ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ. ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Η ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΟΚΛΟΠΡΑΜΙ ΗΣ ΣΤΗΝ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗΣ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΟΥΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗΣ ΣΕ ΜΟΝΤΕΛΟ ΣΗΠΤΙΚΗΣ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙ ΑΣ. (Πειραµατική µελέτη σε επίµυες) ΤΣΙΑΟΥΣΗΣ Ζ. ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΙΑΤΡΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: ΠΑΠΑΖΙΩΓΑΣ Θ. ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΙΟΥΝΙΟΣ

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ...3 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.ΤΟΠΙΚΗ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΝΕΚΡΩΣΗΣ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΟΓΚΩΝ-α (TNF-α) ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΜΑΛΟΝΙΚΗ ΙΑΛ ΕΥ Η (MDA) ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΕΝ ΟΤΟΞΙΝΗ (LPS) ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Η ΝΕΥΡΟΕΝ ΟΚΡΙΝΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΚΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗΣ ΠΡΟΛΑΚΤΙΝΗ ΜΕΤΟΚΛΟΠΡΑΜΙ Η ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ...33 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ α. Πειραµατόζωα β. Πειραµατικό µοντέλο.39 1γ. Καταγραφή επιβίωσης και προσδιορισµός παραµέτρων δ. Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ α. Ανάλυση επιβίωσης β. Λευκά αιµοσφαίρια β. Παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF-α) γ. Μαλονική ιαλδεΰδη (MDA) δ. Ενδοτοξίνη (LPS) ΣΥΖΗΤΗΣΗ...52 ΠΕΡΙΛΗΨΕΙΣ 1.Στην ελληνική γλώσσα Στην αγγλική γλώσσα...60 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

3 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η Gram-αρνητική βακτηριακή σήψη και το επακόλουθο σύνδροµο ανεπάρκειας πολλαπλών οργάνων (multiple organ failure syndrome MOFS) παραµένουν οι κύριες αιτίες νοσηρότητας και θνητότητας µετά από σοβαρό τραύµα [1]. Πειραµατικές έρευνες έχουν δείξει ότι ο σύνδεσµος µεταξύ της κυτταρικής και της οργανικής δυσλειτουργίας, που σχετίζονται µε το MOFS, είναι στην αρχική αντίδραση του οργανισµού στην σήψη [2,3]. Η πρώιµη (1-4 ώρες) συστηµατική φλεγµονώδης απάντηση είναι αποτέλεσµα της ενεργοποίησης των µακροφάγων και της επακόλουθης παραγωγής των προφλεγµονωδών κυτοκινών, κυρίως της IL-1β, της IL-6 και του TNF-α [4,5]. Αυτά, λοιπόν, τα ενεργοποιηµένα µακροφάγα παίζουν το ρόλο των εξωκρινών µεσολαβητών, οι οποίοι εκκινούν και προάγουν την κυτταρική και οργανική δυσλειτουργία κατά την εξέλιξη της σήψης [6,7]. Αλλά και οι προφλεγµονώδεις κυτοκίνες, σε µικρές συγκεντρώσεις, συµµετέχουν στην ευόδωση βασικών κυτταρικών και χυµικών ανοσιακών µηχανισµών, όπως επίσης και στην προστασία έναντι του σηπτικού shock [8,9]. Τα τελευταία χρόνια ερευνάται εντατικά η υπόθεση της επικοινωνίας µεταξύ του ανοσιακού και του νευροενδοκρινικού συστήµατος, µια αλληλεπίδραση που εξυπηρετείται από κοινούς µεταβιβαστές και τους υποδοχείς τους, οι οποίοι παράγονται και εκφράζονται στα κύτταρα και των δύο συστηµάτων. Η προλακτίνη, µια νευροενδοκρινική πεπτιδική ορµόνη που παράγεται από τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, πιθανόν να παίζει σηµαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση µεταξύ του νευροενδοκρινικού και του ανοσοποιητικού συστήµατος [10,11,12,13], αποτελώντας έναν σηµαντικό µεσολαβητή αυτής της αλληλεπίδρασης. Είναι γνωστό ότι η προλακτίνη έχει διεγερτική επίδραση στον φυσιολογικό λεµφοκυτταρικό πολλαπλασιασµό και στη λειτουργία των σπληνικών λεµφοκυττάρων, τόσο in vitro όσο και in vivo [14,15]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι υποφυσεκτοµηθέντα ποντίκια παρουσίασαν έκδηλη καταστολή του ανοσοποιητικού τους συστήµατος, η οποία αποκαταστάθηκε µε τη χορήγηση προλακτίνης [16]. Τέλος, πειραµατόζωα στα οποία χορηγήθηκε βρωµοκρυπτίνη, µια ουσία που αναστέλλει την έκκριση της προλακτίνης, παρουσίασαν επηρεασµένες ανοσιακές απαντήσεις παρόµοιες µε αυτές υποφυσεκτοµηθέντων 3

4 πειραµατόζωων [17]. Οι κατεσταλµένες ανοσοαπαντήσεις σε αυτά τα πειραµατόζωα ανεστράφησαν µετά από θεραπευτική χορήγηση προλακτίνης. Η µετοκλοπραµίδη, ένας ντοπαµινεργικός αγωνιστής, αυξάνει την έκκριση και κατά συνέπεια την συγκέντρωση της προλακτίνης στο πλάσµα [13,18,19,20,21]. Αυτή η ευοδωτική στην έκκριση της προλακτίνης δράση της µετοκλοπραµίδης είναι πιθανώς το αποτέλεσµα του αποκλεισµού των υποδοχέων της ντοπαµίνης που προκαλεί η µετοκλοπραµίδη στον υποθάλαµο, αφού η ντοπαµίνη θεωρείται η ανασταλτική υποφυσιακή ορµόνη της προλακτίνης [22]. Λαµβάνοντας τα παραπάνω υπόψη, η έρευνα για το ρόλο της µετοκλοπραµίδης στην αλληλεπίδραση ανοσιακού και νευροενδοκρινικού συστήµατος αποτελεί ένα επιπλέον βήµα στην αποκωδικοποίηση της τελευταίας. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι η χορήγηση της µετοκλοπραµίδης αποκαθιστά την προκληθείσα, λόγω αιµορραγίας, καταστολή του πολλαπλασιασµού των σπληνικών λεµφοκυττάρων και την έκκριση κυτοκινών, µέσω συνακόλουθης αύξησης των επιπέδων της προλακτίνης στον ορό [13,19,20]. Επιπλέον, προτείνεται ότι η µετοκλοπραµίδη, πέραν του πιθανού ευεργετικού ρόλου της στην µετατραυµατική καταστολή του ανοσιακού µηχανισµού, παρουσιάζει και ευεργετικό ρόλο στην κυτταρική ανοσιακή απάντηση κατά τη διάρκεια της σήψης [18]. Η επίδρασή της όµως στην επιβίωση και στην εξέλιξη της συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης µετά από σήψη δεν έχει επαρκώς µελετηθεί. Σκοπός της παρούσας πειραµατικής εργασίας ήταν: 1. Η µελέτη της επίδρασης της µετοκλοπραµίδης στην επιβίωση επίµυων, µετά από την πρόκληση πολυµικροβιακής σηπτικής περιτονίτιδας. 2. Η µελέτη της επίδρασης της χορηγούµενης µετοκλοπραµίδης στην εξέλιξη της συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης. Ο προσδιορισµός της συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης έγινε µε τη µέτρηση των λευκών αιµοσφαιρίων στο αίµα και τριών παραγόντων στον ορό του αίµατος: του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (tumor necrosis 4

5 factor TNF-α), της µαλονικής διαλδεΰδης (MDA), ενός παραγώγου της υπεροξείδωσης των λιπαρών οξέων και σηµαντικό δείκτη της συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης, και της ενδοτοξίνης (LPS), βασικού δείκτη της ενδοτοξιναιµίας. Στο γενικό µέρος της εργασίας γίνεται καταρχήν µια προσπάθεια ανάλυσης της αλληλουχίας των γεγονότων που απαρτίζουν τη φλεγµονώδη απάντηση του οργανισµού σε πιθανή λοίµωξη, οποιασδήποτε αιτιολογίας. Στη συνέχεια δίνονται πληροφορίες για τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων, τη µαλονική διαλδεΰδη και τους λιπολυσακχαρίτες/ενδοτοξίνη, που χρησιµοποιήθηκαν ως δείκτες της εξέλιξης της συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης. Στη συνέχεια, αναλύεται η νευροενδοκρινική ρύθµιση της ανοσιακής απάντησης, µε επικέντρωση στο ρόλο του άξονα υποθαλάµου υπόφυσης ανοσιακού συστήµατος και κυρίως στη δράση της προλακτίνης. Τέλος, αναλύεται η θέση της µετοκλοπραµίδης (και της προλακτίνης) ως ανοσοτροποποιητικού παράγοντα στη συστηµατική φλεγµονώδη απάντηση. Στο ειδικό µέρος περιγράφεται αναλυτικά η χειρουργική µέθοδος που εφαρµόστηκε για την πειραµατική πρόκληση της σηπτικής περιτονίτιδας, παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα των µετρήσεων και γίνεται στατιστική ανάλυσή τους, προκειµένου να διαπιστωθεί η ύπαρξη στατιστικά σηµαντικών διαφορών. Στο τέλος παρατίθεται συζήτηση στην οποία γίνεται αξιολόγηση των αποτελεσµάτων των µετρήσεων. 5

6 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 6

7 1. ΤΟΠΙΚΗ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Η φλεγµονή αντιπροσωπεύει την πρωτογενή διεργασία, µε την οποία ο οργανισµός αµύνεται έναντι των λοιµώξεων και επιτυγχάνει την ανατοµική και λειτουργική αποκατάσταση των ιστικών βλαβών. Ο οργανισµός µέσω της φλεγµονώδους απάντησης προσπαθεί να περιορίσει την έκταση της βλάβης, να αντιρροπήσει τη πιθανή λοίµωξη και να προάξει την επούλωση των τραυµάτων και την αποκατάσταση των φυσιολογικών λειτουργιών [23]. Παθογενετικά η φλεγµονή αναπτύσσεται ως αποτέλεσµα της πολύπλοκης αλληλεπίδρασης µεταξύ παθογόνων, παρεγχυµατικών κυττάρων, ιστικών στοιχείων, αγγειακού δικτύου και συστατικών της υγρής και της κυτταρικής φάσης του αίµατος. Η τοπική φλεγµονώδης απάντηση αποτελεί στην ουσία µία σειρά γεγονότων που έχουν ως αποτέλεσµα την εµφάνιση των πέντε χαρακτηριστικών της φλεγµονής, δηλαδή της ερυθρότητας, της θερµότητας, του οιδήµατος, του άλγους και της απώλειας της λειτουργικότητας. Τα γεγονότα που οδηγούν στην εκδήλωση των χαρακτηριστικών αυτών είναι: α) τοπική αγγειοδιαστολή, η οποία προκαλεί υπεραιµία και είναι υπεύθυνη για την ερυθρότητα και θερµότητα. β) αύξηση της τριχοειδικής διαπερατότητας, η οποία οδηγεί στην εξαγγείωση: i. ορού και πλάσµατος, µε αποτέλεσµα την εµφάνιση οιδήµατος ii. πρωτεϊνών του πλάσµατος και ειδικότερα κινινών, οι οποίες προάγουν την έκλυση του πόνου, λόγω του ερεθισµού των νευρικών απολήξεων του πόνου iii. λευκών αιµοσφαιρίων µε φαγοκυτταρικές ιδιότητες, που σκοπό έχουν να καταστρέψουν ξένα αντιγόνα και νεκρωµένους ιστούς. Τα πρώτα λευκά αιµοσφαίρια που καταφτάνουν στον τόπο της εισβολής είναι τα ουδετερόφιλα, ακολουθούµενα από τα µακροφάγα και τα ηωσινόφιλα. Στην περίπτωση που τα κύτταρα αυτά δεν µπορέσουν να φαγοκυτταρώσουν και άρα να εξουδετερώσουν τα αντιγόνα, εκλύουν λυσοσωµικά ένζυµα στους γύρω ιστούς µε αποτέλεσµα την ιστική καταστροφή και επίταση των φαινοµένων της φλεγµονής. Τέσσερις είναι οι καταστάσεις που µπορούν να καταγραφούν µετά από µια οξεία φλεγµονή: 7

8 α) πλήρης αποκατάσταση των βλαβών µε αναγέννηση φυσιολογικού ιστού. β)επούλωση των ζηµιών µε δηµιουργία ουλής, αποτέλεσµα της αντικατάστασης του φυσιολογικού ιστού µε συνδετικό ιστό. γ) δηµιουργία αποστήµατος. δ) µετάπτωση σε χρόνια φλεγµονή. Ενώ όλα τα προαναφερόµενα είναι γνωστά, µόλις τα τελευταία χρόνια φαίνεται να αποκωδικοποιείται το µυστήριο που αφορά στον τρόπο µε τον οποίο δίνεται το έναυσµα για την εµφάνιση αυτού του καταρράκτη αντιδράσεων. Το ερώτηµα που τίθεται σήµερα είναι: ποια είναι η αιτία που οδηγεί στην αγγειοδιαστολή, στην αύξηση της τριχοειδικής διαπερατότητας και την εξαγγείωση διαφόρων κυττάρων στο σηµείο της βλάβης; Η αγγειοδιαστολή είναι ένα κλασικό χαρακτηριστικό της οξείας φλεγµονής και έχει σκοπό την διευκόλυνση της µεταφοράς διαλυτών διαβιβαστών και φλεγµονωδών κυττάρων στον τόπο του τραύµατος ή της λοίµωξης [23]. Η αγγειοδιαστολή πραγµατοποιείται µέσω του µονοξείδιου του αζώτου (ΝΟ) και των αγγειοδιασταλτικών προσταγλανδινών. Το ΝΟ παράγεται από την L-αργινίνη, µέσω της δράσης της συνθάσης του ΝΟ (ΝΟS), ενός ενζύµου που εντοπίζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα νευρικά κύτταρα και τα ενεργοποιηµένα λευκά αιµοσφαίρια [24]. Οι κύριες αγγειοδιασταλτικές προσταγλανδίνες είναι οι PGI2, PGD2, PGE2 και PGF2a, οι οποίες παράγονται από το αραχιδονικό οξύ µε την επίδραση της κυκλοξυγονάσης [25]. Στην περίπτωση που η τοπική φλεγµονή µεταπέσει στη συστηµατική φλεγµονώδη απάντηση, η αγγειοδιαστολή επεκτείνεται σε όλο τον οργανισµό και µπορεί να οδηγήσει σε υπόταση και καταπληξία [26]. Aυτές οι αγγειοδραστικές αλλαγές προάγονται από τη δράση του ΝΟ και κάποιων προφλεγµονωδών κυτοκινών, όπως είναι ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (tumor necrosis factor-α ή TNF-α) [27]. Το οίδηµα που παρατηρείται στη φλεγµονή οφείλεται στην µετακίνηση υγρού, πλούσιου σε πρωτεΐνες, από τον ενδαγγειακό χώρο στο διάµεσο κυτταρικό χώρο, ως αποτέλεσµα της δράσης της ισταµίνης, της βραδυκινίνης, των λευκοτριενών, των παραγόντων του συµπληρώµατος, της ουσίας P και του παράγοντα ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων (PAF) [28,29]. Οι παράγοντες αυτοί αυξάνουν τη διαπερατότητα των τριχοειδών και φλεβιδίων στο νερό και τις πρωτεΐνες [30]. Ταυτόχρονα, η τριχοειδική υδροστατική πίεση 8

9 αυξάνεται στο σηµείο του τραυµατισµού ή της λοίµωξης, λόγω της τοπικής αγγειοδιαστολής. Επιπλέον, η απώλεια πρωτεϊνών από τον ενδοαγγειακό χώρο οδηγεί σε ελάττωση της κολλοειδοσµωτικής πίεσης µέσα στα αγγεία. Αποτέλεσµα όλων αυτών των φαινοµένων είναι η µετακίνηση υγρού πλούσιου σε πρωτεΐνες στο διάµεσο χώρο, µε σκοπό την µεταφορά διαλυτών παραγόντων, όπως είναι τα αντισώµατα και οι πρωτεΐνες οξείας φάσης, στο σηµείο της βλάβης. Σε περίπτωση σοβαρής συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης η αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων µπορεί να είναι µεγάλη και να οδηγήσει σε πνευµονικό οίδηµα, το οποίο µε τη σειρά του µπορεί να προκαλέσει το σύνδροµο της οξείας αναπνευστικής ανεπάρκειας (acute respiratory distress syndrome - ARDS) [31]. Η αγγειοδιαστολή και η εξοίδηση πλάσµατος συνοδεύονται και από εξαγγείωση κυττάρων και ειδικότερα λευκών αιµοσφαιρίων. Τα πρώτα λευκά αιµοσφαίρια που εξαγγειώνονται είναι τα ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα. Τα ουδετερόφιλα µετακινούνται από το κεντρικό ρεύµα της αιµατικής ροής προς την περιφέρεια των αγγείων. Εκεί αναπτύσσονται χαλαρές συµφύσεις µε τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. Σηµαντικό ρόλο στη δηµιουργία των συµφύσεων αυτών επιτελούν οι σελεκτίνες. Οι σελεκτίνες είναι γλυκοπρωτεΐνες που εντοπίζονται στη κυτταρική επιφάνεια και εκφράζονται στα λευκά αιµοσφαίρια (L-σελεκτίνη), στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Ε-σελεκτίνη) και στα αιµοπετάλια (Π-σελεκτίνη). Εκτός από τις χαλαρές συµφύσεις οι σελεκτίνες συµβάλουν και στην κύληση (rolling) των ουδετερόφιλων πάνω στην επιφάνεια του ενδοθηλίου, γεγονός που επιτρέπει την επί µακρόν επαφή τους µε µια ανοµοιογενή οµάδα ουσιών, που φέρονται ως χηµειοτακτικοί παράγοντες. Οι χηµειοτακτικοί παράγοντες συνδέονται µε υποδοχείς των ουδετεροφίλων, γεγονός που εξυπηρετεί τη µετακίνηση των τελευταίων µέσω του αγγειακού τοιχώµατος στους ιστούς [32], αφού πρώτα προηγηθεί η ισχυρή σύνδεση των ουδετεροφίλων µε το ενδοθήλιο. Η ισχυρή αυτή προσκόλληση επιτυγχάνεται µε τη συνέργεια των ιντεγκρινών, οι οποίες είναι πρωτεΐνες που εκφράζονται στα λευκά αιµοσφαίρια και συνδέονται µε συγκεκριµένα µόρια και ειδικότερα το µόριο διακυτταρικής προσκόλλησης-i (intercellular adhesion molecule-i ή ICAΜ-I), που βρίσκεται πάνω στην κυτταρική επιφάνεια των ενεργοποιηµένων ενδοθηλιακών κυττάρων [33]. Μετά την ισχυρή προσκόλληση ακολουθεί η διαπήδηση (µετανάστευση) των 9

10 λευκών αιµοσφαιρίων προς την εστία της ιστικής βλάβης. Για να γίνει αυτό θα πρέπει τα κύτταρα να διεισδύσουν µέσα στο ενδοθήλιο, να διαπεράσουν την βασική µεµβράνη και να εισέλθουν στον διάµεσο κυτταρικό χώρο. Αυτό διευκολύνεται από την παρουσία άλλων µορίων προσκόλλησης, όπως είναι το PECAM-I (platelet-endothelial cell adhesion molecule-i), το οποίο εντοπιζόµενο τόσο στις πλάγιες επιφάνειες των ενδοθηλιακών κύτταρων, όσο και στα ουδετερόφιλα, αναστέλλει την προσκόλληση και προάγει µε τον τρόπο αυτό τη διαπήδηση [34]. Πέρα από την εκδήλωση των παραπάνω φαινοµένων, προκειµένου να γίνει η µετανάστευση των ουδετερόφιλων αλλά και των λοιπών λευκών αιµοσφαιρίων στο σηµείο του τραύµατος ή της λοίµωξης είναι απαραίτητη η παρουσία κάποιων µορίων που ονοµάζονται χυµοελκυστές (chemoattractants) στα οποία συµπεριλαµβάνονται κυτοκίνες (chemoattractant cytokines ή chemocines ή χηµειοκίνες), συστατικά του συµπληρώµατος και παράγωγα των µικροοργανισµών. Οι χηµειοκίνες είναι προϊόντα λευκών αιµοσφαιρίων, ενδοθηλιακών κυττάρων, αιµοπεταλίων και άλλων κυττάρων, παράγονται σε µεγάλες ποσότητες στον τόπο της βλάβης και σκοπό έχουν να προσελκύσουν και άλλα λευκά αιµοσφαίρια από τη συστηµατική κυκλοφορία [35]. Σηµαντικό ρόλο στην εξέλιξη της διαδικασίας της φλεγµονώδους απάντησης παίζει και ο πηκτικός µηχανισµός [23]. Η ενεργοποίησή του κατά τη διάρκεια της φλεγµονής επιτελείται µέσω του ιστικού παράγοντα (tissue factor). Ο ιστικός παράγοντας εκφράζεται σε επιφάνειες κυττάρων που φυσιολογικά δεν είναι εκτεθειµένα στα στοιχεία του αίµατος, όπως είναι ο υποδόριος ιστός. Σε περίπτωση τραύµατος, εγκαυµάτων, µεγάλων εγχειρήσεων αλλά και λοίµωξης, τα κύτταρα αυτά εκτίθενται στα συστατικά του αίµατος. Επιπλέον, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα µακροφάγα παράγουν στη διάρκεια της φλεγµονής τον ιστικό παράγοντα, σε απάντηση του ερεθισµού τους από τους TNF-α, IL-1, IL-6 και C-αντιδρώσα πρωτεΐνη [36]. Αποτέλεσµα της παρουσίας του ιστικού παράγοντα είναι η ενεργοποίηση του παράγοντα πήξης VII, ο οποίος στη συνέχεια σχηµατίζει ένα σύµπλεγµα µε τον ιστικό παράγοντα, το οποίο προκαλεί τη δηµιουργία θροµβίνης. Η παρουσία όµως της θροµβίνης και του συµπλέγµατος VIIa-ιστικού παράγοντα επιτείνει την προφλεγµονώδη δραστηριότητα, µέσω της επίτασης 10

11 της παραγωγής προφλεγµονωδών κυτοκινών, όπως είναι ο TNF-α, από τα µονοπύρηνα/µακροφάγα, αλλά και τα ενδοθηλιακά κύτταρα [37]. Φαίνεται εποµένως πως δηµιουργείται ένα κύκλωµα θετικής παλίνδροµης ρύθµισης, κατά το οποίο η οξεία φλεγµονή προκαλεί ενεργοποίηση του πηκτικού µηχανισµού, ο οποίος µε τη σειρά του επιτείνει την φλεγµονώδη απάντηση. Σε ό,τι αφορά στη συµµετοχή του συµπληρώµατος στην φλεγµονώδη απάντηση, αυτή είναι πολύ δυναµική και παρατηρείται τόσο µετά από λοιµώξεις, όσο και µετά από εκτεταµένα τραύµατα [38]. Η ενεργοποίηση του συµπληρώµατος µπορεί να γίνει µε τρεις οδούς, την κλασική, την εναλλακτική και την οδό της λεκτίνης, µε αποτέλεσµα την προαγωγή της χηµειοταξίας των λευκών αιµοσφαιρίων, τη διευκόλυνση της αναγνώρισης αντιγόνων από τα φαγοκύτταρα, την αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων και την εξουδετέρωση παθογόνων µικροοργανισµών. Κυρίαρχο ρόλο στην πορεία της φλεγµονώδους απάντησης διαδραµατίζει το ανοσιακό σύστηµα, ειδικό και µη ειδικό. Στην αρχή, σε απάντηση της ιστικής βλάβης ή της παρουσίας µικροοργανισµών ή άλλων γενικότερα αντιγόνων ενεργοποιείται το µη ειδικό ανοσιακό σύστηµα και ειδικότερα τα µακροφάγα των ιστών. Η ενεργοποίηση αυτή επιτελείται, µέσω της σύνδεσης µορίων που σχετίζονται είτε µε παθογόνους µικροοργανισµούς, όπως πολυσακχαρίτες, λιποπρωτεΐνες ή βακτηριακό DNA, είτε µε προϊόντα αποδόµησης των ιστών, µε ειδικούς µεµβρανικούς υποδοχείς των µακροφάγων, γνωστούς ως υποδοχείς αναγνώρισης µοριακών σχηµατισµών (pattern-recognition receptors PRRs) [39]. Μετά από αυτή τη σύνδεση ακολουθεί η ενεργοποίηση µέσα στο κυτταρόπλασµα παραγόντων, οι οποίοι εισερχόµενοι µέσα στον πυρήνα συνδέονται µε συγκεκριµένες περιοχές του DNA, δίνοντας το έναυσµα για την µεταγραφή των γονιδίων που κωδικοποιούν διάφορους προφλεγµονώδεις παράγοντες, όπως ο TNF-α και οι IL-12, IL-1β, IL-6, και IL-18. Το αποτέλεσµα αυτής της ενεργοποίησης είναι η παραγωγή και η απελευθέρωση από τα µακροφάγα µεγάλων ποσοτήτων από τους παράγοντες αυτούς, οι οποίοι δεν περιορίζονται µόνο στο σηµείο της βλάβης, αλλά µετακινούνται και προς τη συστηµατική κυκλοφορία µε σκοπό την ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων και άλλων λευκών αιµοσφαιρίων [40]. 11

12 Ο TNF-α µαζί µε την IL-1 φαίνεται πως είναι οι πρώτες προφλεγµονώδεις κυτοκίνες που εκκρίνονται [41]. Ο TNF-α απελευθερώνεται µέσα σε λίγα λεπτά της ώρας από τη στιγµή της λοίµωξης ή του τραύµατος από τα µονοκύτταρα και συµµετέχει στη ρύθµιση µιας σειράς µεταβολικών, αιµοδυναµικών και ανοσολογικών φαινοµένων τόσο τοπικά όσο και συστηµατικά. Η ιντερλευκίνη-1 (IL-1) παράγεται από τα ενεργοποιηµένα µονοπύρηνα φαγοκύτταρα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι φυσιολογικές λειτουργίες της είναι παρόµοιες µε αυτές του TNF-α, συµβάλλοντας έτσι στην ενεργοποίηση διαφόρων προφλεγµονωδών µηχανισµών [42]. Είναι η κατεξοχήν υπεύθυνη κυτοκίνη για την ενεργοποίηση του ινωδογόνου και τη δηµιουργία προπηκτικού περιβάλλοντος. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πως η IL-1 µαζί µε τον TNF-α είναι οι µόνες κυτοκίνες για τις οποίες έχει διαπιστωθεί η παρουσία φυσικών αναστολέων [43]. Επιπλέον, η χορήγηση ανταγωνιστών των υποδοχέων της IL-1 δεν αποτρέπει την πρόκληση διάχυτης ενδαγγειακής πήξης σε πειραµατόζωα, µετά από ενδοφλέβια χορήγηση δύο υποτοξικών δόσεων ενδοτοξίνης (συστηµατική αντίδραση Schwartzman) [44]. Η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) είναι άλλη µια κυτοκίνη που απελευθερώνεται κατά τη διάρκεια της φλεγµονής. Εκκρίνεται από τα ενεργοποιηµένα µονοπύρηνα φαγοκύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τους ινοβλάστες. Ο κύριος ρόλος της είναι η προαγωγή της έκκρισης πρωτεϊνών οξείας φάσης από το ήπαρ, όπως επίσης και η ανάπτυξη και διαφοροποίηση των Β- λεµφοκυττάρων [45,46]. Η επίµονη παρουσία της σε υψηλά επίπεδα στο πλάσµα πιθανό να σχετίζεται µε κακή πρόγνωση για τους πολυτραυµατίες και τους ασθενείς που βρίσκονται σε σήψη [47]. Σε ότι αφορά στις IL-12 και IL-8 και στην έκκρισή τους από τα µακροφάγα, φαίνεται πως η δράση τους σχετίζεται µε τη λειτουργία του ειδικού ανοσιακού µηχανισµού. Ειδικότερα, η IL-12 προάγει την διαφοροποίηση των CD4 + T λεµφοκυττάρων (T H 0 κύτταρα) σε T H 1 κύτταρα, τα οποία είναι ικανά να παράγουν ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) [48], ενώ η συνεργική δράση των IL-12 και IL-8 ενεργοποιεί την έκκριση της IFN-γ από τα T H 1 κύτταρα [49]. Η IFN-γ, µε τη σειρά της, προάγει την παραγωγή και έκκριση των προφλεγµονωδών κυτοκινών TNF-α (παράγοντας νέκρωσης των 12

13 όγκων), IL-1, IL-6, IL-8 και IL-15, όπως επίσης και δραστικών µορφών οξυγόνου (ROS). Ταυτόχρονα, περιορίζει την παραγωγή αντιφλεγµονωδών κυτοκινών, όπως είναι η IL-4 και η IL-10, από τα T H 2 λεµφοκύτταρα. Οι κυτοκίνες, γενικά, είναι µικρές πρωτεΐνες ή γλυκοπρωτεΐνες, οι οποίες ρυθµίζουν τον ανοσιακό µηχανισµό και τη φλεγµονώδη απάντηση. Παράγονται και εκκρίνονται από τα µακροφάγα ως αποτέλεσµα ανοσιακού ερεθίσµατος. Γενικά, δρουν σε τοπικό επίπεδο, για περιορισµένο χρονικό διάστηµα και σε πολύ µικρές συγκεντρώσεις. Μπορούν να δρουν πάνω στα ίδια τα κύτταρα που τις εκκρίνουν (αυτοκρινή δράση), σε γειτονικά κύτταρα (παρακρινή δράση) και λιγότερο συχνά σε αποµακρυσµένους στόχους (ενδοκρινή δράση) [50]. Η δράση τους επιτυγχάνεται µε τη σύνδεση τους µε συγκεκριµένους κυτταρικούς υποδοχείς. Ακολουθεί η ενεργοποίηση των δεύτερων αγγελιοφόρων, συνήθως τυροσινικών κινασών, οι οποίες τροποποιούν τη έκφραση συγκεκριµένων γονιδίων και εποµένως αλλάζουν τη συµπεριφορά των κυττάρων. Αυτή η αλλαγή της συµπεριφοράς «µεταφράζεται» σε παραγωγή και άλλων κυτταρικών υποδοχέων ή σε έκκριση άλλων προφλεγµονωδών κυτοκινών που προάγουν τη διαδικασία της φλεγµονώδους απάντησης ή σε έκκριση αντιφλεγµονωδών κυτοκινών που σκοπό έχουν τον περιορισµό της φλεγµονής [51]. ύο πολύ χαρακτηριστικές ιδιότητες των κυτοκινών είναι ο πλειοµορφισµός τους, η ικανότητα δηλαδή των κυτοκινών να δρουν σε πολλά διαφορετικά είδη κυττάρων και η εκδήλωση παρόµοιων λειτουργιών από διαφορετικές κυτοκίνες. Επιπλέον, οι κυτοκίνες µπορούν να δρουν συνεργικά ή ανταγωνιστικά. Υπάρχουν δύο µεγάλες κατηγορίες κυτοκινών, οι προφλεγµονώδεις και οι αντιφλεγµονώδεις. Οι πρώτες, στις οποίες υπάγονται µεταξύ άλλων οι TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, σκοπό έχουν την προαγωγή της φλεγµονώδους απάντησης του οργανισµού, ενώ οι δεύτερες, στις οποίες ανήκουν οι IL-4, IL- 10, IL-11 και IL-13, στοχεύουν στην εξουδετέρωση της δράσης των πρώτων και στην ύφεση της φλεγµονώδους απάντησης. Η υπερπαραγωγή της µιας ή της άλλης οµάδας κυτοκινών εµποδίζει την επίτευξη ή διατήρηση της οµοιόστασης και µπορεί να οδηγήσει, µε διαφορετικό µηχανισµό σε κάθε περίπτωση, στην βλάβη πολλαπλών οργάνων, λόγω επηρεασµού του αµυντικού µηχανισµού του οργανισµού [1,52]. 13

14 Η προαγωγή της φλεγµονής που επιτυγχάνουν οι προφλεγµονώδεις κυτοκίνες δεν περιορίζεται πάντα σε τοπικό επίπεδο. Είναι δυνατό, κάτω από κάποιες συνθήκες, να ενεργοποιηθεί µια γενικότερη απάντηση του οργανισµού που ονοµάζεται συστηµατική φλεγµονώδης απάντηση (systemic inflammatory response) και η οποία είναι υπεύθυνη για την εκδήλωση ενός κλινικού συνδρόµου που ονοµάζεται σύνδροµο συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης(systemic inflammatory response syndrome - SIRS) [53]. Το 1991 καθορίστηκε η σηµειολογία που ορίζει το φαινόµενο της συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης. Έτσι, ως σύνδροµο συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης (SIRS) ορίζεται η συστηµατική φλεγµονώδης απάντηση σε ένα πλήθος σοβαρών κλινικών καταστάσεων, που εκδηλώνεται µε την παρουσία δύο ή περισσότερων από τα παρακάτω σηµεία: 1) θερµοκρασία πάνω από 38 ο C ή κάτω από 36 ο C 2) σφύξεις πάνω από 90 ανά λεπτό 3) αναπνοές πάνω από 20 ανά λεπτό ή PaCO 2 <32mmHg και 4) ο αριθµός των λευκών αιµοσφαιρίων πάνω από ανά mm 3 ή κάτω από 4000 ανά mm 3 ή άωρες µορφές στο περιφερικό αίµα άνω του 10% [53]. Σήψη (sepsis) ονοµάζεται το SIRS, όταν οφείλεται σε λοίµωξη, ενώ ο όρος σοβαρή σήψη (severe sepsis) αναφέρεται στη σήψη που συνοδεύεται από ελαττωµένη αιµάτωση ή υπόταση και οργανική δυσλειτουργία [52]. Η σηπτική καταπληξία (septic shock) αποτελεί υποκατηγορία της σοβαρής σήψης και ορίζεται ως η προκαλούµενη από τη σήψη οξεία κυκλοφορική ανεπάρκεια (υπόταση), που επιµένει παρά την παρεντερική χορήγηση µεγάλης ποσότητας υγρών [52]. Η συστηµατική φλεγµονώδης απάντηση µετά από ένα καταρράκτη αλυσιδωτών αντιδράσεων µπορεί να καταλήξει σε ισχαιµικά φαινόµενα και υπόταση και στην πρόκληση βλάβης στη λειτουργία των οργάνων. Το αποτέλεσµα είναι η εµφάνιση του συνδρόµου βλάβης πολλαπλών οργάνων (multiple organ dysfunction syndrome - MODS), το οποίο είναι επίσης γνωστό και ως σύνδροµο ανεπάρκειας πολλαπλών οργάνων (multiple organ failure syndrome - MOFS), αν και ορισµένοι συγγραφείς θεωρούν πως οι δυο αυτοί όροι δεν είναι συνώνυµοι, αλλά το MOFS είναι µια εξαιρετικά σοβαρή εξέλιξη του MODS [54]. Η επιπλακείσα µε λοίµωξη συστηµατική φλεγµονώδης αντίδραση και η λόγω αυτής σηπτική καταπληξία αποτελεί την πιο συχνή αιτία θανάτου σε µη στεφανιαίες µονάδες (15% έως >60%). Τα τελευταία σαράντα 14

15 χρόνια δε φαίνεται να υπάρχει ιδιαίτερη βελτίωση της θνητότητας που προκαλεί η σήψη [55]. Προκειµένου να εκδηλωθεί η συστηµατική φλεγµονώδης απάντηση ως συνέχεια της τοπικής φλεγµονής είναι απαραίτητο να εισέλθουν στην συστηµατική κυκλοφορία προφλεγµονώδεις διαβιβαστές, όπως οι κυτοκίνες, οι ROS και το ΝΟ, οι οποίοι θα ασκήσουν την προφλεγµονώδη δράση τους συστηµατικά πλέον. Έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η συστηµατική φλεγµονώδης απάντηση, µέχρι κάποιο όριο (threshold), είναι παρούσα σε κάθε περίπτωση φλεγµονής, ως αποτέλεσµα της εισόδου των προφλεγµονωδών κυτοκινών στην συστηµατική κυκλοφορία και είναι απαραίτητη για την διατήρηση της οµοιόστασης. Σύµφωνα µε την άποψη αυτή, η παρουσία των κυτοκινών στο πλάσµα οδηγεί στην εκδήλωση πυρετού και στην παραγωγή πρωτεϊνών οξείας φάσης από το ήπαρ, όπως είναι η C-αντιδρώσα πρωτεΐνη, οι οποίες πιθανόν συνεπικουρούν στον έλεγχο της φλεγµονής. Επιπλέον, η παρουσία αυτή δίνει το έναυσµα για την ωρίµανση, πολλαπλασιασµό και έκκριση λευκοκυττάρων από το µυελό των οστών, ενώ η παρουσία του TNF-α αυξάνει τη δραστηριότητα του υποθαλαµο-υποφυσιακού άξονα που οδηγεί στην αυξηµένη σύνθεση υδροκορτιζόνης και στην ελάττωση της δραστηριότητας των θυρεοειδικών ορµονών. Παράλληλα προς όλα αυτά, ενεργοποιείται το συµπαθητικό νευρικό σύστηµα προκειµένου να εξυπηρετηθούν οι αυξηµένες µεταβολικές ανάγκες του οργανισµού. Όλες αυτές οι ενδοκρινικές διαταραχές προκαλούν αύξηση της ηπατικής γλυκονεογένεσης, περιφερική λιπόλυση και αποδόµηση των πρωτεϊνών, µε πιθανό τελικό σκοπό την παροχή στον οργανισµό των απαραίτητων συστατικών προκειµένου να ολοκληρωθεί επιτυχώς η φλεγµονώδης διαδικασία. Μερικές φορές όµως η συστηµατική φλεγµονώδης απάντηση υπερβαίνει το όριο. Το αποτέλεσµα είναι η εµφάνιση υπότασης, λόγω διαφόρου βαθµού γενικευµένης αγγειοδιαστολής και η εξαγγείωση πλάσµατος µε συνεπακόλουθη δηµιουργία οιδήµατος και καταστροφή των ενδοθηλιακών κυττάρων. Συνέπεια των παραπάνω φαινοµένων είναι ο επηρεασµός της αιµάτωσης των περιφερικών ιστών και οργάνων, που µπορεί να οδηγήσει σε ανεπάρκεια πολλαπλών οργάνων [55]. Ανάµεσα στις καταστάσεις που µπορούν να κινητοποιήσουν πέρα από τα φυσιολογικά όρια την συστηµατική φλεγµονώδη απάντηση 15

16 συµπεριλαµβάνονται οι λοιµώξεις, οι τραυµατισµοί, τα εγκαύµατα, οι χειρουργικές επεµβάσεις, που µπορεί να συνοδεύονται από µεγάλη διεγχειρητική απώλεια αίµατος, και η παρουσία ξένων σωµάτων (foreign body reaction) [52]. Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις απελευθερώνονται µεγάλες ποσότητες προφλεγµονωδών κυτοκινών και ιδίως TNF-α, IL-1 και IL- 6 στο πλάσµα. Επιπλέον, σε περιπτώσεις λοίµωξης είναι δυνατό να γίνει και εισβολή βακτηρίων ή ενδοτοξινών στη συστηµατική κυκλοφορία, ενώ παρόµοιο φαινόµενο µπορεί να εκδηλωθεί και σε καταστάσεις που µεταβάλλουν τη διαπερατότητα του τοιχώµατος του εντερικού σωλήνα, οπότε µετακινούνται βακτήρια και ενδοτοξίνες από τον εντερικό αυλό στο αίµα (υπόθεση «gut origin of sepsis» - βακτηριακή αλλόθεση) [56]. Η παρουσία στην κυκλοφορία βακτηρίων, ενδοτοξινών και προφλεγµονωδών κυτοκινών και η δίοδός τους από το ήπαρ συνεπάγεται την ενεργοποίηση των κυττάρων του Kupffer. Τα κύτταρα του Kupffer αποτελούν µέρος του δικτυοενδοθηλιακού συστήµατος του ήπατος και συνιστούν το 80-90% όλων των µακροφάγων των ιστών. Εκτός από τη φαγοκυτταρική τους ικανότητα έναντι των µικροβίων και των ξένων σωµατιδίων, αδρανοποιούν την ενδοτοξίνη και παράγουν πλήθος βιοενεργών ουσιών, κυτοκίνες (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8), προσταγλανδίνες και ελεύθερες ρίζες οξυγόνου [57]. Οι κυτοκίνες αυτές, όπως έχει ήδη αναφερθεί, σε υψηλές ποσότητες ασκούν µια συστηµατική δράση, µέσω της ενεργοποίησης και επίτασης της αλυσιδωτής αντίδρασης της συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης, η οποία µπορεί να οδηγήσει σε πολλαπλή οργανική ανεπάρκεια, ξεκινώντας από τους πνεύµονες και καταλήγοντας στους νεφρούς, και συνοδεύεται από υψηλά ποσοστά θνητότητας [58]. Επιπρόσθετα, η παρουσία των προφλεγµονωδών κυτοκινών σε µεγάλες συγκεντρώσεις στο αίµα συνοδεύεται και από επηρεασµό του αµυντικού µηχανισµού του οργανισµού. Πιο συγκεκριµένα, τα µόρια αυτά φαίνεται πως επηρεάζουν τα Τ και Β λεµφοκύτταρα, τα οποία οδηγούν σε έκπτωση της λειτουργικότητάς τους, µέσω ενός αρνητικού παλίνδροµου µηχανισµού, µε αποτέλεσµα να εµφανίζονται διαταραχές του ανοσιακού συστήµατος, που έχουν τους χαρακτήρες της ανοσοκαταστολής. Κάτω από τέτοιες συνθήκες ο οργανισµός είναι ευάλωτος σε τυχόν προσβολή από άλλα µικρόβια και, αν προσβληθεί, η πιθανότητα να µεταπέσει το SIRS σε σηπτική 16

17 καταπληξία και MOFS είναι ακόµα µεγαλύτερη, αυξάνοντας ακόµα περισσότερο το ποσοστό θνητότητας [23,3]. 2. ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΝΕΚΡΩΣΗΣ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΟΓΚΩΝ (TNF-α) ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Ως TNF φέρονται οι πρωτεΐνες TNF-α ή παράγοντας νέκρωσης των όγκων και TNF-β ή λεµφοτοξίνη, που έχουν αντίστοιχα, µοριακά βάρη 17 kda και 25 kda. Οι γενετικοί τόποι των δύο τύπων TNF εδράζονται, στενά συνδεδεµένοι, εντός του µείζονος συστήµατος ιστοσυµβατότητας (MHC), στο βραχύ σκέλος του χρωµοσώµατος 6 [24]. Τα αποτελέσµατα µελετών που αφορούσαν στον TNF-α σε πειραµατόζωα, µπορούν να µεταφερθούν άµεσα στον άνθρωπο, διότι η αλληλουχία των αµινοξέων του ανθρώπινου οργανισµού είναι ίδια κατά 80% µε αυτήν του ποντικιού και κατά 72% µε αυτήν του κονίκλου [23]. Τα κύτταρα που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή του TNF-α είναι κυρίως τα µονοπύρηνα φαγοκύτταρα, τα Τ- κύτταρα και τα κύτταρα φυσικοί φονιάδες (NK cells) [25]. Η ενδοφλέβια χορήγηση ραδιοσεσηµασµένου TNF-α σε ποντίκια προκαλεί τη συγκέντρωση του παράγοντα αυτού σε ποσοστό έως και 80%, σε 8 λεπτά, στο ήπαρ, στους νεφρούς, στο δέρµα, στους πνεύµονες και στο έντερο. Στα ίδια όργανα παρατηρείται αυξηµένη µεταγραφή TNF-α mrna κι εποµένως αυξηµένη παραγωγή TNF-α, µετά από τη χορήγηση ενδοτοξίνης. Επειδή σε ορισµένες εργασίες προσδιορίστηκε διαφορετικός χρόνος ηµίσειας ζωής (Τ1/2: 27 λεπτά), θεωρήθηκε ότι η in vivo κατανοµή του TNF-α είναι διαφορετική [26]. Ο TNF-α αποδοµείται γρήγορα στους περιφερικούς ιστούς του σώµατος, χωρίς να σχηµατίζονται ανιχνεύσιµα ενδιάµεσα µεταβολικά του προϊόντα. Παρά τη µεγάλη ποσότητα που φθάνει στους νεφρούς και το µικρό µοριακό του βάρος, µόνο 10% του χορηγούµενου ραδιοσεσηµασµένου TNF-α βρίσκεται στα ούρα. Αυτό ίσως οφείλεται στην ένωση µονοµερών που σχηµατίζουν πολυµερή µε Μ.Β. > ή στο γεγονός ότι ο TNF-α συνδέεται και µε άλλα συστατικά του ορού [27]. Η βιολογική δράση του TNF-α επιτελείται διαµέσου ειδικών κυτταρικών υποδοχέων. Όλα τα κύτταρα των θηλαστικών, µε εξαίρεση τα ερυθροκύτταρα, 17

18 έχουν υποδοχείς TNF-α ( υποδοχείς/κύτταρο), γεγονός που έχει ως αποτέλεσµα ο παράγοντας αυτός να δρα ευρέως στον οργανισµό. Μάλιστα, για την πλήρη εµφάνιση της δράσης του, αρκεί η κατάληψη σε ποσοστό µικρότερο του 5% του συνόλου των κυτταρικών του υποδοχέων [28]. ύο είναι οι βασικότεροι υποδοχείς του TNF-α, ο TNF-R1 (CD120a ή p55) (M.B. 55 kda) και ο TNF-R2 (CD120b ή p75) (M.B. 75 kda), οι οποίοι απαντώνται κυρίως στα επιθηλιακά κύτταρα και στα κύτταρα του αίµατος, ποτέ όµως στα ερυθροκύτταρα και στα µη-διεγερµένα Τ-λεµφοκύτταρα [29]. Οι υποδοχείς αυτοί ανήκουν σε µία ευρύτερη οικογένεια που περιλαµβάνει πρωτεϊνικούς υποδοχείς, όπως ο CD27, ο OX40 και το Fas αντιγόνο. Επειδή είναι διαλυτοί, ανευρίσκονται σε ιδιαίτερα υψηλές συγκεντρώσεις στον ορό, ακόµη και των φυσιολογικών ατόµων (1-4 ngr/ml), τα επίπεδά τους όµως αυξάνονται ακόµη περισσότερο σε παθολογικές καταστάσεις, όπως σε φλεγµονώδη νοσήµατα και νεφρική ανεπάρκεια [30]. Ο TNF-R1 εντοπίζεται κυρίως σε µη αιµοποιητικά κύτταρα και είναι υπεύθυνος για λειτουργίες όπως η κυτταροτοξικότητα, ο πολλαπλασιασµός ινοβλαστών και η ενεργοποίηση του παράγοντα µεταγραφής NF-κΒ, ο οποίος εισέρχεται στον πυρήνα των κυττάρων και ο οποίος πέρα από την προαγωγή της παραγωγής προφλεγµονωδών κυτοκινών µπορεί κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες να δώσει το έναυσµα για την παραγωγή του πρωτεολυτικού ενζύµου κασπάση- 8, η οποία συµµετέχει ενεργά σε ένα καταρράκτη αντιδράσεων που οδηγεί στην απόπτωση [31]. Ο υποδοχέας TNF-R2 βρίσκεται κυρίως σε αιµοποιητικά κύτταρα και προάγει την ανάπτυξη ινοβλαστών, την ενεργοποίηση του ενδοθηλίου και την αντιική δραστηριότητα [31]. Οι λιποπολυσακχαρίτες, που είναι παράγωγα του τοιχώµατος των Gram (-) βακτηρίων, είναι οι ισχυρότεροι από τους µέχρι τώρα γνωστούς διεγέρτες του TNF-α. Το γεγονός ότι οι λιποπολυσακχαρίτες και ο TNF-α έχουν παρόµοιες δράσεις, οδήγησε στο συµπέρασµα ότι ο TNF-α είναι ο κύριος µεσολαβητής της δράσης του πρώτου [32]. Κατά την είσοδό τους στον ορό, οι λιποπολυσακχαρίτες συνδέονται µε διάφορες πρωτεΐνες του ορού, όπως η πρωτεΐνη οξείας φάσης LBP (LPSbinding protein) και µέσω αυτών µεταφέρονται και στη συνέχεια συνδέονται µε τον ειδικό κυτταρικό υποδοχέα CD14 των µακροφάγων του ήπατος (κύτταρα 18

19 Kupffer), µε αποτέλεσµα την παραγωγή TNF-α και IL-1, οι οποίες αποτελούν τις πρώτες κυτoκίνες που εµφανίζονται και που µε τη σειρά τους ενεργοποιούν τα Τ-λεµφοκύτταρα [33]. Η συνεχής επίδραση των λιποπολυσακχαριτών προκαλεί αυξηµένη µεταγραφή του mrna, παραγωγή του οµόλογου TNF-α και, παράλληλα, αυξηµένη είσοδο Ca ++ στα κύτταρα και ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης Α2, µε αποτέλεσµα την αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης αραχιδονικού οξέος και προσταγλανδίνης Ε2 (PGE 2 ), η οποία είναι ισχυρός αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης C, αλλά και της µεταγραφής του γόνου του TNF-α στα µακροφάγα (µηχανισµός αρνητικής παλίνδροµης ρύθµισης). Παρόµοια δράση µε την PGE 2 έχει και η 5-λιποοξυγενάση διαµέσου και πάλι της πρωτεϊνικής κινάσης C [34]. Πειραµατικές εργασίες σε καλλιέργειες µακροφάγων έδειξαν ότι είναι απαραίτητη η συνεχής παρουσία των LPS για την παραγωγή TNF-α, αλλά ταυτόχρονα ότι υπάρχει ένα ανώτερο επίπεδο, τόσο στην ποσότητα όσο και στο χρόνο στον οποίο παράγεται ο TNF-α, ανεξάρτητα από την προοδευτική αύξηση της χορηγούµενης ποσότητας των LPS. Συγκεκριµένα υπολογίστηκε ότι παύει η παραγωγή του TNF-α περίπου 4-6 ώρες, µετά από την αρχική δράση των λιπολυσακχαριτών [35]. Η έντονη µεταγραφή και παραγωγή του TNF-α mrna σε διεγερµένα µακροφάγα in vitro διαπιστώνεται µέσα σε λίγα λεπτά από τη χορήγηση LPS. Ανιχνεύσιµες ποσότητες TNF-α εκκρίνονται σε λεπτά, ενώ το ανώτερο επίπεδο του TNF-α mrna παρατηρείται σε 2-3 ώρες. Το παραπάνω µοντέλο παραγωγής TNF-α είναι σταθερό για διάφορα είδη πειραµατοζώων, στα οποία οι LPS χορηγούνται είτε ενδοπεριτοναϊκώς, είτε µε ταχεία έγχυση (bolus) ή βραδεία ενδοφλέβια έγχυση. Ειδικά για τα ποντίκια, διαπιστώθηκε ότι η ταχεία (bolus) ενδοφλέβια χορήγηση LPS προκαλεί ανώτερα επίπεδα TNF-α µέσα σε 1,5-2 ώρες, ενώ εξαφανίζεται από την κυκλοφορία σε 3-5 ώρες [36]. Εκτός από τους LPS, παραγωγή TNF-α προκαλούν και άλλα στοιχεία του κυτταρικού τοιχώµατος των Gram(-) βακτηριδίων, όπως επίσης και ιοί, παράσιτα, µύκητες και Gram(+) βακτηρίδια. Αλλά και άλλες κυτοκίνες προάγουν την παραγωγή του TNF-α, όπως η IL-1, η IL-2, η ιντερφερόνη-γ (INF-γ), η ιντερφερόνη-α (INF-α) και οι παράγοντες διέγερσης αποικιών 19

20 (Colony Stimulating Factors CSFs) και ειδικά ο παράγοντας διέγερσης των αποικιών των κοκκιοκυττάρων και µακροφάγων (Granulocyte Macrophage- Colony Stimulating Factor, GM-CSF) [37,38]. Στα πλαίσια αυτών των ερευνών µελετήθηκαν επίσης διάφορες ουσίες που φαίνεται ότι αναστέλλουν την παραγωγή ή τη δράση του TNF-α, όπως τα κορτικοστεροειδή, οι προσταγλανδίνες, η πεντοξυφυλλίνη, τα ανοσοκατασταλτικά και τα anti-tnf-α αντισώµατα [39,40]. Όπως ήδη αναφέρθηκε, ο TNF-α είναι µία προφλεγµονώδης κυτοκίνη που έχει : α) αντικαρκινική δράση, β) συµµετοχή στη φλεγµονή και την ανοσία και γ) τοξική δράση [41]. Αποτελεί µία κυτταροστατική και τη µοναδική κυτταροκτόνο κυτοκίνη, µε ιδιαίτερες λυτικές ικανότητες έναντι των νεοπλασµατικών κυττάρων [42]. Ταυτόχρονα, αποτελεί µία κυτοκίνη µε αυτοκρινή, παρακρινή και ενδοκρινή δράση [42]. Τα τελευταία χρόνια διατυπώθηκε η άποψη ότι κάτω από φυσιολογικές συνθήκες η δράση του TNF-α περιορίζεται επίσης από τοπικούς, αλλά σηµαντικούς για την πορεία της φλεγµονής παράγοντες, όπως οι διαλυτοί υποδοχείς (soluble TNF receptors stnfr). Οι τελευταίοι µετρώνται σε υψηλά επίπεδα στην περιφερική κυκλοφορία σε περιπτώσεις βαρέων φλεγµονών και χρόνιων παθήσεων, όπως είναι ο καρκίνος [43]. Σε κάθε περίπτωση συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης ο TNF-α προκαλεί την έκκριση των stnfr από τα ίδια κύτταρα στα οποία παράγεται, ενώ η έγχυση TNF-α στον άνθρωπο αυξάνει τα επίπεδα των υποδοχέων του στην κυκλοφορία [44]. Σε περίπτωση ενδοτοξιναιµίας και σήψης, όπου τα επίπεδα TNF-α είναι υψηλά, ανευρίσκονται υψηλά και τα επίπεδα των stnfr. Οι λιποπολυσακχαρίτες αποτελούν έναν δεύτερο αυτόνοµο διεγέρτη της παραγωγής των stnfr, χωρίς να είναι απαραίτητη η παρουσία του TNFα. In vitro διέγερση ανθρώπινων µονοκυττάρων µε λιπολυσακχαρίτες από E.Coli ή N. Meningitides προκαλεί έκκριση κυρίως του TNF-R1 [45]. Η IL-1, που αποτελεί σηµαντικό µεσολαβητή της παθοφυσιολογίας της σήψης, επίσης, αποτελεί ισχυρό διεγέρτη των stnfr. Παρόµοια δράση βρέθηκε να έχουν τα πολυπεπτίδια fmlp,c5a, GM-CSF και η ελαστάση, οι κυτοκίνες IL-2, IL-6, IL-10, η προσκόλληση των ουδετεροφίλων και η υποξία [46,47]. 20

21 3. ΜΑΛΟΝΙΚΗ ΙΑΛ ΕΫ Η (MDA) ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (ΠΛΟ) αποτελούν συστατικά της καθηµερινής διατροφής και των κυτταρικών µεµβρανών, µε συνέπεια να διαδραµατίζουν βασικό ρόλο στη διατήρηση της δοµής και της ρευστότητάς τους. Η υπεροξείδωση των ΠΛΟ αποκτά ιδιαίτερη βιολογική σηµασία, γιατί οδηγεί στο σχηµατισµό ελεύθερων ριζών και τη δηµιουργία βιολογικά δραστικών αλδεϋδών. Η µαλονική διαλδεΰδη (MDA) αποτελεί ένα τέτοιο µεταβολικό προϊόν. Η παραγωγή MDA ανιχνεύεται σε αυξηµένα επίπεδα σε φλεγµονώδεις καταστάσεις [59,60], ενώ φαίνεται να διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην προαγωγή της βακτηριακής αλλόθεσης που έπεται της ισχαιµίας του εντερικού βλεννογόνου. Συγκεκριµένα σε καταστάσεις ισχαιµίας του εντερικού βλεννογόνου η αφυδρογονάση της ξανθίνης, ένζυµο κατ εξοχήν του κυτταροπλάσµατος των επιθηλιακών κυττάρων του εντερικού βλεννογόνου, µετατρέπεται σε οξειδάση, η οποία καταλύει την παραγωγή Ο - 2 και Η 2 Ο 2 [59] : ξανθίνη + 2Ο 2 +Η2Ο -> ουρικό οξύ + Ο Η 2 Ο 2. Η ΟΗ -, που συµµετέχει στη διαδικασία υπεροξείδωσης των ΠΛΟ, παράγεται από το Η 2 Ο 2 και τα σχηµατιζόµενα υπεροξείδια καταστρέφουν τον εντερικό βλεννογόνο, δίνοντας το έναυσµα για την έναρξη της βακτηριακής αλλόθεσης [61]. Τα ίδια υπεροξείδια καταστέλλουν τη συνθετάση της προστακυκλίνης µε αποτέλεσµα να διαταράσσεται η ισορροπία µεταξύ της ΤxΑ2 και της PGI2 στον αυλό των αγγείων υπέρ της πρώτης. Η ΤxΑ2 προάγει τη θρόµβωση των αρτηριδίων και την περαιτέρω ισχαιµία του εντέρου [62], δηµιουργώντας και εδώ ένα φαύλο κύκλο προαγωγής της βακτηριακής αλλόθεσης, αφού η ισχαιµία, που είναι απότοκη της αρτηριακής θρόµβωσης δίνει το έναυσµα για τη συνέχιση της υπεροξείδωσης των ΠΛΟ. Η σηµασία της µη ενζυµικής υπεροξείδωσης των ΠΛΟ στη φλεγµονώδη αντίδραση φαίνεται να είναι πιο πολύπλοκη, αφού έχει βρεθεί ότι η υπεροξείδωση ενός ΠΛΟ, που εδράζεται εστεροποιηµένο σ ένα υπόλειµµα φωσφατιδυλοχολίνης της κυτταρικής µεµβράνης, µπορεί να οδηγήσει στη βιοσύνθεση ενός µορίου µε δραστικότητα ανάλογη µ αυτή του παράγοντα ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων (PAF), ο οποίος είναι ένας σηµαντικός 21

22 µεσολαβητής της φλεγµονώδους αντίδρασης [63]. Η υπεροξείδωση των ΠΛΟ δεν αποκλείεται να αποτελεί και τµήµα φυσιολογικού αντιφλεγµονώδους µηχανισµού, αφού αναστέλλει την προσκόλληση των µακροφάγων στο ενδοθήλιο των αγγείων [64], αλλά και την έκκριση της IL-1β και της IL-10 και σε µικρότερο βαθµό του TNF-α από τα διεγειρόµενα µε LPS µονοπύρηνα µε δοσοεξαρτώµενο τρόπο [65]. Η αναστολή της ικανότητας προσκόλλησης των µακροφάγων οφείλεται σε αναστολή της γονιδιακής έκφρασης των υποδοχέων VCAM-1 και ELAM-1 των λευκοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων, η οποία µε τη σειρά της είναι απότοκη της αναστολής της ενεργοποίησης του παράγοντα NF-kB [64]. 4. ΕΝ ΟΤΟΞΙΝΗ (LPS) ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Οι λιποπολυσακχαρίτες (LPS) αποτελούν δοµικά συστατικά του τοιχώµατος των Gram(-) βακτηριδίων, των οποίων αντιπροσωπεύει το 65% του βάρους τους. Ελευθερώνονται σε µικρές ποσότητες από ζώντα βακτηρίδια, αλλά σε πολύ µεγαλύτερες ποσότητες, µετά από το θάνατο και την κυτταρική τους λύση. Με την απελεθεύρωσή τους στον εξωκυττάριο χώρο, συνδέονται µε πρωτεϊνικές ουσίες και φέρονται υπό µορφή µικυλλίων (ενδοτοξίνη - LPS). Η ύπαρξή τους είναι γνωστή από πολλές δεκαετίες, ταυτοποιήθηκαν όµως µόλις την τελευταία δεκαπενταετία, µετά από µελέτη των αποτελεσµάτων της χορήγησής τους σε πειραµατόζωα [66]. Τα µόρια των λιποπολυσακχαριτών απαρτίζονται από τρία κύρια τµήµατα (σχήµα 1): ένα εσωτερικό υδρόφοβο λιπίδιο-α, έναν ενδιάµεσο ολιγοσακχαρίτη-r και έναν εξωτερικό υδρόφιλο πολυσακχαρίτη-ο. Ο πολυσακχαρίτης-ο είναι ιδιαίτερος για κάθε στέλεχος µικροβίου και αποτελεί το κύριο αντιγονικό τµήµα, ενώ το λιπίδιο-α είναι υπεύθυνο για την τοξικότητα της ενδοτοξίνης και την προσκόλλησή της σε πρωτεΐνες του οργανισµού. Ο ολιγοσακχαρίτης-r αποτελεί σταθερή µονάδα της ενδοτοξίνης [67]. Η δράση της ενδοτοξίνης αρχίζει στον ξενιστή µέσα σε λίγα λεπτά και αφορά σε όλα τα συστήµατα. Αν και υπάρχουν ακόµη διαφωνίες, το αποτέλεσµα της δράσης αυτής εξαρτάται από τη χηµική της δοµή, την ποσότητά της, την προέλευσή της, την οδό ενοφθαλµισµού και το επίπεδο 22

23 ανοσίας του ασθενούς. Χορήγησή της σε µικρές δόσεις, σε εθελοντές, προκάλεσε ήπια συστηµατική φλεγµονώδη αντίδραση, πυρετό (38 O -39 O C), κεφαλαλγία, µυαλγία, ρίγος, ταχυκαρδία, φωτοφοβία, ναυτία, εµέτους, περιστασιακά υπόταση και παροδική ουδετεροπενία, ακολουθούµενη από ουδετεροφιλία και παραγωγή ηπατικών πρωτεϊνών οξείας φάσης. Μεγάλες ποσότητες ενδοτοξίνης είναι δυνατόν να προκαλέσουν ταχέως αιµοδυναµική αστάθεια, καταπληξία, ανεπάρκεια πολλαπλών οργάνων και θάνατο [68,69]. Η βιολογική δράση µικρών ποσοτήτων της ενδοτοξίνης συνοψίζεται στον πίνακα 1. Τα αποτελέσµατα της δράσης της ενδοτοξίνης είναι εµφανή σε όλα τα όργανα. Οφείλονται στην άµεση επίδρασή της, αλλά και στην έκκριση µέσω αυτής ορµονών και ιδιαίτερα των προφλεγµονωδών κυτοκινών (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) από τα µακροφάγα. Τα κύτταρα αυτά είναι περισσότερο ευάλωτα στην επίδραση της ενδοτοξίνης, διότι έχουν µεγάλη συγκέντρωση Ca ++ [67,70]. Όσον αφορά στην επίδρασή της στο ανοσολογικό σύστηµα, αυτή συνίσταται σε ειδική αντίδραση του τµήµατος του πολυσακχαρίτη-ο µε τα Β- λεµφοκύτταρα, σε έµµεση µη ειδική ενεργοποίηση των Β-λεµφοκυττάρων, µέσω της παραγωγής των κυτοκινών IL-6 και IL-11, σε ενεργοποίηση των Τ- λεµφοκυττάρων και των µακροφάγων και στην ενεργοποίηση των Β- λεµφοκυττάρων, µέσω παράγοντα διέγερσης αποικιών (CSF) [66,67,69]. Αυξηµένες συγκεντρώσεις ενδοτοξίνης προκαλούν µία κατάσταση ελαττωµένης ευαισθησίας του οργανισµού στην ενδοτοξίνη, που φαίνεται από την ελαττωµένη παραγωγή του TNF-α και ονοµάζεται «αντοχή έναντι της ενδοτοξίνης, endotoxin tolerance ETT». Η παρατήρηση αυτή, αν και ενδιαφέρουσα, δεν έχει ακόµη αξιοποιηθεί για την αντιµετώπιση της ενδοτοξιναιµίας [71]. 23

24 Σχήµα 1. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής των λιποπολυσακχαριτών. Πίνακας 1. Βιολογική δράση µικρών ποσοτήτων της ενδοτοξίνης. Κύρια σηµεία - συµπτώµατα Αιµοδυναµική απάντηση Απάντηση λευκοκυττάρων Μεταβολική απάντηση - πυρετός, - κεφαλαλγία, - ρίγος, - µυαλγίες, - φωτοφοβία, - ναυτία, έµετοι - ταχυκαρδία, - παροδική υπόταση - παροδική λευκοπενία, - εµµένουσα όψιµη λευκοκυττάρωση, - εµµένουσα λεµφοπενία και µονοκυτταροπενία - µεγάλες ανάγκες ενέργειας (αύξηση άνω του 20%), - αυξηµένη γλυκονεογένεση και γλυκογονόλυση, - αυξηµένος καταβολισµός πρωτεϊνών, υδατανθράκων και λιπών 5. Η ΝΕΥΡΟΕΝ ΟΚΡΙΝΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΚΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗΣ Σύµφωνα µε τη συνήθη θεώρηση, η ανοσιακή απάντηση εξετάζεται ως διεργασία που εξελίσσεται και ολοκληρώνεται εντός του αυτόνοµου πλαισίου ενός λειτουργικώς «κλειστού» ανοσιακού συστήµατος. Κλινικές παρατηρήσεις, εντούτοις, υποδεικνύουν ότι οι αµυντικοί µηχανισµοί δέχονται ρυθµιστικές επιδράσεις από το νευροενδοκρινικό σύστηµα, του οποίου, κατ' αντιστοιχία, 24

25 επηρεάζουν τη λειτουργία. Πέρα από τη λαϊκή δοξασία που θέλει ασθενείς σε τελικά στάδια θανατηφόρων νοσηµάτων να επιβιώνουν µε την ψυχική τους δύναµη, οι παρατηρήσεις αυτές καταγράφονται ήδη από την εποχή του Γαληνού, ο οποίος αναφέρει ότι οι µελαγχολικές γυναίκες είναι περισσότερο επιρρεπείς από τις αισιόδοξες, στην εµφάνιση καρκίνου. Στη σύγχρονη Ιατρική, είναι πλέον διάχυτη η αντίληψη ότι η κατάθλιψη και το stress συνοδεύονται από αυξηµένο κίνδυνο εκδήλωσης νοσηµάτων ανοσιακής αιτιολογίας, όπως καρκίνου, αυτοάνοσων νοσηµάτων και λοιµώξεων, συµπεριλαµβανοµένου ακόµη και του AIDS. Εξίσου παλαιά είναι και η προσπάθεια πειραµατικής επιβεβαίωσης των σχέσεων και των αλληλεπιδράσεων του ανοσιακού µε το νευρικό σύστηµα. Ήδη από το 1919 ο Ishigami είχε µελετήσει την οψονινοποίηση των µυκοβακτηριδίων, κατά τη διάρκεια της ενεργού και της ανενεργού φάσης της φυµατίωσης και είχε παρατηρήσει ότι η φαγοκυτταρική δραστηριότητα ελαττώνεται, όταν συνυπάρχει ισχυρό συναισθηµατικό stress, οδηγούµενος έτσι στο συµπέρασµα ότι το stress προκαλεί ανοσοκαταστολή και ευαισθησία στη νόσο. Η άποψη αυτή ενισχύθηκε µετέπειτα από σωρεία πειραµάτων, ώστε να εκφράζεται πλέον η υπόθεση ότι το ανοσιακό σύστηµα αποτελεί ένα εσωτερικό αισθητήριο όργανο, το οποίο αναγνωρίζει µη αντιληπτά ερεθίσµατα, όπως τα βακτήρια, τους ιούς και άλλα αντιγόνα και µεταδίδει πληροφορίες στο νευροενδοκρινικό σύστηµα, µέσω ορµονών που εκκρίνονται από τα λεµφοκύτταρα. Η λεπτοµερής, εντούτοις, διερεύνηση, τόσο των κλινικών παρατηρήσεων, όσο και των πειραµατικών ευρηµάτων, οδήγησε σε αντιφατικές και αµφιλεγόµενες ενδείξεις, η διαλεύκανση των οποίων προσκρούει κυρίως στις δυσχέρειες βιολογικής προτύπωσης των νευροψυχικών διαταραχών και σφαιρικής εκτίµησης των ανοσιακών λειτουργιών. Παρά ταύτα, τις τελευταίες δεκαετίες, έχει αθροισθεί τεράστιος όγκος πληροφοριών που πείθουν ότι το νευροενδοκρινικό και το ανοσιακό σύστηµα επικοινωνούν και αλληλεπιδρούν προς διατήρηση της οµοιόστασης του οργανισµού. Απόδειξη αυτού του γεγονότος αποτελεί η επιβεβαίωση της παραγωγής ορµονών και νευροπεπτιδίων από τα κύτταρα του ανοσιακού συστήµατος και διάφορων κυτοκινών, αντιστοίχως, από τους ενδοκρινείς αδένες, τα νευρικά κύτταρα και τη µικρογλοία [72]. Επιπλέον, υποδοχείς όλων αυτών των µορίων 25

26 έχουν εντοπισθεί στα κύτταρα, τόσο του ανοσιακού, όσο και του νευροενδοκρινικού συστήµατος (σχήµα 2). Η πολυπλοκότητα, βέβαια, των αντίστοιχων φαινοµένων είναι τέτοια, που δεν επιτρέπει ακόµη την ένταξη όλων αυτών των πληροφοριών σε ένα ολοκληρωµένο πλαίσιο βιολογικών µηχανισµών ή στη διατύπωση µιας ενιαίας θεωρίας. Νευροενδο κρινικό σύστηµα Ανοσιακό σύστηµα Ορµόνες Νευροµεταβιβαστές Κυτοκίνες Σχήµα 2. Η επικοινωνία ανοσιακού και ενδοκρινικού συστήµατος εξυπηρετείται από κοινούς µεταβιβαστές και τους υποδοχείς τους, οι οποίοι παράγονται και εκφράζονται στα κύτταρα και των δύο συστηµάτων. Υποδοχείς Η νευροενδοκρινική απάντηση στο stress Το stress αποτελεί, µέχρι στιγµής, το καλύτερα µελετηµένο πρότυπο νευροενδοκρινικής ρύθµισης της ανοσιακής απάντησης. Ανεξάρτητα από τη φύση του stress (φυσικό, χηµικό, ψυχοκοινωνικό), ο κοινός µηχανισµός δια του οποίου επηρεάζει τις ανοσιακές λειτουργίες, συνίσταται στη διέγερση του επινεφριδιακού φλοιού, αποτέλεσµα της οποίας είναι η έκκριση κορτικοστεροειδών και η διέγερση του συµπαθητικού νευρικού συστήµατος που εκφράζεται µε την απελευθέρωση κατεχολαµινών. Η νευροενδοκρινική και η συναισθηµατική απάντηση, που συνιστούν τη διεργασία προσαρµογής του οργανισµού στο stress, αρχίζουν µε την αξιολόγηση των στρεσσογόνων µηνυµάτων στο µεταιχµιακό σύστηµα του εγκεφάλου, όπου, µε τη µεσολάβηση των χολινεργικών συνδέσεων της διαφραγµατικής περιοχής του ιππόκαµπου, επιτυγχάνεται η σύγκρισή τους µε τις προηγούµενες εµπειρίες του ατόµου. Το µεταιχµιακό σύστηµα αποτελεί ταυτόχρονα και το σηµαντικότερο σχηµατισµό, µέσω του οποίου ο εγκεφαλικός φλοιός συνδέεται µε τον υποθάλαµο που, πρακτικά, θεωρείται ως απαγωγό σκέλος του εγκεφάλου. Ο υποθάλαµος, δηλαδή, προσλαµβάνει πληροφορίες από την περιφέρεια, τις επεξεργάζεται µέσα στο πλαίσιο του εσωτερικού περιβάλλοντος και προσαρµόζει ανάλογα τη συµπαθητική 26

27 δραστηριότητα και την ορµονική έκκριση. Η έκκριση ΑCΤΗ από τα κορτικοτρόπα κύτταρα της κεντρικής περιοχής του προσθίου λοβού της υπόφυσης αποτελεί την πρωταρχική ορµονική προσαρµοστική αντίδραση στο stress, γι' αυτό και η ΑCTΗ φέρεται ως η ορµόνη του stress. Ο υποθαλαµικός έλεγχος της έκκρισης της ΑCΤΗ ασκείται µέσω των παρακοιλιακών πυρήνων, οι οποίοι προβάλλουν στην πρόσθια υπόφυση, όπου απελευθερώνουν σειρά υποφυσιοτρόπων, πεπτιδικών κυρίως, ορµονών, όπως ο εκκριτικός παράγοντας της ACTH (CRF), η αγγειοτασίνη και η ωκυτοκίνη. Η υποθαλαµική έκκριση του CRF, που είναι ο κατ' εξοχήν ρυθµιστικός παράγοντας της έκκρισης της ΑCΤΗ, ελέγχεται από σειρά διεργασιών, στις οποίες συµµετέχουν οι κατεχολαµίνες και α1- αδρενεργικοί υποδοχείς. ιέγερση της έκκρισης της ΑCΤΗ προκαλείται, επίσης, από την αγγειοτασίνη και την ωκυτοκίνη, αλλά και απ' ευθείας από τις κατεχολαµίνες. Η έκκριση της ΑCΤΗ διεγείρει το φλοιό των επινεφριδίων προς έκκριση κορτικοστεροειδών, η επίδραση των οποίων στη λειτουργία του ανοσιακού συστήµατος έχει κατά κόρον µελετηθεί, όπως θα δούµε στη συνέχεια, λόγω της εκτεταµένης φαρµακευτικής χρήσης τους. Εντούτοις, εκτός της κορτιζόλης, το stress προκαλεί µεταβολές στην έκκριση διάφορων άλλων ορµονών, οι οποίες φαίνεται ότι ασκούν ανοσοτροποποιητική δράση. Η έκκριση της αυξητικής ορµόνης και της προλακτίνης διεγείρεται από το stress [73,74], ενώ καταστέλλεται η παραγωγή των γοναδοτροπινών και η λειτουργία των γονάδων. Στο χρόνιο, εντούτοις, και στο υποτροπιάζον stress, η έκκριση της αυξητικής ορµόνης και της προλακτίνης αναστέλλεται από την επίδραση, αντιστοίχως, της σωµατοστατίνης και της ντοπαµίνης, την παραγωγή των οποίων επάγει ο CRF. Το χρόνιο stress έχει, επίσης, αναφερθεί ότι συνοδεύεται από θυρεοειδική δυσλειτουργία και αυξηµένη έκκριση ενδογενών οπιοειδών. Νευροενδοκρινείς παράγοντες και ανοσοϊκανά κύτταρα Τα ανοσοϊκανά κύτταρα εκφράζουν ειδικούς υποδοχείς για ένα πλήθος νευροενδοκρινών παραγόντων, οι οποίοι κυκλοφορούν στο αίµα, συµπεριλαµβανοµένων της ΑCΤΗ, του VIΡ, της ουσίας Ρ, της προλακτίνης, της αυξητικής ορµόνης, των κορτικοστεροειδών, των κατεχολαµινών, της ακετυλχολίνης, των οπιοειδών, καθώς και διάορών ορµονικών εκλυτικών 27

28 παραγόντων. Η αλληλεπίδραση των υποδοχέων αυτών µε τους συνδέτες τους επάγει δευτέρα σήµατα (π.χ. cαμρ, cgμρ), τα οποία διεγείρουν ή τροποποιούν τη λειτουργία βασικών βιοχηµικών οδών που παρεµβαίνουν στον πολλαπλασιασµό, τη διαφοροποίηση και τη λειτουργία των ανοσοϊκανών κυττάρων. Έτσι, για παράδειγµα, η αύξηση του cαμρ επάγει τη σύνθεση ΤΝF-α, IL-2, ΙFN-γ και IL-12, ενώ αναστέλλει την παραγωγή IL-4,IL-5 και IL- 10. Κατά συνέπεια, η σύνδεση των υποδοχέων των Τ-κυττάρων µε νευροµεταβιβαστές που διεγείρουν τη σύνθεση της αδενυλικής κυκλάσης, προάγει την εκδήλωση Τ Η 2-απάντησης, ενώ η ελάττωση του ενδοκυττάριου cαμρ ευοδώνει την εµφάνιση Τ Η 1-απάντησης. Ανάλογα, λοιπόν, µε τα κύτταρα-στόχους και τη συγκέντρωσή τους, οι διάφοροι νευροενδοκρινείς παράγοντες ασκούν, µε αυτόν τον τρόπο, είτε διεγερτική, είτε κατασταλτική επίδραση επί των ανοσιακών λειτουργιών, η συνισταµένη των οποίων αποτελεί και την τελική έκφραση της ανοσοτροποποιητικής δράσης τους. Είναι διάχυτη η αντίληψη ότι η πολύπλοκη νευροενδοκρινική απάντηση που χαρακτηρίζει το stress, συνοδεύεται από ανοσοκαταστολή. Η αντίληψη αυτή στηρίζεται στην αυξηµένη ευαισθησία που παρουσιάζουν προς τις λοιµώξεις (φυµατίωση, λοιµώξεις του ανώτερου αναπνευστικού, υποτροπές χρόνιων ιογενών λοιµώξεων) άτοµα, τα οποία ζουν υπό συνθήκες stress. Σωρεία πειραµατικών ευρηµάτων υποστηρίζουν ότι το γεγονός αυτό παριστά τη συνισταµένη της ανοσοκατασταλτικής δράσης των κορτικοστεροειδών, των κατεχολαµινών και των οπιοειδών αφενός και της µείωσης της ανοσοενισχυτικής δράσης, την οποία συνεπάγεται η ελάττωση της αυξητικής ορµόνης και της προλακτίνης, αφετέρου. Η άµεση, εντούτοις, συσχέτιση των κλινικών παρατηρήσεων µε τα πειραµατικά ευρήµατα ενέχει σηµαντική αυθαιρεσία, είτε επειδή πολλά από αυτά είναι αντικρουόµενα, είτε επειδή υπάρχουν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των in vivo και των in vitro συνθηκών. Τα κορτικοστεροειδή για παράδειγµα, επηρεάζουν τις διάφορες ανοσολογικές παραµέτρους µε εντελώς διαφορετικό τρόπο στις φυσιολογικές απ ό,τι στις αυξηµένες συγκεντρώσεις και στις φυσικές απ' ό,τι στις συνθετικές µορφές τους. Είναι χαρακτηριστικό ότι, ενώ τα κορτικοστεροειδή µειώνουν την παραγωγή των κυτοκινών, η παραγωγή των προφλεγµονωδών κυτοκινών από τα µακροφάγα, τόσο κατά τη διάρκεια του 28

29 stress που συνοδεύει τις υποξείες και χρόνιες λοιµώξεις, όσο και µετά από την επαγωγή stress σε πειραµατόζωα, εµφανίζεται αυξηµένη. Αυτή, µάλιστα, η αύξηση της παραγωγής των κυτοκινών µετά από stress έχει ενοχοποιηθεί ως αιτιολογικός παράγοντας επιδείνωσης της φλεγµονής σε νοσήµατα αδιευκρίνιστης αιτιολογίας, όπως η ρευµατοειδής αρθρίτιδα. Αναφορικά, εξάλλου, µε την επιρρέπεια στις λοιµώξεις, είναι υπό εξέταση και το γεγονός κατά πόσο αποτελεί συνέπεια της ανοσοκατασταλτικής δράσης των κορτικοστεροειδών ή της άµεσης επίδρασης τους στα παθογόνα, όπως, π.χ., η ενεργοποίηση της µετάφρασης του προϊού του ΗIV. Ο ρόλος, όµως, των νευροενδοκρινών παραγόντων στη ρύθµιση της ανοσιακής απάντησης δεν καταδεικνύεται µόνο από την έκφραση αντίστοιχων υποδοχέων στα ανοσοϊκανά κύτταρα. Τα ενεργοποιηµένα κύτταρα του ανοσιακού συστήµατος είναι, επιπλέον, ικανά να συνθέτουν και να εκκρίνουν διάφορους νευροενδοκρινείς παράγοντες, όπως ΑCΤΗ, VIΡ, σωµατοστατίνη, θυρεοειδοτρόπο ορµόνη, αυξητική ορµόνη, προλακτίνη, πολλές ενδορφίνες και κατεχολαµίνες (πίνακας 2) [72]. Γενικά, η παραγωγή αυτών των παραγόντων από τα ανοσοϊκανά κύτταρα δεν ελέγχεται µόνο από τους Πίνακας 2. Τα κύτταρα του ανοσιακού συστήµατος που παράγουν πεπτιδικές ορµόνες και νευροµεταβιβαστές. Κύτταρα Πεπτίδια ή πρωτεΐνες ACTH, ενδορφίνες, TSH, χοριακή γοναδοτροπίνη, Τ-κύτταρα αυξητική ορµόνη, προλακτίνη, κατεχολαµίνες, IGF-I Β-κύτταρα ACTH, ενδορφίνες, αυξητική ορµόνη, IGF-I ACTH, ενδορφίνες, αυξητική ορµόνη, ουσία Ρ, IGF-I, Μακροφάγα κολπικό νατριουρητικό πεπτίδιο Σπληνικά κύτταρα LH, FSH, CRH Θυµοκύτταρα CRH, LHRH, αγγειοτασίνη, ωκυτοκίνη Σιτευτικά κύτταρα, VIP, σωµατοστατίνη πολυµορφοπύρηνα Μεγακαρυοκύτταρα Νευροπεπτίδιο Υ εκλυτικούς παράγοντες και τους αλληλορυθµιστικούς µηχανισµούς, που ρυθµίζουν τη λειτουργία των αντίστοιχων αδένων, αλλά επάγεται επιπλέον και από τα µιτογόνα και τα υπεραντιγόνα. Πρόκειται δε για de novo παραγωγή, η 29

30 οποία, σε αντίθεση µε εκείνη των ενδοκρινών αδένων, απαιτεί µακρό χρόνο (ώρες) και, κατά συνέπεια, από πλευράς ταχύτητας τουλάχιστον, είναι αδύνατον να εξισορροπήσει ενδεχόµενη υπολειτουργία των τελευταίων. Ποσοτικά, τα ανοσοϊκανά κύτταρα παράγουν ελάχιστες ποσότητες νευροενδοκρινών παραγόντων, είναι όµως ενδεχόµενο οι συνολικά παραγόµενες ποσότητες από τον τεράστιο αριθµό αυτών των κυττάρων να είναι σηµαντικές. Τα νευροενδοκρινή πεπτίδια που παράγονται από τα κύτταρα του ανοσιακού συστήµατος δρουν αυτοκρινώς ως ενδογενείς ρυθµιστικοί παράγοντες της αύξησης και της λειτουργίας τους, παρακρινώς επί άλλων κυττάρων, συµπεριλαµβανοµένων και των νευρώνων, ενώ υπάρχουν ενδείξεις ότι ασκούν και ενδοκρινή δράση. Χαρακτηριστικά, η προλακτίνη ευοδώνει αυτοκρινώς τα µακροφάγα και τα Τ-κύτταρα, στον πολλαπλασιασµό, στη διαφοροποίηση και στην ενεργοποίησή τους [74], ενώ, αντίθετα, οι κατεχολαµίνες προάγουν τόσο αυτοκρινώς, όσο και παρακρινώς, σε άλλα ανοσοϊκανά κύτταρα την απόπτωση. Το γεγονός αυτό, µάλιστα, έχει θεωρηθεί ότι αντιπροσωπεύει έναν αυτοκρινή κατασταλτικό µηχανισµό, ο οποίος εντάσσεται στο πλαίσιο του αιµατοεγκεφαλικού φραγµού και προστατεύει από την ανοσιακή προσβολή τις πλούσιες σε συνάψεις περιοχές του εγκεφάλου και, φυσικά, του περιφερικού νευρικού συστήµατος. Η εντυπωσιακότερη, όµως, παρακρινής δράση νευροπεπτιδίων ανοσιακής προέλευσης, είναι η αναλγησία, την οποία προκαλεί η β-ενδορφίνη, που παράγουν τα µακροφάγα, τα λεµφοκύτταρα και τα πλασµατοκύτταρα στο ση- µείο της φλεγµονής, µετά από τη σύνδεση της µε τους υποδοχείς των οπιοειδών στις απολήξεις των αισθητικών νεύρων [111]. Αξίζει, τέλος, να σηµειωθεί ότι σηµαντικό ανοσορρυθµιστικό ρόλο φαίνεται να διαδραµατίζει και η επίφυση. Ο φαρµακολογικός αποκλεισµός του αδένα και η επιφυσιεκτοµή έχουν ως αποτέλεσµα τη µείωση της πρωτογενούς παραγωγής αντισωµάτων και την ελάττωση της διέγερσης στη µεικτή καλλιέργεια λεµφοκυττάρων. Ανάλογες συνέπειες έχει και η παρατεταµένη έκθεση πειραµατόζωων στο φως. Η χορήγηση µελατονίνης αναστέλλει αυτά τα ανοσοκατασταλτικά φαινόµενα, µε αποτέλεσµα να θεωρείται ότι µπορεί να εξουδετερώσει και την προκαλούµενη από τα γλυκοκορτικοειδή ανοσοκαταστολή [75,76]. 30

31 Κυτοκίνες και νευροενδοκρινικό σύστηµα Οι κυτοκίνες αποτελούν ισχυρούς διεγέρτες του νευροενδοκρινικού συστήµατος. Οι IFNs είναι οι πρώτες κυτοκίνες που αποδείχθηκε ότι επιδρούν πάνω στα νευρικά κύτταρα και στα κύτταρα των ενδοκρινών αδένων, προάγοντας τη στεροειδογένεση, τη µελανινογένεση και την πρόσληψη ιωδίου, ενώ παράλληλα συνδέονται και µε τους υποδοχείς των οπιοειδών. Η IL-2 είναι ο ισχυρότερος εκκριτογόνος παράγοντας της ΑCΤΗ που έχει αναγνωριστεί µέχρι σήµερα, πολύ πιο ισχυρός ακόµη και από τον CRF [77]. Η IL-1 και, κατά δεύτερο λόγο, η IL-6 αντιπροσωπεύουν τους κύριους διεγέρτες του υποθαλαµο-υποφυσιο-επινεφριδιακού άξονα κατά τη διάρκεια της ανοσιακής απάντησης και της φλεγµονής. Η IL-1 επάγει την έκκριση ΑCTΗ, προάγοντας την παραγωγή CRF, ο οποίος, πέραν της άµεσης εκλυτικής δράσης του, ευαισθητοποιεί την υπόφυση στην άµεση εκκριτογόνο δράση της IL-1. Η IL-1 προκαλεί, επίσης, άµεση διέγερση των επινεφριδίων. Η δράση των κυτοκινών στα κύτταρα του νευροενδοκρινικσύ συστήµατος ασκείται µέσω των αντίστοιχων υποδοχέων που εκφράζονται, ανοµοιόµορφα κατανεµηµένοι, στην επιφάνεια των κυττάρων των διάφορων περιοχών του εγκεφάλου και των ενδοκρινών αδένων. Η ανοµοιογενής κατανοµή των υποδοχέων των κυτοκινών στο νευροενδοκρινικό σύστηµα υποδεικνύει το σηµαντικό ρόλο που ενδέχεται να διαδραµατίζουν στη µεταβίβαση των νευρικών µηνυµάτων και στις διαταραχές της συµπεριφοράς που προκαλούν οι κυτοκίνες, όπως, π.χ., η κατατονία που παρατηρείται µετά από ενδοκοιλιακή έγχυση IFN-α. Η έκφραση των υποδοχέων της IL-1 στο κεντρικό νευρικό σύστηµα και στην υπόφυση επηρεάζεται, όπως και στα λεµφοκύτταρα, από την ενδοτοξίνη, αλλά και από την ίδια την IL-1. Η έκφραση των υποδοχέων της IL- 1 στην υπόφυση επάγεται, επίσης, από τον CRF, γεγονός στο οποίο οφείλεται πιθανότατα και η µεσολαβούµενη από τον CRF ευαισθητοποίηση της υπόφυσης στην IL-1 [117]. Πιθανότατα, µάλιστα, το φαινόµενο αυτό είναι αντιπροσωπευτικό ενός γενικότερου πλαισίου αλληλεπίδρασης των κυτοκινών µε τις εκλυτικές ορµόνες του υποθαλάµου. Κατ' αυτήν την έννοια, ένα ήπιο ψυχολογικό ή φυσικό stress ενδέχεται να προκαλεί έκκριση CRF, ο οποίος ευαισθητοποιεί σηµαντικά την υπόφυση στην επίδραση των φλεγµονωδών κυτοκινών, µε τελικό αποτέλεσµα την εκσεσηµασµένη 31

32 παραγωγή γλυκοκορτικοειδών και την πρόκληση ανοσοκαταστολής. Προκειµένου η IL-1 να παρακάµψει τον αιµατοεγκεφαλικό φραγµό, για να ασκήσει τη δράση της στους εκκριτικούς νευρώνες του υποθαλάµου, φαίνεται ότι συνδέεται µε τους υποδοχείς της, που εκφράζονται στο επιθήλιο των εγκεφαλικών αγγείων. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη δευτερογενή έκκριση µορίων, όπως το ΝΟ ή οι προσταγλανδίνες, τα οποία δρουν τοπικά και ερεθίζουν τους νευρώνες. Επιπλέον, είναι πιθανόν ότι η IL-1 εισέρχεται από την αιµατική κυκλοφορία στο εγκεφαλικό παρέγχυµα από τα σηµεία των περικοιλιακών σχηµατισµών του εγκεφάλου, οι οποίοι στερούνται λειτουργικού αιµατοεγκεφαλικού φραγµού. Οι νευροενδοκρινείς ιστοί, όµως, δεν δέχονται µόνο την επίδραση των εξωγενών κυτοκινών. Όλες σχεδόν οι κυτοκίνες, που έχουν ανακαλυφθεί µέχρι σήµερα, παράγονται από διάφορα κύτταρα του νευροενδοκρινικού συστήµατος, επί των οποίων, αυτοκρινώς ή και παρακρινώς, ασκούν είτε διεγερτική, είτε τροφική, είτε ανοσιακού τύπου επίδραση. Κλασικό παράδειγµα αποτελεί η IL-1, που είναι η περισσότερο µελετηµένη ενδογενής κυτοκίνη του νευροενδοκρινικού συστήµατος [118]. Παράγεται από τα αστροκύτταρα, τη µικρογλοία, το ενδοθήλιο της εγκεφαλικής µικροκυκλοφορίας, από νευρώνες του υποθαλάµου και του προσθίου εγκεφάλου, καθώς και από τα θυρεοειδοτρόπα κύτταρα της υπόφυσης. Πέραν της εκκριτογόνου δράσης της, προκαλεί καταστολή του πόνου και της όρεξης και επαγωγή του ύπνου. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον, όµως, παρουσιάζει η συµµετοχή της IL-1 στις εκφυλιστικές διεργασίες των νευρώνων [118]. Ανάλογες πειραµατικές ενδείξεις, που έχουν προκύψει για τη συµµετοχή και άλλων κυτοκινών (π.χ. IL-5,IL-7,IL-9, ΤGF-β) στη ρύθµιση της διαφοροποίησης των νευρώνων, επιτρέπουν την υπόθεση ότι η πλαστικότητα των νευρώνων βρίσκεται, µερικώς τουλάχιστον, υπό τον έλεγχο του δικτύου των κυτοκινών και, κατ' επέκταση, ότι το ανοσιακό σύστηµα διαδραµατίζει κάποιο ρόλο στη διαµόρφωση της διασυνδεσιµότητας (connectivity) του νευρικού συστήµατος. 6. ΠΡΟΛΑΚΤΙΝΗ - ΜΕΤΟΚΛΟΠΡΑΜΙ Η ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΩ ΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Από τη δεκαετία του 1970, µε τις πρωτοποριακές πειραµατικές παρατηρήσεις του Besedovsky και των συνεργατών του [78], διατυπώθηκε η 32

33 θεωρία της αµφίδροµης ανταλλαγής πληροφοριών µεταξύ του ανοσιακού συστήµατος και του υποθαλαµο υποφυσιακο επινεφριδιακού άξονα (ΥΥΕ άξονας). Πιο πρόσφατα διατυπώθηκε η σκέψη πως φυλοσύνδετοι ορµονικοί παράγοντες πιθανόν να επηρεάζουν την ανοσιακή απάντηση στα πειραµατόζωα, αλλά και στους ανθρώπους [79]. Αρκετές µελέτες ερεύνησαν το ρόλο της προλακτίνης στην αλληλεπίδραση µεταξύ του ανοσιακού και του νευροενδοκρινικού συστήµατος [15, 80-89]. Η προλακτίνη έχει χρόνο ηµίσειας ζωής περίπου 20 λεπτών [90]. Όπως και µε τα γλυκοκορτικοειδή, η έκκριση της προλακτίνης από την υπόφυση υπόκειται σε κιρκάδιο ρυθµό, ενώ τροποποιείται περαιτέρω µέσω περιβαλλοντικών ερεθισµάτων, του καταµήνιου κύκλου, των στεροειδών ορµονών, των νευροδιαβιβαστών, των ανοσορυθµιστικών κυτοκινών και πολλών φαρµάκων. Η έκκριση της προλακτίνης αναστέλλεται τονικά από την ντοπαµίνη, έναν νευροδιαβιβαστή που εκκρίνεται από τον υποθάλαµο και ενεργεί σε ειδικούς υποδοχείς των λακτοτρόπων κυττάρων της πρόσθιας υπόφυσης. Το αντίθετο αποτέλεσµα, δηλαδή την άρση της τονικής αναστολής έκκρισης της προλακτίνης, µε αποτέλεσµα την άµεση έκκριση της τελευταίας, επιφέρουν οι ανταγωνιστικές προς την ντοπαµίνη ουσίες, όπως η µετοκλοπραµίδη. Η µετοκλοπραµίδη, 4-αµινο-5-χλωρο-Ν-[(2-διαυθυλαµινο)αιθυλο]-2- µεθοξυ βενζαµιδίνη, είναι ένας ανταγωνιστής της ντοπαµίνης, που ευαισθητοποιεί τις λείες µυϊκές ίνες στη δράση της ακετυλοχολίνης. Η αντιντοπαµινεργική της δράση στο κεντρικό νευρικό σύστηµα, που έχει ως αποτέλεσµα αφενός την αύξηση του ουδού του αντανακλαστικού του εµέτου και αφετέρου την επιτάχυνση της γαστρικής κένωσης, την καθιστά ένα µοναδικό αντιεµετικό φάρµακο. Ως διεγέρτης των λείων µυϊκών ινών, προκαλεί χάλαση του κατώτερου οισοφαγικού σφιγκτήρα και ελαττώνει το χρόνο κένωσης του στοµάχου. Εξαιτίας των ιδιοτήτων αυτών, η µετοκλοπραµίδη έχει χρησιµοποιηθεί µε επιτυχία στην αντιµετώπιση της γαστροοισοφαγικής παλινδρόµησης και του συνδρόµου της γαστρικής στάσης. Το φάρµακο απορροφάται ταχύτατα, επιτυγχάνοντας µέγιστες τιµές συγκέντρωσης στο πλάσµα εντός λεπτών. Η συνήθης δοσολογία του φαρµάκου είναι 10 mg από του στόµατος, τρεις µε τέσσερις φορές την ηµέρα, ενώ στις ανεπιθύµητές του ενέργειες, ιδιαίτερα όταν χορηγείται σε 33

34 µεγάλες δόσεις και παρατεταµένα, περιλαµβάνονται η υπνηλία, η νευρικότητα και οι δυστονικές εξωπυραµιδικές αντιδράσεις. Μια από τις απαντήσεις του Κεντρικού Νευρικού Συστήµατος (ΚΝΣ) σε ανοσολογικά ερεθίσµατα είναι η αύξηση της έκκρισης της ACTH και των γλυκοκορτικοειδών [91,92], όπως ήδη αναφέρθηκε. Οι κυτοκίνες TNF-α, IL-1 και IL-6 έχουν αναγνωρισθεί ως σηµαντικοί µεσολαβητές της απάντησης του ΥΥΕ άξονα στην ενεργοποίηση του ανοσιακού συστήµατος in vivo [93]. Τα γλυκοκορτικοειδή παρακωλύουν την έκκριση των TNF-α και IL-1 από τα µακροφάγα και ελαττώνουν την έκκριση των IFN-γ και IL-2 από τα Τ- λεµφοκύτταρα [94]. Η αναστολή του πολλαπλασιασµού των Τ-λεµφοκυττάρων αποτελεί την πιο συχνά παρατηρούµενη άµεση επίδραση της αύξησης των επιπέδων των γλυκοκορτικοειδών [95,96], η οποία έχει αποδειχθεί ότι οφείλεται στην καταστολή της παραγωγής της IL-2, της οποίας η παρουσία είναι υποχρεωτική για τον πολλαπλασιασµό αυτό [97,98]. Πειραµατικές µελέτες έχουν επισηµάνει ότι η ικανότητα των σπληνικών κυττάρων να απελευθερώνουν IL-2 καταστέλλεται, µετά από τραυµατική καταπληξία [99,100], καταστολή που µπορεί να αναστραφεί µε τη χορήγηση προλακτίνης [73]. Παρόµοια αποτελέσµατα είχαν και οι έρευνες του Bernton και των συνεργατών του [90], οι οποίοι έδειξαν σε δείγµατα σπληνός πειραµατοζώων, ότι ο πολλαπλασιασµός των λεµφοκυττάρων (ως απάντηση σε µιτογόνα Β- και Τ- κυττάρων) µετά από χορήγηση βρωµοκρυπτίνης (ενός ισχυρού ντοπαµινεργικού αγωνιστή) καταστέλλεται. Σε άλλες πειραµατικές εργασίες αποδείχθηκε ότι ανοσοκατασταλτικές δόσεις βρωµοκρυπτίνης ελαττώνουν τα επίπεδα προλακτίνης σε ποντικούς [85], ενώ η χορήγηση της ίδιας φαρµακευτικής ουσίας πάλι σε ποντικούς και σε δόσεις που προκαλούν καταστολή της έκκρισης της προλακτίνης, αυξάνει τη θνητότητα σε αντιγόνα λιστέριας, καταστέλλει την µεσολαβούµενη από Τ-λεµφοκύτταρα ενεργοποίηση των µακροφάγων και µειώνει την παραγωγή IFN-γ από τα Τ- λεµφοκύτταρα. Εντούτοις, όλες αυτές οι δράσεις αναστρέφονταν µε τη χορήγηση προλακτίνης [81]. Επίσης, σε υπερπρολακτιναιµικά ποντίκια παρατηρήθηκε ελάττωση της τριπλάσιας αύξησης των επιπέδων των κορτικοστεροειδών που είχε παρατηρηθεί σε νορµοπρολακτιναιµικά ποντίκια κάτω από συνθήκες stress [101]. 34

35 Ο µηχανισµός µε τον οποίο η προλακτίνη ασκεί την επίδρασή της στο ανοσιακό σύστηµα δεν είναι πλήρως κατανοητός. Παρόλα αυτά, τµήµα µιας πιθανής ανατοµικής βάσης των επιδράσεων αυτών ανακαλύφθηκε πρόσφατα, µε την ανεύρεση υποδοχέων της προλακτίνης σε ανθρώπινα µονοκύτταρα του αίµατος και σε ανθρώπινα και ζωικά Τ- και Β- λεµφοκύτταρα [102,103]. Τα λεµφοκύτταρα, επίσης, παράγουν µια πρωτεΐνη ανάλογη της προλακτίνης [104], που ίσως δρα ως αυτοκρινής κυτοκίνη, που προάγει τον λεµφοκυτταρικό πολλαπλασιασµό [104]. Η προλακτίνη είναι ικανή να επάγει την αποκαρβοξυλίωση της ορνιθίνης στα λεµφοκύτταρα, ένα ενζυµικό βήµα απαραίτητο στην έναρξη της ανοσιακής απάντησης [105,106]. Έχει περιγραφεί ότι η ίδια η προλακτίνη είναι µιτογόνος και ότι επάγει την απάντηση των Τ-λεµφοκυττάρων σε µιτογόνα [14,107]. Η προλακτίνη ενεργοποιεί το «µονοπάτι» της πρωτεϊνικής κινάσης C και ρυθµίζει την έκφραση ανοσολογικά συγγενών γονιδίων, όπως του C-myc [108]. Έχει επίσης προταθεί πως η ικανότητα των Τ-λεµφοκυττάρων να απαντούν πλήρως σε αντιγονικό ερεθισµό ίσως να εξαρτάται από τη σύνδεση της προλακτίνης σε ειδικούς υποδοχείς της µεµβράνης τους [109]. Τα Τ- λεµφοκύτταρα, µε την εµφάνιση του αντιγόνου, παράγουν ένα δευτερογενές σήµα, µε τη µορφή ενός πολυπεπτιδίου σχετιζοµένου µε την προλακτίνη και την αυξητική ορµόνη, το οποίο δρα αυτοκρινώς ή/και παρακρινώς, επάγοντας την ανοσιακή απάντηση. Οι Fletcher-Chiappini et al. αναφέρουν σε µελέτη τους [89] ότι η προλακτίνη έχει την ικανότητα να προστατεύσει κύτταρα λεµφώµατος από την δια των υποδοχέων των γλυκοκορτικοειδών µεσολαβούµενη απόπτωσή τους. Αυτή η αντι-αποπτωτική δράση της προλακτίνης ίσως µεσολαβείται δια του υποδοχέα της λακτοτρόπου ορµόνης. Άλλες µελέτες που υποστηρίζουν την επίδραση της προλακτίνης στον ΥΥΕ άξονα είναι αυτές των Parrot et al. [110] και Domanski et al. [111], στις οποίες υποστηρίζουν ότι τα οπιοειδή επάγουν την έκκριση της προλακτίνης και ότι η κατασταλτική δράση των β-ενδορφινών στην έκκριση της κορτιζόλης σε πειραµατόζωα υπό stress οφείλεται στη δράση της προλακτίνης. Η ενδοφλέβια χορήγηση µορφίνης ελάττωσε τα επίπεδα κορτιζόλης και αύξησε τα επίπεδα προλακτίνης σε αρσενικά πρόβατα υπό stress, ενώ η χορήγηση ναλοξόνης πέτυχε ακριβώς το αντίθετο. 35

36 Τέλος, ορισµένοι ερευνητές πρότειναν την υπόθεση της διπλής µορφής δράσης της προλακτίνης: στην ευπρολακτιναιµία η προλακτίνη ασκεί ευοδωτική ή προστατευτική δράση στο ανοσιακό σύστηµα, ενώ στην υπο- ή στην υπερ- προλακτιναιµία ασκεί κατασταλτική δράση σ αυτό [133,134]. 36

37 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 37

38 1. ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Πειραµατόζωα Τα πειράµατα διενεργήθηκαν στο Εργαστήριο Χειρουργικής Έρευνας της Β Χειρουργικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, στο Γ.Ν.Θ. «Γ. Γεννηµατάς» ( ιευθυντής: Κωνσταντίνος Ατµατζίδης, Καθηγητής Χειρουργικής), σύµφωνα µε τις κατευθυντήριες γραµµές της Οδηγίας 86/609/EEC της Ευρωπαϊκής Ένωσης, σχετικά µε την προστασία των ζώων που χρησιµοποιούνται για πειραµατικούς ή άλλους επιστηµονικούς σκοπούς. Ως πειραµατόζωα χρησιµοποιήθηκαν 74 συνολικά αρσενικοί WISTAR λευκοί επίµυες, ηλικίας εβδοµάδων, µε σωµατικό βάρος γραµµάρια (εικόνα 1). Όλα τα ζωικά πρότυπα παρέµειναν κατά τη διάρκεια της µελέτης σε µεταλλικά κλουβιά πέντε θέσεων, τα οποία βρίσκονταν σε ειδικά διαµορφωµένο χώρο του εργαστηρίου, υπό συνθήκες σταθερής θερµοκρασίας, σχετικής υγρασίας και ηµερήσιου δωδεκάωρου κύκλου φωτισµού. Λάµβαναν την ίδια ποιότητα και ποσότητα τροφής, ειδική για επίµυες, καθηµερινά, και είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε νερό. Εικόνα 1: Το πειραµατικό πρότυπο 38

39 Πειραµατικό µοντέλο Πειραµατικές οµάδες Από τα 74 συνολικά πειραµατόζωα, έξι δεν περιελήφθησαν σε αυτά του πειραµατικού µοντέλου, γιατί χρησιµοποιήθηκαν τα µεν δύο για την ταυτοποίηση του πειράµατος και τη διερεύνηση των δυνατοτήτων εκτέλεσης όλων των χειρισµών που απαιτούσε το πειραµατικό πρωτόκολλο, τα δε τέσσερα εξαιρέθηκαν, προκειµένου να διενεργηθεί αιµοληψία, της οποίας οι προσδιορισθείσες αιµατολογικές και βιοχηµικές παράµετροι χρησίµευσαν ως τιµές σύγκρισης για την εξαγωγή συµπερασµάτων, µετά από την εκτέλεση του πειράµατος. Εποµένως, τα τελικά αποτελέσµατα του πειραµατικού µοντέλου αναφέρονται σε 68 πειραµατόζωα, τα οποία χωρίστηκαν σε τέσσερις οµάδες. Στην πρώτη οµάδα (Α) συµπεριελήφθησαν 20 πειραµατόζωα και µελετήθηκε η επιβίωσή τους. Τα πειραµατόζωα χωρίστηκαν σε δύο ισάριθµες υποοµάδες, την υποοµάδα Α1, που αποτέλεσε την πειραµατική οµάδα ελέγχου και την υποοµάδα Α2, που αποτέλεσε την πειραµατική οµάδα µελέτης. Όλα τα πειραµατόζωα της οµάδας υπεβλήθησαν σε λαπαροτοµία και πρόκληση σηπτικής περιτονίτιδας, µετά από διάτρηση και απολίνωση του τυφλού (cecal ligation and puncture CLP). Πριν από τη σύγκλειση του χειρουργικού τραύµατος, στα µεν πειραµατόζωα της υποοµάδας Α1 χορηγήθηκε υποδορίως φυσιολογικός ορός (saline S), στα δε ζωικά πρότυπα της υποοµάδας Α2 χορηγήθηκε υποδορίως µετοκλοπραµίδη (metoclopramide MCP). Στην δεύτερη οµάδα (Β) συµπεριελήφθησαν 16 πειραµατόζωα και µελετήθηκε η εξέλιξη της συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης στο πρώτο εξάωρο, µετά από την εγκατάσταση της σηπτικής περιτονίτιδας. Τα πειραµατόζωα χωρίστηκαν σε δύο ισάριθµες υποοµάδες, στην υποοµάδα Β1, που αποτέλεσε την πειραµατική οµάδα ελέγχου και στην υποοµάδα Β2, που αποτέλεσε την πειραµατική οµάδα µελέτης. Όλα τα πειραµατόζωα της οµάδας υπεβλήθησαν σε λαπαροτοµία και πρόκληση σηπτικής περιτονίτιδας, µετά από διάτρηση και απολίνωση του τυφλού (CLP). Πριν από τη σύγκλειση του χειρουργικού τραύµατος, στα µεν πειραµατόζωα της υποοµάδας Β1 χορηγήθηκε υποδορίως φυσιολογικός ορός (saline S), στα δε 39

40 πειραµατόζωα της υποοµάδας Β2 χορηγήθηκε υποδορίως µετοκλοπραµίδη (MCP). Σε όλα τα ζωικά πρότυπα της δεύτερης οµάδας (Β) διενεργήθηκε αιµοληψία από την πυλαία φλέβα, 6 ώρες µετά από την εγκατάσταση της σηπτικής περιτονίτιδας. Στην τρίτη οµάδα (Γ) συµπεριελήφθησαν 16 πειραµατόζωα και µελετήθηκε η εξέλιξη της συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης στο πρώτο δωδεκάωρο, µετά από την εγκατάσταση της σηπτικής περιτονίτιδας. Τα πειραµατόζωα χωρίστηκαν σε δύο ισάριθµες υποοµάδες, στην υποοµάδα Γ1, που αποτέλεσε την πειραµατική οµάδα ελέγχου και στην υποοµάδα Γ2, που αποτέλεσε την πειραµατική οµάδα µελέτης. Όλα τα πειραµατόζωα της οµάδας υπεβλήθησαν σε λαπαροτοµία και πρόκληση σηπτικής περιτονίτιδας, µετά από διάτρηση και απολίνωση του τυφλού (CLP). Πριν από τη σύγκλειση του χειρουργικού τραύµατος, στα µεν πειραµατόζωα της υποοµάδας Γ1 χορηγήθηκε υποδορίως φυσιολογικός ορός (saline S), στα δε πειραµατόζωα της υποοµάδας Γ2 χορηγήθηκε υποδορίως µετοκλοπραµίδη (MCP). Σε όλα τα πειραµατόζωα της τρίτης οµάδας (Γ) διενεργήθηκε αιµοληψία από την πυλαία φλέβα, 12 ώρες µετά από την εγκατάσταση της σηπτικής περιτονίτιδας. Στην τέταρτη οµάδα ( ) συµπεριελήφθησαν 16 πειραµατόζωα και µελετήθηκε η εξέλιξη της συστηµατικής φλεγµονώδους απάντησης στο πρώτο εικοσιτετράωρο από την εγκατάσταση της σηπτικής περιτονίτιδας. Τα πειραµατόζωα χωρίστηκαν σε δύο ισάριθµες υποοµάδες, στην υποοµάδα 1, που αποτέλεσε την πειραµατική οµάδα ελέγχου και στην υποοµάδα 2, που αποτέλεσε την πειραµατική οµάδα µελέτης. Όλα τα πειραµατόζωα της οµάδας υπεβλήθησαν σε λαπαροτοµία και πρόκληση σηπτικής περιτονίτιδας, µετά από διάτρηση και απολίνωση του τυφλού (CLP). Πριν από τη σύγκλειση του χειρουργικού τραύµατος, στα µεν πειραµατόζωα της υποοµάδας 1 χορηγήθηκε υποδορίως φυσιολογικός ορός (saline S), στα δε πειραµατόζωα της υποοµάδας 2 χορηγήθηκε υποδορίως µετοκλοπραµίδη (MCP). Σε όλα τα πειραµατόζωα της τέταρτης οµάδας ( ) διενεργήθηκε αιµοληψία από την πυλαία φλέβα, 24 ώρες µετά από την εγκατάσταση της σηπτικής περιτονίτιδας. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, οι υποοµάδες των πειραµατοζώων Β1, Γ1 και 1, στις οποίες χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός, µετά από την πρόκληση 40

41 σηπτικής περιτονίτιδας, αποτέλεσαν την οµάδα Saline, ενώ οι υποοµάδες Β2, Γ2 και 2, στις οποίες χορηγήθηκε µετοκλοπραµίδη, αποτέλεσαν την οµάδα MCP. Μοντέλο πρόκλησης πολυµικροβιακής σηπτικής περιτονίτιδας. Προκειµένου να προκληθεί σηπτική περιτονίτιδα στα πειραµατόζωα, εφαρµόστηκε το µοντέλο της απολίνωσης και διάτρησης του τυφλού (cecal ligation and puncture), όπως πρωτοπεριγράφηκε από τον Wichterman και τους συνεργάτες του το 1980 [112], µε µικρές τροποποιήσεις. Όλα τα πειραµατόζωα υποβλήθηκαν σε στέρηση τροφής για 8 ώρες πριν την επέµβαση, αλλά είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε νερό. Η εισαγωγή στην αναισθησία έγινε µε την εισπνοή αιθέρα, ενώ η διατήρησή της σε όλη τη διάρκεια της επέµβασης επιτεύχθηκε µε την εφάπαξ ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση διαλύµατος ένυδρης χλωράλης, συγκέντρωσης 2,25%, σε δόση 1ml/100mg. Ακολουθούσε καθαρισµός ολόκληρης της κοιλιακής χώρας και πλύσεις µε διάλυµα ιωδιούχου ποβιδόνης, ώστε να επιτευχθούν συνθήκες αντισηψίας και στη συνέχεια µέση λαπαροτοµία µε τοµή 3 εκατοστών από το ύψος της ξιφοειδούς απόφυσης. Μετά από τη διάνοιξη του δέρµατος και του ορθού κοιλιακού µυός, ακολουθούσε διάνοιξη του περιτοναίου, είσοδος στην περιτοναϊκή κοιλότητα και ανεύρεση του τυφλού (εικόνα 2). Με τη βοήθεια άµελξης εντερικού περιεχοµένου από το ανιόν κόλον, το τυφλό πληρούτο µε κόπρανα και στη συνέχεια απελινώνετο, αµέσως περιφερικότερα της ειλεοτυφλικής βαλβίδας, µε ράµµα µέταξας 3-0, δύο φορές (εικόνα 3). Με τη βοήθεια βελόνας διαµέτρου 18G, επιτυγχάνετο διάτρηση τρεις φορές του αντιµεσεντερικού χείλους του τυφλού (εικόνα 4), ενώ επεδιώκετο µικρή ποσότητα κοπρανώδους υλικού να εξέλθει δια των οπών των διατρήσεων (εικόνα 5). Μετά την επιστροφή του εντέρου στην περιτοναϊκή κοιλότητα και τον έλεγχο τυχόν αιµορραγίας, ενίετο υποδόρια φυσιολογικός ορός ή µετοκλοπραµίδη (εικόνα 6). Ακολουθούσε συρραφή κατά στρώµατα του περιτοναίου και της περιτονίας του ορθού κοιλιακού µυός, µε ράµµα Vicryl 3-0 και σύγκλειση του δέρµατος µε συνεχές ράµµα Prolene 2-0 (εικόνα 7). Μετά το τέλος της επέµβασης οι επίµυες επέστρεφαν στα κλουβιά τους, όπου είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. 41

42 Εικόνα 2. Είσοδος στην περιτοναϊκή κοιλότητα και ανεύρεση του τυφλού. Εικόνα 3. ιπλή απολίνωση του τυφλού, αµέσως περιφερικότερα της ειλεοτυφλικής βαλβίδας. Εικόνα 4. ιάτρηση του αντιµεσεντερικού χείλους του τυφλού µε βελόνα διαµέτρου 18G τρεις φορές. 42

43 Εικόνα 5. Εντερικό περιεχόµενο εξέρχεται δια των οπών στην επιφάνεια του τυφλού. Εικόνα 6. Υποδόρια έγχυση φυσιολογικού ορού ή µετοκλοπραµίδης. Εικόνα 7. Σύγκλειση του χειρουργικού τραύµατος. 43

44 Χορήγηση φαρµάκου και φυσιολογικού ορού Η µετοκλοπραµίδη χορηγήθηκε υποδορίως σε όλα τα πειραµατόζωα των υποοµάδων Α2, Β2, Γ2 και 2, αµέσως µετά από την πρόκληση της σηπτικής περιτονίτιδας (εικόνα 6). Η χορηγούµενη δόση ήταν 0,5 mg/kg ΒΣ, δόση που συνήθως χορηγείται στην κλινική πράξη για την αντιµετώπιση της ναυτίας και των εµέτων. Επιπλέον, η δόση αυτή ήταν αποτελεσµατική στην αύξηση της συγκέντρωσης της προλακτίνης στον ορό βαρέως πασχόντων ασθενών και σε πειραµατικά µοντέλα ολιγαιµικής καταπληξίας σε επίµυες [10,19,113,114]. Ο φυσιολογικός ορός χορηγήθηκε υποδορίως σε όλα τα πειραµατόζωα των υποοµάδων Α1, Β1, Γ1 και 1 αµέσως µετά από την πρόκληση της σηπτικής περιτονίτιδας (εικόνα 6). Η χορηγούµενη δόση ήταν ισόποση της δόσης της µετοκλοπραµίδης. Αιµοληψία Σε όλα τα πειραµατόζωα της δεύτερης (Β), τρίτης (Γ) και τέταρτης ( ) οµάδας εκτελέστηκε αιµοληψία από την πυλαία φλέβα, 6, 12 και 24 ώρες από την πρόκληση της σηπτικής περιτονίτιδας, αντίστοιχα. Η κάθε αιµοληψία λάµβανε χώρα κάτω από αναισθησία µε αιθέρα. Το χειρουργικό τραύµα της προηγηθείσας επέµβασης διανοιγόταν, αναγνωριζόταν η πυλαία φλέβα και µε τη βοήθεια αποστειρωµένης σύριγγας, µε βελόνα διαµέτρου 26G, διενεργείτο η αιµοληψία. Μετά το τέλος της διαδικασίας τα πειραµατόζωα θυσιάζονταν µε παρατεταµένη εισπνοή αιθέρα. Προσδιορισµός παραµέτρων Από τα 5 ml αίµατος τα οποία λαµβάνονταν κατά την αιµοληψία, τα 2ml συλλέγονταν σε σωληνάρια ψεκασµένα µε E.D.T.A (Greiner Bio-one, USA) και µεταφέρονταν άµεσα στο µικροβιολογικό εργαστήριο του Γ.Ν.Θ. «Γ. Γεννηµατάς», όπου γινόταν µέτρηση των λευκών αιµοσφαιρίων. Τα υπόλοιπα 3ml συλλέγονταν σε σωληνάρια ελεύθερα ενδοτοξινών (Vacutainer, Becton, Dickinson, Cockeysville Md), όπου φυγοκεντρούνταν και ο υπερκείµενος ορός φυλασσόταν σε αντίστοιχα σωληνάρια στους -70 ο C µέχρι την εκτέλεση των µετρήσεων. Οι µετρούµενες παράµετροι στον φυλασσόµενο 44

45 ορό ήταν ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF-α), η µαλονοδιαλδεΰδη (MDA) και η ενδοτοξίνη (LPS). Καταγραφή της επιβίωσης Τα πειραµατόζωα της οµάδας Α, µετά το τέλος της επέµβασης και την επιστροφή στα κλουβιά τους, παρακολουθήθηκαν και καταγράφηκε, ανά εξάωρο, η επιβίωσή τους. Προσδιορισµός λευκών αιµοσφαιρίων Ο προσδιορισµός των λευκών αιµοσφαιρίων έγινε µε τη χρήση του αυτόµατου αναλυτή Genesis (Coulter Electronics, Miami, Florida, USA). Προσδιορισµός παράγοντα νέκρωσης καρκινικών όγκων (TNF-α) Ο προσδιορισµός του TNF-α στον ορό έγινε µε µέθοδο που στηρίζεται στην κυτταροτοξική επίδραση του TNF-α στη σειρά των ινοβλαστών L929(ATCC). Συγκεκριµένα, τοποθετούνταν σε πλάκες 1Χ10 5 κύτταρα επώασης των 96 περιεκτών, συνολικού όγκου 0.05ml και σε θρεπτικό υλικό RPMI 1640 εµπλουτισµένο µε 10% FBS και 2Mm γλουταµίνης (Biochrom AG, Berlin, Germany) παρουσία 4µg/ml αµπικιλλίνης (Beecham). Μετά από τρίωρη επώαση στους 37 0 C, σε περιβάλλον 5% CO 2, προστίθεντο 0,05ml διαλύµατος 0,3mg/ml κυκλοαιξιµίδης (Sigma Co, St. Lious, USA) και 0,06ml ορού του δείγµατος. Ακολουθούσε ολονύκτια επώαση, µετά την οποία το υπερκείµενο στρώµα αφαιρείτο και προστίθετο 0,1ml διαλύµατος µεθυλικού µπλε περιεκτικότητας 50mg σε 100ml απόλυτης µεθανόλης. Αυτό παρέµενε επί 10 λεπτά οπότε πραγµατοποιούνταν δύο διαδοχικές πλύσεις µε διάλυµα 0,9% NaCl. Μετά την αποξήρανση της πλάκας η χρωστική απαλείφετο µε διάλυµα οξεικού οξέος 50% και ακολουθούσε ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας στα 495nm. O προσδιορισµός της συγκέντρωσης του TNF-α γινόταν από πρότυπη καµπύλη µε γνωστές συγκεντρώσεις από ανθρώπειο TNF-α (23-375pg/ml) (Sigma Co, St. Louis, USA). Ο σχεδιασµός της πρότυπης καµπύλης γινόταν σε ηµιλογαριθµική κλίµακα και περιελάµβανε τις µεταβολές της υπολογιζόµενης διαφοράς: (OD µάρτυρα -OD γνωστής συγκέντρωσης TNF-α ) για καθεµιά εκ των γνωστών συγκεντρώσεων όπου OD µάρτυρα είναι η οπτική απορρόφηση των πολλαπλασιαζόµενων ινοβλαστών ή ορού και OD γνωστής συγκέντρωσης TNF-α είναι η ανάλογη οπτική απορρόφηση, µετά από επώαση, 45

46 παρουσία της γνωστής συγκέντρωσης του TNF-α. Κάθε προσδιορισµός διενεργήθηκε τέσσερις φορές και χρησιµοποιήθηκαν οι µέσες τιµές. Προσδιορισµός µαλονικής διαλδεΰδης (MDA) Ο προσδιορισµός της MDA έγινε µε τη µέθοδο του θειοβαρβιτουρικού οξέος [115,116]. Περιληπτικά, 0,1ml ορού αναµείχθηκε µε 0.9ml διαλύµατος τριχλωροξεικού οξέος 20% (Merck, Darmstadt, Germany) και φυγοκεντρήθηκε επί 10 λεπτά στους 4 0 C στα 12,000g. Το υπερκείµενο στρώµα επωάζετο µε 1ml διαλύµατος PBS (ph: 7.0) και µε 1ml διαλύµατος θειοβαρβιτουρικού οξέος 0,6% (Merck, Darmstadt, Germany), για 20 λεπτά στους 90 0 C. Ακολουθούσε ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας στα 535nm (Hitachi, Tokyo, Japan), ενώ ο προσδιορισµός των συγκεντρώσεων της MDA επιτυγχάνετο µε πρότυπη καµπύλη από γνωστές συγκεντρώσεις διαλύµατος 1, 1, 3, 3-τετραµεθοξυπροπανίου (Merck, Darmstadt, Germany). Προσδιορισµός ενδοτοξίνης (LPS) O προσδιορισµός της συγκέντρωσης της ενδοτοξίνης έγινε µε τη χρωµατοµετρική µέθοδο QCL-1000 LAL (Limulus Amoebocyte Lysate) (Biowhitaker, Walkersville, Maryland). Προ της µεθόδου προηγήθηκε αραίωση των δειγµάτων 1:10 µε αποστειρωµένο ύδωρ, ελεύθερο πυρετογόνων (Biowhitaker, Walkersville, Maryland) και επώαση επί 5 λεπτά στους 70 0 C. Κάθε µέτρηση επαναλήφθηκε δύο φορές. Στατιστική ανάλυση Τα µετρούµενα µεγέθη, όλα συνεχείς µεταβλητές, εκφράστηκαν µε τον αριθµητικό µέσο όρο ± µία σταθερά απόκλιση. Για τη σύγκριση των µέσων όρων των µεταβλητών στις υπό µελέτη δύο οµάδες πειραµατοζώων, δηλαδή σ αυτήν που της χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός µετά από την πρόκληση σηπτικής περιτονίτιδας (υποοµάδες Β1, Γ1 και 1) και σ αυτήν που της χορηγήθηκε µετοκλοπραµίδη, χρησιµοποιήθηκε η δοκιµασία t-test για ανεξάρτητα δείγµατα σε κάθε χρονική στιγµή (6, 12 και 24 ώρες µετά την πρόκληση της σηπτικής περιτονίτιδας). Λόγω του µικρού αριθµού πειραµατοζώων ανά οµάδα και της µη κανονικής κατανοµής των µεγεθών, εφαρµόστηκε στα πλαίσια του t-test η δοκιµασία του Levene, για εκτίµηση της ισότητας των διακυµάνσεων. Ο προσδιορισµός της επιβίωσης για κάθε οµάδα πειραµατοζώων έγινε µε τη δοκιµασία κατά Kaplan-Meier. Η σύγκριση της 46

47 επιβίωσης των πειραµατοζώων που έλαβαν και αυτών που δεν έλαβαν µετοκλοπραµίδη έγινε µε το κριτήριο log-rank. Τιµές του Ρ µικρότερες του 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων έγινε µε τη χρήση του στατιστικού προγράµµατος SPSS (Statistical Package for Social Sciences, Version 12.0). 2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ανάλυση επιβίωσης Όλα τα πειραµατόζωα µετά την πειραµατική πρόκληση πολυµικροβιακής σηπτικής περιτονίτιδας µε την απολίνωση και διάτρηση του τυφλού απεβίωσαν τελικά. Τα πειραµατόζωα της οµάδας Α1, που έλαβαν φυσιολογικό ορό, σηµείωσαν διάµεση επιβίωση 16 ώρες, ενώ της οµάδας Α2, που έλαβαν µετοκλοπραµίδη, 48 ώρες. Η συγκριτική επιβίωση των δύο οµάδων φαίνεται στο σχήµα 3, όπου επισηµαίνεται η στατιστικώς σηµαντική αύξηση της επιβίωσης στα πειραµατόζωα που έλαβαν µετοκλοπραµίδη. 1,0,8,6 p: Cumulative survival,4,2 0, Breslow : Α1 - - Α2 --- B A 168 Σχήµα 3. Συγκριτική επιβίωση των οµάδων Α1 (φυσιολογικός ορός) και Α2 (µετοκλοπραµίδη) p< 0, 05. Survival (hours) 47

48 Λευκά αιµοσφαίρια Στον πίνακα 3 παρατίθενται οι αριθµητικοί µέσοι όροι ± µία σταθερή απόκλιση των τιµών των λευκών αιµοσφαιρίων, ξεχωριστά για κάθε οµάδα (Saline και MCP), στα προκαθορισµένα χρονικά διαστήµατα των 6, 12 και 24 ωρών. Πίνακας 3. Τιµές λευκών αιµοσφαιρίων (ανά mm 3 ) στις οµάδες Saline και MCP στα προκαθορισµένα χρονικά διαστήµατα. Χρόνος Saline MCP Ρ 6h 12h 24h 4457 ± ± ± ± ± ± ,906 0,050 0,067 Οι τιµές εµφανίζονται µε τη µορφή: αριθµητικός µέσος ± µία σταθερή απόκλιση. Στατιστικώς σηµαντική διαφορά επί p<0,05. Στις 12 και 24 ώρες διαπιστώνεται αυξηµένος αριθµός λευκών αιµοσφαιρίων στην οµάδα MCP, έναντι της οµάδας Saline, χωρίς όµως στατιστικώς σηµαντική διαφορά. Τα αποτελέσµατα αυτά απεικονίζονται γραφικά στο σχήµα 4. Σχήµα 4. Τιµές λευκών αιµοσφαιρίων (ανά mm 3 ) των οµάδων Saline και MCP στις 6, 12 και 24 ώρες. Με αστερίσκο σηµειώνονται οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές. 48

49 Παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF-α) Ειδικά στην περίπτωση του TNF-α οι τιµές του προσδιορίστηκαν σε δύο αντί για τρία χρονικά σηµεία, στις 6 και στις 24 ώρες (πίνακας 4). Πίνακας 4. Τιµές TNF-α (pg/ml) στις οµάδες Saline και MCP σε δύο χρονικά διαστήµατα. Χρόνος Saline MCP Ρ 6h 24h 31,25 ± 0 31,25 ± 0 107,37 ± 115,88 31,25 ± 0 0,106 1 Οι τιµές εµφανίζονται µε τη µορφή: αριθµητικός µέσος ± µία σταθερή απόκλιση. Στατιστικώς σηµαντική διαφορά επί p<0,05. Στις 6 ώρες παρατηρείται αυξηµένη τιµή του TNF-α στην οµάδα MCP σε σχέση µε την οµάδα Saline. Ωστόσο, η στατιστική δοκιµασία κατέδειξε ότι η παρατηρούµενη διαφορά δεν είναι στατιστικώς σηµαντική. Στις 24 ώρες όλες οι τιµές προσδιορίζονται στο κατώτερο ανιχνεύσιµο όριο (σχήµα 5). Σχήµα 5. Τιµές TNF-α (pg/ml) των οµάδων Saline και MCP στις 6 και 24 ώρες. Παρά την εµφανή διαφορά στις 6 ώρες, το p είναι στατιστικώς µη σηµαντικό. 49

50 Μαλονική διαλδεΰδη (MDA) Στον πίνακα 5 παρουσιάζονται οι αριθµητικοί µέσοι όροι ± µία σταθερή απόκλιση των τιµών της MDA, ξεχωριστά για κάθε οµάδα (Saline και MCP), στα προκαθορισµένα χρονικά διαστήµατα των 6, 12 και 24 ωρών. Πίνακας 5. Τιµές MDA (Μ) στις οµάδες Saline και MCP στα προκαθορισµένα χρονικά διαστήµατα. Χρόνος Saline MCP Ρ 6h 12h 24h 0,883 ± 0,424 1,108 ± 0,685 0,912 ± 0,478 0,278 ± 0,072 0,296 ± 0,175 0,348 ± 0,169 0,002 0,033 0,018 Οι τιµές εµφανίζονται µε τη µορφή: αριθµητικός µέσος ± µία σταθερή απόκλιση. Στατιστικώς σηµαντική διαφορά επί p<0,05. ιαπιστώνεται ότι σε κάθε χρονική στιγµή η τιµή της MDA στην οµάδα Saline είναι στατιστικώς σηµαντικά υψηλότερη σε σχέση µε την οµάδα MCP (σχήµα 6). Σχήµα 6. Τιµές MDA (Μ) των οµάδων Saline και MCP στις 6, 12 και 24 ώρες. Με αστερίσκο σηµειώνονται οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές. 50