Metabonomics: Η επιστροφή των μεταβολιτών; Το παράδειγμα του Σακχαρώδη Διαβήτη

Metabonomics: Η επιστροφή των μεταβολιτών; Το παράδειγμα του Σακχαρώδη Διαβήτη Χριστίνα Κωσταρά, Πανεπιστημιακός Υπότροφος Ελένη Μπαϊρακτάρη, Καθηγήτρια Κλινικής Χημείας Εργαστήριο Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων

Metabolome = the total metabolite pool All low molecular weight (< 1500 Da) organic molecules in a sample such as serum, urine, bile, etc. Sugars Lipids Small peptides Nucleosides Organic acids Amines Amino acids Steroids Drugs (xenobiotics)

The Estimation of Acetoacetic Acid and beta-hydroxybutyric Acid in Urine. Goldblatt MW. Biochem J. 1925;19(4):626-32 The metabolism of normal and tumour tissue: The effects of lactate pyruvate and deprivation of substrate. Dickens F, Greville GD. Biochem J. 1933;27(4):1134-40 Biochemistry of branched organic acids; metabolic experiments with alkylated adipic acids. WEITZEL G. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1950 Mar;285(1-3):58-77. Plasma amino acid levels and insulin secretion in obesity. Felig P, Marliss E, Cahill GF Jr. N Engl J Med. 1969 Oct 9;281(15):811-6.

BCAAs and aromatic AA

-omics" τεχνολογίες προσδιορισμός οικογενειών κυτταρικών συστατικών σε μία μόνο ανάλυση Γονιδιωματική Πρωτεομική Μεταβονομική

-omics" τεχνολογίες προσδιορισμός οικογενειών κυτταρικών συστατικών σε μία μόνο ανάλυση

(Μεταβονομική) Metabonomics Σύστημα στατιστικής επεξεργασίας του συνολικού προφίλ των μεταβολιτών που ανιχνεύονται στα βιολογικά υγρά Αντανακλά φυσιολογικές καταστάσεις και την απόκριση του οργανισμού σε διάφορες παθολογικές οντότητες (1989) Nicholson JK, Connelly J, Lindon JC, Holmes E. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function. Nat Rev Drug Discov. 2002;1:153-61

αληθή βιολογικά συμβάντα ( actual biological events) πραγματικά τελικά προϊόντα (real-world end points) Nicholson JK, Connelly J, Lindon JC, Holmes E. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function. Nat Rev Drug Discov. 2002;1:153-61

Metabonomics Μεταβολικό προφίλ βιολογικών υγρών Βιολογικά Υγρά (υγρή κατάσταση) Ορός / Πλάσμα Ούρα ΕΝΥ Αμνιακό υγρό Ασκητικό υγρό Χολή Σπερματικό υγρό Θυλακικό υγρό Προστατικό υγρό Αρθρικό υγρό Εκχυλίσματα ιστών κ.α. παθολογικές οντότητες ανταπόκριση σε φαρμακευτική αγωγή επίδραση τοξικών παραγόντων πειραματικά μοντέλα κλινικές μελέτες (στερεά κατάσταση) Άθικτοι ιστοί (βιοψίας) και κύτταρα Ζωντανοί οργανισμοί

Αναλυτικές Τεχνικές Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR)) Υγρή χρωματογραφία/φασματομετρία μάζης (LC-MS) (Liquid Chromatography - Mass Spectrometry (LC-MS)) Αέριος χρωματογραφία/φασματομετρία μάζης (GC/MS) (Gas Chromatography /Mass Spectrometry (GC/MS))

Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) Φάσμα του ανθρώπινου πλάσματος του αίματος χαρακτηριστικό αποτύπωμα Φύλο Ηλικία Εντερική μικροχλωρίδα Διατροφή Περιβάλλον Κάπνισμα Άγχος

Μεταβολικό προφίλ βιολογικών υγρών Σημείο 1 Δείγμα : 0.5 ml Μικρή ή καθόλου προεργασία του δείγματος Χωρίς χρήση αντιδραστηρίων Γρήγορη και συνολική ανάλυση Χαμηλό κόστος / δείγμα!!! Χαμηλό κόστος / παράμετρο Χρόνος ανάλυσης:15 min

Μεταβολικό προφίλ βιολογικών υγρών Φυσιολογική διακύμανση Παθοφυσιολογική Επίδραση ατέλεια μεταβολικής οδού Ατελής χειρισμός από ένα σύστημα οργάνων

Εγγενή μεταβολικά νοσήματα Γενετικά καθορισμένες ατελείς δράσεις ενζύμων Επηρεάζουν συγκεκριμένους βιοχημικούς δρόμους Εμφάνιση σοβαρών παθολογικών καταστάσεων Συσσώρευση σε mm, μη φυσιολογικών μεταβολιτών στα βιολογικά υγρά (κυρίως στα ούρα)

Εγγενή μεταβολικά νοσήματα Τριμεθυλαμινουρία (fish odour syndrome) χαρακτηριστικό παράδειγμα γενετικά καθορισμένης τροποποίησης του μεταβολισμού συστατικών της τροφής που επιφέρει μια δυσάρεστη κλινική κατάσταση φλαβινοοξυγενάση 3 (ΤΜΑ) Ατελής δράση (ΤΜΑΟ) TMAΟ TMA +TMAO = 92-98%

fish odour syndromes Διμεθυλογλυκίνη: 2.93s; 3.80s Ατελής δράση Τριμεθυλαμίνη: 2.89d Τριμεθυλαμινοξείδιο:3.54s TMA TMA +TMAO = 70% φλαβινοοξυγενάση 3 Ατελής δράση Control Clin Chem 1999;45:459-64

Μεταβολικό προφίλ βιολογικών υγρών Φυσιολογική διακύμανση Παθοφυσιολογική Επίδραση ατέλεια μεταβολικού δρόμου Ατελής χειρισμός από ένα σύστημα οργάνων

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ Nicholson JK, Connelly J, Lindon JC, Holmes E. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function. 2002; 1:153-161

-οmics προσέγγιση Multivariate Data Analysis (Ανάλυση Πολυμεταβλητών Δεδομένων) Pattern Recognition Techniques (Τεχνικές αναγνώρισης προτύπων) Άντληση της πιο σημαντικής πληροφορίας Διάκριση των υπό μελέτη ομάδων 2 η κύρια συνιστώσα, (2 nd Principal Component, PC) bin υγιείς ασθενείς 1 Η-NMR φάσμα 1 η κύρια συνιστώσα, (1 st Principal Component, PC)

Ασθενής 4 Ασθενής 3 Ασθενής 2 Ασθενής 1 Δείγματα (scores plot) 0,6 0,4 C o e f f i c i e n t s 0,2 0,0-0,2 Βins (loadings plot) -0,4 9,98 9,38 8,78 8,18 7,58 6,98 6,38 3,86 3,26 2,54 1,9 1,3 0,7 C h e m i c a l s h i f t (p p m) SIMCA-P 10.5-25/10/2006 2:46:49 ìì

PC 3 Μεταβολικό προφίλ Στοχευμένη παρατήρηση Μη στοχευμένη παρατήρηση εντοπίζουμε τον ή τους μεταβολίτες που αποκλίνουν και μετράμε την ποσότητά τους -omic παρατήρηση Τεχνικές αναγνώρισης προτύπων 10 8 6 4 2 0-2 -4 HUMAN RAT RABBIT MOUSE -6-20 -15-10 -5 0 5 10 15 PC 1

1H NMR-based metabonomics for investigating diabetes

Proton-nuclear-magnetic-resonance studies of serum, plasma and urine from fasting normal and diabetic subjects bu 1H NMR spectra of serum samples from a subject who had fasted for 12, 37 and 48h 1H NMR spectra of plasma from an insulin-dependent diabetic subject 0, 2, and 8h after insulin withdrawal Glc, glucose; P2 / P3, fatty acid; Val, valine; lac, lactate; Ala, alanine; Gln, glutamine; cit, citrate; cn, creatinine; Glc, glucose; bu / bu2, 3-hydroxybutyrate; a, acetate; ac, acetone; acac, acetoacetate Nicholson JK et al. Biochem. J. (1984) 217, 365-375 365

HOMA Association of a BCAA-Related PCA Factor with Insulin Resistance in Humans 30 25 20 15 10 R = 0.604 Lean Subjects Obese Subjects 5 0-2 0 2 4 6 PCA Factor 1* *PCA factor 1 comprised of Val, Leu/Ile, Glx, C3AC, C5AC, Phe, Tyr Newgard, et al. Cell Metabolism 9: 311, 2009

Metabolic Signatures of Insulin Resistance in 7,098 Young Adults age 31 ± 3 years; 52% women Associations of dietary composition and physical activity with circulating metabolites 20 metabolites associated with HOMA-IR (P <0.0005) Branched-chain and aromatic amino acids, gluconeogenesis intermediates, ketone bodies, and fatty acid composition and saturation Würtz P. Diabetes 61:1372 1380, 2012

Metabonomic analysis of potential biomarkers and drug targets involved in diabetic nephropathy mice Wei T, nature.com/scientific reports. 2015 Jul 7;5:11998

Metabonomic analysis of potential biomarkers and drug targets involved in diabetic nephropathy mice Wei T, nature.com/scientific reports. 2015 Jul 7;5:11998

1H NMR metabonomics approach to the disease continuum of diabetic complications and premature death serum of 613 patients with type I diabetes recruited by the Finnish Diabetic Nephropathy Study (FinnDiane) and a diverse spread of complications Makinen VP et al. Molecular Systems Biology (2008 ) 4:167 on behalf of the FinnDiane Study Group

Revisiting the membrane-centric view of diabetes. Pilon M. Lipids Health Dis. 2016 Sep 27;15(1):167 Red Cell membrane

Revisiting the membrane-centric view of diabetes. Pilon M. Lipids Health Dis. 2016 Sep 27;15(1):167 Red Cell membrane

Revisiting the membrane-centric view of diabetes. Pilon M. Lipids Health Dis. 2016 Sep 27;15(1):167 Red Cell membrane

DIAL LA ALLYL DHA EPA + AA ω-3 FA PC 1 H NMR- OPLS-DA analysis a) Scores plot b) Regression coefficient plot Diabetic Increased in Diabetics PL SM SFA CHOL non- Diabetic Increased in non-diabetic PE UFA DU CHOL, Cholesterol; DHA, Docosahexaenoic acid; DIAL, Diallylic fatty acids; DU, Degree of unsaturation; EPA+AA, The sum of EPA and AA; LA, Linoleic acid; nfa, Number of fatty acids; PL, total phospholipids; PC, Phosphatidylcholine; SFA, Saturated fatty acids; SM, Sphingomyelin; TG, Triglycerides; UFA, Unsaturated fatty acids and ω-3 FA, total omega-3 fatty acids.

Metabolic switching in the hypoglycemic and antitumor effects of metformin on high glucose induced HepG2 cells (2018) control low high Typical 500 MHz CPMG 1H NMR spectra for HepG2 cells of Cοntrol, Low and High dose of metformine groups Labeled metabolites: 1 Isoleucine, 2 leucine, 3 valine, 4 3-hydroxybutyrate (3-HB), 5 lactate, 6 Threonine, 7 alanine, 8 Lysine, 9 glutamate, 10 glutamine, 11 Glutathione, 12 Succinate, 13 Methionine, 14 Aspartate, 15 Creatine, 16 Ethanolamine, 17 Choline, 18 O-Phosphocholine, 19 Taurine, 20 Glycine, 21UDP-Nacetylglucosamine, 22 NAD+, 23ATP, 24 Tyrosine, 25 Phenylalanine, 26 Carnosine, 27 Formate.

Metabolic switching in the hypoglycemic and antitumor effects of metformin on high glucose induced HepG2 cells (2018) Metformin with hypoglycemic effect rectified glucose metabolic imbalance and regulated oxidative stress, energy and amino acid metabolism. Metformin inhibited tumor cell proliferation and induced apoptosis through activation of AMPK/ mtor pathway and further influencing energy metabolism, phospholipid metabolism and glucose catabolism. SUS-plots and corresponding Venn plots of HepG2 cells between High and Low metformin treatment groups modeled with Model group. (A and C) SUS-plots between the High and Low metformin treatment groups at 24 and 36 h, respectively. The metabolites close to the red diagonal line are equally affected in both groups, and the metabolites in the rectangular frame were uniquely affected in a single group. (B and D) Venn plots were used to illustrate the metabolites that were shared between classes and their positive and negative correlations as well as those that belong to only a single class

ΟΡΟΣ ΟΥΡΑ

Μεταβολικό προφίλ βιολογικών υγρών Σημείο 4 Κατανόηση του Μεταβολισμού σε πραγματικές συνθήκες Σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις

Ιωάννινα Η Λίμνη Παμβώτιδα (Παμβῶτις) Σας ευχαριστώ