DIABETES MELLITUS - GLYKÁCIA, OXIDAČNÝ STRES A ROZVOJ DIABETICKÝCH KOMPLIKÁCIÍ

Transcript

1 DIABETES MELLITUS - GLYKÁCIA, OXIDAČNÝ STRES A ROZVOJ DIABETICKÝCH KOMPLIKÁCIÍ Vladimír Jakuš Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského, Sasinkova 2, Bratislava

2 Prof. Louis Camille MAILLARD ( )

3 Storočie Maillardovej reakcie Maillard, L.-C.: Council of Royal Acad. Sci. Ser. 2, 154, 1912, 3,

4 Chémia Maillardovej reakcie Hodge, 1953 (J. Agric. Food Chem., 1, 1953, )

5 Prof. Samuel RAHBAR (nar v Hamedane, Irán)

6 Roku 1969 Rahbar objavil glykovaný hemoglobín Diabetici Kontrola Izolovaný HbA1c

7 Rahbar HbA1c h Glukóza Hemoglobín Amadoriho produkt Rahbar a kol., 1969 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 36, 1969, 5, )

8 Hyperglykémia, toxicita glukózy a glykácia Chronická hyperglykémia má za následok širokú škálu funkčných zmien a štruktúrnych abnormalít buniek, tkanív a orgánov. Glukózová toxicita má charakter bludného kruhu: Hyperglykémia má nepriaznivý účinok na sekréciu inzulínu β-bunkami Langerhansových ostrovčekov a na inzulínovú senzitivitu periférnych tkanív.

9 Následky glukózovej toxicity 1. Reverzibilné biochemické zmeny: Zvýšený tok substrátov polyolovou cestou Porucha metabolizmu myoinozitolu Zmenená činnosť fosfatidylinozitolovej sústavy Diabetická pseudohypoxia 2. Ireverzibilné biochemické zmeny: Neskorá glykácia, poškodenie voľnými radikálmi Bunkové, tkanivové a orgánové zmeny Mikro- a makroangiopatia

10 Mechanizmy spájajúce hyperglykémiu s diabetickými komplikáciami Environmentálne rizikové faktory Polyolová cesta Hyperglykémia Neenzýmová glykácia/maillardova reakcia Aktivácia proteínkinázy C Diabetické komplikácie Hexózamínová cesta Oxidačný stres Genetické rizikové faktory

11 Mikro- a makroangiopatické komplikácie Diabetes mellitus Nefropatia Retinopatia Choroby srdca a Diabetická noha

12 Biochémia a patofyziológia biologických AGEs

13 Fluorescenčné AGEs O H C N C (CH 2 ) 3 NH N N H + N (CH 2 ) 4 C C H N O H Pentozidínový krosslink (fluorofór) O H C H C N (CH 2 ) 3 NH N N CH 3 OH CH 3 Argpyrimidín (fluorofór)

14 Monolyzínové adukty O H C N CH (CH 2 ) 4 NHCH 2 CO 2 - O H HOCH 2 C CH (CH 2 ) 4 N N H C O Pyralín O H C C N ε karboxymetyllyzín CH (CH 2 ) 4 NH C CH 3 H CO 2 - N ε karboxyetyllyzín

15 AGE prekurzory odvodené od glykácie HO O O O O HO OH O O Glyoxál Metylglyoxál 3-Deoxyglukozón HO OH Glukozón HO OH O O

16 Tvorba 3-deoxyglukozónu Maillardovou reakciou a polyolovou cestou. Z neho sa môžu vytvoriť viaceré AGEs: imidazolón, pyralín, pentozidín, karboxymetyllyzín Proteín Glukóza Schiffova zásada Amadoriho produkt Aldóza reduktáza Sorbitol dehydrogenáza Sorbitol Fruktóza 3-DEOXYGLUKOZÓN Proteín Proteín Proteín O 2 O 2 Fruktóza- 3-fosfokináza Fruktóza-3-fosfát Imidazolón Pyrralín Karboxymetyllyzín Pentozidín

17

18 Tvorba MGO a glyceraldehydu GLYKÁCIA proteínov glukózou GLYOXALÁZA DETOXIFIKÁCIA NA D-LAKTÁT LIPOPEROXIDÁCIA METABOLIZMUS DHAP a glyceraldehyd- 3-fosfátu METYL- GLYOXÁL METABOLIZMUS ACETÓNU A TREONÍNU GLYCERALDEHYD GLYKÁCIA PROTEÍNOV

19 Cievy a AGEs upravené podľa Vlassara, 1997 (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94, 1997, 12, )

20 upravené podľa Vlassara, 1997 (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94, 1997, 12, ) Depozity a clearance AGEs

21 RAGE upravené podľa Zíma a kol.,1996 (Remedia, 1996, 6, 35-38)

22 upravené podľa Zíma a kol.,1996 (Remedia, 1996, 6, 35-38) Glykovaný LDL

23 Biodistribúcia a metab. exogénnych AGEs Gugliucci, 2009 ( ANII 2009)

24 Metabolická pamäť Prevencia DM Prevencia komplikácií

25 AGEs a ich inhibícia X Proteínové lyzíny Schiffova zásada Autooxidácia P N H + sacharid 2 A B H H O H P N = C C + H O + 2 H C1 C2 C F Amadoriho produkt H H O P N C C H E2 E1 C Oxidácia C D C=O C=O Dikarbonyly AGEs Proteín. krosslinky Nefluorescenčné AGEs CML Pentozidín Fluorescenčné AGEs

26 Klasifikácia AGE inhibítorov Typ Miesto účinku Inhibítor Príklady Poznámka A RNH 2 elektrofily Aspirín (acetylácia) Nepraktické aldehydy Pyridoxál-P (Schiff ) B Sacharid >C=O nukleofily aminoguanidín Deplécia pyridoxálu aldóza, ketóza hydrazíny (tvorí hydrazón) PLP (Vitam B6) isoniazid C1 Fe 3+, Cu 2+ chelátory DETAPAC, fytát toxicita?? penicilamín C2 ROS [O] antioxidanty askorbát (vitam. C)?? Vitam. E, lipoát

27 Klasifikácia AGE inhibítorov Typ Miesto účinku Inhibítor Príklady Poznámka i D O=C--C=O guanidíny AG, L-arginín Limitovaný? E1 Amadoriho p. hydrazíny aminoguanidín Deplécia pyridoxálu >C=O (tvorba hydrazónu) PLP (Vitam. B6) E2 Amadoriho p./post interakcia pyridoxamín mechanizmus? s kovom? E3 Amadoriho p. Monoklonal. pr. Exocell A717 epitop albumin E4 Amadoriho p. amadoriázy (deglykácia) bakteriálna E5 Amadoriho p. fosforyláza???? F O=C--C=O thiazolium PTB, ALT-711 mechanizmus? krosslinky tiamín (vitam. í B1) produkt?;

28 III. MONITOROVANIE GLYKAČNÉHO A OXIDAČNÉHO STRESU U DETÍ A ADOLESCENTOV S DM 1. TYPU Hodnoty markerov glykácie a lipooxidácie v sérových proteínoch detí s DM. Hladiny s- AGEs vo vzťahu ku HbA1c

29 Hodnoty markerov glykácie a lipooxidácie v sérových proteínoch detí s DM. Hladiny s- AGEs vo vzťahu ku HbA1c

30 Hodnoty markerov glykácie a lipooxidácie v sérových proteínoch detí s DM. Hladiny s- AGEs vo vzťahu ku HbA1c

31 Korelácia medzi fluorescenčnými s-ages a HbA1c (r=0,65; P=0,0051) S-AGEs (A.U.) HbA1c (%)

32 V súbore detí s DM a bez komplikácií boli signif. zvýšené hodnoty fruktozamínu, HbA1c a špecifická fluorescencia AGEs a MDAproteínových aduktov oproti zdravej kontrole. AGE špecifická fluorescencia významne korelovala so špecifickou fluorescenciou MDA-proteínových aduktov. V súbore detí s DM 1.typu a bez diab. komplikácií boli signif. zvýšené s-ages AGE špecifická fluorescencia signif. kolerovala s HbA1c. Jakuš, V. a kol.: Bratisl. Lek. Listy, 101, 2000, 9, Ohlasy: 11 Jakuš, V. a kol.: Diab. Nutr. Metab., 14, 2001, 4, Ohlasy: 2

33 Monitorovanie glykácie a oxidačného stresu vo vzťahu k výskytu mikrovaskulárnych komplikácií u detí s DM 1. typu 4 3,5 Porovnanie FAM u diabetických pacientov a kontrol FAM (mmol/l) 3 2,5 2 1,5 1 DM1 DM1 +DK DM1 -DK kontroly 0,5 0 DM1 n=75 +DK n=40 -DK n=35 kontroly n=29 FAM sú signifikantne vyššie u všetkých diabetických skupín v porovnaní s kontrolami (p<<0,001), a tiež u +DK v porovnaní s DK (p<<0,001). Výsledky sú prezentované ako priemer ± SD.

34 Porovnanie HbA1c u diabetických pacientov a kontrol HbA1c (%) DM1 DM1 +DK DM1 -DK kontroly 0 DM1 n=79 +DK n=40 -DK n=39 kontroly n=21 HbA1c sú signifikantne vyššie u všetkých diabetických skupín v porovnaní s kontrolami (p<<0,001), a tiež u +DK v porovnaní s DK (p<<0,001). Výsledky sú prezentované ako priemer ± SD.

35 Porovnanie s-ages diabetických pacientov a kontrol Kontroly s-ages (A.U.) n=29 -DK s-ages (A.U.) n=36 +DK s-ages (A.U.) n=34 Všetci DM s-ages (A.U.) n= min -[ 1. kvartil - medián 3. kvartil ]- max V skupine všetkých subjektov s DM1 sú hodnoty s-ages signifikantne vyššie ako u kontrol (p<0,001*), signifikantne vyššie u +DK (p<0,001*) a tiež u DK (p<0,01*) v porovnaní s kontrolami. Tiež u +DK sú s-ages signifikantne vyššie ako u DK (p=0,02*). * - Mann Whitneyho test

36 Porovnanie AOPP diabetických pacientov a kontrol Kontroly AOPP (umol/l) n=12. -DK AOPP (umol/l) n=29 +DK AOPP (umol/l) n=30 Všetci DM AOPP (umol/l) n= Min.-[1. kvartil - median 3. kvartil ]- max. V skupine všetkých subjektov s DM1 sú hodnoty AOPP signifikantne vyššie ako u kontrol (p<0,01**), a tiež u +DK sú AOPP signifikantne vyššie ako u kontrol (p<0,01**). Rozdiely medzi DK a kontrolami a medzi +DK a DK nie sú signifikantné.**nepárový t-test transformovaných dát

37 Porovnanie LPO diabetických pacientov a kontrol Kontroly LPO (nmol/ml) n=11l -DK LPO (nmol/ ml) n=26 +DK LPO (nmol/ml) n=22l Všetci DM LPO (nmol/ ml) n= Min. -[ 1.kvartil - medián 3. kvartil ]- max. V skupine všetkých subjektov s DM1 sú hodnoty LPO signifikantne vyššie ako u kontrol (p<0,01*, **); u +DK subjektov sú hodnoty signifikantne vyššie ako u kontrol (p<0,01*, **) a tiež u DK ako u kontrol (p=0,01*, p<0,01**). Rozdiel medzi skupinami +DK a DK nie je signifikantný. * - Mann Whitneyho test, **nepárový t-test transformovaných dát.

38 Porovnanie TGF-β diabetických pacientov a kontrol Kontroly TGF-b (ng/ml) n=9 -DK TGFb (ng/ml) n=12 +DK TGFb (ng/ml) n=17 Všetci DM TGFb (ng/ml) n= Min.-[1. kvartil - median 3. kvartil ]- max. V skupine všetkých subjektov s DM1 sú hodnoty TGF-β signifikantne vyššie ako u kontrol (p<0,01*, **), u subjektov +DK ako u kontrol (p=0,001*, **), rozdiel medzi DK a kontrolami nie je signifikantný, a hodnoty sú signifikantne vyššie u +DK ako u DK (p=0,01*, **). * - Mann Whitneyho test, **nepárový t-test transformovaných dát.

39 Našli sme signif. zvýšené hodnoty fruktozamínu a HbA1c u detí s diab. komplikáciami v porovnaní s diab. deťmi bez komplikácií a tiež v porovnaní so zdravou kontrolou. Našli sme signif. zvýšené hodnoty s-ages u detí s diab. komplikáciami v porovnaní so zdravou kontrolou. Našli sme signif. zvýšené hodnoty sérových LPO u detí s diab. komplikáciami v porovnaní so zdravou kontrolou. Hladina TGF-β v sére bola signifikantne zvýšená u všetkých diabetikov ako i diabetikov s komplikáciami v porovnaní so zdravými kontrolami.

40 HbA1c aktuálne (%) Korelácie a vzťahy medzi parametrami u všetkých diabetických pacientov Korelácia HbA1c s FAM všetkých diabetických subjektov (r=0,601; p<<0,001; n=79) ,0 2,0 3,0 4,0 5,0 FAM (mmol/l)

41 s-ages (A. U.) Korelácie a vzťahy medzi parametrami u všetkých diabet. pacientov Korelácia s-ages s TAG všetkých diabetických subjektov (r=0,546; p<<0,001; n=70) TAG(mmol/l)

42 AOPP (umol/l) Korelácie a vzťahy medzi parametrami u všetkých diabetických pacientov Korelácia AOPP s TAG všetkých diabetických subjektov (r=0,720; p<<0,001; n=59) TAG (mmol/l)

43 Korelácie a vzťahy medzi parametrami u všetkých diabetických pacientov LPO (nmol/ml) Korelácia LPO s TAG všetkých diabetických subjektov (r=0,531; p<<0,001; n=48) TAG (mmol/l)

44 Korelácie a vzťahy medzi parametrami u pacientov s diabetickými komplikáciami Signifikantné korelácie: kreatinín v sére s trvaním DM1 (r=0,458; p<0,01) HbA1c so všetkými parametrami lip. profilu - s FAM na hranici signifikancie (r=0,315; p=0,05) s-ages - s TAG (r=0,541; p=0,001) AOPP - s FAM (r=0,392; p<0,05), - s ø HbA1c za posledné 2 roky (r=0,490; p<0,01) - s TC (r=0,481; p<0,01) - s TAG (r=0,730; p<<0,001) - s FAM (r=0,450; p=0,01) - s HbA1c (r=0,620; p<0,001) - so s-ages (r=0,573; p<0,01)

45 Korelácie a vzťahy medzi parametrami u pacientov s diabetickými komplikáciami Signifikantné korelácie: LPO - s TAG (r=0,435; p<0,05) - s FAM (r=0,593; p<0,01) - so s-ages a s AOPP sign. vzťah na 95% hladine významnosti TGF-β - s vekom signif. vzťah na 95% hladine významnosti - s LDL na 95% hladine významnosti - s FAM na 99 % hladine významnosti - s ø HbA1c za posledné 2 roky na 95% hladine významnosti - s aktuálnymi HbA1c vzťah nie je významný - s AOPP a s LPO na 95% hladine významnosti

46 s-ages (A. U.) Korelácia s-ages s TAG u +DK pacientov (r=0,541; p<<0,001; n=34) TAG (mmol/l)

47 AOPP (umol/l) Korelácia AOPP s TAG u +DK pacientov (r=0,730; p<<0,001; n=30) TAG (mmol/l)

48 Korelácie a vzťahy medzi parametrami u pacientov bez diabetických komplikácií Signifikantné korelácie: Parametre lipidového profilu s: - HDL (r= 0,429; p<0,01) - LDL (r=0,353; p<0,05) - TAG (r=0,369; p<0,05) Kreatinín v sére s trvaním DM1 (r=0,471; p<0,01) HbA1c len s FAM (r=0,712; p<<0,001) S-AGEs - s TAG (r=0,386; p<0,05) - s FAM (r=0,118; p<0,05)

49 Korelácie a vzťahy medzi parametrami u pacientov bez diabetických komplikácií Signifikantné korelácie: LPO - s HDL (r= 0,444; p<0,05), - s TAG (r=0,751; p<<0,001) - s AOPP (r=0,691; p<0,01; na 99% hlad. význam. Spearmanovho testu) TGF-β - s LDL signifikantný vzťah na 95% hladine významnosti - s AOPP signifikantný vzťah na 95% hladine významnosti Kostolanská, J. - Jakuš, V. - Barák, Ľ.: Physiol. Res., 58, 2009, 4, Ohlasy: 3 Kostolanská, J. - Jakuš, V. - Barák, Ľ.: J. Pediat. Endocrinol. Metab., 22, 2009, 7, Kostolanská, J. - Jakuš, V. a kol.: Bratisl. Lek. Listy in press

50 Monitorovanie glykácie a oxidačného stresu vo vzťahu ku glykemickej kompenzácii detí s DM 1. typu Porovnanie FAM u diabetických subjektov s NGK, DGK a kontrol (p1, p2, p3<0,001) P1 NGK vs. kontroly, p2 DGK vs. kontroly, p3 NGK vs. DGK. 3,5 4 FAM (mmol/l) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 DM1 NGK DM1 DGK kontroly 0 NGK n=56 DGK n=19 kontroly n=29

51 Monitorovanie glykácie a oxidačného stresu vo vzťahu ku glykemickej kompenzácii detí s DM 1. typu Porovnanie HbA1c u diabetických subjektov s NGK, DGK a kontrol (p1, p2, p3<0,001). P1 NGK vs. kontroly, p2 DGK vs. kontroly, p3 NGK vs. DGK DM1 NGK DM1 DGK kontroly HbA1c (%) NGK n=59 DGK n=20 kontroly n=21

52 Porovnanie s-ages diabetických pacientov a kontrol: v skupine s NGK sú hodnoty s-ages signifikantne vyššie ako u kontrol (p<0,01*), u pacientov s NGK sú hodnoty signifikantne vyššie ako u DGK (p<0,01*). Rozdiel medzi DGK a kontrolami nie je signifikantný. *Mann Whitneyho test Kontroly s-ages (A.U.) n=29 DGK s-ages (A.U.) n=18 NGK s-ages (A.U.) n= min -[ 1. kvartil - medián 3. kvaretil ]- max

53 Porovnanie AOPP diabetických pacientov a kontrol: hodnoty AOPP sú signifikantne vyššie u pacientov s NGK ako u kontrol (p<0,01**), u pacientov s DGK ako u kontrol (p<0,05**), avšak rozdiel medzi skupinami s NGK a DGK nie je signifikantný. **nepárový t-test transformovaných dát Kontroly AOPP (umol/l) n=12 DGK AOPP (umol/l) n=17. NGK AOPP (umol/l) n= min -[ 1. kvartil - medián 3. kvartil ]- max

54 Porovnanie LPO diabetických pacientov a kontrol: LPO sú signifikantne vyššie u skupiny s NGK ako u kontrol (p<0,01**) a s DGK ako u kontrol (p=0,01**). Rozdiel medzi skupinami s NGK a DGK nie je signifikantný. **nepárový t-test transformovaných dát Kontroly LPO (nmol/ml) n=11 DGK LPO (nmol/ml) n=15 NGK LPO (nmol/ml) n= min -[ 1. kvartil - medián 3. kvartil ]- max

55 Klinické a biochemické parametre diabet. pacientov a kontrol Parameter NGK n DGK n Kontroly n Vek 15,4±2, ,4±3,2 20 9,2±4,9 31 Trvanie DM (r.) 9,2 ± 3,0 59 7,1±2, TC (mmol/l) 4,35±0, ,36±0, ,89±0,73 1,2 31 HDL (mmol/l) 1,52±0, ,71±0, ,28±0,32 1,2,3 31 LDL (mmol/l) 2,73±0, ,47±0, ,42±0, TAG (mmol/l) 1,26±0, ,88±0, ,29±0, Kreatinín (µmol/l) 58±11, ±14, ,2±12,3 1,2,3 29

56 UAER (µg/min) 48,3±135,5 54 9,6±5, FAM (mmol/l) 2,95±0, ,58±0, ,62±0,35 1,2,3 29 HbA1c (%) 10,12±1, ,71±0, ,0±0,39 1,2,3 21 s-ages* (A. U.) 71,9(63,3; 77,2) 52 61,9(59,6; 67,8) ,2(52; 65,7) 1,2 29 AOPP* (µmol/l) 75,9(43,3; 129,4) 42 75,8(51,1; 136,2) 17 58,5(51,5;66,9) 1,2, 3 12 LPO*(nmol/ml) 121(101; 138) TGF-β* (ng/ml) 9,75(5,29; 13,63) (91,5; 172) 15 99(67; 106) 1,2, (1,73; 8) 11 1,58(0,78; 3,9) 1,2 9 Výsledky sú prezentované ako priemer±smerod. Odch., resp. medián (1. kvartil; 3. kvartil)* 1 signifikantný rozdiel v porovnaní so všetkými pacientmi s DM1 2 signifikantný rozdiel v porovnaní s NGK 3 signifikantný rozdiel v porovnaní s DGK

57 Korelácie a vzťahy medzi parametrami u pacientov s nedostatočnou glykemickou kompenzáciou Signifikantné korelácie: Kreatinín s trvaním DM (r=0,490; p<0,001) FAM s TAG (r=0,289; p=0,03) HbA1c - s HDL (r= 0,303; p<0,001) - s TAG (r=0,437; p<0,001) - s FAM (r=0,522; p<0,001) s-ages - z parametrov lipidového profilu len s TAG (r=0,537; p<0,001) - s FAM (r=0,354; p=0,01) a - s ø HbA1c za posledné 2 roky (r=0,486;p<0,001)

58 AOPP - s TC (r=0,393; p=0,01), - s HDL (r= 0,332; p=0,03) - s TAG (r=0,734; p<0,001) - s FAM (r=0,445; p<0,01) - s HbA1c (r=0,608; p<<0,001) - so s-ages (r=0,575; p<0,001) LPO - s TAG (r=0,479; p<0,01) - s FAM (r=0,482; p<0,01) - s HbA1c nekorelujú vôbec, a - so s-ages (r=0,375; p=0,049 - s AOPP (r=0,860; p<<0,001) TGF-β - s FAM signifikantný vzťah na 99 % hladine významnosti - s LDL na 95% hladine významnosti - s ø HbA1c za posledné 2 roky na hladine významnosti 95% - s AOPP a s LPO na 95% hladine významnosti - s aktuálnymi hodnotami HbA1c nemá významný vzťah

59 Korelácie a vzťahy medzi parametrami u pacientov s dobrou glykemickou kompenzáciou Signifikantné korelácie: HDL, TAG s vekom (r=-0,488; p<0,05; resp. r=0,532; p <0,05) Kreatinín s trvaním DM (r=0,621; p <0,01) HbA1c s HDL (r=0,451; p<0,05) - s LDL (r=-0,450; p<0,05) - s FAM na 95% hladine významnosti s-ages nekorelujú...

60 Korelácie a vzťahy medzi parametrami u pacientov s dobrou glykemickou kompenzáciou Signifikantné korelácie: AOPP s HDL a LDL na 95 % hladine významnosti - s TAG na 99 % hladine významnosti - s kreatinínom a HbA1c na 95% hladine významnosti LPO s TAG na 99 % hladine významnosti - s ø HbA1c za posledné 2 roky na hladine významnosti 95 % - s aktuálnymi HbA1c nemá signifikantný vzťah - s AOPP na 99 % hladine významnosti TGF-β s TC a LDL a s AOPP na hladine významnosti 95 % - s LDL na hladine významnosti 99 %

61 Vzťah glykemickej kompenzácie k prítomnosti diabetických komplikácií χ2 = 22,7; p<<0,001 Medzi aktuálnymi hodnotami HbA1c a prítomnosťou DK existuje signifikantný vzťah χ2 = 17,4; p<<0,001 Medzi priemernými hodnotami HbA1c za posledné 2 roky a prítomnosťou DK existuje signifikantný vzťah

62 Vzťah s-ages k prítomnosti diabetických komplikácií χ2 = 6,6; p = 0,01 Prípustná hodnota s-ages - pomocou rovnice regresnej priamky y=0,9212x + 41,644 (y = s-ages, x = HbA1c = 8,5 %) Medzi hodnotami s-ages a prítomnosťou DK existuje signifikantný vzťah Kostolanská, J. - Jakuš, V. - Barák, Ľ.: J. Pediat. Endocrinol. Metab., 22, 2009, 7, Ohlasy: 2 Kostolanská, J. - Jakuš, V. a kol.: Bratisl. Lek. Listy in press

63 Meranie AGEs v sére môže napomôcť včasnému odhaleniu rizika vzniku komplikácií Meranie s-ages ako AGE špecifickej fluorescencie by sa mohlo využiť v klinickej praxi na včasnú diagnostiku diabetických vaskulárnych komplikácií, zvlášť u detí a adolescentov s DM 1. typu Jednoduchosť a časová i finančná nenáročnosť merania AGEs

64 u DGK: nie sú signifikantne zvýšené AGEs => riziko akumulácie AGEs AOPP a LPO u DM v porovnaní s kontrolami => naznačujú prítomnosť oxidačného stresu Meranie sérových LPO by sa mohlo využiť na včasnú diagnostiku diab. vaskulárnych komplikácií, zvlášť u detí a adolescentov s DM 1. typu

65 IV. VÝVOJ METÓD NA STANOVENIE AGEs Rýchla a jednoduchá metóda na stanovenie Nε-(karboxymetyl)lyzínu a Nε-(karboxyetyl) lyzínu v moči pomocou GC/MS spektrometrie Vzorky moča sa deproteinizovali s acetonitrilom a následne derivatizovali etylchlóroformiátom a vzniknuté N(O,S)- etoxykarbonyletylestery aminokyselín, CML a CEL sa analyzovali pomocou izotopovej dilučnej GC-MS spektrometrie.

66 GC/MS chromatogram, hmotnostné spektrá a navrhnuté fragmentačné vzory EOC etyl esterov CML (A), d4cml (B), CEL (C) a d8cel (D).

67 GC/MS chromatogram močových CML and CEL od pacienta s DM 1. typu

68 GC/MS chromatogram CML, CEL a aminokyselín Nová metodika umožňuje s využitím interných deuterovaných štandardov exaktné a rýchle stanovenie koncentrácie dvoch nefluorescenčných AGEs v moči CML a CEL a tiež všetkých aminokyselín (s výnimkou arginínu) v jednej analýze.

69 Močové hladiny CML a CEL u kontrol a diabetických pacientov CML- DM1 CML- Kontrola CEL-DM1 CEL- Kontrola Priemer 2,52 1,21 4,17 1,68 SD 1,56 0,64 2,60 0,74 Minimum 0,51 0,46 1,28 0,55 Maximum 6,25 2,32 10,35 2,84 n p 0,0055 0,0055 0,0018 0,0018 Hodnoty sú v mmol/mol kreatinínu. SD, štandardná odchýlka. Je tu signifikantný rozdiel medzi hladinami CML a CEL u diabetických pacientov a kontrol. Korelácia medzi CML a CEL bola 0,862. U zle kompenzovaných detí a adolescentov s DM 1. typu sme zistili signif. zvýšenie koncentrácie CML a CEL v moči pomocou GC-MS spektrometrie v porovnaní so zdravou kontrolnou skupinou detí. Petrovič, R. - Futas, J. - Chandoga, J. - Jakuš, V.: Biomed. Chromatogr, 19, 2005, 9, Ohlasy: 15