h = 0.17!!! Γιατί όμως συμβαίνει αυτό στο πληθυσμό από το ηφαίστειο Alcedo? ο μεγαλύτερος πληθυσμός στο αρχιπέλαγος (3,000 5,000) ένας από τους πρώτους που εποίκισαν το νησί Alcedo είναι τόσο παλιός όσο και το παλιότερο ηφαίστειο της Isabela Alcedo πιθανά ποτέ δεν επηρεάστηκε από τους φαιλονοθήρες

77 Το ηφαίστειο Alcedo υπέφερε από μια τρομερή ηφαιστειακή έκρηξη πριν από περίπου 100 (±20) χιλ. χρόνια Αυτή προκάλεσε μια δραματική μείωση του πληθυσμού (στενωπός) 91% των χελωνών μοιράζονται την ίδια μητρική γενεαλογία-απλότυπο Επιβίωση ενός απλότυπου (που οδήγησε στην επαναδημιουργία του πληθυσμού) Χρονολόγηση της εξαφάνισης των απλοτύπων = χρόνια ( )

78 ΦΥΛΟΕΓΩΓΡΑΦΙΑ και mtdna John Avise, University of Georgia

79 Φυλογεωγραφία: ασχολείται με τις αρχές και τις διαδικασίες που καθορίζουν τα γεωγραφικά πρότυπα των γενεαλογικών γραμμών, ειδικά εκείνων εντός του είδους, αλλά ακόμα και μεταξύ στενά συγγενικών εξελικτικά ειδών (Avise 2000) Οι φυλογεωγράφοι προσπαθούν να ερμηνεύσουν τον τρόπο και το βαθμό στον οποίο οι διάφορες ιστορικές διαδικασίες που σχετίζονται με τη δημογραφία των πληθυσμών, έχουν αφήσει τα εξελικτικά τους αποτυπώματα στη σύγχρονη γεωγραφική κατανομή των γονιδιακών γραμμών των οργανισμών. Στη πιο απλή της μορφή, η φυλογεωγραφία ασχολείται με τη χωρική κατανομή των απλοτύπων, των οποίων οι φυλογενετικές σχέσεις είναι γνωστές ή μπορούν να εκτιμηθούν.

80 Η φυλογεωγραφία λειτουργεί ως μία «ομπρέλα» που θέτει υπό την εποπτεία της διάφορα εναλλακτικά σενάρια για την ερμηνεία των χωρικών διευθετήσεων των οργανισμών και των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους. Ο βικαριανισμός και η διασπορά είναι δύο συχνά ανταγωνιστικοί παράγοντες που καθορίζουν, ο καθένας με το δικό του τρόπο την προέλευση του χωρικού διαχωρισμού των ταξινομικών μονάδων. 1) Διασπορά Πριν Κατά τη διάρκεια Μετά 1) μια ταξινομική μονάδα αποκτά τη σημερινή της κατανομή μέσω ενεργητικής ή παθητικής διασποράς από ένα ή περισσότερα προγονικά κέντρα προέλευσης 2) Βικαριανισμός Πριν Κατά τη διάρκεια Μετά 2) κατακερματισμός από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως φαινόμενα ορογένεσης, σπασίματα ηπειρωτικών μαζών, ευστατικά φαινόμενα

81 H φυλογεωγραφία είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με τη φυλογένεση 1. Κατασκευάζουμε ένα φυλογενετικό δέντρο για να πιστοποιήσουμε τις γενετικές σχέσεις μεταξύ των πληθυσμών ενός είδους (ή συγγενικών ειδών) 2. Συνδέουμε το δέντρο με την γεωγραφία Συσχετισμένη ανάλυση των γεωγραφικών και γενετικών αποστάσεων μεταξύ των πληθυσμών

82 Φυλογένεση Βάσει της εξελικτικής ιστορίας, όλοι οι οργανισμοί έχουν προέλθει από ένα κοινό πρόγονο, πηγαίνοντας πίσω στην προέλευση της ζωής

83 Φυλογένεση Διάφοροι μηχανισμοί έχουν οδηγήσει στη σημερινή βιοποικιλότητα, οι οποίοι περιλαμβάνουν: 1) μεταλλαγές (απλές αντικαταστάσεις, ελλείψεις, προσθήκες) 2) διπλασιασμό γονιδίων 3) επαναδιοργάνωση του γονιδίωματος 4) ανασυνδυασμό Για το έλεγχο της εξελικτικής ιστορίας και των σχέσεων των ειδών, χρησιμοποιούνται διάφορα σύνολα δεδομένων 1) Μορφολογικοί χαρακτήρες. Η ταξινομική ακόμα και σήμερα στηρίζεται στη μορφολογία. 2) Γενετικοί χαρακτήρες a) Νουκλεοτιδικές αλληλουχίες b) πρωτεϊνικές αλληλουχίες, c) RFLPs, d) Μικροδορυφορικά e) SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)

84 Φυλογενετικό Πρόβλημα U V W X Y AGGGCAT TAGCCCA TAGACTT TGCACAA AGCGCTT U X Y V W

85 DNA Sequence Evolution Φυλογένεση AAGGCCT AAGACTT TGGACTT -3 mil yrs -2 mil yrs AGGGCAT TAGCCCT AGCACTT -1 mil yrs AGGGCAT TAGCCCA TAGACTT AGCACAA AGCGCTT today

86 Φυλογενετικό Πρόβλημα U V W X Y AGGGCAT TAGCCCA TAGACTT TGCACAA AGCGCTT U X Y V W

87 Φυλογενετική Ανάλυση Βήμα 1: Συλλογή δεδομένων και ευθυγράμμιση (εύρεση των ομόλογων αλληλουχιών και θέσεων). Βήμα 2: Κατασκευή δέντρων βάσει των δεδομένων. Βήμα 3: Εφαρμογή συναινετικών μεθόδων ώστε να συναχθεί πιο είναι το πιο πραγματικό.

88 ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗΣ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΔΕΝΤΡΩΝ 1) Μέθοδοι Πινάκων Αποστάσεων (Distance Matrix Methods) (χρήση δεδομένων από πίνακες αποστάσεων) 2) Μέθοδοι Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony Methods) (χρήση δεδομένων από καταστάσεις χαρακτήρων) 3) Μέθοδοι Πιθανότητας ή Πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood και 4) Μπεϋζυανή Συμπερασματολογία (Bayesian Inference)

89 Στο σύνολο των φυλογεωγραφικών μελετών, ο πλέον επιλεγόμενος δείκτης είναι το mtdna (τουλάχιστον όταν η μελέτη αφορά ζωικούς οργανισμούς) Η ευρεία χρήση του mtdna οφείλεται στην PCR και στην χρήση των γενικευμένων εκκινητών (Universal primers) (Kocher et al. 1989)

90 PCR συντηρημένοι εκκινητές consensus 5 GGATTTGGAAATTGATTAGTTCC Μύγα Ακρίδα Φρύνος..G...G.....C...A.....G..C...

91 Γιατί το mtdna είναι τόσο χρήσιμο και ευρύτατα εφαρμοσμένο; «If one could design a customized genetic marker for use in population and evolutionary biology, it is quite likely that one would reinvent mtdna» Rand (1994) Εξακολουθεί να είναι ο κυρίαρχος δείκτης στην πληθυσμιακή βιολογία! Αυτό ερμηνεύεται από τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του mtdna και των εντυπωσιακό σε όγκο εργασιών, με επιτυχή αποτελέσματα, που έχουν γίνει με τη χρήση αυτού

92 Ιστορία της φυλογεωγραφίας

93 Χαρακτηριστικά του mtdna που του δίνουν πλεονέκτημα στη φυλογεωγραφία Απλοειδές Μονογονική κληρονόμηση Δεν ανασυνδυάζεται Δεν έχει μεταθετά στοιχεία, ψευδογονίδια, ιντρόνια, διαγονιδακές αλληλουχίες και επαναληπτικό DNA Έχει γρήγορο ρυθμό εξέλιξης Έχει μόνο το 25% του δραστικού πληθυσμιακού μεγέθους των πυρηνικών δεικτών, αφού σε αντίθεση με τους πυρηνικούς δείκτες τα αρσενικά άτομα δεν συνεισφέρουν στην επόμενη γενεά, ενώ τα θηλυκά έχουν μόνο έναν μιτοχονδριακό τύπο Είναι διαγνωστικό για διάφορες ταξινομικές βαθμίδες (π.χ. είδη)

94 Σύγκριση της διακριτικής ικανότητας (ή ικανότητα επίλυσης της φυλογένεσης) του mtdna και πυρηνικών γονιδίων στις γιγάντιες χελώνες των Γκαλάπαγκος 0.2% 0.2% 0.2% Pinta 0.3% 16 A 0.4% 9 Espanõla Santa Cruz: C. Fatal 3.1% Espanõla S.Cristobal Pinta 6.4% 5.4% 13.2% 13.2% 7.8% 0.2% 0.6% 0.1% 0.6% 0.2% % 0.3% S.Cristobal % Santiago Northern Isabela: V. Wolf S. Cruz: Caseta 16 Pinzon S. Cruz: C. Montura 43 Central Isabela: V. Darwin G.chilensis G.carbonaria G.denticulata Southern Isabela: V. Alcedo C. Azul S. Nigra % 3.1% 5.1% 2.2% Pinzon S.Cruz: Caseta Southern Isabela: C.Azul, S. Nigra Central Isabela: V. Darwin Northern Isabela: V. Wolf Santiago Southern Isabela: V. Alcedo G.chilensis G.carbonaria G.denticulata Caccone et al Molecular Phylogenetics and Evolution 31,

95 Μειονέκτημα 1) Κάθε οργανίδιο (μιτοχόνδριο, χλωροπλάστης) συμπεριφέρεται σαν μία μονάδα και το γονιδίωμά του σαν ένας γενετικός τόπος. ιχνηλατούμε την ιστορία ενός γενετικού τόπου, που μπορεί να συμφωνεί ή όχι με την εξελικτική ιστορία του υπό εξέταση είδους. Ο μόνος τρόπος να ελέγξουμε εάν η γενεαλογία που παράγεται από το mtdna είναι ακριβής (αντιστοιχεί στην γενεαλογία των ειδών), είναι να δούμε εάν συμφωνεί με γενεαλογίες που παράγονται από άλλες γονιδιωματικές περιοχές (πυρηνικό DNA)

96 Φυλογεωγραφική μελέτη σταθμός Φυλογένεση mtdna 87 ατόμων του είδους γεώμυς (Geomys pinetis) -- 2 διακριτοί κλάδοι που απέχουν 3%

97 Τα είδη αποτελούνται από γεωγραφικά δομημένους πληθυσμούς, μερικοί από τους οποίους μπορεί να έχουν μικρή ή καθόλου γενετική επαφή για μεγάλο χρονικό διάστημα. Άλλα είδη πάλι χαρακτηρίζονται από σχετικά πρόσφατη επέκταση της κατανομής τους, με αποτέλεσμα οι πληθυσμοί τους να συνδέονται πολύ στενά μεταξύ τους.

98 Όταν ένας πληθυσμός χωρίζεται σε δύο απομονωμένους υπο-πληθυσμούς, τότε οι απλότυποι του αρχικού πληθυσμού (οι οποίοι έχουν συγκεκριμένες φυλογενετικές σχέσεις) μοιράζονται στους υπο-πληθυσμούς με λίγο - πολύ τυχαίο τρόπο.

99 Σε μια τέτοια περίπτωση τα πιθανά παρατηρούμενα φυλογενετικά πρότυπα είναι τρία:

100 Μονοφυλία, η ομάδα έχει προέλθει από έναν μοναδικό κλάδο, δηλαδή από μια ίδια ή χαμηλότερου βαθμού ταξινομική μονάδα. Παραφυλία, η ομάδα δεν περιλαμβάνει όλους τους απογόνους ενός κοινού προγόνου Πολυφυλία, η ομάδα αποτελείται από μέλη που έχουν προέλθει εξελικτικά από προγόνους οι οποίοι ανήκουν σε περισσότερα από ένα προγονικά τάξα. Παραφυλετικότητα των Ερπετών

101 Τυχαία επιλογή γενεαλογικών γραμμών (stochastic lineage sorting) Oι τρεις κατηγορίες φυλογενετικών σχέσεων ουσιαστικά παρατηρούνται σε ζευγάρια αδελφών πληθυσμών, όταν εξετάζονται σε διαφορετικές χρονικές στιγμές από τη στιγμή που διαχωρίστηκαν από τον αρχικό πληθυσμό. Αμέσως μετά το διαχωρισμό των υποπληθυσμών εξαιτίας ενός φράγματος που εμποδίζει τη γονιδιακή ροή, οι υποπληθυσμοί εμφανίζονται ως πολυφυλετικοί, επειδή οι απλότυποι του προγονικού πληθυσμού διαχωρίζονται σε αυτούς με τυχαίο τρόπο.

102 Λόγω της τυχαίας εξαφάνισης κάποιων γενεαλογικών γραμμών, οι πληθυσμοί εμφανίζονται παραφυλετικοί, ενώ τελικά μετά το πέρασμα αρκετών γενεών οι πληθυσμοί γίνονται τελικά μονοφυλετικοί.

103 Ο χρόνος που απαιτείται ώστε ένα ζευγάρι μη συνδεδεμένων πληθυσμών να φθάσει στο στάδιο της αμοιβαίας μονοφυλετικότητας εξαρτάται από το μέγεθος των πληθυσμών και από το τύπο του γονιδιώματος που χρησιμοποιείται. Ο χρόνος προς τη μονοφυλετικότητα είναι 4 φορές μεγαλύτερος στα πυρηνικά σε σχέση με τα μιτοχονδριακά γονίδια

104 Ωστόσο υπάρχουν δύο φαινόμενα που, ακόμα αν και οι πληθυσμοί (είδη) φτάσουν σε κατάσταση αμοιβαίας μονοφυλετικότητας, μπορούν να οδηγήσουν σε πόλυ- ή πάρα φυλετικές καταστάσεις (δευτερογενή γονιδιακή ροή μεταξύ των παραγόμενων πληθυσμών) Ατελής επιλογή γενεαλογικών γραμμών (Incomplete lineage sorting) Διείσδυση γονιδιώματος (Introgression or Introgressive Hybridization)

105 Παράδειγμα μελέτης: Διείσδυση και επιλογή γενεαλογικών γραμμών στο mtdna του είδους Zosterops lateralis Αυτή η μελέτη τονίζει δύο σημαντικές αρχές: Η διείσδυση μπορεί να οδηγήσει σε ασυμφωνία μεταξύ του γονιδιακού και του οργανισμικού δέντρου Silvereye Zosterops lateralis photo Paul Sunnucks Η MtDNA ποικιλότητα ταξινομείται μέσα στους πληθυσμούς γρηγορότερα από τη πυρηνική ποικιλότητα Degnan (1993) Molecular Ecology 2,

106 Το Αυστραλιανό silvereye (Zosterops lateralis, με πράσινο χρώμα) είναι ένα ευρύτατα κατανεμημένο είδος των ανατολικών ακτών της Αυστραλίας (VIC, NSW, QLD), ενώ διαθέτει μικρότερους πληθυσμούς στα δυτικά (SA and WA). Η ανάλυση του mtdna έδειξε ότι οι ανατολικοί πληθυσμοί διαφέρουν από τους δυτικούς. Το συγγενικό του είδος, το κίτρινο silvereye (Z. lutea, με κίτρινο χρώμα) είναι πιο σπάνιο και διαθέτει ένα δυτικό πληθυσμό στο WA και ένα πιο ανατολικό στο NT/QLD. Ο δυτικός πληθυσμός του κίτρινου έχει διακριτό mtdna αλλά ο ανατολικός έχει mtdna που μοιάζει με αυτό του πράσινου.

107 Η παραφυλετικότητα παρατηρείται σε αρκετά είδη και μπορεί να ερμηνευθεί μέσω: (α) διείσδυσης γονιδιώματος μέσω υβριδισμού (διαειδική σύζευξη και ανάδρομη διασταύρωση των υβριδίων με άτομα των πατρικών πληθυσμών), (β) ατελούς επιλογής γενεαλογικών γραμμών εξαιτίας πρόσφατων γεγονότων ειδογένεσης και (γ) λανθασμένη ταξινόμηση που προκαλείται από τη λανθασμένη αναγνώριση της ενδοειδικής ποικιλότητας.

108 MtDNA introgression Η διείσδυση μπορεί να εξηγηθεί εάν κάποια στιγμή στο παρελθόν θηλυκά πράσινα άτομα συζεύκτηκαν με αρσενικά κίτρινα, οπότε ο πράσινος mtdna απλότυπος πέρασε στα κίτρινα. Η κίτρινος απλότυπος θα μπορούσε να εξαφανιστεί μέσω γενετικής παρέκκλισης. Αυτή διαδικασία ονομάζεται διείσδυση γονιδιώματος μέσω υβριδισμού όπου ο πράσινος mtdna απλότυπος εμφανίζεται μέσα στο κίτρινο έιδος

109 MtDNA introgression Διείσδυση του ανατολικού πράσινου mtdna στους ανατολικούς πληθυσμούς της του κίτρινου είδους. (Modified from Degan 1993). * Αυτό αποτελεί μια σημαντική αρχή: διείσδυση σαν αυτήν έχει ως αποτέλεσμα το γονιδιακό δέντρο να μην περιγράφει το οργανισμικό: άτομα τα οποία με βάσει όλα τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά είναι «κίτρινα» (συμπεριλαμβανόμενων της μορφολογίας, κατανομής και των πυρηνικών δεικτών που θα δούμε στη συνέχεια) έχουν «πράσινο» mtdna. Η ανάγκη να έχουμε γονιδιακά δέντρα από διαφορετικά γονίδια.

110 MtDNA lineage sorting Σε κάθε είδος παρατηρείται διάκριση σε ανατολικούς και δυτικούς πληθυσμούς (Ε/W divisions in each species)

111 Nuclear DNA Τα είδη είναι διακριτά, αλλά δεν υπάρχει ξεκάθαρη διάκριση ανατολικώνδυτικών πληθυσμών (E/W divisions).

112 Mt/nuc DNA mt / nuc αποκαλύπτουν διαφορετικές διαδικασίες mt τρέχει γρηγορότερα (E/W διαφοροποίηση) >1 δείκτες είναι απαραίτητοι