ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΦΑΙΝΟΛΩΝ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ

12/ 2 / 2 1 8 C E R T I F I C A T E N o : P G 4 6 / 2 1 7 Περιγραφή ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΦΑΙΝΟΛΩΝ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ Δείγμα ελαιολάδου Παραγωγόσ / Διανομζασ ENKARDIA Προζλευςη ΓΕΡΑΚΙ, ΛΑΚΩΝΙΑ Ποικιλία ΚΟΡΩΝΕΙΚΗ Είδοσ καλλιζργειασ ΤΜΦΩΝΑ ΜΕ ΣΟΝ ΚΩΔΙΚΑ ΟΡΘΗ ΓΕΩΡΓΙΚΗ ΠΡΑΚΣΙΚΗ Τρόποσ παραγωγήσ ελαιολάδου Ημ/νία ςυλλογήσ ελαιοκάρπου 18/1/218 Ημ/νία ελαιοποίηςησ 18/1/218 Ημ/νία παραλαβήσ δείγματοσ 8/2/218 Ημ/νία ανάλυςησ 9/2/218 Συςκευαςία ΓΤΑΛΙΝΟ ΔΟΧΕΙΟ ΑΝΑΛΥΣΗ* 1. Εκχφλιςη πολυφαινολών ελαιολάδου 2. Ποςοτικόσ προςδιοριςμόσ Τδροξυτυροςόλησ (HT) και Συροςόλησ (T) με την προτεινόμενη από τον IOC αναλυτική τεχνική HPLC-DAD (http://www.internationaloliveoil.org/documents/viewfile/4141-met29eng). 3. Ημι-ποςοτικόσ προςδιοριςμόσ Ολεαςείνησ (OLEA) και Ολεοκανθάλησ (OLEO) με την τεχνική HPLC-DAD. 4. Προςδιοριςμόσ ςυνολικήσ ποςότητασ HT, T και παραγώγων τουσ/ Kg ελαιολάδου με όξινη υδρόλυςη του πολυφαινολικοφ κλάςματοσ και ςε ςυνδυαςμό με την τεχνική HPLC-DAD [1]. *Πειραματικές συνιθκες: Διαιέσιμες εφόσον ζητηιοφν. [1] Mastralexi et al., 214. Addressing analytical requirements to support health claims on "olive oil polyphenols" (EC Regulation 432/212), J Agric Food Chem, 26;62(12):2459-61. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΚΑΙ ΗΜΙΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΑΙΝΟΛΩΝ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ (HPLC-DAD) mg ουςίασ/kg ελαιολάδου HT T OLEA OLEO Συνολική ποςότητα ΗΤ και Τ/Kg ελαιολάδου Όξινη Υδρόλυςη Συνολική ποςότητα HT, T και παραγώγων τουσ/ Kg ελαιολάδου [1] 5,35 4, 29 39 193 446 ΗΤ: Τδροξυτυροςόλη; Τ: Συροςόλη, ΟLEA: Ολεαςείνη, OLEO: Ολεοκανθάλη Σχόλια ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΣΙΑ Εθνικό και Καποδιςτριακό Πανεπιςτήμιο Αθηνών ΣΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΤΣΙΚΗ Τομζασ Φαρμακογνωςίασ & Χημείασ Φυςικών Προϊόντων Καθηγητήσ Α.Λ. Σκαλτςοφνησ φμφωνα με τα αποτελζςματα των αναλφςεων, το ςυγκεκριμζνο ελαιόλαδο την ημερομηνία τησ ανάλυςησ περιζχει 446 mg HT, T και παραγώγων τουσ/ Κg ελαιολάδου. Σα επίπεδα αυτά ικανοποιοφν τα προτεινόμενα κριτήρια από την Ευρωπαϊκή Αρχή Αςφάλειασ Σροφίμων (ΕFSA) ςχετικά με τον ιςχυριςμό υγείασ-κανονιςμόσ (ΕΕ) αριθ. 432/212 (http://www.gcsl.gr/media/trofima/reg-432-212.pdf). PharmaGnose, Αναλυτικό Σμήμα PharmaGnose, Papathanasiou 24, 34, Chalkida, Euboea, Greece. web: www.pharmagnose.com, e-mail: info@pharmagnose.com

1 2 / 2 / 2 1 8 P a g e 1 of 7 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΣΙΑ Εθνικό και Καποδιςτριακό Πανεπιςτήμιο Αθηνών ΣΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΤΣΙΚΗ Σομζασ Φαρμακογνωςίασ & Χθμείασ Φυςικϊν Προϊόντων Κακθγθτισ Α.Λ. καλτςοφνθσ ΕΡΓΑΣΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΦΟΡΑ ΘΕΜΑ: Ποιοτικι και ποςοτικι ανάλυςθ πολυφαινολϊν ςε δείγμα ελαιολάδου ΗΜ/ΝΙΑ: 12/2/218 ΔΕΙΓΜΑΣΑ ΚΩΔΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑΣΟ OLE 1214 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Δείγμα ελαιολάδου ΑΝΑΛΤΗ 1. Εκχφλιςθ πολυφαινολϊν 2. HPLC-DAD ανάλυςθ ποιοτικό προφίλ 3. Ποςοτικόσ και θμιποςοτικόσ προςδιοριςμόσ ςυγκεκριμζνων φαινολϊν 4. Ποςοτικι ανάλυςθ του υδρολυμζνου εκχυλίςματοσ ελαιολάδου

1 2 / 2 / 2 1 8 P a g e 2 of 7 ΣΟΙΧΕΙΑ ΔΕΙΓΜΑΣΟ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΤ ΚΩΔΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑΣΟ Όνομα παραγωγοφ OLE_1214 ENKARDIA Η παροφςα μελζτθ ζχει ωσ ςτόχο τθν εφαρμογι εξειδικευμζνων τεχνικϊν ανάλυςθσ (RP- HPLC-DAD) για τθν ανίχνευςθ των βιοδραςτικϊν ςυςτατικϊν του ελαιολάδου, γνωςτά και ωσ βιοφαινόλεσ, που ευκφνονται ςε μεγάλο βακμό για τισ ευεργετικζσ του ιδιότθτεσ. Ιδιαίτερο ενδιαφζρον παρουςιάηουν οι δευτερογενείσ μεταβολίτεσ τθσ κατθγορίασ των φαινυλαλκοολϊν, όπωσ θ Τδροξυτυροςόλθ (Hydroxytyrosol) και θ Συροςόλθ (Tyrosol), κακϊσ και των ςεκοϊριδοειδϊν, όπωσ θ Ολεαςείνθ (Oleacein) και θ Ολεοκανκάλθ (Oleocanthal). Σα μόρια αυτά αποτελοφν μζροσ του πολικοφ φαινολικοφ κλάςματοσ του ελαιολάδου, και εμφανίηουν ςθμαντικζσ αντιοξειδωτικζσ, αντικαρκινικζσ και αντιφλεγμονϊδεισ ιδιότθτεσ, ενϊ φαίνεται να δρουν προςτατευτικά κατά τθσ νόςου Αλτςχάιμερ και τθσ γιρανςθσ του δζρματοσ. Πρόςφατα, θ Ευρωπαϊκι Αρχι Αςφάλειασ Σροφίμων (EFSA) αναγνϊριςε επίςθμα τθν καρδιοπροςτατευτικι δράςθ που αςκεί ςτον ανκρϊπινο οργανιςμό το ιςχυρό αντιοξειδωτικό του ελαιολάδου Τδροξυτυροςόλθ. φμφωνα με τον κανονιςμό 432/212 τθσ EFSA, θ θμεριςια κατανάλωςθ 5 mg Τδροξυτυροςόλθσ και παραγϊγων αυτισ (όπωσ για παράδειγμα το ςφμπλοκο τθσ Ολευρωπεΐνθσ και θ Συροςόλθ) εμποδίηει τθν οξείδωςθ τθσ κακισ χολθςτερόλθσ και κατ επζκταςθ αποτρζπει το ςχθματιςμό ακθρωματικισ πλάκασ ςτα αιμοφόρα αγγεία, προςτατεφοντασ ζτςι τον οργανιςμό από τθν εμφάνιςθ καρδιαγγειακϊν νοςθμάτων. Ο διατροφικόσ αυτόσ ιςχυριςμόσ μπορεί να χρθςιμοποιθκεί για ζνα ελαιόλαδο εφόςον θ προαναφερόμενθ ποςότθτα Τδροξυτυροςόλθσ και παραγϊγων τθσ περιζχονται ςε 2 γραμμάρια ελαιολάδου. ε αυτό το ςθμείο αξίηει να αναφερκεί ότι τα διαλδεχδικά ςεκοϊριδοειδι Ολεαςείνθ και Ολεοκανκάλθ αποτελοφν παράγωγα τθσ Τδροξυτυροςόλθσ και τθσ Συροςόλθσ, αντίςτοιχα. Εξαιτίασ του γεγονότοσ αυτοφ προςμετρϊνται ςτθ ςυνολικι αποτίμθςθ τθσ ενεργότθτασ του ελαιολάδου και θ ποςοτικοποίθςι τουσ ςυμβάλλει ςτθν επίτευξθ των ποςοτικϊν κριτθρίων που κζτει θ EFSA. Ζτςι, θ ςυγκεκριμζνθ μελζτθ επικεντρϊκθκε ςτθν αποτφπωςθ χαρακτθριςτικϊν αντιπροςϊπων των προαναφερόμενων κατθγοριϊν βιοενεργϊν ςυςτατικϊν. Ωςτόςο,

1 2 / 2 / 2 1 8 P a g e 3 of 7 μπορεί να επεκτακεί και ςτθν ανίχνευςθ και τον ποςοτικό προςδιοριςμό επιπλζον χθμικϊν βιοδραςτικϊν μορίων, όπωσ φαινολοξζα, φλαβονοειδι, λιγνάνια, τερπενοειδι. Η ςυγκεκριμζνθ μεκοδολογία μπορεί να εφαρμοςτεί για τον ποιοτικό ζλεγχο του ελαιολάδου και ςε ςυνδυαςμό με ιδθ υπάρχουςεσ τεχνικζσ ελζγχου. Σο παραγόμενο μεταβολικό προφίλ είναι ςυγκεκριμζνο για κάκε τφπο ελαιολάδου (ποικιλία, εποχι ςυλλογισ, γραμμι παραγωγισ κ.ά.) και μπορεί να χρθςιμοποιθκεί ωσ χθμικό «αποτφπωμα». A. ΕΚΧΤΛΙΗ / ΠΡΟΕΣΟΙΜΑΙΑ ΔΕΙΓΜΑΣΟ Με ςκοπό τθν απομόνωςθ των πολικϊν φαινολικϊν ςυςτατικϊν του δείγματοσ ελαιολάδου OLE_1214, εφαρμόςτθκε θ μζκοδοσ τθσ υγρισ-υγρισ εκχφλιςθσ με χριςθ φυγοκζντρου (πειραματικζσ ςυνκικεσ: διακζςιμεσ εφόςον ηθτθκοφν). Σο πολυφαινολικό εκχφλιςμα που προκφπτει από εδϊ και ςτο εξισ OLE_1214 εξατμίηεται υπό κενό ςτουσ 4 o C μζχρι ξθροφ, ηυγίηεται και οδθγείται προσ ανάλυςθ. Επιπλζον, μζροσ του πολυφαινολικοφ κλάςματοσ που προζκυψε από τθν παραπάνω διαδικαςία εκχφλιςθσ υδρολφκθκε υπό όξινεσ ςυνκικεσ [Mastralexi et al., 214. Addressing analytical requirements to support health claims on "olive oil polyphenols" (EC Regulation 432/212), J Agric Food Chem, 26;62(12):2459-61] με ςκοπό τθν ποςοτικοποίθςθ των φαινολϊν του αναλυόμενου δείγματοσ εκφραςμζνων ωσ Τδροξυτυροςόλθ, Συροςόλθ & παραγϊγων τουσ και τθν τεκμθρίωςθ του διατροφικοφ ιςχυριςμοφ υγείασ τθσ EFSA. B. ΑΝΑΛΤΗ HPLC-DAD Με τθν τεχνικι τθσ υγρισ χρωματογραφίασ υψθλισ απόδοςθσ με ανιχνευτι ςυςτοιχίασ φωτοδιόδων (HPLC-DAD) πραγματοποιικθκε: α) ποιοτικι ανάλυςθ των βιοφαινολϊν του δείγματοσ ελαιολάδου OLE_1214, β) ποςοτικόσ προςδιοριςμόσ των φαινυλαλκοολϊν Τδροξυτυροςόλθ (ΗΣ) και Συροςόλθ (Σ), τόςο ςτο αρχικό όςο και ςτο υδρολυμζνο πολυφαινολικό εκχφλιςμα του υπό μελζτθ δείγματοσ ελαιολάδου, και γ) θμιποςοτικόσ προςδιοριςμόσ των διαλδεχδικϊν ςεκοϊριδοειδϊν Ολεαςείνθ και Ολεοκανκάλθ (πειραματικζσ ςυνκικεσ: διακζςιμεσ εφόςον ηθτθκοφν). Σα αποτελζςματα τθσ ποςοτικισ

1 2 / 2 / 2 1 8 P a g e 4 of 7 και θμι-ποςοτικισ ανάλυςθσ εκφράςτθκαν ςε mg ουςίασ ανά κιλό ελαιολάδου, κακϊσ και ςε mg ουςίασ ανά 2 g ελαιολάδου (Πίνακασ 2 και 3). ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ B1) Προςδιοριςμόσ Τδροξυτυροςόλησ και Συροςόλησ 14 12 Detector 1-28nm IS OLE_1214 14 12 8 8 6 4 Τδροξυτυροςόλη Συροςόλη 6 4 2 2-2 -2 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 Minutes Εικόνα 1: Χρωματογράφθμα RP-HPLC-DAD (28 nm) του αναλυόμενου δείγματοσ OLE_1214, όπου επιςθμαίνονται οι κορυφζσ που αντιςτοιχοφν ςτθν Τδροξυτυροςόλθ και τθν Συροςόλθ. 3 Detector 1-28nm Detector 1-28nm Detector 1-28nm [1] Τδροξυτυροςόλη [2] Συροςόλη [3] [6] 3 25 [4] [8] 25 2 [5] [7] 2 15 IS 15 5 5 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 Minutes Εικόνα 2: Χρωματογράφθμα RP-HPLC-DAD του αναλυόμενου δείγματοσ OLE_1214 ςτα 28 nm (κόκκινθ γραμμι). Αντιπαραβάλλεται το αντίςτοιχο χρωματογράφθμα (μπλε γραμμι) διαλφματοσ πρότυπων ουςιϊν (βλ. Πίνακα 1), ςυμπεριλαμβανομζνων τθσ Τδροξυτυροςόλθσ [1] και τθσ Συροςόλθσ [2].

1 2 / 2 / 2 1 8 P a g e 5 of 7 Πίνακασ 1: Πρότυπεσ φαινολικζσ ενϊςεισ. [1] Τδροξυτυροςόλη (Hydroxytyrosol) [2] Συροςόλη (Tyrosol) [3] Βερμπαςκοςίδησ (Verbascoside) [4] Ολευρωπεΐνη (Oleuropein) [5] Λουτεολίνη (Luteolin) [6] Πινορεςινόλη (Pinoresinol) [7] Ακετοξυπινορεςινόλη (Acetoxypinoresinol) [8] Απιγενίνη (Apigenin) B2) Προςδιοριςμόσ Ολεαςείνησ και Ολεοκανθάλησ 2 18 Detector 1-235nm OLE_1214 2 18 16 16 14 14 12 Ολεοκανθάλη Φλαβονοειδή, Λιγνάνια, εκοϊριδοειδή 12 8 8 6 4 Ολεαςείνη 6 4 2 2-2 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 Minutes -2 Εικόνα 3: Χρωματογράφθμα RP-HPLC-DAD (235 nm) του αναλυόμενου δείγματοσ OLE_1214, όπου επιςθμαίνονται οι κορυφζσ που αντιςτοιχοφν ςτθν Ολεαςείνθ και τθν Ολεοκανκάλθ. Επίςθσ, επιςθμαίνεται θ περιοχι ζκλουςθσ άλλων ςθμαντικϊν βιοδραςτικϊν μορίων, όπωσ φλαβονοειδϊν, λιγνανίων και άλλων ςεκοϊριδοειδϊν.

1 2 / 2 / 2 1 8 P a g e 6 of 7 45 Detector 1-235nm Detector 1-235nm Ολεαςείνη Ολεοκανθάλη 45 4 4 35 35 3 3 25 25 2 2 15 15 5 5 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 Minutes Εικόνα 4: Χρωματογράφθμα RP-HPLC-DAD του αναλυόμενου δείγματοσ OLE_1214 ςτα 235 nm (κόκκινθ γραμμι). Αντιπαραβάλλεται το αντίςτοιχο χρωματογράφθμα (μπλε γραμμι) των πρότυπων ουςιϊν Ολεαςείνθ και Ολεοκανκάλθ. Πίνακασ 2: Ποςοτικι και θμι-ποςοτικι ανάλυςθ του υπό μελζτθ δείγματοσ. Κωδικόσ δείγματοσ Ελεφθερη HT (mg/kg) Ελεφθερη T (mg/kg) OLEA (mg/kg) OLEO (mg/kg) OLE_1214 (n=3) 5,35 4, 29 39 Πίνακασ 3: Χθμικι ανάλυςθ υδρολυμζνου εκχυλίςματοσ ελαιολάδου. Κωδικόσ δείγματοσ υνολική ποςότητα (mg) ΗΣ και Σ /Kg ελαιολάδου υνολική ποςότητα (mg) HT, T και παραγώγων τουσ/ Kg ελαιολάδου [1] OLE_1214 (n=3) 193 446 [1] Mastralexi et al., 214. Addressing analytical requirements to support health claims on "olive oil polyphenols" (EC Regulation 432/212), J Agric Food Chem, 26;62(12):2459-61. ΧΟΛΙΑ ΠΑΡΑΣΗΡΗΕΙ 1. Παρατθρϊντασ το χρωματογράφθμα τθσ Εικόνασ 1, μετά τθν ποςοτικοποίθςθ που πραγματοποιικθκε ςτο OLE_1214 προκφπτει ότι θ περιεκτικότθτά του ςε Τδροξυτυροςόλη είναι 5,35 mg/kg ελαιολάδου, ενϊ ςε Συροςόλη είναι 4,

1 2 / 2 / 2 1 8 P a g e 7 of 7 mg/kg ελαιολάδου. Σα χαμθλά επίπεδα τθσ υδροξυτυροςόλθσ και τυροςόλθσ είναι χαρακτθριςτικό των φρζςκων ελαιολάδων. 2. Όςον αφορά τα 235 nm (Εικόνεσ 3 και 4), όπου πραγματοποιείται ανίχνευςθ και προςδιοριςμόσ των διαλδεχδικϊν ςεκοϊριδοειδϊν, παρατθροφμε ότι θ Ολεαςείνη και το δομικά ςυγγενζσ τθσ μόριο Ολεοκανθάλη εμφανίηονται ςε επίπεδα περίπου 29 και 39 mg/kg ελαιολάδου, αντίςτοιχα. 3. Από τθν όξινθ υδρόλυςθ που πραγματοποιικθκε προζκυψε ότι τo υπό μελζτθ δείγμα ελαιολάδου περιζχει 446 mg Τδροξυτυροςόλησ και παραγώγων τησ/kg ελαιολάδου. Tα αποτελζςματα των ςυγκεκριμζνων εργαςτθριακϊν αναλφςεων δείχνουν ότι, τθν θμερομθνία τθσ ανάλυςθσ, το δείγμα OLE_1214 πλθροί τισ προχποκζςεισ του διατροφικοφ ιςχυριςμοφ υγείασ τθσ EFSA (http://www.gcsl.gr/media/trofima/reg-432-212.pdf), κακϊσ περιζχει > 5 mg Τδροξυτυροςόλησ και παραγώγων τησ ανά 2 g ελαιολάδου. 4. Σζλοσ, ςτο πολυφαινολικό κλάςμα του εξεταηόμενου δείγματοσ ελαιολάδου παρατθροφνται, εκτόσ των προαναφερόμενων, και άλλεσ κατθγορίεσ δραςτικϊν φυςικϊν μορίων, όπωσ φλαβονοειδι (π.χ. απιγενίνθ), λιγνάνια (π.χ. πινορεςινόλθ, ακετοξυπινορεςινόλθ) και άλλα ςεκοϊριδοειδι (Εικόνεσ 2 και 4).