Elemente structurale constante

Transcript

1 . MCRRGASME PRCARTE ULTRASTRUCTURA CELULE BACTEREE Elementele structurale ale celulei bacteriene au fost clasificate în: elemente structurale constante (permanente) şi elemente structurale inconstante (nepermanente). Elemente structurale constante Peretele celular bacterian Celula bacteriană este delimitată de un perete celular bine definit structural, având o consistenţă rigidă. Peretele acoperă membrana citoplasmatică şi poate la rândul său să fie acoperit la unele specii de o capsulă sau de un strat mucos. Datorită indicelui de refracţie mic, peretele celular este invizibil, ori foarte greu vizibil, la celulele vii examinate la microscopul fotonic. El poate fi pus în evidenţă prin colorare selectivă sau prin examinare la microscopul electronic. La bacteriile tinere, care au citoplasmă abundentă, compactă şi omogenă peretele celular aderă intim la conţinutul celular subiacent. La celulele bătrâne însă, sau la cele în curs de liză, peretele celular devine evident datorită îndepărtării de citoplasmă. Examinat la microscopul electronic, peretele celular izolat are aspectul unui sac gol, care conservă forma bacteriei din care provine şi o constituţie asemănătoare ochiurilor unei plase. Grosimea peretelui celular variază între nm, excepţional putând să ajungă la 80 nm. Este mai subţire la celulele tinere faţă de celulele bătrâne. Ultrastructura peretelui celular este diferită la cele două grupe mari de bacterii (clasificate în funcţie de afinităţile tinctoriale): bacterii Gram pozitive şi bacterii Gram negative. La bacteriile Gram pozitive peretele celular apare la microscopul electronic ca un strat unic, omogen. Componentul care se găseşte în cea mai mare parte în peretele celular al acestor bacterii (80 90 % din greutatea uscată a celulei) este peptidoglicanul sau mureina. În afara acestui component peretele celular mai conţine proteine, polizaharide şi acizi teichoici. Peptidoglicanul este un component parietal comun şi caracteristic tuturor bacteriilor, cu excepţia celor din genul Mycoplasma şi a bacteriilor halofile extreme. Din punct de vedere chimic peptidoglicanul este un heteropolimer compus dintr-o porţiune glicanică şi o porţiune peptidică. Porţiunea glicanică, foarte uniformă este formată din două acetil hexozamine diferite: acetilglucozamina şi acidul acetilmuramic, legate între ele prin legături β 1,4. Acizii teichoici (gr. teichos = zid, perete) sunt prezenţi numai în peretele celular al bacteriilor Gram pozitive, conferindu-le o serie de proprietăţi importante. 1

2 La bacteriile Gram negative peretele celular este mai subţire, dar are o structură mai complexă. El este alcătuit din următoarele structuri: complexul peptidoglican lipoproteine care reprezintă 2 10 % din greutatea peretelui celular şi are o compoziţie chimică foarte asemănătoare la toate bacteriile Gram negative; membrana externă a peretelui celular, cu o grosime de 6 20 nm, formată din fosfolipide, proteine şi lipopolizaharide; spaţiul periplasmic sau periplasmatic întâlnit numai la bacteriile Gram negative, cuprins între membrana citoplasmatică şi membrana externă a peretelui celular. În spaţiul periplasmic se depozitează un mare număr de enzime şi pigmenţi. Enzimele au rolul de a hidroliza substanţele nutritive pătrunse prin porii membranei externe, pregătindu-le pentru transportul activ prin membrana citoplasmatică. Semnificaţia biologică a peretelui celular Peretele celular reprezintă sistemul de susţinere mecanică a întregii celule. Datorită rigidităţii sale determină forma caracteristică a celulelor bacteriene şi o apără de acţiunea factorilor nefavorabili din mediu. Asigură protecţia celulei faţă de şocul osmotic. Participă la procesul de creştere şi diviziune celulară, urmând membrana citoplasmatică în formarea septului transversal care separă celula mamă în cele două celule fiice. Datorită porilor, peretele celular permite pătrunderea în celulă a substanţelor nutritive şi eliminarea substanţelor rezultate din metabolism. Participă indirect la deplasarea bacteriilor ciliate, constituind suportul rigid pe care se sprijină cilii în contracţie. Conţine substanţele care dau specificitatea antigenică a celulelor şi receptori specifici pentru fixarea bacteriofagilor (virusuri care parazitează bacteriile). Membrana citoplasmatică Membrana citoplasmatică acoperă citoplasma celulei bacteriene separând-o de suprafaţa internă a peretelui celular de care este, de obicei, strâns lipită. Poate fi pusă în evidenţă şi la microscopul fotonic, după o colorare selectivă cu albastru Victoria, sau fără colorare, la bacteriile vii examinate în câmp întunecat, caz în care apare ca o linie netă, luminoasă, strălucitoare. La microscopul electronic, pe secţiuni ultrafine membrana citoplasmatică prezintă o structură tristratificată, tipică tuturor membranelor biologice: două foiţe opace la electroni ce limitează o foiţă internă electronotransparentă. Grosimea membranei citoplasmatice este de 7,5 10 nm şi nu prezintă pori. Din punct de vedere chimic este formată din proteine, lipide şi glucide. Membrana citoplasmatică este prevăzută cu numeroase invaginări de formă veziculară, lamelară sau tubulară care pătrund în citoplasmă. Aceste invaginări sunt denumite mezozomi şi împreună cu membrana citoplasmatică din care derivă formează sistemul membranar unic sau unit membrana. Mezozomii au caracteristicile structurale ale membranei plasmatice din care derivă. Sunt mai numeroşi şi mai bine dezvoltaţi la bacteriile Gram pozitive comparativ cu bacteriile Gram negative unde sunt, în general, rudimentari, slab dezvoltaţi ca mărime şi mai puţini ca număr. Mezozomii 2

3 sunt structuri multifuncţionale. Au o deosebită plasticitate structurală ca răspuns la nevoile variate ale celulei. Formarea lor reprezintă o modalitate prin care celula bacteriană îşi măreşte suprafaţa membranei citoplasmatice, în funcţie de condiţiile de mediu. De aceea, se consideră că nu ar avea funcţii diferite faţă de cele ale membranei plasmatice. Mezozomii sunt legaţi atât de membrana plasmatică, cât şi de materialul nuclear, având rol important în controlul replicării cromozomului bacterian. Mezozomii sunt implicaţi şi în sinteza membranei plasmatice, a peretelui celular şi a septului transversal care separă celulele după diviziune. Semnificaţia biologică a membranei citoplasmatice Membrana citoplasmatică reprezintă o componentă permanentă a celulei bacteriene, având rolul de a delimita spaţiul intracelular. Pentru celula bacteriană membrana citoplasmatică reprezintă o barieră osmotică semipermeabilă, asigurând o rapidă echilibrare a ionilor de sodiu între interiorul şi exteriorul celulei, o concentrare intracelulară a ionilor de potasiu şi magneziu, precum şi a unor metaboliţi. Membrana citoplasmatică este sediul a numeroase enzime respiratorii, reprezentând o importantă structură cu rol energetic. Membrana citoplasmatică coordonează creşterea şi diviziunea celulară, iniţiind replicarea cromozomului bacterian şi asigurând separarea cromozomilor fii, prin formarea septului transversal de diviziune. Materialul nuclear Spre deosebire de celulele eucariote care au un nucleu cu structură bine definită, mărginită de o membrană, conţinând un număr definit de cromozomi capabili de diviziune mitotică, materialul nuclear bacterian are o formă primitivă de organizare, lipsit de membrană, situat în partea centrală a celulei şi care nu suferă modificări de tip mitotic în cursul ciclului de diviziune. Datorită caracteristicilor sale particulare, această structură a fost desemnată cu numeroşi termeni: nucleoid, nucleozom, material nuclear, nucleoplasmă, cromozom bacterian etc. Din punct de vedere chimic materialul nuclear conţine 60% AD, 30% AR şi 10% proteine. Se pare că AR-ul şi proteinele contribuie la conservarea unităţii structurale a nucleoplasmei, în lipsa unei membrane proprii. Evidenţierea materialului nuclear bacterian la microscopul fotonic nu se poate face prin colorare selectivă decât după îndepărtarea AR-ului citopasmatic, realizată prin hidroliza acidă sau enzimatică cu ribonuclează. Cu ajutorul acestor tehnici materialul nuclear apare sub diferite forme: granule sferice sau ovalare, halteră, bastonaşe izolate sau dispuse în V etc., reprezentând 5 16% din volumul celulei. Pe micrografiile electronice se constată localizarea materialului nuclear în partea centrală a celulei. El se prezintă ca o zonă clară, cu o densitate medie mai mică decât cea a citoplasmei înconjurătoare. Pe secţiuni ultrafine s-a observat că regiunea nucleară este plină cu filamente foarte fine, uneori aranjate în şiruri ondulate, paralele asemănătoare unei papiote de aţă, câteodată răsucită. Aceste filamente sunt formate din AD şi corespund cromozomului bacterian. În 3

4 mod normal, bacteriile aflate în faza de repaus, în culturi staţionare şi vechi au un singur cromozom, deci sunt uninucleate. În faza de creştere activă, în culturi tinere, pe medii optime ele apar multinucleate, având 2 4 cromozomi, identici genetic, deoarece provin prin replicarea cromozomului parental. De aceea, indiferent de aspectul morfologic al materialului nuclear, din punct de vedere genetic bacteriile sunt haploide. Apariţia bacteriilor multinucleate este rezultatul unei lipse de sincronizare între ritmul de creştere şi ritmul de diviziune celulară. Bacteriile multinucleate apar şi sub influenţa unor condiţii de mediu. Astfel, sub acţiunea penicilinei, care blochează sinteza mureinei din peretele celular, aceasta nu mai poate participa la formarea septului transversal de diviziune şi apar astfel celule filamentoase sau globuloase cu mai mulţi nuclei. Semnificaţia biologică a materialului nuclear Cromozomul bacterian poartă în structura sa întreaga informaţie genetică necesară pentru biosinteză, creştere, diviziune, reglarea activităţii celulare etc. Determină arhitectura celulei bacteriene, ereditatea şi capacitatea ei de evoluţie. Datorită lipsei membranei proprii, un contact direct între AD şi ribozomii din citoplasmă face ca transferul informaţiei genetice să se facă foarte rapid. ncluziunile citoplasmatice ncluziunile sunt formaţiuni structurale ce cuprind o serie de substanţe inerte depuse în citoplasma celulei, cu rol de substanţă de rezervă. După structura lor, evidenţiată la microscopul electronic, ele sunt de două tipuri: A - incluziuni înconjurate de membrană: incluziuni de poli β-hidroxibutirat, incluziuni cu sulf şi carboxizomii; B - incluziuni neînconjurate de membrane: incluziuni de polimeri anorganici, incluziuni polizaharidice, rhapidozomii şi magnetozomii. ncluziunile de poli β-hidroxibutirat sunt specifice numai procariotelor. Aceste incluziuni se observă uşor datorită gradului mare de refringenţă sau pot fi puse în evidenţă după o colorare specifică pentru grăsimi (negru de Sudan). În celulele vii apar ca granulaţii rotunde foarte refringente şi reprezintă un material de rezervă tipic pentru procariote. ncluziunile cu sulf apar sub forma unor corpusculi strălucitori, birefringenţi la două grupe ecologice de bacterii: bacterii sulfuroase purpurii (genul Chromatium) şi la bacterii sulfuroase nepigmentate (genurile Beggiatoa, Thiothrix). Granulele de sulf se găsesc în cantităţi mari la bacteriile care cresc în medii bogate în hidrogen sulfurat şi reprezintă un depozit, deoarece dispar prin oxidarea sulfului, dacă aceste bacterii sunt transferate într-un mediu sărac în hidrogen sulfurat. 4

5 Carboxizomii sunt incluziuni cu profil poliedric în număr variabil (1 200) prezenţi la bacteriile care fixează C 2 pe calea pentozofosfaţilor. Sunt localizaţi în vecinătatea nucleoplasmei şi reprezintă locul de depozitare a enzimelor cu activitate în fixarea C 2. ncluziunile de polimeri anorganici se mai numesc și incluziuni de volutină, denumire dată de Grimm (1902) deoarece au fost găsite în număr mare la bacteria Spirillum volutans. Aceste incluziuni au fost descoperite de către V. Babeş în 1897 la Corynebacterium diphtheriae şi Mycobacterium tuberculosis şi apoi de Ernst în 1899 la alte bacterii, fapt pentru care mai sunt numiţi şi corpusculii Babeş Ernst. Datorită conţinutului mare în polifosfaţi anorganici produc efecte metacromatice (se colorează în roşu - violet cu albastrul de metilen) motiv pentru care au fost denumite şi granulaţii metacromatice. Granulele de volutină reprezintă o rezervă de fosfor şi energie intracelulară. ncluziunile polizaharidice cuprind incluziunile de glicogen şi amidon. Acestea se întâlnesc ca substanţe de rezervă la bacteriile aerobe sporulate. La microscopul fotonic pot fi observate după o prealabilă tratare a celulelor cu iod în iodură de potasiu. În aceste condiţii incluziunile de glicogen se colorează în brun roşcat, iar cele de amidon în albastru, în contrast cu citoplasma care apare colorată în galben pal. Rhapidozomii sunt particule ribonucleoproteice sub formă de bastonaşe scurte, rigide, intrasau extracelular, care pot fi eliminate din celule prin liza lor. Sunt întâlniţi la numeroase specii de mixobacterii, la Proteus, Pseudomonas, Actinomyces. Conţin proteine şi AR în proporţie de 2:1. Magnetozomii sunt incluziuni care conţin fier şi au rol în orientarea şi migrarea unor bacterii sub influenţa câmpurilor magnetice slabe. Se întâlnesc la unele bacterii magnetotactice din sedimentele marine sau de apă dulce. u se găsesc dispersaţi în celulă ci formează una, două formaţiuni intracelulare alcătuite din 5 41 particule de formă cubică, cu colţurile rotunjite, situate în apropierea suprafeţei interne a membranei plasmatice. Magnetozomii conţin fier sub formă de magnetită. Ei acţionează ca o busolă biomagnetică, asigurând orientarea şi deplasarea bacteriilor în câmpurile magnetice. Elemente structurale inconstante Capsula şi stratul mucos Unele bacterii au proprietatea de a elabora, în anumite condiţii de mediu, substanţe macromoleculare cu caracter vâscos, gelatinos mucos. În funcţie de structura şi raporturile cu celula bacteriană substanţa mucoidă se poate prezenta sub următoarele forme: 5

6 a) Microcapsula - la care substanţa mucoidă alcătuieşte un strat foarte fin în jurul celulei bacteriene, având o grosime de 0,2 µm. u poate fi observată la microscopul fotonic, dar este detectabilă prin metode imunologice. b) Macrocapsula sau capsula adevărată - are o grosime ce depăşeşte 0,2 µm şi se prezintă ca o formaţiune morfologic distinctă care înveleşte de jur împrejur fiecare celulă sau perechi de celule. c) Stratul mucos - apare ca o masă amorfă, neorganizată în jurul celulei bacteriene. d) Zooglea sau masa zoogleică - în care stratul mucos leagă între ele mai multe celule, formând adevărate colonii mucilaginoase de bacterii. Macrocapsula sau capsula adevărată apare la microscopul fotonic ca un halou incolor în jurul celulei bacteriene. Dimensiunile ei variază foarte mult în raport cu corpul bacterian. Spre deosebire de stratul mucos care formează în jurul bacteriilor o reţea laxă şi difuză de exopolizaharide, fără o structură definită, capsula adevărată este strâns aderentă de peretele celular. Exemple de bacterii capsulate: Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, Leuconostoc mesenteroides, Enterobacter aeruginosa, Klebsiella pneumoniae. Capsula este greu de observat prin microscopie directă. Are o afinitate slabă pentru coloranţi şi de aceea ea poate fi evidenţiată numai prin coloraţii speciale. După coloraţii uzuale ea apare ca un halou incolor. Fiind puţin opacă pentru electroni capsula nu apare clar sau este invizibilă la microscopul electronic. Semnificaţia biologică a capsulei Capsula este un produs inert care rezultă din activitatea metabolică a celulei bacteriene şi care poate fi îndepărtat, celula bacteriană păstrându-şi viabilitatea. Capsula are un rol ecologic în supravieţuierea bacteriilor în natură. Ea protejează celula bacteriană de efectul nociv al desicaţiei datorită proprietăţilor sale higroscopice şi reprezintă un rezervor pentru stocarea substanţelor nutritive sau a celor rezultate din metabolism. La bacteriile patogene, capsula are rol protector faţă de acţiunea fagocitelor. Bacteriile patogene capsulate au o virulenţă mai mare pentru om şi animale. Astfel, pneumococul capsulat este virulent, în timp ce tulpinile necapsulate sunt nevirulente şi fagocitabile. Glicocalixul Glicocalixul este alcătuit dintr-o masă de filamente polizaharidice ataşate de lipopolizaharidele de pe suprafaţa bacteriilor, formând în ansamblu o structură ca o pâslă pe suprafaţa celulei, asigurând fixarea acesteia de alte celule sau suporturi. Adeseori, diviziunea bacteriilor în interiorul glicocalixului poate produce o microcolonie de celule acoperite de un glicocalix comun. 6

7 Semnificaţia biologică a glicocalixului Glicocalixul reprezintă un rezervor de hrană pentru bacterii, prin legarea diferiţilor ioni şi molecule care provin din mediul înconjurător sau sunt eliberate prin digestia enzimatică a celulelor moarte. Prezenţa glicocalixului la bacteriile patogene reprezintă o protecţie pentru celulă, asigurând fixarea şi menţinerea ei în mediile naturale sterile (ex. căile urinare), fără a fi îndepărtată, precum şi o rezistenţă mărită faţă de bacteriofagi sau protozoare. În natură, în apele repezi curgătoare de munte, glicocalixul asigură fixarea bacteriilor pe diferite substraturi inerte (pietre, resturi de lemn etc.) pe care formează depozite vâscoase. Flagelii Flagelii sunt apendici filamentoși dispuși la suprafaţa bacteriilor, reprezentând organite de locomoţie. Posibilitatea de deplasare se întâlneşte numai la anumite specii bacteriene ca: bacili, vibrioni şi spirili. Morfologie. Flagelii sunt structuri filamentoase subţiri, flexibile, de formă helicală. Lungimea lor este mult mai mare decât a celulelor care îi poartă. De asemenea, ei sunt mai lungi la celulele bătrâne şi la cele care trăiesc în medii lichide. Forma lor este cilindrică deşi, uneori, apar turtiţi ca o panglică. umărul flagelilor pe suprafaţa unei celule variază între 1 şi 100, fiind caracteristic pentru o anumită specie. În funcţie de dispunerea flagelilor pe suprafaţa celulelor bacteriene acestea pot fi: atriche (bacterii imobile, fără flageli - majoritatea bacteriilor); monotriche (cu un singur flagel polar, exemplu Vibrio cholerae); lofotriche (cu un smoc de flageli situat la un pol al celulei, exemplu Spirillum marinus); amfitriche (cu câte un flagel la ambii poli ai celulei, exemplu Bacillus megaterium); peritriche (cu flageli pe toată suprafaţa celulei, exemplu Proteus vulgaris). Ultrastructură. Un flagel este alcătuit din trei elemente principale: corpul bazal, articulaţia (cârligul) şi filamentul helical extracelular. La bacteriile Gram negative corpul bazal este alcătuit din patru discuri interconectate şi anume: discul M dispus în membrana plasmatică şi montat fix pe axul de transmisie, dar care se roteşte liber în membrana plasmatică; discul S localizat în regiunea supramembranară plasmatică (spaţiul periplasmic); discul P inclavat în stratul peptidoglicanic; discul L legat de membrana externă lipopolizaharidică a peretelui celular. La bacteriile Gram pozitive structura corpului bazal este mai simplă, fiind format din două discuri corespunzătoare discurilor P şi M. Modul de deplasare. Filamentul flagelului pus în mişcare de motorul rotativ se învârte în jurul propriului său ax, propulsând astfel celula. Când flagelii se rotesc în sens opus acelor de ceasornic aceştia formează un fascicul în urma celulei care este propulsată în linie dreaptă. Când 7

8 sensul rotirii se schimbă, în sensul acelor de ceasornic, celula se rostogoleşte deoarece flagelii se răsfiră, fiecare trăgând celula în altă direcţie. Deci, rotaţia în sens antiorar asigură deplasarea celulei în linie dreaptă, iar cea în sens orar rostogolirea. Pilii şi fimbriile Sunt apendici filamentoşi, pericelulari prezenţi la bacteriile Gram negative (Escherichia coli, Proteus, Klebsiella, Shigella, Salmonella) şi mai rar la bacteriile Gram pozitive. Pot fi evidenţiaţi numai prin microscopie electronică. Sunt mai numeroşi decât flagelii, mai subţiri şi mai casanţi. După structură, funcţie şi determinismul genetic aceşti apendici au fost grupaţi în două categorii: pili de sex - apendici filamentoși care reprezintă receptori specifici pentru bacteriofagi şi calea de transfer a AD-ului bacterian şi plasmidial în procesul de conjugare; fimbriile - care nu sunt implicate în transferul AD-ului cromozomal, viral sau plasmidial. Pilii de sex sunt în număr de 1 10 per celulă. Sunt codificaţi de informaţia genetică extracromozomală (plasmida de sex). La microscopul electronic apar ca nişte structuri tubulare, cu un canal axial delimitat de un perete alcătuit din molecule de pilină (o fosfoglicoproteină) asamblate după o simetrie helicală. Semnificaţia biologică a pililor Pilii sunt organite esenţiale pentru transferul AD-ului cromozomal sau plasmidial în cursul conjugării celulelor bacteriene mascule şi femele. Ei poartă receptori pentru fixarea bacteriofagilor de celulele bacteriene şi servesc drept conduct prin care se realizează transferul genomului fagic în celula bacteriană. Pierderea pililor prin mutaţie determină rezistenţa faţă de infecţia cu bacteriofagi. Fimbriile sunt apendici filamentoși, rectilinii, dispuși pericelular, polar sau bipolar şi a căror sinteză este controlată de gene cromozomale. umărul lor variază între per celulă. Semnificaţia biologică a fimbriilor Creşterea suprafeţei de absorbţie a substanţelor nutritive. Creşterea activităţii respiratorii a bacteriilor. Facilitarea aderării bacteriilor de diferite substraturi sau alte organisme. Servesc ca organite de transport a unor metaboliţi. Contribuie la stabilizarea cuplurilor de conjugare. nfluenţează virulenţa bacteriilor patogene prin: fixarea bacteriilor patogene de celule şi ţesuturi, determinarea unei specificităţi de ţesut; inducerea formării de anticorpi datorită antigenelor din fimbrii; conferirea unei rezistenţe deosebite a bacteriilor la fagocitoză. Sporul bacterian La unele bacterii forma vegetativă se poate transforma într-un spor. Aceste bacterii se numesc sporogene. La bacterii se întâlnesc mai multe tipuri de spori: 8

9 Endosporul (sporul propriu- zis) - este o formaţiune intracelulară foarte refringentă şi rezistentă la factorii nefavorabili de mediu. Este caracteristic pentru genurile Clostridium şi Bacillus. Exosporul reprezintă o formaţiune rezistentă care se întâlneşte la bacteriile metanooxidante şi la unele tulpini de Rhodomicrobium vannielii. Artrosporul constituie o formaţiune intracelulară mai puţin rezistentă decât endosporul, dar superioară formei vegetative. Se formează prin fragmentarea celulei vegetative. A fost descris la Bacillus megaterium. Chlamidosporul este întâlnit la mixobacterii şi la Azotobacter chroococcum. Rezultă din îngroşarea peretelui celulei vegetative şi acumularea unor substanţe de rezervă. Gonidia reprezintă o formaţiune intracelulară sferică rezultată din condensarea şi fragmentarea conţinutului celular. u are calităţi specifice sporului adevărat dar are în schimb rol în înmulţire. A fost descris la Leptothrix ochracea, Beggiatoa, Crenothrix. Sporii de la actinomicete sunt rezistenţi la uscăciune dar nu şi la temperatură. Au rol în reproducere. Poartă diferite denumiri în funcţie de reprezentanţii unor familii şi anume: oidiospori, conidiospori, sporangiospori. Adevăratul spor bacterian sau endosporul este întâlnit la speciile genului Bacillus (aerob) şi Clostridium (anaerob). La coci endosporul este întâlnit numai excepţional la Sporosarcina ureae. Datorită calităţilor sale deosebite de rezistenţă endosporul conservă în stare dormantă, timp îndelungat, toate proprietăţile genotipice ale celulei vegetative din care provine. ndiferent de morfologia celulei în care se constituie, forma sporului (endosporului) este rotundă sau ovală, cu diametrul variind între 0,2 şi 2 µm. Poziţia sporului în celulă este diferită şi reprezintă un criteriu taxonomic. Astfel, sporul ocupă o poziţie centrală la Bacillus anthracis, subterminală la Bacillus cereus sau o poziţie terminală la Bacillus subtilis (la care sporul poate avea și pozițiile centrală sau subterminală). Diametrul sporilor poate fi mai mic decât al celulelor vegetative (ex. genul Bacillus) și se numesc spori nedeformanți. La unele specii, diametrul sporului este mai mare decât cel al celulei în care se formează, deformând astfel celula. Sporii deformanţi îi întâlnim la bacilii telurici, anaerobi, aparţinând genului Clostridium şi pot avea poziţie centrală dându-le acestora aspect de fus (Clostridium pasteurianum), poziţie subterminală aspect de rachetă de tenis (Clostridium sporogenes) sau băţ de tobă dacă sporul este terminal (Clostridium tetani). Ultrastructura În general, ultrastructura sporului este, cu mici variaţii, aceeaşi la toate bacteriile. Microscopia electronică a pus în evidenţă următoarele elemente structurale: tunicile (învelişurile sporale) reprezentând trei straturi suprapuse: unul extern (exina), unul intern (intina), între care se găseşte stratul mijlociu; toate sunt electronoopace şi reprezintă % din greutatea sporului; 9

10 cortexul o zonă electronotransparentă, situată sub tunica internă, format dintr-un peptidoglican (altul decât mureina) şi acid dipicolinic; membrana sporoplasmei identică cu membrana citoplasmatică a celulei vegetative; sporoplasma (inima sporului) reprezintă 60 70% din greutatea sporului şi conţine elementele biologic active (AD, AR, mai puţin AR mesager, ribozomi). La unele specii (Bacillus cereus, Bacillus anthracis) la suprafaţa tunicilor sporale se află un strat mucos, de formă neregulată numit exosporium. Sporul conţine, în general, aceeaşi componenţi ca celula vegetativă dar în raporturi diferite. Astfel, comparativ cu celula, sporul are un conţinut scăzut în apă, mai ales în apă liberă; este mai bogat în Ca 2+ şi Mg 2+ dar mai sărac în K. Caracteristic sporului este prezenţa acidului dipicolinic, care sub forma dipicolinatului de calciu conferă sporului termorezistenţă. Sporul este mai sărac în enzime decât celula vegetativă, iar enzimele existente sunt inactive, motiv pentru care sporul este metabolic inactiv. Semnificaţia biologică a sporului Sporul reprezintă o etapă normală a ciclului de dezvoltare a bacteriilor sporogene, deoarece sporogeneza necesită condiţii de mediu similare celor reclamate de celula vegetativă, uneori cu limite de variaţie mult mai mici. El se deosebeşte de celula vegetativă prin mai multe caractere şi se comportă ca o formă de rezistenţă ce păstrează intacte toate caracterele genotipice şi fenotipice ale speciei. Sporul bacterian nu reprezintă o formă de multiplicare ca la fungi. Rezistenţa sporului bacterian la factorii nefavorabili de mediu este deosebit de mare; pot rezista câteva ore la C căldură umedă sau C căldură uscată.. STRUCTURA Ș ULTRASTRUCTURA CELULELR EUCARTE 1. Structura si ultrastructura organitelor specifice celulei vegetale (cloroplastul, peretele celular si vacuola) Cloroplastele sunt plastide care contin pigmentul verde numit clorofilă, cu ajutorul căruia realizează fotosinteza, ceea ce conferă plantelor rol de producători primari. Clorofila este concentrată în mici granule lenticulare numite grana, dispuse mai mult sau mai puţin regulat şi dând cloroplastului o structură granulară. Ansamblul regiunilor clare, nepigmentate, ce separă grana se numeşte stromă (matrix). Morfologie. La alge cloroplastele se numesc cromatofori; forma acestora variază şi este utilizată în taxonomie pentru a diferenţia speciile, genurile şi grupele între ele: la Chlamydomonas şi Chlorella, alge unicelulare, are aspect de cupă sau de clopot; la Ulothrix, algă pluricelulară, are aspect de inel ecuatorial, cu marginile dantelate; la Cladophora, algă pluricelulară ramificată, este reticulat; la Spirogyra, algă pluricelulară filamentoasă, are aspect de panglică spiralată. În ceea ce priveşte numărul de cromatofori / celulă, acesta poate fi: între 1-6 la Spirogyra, 2 în formă de stea la Zygnema, mai multe zeci cu aspect lenticular la Bryopsis. 10

11 Majoritatea cromatoforilor au una sau mai multe granule proteice numite pirenoizi în jurul cărora sunt granule de amidon. Pirenoizii sunt corpusculi sferici, având 1-10 micrometri în diametru. La algele verzi şi la unele alge roşii, pirenoizii sunt intraplastidiali, iar la algele brune, extraplastidiali, fixaţi în afara cromatoforului cu ajutorul unui pedicel. Corpul central al pirenoidului este de natură lipoproteică şi se numeşte pirenozom. La unele alge verzi, pirenoizii mai conţin AD şi clorofilă. La plantele superioare, cloroplastele sunt lenticulare, mari, vizibile la microscopul fotonic. Dimensiunile lor variază cu specia, organul analizat, tipul de ţesut vegetal (la frunze, cloroplastele din celulele ţesutului palisadic sunt de 2,5 ori mai mari decât cele din ţesutul lacunos). Ultrastructură. Cloroplastul este limitat de o anvelopă (membrană dublă), ce închide o stromă incoloră. Fiecare din cele două membrane simple are grosimea de 7,5 nm, între ele aflânduse un spaţiu clar de 10 nm. Membrana externă este netedă. Membrana internă emite invaginaţii, din care unele se prelungesc în lamele stromatice, dispuse paralel cu axa mare a organitului. Între lamelele stromatice (stromatilacoizi) se formează, pe alocuri, un anumit număr de saci mici, aplatizaţi, numiţi saculi granari (granatilacoizi) dispuşi în teancuri (de la 2 până la 60 într-un teanc); aceştia provin din dilatări ale lamelelor stromatice, care se etalează paralel cu aceste lamele şi de care se detasează. Ansamblul format de saculele granare şi porţiunile de lamele stromatice care le mărginesc constituie aşa-numitul granum. Tilacoizii cuprind: - unităţi pătratice de 15 nm, care apar pe cele două feţe ale membranei care conţin aproximativ 300 de molecule de clorofile şi aproximativ 50 de molecule de pigmenţi carotenoizi, toate înglobate prin polul lor hidrofob în pătura lipidică a membranei tilacoidale (fotosintetizantă); aceste unităţi pătratice au fost asimilate cu unităţi funcţionale numite cuantozomi; - unităţi mai mici (8 nm), tot transmembranare; - unităţi intermediare (9 nm) pedicelate, situate exclusiv pe faţa stromatică a membranei tilacoidale, îndeosebi la extremităţile tilacoidelor (ele sunt factori de cuplaj clorofilieni, care servesc la sinteza de ATP, ca şi în mitocondrie). Stroma este incoloră, având o structură asemănătoare cu cea a hialoplasmei. Este de natură proteică, conţinând picături lipidice şi câteva granule de amidon; acestea se formează la sfârşitul zilei, dar sunt hidrolizate în cursul nopţii în glucoză, care migrează în plantă. În stromă s-au evidenţiat şi plastoribozomi, AR, AD. Peretele celular - Marea majoritate a celulelor vegetale sunt acoperite la exterior de un înveliş solid numit perete celular, care separă celulele între ele, le protejează întreg conţinutul şi le conferă o anumită formă stabilă. Aceste celule sunt cunoscute şi sub numele de dermatoplaste, prin contrast cu celulele animale, numite nude sau gimnoplaste. 11

12 Peretele celular a fost prima componentă structurală observată la microscopul fotonic de către Robert Hooke, în Peretele celular este un produs al protoplastului şi rămâne permanent în contact cu citoplasma, prin intermediul plasmalemei. Formarea sa începe la sfârşitul telofazei când se constituie un nou perete intercelular în fragmoplast. În zona ecuatorială a fragmoplastului apar numeroase formaţiuni granulare mici, ce conţin pectine şi care nu sunt altceva decât vezicule ale aparatului Golgi. umărul şi mărimea acestora cresc treptat, se apropie şi fuzionează într-o placă celulară (viitoarea lamelă mediană), care creşte centrifugal. În cursul apropierii şi fuzionării veziculelor golgiene, membranele lor produc plasmalemele celor două celule vecine. Între vezicule se află profile de RE, ce formează plasmodesmele, care trec prin punctuaţiile ce rămân în lamela mediană. Ulterior se formează pereţii primari ai celulelor vecine. oul perete se sudează cu pereţii laterali ai celulei iniţiale şi separă astfel celula veche în două celule noi. Peretele celulelor meristematice şi parenchimatice rămâne primar, celulozo-pectic tot timpul vieţii acestora. În schimb, peretele celulelor ţesuturilor mecanice, conducătoare şi protectoare se îngroaşă prin depuneri de material nou peste peretele primar, alcătuind peretele secundar. Spre deosebire de peretele primar, care creşte mai mult în suprafaţă, peretele secundar creşte numai în grosime. Compoziţia chimică a peretelui celular este foarte variată, în funcţie de grupa taxonomică. Pereţii celulelor conţin 4 grupe de substanţe: glucide, lipide, proteine şi substanţe minerale. De regulă, predomină glucidele, găsindu-se în special sub formă de polizaharide, cea mai frecventă fiind celuloza. Alături de celuloză, în mod constant se găsesc hemiceluloze şi substanţe pectice. Celuloza este un polimer liniar, neramificat, alcătuit din molecule de D-glucoza. Prin tehnica curentă de dublă colorare a preparatelor microscopice (verde iod şi carmin alaunat), coloraţia roz a peretelui celular nu este specifică numai celulozei, ci şi hemicelulozei, calozei şi substanţelor pectice. Microscopia electronică a permis decelarea unităţilor de constituţie ale celulozei: formaţiunea submicroscopică fundamentală este fibrila elementara. Fibrilele elementare se asociază în unităţi superioare numite microfibrile. Prin asocirea a circa 250 microfibrile rezultă o fibrilă, iar prin unirea a de fibrile rezultă o fibră macroscopică. Biodegradarea celulozei se realizează prin hidroliză catalizată de celulaz. Relativ puţine organisme sintetizează celulază şi, deci, pot utiliza direct această biomasă disponibilă. Plantele verzi, care produc cea mai mare cantitate de celuloză, nu au activitate celulolitică deosebită, fiind practic incapabile să catabolizeze acest compus. Dintre animale, rumegătoarele, realizând o digestie 12

13 simbiotică, reuşesc să catabolizeze celuloza; activitatea de celuloliză este restrânsă practic la microorganisme: bacterii, protiste, ciuperci. Pectinele constituie cea mai mare parte din lamela mediană, care menţine împreună celulele unui ţesut. Locul de sinteză al pectinelor îl reprezintă aparatul Golgi. Se colorează specific în roz cu roşu ruteniu. Plantele dispun de pectinaze care hidrolizează pectinele. Remanierea acestor polizaharide reprezintă un proces natural frecvent, fie în cursul creşterii, fie la sfârşitul maturării celulei. Hemicelulozele sunt macromolecule cu un grad mai scăzut de polimerizare, comparativ cu celuloza Spre deosebire de celuloză, hemiceluloza poate fi utilizată de plantă ca substanţă de rezervă, deoarece conţine o enzimă, hemicelulaza, care o poate hidroliza până la oze simple. Ultrastructura peretelui celular. Se apreciază că primele straturi dinspre lamela mediană sunt mai bogate în substanţe pectice şi hemicelulozice, cantitatea de celuloză crescând treptat spre interior. Cercetările de microscopie electronică au evidenţiat că, in peretele primar, textura fibrilară are o orientare determinată; fibrilele celulozice prezintă o dispoziţie paralelă pe faţa externă a peretelui şi aproape perpendiculară pe cea internă, în raport cu axul longitudinal al celulei. Peretele secundar conţine mai multă celuloză, iar în plus are şi substanţe de încrustaţie: cutina, suberina, ceara, lignina, mucilagii, săruri, răşini. Este heterogen, fiecare din cele trei straturi ale sale (S1, S2, S3) având structură proprie, situaţie vizibilă îndeosebi la vasele de lemn şi fibrele de sclerenchim. Stratul S1 (extern) este gros de 0,12 0,35 micrometri (ocupă 5-11% din perete); este format din 4-6 lamele de microfibrile celulozice, având structură aparent reticulată. Stratul S2 (mijlociu) ese cel mai gros (ocupă 74-84% din perete); are de lamele foarte apropiate, iar microfibrilele de celuloză au dispoziţie helicoidală, deci textura este paralelă, dar diferă direcţia de înfăşurare în diferite lamele. Stratul S3 (intern) este gros de 0,07-0,08 micrometri; are doar 2-3 lamele de microfibrile celulozice, iar direcţia lor de înfăşurare în lamele alternează, deci textura este reticulată. Peretele primar este plastic, extensibil şi, deci, permite alungirea organelor; peretele secundar este elastic, dar nu plastic (el se formează atunci cand celulele, deci şi organele, au încetat să mai crească). Modificările chimice secundare ale peretelui celular pot fi clasificate astfel: 1. apoziţii lipidice: cutinizare, cerificare, suberificare; 2. încrustaţii cu polifenoli: lignificare; 3. încrustaţii cu săruri minerale: mineralizare (silicificare, calcificare); 4. modificări cu rol degenarativ: gelificare şi lichefiere. 13

14 Cutinizarea şi cerificarea constau în impregnarea şi acoperirea pereţilor externi ai celulelor epidermice cu substanţe de natură lipidică, numite cutina şi ceara. În general, celulele situate la suprafaţa organelor aeriene au pereţii acoperiţi de o cuticulă, în care se disting ceruri (extractibile cu cloroform, benzen, hexan) şi un polimer insolubil numit cutină. Cuticula are un rol foarte important în echilibrul hidric al plantei, reducând evaporarea apei în atmosferă; apariţia sa în cursul evoluţiei a fost esenţială pentru dezvoltarea plantelor în mediul aerian. În caz de uscăciune, stomatele se închid şi atunci transpiraţia cuticulară devine determinantă pentru adaptarea la viaţa în mediul uscat. Cuticula intervine, de asemenea, în reglarea umidităţii de la suprafaţa organelor, eliminarea substanţelor volatile, apărarea împotriva factorilor externi (vânt, poluanţi, paraziţi); de cuticulă depinde puterea de pătrundere a erbicidelor în plante. Ceara şi cutina constituie complexul cuticular. Cuticula se colorează cu diferiţi reactivi (roşu Sudan, tetraoxid de osmiu). Grosimea sa variază în funcţie de condiţiile ecologice în care creşte planta: astfel, plantele submerse au o cuticulă foarte subţire (uneori chiar poate lipsi), în timp ce xerofitele au cuticula foarte groasă; la frunzele de măslin, laur, afin ea poate atinge de micrometri. Cerurile se află incluse fie în ochiurile polimerului de cutină (ceruri intracuticulare), fie se prezintă sub forma unor proiecţii superficiale de forme variate plăci, tubuli, bastonaşe, panglici reprezentând aproximativ 90% din ceara totală (ceruri epicuticulare). În ceea ce priveşte biodegradarea cutinei: în natură, aceasta este reciclată de microflora solului (bacterii, levuri); unele ciuperci saprofite pot fi cultivate pe substrat de cutină ca unică sursă carbonată. Mamiferele posedă lipaze care degadează acest polimer. Suberificarea constă în impregnarea pereţilor celulozici cu suberină (de natură lipidică). Procesul de suberificare priveşte organe relativ în vârstă, adesea cu structură secundară; rareori, suberificarea reprezintă un răspuns la răniri (când epiderma este distrusă), rezultând un suber de cicatrizare. În celulele de suber adcrustarea de lipide are loc centripetal afectând toţi pereţii celulari, făcându-i impermeabili pentru lichide şi gaze, împiedicând schimburile dintre celule şi mediul extern, conducând la moartea acestora. De aceea funcţiile de izolare şi protecţie caracteristice suberului se realizează numai ce către pereţi atunci când celulele mor. Suberificarea poate fi totală la fag, salcie sau parţială la plop, arţar. Lignificarea constă în impregnarea pereţilor celulozici cu lignină, compus de natură polifenolică, care înconjoară microfibrilele de celuloză, umplând spaţiile dintre ele, mărind duritatea, rezistenţa mecanică şi chimică a peretelui, micşorându-i flexibilitatea. Poate fi totală (în sclerenchimul târziu) sau parţială (în xilemul timpuriu). Este un proces ireversibil, propriu 14

15 cormofitelor, îndeosebi vaselor de lemn şi elementelor de sclerenchim, rareori celulelor epidermice (ca la poacee). Pereţii lignificaţi au o organizare ternară, cuprinzând un schelet microfibrilar de celuloză foate bine organizat, o matrice amorfă predominant glucidică şi o reţea de polifenoli încrustaţi. Între biopolimerii elaboraţi pe suprafaţa globului, ligninele ocupă locul al doilea după celuloză, împreună reprezentând 60-80% din biomasa terestră. Celulele care işi lignifică pereţii celulari sunt decelabile la microscopul fotonic prin utilizarea unor coloranţi specifici; caracteristice pentru lignificare sunt reacţiile cu sulfat de anilină şi acid sulfuric, care conferă ligninei o culoare galben aurie (deci nuanţează culoarea naturală a ligninei, care este cea galbenă), precum şi cea cu fluoroglucină şi acid clorhidric, care o colorează în roşu. Lignina este foarte greu biodegradabilă; numai anumite bacterii şi câteva ciuperci (Polyporus) sunt capabile să produca peroxidaze şi în prezenţa apei oxigenate să producă o lignoliză completă. Mineralizarea este procesul de impregnare a pereţilor celulari cu diferite săruri minerale şi organice, ceea ce le conferă rigiditate, soliditate şi rezistenţă. Substanţele încrustante sunt reprezentate mai cu seamă de carbonat de calciu şi dioxid de siliciu. Calcificarea - La plantele superioare, calcificarea pereţilor este localizată: astfel, în pereţii unor peri protectori numiţi peri cistolitici (de la cânepă, hamei, mierea ursului) întâlnim concreţiuni amorfe care le conferă o anumită rigiditate; în frunza de la Ficus există structuri numite cistoliţi, în care un repliu intern din perete funcţionează ca loc de acumulare calcaroasă pe un schelet celulozic. Dizolvarea carbonatului de calciu se poate realiza, pe o secţiune transversală prin frunză, cu ajutorul unei picaturi de acid. Silicificarea poate fi întâlnită la algele unicelulare din grupa diatomeelor, peretele acestora fiind constituit din două valve silicificate, inextensibile, foarte fin ornamentate. Tulpinile poaceelor şi ciperaceelor au pereţii celulelor epidermice mineralizaţi,cu o cantitate apreciabilă de dioxid de siliciu. În cazul perilor de la Urtica dioica, cea mai mare parte a peretelui este calcificată; doar vârful este silicificat, ceea ce determină ruperea lui în punctele diferit mineralizate şi transformarea într-un minuscul vârf de ac de seringă, care se adânceşte în piele, lăsând să difuzeze conţinutul celular urticant. Gelificarea este procesul prin care compuşii pectici se îmbibă cu apă, se hidrolizează, transformându-se într-o masa gelatinoasă. Lichefierea poate urma gelificării şi constă în dizolvarea şi dispariţia peretelui celular. Ambele sunt procese de degradare controlată a peretelui celular (autoliză), frecvent întâlnite la celulele ţesuturilor. 15

16 Vacuolele provin fie din dilatările locale ale membranelor RE, fie din diviziunea celor preexistente. Sunt incluziuni inerte apoase, prezente în citoplasmă; ele nu efectuează transformări metabolice şi sunt limitate de tonoplast. Pot fi colorate natural atunci când conţin antociani sau flavone, ori artificial cu coloranţi selectivi de tipul roşului neutru şi albastrului de crezil. În celulele tinere (meristematice) din apexurile radicular şi caulinar vacuolele sunt numeroase, dar foarte mici; pe măsură ce procesul de diferenţiere avansează, vacuolele confluează, ajungând ca în celula adultă să existe o singură vacuolă foarte mare, care ocupă circa 90% din volumul celular. Conţinutul vacuolar este o soluţie de compoziţie complexă, a cărei natură chimică şi concentraţie sunt foarte variabile în funcţie de specie, tip celular şi stare fiziologică. Compuşii încorporaţi în vacuole pot fi grupaţi în două categorii: 1. compuşi intermediari ai metabolismului celular: acizii carboxilici răspunzători de ph-ul conţinutului vacuolar; glucide (zaharoză la trestia de zahar şi sfeclă; inulină îndeosebi la asteracee); acizi aminici şi proteine (care sunt transferaţi în vacuole dupa sinteză de către poliribozomii citoplasmici). 2. compuşi finali ai metabolismului celular: pigmenţii flavonoizi (exclusiv vegetali, semnale atractive esenţiale pentru polenizatori); taninurile (inhibitori ai enzimelor; conferă astringenţă fructelor; oferă protecţie organelor vegetale contra agenţilor patogeni); alcaloizii (cu proprietăţi farmacodinamice foarte variate). Aparatul vacuolar al celulelor din embrion şi acela din celulele albumenului are un comportament particular. În ovulele care se transformă în seminţe, celulele au vacuole mari, hidratate; în cursul maturării seminţelor, vacuolele se deshidratează şi se fragmentează, în acelaşi timp acumulâdu-se o mare cantitate de proteine. La sfârşitul evoluţiei lor, vacuolele vor conţine proteina precipitată (ne referim la granulele de aleurona, care pot fi simple sau compuse, în ultimul caz proteina fiind organizată sub forma unui cristaloid însoţit de o parte neproteică numită globoid). Funcţiile vacuolei: - constituie pentru celulă principala sa rezervă de apă, compus indispensabil multiplelor reacţii de biosinteză: - acumulează substanţe de rezervă sau deşeuri toxice; - contribuie la creşterea celulară; - exercită presiune asupra peretelui celular extensibil şi elastic, care se întinde (starea de turgescenţă celulară, care implică şi fenomene osmotice). 2. Structura si ultrastructura nucleului; diviziunea celulara (mitoza si meioza). ucleul - Este organitul descoperit pentru prima dată de R. Brown în 1831 (1835) în celulele petalelor de orhidee. Ulterior a fost semnalat şi în celula animală. În 1838, M. Schleiden generalizează prezenţa nucleului în toate celulele vegetale. Rolul nucleului în procesele de înmulţire, 16

17 diferenţiere, cancerizare, sinteza proteinelor citoplasmice i-a determinat pe citologi şi biochimişti săi acorde o atenţie prioritară în cercetările lor. Morfologia nucleului interfazic. ucleul eucariotelor este o achiziţie a evoluţiei; la procariote (virusuri, bacterii, cianobacterii) întâlnim un nucleoid (substanţă nucleară, îndeosebi AR şi AD, fără existenţa unei anvelope nucleare). umăr: la eucariote, fiecare celulă are în general un singur nucleu; filamentele dicariotice ale unor basidiomicete au câte doi nuclei; unele alge verzi (Caulerpa, Cladophora) au mai mulţi nuclei. Deosebim astfel: plasmodii, în cazul cariocinezelor neurmate de citocineze şi sinciţii, ce rezultă în urma lizei pereţilor despărţitori. Există şi celule anucleate: articulele tuburilor ciuruite, la care nucleul, devenit inutil în cursul difereţierii celulare, a dispărut. În cazul elementelor moarte la maturitate (vasele de xilem, elementele de sclerenchim, celulele de suber) nucleul a degenerat şi a dispărut o dată cu tot ce era viu în celulă. Forma variază în funcţie de vârstă, forma şi funcţia celulei. În celulele tinere este sferic, iar în cele diferenţiate este eliptic. Forme particulare: semilunară (celulele stomatice ale frunzei de Tradescantia); fusiformă (parenchimul medular din tulpina de la Tilia); filamentoasă (celulele epidermice ale frunzei de Aloe). Poziţia în celulă poate fi: centrală (în celulele meristematice); parietală (în celulele diferenţiate); parietală, dar numai lângă peretele extern (celulele epidermice de la frunza de Aloe); subterminală (în perii absorbanţi radiculari). Mărimea variază de la 0,5-3 micrometri la unele ciuperci şi alge, până la 1000 de micrometri în cazul zigotului de Cycas revoluta; în medie, dimensiunile sunt cuprinse între 5 şi 15 micrometri. Ultrastructură. ucleul prezintă patru componente: - anvelopa (membrana dublă); - unul sau câţiva nucleoli sferici sau ovoizi; - nucleoplasma, substanţa fundamentală optic omogenă ; - cromatina, substanţă cu aspect variabil, dispersată în nucleoplasmă. Anvelopa nucleară cuprinde două membrane simple (fiecare având grosimea de 7,5 nm), separate de un spaţiu perinuclear clar, gros de nm. Anvelopa prezintă pori nucleari, ce ocupă până la 25% din suprafaţa ei, reprezentând deschideri prin care se pun în contact direct hialoplasma şi nucleoplasma. Prin intermediul membranei externe, spaţiul perinuclear este în contact direct cu cavităţile RE (unii autori consideră că membrana nucleară este o porţiune specializată a RE). 17

18 Membrana internă este dublată (în celula animală) pe faţa internă de o pătură groasă (60 nm) de proteine, numită lamină fibroasă. Mitoza (diviziunea ecvaţională) Are loc la formarea celulelor somatice (diploide); plecând de la o celulă diploidă (2n) se ajunge la două celule-fiice, tot diploide. 1. Cariocineza (mitoza în sens restrâns) cuprinde: interfaza, profaza, metafaza, anafaza, telofaza, toate alcătuind ciclul celular, care durează ore, uneori chiar câteva zile. nterfaza este etapa în care se dublează numărul constituenţilor nucleari, mai ales AD; cuprinde trei perioade : G1 (perioada presintetică, cuprinde 25-50% din interfază), când fiecare filament cromatic are o moleculă de AD combinat cu histone; are loc sinteza de ARm; cromozomii sunt monocromatidici; S (perioada sintetică, cuprinde 35-40% din interfază), când continuă sinteza de ARm; se dublează cantitatea de AD; cromozomii sunt bicromatidici; G2 (perioada postsintetică, cuprinde 10-40% din interfază), cand continuă sinteza de ARm; are loc sinteza proteinelor cu rol contractil, necesare formării viitorului fus de diviziune. Profaza: - se individualizează, prin spiralizare şi prin scurtare, cromozomii clivaţi în cele două cromatide unite încă prin centromeri; - începe formarea fusului de diviziune ( fibre proteice cu diametrul de 25 nm) pe seama citoplasmei perinucleare (întâi sub forma unor calote polare, ce se alungesc în formă de conuri; în metafază ele ating polii celulei şi cu bazele se unesc la mijloc); - dispare nucleolul; - membrana nucleară se fragmentează şi dispare; - citoplasma şi nucleoplasma se amestecă, rezultând mixoplasma, în care sunt dispersaţi cromozomii. Metafaza: - se încheie formarea fusului acromatic de diviziune; - cromozomii bicromatidici clivaţi se dispun în planul ecuatorial al celulei, unde se inseră prin centromer de filamentele fusului de diviziune (singurul nedivizat); - braţele cromozomilor sunt orientate spre polii celulei; - se formează astfel placa celulară. Anafaza: - are loc disocierea (separarea) cromatidelor, începând de la centromer (care s-a divizat), astfel încât acum fiecare cromatidă este autonomă, individualizată, cu valoare de cromozom; - cromozomii fii (cromatidele) migrează sincron spre polii fusului de diviziune, cu centromerul spre poli şi braţele spre vechea placă ecuatorială; - cromozomii ating polii fusului, formând două grupe simetrice compacte, cu braţele tasate unele lângă altele; - rol motor în migrarea cromozomilor îl are centromerul, dar ei se mişcă datorită scurtării filamentelor fusoriale cromozomice. Telofaza: - se formează cei doi nuclei fii, tot cu număr dublu de cromozomi, dar aceştia din urmă sunt monocromatidici; - cromozomii se despiralizează, rezultând o nouă reţea cromatică; - ia naştere nucleolul, lângă o zonă specială heterocromatică, numită nucleolară, a unor 18

19 cromozomi cu satelit, organizatori de nucleol; - se formeză membrana nucleară, din fragmente ale membranei iniţiale, care au fost antrenate spre cei doi poli ai fusului de diviziune şi pe seama RE. 2. Citocineza începe la sfârşitul anafazei sau la începutul telofazei. La cormofite, mici vezicule golgiene, bogate în glucide, protide şi lipide, se dispun la ecuatorul fusului de diviziune, cresc, confluează (exceptând locurile ce corespund punctuaţiilor primare, pe unde trec plasmodesmele) şi astfel se organizează fragmoplastul sau placa celulară. Fragmoplastul se întinde treptat centrifugal spre peretele celulei iniţiale, intrată în diviziune, pentru a forma lamela mediană dintre cele două celule fiice. În paralel, fusul de diviziune se dezorganizează, după ce şi filamentele sale participaseră la formarea lamelei mediane. Fiecare din cele două citoplasme sintetizează câte un perete primar şi astfel sunt separate cele două celule- fiice, în care s-au repartizat mai mult sau mai puţin egal diversele organite. Meioza (diviziunea reducţională) Fecundaţia şi meioza apar ca două mecanisme compensatoare: fecundaţia dublează numărul de cromozomi, iar meioza îi reduce la jumătate. La covârşitoarea majoritate a plantelor, meioza precede formarea sporilor. Meioza cuprinde două diviziuni succesive: mitoza reducţională sau heterotipică (un nucleu 2n dă doi nuclei n) şi mitoza ecvaţională sau homeotipică (cei doi nuclei n dau patru nuclei n). Aşadar, meioza are loc la formarea celulelor de reproducere. Mitoza reducţională Profaza durează câteva zile şi cuprinde mai multe subfaze: - leptoten: cromozomii sunt filamente lungi, foarte fine, sinuoase; deşi s-au format cele două cromatide, nu este vizibil clivajul; - zigoten: cromozomii sunt tot filamente lungi, dar împerecheate; cromozomii omologi, paterni şi materni, se apropie şi se unesc doi câte doi, fenomen numit sinapsă, ce conduce la formarea de bivalenţi; - pachiten: cromozomii perechi sunt mai scurţi şi devin mai groşi prin spiralizare unul în jurul altuia; clivajul apare vizibil la extremităţi; - diploten: clivajul este vizibil, cromozomii din fiecare bivalent tind să se separe, dar cromatidele rămân ataşate în mai multe porţiuni numite chiasme; - diacineza: se accentuează spiralizarea, cromozomii devenind foarte scurţi şi groşi; cromozomii omologi din fiecare bivalent se separă şi la nivelul chiasmelor are loc fenomenul de crossing-over (schimb de gene); acum dispar nucleolul şi membrana nucleară, începe să se formeze fusul de diviziune. 19

20 Metafaza : - se termină de format fusul de diviziune; - perechile de cromozomi (bivalenţii clivaţi) se dispun în planul ecuatorial al celulei, cu centromerii de o parte şi de alta a planului ecuatorial. Anafaza : - disocierea anafazică separă cromozomi întregi (clivaţi în cele două cromatide) şi nu cromatide ca în mitoza ecvaţională; - rezultă două loturi de cromozomi bicromatidici care migrează spre poli. Telofaza : - cromozomii bicromatidici s-au regrupat la cei doi poli ai fusului de diviziune; - se formează nucleolul şi anvelopa nucleară. Uneori se formează peretele dintre cele două celule-fiice, deci are loc citocineza. u se mai observă interfaza, deci nu are loc replicarea AD. Mitoza ecvaţională Profaza : - este scurtă; Metafaza : cromozomii se inseră cu centromerul la ecuatorul fusului de diviziune (cele două fuse se dispun perpendicular pe fusul primei mitoze). Anafaza : disocierea anafazică separă cromatide, care migrează spre cei doi poli. Telofaza : - are loc regruparea cromozomilor monocromatidici la polii fusului de diviziune; - se formează pereţi între celule, rezultând o tetradă de spori, mai rar gameţi; - împreună, cele două telofaze reconstiuie patru nuclei haploizi; - se formează nucleolul şi anvelopa nuleară; - cantitatea totală de AD / nucleu este egală cu jumătate din cea a unui nucleu somatic la sfârşitul mitozei. 20

21 STRUCTURA Ş ULTRASTRUCTURA CRMSMULU EUCART Cromosomii fiecărei specii eucariote, de plante sau de animale, au particularităţi morfologice şi numerice caracteristice speciei. Regiune distală braţ scurt telomer satelit cromatide organizator nucleolar (constricţie secundară) Regiune proximală centromer (constricţie primară) Regiune distală braţ lung cromoneme telomer Reprezentarea schematicã a morfologiei şi organizăriii cromosomului la eucariote. Pe lângă constricţia primară, determinantă a poziţiei centromerului, cromosomii au şi constricţii secundare, cu rol în formarea nucleolului, fapt pentru care au primit şi denumirea de organizatori nucleolari. Uneori, cromosomii au la unul din capete un segment numit satelit. umărul nucleolilor dintr-un nucleu este egal cu numărul cromosomilor cu satelit. Centromerul (constricţia primară): - formaţiune de natură proteică, care permite ataşarea cromosomilor la fibrele fusului de diviziune. Regiunile telomerice: - sunt de natură proteică şi se formează prin activarea în primele stadii de dezvoltare; telomerazei - după formare, telomeraza se inactivează, iar regiunile telomerice se scurtează la fiecare ciclu de diviziune. Rolul regiunilor telomerice: - împiedică alipirea cromosomilor în timpul diviziunii - rol de protecţie enzimatică împotriva nucleazelor - se presupune că intervine în vârsta celulei 21

22 rganizatorul nucleolar (constricţia secundară): - deţine informaţia pentru formarea nucleolilor. Structura internă a cromosomilor la eucariote. Referitor la compoziţia chimică a cromosomilor eucariotelor, s-a stabilit că principala componentă o constituie substanţa cromatică, denumită cromatină, alcătuită, la rândul ei, din acizi nucleici şi proteine. S-a constatat că partea proteică este reprezentată de proteine histonice, notate cu H1, H2A, H2B, H3 şi H4. Aceste cinci histone au secvenţă aminoacidică asemănătoare la majoritatea plantelor şi animalelor, ceea ce sugerează că gena care este responsabilă de biosinteza lor are o origine foarte îndepărtată şi nu a suferit prea multe mutaţii, pe întregul parcurs al procesului filogenezei. Patru dintre proteinele histonice (H2A, H2B, H3 şi H4) formează octameri, particule în jurul cărora se înfăşoară AD, care, împreună cu proteina H1 alcătuiesc nucleosomul. ucleosomul este considerat, structura de bază a cromosomului. Analizele cu raze X au dovedit că nucleosomii sunt legaţi între ei prin AD neasociat cu histone, fiind sub forma unei fibrile de aproximativ 10 nm grosime. În celulele eucariotelor cu organizare superioară, nucleosomii conţin aproximativ pb de AD, un octamer histonic alcătuit din câte două molecule de H2A, H2B, H3 şi H4 şi o moleculă de H1. De asemenea, există şi un fragment de 27pb (perechi de baze), care nu este direct asociat cu octamerul histonic. Acest fragment conectează, între ei, doi nucleosomi consecutivi. Lungimea AD pliat în jurul octamerului histonic este variabilă. În general, octamerul histonic are în jurul lui aproximativ 1,7 ture de AD (adică 146 pb). ctamerul histonic împreună cu cele 146 perechi de nucleotide alcătuiesc miezul, sâmburele, particula centrală a nucleosomului. Astfel, în conformitate cu acest model, există un disc de 11nm diametru, care are 1,7 ture de acid dezoxiribonucleic, înfăşurat în jurul lui. Cele 146 de pb ale acidului dezoxiribonucleic nu sunt repartizate uniform în jurul octameruiui histonic. Tetramerii 2H3 şi 2H4 interacţionează cu macromolecula de AD. S-a demonstrat că partea centrală a octameruiui are histonele H3 şi H4, celelalte două histone fiind la exteriorul lor (pe feţele discului). ntegritatea octameruiui este asigurată de interacţiunile puternice între moleculele de histone (H2A interacţionează cu H2b şi cu H3, H2B cu H2A şi cu H4, H3 cu H4). 22

23 ucleosomii împreună cu acidul dezoxiribonucleic linker alcătuiesc o fibră cromatică de 11 nm grosime care se spiralizează, la rândul ei, dând un solenoid de 30 nm grosime. În solenoid nucleosomii sunt aranjaţi într-un helix de stânga, câte 6 pe tura de helix, cu o grosime a spiralei solenoidului egalã cu diametrul nucleosomului - adicã 11 nm. Histona H 1 este localizatã în sau lângã centrul solenoidului. AD-ul din componenţa solenoidului este, la rândul lui, constituit din douã pãrţi - o parte ataşatã la miezul histonic şi o altã parte cu rol de linker, care asambleazã nucleosomii în solenoid. Cromosomii metafazici, care sunt eliberaţi de aproximativ 99% din conţinutul lor histonic, îşi pãstreazã AD-ul în formã aproximativ constantã (asemenea cromosomilor iniţiali, intacţi), probabil tocmai din cauzã cã AD-ul este ataşat, în numeroase puncte, la scheletul proteic nonhistonic intern. Acest schelet constã, în primul rând, din douã proteine, desemnate prin Sc1 şi Sc2, cu greutãţi moleculare de 170 kd şi, respectiv, de 135 kd. Sc1 este Topoizomeraza, buclele radiale ale AD-ului fiind ataşate la aceastã proteinã, în punctele numite SAR (în englezã scaffolding attaching regions - regiuni de ataşare la schelet). Eucromatina reprezintã materialul normal, izopicnotic, deţinãtorul informaţiei genetice, cu comportament tipic în cazul diviziunii celulare (se spiralizeazã, se condenseazã, se decondenseazã şi se coloreazã). La rândul ei, eucromatina este de douã tipuri: eucromatina activã şi eucromatina permisivã. Eucromatina activã conţine genele ce vor fi transcrise în ARm. 23

24 Eucromatina permisivã este reprezentatã de acea porţiune din eucromatinã care devine activã doar dupã ce acceptã (permite) semnale declanşatoare (din categoria hormonilor, enzimelor etc.). Procesul autoreplicãrii semiconservative a AD-ului, în faza S din ciclul diviziunii celulare, începe la nivelul eucromatinei. În consecinţã, replicarea eucromatinei este mult mai timpurie, în comparaţie cu cea a heterocromatinei. Heterocromatina reprezintã materialul unor regiuni (uneori al unor întregi cromosomi) heteropicnotice, caracterizate prin structurã densã şi compactã, inclusiv în telofazã, interfazã şi profaza timpurie. Din aceste cauze, heterocromatina se coloreazã intens şi este vizibilã şi în interfaza ciclului celular. Heterocromatina este componenta preferenţialã a cromosomilor sexuali şi a celor suplimentari (cromosomii B). Sunt unele specii (broaştele ţestoase, unii viermi) la care întregul set cromosomial este heterocromatic. TRASCRPŢA Ş TRASLAŢA FRMAŢE GEETCE Transcripţia este procesul prin care regiuni din AD (gene) sunt copiate în ARm cu ajutorul enzimelor AR-polimeraze. Transcripţia mai este cunoscută şi sub numele de expresie a genelor. Toate cele trei tipuri de AR celular (ARm, ARr, ARt) se sintetizează printr-un mecanism complex cunoscut sub numele de transcrierea AR, sau transcripţia AD. Rolul principal în acest proces biosintetic îl joacă enzima AR-polimeraza-AD-dependentă care necesită în calitate de substrat cei patru ribonucleosid-5 ' -trifosfaţi (ATP, GTP, CTP, UTP), a ionilor de Mg 2+ şi Mn 2+, precum şi prezenţa în calitate de template a AD dublu-catenar. Secvenţele de ARm sunt în aşa fel prezentate, astfel încât sinteza să se desfăşoare de la stânga la dreapta, în direcţia 5 3 Copierea informaţiei de pe catena antisens a AD şi sinteza ARm La eucariote există diferite ARpolimeraze pentru cele trei tipuri de AR transcrise, în timp ce la procariote există o singură ARpolimerază care este implicată în transcrierea celor trei tipuri de AR. Biosinteza AR sub acţiunea AR-polimerazei-AD-dependente se desfăşoară în patru etape: legarea matriţei, iniţierea transcrierii, elongarea catenei AR, terminarea transcrierii. 24

25 Prima etapă (legarea matriţei) constă în interacţiunea AR-polimerazei cu AD-ul matriceal, când se formează un complex binar ce poate lega în continuare ribonucleosid-trifosfatul pentru a iniţia sinteza lanţului polinucleotidic de AR. AR-polimeraza se ataşează stabil la nivelul unei secvenţe specifice de AD, secvenţă numită promotor. Promotorii reprezintă fragmente cu până la 50 de dezoxiribonucleotide, localizate imediat înaintea genei (la eucariote), sau înaintea grupului de gene (la procariote) a cărei informaţie genetică trebuie transcrisă în AR. Promotorul conţine mai multe secvenţe aflate la distanţe diferite de situsul start, care cuprind până la 6 nucleotide (GGCGGG secvenţă numită şi GC box, TATAAT TATA box). După legarea la promotor, are loc desfacerea (despiralizarea) dublului helix de AD, formându-se aşa-numita buclă de transcriere, sau complex deschis la nivelul căruia punţile de hidrogen scindează. A doua etapă: Din situsul start se iniţiază biosinteza lanţului de AR când ARpolimeraza debutează prin reacţia dintre ATP sau GTP cu o a doua moleculă de ribonucleosidtrifosfat, rezultând un dinucleotid care mai conţine un radical ortofosfat la capătul 3'. Succesiunea bazelor azotate din promotor nu este transcrisă în catena de AR nou sintetizat. Elongarea (a treia etapă) catenei de AR se realizează prin legarea succesivă a câte unui nou ribonucleotid la gruparea H liberă din poziţia 3' a dinucleotidului, respectiv a polinucleotidului precedent. Formarea legăturilor fosfodiesterice între ribonucleotide se realizează numai în direcţia 5 ' 3 ', ceea ce înseamnă că AR-polimeraza începe să acţioneze la capătul 3 ' al catenei de AD ce urmează a fi transcrisă. Catena matricială (de AD) formează cu catena de AR aflată în creştere un hibrid molecular AD-AR temporar, prin intermediul punţilor de hidrogen ce se stabilesc între bazele azotate complementare. Deci, catena de AR ce se sintetizează este complementară din 25

26 punctul de vedere al structurii sale primare cu catena de AD utilizată drept matriţă. Alungirea lanţului de AR se continuă până când se ajunge la o altă secvenţă specială de pe AD, secvenţă formată din trei nucleotide, numită semnal stop (a patra etapă terminarea transcrierii). Semnalul stop, numit şi semnal de terminare este reprezentat de un anumit bloc de baze azotate perechi. În momentul în care AR-polimeraza ajunge în dreptul situsului stop, ea se desprinde de pe AD, eliberându-se în acelaşi timp şi molecula de AR transcris. Spre deosebire de replicarea AD, care este semiconsevativă, transcrierea acestuia este un proces complet conservativ. Macromoleculele de AR astfel sintetizate sunt apoi supuse maturării post-trascripţionale. cu AR-polimeraza, şi. Eucariotele au trei tipuri de AR-polimeraze, fiecare fiind responsabilă pentru transcrierea a diferite seturi de gene. Aceste enzime au fost notate AR-polimerazele sunt molecule proteice mari, unele din ele având molecula alcătuită din mai multe subunităţi. De exemplu, AR-polimeraza din Escherichia coli este o enzimă care conţine în moleculă patru subunităţi, notate cu,, şi, alături de ioni de zinc. Deosebirea esenţială dintre cele trei AR-polimeraze ale eucariotelor, constă în localizarea celulară şi în funcţiile acestora: - AR-polimeraza este localizată preponderent în nucleol şi catalizează biosinteza AR ribosomal. - AR-polimeraza este localizată în principal în nucleoplasmă şi este implicată în biosinteza AR mesager (AR informaţional) ce va fi decodificat în procesul translaţiei informaţiei genetice. - AR-polimeraza este localizată în nucleoplasmă şi participă la biosinteza AR transportor, precum şi la transcrierea moleculelor foarte mici de AR 5S, molecule care intră în structura ribosomilor. 26