Επαλήθευση μεθόδων, υπολογισμός αβεβαιότητας, υπολογισμός τιμών αναφοράς

Transcript

1 Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Συμπληρωματικές σημειώσεις για το μάθημα Διαπίστευση Βιοϊατρικών Εργαστηρίων Επαλήθευση μεθόδων, υπολογισμός αβεβαιότητας, υπολογισμός τιμών αναφοράς ΠΕΤΡΟΣ Λ. ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ Βιολόγος Msc, PhD, EurClinChem Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΘΟΔΩΝ ΕΛΕΓΧΟΥ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Έκδοση Πέμπτη ΑΘΗΝΑ 2017

2 Εισαγωγή Όποτε το εργαστήριο αρχίζει να εφαρμόζει μία καινούργια μέθοδο δηλαδή όποτε αλλάζει προμηθεύτρια εταιρεία αντιδραστηρίων ή αλλάζει αναλυτή θα πρέπει να προβαίνει στην επαλήθευση της μεθόδου. Θα πρέπει δηλαδή να υπολογίσει τις ακόλουθες παραμέτρους: 1. Όριο ανίχνευσης 2. Όριο ποσοτικοποίησης 3. Ορθότητα (ανάκτηση ή μεροληψία) 4. Επαναληψιμότητα 5. Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα Στη περίπτωση όμως που το εργαστήριο επιθυμεί να κάνει αλλαγές στην μέθοδο που έχει προμηθευτεί ή ακόμα και να φτιάξει μία δική του μέθοδο τότε θα πρέπει να την διαδικασία της επικύρωσης της μεθόδου. Στη πράξη θα κάνει όλα αυτά που περιλαμβάνει η επαλήθευση συν τον υπολογισμό του ορίου γραμμικότητας και του αλληλεπιδράσεων (δηλαδή των αλληλεπιδράσεων από την παρουσία αιμοσφαιρίνης, χολερυθρίνης κ.α.) Όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης Όριο ανίχνευσης (Limit Of Detection ή LOD) To όριο ανίχνευσης μιας μεθόδου είναι η ελάχιστη συγκέντρωση μιας ουσίας που μπορεί να μετρηθεί με την μέθοδο αυτή. Η συγκέντρωση αυτή δεν αποτελεί αξιόπιστη μέτρηση και αποτελεί απλά μία τιμή συγκέντρωσης πάνω από αυτή του τυφλού. Μαθηματικά ισούνται με την ελάχιστη συγκέντρωση της ουσίας που έχει συγκέντρωση τριπλάσια από την τυπική απόκλιση διαδοχικών μετρήσεων του τυφλού. Για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης (LOD) απαιτείται ο υπολογισμός της τυπικής απόκλισης SD της μεθόδου σε μηδενική συγκέντρωση. Αυτός ο υπολογισμός της τυπικής απόκλισης γίνεται με δύο διαφορετικούς τρόπους ανάλογα με τη μορφή της καμπύλης αναφοράς. 2

3 Γραμμική καμπύλη αναφοράς. Πρόκειται για καμπύλες αναφοράς της μορφής y=αx όπως συμβαίνει στις χρωματομετρικές εξετάσεις (π.χ. ουρία, χοληστερόλη, LDH κ.α.). Σε αυτή την περίπτωση αραιώνουμε ένα δείγμα κοντά στο όριο του τυφλού. Για να το βρούμε αυτό συμβουλευόμαστε το εσώκλειστο φυλλάδιο του αντιδραστηρίου. Μέσα αναφέρει σε κάποιο σημείο το εύρος μέτρησης (measuring range) δηλαδή το εύρος: όριο ποσοτικοποίησης όριο γραμμικότητας. Μέσα σε αυτό το εύρος μπορούν να γίνουν με ασφάλεια οι μετρήσεις. Η τιμή μέχρι την οποία θα αραιωθεί το δείγμα που επιλέξαμε είναι γύρω στο όριο ποσοτικοποίησης. Κάνουμε τουλάχιστον έξι μετρήσεις κοντά στο όριο αυτό. Π.χ. Έστω ότι ο μέσος όρος των έξι μετρήσεων είναι 0,15 mg/dl και η τυπική απόκλιση 0,012 mg/dl. Toτε LOD = 0,012 x 3 = 0,036 mg/dl. Όταν η καμπύλη βαθμονόμησης δεν είναι γραμμική τότε: 1. Πραγματοποιούνται 10 μετρήσεις των παρεχόμενων βαθμονομητών, στα διαθέσιμα επίπεδα συγκεντρώσεων και υπολογίζεται η μέση τιμή μ και η τυπική απόκλιση SD ανά επίπεδο. 2. Τα αποτελέσματα τοποθετούνται σε διάγραμμα δύο αξόνων το οποίο ονομάζεται διάγραμμα ανακρίβειας. Στον άξονα των x τοποθετούνται οι τιμές των μέσω τιμών των συγκεντρώσεων και στον άξονα των y οι τιμές της τυπικής απόκλισης. 3. Υπολογίζεται με τη βοήθεια της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων η εξίσωση γραμμικής ευθείας της μορφής y=αx+b και προσδιορίζεται η τιμή της τυπικής απόκλισης SD για μηδενική συγκέντρωση (x=0 άρα SD=b). LOD = 3 x SD για στάθμη εμπιστοσύνης 99,87% LOD = 2 x SD για στάθμη εμπιστοσύνης 95% Όριο ποσοτικοποίησης (Limit Of Quantification ή LOQ) Το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) ή λειτουργική ευαισθησία είναι η ελάχιστη συγκέντρωση της μετρούμενης παραμέτρου που μπορεί να προσδιοριστεί ποσοτικά με αποδεκτή ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Tο όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) δίνεται από τον τύπο: LOQ = 10 SD 3

4 To όριο ποσοτικοποίησης είναι η μικρότερη τιμή που πρέπει να δίνεται στους ασθενείς. Αν π.χ. για μια εξέταση το όριο ποσοτικοποίησης είναι 5 τότε για τιμές αποτελεσμάτων μικρότερες του 5 δίνουμε < 5. Παράδειγμα προσδιορισμού ορίου ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης για αναλύσεις με μη γραμμική καμπύλη αναφοράς Στο παράδειγμα για έναν αναλύτη πραγματοποιούνται από 10 αναλύσεις σε κάθε ένα από τους τρεις βαθμονομητές του και υπολογίζεται η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση. Ελλείψει τριών βαθμονομητών μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένας βαθμονομητής και να γίνουν δύο αραιώσεις σε αυτόν και μετά από 10 μετρήσεις. Α (ng/ml) Β (ng/ml) Γ (ng/ml) 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,43854 Μέση τιμή: 0, , ,28687 Τυπική απόκλιση: 0, , , Κατασκευάζεται στην συνέχεια διάγραμμα ανακρίβειας με τις τιμές της μέσης τιμής και τυπικής απόκλισης. Οι τιμές της τυπικής απόκλισης θα πρέπει να έχουν τοποθετηθεί από την μικρότερη προς την μεγαλύτερη. Αυτή την σειρά θα έχουν προφανώς και οι μέσες τιμές. 4

5 Τυπική απόκλιση 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 y = 0,0116x + 0,0136 R² = 0, Mέση τιμή Εμείς αναζητούμε την τυπική απόκλιση των διαδοχικών μετρήσεων όταν η μέση τιμή τους είναι μηδέν. Αναζητούμε δηλαδή την μέση τιμή των μετρήσεων του τυφλού. Η γραμμή παλινδρόμησης είναι y = 0,0116x + 0,0136. Κατά συνέπεια όταν η μέση τιμή x είναι μηδέν η τυπική απόκλιση είναι SD = 0,0136. Για διάστημα εμπιστοσύνης 95% θα ισχύει: Άρα το όριο ανίχνευσης είναι LOD = 3 x 0,0136 = 0,0408 ng/ml Το όριο ποσοτικοποίησης είναι LOQ = 10 x 0,0136 = 0,136 ng/ml Ορθότητα και πιστότητα Δύο σημαντικά μεγέθη που επηρεάζουν την ποιότητα των μετρήσεων είναι η πιστότητα (και η ορθότητα. Η ορθότητα ή αλλιώς η έλλειψη ακρίβειας ισούνται με το συστηματικό σφάλμα της μεθόδου και η πιστότητα με το τυχαίο σφάλμα της μεθόδου. Το πρώτο σφάλμα μπορεί να αποφευχθεί με βαθμονόμηση του αναλυτή, το δεύτερο όμως είναι αναπόφευκτο και μπορεί μόνο με σωστή χρήση του αναλυτή και των αντιδραστηρίων να περιοριστεί. Ορθότητα (Trueness) Η ορθότητα ορίζεται ως ανάκτηση (recovery) ή μεροληψία (bias) ανάλογα με τον τρόπο υπολογισμού. Η ορθότητα δείχνει την έλλειψη ακρίβειας (inaccurancy%). Στη πράξη είναι η διαφορά κάθε μέτρησης (x i ) από την αληθή τιμή (μ). Bias = x i μ 5

6 Επειδή όμως η αληθή τιμή είναι πολλές φορές άγνωστη - εκτός και εάν είναι δυνατόν να γίνει προσδιορισμός με πρότυπες μεθόδους η ορθότητα ορίζεται συνήθως ως η διαφορά μίας τιμής από την μέση τιμή όσο το δυνατόν πιο σωστών μετρήσεων. Bias = xi 1ος τρόπος. Υπολογισμός μεροληψίας με πείραμα. Χρησιμοποιείται η τιμή του βαθμονομητή (calibrator) η οποία έτσι και αλλιώς έχει υπολογιστεί από την παρασκευάστρια εταιρεία με πρότυπες μεθόδους. Η τιμή αυτή συμβολίζεται Cstd. Παράλληλα προσδιορίζεται η τιμή ενός δείγματος εις τριπλούν και υπολογίζεται ο μέσος όρος τους (Co). Αναμιγνύεται σε ίσα μέρη (1:1) βαθμονομητής και δείγμα και μετράται το νέο δείγμα πάλι τρεις φορές (Cτελ). H ανάκτηση υπολογίζεται από την παρακάτω εξίσωση: ή αλλιώς: Παράδειγμα Έστω ότι για την χοληστερόλη η τιμή του βαθμονομητή είναι 200 mg/dl. Πήραμε ένα δείγμα και το μετρήσαμε 3 φορές και πήραμε τιμές 240, 243, 238 mg/dl. Αναμίξαμε σε ίσα μέρη δείγμα και βαθμονομητή και το μετρήσαμε για χοληστερόλη πάλι επί τρεις φορές και πήραμε τις τιμές 221, 223, 218 mg/dl. Έχουμε: Co = 240,3 mg/dl, Cst = 200 mg/dl και Cτελ = 220,6 mg/dl Oπότε Αυτό πρακτικά σημαίνει ότι η ανάκτηση είναι ,45 = 0,45%. 6

7 Μερικές φορές επιλέγονται δείγματα ελέγχου αντί του βαθμονομητή για πρακτικούς ή οικονομικούς λόγους. Ο λόγος είναι ότι σε πολλούς αναλυτές κάθε εξέταση έχει τον δικό της βαθμονομητή σε αντίθεση με τα δείγματα ελέγχου όπου χρησιμοποιούνται τα ίδια για πολλές εξετάσεις, οπότε είναι βολικότερη η χρησιμοποίησή τους. 2ος τρόπος. Υπολογισμός μεροληψίας από τις τιμές του εργαστηρίου. Δεν είναι η καλύτερη μέθοδος αλλά εφαρμόζεται όταν δεν υπάρχει βαθμονομητής ή και για τη μείωση του κόστους. Χρησιμοποιείται εδώ η μέση τιμή των ημερήσιων τιμών ελέγχου και η μέση τιμή των ορίων ελέγχου (μ). Π.χ. έστω ότι για το ουρικό οξύ η μέση τιμή 20 ημερήσιων τιμών ελέγχου δηλαδή 20 διαδοχικών ημερών είναι 5,8 mg/dl. Εάν η μέση τιμή του ορίου ελέγχου του ίδιου control είναι 6,1 mg/dl η ανάκτηση είναι: Πιστότητα (Precision) Προηγουμένως αναφέρθηκε η έλλειψη επαναληψιμότητας ως το τυχαίο σφάλμα μιας αναλυτικής μεθόδου. Η πιστότητα είναι ένας γενικότερος όρος και περιλαμβάνει τόσο την επαναληψιμότητα όσο και την αναπαραγωγιμότητα. Σε γενικές γραμμές οι όροι αυτοί σημαίνουν τα εξής: Η επαναληψιμότητα (repeatability ή r) είναι διασπορά των τιμών διαδοχικών μετρήσεων που έγιναν στον ίδιο αναλυτή, με τα ίδια αντιδραστήρια, με την ίδια βαθμονόμηση και τις ίδιες εξωτερικές περιβαλλοντικές συνθήκες και μέσα στην ίδια ημέρα. H επαναληψιμότητα προσδιορίζεται από διαδοχικές μετρήσεις του ίδιου δείγματος που πραγματοποιούνται μέσα στην ίδια ημέρα (intra-assay) με τις συνθήκες που 7

8 περιγράψαμε. Κάθε μέτρηση θα πρέπει να διαφέρει από την άλλη τουλάχιστον 15 λεπτά. Το δείγμα που χρησιμοποιείται στις μετρήσεις μπορεί να είναι μεμονωμένο δείγμα ή ανάμιξη (pooled sample) διαφορετικών δειγμάτων. Μέτρο της επαναληψιμότητας είναι ο συντελεστής επαναληψιμότητας CVr ή αλλιώς η σχετική τυπική απόκλιση RSDr που υπολογίζεται από την μέση τιμή και την τυπική απόκλιση των διαδοχικών μετρήσεων. Η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα (interlaboratory reproducibility ή R) ή ενδιάμεση πιστότητα είναι η διασπορά των τιμών διαδοχικών μετρήσεων διαφορετικών ημερών (inter-assay). Οι μετρήσεις αυτές γίνονται υπό διαφορετικές συνθήκες αφού μεταξύ των διαφορετικών ημερών πολλές συνθήκες της ανάλυσης έχουν αλλάξει π.χ. αντιδραστήριο, βαθμονόμηση, περιβαλλοντικές συνθήκες κ.α. Μέτρο της αναπαραγωγιμότητας είναι ο συντελεστής μεταβλητότητας CVR ή η σχετική τυπική απόκλιση RSDR. Προσδιορίζεται από την μέση τιμή και την τυπική απόκλιση των μετρήσεων διαδοχικών ημερών. Ο υπολογισμός της πιστότητας. Η πιστότητα είναι το αλγεβρικό άθροισμα της RSDr και RSDR. To άθροισμα αυτό υπολογίζεται ως εξής: Π.χ. Κατά κανόνα η αναπαραγωγιμότητα είναι μεγαλύτερη από την επαναληψιμότητα (RSDR > RSDr π.χ. 4,5% > 2,35%). Το ολικό σφάλμα της αναλυτικής μεθόδου (Total Error ή ΤΕ) Το άθροισμα της πιστότητας και της ορθότητας ισούνται με το ολικό σφάλμα της αναλυτικής μεθόδου. Αυτό ισούνται με: TE = Bias% + 1,65 Precision% 8

9 Τα όρια ανοχής των τιμών ορθότητας και πιστότητας Οι τιμές πιστότητας (επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας) καθώς και ορθότητας (ανάκτησης ή μεροληψίας) θα πρέπει να ελέγχονται για το αν τηρούνται συγκριμένες προδιαγραφές. Συγκεκριμένα: Α. Το εργαστήριο συγκρίνει τις τιμές πιστότητας και ορθότητας με αυτές που δίνει η κατασκευάστρια εταιρεία των αντιδραστηρίων. Σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή οδηγία EC 98/79 όλα τα αντιδραστήρια που κυκλοφορούν στην Ευρωπαϊκή Ένωση θα πρέπει να συνοδεύονται από εσώκλειστο φυλλάδιο που περιέχει όλες τις πληροφορίες επικύρωσης της αναλυτικής μεθόδου, μεταξύ αυτών και της πιστότητας και ορθότητας. Θα πρέπει οι τιμές που υπολόγισε το εργαστήριο στο πλαίσιο της επαλήθευσης της μεθόδου να είναι μικρότερες ή ίσες από αυτές που δίνει η εταιρεία. Β. Τα τελευταία χρόνια έχει γίνει μια διεθνή προσπάθεια να υπολογιστούν συγκεκριμένα όρια πιστότητας, ορθότητας και ολικού σφάλματος κοινά αποδεκτά από όλη την επιστημονική κοινότητα. Η συλλογή όλων αυτών των δεδομένων από τη διεθνή βιβλιογραφία έγινε από μία Ισπανική ομάδα κλινικών χημικών υπό την Dr Carmen Ricos. Tα όρια που υπολόγισε αυτή η επιστημονική ομάδα βασίζονταν κυρίως στη μέση βιολογική μεταβλητότητα των ουσιών εντός του ίδιου ανθρώπου (CVBW%) και εντός διαφορετικών ημερών (CVBb%). To ανώτερο όριο πιστότητας έχει οριστεί ως: Πιστ τητα < 0,5 CVBW% To ανώτερο όριο για την ορθότητα έχει οριστεί ως: 9

10 Αβεβαιότητα (Uncertainty) Ως αβεβαιότητα πρακτικά ορίζεται ως η διασπορά των τιμών που μπορούν να αποδοθούν το μετρούμενο συστατικό. Διαφέρει από την έννοια του σφάλματος στο ότι ενώ το σφάλμα αναφέρεται στη διαφορά μιας τιμής από την αληθή τιμή, η αβεβαιότητα αναφέρεται στη διασπορά των τιμών γύρω από την αληθή τιμή. Μαθηματικά η αβεβαιότητα μοιάζει με την τυπική απόκλιση διαφέρει όμως από αυτή στο ότι κατά τον υπολογισμό της δεν συμπεριλαμβάνονται μόνο τιμές επαναληπτικών μετρήσεων αλλά και μετρήσεις που προέρχονται από πιστοποιητικά διακριβώσεων, εμπειρικές μετρήσεις κ.α. Υπάρχουν δύο τύποι αβεβαιότητας: Αβεβαιότητα τύπου Α. Εκτιμάται με σειρά επαναλαμβανομένων μετρήσεων με στατιστικές μεθόδους. Αφορά την πιστότητα και την ανάκτηση. Αβεβαιότητα τύπου Β. Εκτιμάται με άλλες μεθόδους εκτός στατιστικής όπως πιστοποιητικά διακριβώσεων, με εμπειρικές μετρήσεις κ.α. Στη κλινική χημεία αφορά κυρίως την αβεβαιότητα των βαθμονομητών και των πιπεττών. H αβεβαιότητα συμβολίζεται ως U και όπως θα δούμε παρακάτω υπάρχουν πολλές διαφορετικές μορφές της. Tα πειράματα (αβεβαιότητα τύπου Α) και τα πιστοποιητικά υπολογίζουν την λεγόμενη τυπική αβεβαιότητα η οποία έχει την ίδιες μονάδες μέτρησης με τις μετρήσεις και αντιστοιχεί σε ένα συγκεκριμένο επίπεδο τιμών. Για τον υπολογισμό της ολικής αβεβαιότητας χρειάζεται όμως να εξαλειφθούν οι μονάδες μέτρησης καθώς επίσης αυτή να είναι ανεξάρτητη από το επίπεδο τιμών των μετρήσεων. Για τον λόγο αυτό η τυπική αβεβαιότητα μετατρέπεται σε σχετική αβεβαιότητα. Το άθροισμα των σχετικών αβεβαιοτήτων είναι η συνδυασμένη αβεβαιότητα. Αυτή όμως που τελικά λαμβάνεται υπόψη είναι η διευρυμένη αβεβαιότητα η οποία υπολογίζεται στο τέλος αυτής της αλυσίδας υπολογισμών και ισούνται συνήθως με το διπλάσιο της συνδυασμένης αβεβαιότητας. Που χρησιμεύει ο υπολογισμός της αβεβαιότητας Ο υπολογισμός της αβεβαιότητας αποτελεί βασική απαίτηση για κάθε εργαστήριο που θέλει να διαπιστευθεί κατά ISO Η αβεβαιότητα προσφέρει στο εργαστήριο ένα 10

11 δείκτη ποιότητας. Όσο μικρότερη είναι η αβεβαιότητα τόσο καλύτερη η ποιότητα της εξέτασης. Επιπλέον βοηθά στη σύγκριση διαφορετικών αποτελεσμάτων του ίδιου ασθενούς. Έστω για παράδειγμα ότι η τιμή της κρεατινίνης ενός ασθενούς ήταν πριν τρεις ημέρες 1,4 mg/dl. Εάν σήμερα η τιμή της κρεατινίνης είναι 1,6 mg/dl και η αβεβαιότητα (U) της εξέτασης είναι 0,2 mg/dl, οι δύο τιμές διαφέρουν μεταξύ τους; Απάντηση H διασπορά των τιμών γύρω από την πρώτη τιμή κρεατινίνης είναι 1,6 ± 2 x 0,2 mg/dl δηλαδή από 1,0 έως 1,8 mg/dl. Η διασπορά γύρω από τη δεύτερη τιμή κρεατινίνης είναι 1,2 έως 2 mg/dl. Τα δύο σύνολα τιμών αλληλεπικαλύπτονται. Κατά συνέπεια δεν μπορούμε να αποφανθούμε με ακρίβεια εάν η τιμή 1,6 mg/dl είναι μεγαλύτερη από αυτή των 1,4 mg/dl. O γιατρός δεν θα πρέπει να θεωρήσει αυτή την τιμή είναι σίγουρα αυξημένη. Τι προϋποθέσεις πρέπει να τηρεί το εργαστήριο για τον υπολογισμό της αβεβαιότητας των εξετάσεων του Πριν τον υπολογισμό της αβεβαιότητας θα πρέπει το εργαστήριο να έχει φτάσει σε υψηλά επίπεδα ποιότητας. Συγκεκριμένα: o o o o o Θα πρέπει να διερευνήσει ποιοι παράγοντες μπορούν να επιδράσουν στον προσδιορισμό της ουσίας. Αραιώσεις, βαθμονομητής, φυγόκεντρος, συνθήκες αποθήκευσης, αναλυτής κ.α. Θα πρέπει να έχει φροντίσει έτσι ώστε ο εξοπλισμός του πχ αναλυτές, φυγόκεντροι κ.α. να είναι ο κατάλληλος και σωστά συντηρημένος. Όλα τα όργανα που επιδέχονται διακρίβωση θα πρέπει να έχουν διακριβωθεί και να έχει υπολογιστεί η αβεβαιότητά τους. Σε όλους τους αναλυτές θα πρέπει να γίνεται εσωτερικός έλεγχος ποιότητας και να έχει υπολογιστεί η αβεβαιότητά τους. Θα πρέπει να ελέγχονται τακτικά οι περιβαλλοντικές συνθήκες που μπορεί να επηρεάσουν τις δοκιμές και να λαμβάνονται μέτρα όταν αυτά δεν είναι μέσα στα επιθυμητά όρια. 11

12 Θα πρέπει να τονιστεί ότι ο υπολογισμός της αβεβαιότητας αφορά μόνο τις ποσοτικές μετρήσεις και όχι τις ποιοτικές ή ημιποσοτικές. Πόσες πηγές αβεβαιότητας υπάρχουν; Προκειμένου να γίνει ο υπολογισμός της αβεβαιότητας μιας εξέτασης θα πρέπει να αναζητηθούν τα αίτια της αβεβαιότητας. Για τον λόγο αυτό είναι καλό να γίνει το διάγραμμα αιτίας αποτελέσματος του Ishikawa ή αλλιώς ψαρακόκκαλο. Δείτε στο ακόλουθο διάγραμμα τα αίτια αβεβαιότητας ενός προσδιορισμού κλινικής χημείας. Υπολογισμός αβεβαιότητας τύπου Α Αβεβαιότητα από επαναληψιμότητα Τυπική αβεβαιότητα. Ισούνται με την τυπική απόκλιση διαδοχικών μετρήσεων δηλαδή U SD = SD. Δηλαδή η U SD είναι η τυπική απόκλιση διαδοχικών μετρήσεων που ελήφθησαν μέσα στην ίδια ημέρα, με τα ίδια αντιδραστήρια και βαθμονομητή 1. H σχετική τυπική αβεβαιότητα. Ισούνται με:. Όπου είναι η μέση τιμή των διαδοχικών μετρήσεων που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα της επαναληψιμότητας. H επί τοις εκατό (%) σχετική τυπική αβεβαιότητα. Ισούνται με:. 1 Συνήθως χρησιμοποιείται η αναπαραγωγιμότητα αντί της επαναληψιμότητας. 12

13 Αβεβαιότητα από ανάκτηση H τυπική αβεβαιότητα. Ισούνται με:. Όπου SD bias η τυπική απόκλιση των n διαδοχικών μετρήσεων που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα της ανάκτησης. Συνήθως ο αριθμός αυτός είναι 6 (n=6). Η σχετική τυπική αβεβαιότητα. Ισούνται με: Όπου ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων από τη δοκιμή της ανακτήσεως. H επί τοις εκατό (%) σχετική τυπική αβεβαιότητα. Ισούνται με:. Υπολογισμός αβεβαιότητας τύπου Β Στον προηγούμενο τύπο μπορεί να προστεθεί και οποιαδήποτε άλλη αβεβαιότητα από οποιαδήποτε αιτία π.χ. αβεβαιότητα πιπέττας εφόσον χρησιμοποιείται στην ανασύσταση του βαθμονομητή και η αβεβαιότητα του βαθμονομητή που δίνεται από την εταιρεία. Η αβεβαιότητα του βαθμονομητή Εφόσον ο βαθμονομητής της αναλυτικής μεθόδου είναι πιστοποιημένο υλικό αναφοράς (CRM ή Certified Reference Material) συνοδεύεται από ένα πιστοποιητικό ιχνηλασιμότητας (traceability certificate) όπου αναγράφεται η αβεβαιότητα του. Η αβεβαιότητα προσφέρεται για κάθε βαθμονομητή που χρησιμοποιείται για την καμπύλη αναφοράς της εξέτασης. Προσοχή: Τα πιστοποιητικά αβεβαιότητας που συνοδεύουν τους βαθμονομητές αναγράφουν την διευρυμένη αβεβαιότητα και όχι την τυπική. Επειδή όμως στους υπολογισμούς μας, όπως θα αναφέρουμε εδώ, απαιτείται η γνώση της τυπικής αβεβαιότητας και όχι της διευρυμένης η τυπική αβεβαιότητα του βαθμονομητή είναι: Η βεβαιότητα του βαθμονομητή έχει την ίδια μονάδα μέτρησης με τη συγκέντρωση του βαθμονομητή π.χ. mg/dl, mmole/l. Συνήθως όμως μας ενδιαφέρει η σχετική τυπική αβεβαιότητα του βαθμονομητή που ισούνται με: 13

14 ή αλλιώς Ur% cal = 100 Ur cal Παράδειγμα Έστω ότι η εξέταση HbA1c προσδιορίζεται με τη χρήση πέντε βαθμονομητών. Για κάθε ένα από αυτούς έχει υπολογιστεί από την παρασκευάστρια εταιρεία ξεχωριστή τιμή αβεβαιότητας. Βαθμονομητής Συγκέντρωση βαθμονομητή Διευρυμένη αβεβαιότητα 1 1,2 0,05 2 2,9 0,41 3 4,9 0,32 4 6,8 0,41 5 8,5 0,86 Aπάντηση Υπολογίζεται ο τυπική αβεβαιότητα κάθε βαθμονομητή π.χ. = 0,025 και στη συνέχεια η σχετική αβεβαιότητα αυτού π.χ. = 0,02 ή 2%. Κατόπιν τούτου ο υπολογισμός της αβεβαιότητας του βαθμονομητή υπολογίζεται από τον ακόλουθο πίνακα: Βαθμονομητής Συγκέντρωση βαθμονομητή Διευρυμένη αβεβαιότητα Τυπική αβεβαιότητα Σχετική τυπική αβεβαιότητα %Σχετική τυπική αβεβαιότητα 1 1,2 0,05 0,025 0,021 2,08 2 2,9 0,41 0,205 0,071 7,07 3 4,9 0,32 0,16 0,033 3,27 4 6,8 0,41 0,205 0,030 3,01 5 8,5 0,86 0,43 0,051 5,06 Η συνολική αβεβαιότητα των βαθμονομητών είναι η συνδυασμένη σχετική αβεβαιότητα όλων των βαθμονομητών. Ισχύει δηλαδή η εξίσωση: Οπότε στο παράδειγμα μας η αβεβαιότητα είναι: 14

15 Πιστοποιητικό ιχνηλασιμότητας βαθμονομητή. 15

16 Πιστοποιητικό αβεβαιότητας για το Mg. Αναφέρεται και η μέθοδος αναφοράς. Η αβεβαιότητα της πιπέττας Υπολογίζεται μόνο εφόσον ο βαθμονομητής είναι σε σκόνη και χρειάζεται ανασύσταση. Υπολογίζεται από πείραμα διακρίβωσης και αναγράφεται πάντα στο πιστοποιητικό διακρίβωσης. Σε περίπτωση που η πιπέττα είναι μεταβλητού όγκου για κάθε όγκο υπολογίζεται χωριστά η αβεβαιότητα. Προσοχή: Τα πιστοποιητικά αβεβαιότητας που συνοδεύουν τις διακριβώσεις των πιπεττών αναγράφουν την διευρυμένη αβεβαιότητα και όχι την συνδυασμένη. Επειδή όμως στους 16

17 υπολογισμούς μας απαιτείται και εδώ η γνώση της τυπικής αβεβαιότητας και όχι της διευρυμένης η τυπική αβεβαιότητα της πιπέττας είναι: Eπίσης στον υπολογισμό της αβεβαιότητας της πιπέττας θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη και ο αριθμός των χρήσεων της. Συγκεκριμένα εάν για την ανασύσταση του βαθμονομητή απαιτούνται περισσότερες από μία χρήσεις της πιπέττας τότε θα πρέπει να πολλαπλασιαστεί η αβεβαιότητα της πιπέττας επί τον αριθμό των χρήσεων. Η σχετική αβεβαιότητα της πιπέττας (Urpip) υπολογίζεται σε σχέση με τον όγκο για τον οποίο θα χρησιμοποιήσουμε την πιπέττα: Όπως και στις προηγούμενες αβεβαιότητες χρησιμοποιείται συνήθως η % σχετική αβεβαιότητα που ισούνται με: Παράδειγμα Έστω ότι στο εργαστήριο έχουμε μία πιπέττα μεταβλητού όγκου μl. H αβεβαιότητα θα υπολογιστεί για τους δύο ακραίους όγκους και ένα μεσαίο. Π.χ. Όγκος (μl) Τιμή διευρυμένης αβεβαιότητας (μl) 2,5 2,8 3,5 Έστω ότι για την ανασύσταση του βαθμονομητή μας απαιτούνται 3 ml αποσταγμένου νερού. Κατά συνέπεια από την πιπέττα βαθμονομημένου όγκου που διαθέτουμε θα χρησιμοποιήσουμε τον όγκο 1000 μl. Η τυπική αβεβαιότητα σε αυτό τον όγκο είναι: H σχετική τυπική αβεβαιότητα είναι 17 = 1,75 μl

18 Επειδή όμως η πιπέττα θα χρησιμοποιηθεί 3 φορές η τελική σχετική τυπική αβεβαιότητα είναι: Παράδειγμα διακρίβωσης πιπέττας όγκου 100 μl. H αβεβαιότητα που υπολογίζεται είναι η διευρυμένη αβεβαιότητα δηλαδή τη τυπική αβεβαιότητα δια δύο. Η σχετική αβεβαιότητα είναι το κλάσμα της τυπικής αβεβαιότητας (0,2 μl) δια τον όγκο της πιπέττας (100 μl), δηλαδή 0,2/

19 Συνδυασμένη αβεβαιότητα (Combined uncertainty) H συνδυασμένη αβεβαιότητα (U c ) υπολογίζεται από το άθροισμα όλων των αβεβαιοτήτων. To άθροισμα αυτό δίνεται από τον παρακάτω τύπο: H συνδυασμένη αβεβαιότητα μπορεί να υπολογιστεί είτε με τις τυπικές αβεβαιότητες είτε με τις σχετικές τυπικές αβεβαιότητες. Στη πρώτη περίπτωση η συνδυασμένη αβεβαιότητα έχει τις ίδιες τιμές με την εξέταση ενώ στη δεύτερη υπολογίζεται ως ποσοστό. Διευρυμένη αβεβαιότητα (Expanded uncertainty) Κατόπιν υπολογίζεται η διευρυμένη αβεβαιότητα (U) χρησιμοποιώντας την εξίσωση: U = k Uc. Όπου k o συντελεστής καλύψεως ο οποίος εκφράζει τη στάθμη εμπιστοσύνης. Συνήθως η στάθμη εμπιστοσύνης είναι 95% οπότε το k = 2. Μετά τον υπολογισμό της διευρυμένης αβεβαιότητας τα αποτελέσματα δίνονται ως Tιμή ± U π.χ. 10 1,3 mg/dl ή π.χ. 10 mg/dl 2,1% εάν χρησιμοποιηθούν οι σχετικές τυπικές αβεβαιότητες. 19

20 Παράδειγμα υπολογισμού αβεβαιότητας Έστω ότι για την επαλήθευση της μεθόδου προσδιορισμού του καρκινικού δείκτη CEA στον αναλυτή Elecsys 2010 έγιναν τα πειράματα επαναληψιμότητας και ανάκτησης. Για τον υπολογισμό της επαναληψιμότητας λήφθηκαν οι εξής διαδοχικές μετρήσεις σε απόσταση 15 λεπτών η μία από την άλλη. 1,89, 1,79, 1,87, 1,93, 1,82, 1,74 μg/l Ο αναλυτής χρησιμοποιεί δύο βαθμονομητές για την εξέταση CEA. To πιστοποιητικό ιχνηλασιμότητας που τους συνοδεύει αναφέρει τα εξής: Συγκέντρωση Βαθμονομητή 4,33 48,7 Αβεβαιότητα 0,11 1,33 Ο βαθμονομητής προσφέρεται λυοφιλοποιημένος. Για την ανασύσταση του απαιτείται η προσθήκη 4 ml αποσταγμένου νερού. Η προσθήκη του νερού γίνεται με πιπέττα των 1000 μl. H διακρίβωση της πιπέττας έδειξε ότι η τυπική αβεβαιότητα της για τον όγκο των 1000 μl είναι 2,5 μl. Για την επαλήθευση της μεθόδου έγινε και το πείραμα ανάκτησης προκειμένου να υπολογιστεί η ορθότητα της αναλυτικής μεθόδου. Στην ανάκτηση χρησιμοποιήθηκε η τιμή του βαθμονομητή 48,7 μg/l. Ακολούθησε ανάμιξη αυτού 1:1 με μετρημένο δείγμα. Η ανάμιξη μετρήθηκε 6 φορές. H μέση τιμή των 6 μετρήσεων ήταν =23,81 μg/l και η τυπική απόκλιση SDbias = 1,38 μg/l Λύση Αρχικά υπολογίζεται η σχετική αβεβαιότητα της επαναληψιμότητας (Ur). H τυπική απόκλιση των 6 τιμών είναι SD = 0,07 μg/l και κατά συνέπεια η τυπική αβεβαιότητα της επαναληψιμότητας είναι: USD = 0,07 μg/l και η μέση τιμή 1,84 μg/l. Κατόπιν υπολογίζεται η τυπική αβεβαιότητα της ανάκτησης. Υπολογίζεται από τον εξίσωση: = 0,58 μg/dl 20

21 H σχετική τυπική αβεβαιότητα της ανάκτησης είναι: = 0,024 ή 2,4% Ακολουθεί ο υπολογισμός της αβεβαιότητας του βαθμονομητή. Το πιστοποιητικό ιχνηλασιμότητας που συνοδεύει τον βαθμονομητή αναφέρει δύο διαφορετικές αβεβαιότητες για τους δύο βαθμονομητές που χρειάζονται. Γι αυτό τον λόγο θα χρησιμοποιήσουμε τον μέσο όρο τους. Αυτή η αβεβαιότητα όμως που δίνεται είναι η διευρυμένη αβεβαιότητα του βαθμονομητή. Θα την μετατρέψουμε σε σχετική τυπική αβεβαιότητα διαιρώντας για κάθε βαθμονομητή την συγκέντρωση του με την τυπική του αβεβαιότητα. Δηλαδή: Συγκέντρωση Βαθμονομητή Σχετική τυπική αβεβαιότητα βαθμονομητή Σχετική τυπική αβεβαιότητα βαθμονομητή% Τυπική Αβεβαιότητα αβεβαιότητα 4,33 0,11 0,11/2=0,055 0,055/4,33 = 0,012 1,2% 48,7 1,33 1,33/2=0,665 0,665/48,7 = 0,013 1,3% Η συνδυασμένη αβεβαιότητα των βαθμονομητών είναι: To πιστοποιητικό διακρίβωσης της πιπέττας αναφέρει ότι στα 1000 μl η αβεβαιότητα της είναι 2,5 μl. Aυτή είναι η διευρυμένη αβεβαιότητα. Η τυπική αβεβαιότητα της πιπέττας είναι 2,5 μl/2 = 1,25 μl. H σχετική αβεβαιότητα της πιπέττας είναι 1,25/1000 = 0,00125 και η %σχετική τυπική αβεβαιότητα είναι: 0,125%. Επειδή ο όγκος που χρειάζεται για την βαθμονόμηση των πιπεττών είναι 4 ml θα χρειαστούν τέσσερις χρήσεις της πιπέττας από 1 ml κάθε φορά. Κατά συνέπεια η %σχετική τυπική αβεβαιότητα από την χρήση της πιπέττας είναι:. Oπότε η συνδυασμένη αβεβαιότητα για την ανάλυση του CEA είναι: Άρα η διευρυμένη αβεβαιότητα είναι: U = 2 x 4,9% = 9,8%. Δηλαδή αν η τιμή CEA ενός ασθενούς είναι 10,5 mg/dl η τιμή αυτή είναι: 10,5 ± 9,8% ή 8,3 11,8 μg/dl 21

22 Οι τιμές αναφοράς Κάθε εγχειρίδιο αντιδραστηρίου αναγράφει και τις τιμές αναφοράς ή όπως αλλιώς ονομάζονταν τις φυσιολογικές τιμές. Ο όρος φυσιολογικές τιμές έχει πλέον εγκαταλειφτεί αφού στις περισσότερες περιπτώσεις δεν αντιστοιχούν σε τιμές τέτοιες ώστε εκτός αυτών να υπάρχει νόσος (το ουρικό οξύ είναι ένα τέτοιο παράδειγμα) αλλά απλά στις τιμές που στατιστικά έχουν οι περισσότεροι άνθρωποι (όχι όλοι) οι οποίοι δεν νοσούν. Σε κάποιες περιπτώσεις οι φυσιολογικές τιμές δίνονται από διεθνείς επιστημονικές εταιρείες με την μορφή guidelines (κατευθυντήριων οδηγιών) και σε άλλες περιπτώσεις υπολογίζονται από επιστημονικές ομάδες ή ακόμα και από την ίδια την εταιρεία που κατασκευάζει το αντιδραστήριο. Στις τελευταίες περιπτώσεις θα πρέπει αυτός που υπολογίζει τις τιμές αναφοράς να περιγράφει το μέγεθος και το είδος του πληθυσμού όπου έγιναν οι μετρήσεις. Σε γενικές γραμμές για να υπολογιστούν οι τιμές αναφοράς χρειάζεται να μετρηθούν τουλάχιστον 200 άτομα. Αν υπάρχουν διαφορετικές τιμές αναφοράς για άνδρες, γυναίκες και παιδιά τότε ο αριθμός αυτός ανεβαίνει. Πριν υπολογιστούν οι τιμές αναφοράς θα πρέπει να γνωρίζουμε αν η κατανομή συχνοτήτων των τιμών μας. Ελέγχουμε πρώτα αν η κατανομή είναι κανονική. Αν και υπάρχουν ειδικές στατιστικές δοκιμασίες που ελέγχουν την κανονικότητα μιας κατανομής (normality test) ένας απλός τρόπος ελέγχου της κανονικότητας είναι αν η επικρατούσα τιμή της κατανομής ισούνται με την μέση τιμή και την διάμεσο (ή έστω να είναι πολύ κοντά). Η κανονικότητα μιας κατανομής φαίνεται φυσικά και από το σχήμα της κατανομής αλλά αυτός είναι ο ασφαλέστερος τρόπος. Πως υπολογίζονται οι τιμές αναφοράς όταν οι τιμές ακολουθούν την κανονική κατανομή Αν η κατανομή είναι κανονική υπολογίζουμε την μέση τιμή και την τυπική απόκλιση των τιμών. Οι τιμές αναφοράς ισούνται τότε με το εύρος μέση τιμή - 2 τυπικές αποκλίσεις έως μέση τιμή + 2 τυπικές αποκλίσεις Πως υπολογίζονται οι τιμές αναφοράς όταν οι τιμές δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή 22

23 Αν η κατανομή δεν είναι κανονική τότε χρησιμοποιούμε εκατοστημόρια (P). Αυτή η μέθοδος είναι η πιο συνηθισμένη. Οι τιμές αναφοράς ισούνται με το εύρος 2,5P έως 97,5P. Η διάμεσος και τα εκατοστημόρια δεν έχουν εξισώσεις υπολογισμού. Φτάνει να βάλετε όλους τους αριθμούς στην σειρά (να μεταφέρετε αυτή την σειρά στο word) και να υπολογίσετε την θέση όπου βρίσκεται η διάμεσος και τα εκατοστημόρια που θέλετε. Η θέση όπου βρίσκεται η διάμεσος υπολογίζεται εμπειρικά από την εξίσωση (Ν+1)/2 όπου Ν ο αριθμός των παρατηρήσεων. Αντίστοιχα η θέση όπου βρίσκεται ένα εκατοστημόριο υπολογίζεται από την εξίσωση (N+1)P/100. Όπου P το εκατοστημόριο. Π.χ. έστω ότι έχουμε 150 τιμές και ψάχνουμε την διάμεσο και το 35 ο εκατοστημόριο. Τότε λέμε: (N+1)/2 = (150+1)/2 = 76η τιμή και (N+1)P/100 = (150+1) x 35/100 = 53 η τιμή Επομένως βάζουμε τις τιμές μας σε αύξουσα σειρά. Στην 76 η θέση βρίσκεται η τιμή της διαμέσου και στην 53 η θέση η τιμή του εκατοστημορίου 35. Βιβλιογραφία 1. Yesper W, Thienpont L. Tranceability in laboratory medicine. Clin Chem 2009;55(6): EA guidelines on the expression of uncertainty in quantitative testing, Dec Λειμονή Ε. Επαλήθευση αναλυτικών μεθόδων κλινικών εργαστηρίων. 1 ο Σεμινάριο συνεχιζόμενης εκπαίδευσης Πιστοποίηση και διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων, ΕΕΚΧ-ΚΒ, Λυκόκα Ε, Πουλάκη Ε, Πρίγκος Ν, Πιπεράκη Κ, Σταθάκη-Φερδερίγου Α. Επαλήθευση αναλυτικών μεθόδων κλινικών εργαστηρίων. 1 ο Σεμινάριο συνεχιζόμενης εκπαίδευσης Πιστοποίηση και διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων, ΕΕΚΧ-ΚΒ, Eυαγγελόπουλος Α, Θωμαίδης Ν, Κουππάρης Μ. Αβεβαιότητα και ιχνηλασιμότητα στο κλινικό εργαστήριο: Νέα θεώρηση παλαιότερων όρων. Δελτίο Ελληνικής Μικροβιολογικής εταιρείας 2006; 51(2): ΕΣΥΔ. Κατευθυντήρια οδηγία για τη διαπίστευση των εργαστηρίων σύμφωνα με το πρότυπο ISO ΕΣΥΔ ΚΟ ΚΛΙΝΕΡΓ 01/02/ Μαθιουδάκης Μ. Μέτρηση ποιότητα μέτρησης και αβεβαιότητα. Ελληνική ένωση εργαστηρίων,

24 Επιτρεπτά σφάλματα βιοχημικών παραμέτρων στο ορό Εξέταση Συμβολισμός I% B% TE b % Χολερυθρίνη TBILI 12,8 10,0 31,1 Άμεση χολερυθρίνη DBILI 18,4 14,2 44,5 Αλβουμίνη ALB 1,6 1,3 3,9 Oλική πρωτεΐνη TP 1,4 1,2 3,4 Ασπαραγινική αμινοτρανσφεράση GPT/ALT 5,8 4,5 14,0 Αλανίνη αμινοτρανφεράση GOT/AST 6,0 5,4 15,2 γ-γλουταμινική τρανσαμινάση γgt 6,1 10,7 20,8 Γαλακτική δευδρογονάση LDH 3,7 5,0 11,1 Αλκαλική φωσφατάση ALP 3,2 6,4 11,7 Ασβέστιο Ca 1,0 0,8 2,4 Φώσφορος Phos 4,3 3,2 10,2 Χοληστερόλη Chol 3,0 4,0 9,0 Τριγλυκερίδια Trig 10,5 10,7 27,9 Κρεατινίνη Creat 2,2 3,4 6,9 Ουρία Urea 6,2 5,5 15,7 Oυρικό οξύ UA 3,7 5,0 11,1 Χλώριο Cl 0,6 0,4 1,4 Κρεατινοφωσφοκινάση CK 11,4 11,5 30,3 Κρεατινοφωσφοκινάση MB (δραστικότητα) CK MB 9,9 7,8 24,1 Κρεατινοφωσφοκινάση MB (μάζα) CK MB 9,2 16,0 31,2 Γλυκόζη Gluc 2,5 2,3 6,3 Χολ/λη συνδ/νη με λιπ/νες υψηλής πυκ/τας HDL 3,6 5,2 11,1 Χολ/λη συνδ/νη με λιπ/ες χαμηλής πυκ/τας LDL 4,2 6,8 13,6 Σίδηρος Fe 13,3 8,8 30,7 Μαγνήσιο Mg 1,6 1,7 4,3 Κάλιο Κ 2,4 1,8 5,8 Νάτριο Na 0,4 0,3 0,9 α-αμυλάση α-amyl 4,4 7,4 14,6 α-αμυλάση (παγκρεατική) α-amyl 11,7 29,9 17,7 Χοληνεστεράση CHE 3,5 3,1 8,9 Χοληνεστεράση (δραστικότητα) CHE 2,7 2,9 7,4 24

25 Εξέταση Συμβολισμός I% B% TE b % Ειδικό προστατικό αντιγόνο PSA 7,0 18,4 30 Προστατική όξινη φωσφατάση PAP 1,4 2,3 4,5 Καρκινικό αντιγόνο 125 Ca ,6 14,1 38,2 Καρκινικό αντιγόνο 15.3 Ca ,9 10,8 15,5 Καρκινικό αντιγόνο 19.9 Ca , ,3 Καρκινικό αντιγόνο 549 Ca 549 4,6 8,7 16,2 Καρκινοεμβρυικό αντιγόνο CEA 4,7 14,1 21,8 Επιθηλιακό κυτταρικό καρκίνωμα SCC 19,7 13,3 45,8 Ιστικό πολυπεπτιδικό αντιγόνο TPA 14,4 12,4 36,1 Αντιγόνο βλεννώδους καρκινώματος ΜCA 5,1 10,1 18,5 Ειδικό ιστικό πολυπεπτιδικό αντιγόνο TPS 18,1 28,5 58,3 Εξέταση Συμβολισμός Ι% B% TE b % Τριιωδοθυρονίνη T 3 4,4 4,2 11,4 Θυροξίνη T 4 3,0 3,4 8,3 Θυρεοτρόπος ορμόνη ΤSΗ 9,9 8,4 24,6 Ελεύθερη τριιωδοθυρονίνη FT 3 4,0 - - Ελεύθερη θυροξίνη FT 4 3,8 3,6 9,9 Ελεύθερη τεστοστερόνη F-testo 4,7 - - Tεστοστερόνη Testo 4,7 6,4 14,0 Ανδροστερόνη Androsterone 5,8 13,1 22,6 Ελεύθερη οιστραδιόλη F-E 2 11,4 - - Ωχρινοτρόπος ορμόνη LH 7,3 7,8 19,8 Θυλακιοτρόπος ορμόνη FSH 5,1 8,4 16,7 Θειική δευδροεπιανδροστερόνη DHEA-S 5,8 12,6 22,2 Προλακτίνη (άνδρες) PRL 3,5 15,4 21,1 Ινσουλίνη Insulin 10,6 15,5 32,9 C-πεπτίδιο C-pep 4,7 4,1 11,7 Αλδοστερόνη ALD 14,7 12,4 36,7 Φυλοσύνδετη ανθρώπινη σφαιρίνη SHBG 6,1 11,1 21,1 Oστεοκαλσίνη BGP 3,2 6,0 11,2 17-Υδρόξυ-προγεστερόνη 17-OHP 9,8 14,0 30,2 11-Δεσοξυκορτιζόλη 11-D-Cortisol 10,7 9,5 27,1 Κορτιζόλη Cortisol 10,5 12,5 29,8 25