ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ ΤΟΥ LDL ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΟΙΚΟΓΕΝΗ ΥΠΕΡΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΑΙΜΙΑ ΣΤΗ ΒΟΡΕΙΟ ΥΤΙΚΗ ΕΛΛΑ Α. Μ 2, Ελισάφ Μ 1

Transcript

1 ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ ΤΟΥ LDL ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΟΙΚΟΓΕΝΗ ΥΠΕΡΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΑΙΜΙΑ ΣΤΗ ΒΟΡΕΙΟ ΥΤΙΚΗ ΕΛΛΑ Α Μιλτιάδου Γ 1, Μπαϊρακτάρη Ε 1, Ξενοφώντος Σ 2, Μανόλη Π 2, Καριόλου Μ 2, Ελισάφ Μ 1 1 Ιατρική Σχολή, Τοµέας Παθολογίας, Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων, 2 Ινστιτούτο Νευρολογίας και Γενετικής Κύπρου, Τµήµα Ταυτοποίησης Βιολογικών ειγµάτων Υπεύθυνος για την αλληλογραφία: Ελισάφ Μωϋσής, MD, FRSH Καθηγητής Παθολογίας Ιατρική Σχολή Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων Ιωάννινα Tel: Fax: me00521@cc.uoi.gr Βραχύς Τίτλος: Οικογενής υπερχοληστερολαιµία στη βορειοδυτική Ελλάδα

2 Περίληψη: ΣΚΟΠΟΣ: Η ανίχνευση των µεταλλάξεων που προκαλούν οικογενή υπερχοληστερολαιµία σε Έλληνες ασθενείς και η ανεύρεση της γεωγραφικής κατανοµής των συχνοτέρων µεταλλάξεων. ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟ ΟΣ: Στην µελέτη συµµετείχαν 112 ασθενείς στους οποίους τέθηκε η κλινική διάγνωση της ετερόζυγης οικογενούς υπερχοληστερολαιµίας. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Σε 101 ασθενείς (ποσοστό 90%) η κλινική διάγνωση επιβεβαιώθηκε σε γενετικό επίπεδο (94 ασθενείς ήταν ετεροζυγώτες και 7 ήταν οµοζυγώτες). Εκτός από τις µεταλλάξεις T517C, C858A, G1285A και G1646A που έχουν προηγούµενα περιγραφεί στην Ελλάδα, οι µεταλλάξεις T81G και G1775A περιγράφονται για πρώτη φορά σε Έλληνες ασθενείς. Επιπρόσθετα, η µετάλλαξη T1352C περιγράφεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία. Η µετάλλαξη G1775A είναι η συχνότερη µετάλλαξη στην περιοχή µας µε συχνότητα 33%. Όλοι οι οµοζυγώτες ασθενείς (n=7) έχουν τη µετάλλαξη G1775A, ένα εύρηµα που συνηγορεί για την παρουσία θεµελιώδους µετάλλαξης (founder effect). Η δεύτερη σε συχνότητα µετάλλαξη είναι η µετάλλαξη G1646A στο εξόνιο 11 του γονιδίου του LDLR (26,1%). Η µετάλλαξη G1285A στο εξόνιο 9 και η µετάλλαξη C858A στο εξόνιο 6 έχουν συχνότητα 13,6% και 12,5%, αντίστοιχα. εν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές στα επίπεδα των λιπιδαιµικών παραµέτρων µεταξύ των διαφόρων µεταλλάξεων. Αντίθετα, οι οµοζυγώτες ασθενείς εµφάνιζαν υψηλότερα επίπεδα ολικής χοληστερόλης, LDL χοληστερόλης, απολιποπρωτείνης Β και Lp(a) σε σύγκριση µε τους ετεροζυγώτες που έχουν την ίδια µετάλλαξη (p<0.02 για όλες τις συγκρίσεις). Παρατηρήθηκε σαφής γεωγραφική κατανοµή των συχνοτέρων µεταλλάξεων, η οποία είναι χρήσιµη για την κατάρτιση προγραµµάτων ελέγχου του

3 πληθυσµού της Βορειοδυτικής Ελλάδος που θα οδηγήσει στην έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία ασθενών µε οικογενή υπερχοληστερολαιµία. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: (α) Οι µεταλλάξεις του γονιδίου του LDL υποδοχέα που προκαλούν οικογενή υπερχοληστερολαιµία στην Bορειοδυτική Ελλάδα είναι οι µεταλλάξεις T81G, T517C, C858A, G1285A, T1352C, G1646A, και G1775A. (β)οι συχνότερες µεταλλάξεις εµφανίζουν σαφή γεωγραφική κατανοµή. (γ) Τα αποτελέσµατα αυτά θα βοηθήσουν στην έγκαιρη διάγνωση νέων ασθενών µε οικογενή υπερχοληστερολαιµία στον Ελληνικό πληθυσµό. Λέξεις κλειδιά: οικογενής υπερχοληστερολαιµία, µεταλλάξεις του LDL υποδοχέα, Ελληνικός πληθυσµός

4 Abstract: AIM: The aim of this study was the identification of the responsible LDLR gene mutations accounting for familial hypercholesterolemia (FH) in Greek patients and to determine, if any, the geographical distribution of these mutations. MATERIAL-METHODS: 112 patients with a clinical diagnosis of heterozygous FH in Northwestern Greece were participated in this study. RESULTS: The clinical diagnosis was confirmed at DNA level in 101 patients (90%) (94 patients were heterozygotes and 7 homozygotes). In addition to the previously described LDLR gene mutations T517C, C858A, G1285A and G1646A, two known mutations (T81C, G1775A) were also detected in the Greek population for the first time. Furthermore, the mutation T1352C was described as a novel point mutation in a Greek family originating from Northwestern Greece. The G1775A mutation in exon 12 was the most frequent (33%) and responsible for all the homozygous patients in our area (n=7), indicating a founder effect. Twenty-six (26) percent of the patients possessed the G1646A in exon 11. The frequencies of the G1285A (exon 9) and C858A (exon 6) mutations were 13,6% and 12,5%, respectively. The nature of the LDL receptor gene mutation did not significantly affect the lipid parameters. However, homozygous FH patients showed significantly higher levels of total and LDL cholesterol, apolipoprotein B and Lp(a) compared with heterozygous FH patients with the same mutation. Clear geographic distribution of the most common mutations was observed in our area. These data will favor the development of tailed information and screening programs in Northwestern Greece for the primary prevention of cardiovascular disease in FH patients.

5 CONCLUSIONS: (a) The responsible LDLR gene mutations accounting for FH in Northwestern Greece are the T81G, T517C, C858A, G1285A, T1352C, G1646A, and G1775A mutations. (b) Clear geographic distribution of the most common mutations was observed in our area. (c) The knowledge of the mutations and their distribution may favor the development of tailed information and screening programs based on these data. Key words: familial hypercholesterolemia, LDL receptor mutations, Greek population

6 Εισαγωγή: Η οικογενής υπερχοληστερολαιµία οφείλεται σε µεταλλάξεις του γονιδίου που κωδικοποιεί τον LDL υποδοχέα και κληρονοµείται µε τον επικρατούντα χαρακτήρα. Ο LDL υποδοχέας (LDLR) βρίσκεται στην επιφάνεια των ηπατοκυττάρων και εµφανίζει χηµική συγγένεια µε την απολιποπρωτείνη (apo) Β100 των χαµηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (LDL) 1. Η φαγοκύτωση του συµπλέγµατος υποδοχέα και σωµατιδίου LDL στο εσωτερικό του ηπατοκυττάρου έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση της LDL χοληστερόλης στο πλάσµα. Το σύνδροµο της οικογενούς υπερχοληστερολαιµίας οφείλεται σε µεταλλάξεις του γονιδίου που κωδικοποιεί τον LDLR µε αποτέλεσµα είτε την αδυναµία παραγωγής είτε την δυσλειτουργία του υποδοχέα και επακόλουθα την αύξηση της ολικής και LDL χοληστερόλης στο πλάσµα. Το γονίδιο που κωδικοποιεί τον LDLR βρίσκεται στο βραχύ σκέλος του χρωµοσώµατος 19 και αποτελείται από 18 εξόνια και 17 ιντρόνια. Υπάρχουν 5 τύποι µεταλλάξεων. Οι µεταλλάξεις τύπου I χαρακτηρίζονται από αδυναµία σύνθεσης του υποδοχέα. Οι τύπου II µεταλλάξεις είναι οι συχνότερες. Σε αυτές τις περιπτώσεις ο υποδοχέας παράγεται αλλά δεν µεταφέρεται από το ενδοπλασµατικό δίκτυο στη συσκευή Golgi. Στις µεταλλάξεις τύπου III ο υποδοχέας παράγεται και µεταφέρεται στην επιφάνεια του κυττάρου. Ωστόσο παρατηρείται µείωση της χηµικής συγγένειας του υποδοχέα µε την ApoB. Οι µεταλλάξεις τύπου IV κωδικοποιούν υποδοχείς που ανιχνεύονται στην επιφάνεια του κυττάρου, αναγνωρίζουν την apob100, υπάρχει όµως αδυναµία ενδοκύττωσης του συµπλέγµατος υποδοχέα LDL. Τέλος, στις µεταλλάξεις τύπου V ο υποδοχέας αποτυγχάνει να απελευθερώσει την LDL στο κυτταρόπλασµα και έτσι ο υποδοχέας δεν ανακυκλώνεται στην επιφάνεια του κυττάρου 2.

7 Τα επίπεδα της ολικής χοληστερόλης στο πλάσµα σε ασθενείς µε ετερόζυγο FH είναι περίπου διπλάσια των επιπέδων που παρατηρούνται σε φυσιολογικά άτοµα, ενώ οι οµοζυγώτες έχουν πολύ υψηλά επίπεδα που πολλές φορές ξεπερνούν τα 1000 mg/dl. Η FH χαρακτηρίζεται κλινικά από την παρουσία τενόντιων ξανθωµάτων, ξανθελασµάτων και γεροντότοξου. Επίσης οι ασθενείς εµφανίζουν πολύ συχνά στεφανιαία νόσο σε πολύ µικρότερη ηλικία σε σύγκριση µε το γενικό πληθυσµό 3. Η συχνότητα της ετερόζυγης µορφής στο γενικό πληθυσµό είναι 1:500, ενώ η οµόζυγος µορφή παρατηρείται πολύ σπάνια (1:1,000,000). Έχουν περιγραφεί περισσότερες από 600 µεταλλάξεις που προκαλούν το σύνδροµο της οικογενούς υπερχοληστερολαιµίας. Το είδος των µεταλλάξεων σαφή γεωγραφική κατανοµή. Υπάρχουν λίγα δεδοµένα στη βιβλιογραφία για τις µεταλλάξεις του LDL υποδοχέα που προκαλούν οικογενή υπερχοληστερολαιµία στον Ελληνικό πληθυσµό. Σκοπός της µελέτης µας ήταν η ανίχνευση των µεταλλάξεων του γονιδίου του LDLR που προκαλούν το σύνδροµο της FH στη Βορειοδυτική Ελλάδα και η αναγνώριση της γεωγραφικής κατανοµής τους. Υλικό και Μέθοδοι: Στην µελέτη µας συµµετείχαν 112 ασθενείς από διαφορετικές οικογένειες που παρακολουθούνται στο ιατρείο ιαταραχών του Μεταβολισµού των λιπιδίων του Πανεπιστηµιακού Περιφερειακού Γενικού Νοσοκοµείου Ιωαννίνων στους οποίους τέθηκε η κλινική διάγνωση της ετερόζυγης FH. Τα κριτήρια που χρησιµοποιήθηκαν για την διάγνωση φαίνονται στο πίνακα 1 4. Σε όλους τους ασθενείς ελήφθη αίµα για τον προσδιορισµό των λιπιδαιµικών παραµέτρων και την ανίχνευση των µεταλλάξεων του LDL υποδοχέα. Η αιµοληψία έγινε µετά από 14 ώρες νηστεία και ύστερα από γραπτή συγκατάθεση του ασθενή.

8 Μετά από φυγοκέντρηση για 30 λεπτά (3000g) έγινε διαχωρισµός του πλάσµατος από τα έµµορφα συστατικά. Τόσο το πλάσµα όσο και τα έµµορφα συστατικά τοποθετήθηκαν στους 4 0 C, ενώ πλάσµα για τον προσδιορισµό της Lp(a) καταψύχθηκε στους 70 0 C. Πρέπει να τονιστεί ότι κανένας ασθενής δεν έπαιρνε υπολιπιδαιµική αγωγή ή φάρµακα που επηρεάζουν το λιπιδαιµικό προφίλ. Το γενετικό υλικό (DNA) αποµονώθηκε από λευκά αιµοσφαίρια 4. Στην συνέχεια, µε τη χρήση της µεθόδου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) έγινε πολλαπλασιασµός του εναρκτή (promotor) και όλων των εξονίων (exons) του γονιδίου του LDLR 2. Η ανάλυση των µεταλλάξεων έγινε είτε µε ηλεκτροφόρηση σε πήγµα αγαρόζης µετά τη δράση περιοριστικών ενζύµων [για µεταλλάξεις που έχουν περιγραφεί προηγούµενα σε Έλληνες ασθενείς 6,7 ] είτε µε την ανεύρεση της αλληλουχίας των βάσεων του γενετικού κώδικα µε τη χρησιµοποίηση του γενετικού αναλυτή ABI PRISM 310. Η οικογενής ανεπάρκεια της apob100 αποκλείστηκε µε βάση το πρωτόκολλο των Tybjaerg- Hansen et al, Η ολική χοληστερόλη και τα τριγλυκερίδια στο πλάσµα προσδιορίστηκαν µε ενζυµικές µεθόδους µε τη βοήθεια του αναλυτή OLYMPUS AU 600. Ο προσδιορισµός της HDL χοληστερόλης έγινε ενζυµικά στο υπερκείµενο διάλυµα µετά από καθίζηση των άλλων λιποπρωτεϊνών µε το αντιδραστήριο δεξτράνη θεϊκού µαγνησίου. Η τιµή της LDL χοληστερόλης υπολογίστηκε από τον τύπο του Friedewald 9. Ο προσδιορισµός των τιµών των απολιποπρωτεϊνών στο πλάσµα έγινε µε ανοσονεφελοµετρία µε τη χρήση του αναλυτή Beckman (Beckman Instruments, CA, USA). Τέλος, η Lp(a) µετρήθηκε µε τη βοήθεια µονοκλωνικού αντισώµατος µε την ανοσοενζυµική µέθοδο Macra Lp(a) [(anti-lp(a) antibody technique by the enzyme immunoassay Macra Lp(a))- Temuro Medical Corporation Diagnostic Division, Elktron, MD].

9 Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων έγινε µε τη δοκιµασία Student s t-test, Mann-Whitney U test, καθώς και µε τη δοκιµασία µεταβλητότητας σε µία διεύθυνση (ANOVA). Αποτελέσµατα: Σε 101 ασθενείς (ποσοστό 90%) η κλινική διάγνωση επιβεβαιώθηκε σε γενετικό επίπεδο, ενώ σε 11 ασθενείς δεν έγινε δυνατή η ανίχνευση µετάλλαξης παρά την πλήρη ανάλυση του γονιδίου του LDL υποδοχέα. Ενενήντα-τέσσερις ασθενείς ήταν ετεροζυγώτες και 7 οµοζυγώτες. Οι υπεύθυνες µεταλλάξεις που προκαλούν FH στη βορειοδυτική Ελλάδα είναι επτά. Οι µεταλλάξεις T517C (FH Greece-1) στο εξόνιο 4, C858A (FH Greece-2) στο εξόνιο 6, G1285A (FH Afrikaner-2) στο εξόνιο 9 και G1646A (FH Genoa) στο εξόνιο 11 έχουν προηγούµενα περιγραφεί σε Έλληνες ασθενείς 6,7. Οι µεταλλάξεις T81G (FH San Francisco) στο εξόνιο 2 and G1775A (Sicily/Foggi/Naples4) στο εξόνιο 12 περιγράφονται για πρώτη φορά στον Ελληνικό πληθυσµό 10. Η µετάλλαξη T1352C στο εξόνιο 9 περιγράφεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία 11. Οι υπεύθυνες µεταλλάξεις, η συχνότητα τους και ο τρόπος ανίχνευσης τους φαίνονται στο πίνακα 2. Το λιπιδαιµικό προφίλ των ασθενών σε σχέση µε τις υπεύθυνες µεταλλάξεις φαίνεται στον πίνακα 3. εν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές στα επίπεδα των λιπιδαιµικών παραµέτρων µεταξύ των διαφόρων µεταλλάξεων. Αντίθετα, οι οµοζυγώτες ασθενείς εµφάνίζαν υψηλότερα επίπεδα ολικής χοληστερόλης, LDL χοληστερόλης, απολιποπρωτείνης Β και Lp(a) σε σύγκριση µε τους ετεροζυγώτες που έχουν την ίδια µετάλλαξη (p<0.02 για όλες τις συγκρίσεις).

10 Η γεωγραφική κατανοµή των συχνότερων µεταλλάξεων φαίνεται στο σχήµα 1. Όπως ήδη αναφέρθηκε, η µετάλλαξη G1775A αποµονώθηκε σε ασθενείς που κατάγονται από την περιοχή των Τζουµερκών. Ασθενείς που κατάγονται από τη Θεσπρωτία έχουν τη µετάλλαξη G1646A, ενώ η µετάλλαξη C858A αποµονώθηκε κυρίως σε ασθενείς που κατάγονται από τo νοµό της Πρέβεζας. Τέλος, ασθενείς που κατάγονται από την Αιτωλοακαρνανία έχουν τη µετάλλαξη G1285A. Συζήτηση: Στην µελέτη αυτή περιγράφονται οι µεταλλάξεις του LDL υποδοχέα που προκαλούν FH στη βορειοδυτική Ελλάδα και η γεωγραφική τους κατανοµή. Η µετάλλαξη G1775A είναι η συχνότερη µετάλλαξη στην περιοχή µας µε συχνότητα 33%. Η µετάλλαξη αυτή είναι υπεύθυνη για τους επτά οµοζυγώτες ασθενείς και ανιχνεύθηκε σε ασθενείς που κατάγονται από την περιοχή των Τζουµέρκων. Η ορεινή αυτή περιοχή εκτείνεται από τα Ιωάννινα µέχρι την πόλη της Άρτας, έχει πληθυσµό περίπου 3,000 κατοίκους και τουλάχιστον µέχρι πρόσφατα ήταν σχετικά αποµονωµένη. Η υψηλή συχνότητα οµοζυγωτών σε αυτή την περιοχή, καθώς και το γεγονός ότι η µετάλλαξη αυτή δεν έχει ανιχνευθεί σε άλλα διαµερίσµατα της χώρας υποδεικνύουν την παρουσία θεµελιώδους µετάλλαξης (founder effect). Πρέπει να αναφερθεί ότι αυτή η µετάλλαξη έχει επίσης περιγραφεί σε Ιταλούς και Γερµανούς ασθενείς µε οικογενή υπερχοληστερολαιµία 12. Η µετάλλαξη G1775A χαρακτηρίζεται ως µετάλλαξη τύπου V. Όπως ήδη αναφέρθηκε στις µεταλλάξεις τύπου V συντίθενται LDL υποδοχείς που ανιχνεύονται στην επιφάνεια του κυττάρου, αναγνωρίζουν την apob100, επιτυγχάνουν την ενδοκύτωση του συµπλέγµατος υποδοχέα LDL, αλλά αποτυγχάνουν να απελευθερώσουν την LDL στο κυτταρόπλασµα και έτσι οι

11 υποδοχείς αυτοί δεν ανακυκλώνονται στην κυτταρική επιφάνεια 2. Υπάρχουν αρκετά δεδοµένα που δείχνουν ότι οι ασθενείς που έχουν µεταλλάξεις τύπου V έχουν χαµηλότερα επίπεδα ολικής και LDL χοληστερόλης και εποµένως ηπιότερη κλινική έκφραση της νόσου σε σύγκριση µε ασθενείς που έχουν άλλου τύπου µεταλλάξεις 2. Αξίζει να σηµειωθεί ότι οι ασθενείς µας µε οµόζυγο FH που έχουν τη µετάλλαξη G1775A πληρούσαν τα κριτήρια για τη διάγνωση της ετερόζυγης FH. Πράγµατι, οι ασθενείς αυτοί είχαν σχετικά χαµηλές τιµές ολικής και LDL χοληστερόλης σε σύγκριση µε αυτές που αναφέρονται στη διεθνή βιβλιογραφία (πίνακας 4). Αρκετές µελέτες έδειξαν ότι οι ασθενείς µε FH έχουν υψηλότερη συγκέντρωση της Lp(a) σε σύγκριση µε νορµολιπιδαιµικά άτοµα της ίδιας ηλικίας και φύλου 13,14. Πράγµατι, σε µία παλαιότερη µελέτη της δικής µας ερευνητικής οµάδας οι ασθενείς µε ετερόζυγη FH είχαν υψηλότερες τιµές της Lp(a) στο πλάσµα σε σύγκριση µε φυσιολογικά άτοµα 15. Τα αποτελέσµατα της παρούσας εργασίας µας επιβεβαίωσαν αυτό το εύρηµα αφού η ενδιάµεση τιµή της Lp(a) στον ολικό πληθυσµό της µελέτης ήταν σηµαντικά υψηλότερη σε σύγκριση µε τη συγκέντρωση της Lp(a) που παρατηρείται στο γενικό πληθυσµό [ενδιάµεση τιµή (εύρος τιµών): 11.5 ( ) Vs 6.9 (0.8-24) p<0.01]. Όπως φαίνεται στο πίνακα 3, οι οµοζυγώτες ασθενείς για τη µετάλλαξη G1775A είχαν υψηλότερες τιµές της Lp(a) στο πλάσµα σε σύγκριση µε τους ετεροζυγώτες που έχουν την ίδια µετάλλαξη. Ωστόσο, οι οµοζυγώτες είχαν χαµηλότερες τιµές της Lp(a) στο πλάσµα σε σχέση µε οµοζυγώτες που έχουν άλλου τύπου µεταλλάξεις (πίνακας 4) 13,14. Έτσι, φαίνεται ότι ο τύπος της µετάλλαξης του γονιδίου του LDLR µπορεί να επηρεάσει όχι µόνο τις κλασσικές λιπιδαµικές παραµέτρους, αλλά και τα επίπεδα της Lp(a) 16. Η µετάλλαξη Τ1352C περιγράφεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία 11. Αρχικά η µετάλλαξη αυτή αποµονώθηκε σε γενετικό υλικό [µετά από ανεύρεση της

12 αλληλουχίας των βάσεων όλων των εξονίων και του εναρκτή του γονιδίου του LDLR 2 ] σε µία γυναίκα ηλικίας 42 ετών που πληρούσε τα κριτήρια για τη διάγνωση της νόσου (πίνακας 1). Στη συνέχεια, η µετάλλαξη αποµονώθηκε σε µέλη της οικογένειας της που είχαν υψηλά επίπεδα χοληστερόλης, ενώ αντίθετα µέλη της ίδιας οικογένειας µε φυσιολογικές τιµές χοληστερόλης δεν είχαν τη µετάλλαξη στο γενετικό τους υλικό. Επιπρόσθετα, περιγράφηκε µέθοδος ανίχνευσης της µετάλλαξης µε τη χρησιµοποίηση ενζύµου περιορισµού µε αποτέλεσµα την γρήγορη ανίχνευση αυτής της µετάλλαξης σε Έλληνες ασθενείς µε την κλινική διάγνωση της FH. Η δεύτερη σε συχνότητα µετάλλαξη είναι η µετάλλαξη G1646A στο εξόνιο 11 του γονιδίου του LDLR (26,1%). Η µετάλλαξη αυτή έχει προηγούµενα αποµονωθεί σε Ιταλούς και Έλληνες ασθενείς 2,6. Η µετάλλαξη G1285A στο εξόνιο 9 έχει συχνότητα 13,6% και έχει περιγραφεί σε πολλούς πληθυσµούς (Αφρική, Ολλανδία, Γερµανία και Ελλάδα) 6, Η µετάλλαξη C858A (12,5%). έχει προηγούµενα περιγραφεί σε Έλληνες, Αυστριακούς και Άγγλους ασθενείς 7,20. Στη µελέτη µας για πρώτη φορά ανιχνεύθηκε η µετάλλαξη T81G στο εξόνιο 2 σε Έλληνες ασθενείς (9.1%). Η µετάλλαξη αυτή έχει περιγραφεί στην Αµερική, Κροατία και Αγγλία (21, Database of LDLR gene mutations in FH: Τέλος, η µετάλλαξη T517C στο εξόνιο 4 έχει αποµονωθεί µόνο σε Έλληνες ασθενείς 6 και η συχνότητα της στη βορειοδυτική Ελλάδα είναι 3,4%. Όπως ήδη αναφέρθηκε, οι συχνότερες µεταλλάξεις εµφάνησαν γεωγραφική κατανοµή στα διαµερίσµατα της βορειοδυτικής Ελλάδας (σχήµα1). Η σαφής αυτή γεωγραφική κατανοµή θα βοηθήσει σηµαντικά στη δηµιουργία προγραµµάτων ελέγχου του πληθυσµού σε άτοµα υψηλού κινδύνου για την έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία της νόσου. Πράγµατι, η γνώση της υπεύθυνης µετάλλαξης θα επιτρέψει τη γρήγορη γενετική διάγνωση νεότερων σε ηλικία µελών της οικογένειας και την έγκαιρη

13 έναρξη επιθετικής υπολιπιδαιµικής θεραπείας. Επιπλέον, η καταγωγή νέων ασθενών µε κλινική διάγνωση FH καθιστά δυνατή την πιθανολόγηση της υπεύθυνης µετάλλαξης. Έτσι ο γενετικός έλεγχος µπορεί να γίνει πολύ γρήγορα και µε µικρότερο κόστος. Αξίζει να σηµειωθεί ότι οι µεταλλάξεις A902G ex6, A902C ex6, C681G ex4, G523A ex4, del 6 at 137 ex2, del G at 6 ex1 και del T at 2092 ex14 που έχουν προηγούµενα περιγραφεί σε Έλληνες ασθενείς ( δεν έχουν εντοπιστεί στον δικό µας πληθυσµό. Βιβλιογραφία: 1. Goldstein JL, Brown MS. Familial hypercholesterolaemia. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, editors. The Metabolic Basis of Inherited Diseases. New York: McGraw-Hill 1989, p Hobbs HH, Brown SM, Goldstein LJ. Molecular genetics of the LDL receptor gene in familial hypercholesterolemia. Hum Mut 1992, 1: Paul N Durrington. Hyperlipidaemia: Diagnosis and Management. Great Britain: Cambridge 1995, p Williams RR, Hunt SC, Schumacher MC et al. Diagnosing heterozygous familial hypercholesterolemia using new practical criteria validated by molecular genetics. Am J Cardiol 1993, 72: Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988, 16(3): Traeger-Synodinos J, Mavroidis N, Kanavakis E et al. Analysis of low density lipoprotein receptor gene mutations and microsatellite haplotypes in Greek FH

14 heterozygous children: six independent ancestors account for 60% of probands. Hum Genet 1998, 102: Mavroidis N, Traeger-Synodinos J, Kanavakis E et al. A high incidence of mutations in exon 6 of the low-density lipoprotein receptor gene in Greek familial hypercholesterolemia patients, including a novel mutation. Hum Mut 1997, 9: Tybjaerg-Hansen A, Steffensen R, Meinertz H et al. Association of mutations in the apolipoprotein B gene with hypercholesterolemia and the risk of ischaemic heart disease. N Engl J Med 1998, 338: Fridewald WT, Levy RI, Fredrickson DS. Estimation of the concentration of lowdensity lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin Chem 1972, 18: Miltiadous G, Elisaf M, Bairaktari E et al. Characterization and geographic distribution of the low density lipoprotein receptor gene mutations in northwestern Greece. Hum Mut 2001, 17(5): Miltiadous G, Elisaf M, Xenophontos S et al. Segregation of a novel LDLR gene mutation (I430T) with familial hypercholesterolemia in a Greek pedigree. Hum Mut 2000, 16(3): Esser V, Russell DW. Transport-deficient mutations in the low density lipoprotein receptor: Alterations in the cysteine rich and cysteine-poor regions of the protein block intracellular transport. J Biol Chem 1988, 263: Kraft HG, Lingenhel A, Raal FJ et al. Lipoprotein(a) in homozygous familial hypercholesterolaemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000, 20:

15 14. Guo HC, Chapman MJ, Bruckert E et al. Lipoprotein Lp(a) in homozygous familial hypercholesterolaemia: density profile, particle heterogeneity and apolipoprotein(a) phenotype. Arteriosclerosis 1991, 31: Elisaf M, Bairaktari E, Siamopoulos C. Lp(a) levels in Greek patients with heterozygous familial hypercholesterolemia. Intern J Cardiol 1996, 53: Miltiadous G, Tsimihodimos V, Bairaktari E et al. Lp(a) levels in patients with homozygous familial hypercholesterolemia. Arteriosclerosis 2001, 157: Leitersdorf E, Westhuyzen DR van der, Coetzee GA et al. Two common low density lipoprotein receptor gene mutation cause familial hypercholesterolemia in Africaners. J Clin Invest 1989b, 84: Desfesche JC, Van Dierman DE, Lansberg PJ et al. South African founder mutations in the low-density lipoprotein gene causing familial hypercholesterolemia in the Dutch population. Hum Genet 1993, 92: Schuster H, Fischer H J, Keller C et al. Identification of the 408 valine to methionine in the low density lipoprotein receptor in a German family with familial hypercholesterolemia. Hum Genet 1993, 91: Hobbs HH, Russell DW, Brown MS et al. The LDL receptor locus and familial hypercholesterolemia: mutational analysis of a membrane protein. Annu Rev Genet 1990, 24: Leitersdorf E, Reshef A, Meiner V et al. A missense mutation in the low density lipoprotein receptor gene causes familial hypercholesterolemia in Sephardic Jews. Hum Genet 1992, 91(2):

16 Πίνακας 1 Κριτήρια για διάγνωση της ετερόζυγης FH (βιβλιογραφία 4) Ηλικία (έτη) <18 1. Υψηλές τιµές ολικής χοληστερόλης(mg/dl) >360 >340 >290 > Φυσιολογικά τριγλυκερίδια (mg/dl) <200 <180 <150 <100 ή Υψηλές τιµές LDL χοληστερόλης (mg/dl) >260 >260 >220 > Αποκλεισµός υπερχοληστερολαιµίας που οφείλεται σε δευτεροπαθή αίτια 4. Ύπαρξη ενός παιδιού στην οικογένεια ηλικίας <18 ετών µε τιµή ολικής χοληστερόλης στο πλάσµα >270 mg/dl ή ύπαρξη τενόντιων ξανθωµάτων σε µέλη της οικογένειας 5. Σαφές οικογενειακό ιστορικό υπερχοληστερολαιµίας

17 Πίνακας 2 Μεταλλάξεις του γονιδίου του LDL υποδοχέα που προκαλούν FH στη βορειοδυτική Ελλάδα (n=101) ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΑΛΛΑΓΗ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ % ΤΡΟΠΟΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΣΤΟΝ ΑΜΙΝOΞΕΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΠΛΗΘΥΣΜΟ T81G C6W 9,1% A ΟΧΙ T517C C152R 3,4% B ΝΑΙ C858A S265R 12,5% A ΝΑΙ G1285A V408M 13,6% B ΝΑΙ T1352C I430T 2,3% A,B ΟΧΙ G1646A G528V 26,1% A ΝΑΙ G1775A G571E 33% A ΟΧΙ Α ανεύρεση αλληλουχίας βάσεων Β χρησιµοποίηση περιοριστικού ενζύµου

18 Πίνακας 3 A. Λιπιδαιµικό προφίλ των ασθενών µε ετερόζυγο FH (n=94) ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΟΛΙΚΗ ΤΡΙΓΛΥΚΕΡΙ ΙΑ HDL LDL apoa1 apob apoe Lp(a) ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ T81G 327±69 109±27 53±19 202±78 152±42 176±26 51± (5-12.8) T517C 284±21 83±15 47±7 231±32 134±11 153±17 44±1 13 ( ) C858A 338±53 158±89 48±10 259±42 143±19 184±18 53±9 8.4 ( ) G1285A 393±116 92±38 56±11 318± ±24 212±66 55± (5-32.4) T1352C 355±4 136±69 35±4 293±13 127±23 210±6 43±7 8.7 ( ) G1646T 333±37 113±77 50±21 249±49 138±20 176±29 47±12 11 (0.8-36) G1775A 327±70 106±53 49±10 255±69 142±25 174±41 57± ( ) µέση τιµή±σταθερή απόκλιση, Lp(a) ενδιάµεση τιµή (εύρος τιµών), mg/dl apo= απολιποπρωτείνη Lp(a)= λιποπρωτείνη (a) εν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές στα επίπεδα των λιπιδαιµικών παραµέτρων µεταξύ των διαφόρων µεταλλάξεων [µε τη δοκιµασία µεταβλητότητας σε µία διεύθυνση (ANOVA)] B. Λιπιδαιµικό προφίλ ασθενών οµόζυγων για τη µετάλλαξη G1775A (n=7) ΜΕΤΑΛΛΑΞ ΟΛΙΚΗ ΤΡΙΓΛΥΚΕΡΙ ΙΑ HDL LDL apoa1 apob apoe Lp(a) Η ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ G1775A 440±80 147±89 39±8 354±75 101±30 237±19 62± ( ) µέση τιµή±σταθερή απόκλιση, Lp(a) ενδιάµεση τιµή (εύρος τιµών), mg/dl

19 apo= απολιποπρωτείνη Lp(a)= λιποπρωτείνη (a)

20 Πίνακας 4 Επίπεδα ολικής χοληστερόλης και Lp(a) (mg/dl) σε ασθενείς µε οµόζυγο FH Ασθενείς µε µετάλλαξη τύπου V (G1775A) Αναφερόµενες τιµές στη βιβλιογραφία (Guo HC et al, 1991,βιβλιογραφία 19) Lp(a) Ενδιάµεση τιµή (εύρος τιµών) 16,15 ( ) 39,0 (21-116) T CHOL µέση τιµή ±σταθερή απόκλιση 440 ± ±205

21 Σχήµα 1 Γεωγραφική κατανοµή των συχνότερων µεταλλάξεων στη βορειοδυτική Ελλάδα Map not drawn to scale o ALBANIA o Konitsa G1646A odelvinaki W N E S Corfu ofiliates G1646A oigoumenitsa o Ioannina TZOUMERKA G1775A oparga C858A o Agrinio G1285A