- 48 - Ε Ν Ο Τ Η Τ Α Ε ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΗ Αζωτούχα συστατικά των φυτών με βασικές ιδιότητες, τα οποία εμφανίζουν βιολογική δράση στα ζώα ή τον άνθρωπο χαρακτηρίζονται με το γενικό όρο αλκαλοειδή. Τα αλκαλοειδή ευρίσκονται στα φύλλα, τις ρίζες, τους καρπούς και τους φλοιούς διαφόρων φυτών. Πρόκειται για οπτικά ενεργές ενώσεις οι οποίες, εκτός λίγων περιπτώσεων, είναι άχρωμες, κρυσταλλικές, μη πτητικές, αδιάλυτες στο νερό. Πολλά αλκαλοειδή είναι ισχυρά δηλητήρια (π.χ. κολχικίνη, στρυχνίνη), ενώ άλλα παρουσιάζουν σημαντική φαρμακολογική δράση ακόμα και σε πολύ μικρές ποσότητες (π.χ. κινίνη, κωδεΐνη, μορφίνη, εμετίνη ). Ο ρόλος τους είναι πολυποίκιλος και όχι απόλυτα καθορισμένος. Θεωρούνται προϊόντα μεταβολισμού αλλά και υλικά σύνθεσης πρωτεϊνών ή ενώσεις οι οποίες προστατεύουν τα φυτά από τα ζώα και τα έντομα αλλά και ρυθμιστικοί παράγοντες του φυτού με δράση παρόμοια με αυτή των ορμονών. Για την ανίχνευση των αλκαλοειδών χρησιμοποιούνται αντιδράσεις οι οποίες δίνουν έγχρωμα ιζήματα, όπως καταβυθίσεις με πικρικό οξύ, φωσφοβολφραμικό οξύ ή διάλυμα ιωδίου σε ιωδιούχο κάλιο. Οι χρησιμοποιούμενες μέθοδοι για την παραλαβή των αλκαλοειδών βασίζονται στο γεγονός ότι τα άλατά τους είναι ευδιάλυτα στο νερό αλλά όχι σε οργανικούς διαλύτες, ενώ το αντίθετο συμβαίνει με τις βασικές μορφές τους. Μία γενική μέθοδος απομονώσεως αλκαλοειδών (πλην των περιεχόντων τεταρτοταγές άζωτο) παρουσιάζεται στο Σχήμα 1.
Νερό ΔΡΟΓΗ Βάση ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΗ(μετατραπέντα σε ελεύθερες βάσεις) ΚΑΙ ΥΠΟΛΟΙΠΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΔΡΟΓΗΣ Οργανικός διαλύτης (CHCl 3, αιθέρας, οξικός αιθυλεστέρας κ.ά.) Οργανική φάση ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΗ, ΡΗΤΙΝΕΣ, ΛΙΠΗ, ΚΗΡΟΙ Υδατική φάση ΟΞΕΑ, ΓΛΥΚΟΖΙΤΕΣ Αραιό HCl Υδατική φάση ΑΛΑΤΑ ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΩΝ, ΠΡΟΣΜΙΞΕΙΣ Αλκαλοποίηση Οργανική φάση ΡΗΤΙΝΕΣ, ΛΙΠΗ, ΚΗΡΟΙ Εκχύλιση με οργανικό διαλύτη Υδατική φάση Οργανική φάση ΠΡΟΣΜΙΞΕΙΣ ΕΛΕΥΘΕΡΑ ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΗ (Βάσεις) Απομάκρυνση του διαλύτη και κατεργασία των αλκαλοειδών (κρυστάλλωση, χρωματογραφικός διαχωρισμός κ.ά.) Σχήμα 1. Γενική Μέθοδος Απομόνωσης Αλκαλοειδών από μια Δρόγη
- 50 - icotiana tabacum α) φύλλο, β) άκρη ανθισμένου βλαστού, γ) άνθος σε κατά μήκος τομή, δ) ανθήρας, ε) ωοθήκη σε κατά μήκος τομή, ζ) ωοθήκη σε εγκάρσια τομή, η) καρπός, θ) σπέρμα, ι) κατά μήκος τομή σπέρματος Piper nigrum 1) φλοιός, 2) ενδοκάρπιο, 3) φλοιός σπόρου, 4) έμβρυο, 5,6) θρεπτικός ιστός ΑΣΚΗΣΗ 1 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΙΚΟΤΙΝΗΣ ΑΠΟ ΚΑΠΝΟ Το κύριο αλκαλοειδές συστατικό των φύλλων καπνού (icotiana tabacum) είναι η νικοτίνη και σε μικρότερες ποσότητες η νορνικοτίνη, η αναβασίνη και άλλα επτά τουλάχιστον αλκαλοειδή. CH 3 H H Νικοτίνη Νορνικοτίνη Αναβασίνη
- 51 - Η νικοτίνη (υγρό ελαιώδες, δηλητήριο, με ισχυρή οσμή, γεύσης οξείας και καυστικής) είναι μια αζωτούχος βάση αποτελούμενη από δύο ετεροκυκλικούς δακτυλίους (πυριδίνης και πυρρολιδίνης). Τα άζωτα των δύο δακτυλίων είναι τριτοταγή και είναι δυνατόν να πρωτονιωθούν εύκολα και να σχηματίσουν άλατα. Επειδή ο δακτύλιος της πυρρολιδίνης έχει pk a 8 ενώ της πυριδίνης 3, είναι αναμενόμενο ότι σε ph 7 ο δακτύλιος της πυρρολιδίνης θα είναι κατά 90% πρωτονιωμένος. Tο γεγονός αυτό δικαιολογεί τη μεγάλη διαλυτότητα της νικοτίνης στο νερό όπως και την ικανότητά της να δεσμεύεται στους υποδοχείς της ακετυλοχολίνης στις μυϊκές μεμβράνες. Επειδή όμως το ένζυμο χολινεστεράση (η οποία υδρολύει την ακετυλοχολίνη) δεν αποικοδομεί τη νικοτίνη, πρόσληψη μεγάλων ποσοτήτων νικοτίνης μπορεί να επιφέρει τη δέσμευση όλων των υποδοχέων με αποτέλεσμα την πρόκληση σπασμών και παράλυσης. Τα συμπτώματα τα οποία εμφανίζονται είναι ζαλάδα, πονοκέφαλος, εφίδρωση, οπτική διαταραχή, σύγχυση, αδυναμία, σπασμοί, δύσπνοια. Γενικά, η νικοτίνη μπορεί να απορροφηθεί από τον πεπτικό σωλήνα και από το αναπνευστικό σύστημα, ενώ αφήνει ανέπαφο το δέρμα. Μεγάλη έκθεση στη νικοτίνη προκαλεί αίσθημα καψίματος στο στόμα και στο λαιμό, έκκριση σιέλου, ναυτία, εμετό, πόνους στη κοιλιακή χώρα. Διάφορες έρευνες έχουν δείξει ότι υπάρχει γενετική προδιάθεση στην εξάρτηση από τη νικοτίνη (μεγάλος αριθμός υποδοχέων στον εγκέφαλο), η οποία συνδυάζεται με διάφορες άλλες ψυχολογικές και φυσιολογικές εξαρτήσεις. Εκτός όμως από όλες αυτές τις δυσάρεστες παρενέργειες της νικοτίνης, πρόσφατα έχει αναφερθεί και μια θετική δράση αυτής. Προκαταρκτικές μελέτες του American Association for the Advancement of Science έδειξαν ότι η νικοτίνη επιδρά θετικά στη νόσο του Parkinson. Συγκεκριμένα, η νικοτίνη βελτιώνει την πνευματική εγρήγορση, τον έλεγχο του σώματος κατά το βάδισμα και τη χρήση των χεριών, ενώ μειώνει το άγχος. Τέλος η νικοτίνη χρησιμοποιείται ως εντομοκτόνο και παρασιτοκτόνο κυρίως στην κηπουρική. Κατεργασία των φύλλων καπνού με ισχυρή βάση (10% ah) αποπρωτονιώνει το δακτύλιο της πυρρολιδίνης και έτσι η νικοτίνη είναι δυνατόν να εκχυλιστεί σ έναν οργανικό διαλύτη π.χ. αιθέρα. Η απομάκρυνση του οργανικού διαλύτη οδηγεί σε ελαιώδες υπόλειμμα (Σ.Ζ. 246 o C) το οποίο σε μικρές ποσότητες δεν κατεργάζεται εύκολα και γι αυτό το λόγο η απομονωθείσα νικοτίνη μετατρέπεται σε άλας του πικρικού οξέος.
- 52 - ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Διαχωριστική χοάνη Κωνικές φιάλες Διάταξη διηθήσεως Θερμαντική πλάκα Υλικά και αντιδραστήρια Κονιοποιημένα φύλλα καπνού ah 10 % a 2 S 4 MeH Αιθέρας EtH (96%) Πικρικό οξύ P 2 5 Υαλοβάμβακας Πειραματική πορεία Σε κωνική φιάλη των 200 ml τοποθετούνται 8.5 g κονιοποιημένου καπνού και 120 ml διαλύματος ah 10%. Το μίγμα αναδεύεται ζωηρά επί 30 λεπτά και κατόπιν το στερεό διηθείται μέσω ενός λεπτού στρώματος υαλοβάμβακα εντός υάλινου χωνιού [Σχήμα Π8]. Το στερεό πλένεται 1 φορά με 15 ml νερού και το διήθημα μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη των 250 ml και εκχυλίζεται δύο φορές με 60 ml αιθέρα [Σχήμα Π6]. Τα εκχυλίσματα του αιθέρα ενώνονται, ξηραίνονται με Να 2 S 4 και διηθούνται μέσω πτυχωτού ηθμού εντός υάλινου χωνιού [Σχήμα Π8]. Κατόπιν η αιθερική στοιβάδα συμπυκνώνεται υπό κενό [Σχήμα Π9] και χωρίς θέρμανση. Το ελαιώδες υπόλειμμα, το οποίο λαμβάνεται μετά την συμπύκνωση, διαλύεται με προσθήκη 10 ml MeH. Το προκύπτον διάλυμα πρέπει να είναι διαυγές χωρίς αιωρούμενα σωματίδια διαφορετικά διηθείται μέσω λεπτού στρώματος υαλοβάμβακα εντός μικρού υάλινου χωνιού. Ακολουθεί προσθήκη 10 ml κορεσμένου μεθανολικού διαλύματος πικρικού οξέος (2 g πικρικού οξέος σε 10 ml μεθανόλης). Η σχηματιζόμενη διπικρική νικοτίνη (ελαφρώς κίτρινο στερεό) συλλέγεται με διήθηση, υπό κενό, σε ηθμό με πορώδες (Νο.4) [Σχήμα Π16β] και ανακρυσταλλώνεται από H νικοτίνη είναι ισχυρά τοξική ουσία (μια δόση των 60 mg θεωρείται θανατηφόρα). Για το λόγο αυτό απαιτούνται προσεκτικοί χειρισμοί Τα άλλα συστατικά του καπνού, όπως η κυτταρίνη και το ταννικό οξύ (υπό μορφή άλατος) καθώς και τα προϊόντα οξειδώσεως της χλωροφύλλης δεν εκχυλίζονται στον αιθέρα
- 53 - θερμό διάλυμα EtH/H 2 (1:1, v/v). Το διάλυμα αφήνεται να ψυχθεί αργά. Το σχηματιζόμενο στερεό διηθείται, υπό κενό, σε ηθμό με πορώδες (Νο.4) [Σχήμα Π16β] και ξηραίνεται σε ξηραντήρα κενού πάνω από P 2 5. Σ.Τ. 222 223 C ΑΣΚΗΣΗ 2α ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΙΠΕΡΙΝΗΣ ΑΠΟ ΜΑΥΡΟ ΠΙΠΕΡΙ Η πιπερίνη είναι αμίδιο της πιπεριδίνης και του ακόρεστου αρωματικού οξέος πιπερικού οξέος. Θεωρείται ότι ανήκει στα αλκαλοειδή τύπου πιπεριδίνης. Χαρακτηρίζεται από πολύ μικρή διαλυτότητα στο νερό και σ αυτήν οφείλεται κυρίως η δριμεία γεύση του πιπεριού. Η απομόνωσή της γίνεται δι εκχυλίσεως με αιθανόλη των αποξηραμένων, άωρων καρπών του Piper nigrum (μαύρο πιπέρι), οι oποίοι περιέχουν 6-9 % πιπερίνη. Τέλος με 1,3,5-τρινιτρο-βενζόλιο δίνει ένα στερεό σύμπλοκο ερυθρού χρώματος με Σ.Τ. 130 o C. Μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση η οποία έγινε πρόσφατα αφορά στη σύγκριση δύο νέων φαρμάκων με την πιπερίνη, του CX-516 που έχει αναπτυχθεί για την αντιμετώπιση της νόσου του Alzheimer και της 1-(1,3-βενζοδιοξολ-5-υλκαρβονυλο)πιπεριδίνης η οποία χρησιμοποιείται για την ενίσχυση της μνήμης. Οι δομικές ομοιότητες των τριών αυτών ουσιών έχει οδηγήσει στη διερεύνηση της σχέσης που μπορεί να υπάρχει μεταξύ μαύρου πιπεριού και της διαδικασίας της μνήμης. Πιπερίνη 1-(1,3-βενζοδιοξολ-5-υλ-καρβονυλο)πιπεριδίνη CX-516 Ισχυρή θέρμανση είναι δυνατόν να οδηγήσει σε αποσύνθεση της νικοτίνης
- 54 - Η πιπερίνη χρησιμοποιείται ως εντομοκτόνο (είναι περισσότερο τοξική από τα εντομοκτόνα πυρέθρου ) και για να προσδώσει δριμεία γεύση στο κονιάκ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Συσκευή εκχύλισης Soxhlet Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Κωνικές φιάλες Διάταξη διηθήσεως Ηλεκτρικός μανδύας Ψυκτήρας Υλικά και αντιδραστήρια Μαύρο πιπέρι EtH (96%) Αιθανολικό διάλυμα ΚΟΗ 10% a 2 S 4 P 2 5 Πειραματική πορεία Σε συσκευή Soxhlet [Σχήμα Π5] εκχυλίζονται 10 g μαύρου πιπεριού με 120 ml αιθανόλης για δύο ώρες. Εν συνεχεία το αλκοολικό εκχύλισμα συμπυκνώνεται [Σχήμα Π9] μέχρι ξηρού. Στο ελαιώδες υπόλειμμα προστίθενται 10 ml αιθανολικού διαλύματος KH 10%. Τα αδιάλυτα στερεά διηθούνται μέσω πτυχωτού ηθμού [Σχήμα Π8]. Στο διήθημα προστίθενται 20 ml H 2 και το μίγμα ψύχεται. Το ίζημα συλλέγεται με διήθηση, υπό κενό, σε ηθμό με πορώδες (Νο.4) [Σχήμα Π16β] και ξηραίνεται σε ξηραντήρα κενού πάνω από P 2 5. Σ.Τ. 125 126 C Τα αποξηραμένα άνθη του Chrysanthemum cinerariaefolium περιέχουν ενώσεις οι οποίες είναι δραστικά εντομοκτόνα, ακίνδυνα για τον άνθρωπο και άλλα θερμόαιμα ζώα. Οι ενώσεις αυτές αποικοδομούνται ταχύτατα στη Φύση και δε συσσωρεύονται στη θρεπτική αλυσίδα. Σε μια πλάκα TLC τοποθετείται μια κηλίδα από το εκχύλισμα του πιπεριού. Στην ίδια πλάκα τοποθετούνται επίσης κηλίδες από διαλύματα απομονωθείσας πιπερίνης και πιπερίνης εμπορίου. Η πλάκα αναπτύσσεται με σύστημα τολουολίου-οξικού αιθυλεστέρα (2:1, v/v). Η εμφάνιση του χρωματογραφήματος γίνεται: α) με υπεριώδη ακτινοβολία και β) με ψεκασμό με διάλυμα ανισαλδεΰδης-θειϊκού οξέος και θέρμανση στους 110 C για 10 min.
- 55 - ΑΣΚΗΣΗ 2β ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΠΙΠΕΡΙΝΗΣ Η πιπερίνη όταν κατεργασθεί με διαλύματα αλκάλεως υδρολύεται προς πιπεριδίνη και πιπερικό οξύ. Πιπερίνη Πιπερικό οξύ H KH EtH H Πιπεριδίνη ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Σφαιρικές φιάλες Ψυκτήρας Ηλεκτρικός μανδύας Διάταξη διηθήσεως Θερμαντική πλάκα Υλικά και αντιδραστήρια Πιπερίνη Αιθανολικό διάλυμα ΚΟΗ 10% π. ΗCl EtH (96%) Πειραματική πορεία Σε εσμυρισμένη σφαιρική φιάλη των 50 ml τοποθετούνται 0.5 g πιπερίνη και 10 ml αιθανολικού διαλύματος ΚΟΗ 10%. Αφού προστεθούν πέτρες βρασμού και προσαρμοστεί στη φιάλη κάθετος ψυκτήρας, το μίγμα βράζεται για 90 λεπτά [Σχήμα Π3α]. Εν συνεχεία το διάλυμα συμπυκνώνεται, υπό ελαττωμένη πίεση, [Σχήμα Π9] μέχρι απομακρύνσεως όλης της ποσότητας του διαλύτη. Στο στερεό
- 56 - υπόλειμμα προστίθενται 15 ml νερού και το αιώρημα οξινίζεται, υπό ψύξη, με π. ΗCl μέχρι ph 1, όπου αποβάλλεται ένα κίτρινο στερεό. Το στερεό συλλέγεται με διήθηση, υπό κενό, σε ηθμό με πορώδες (Νο.2) [Σχήμα Π16β] και πλένεται πάνω στον ηθμό καλά με κρύο νερό. Εν συνεχεία το προϊόν ανακρυσταλλώνεται από θερμή αιθανόλη για να δώσει τελικά κρυσταλλικό πιπερικό οξύ με Σ.Τ 216-217 C. Το διήθημα από την απομόνωση του πιπερικού οξέος συμπυκνώνεται, υπό ελαττωμένη πίεση, [Σχήμα Π9] μέχρι απομακρύνσεως όλης της ποσότητας του διαλύτη. Το στερεό υπόλειμμα ανακρυσταλλώνεται από θερμή αιθανόλη για να δώσει τελικά υδροχλωρική πιπεριδίνη με Σ.Τ 244 C. ΑΣΚΗΣΗ 3 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΑΣ ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΩΝ Α. Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας αλκαλοειδών τροπανίου ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Δοκιμαστικοί σωλήνες Ογκομετρικοί κύλινδροι Ποτήρια ζέσεως Φούρνος Λάμπα UV Υλικά και αντιδραστήρια Αλκαλοειδή Τροπανίου Ακετόνη Αμμωνία 25% Διάλυμα ανισαλδεΰδης-θειϊκού οξέος Πλάκες Kieselgel GF 254 Πειραματική διαδικασία Σε μικρούς δοκιμαστικούς σωλήνες ετοιμάζονται τα δείγματα Α, Β, Γ και Δ (1% δραστικού συστατικού σε τολουόλιο). Το δείγμα Α περιέχει διάλυμα υοσκυαμίνης, το δείγμα Β διάλυμα σκοπολαμίνης, το δείγμα Γ διάλυμα τροπίνης, και το δείγμα Δ διάλυμα τροπίνης. Εν συνεχεία σε μια πλάκα 10x6 cm σημειώνονται με μολύβι η γραμμή εκκίνησης και τα σημεία τοποθέτησης των δειγμάτων και εν συνεχεία με τριχοειδή σωληνάκια γίνεται η τοποθέτηση των δειγμάτων. Η ανάπτυξη του χρωματογραφήματος γίνεται με σύστημα διαλυτών ακετόνης-νερού-αμμωνίας 25%. (96:4, v/v). Μετά την ανάπτυξη του χρωματογραφήματος, σημειώνεται η θέση του
- 57 - μετώπου του υγρού ανάπτυξης και η πλάκα ξηραίνεται στο φούρνο στους 100 C. Η εμφάνιση του χρωματογραφήματος γίνεται αρχικά με υπεριώδη ακτινοβολία (σημειώνονται οι κηλίδες) και εν συνεχεία με ψεκασμό με διάλυμα ανισαλδεΰδηςθειϊκού οξέος και θέρμανση στους 120 C. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Gunnar Samuelsson, "Φαρμακευτικά Προϊόντα Φυσικής Προελεύσεως", (Απόδοση στην Ελληνική, Γενική Επιστημονική Επιμέλεια: Π. Κορδοπάτης, Ε. Μάνεση-Ζούπα, Γ. Πάϊρας), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο (1996). 2. Γεωργίου Κ. Φωκά, "Μαθήματα Φαρμακογνωσίας", Β' έκδοση, Γραφικές Τέχνες Ε. Τσολακοπούλου, Θεσσαλονίκη (1982). 3. Laurence M. Harwood and Christopher J. Moody, "Experimental rganic Chemistry, Principles and Practice", Blackwell Scientific Publications, xford (1990). 4. R. Ikan, "atural Products, A Laboratory Guide", 2 nd Edition, Academic Press Inc., ew York (1991). 5. D.L. Paiva, G.M. Lampman and G.S. Kriz Introduction to rganic Laboratory Techniques, Second Edition Saunders College Publishing, ew York (1998).