Διασφάλιση Ποιότητας στο Εργαστήριο Κλινικής Βιοχημείας Χρήστος Κρούπης, MSc, PhD Επίκουρος Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας και Μοριακής Διαγνωστικής, Εργαστήριο Κλινικής Βιοχημείας, Αττικόν Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Βιβλιογραφία Clinical Chemistry by W. Marshall σελ. 4-9 Clinical Biochemistry by A. Gow et al σελ. 6-9 Clinical Chemistry by A. Kaplan et al σελ. 25-38
Θέματα Ομιλίας Πιστοποίηση και Διαπίστευση εργαστηρίου (ISO) Ιχνηλασιμότητα μεθόδων - Υλικά αναφοράς (Reference materials) Αναλυτικά χαρακτηριστικά δοκιμασιών- Επαλήθευση/Επικύρωση μεθόδων Εσωτερικός έλεγχος ποιότητας Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας
Σφάλματα στις βιοχημικές δοκιμασίες Προ-αναλυτική διαδικασία εκτός εργαστηρίου εντός εργαστηρίου Αναλυτική διαδικασία Μετα-αναλυτική διαδικασία Η προαναλυτική διαδικασία υπεύθυνη για το 57% των σφαλμάτων στα αποτελέσματα!
Διαχείριση ολικής ποιότητας στο Εργαστήριο Κλινικής Βιοχημείας Total Quality Management (TQM) 1. Quality planning (QP) 2. Quality laboratory process (QLP) 3. Quality control (QC) 4. Quality assessment (QA) 5. Quality improvement (QI) Five Q PDCA cycle (Plan, Do, Check, Act)
ISO (από το ίσος) «Ανάγκη για τεκμηρίωση και αμοιβαία αναγνώριση των αποτελεσμάτων μετρήσεων και δοκιμών που διακινούνται και παρέχονται διεθνώς» Ελεύθερη διακίνηση προϊόντων και υπηρεσιών Ισοδυναμία ελέγχων σε όλα τα κράτη Ομοιόμορφη εφαρμογή πολιτικών - εναρμόνιση Αποδοχή της αξιοπιστίας αποτελεσμάτων και δημόσιων πιστοποιητικών από όλα τα κράτη Υγιής ανταγωνισμός όφελος για «πελάτη-ασθενή» Ο ΕΛ.Ο.Τ. (Ελληνικός Οργανισμός Τυποποίησης) αντιπροσωπεύει την Ελλάδα στο ISO
Στάδια ποιότητας κατά ISO Άδεια Λειτουργίας (Licensing): από το κράτος Πιστοποίηση (certification): γραπτή διαβεβαίωση ότι ένα προϊόν ή υπηρεσία συμμορφώνεται σε ένα Πρότυπο ή Οδηγία με την εφαρμογή συστήματος διαχείρισης ποιότητας Διαπίστευση (accreditation): η διαδικασία με την οποία ένας αρμόδιος φορέας παρέχει επίσημη αναγνώριση ότι ένα εργαστήριο είναι τεχνικά επαρκές να διεξάγει συγκεκριμένες δοκιμασίες Φορείς πιστοποίησης πολλοί, μόνο ένας φορέας διαπίστευσης ανά χώρα (Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης, Ε.ΣΥ.Δ) αναγνωρισμένος από EA (European co-operation for Accreditation) και ILAC (International Laboratory Accreditation Cooperation) Προς το παρόν προαιρετικά στην Ελλάδα Μετά την αρχική αξιολόγηση και θετική εισήγηση της ομάδας αξιολόγησης: κάθε χρόνο επιτήρηση και στα 4 χρόνια επαναξιολόγηση κδίδεται πιστοποιητικό για τις παραμέτρους μόνο που διαπιστεύονται την έκθεση αποτελεσμάτων μπορεί να προστίθεται λογότυπος ΕΣΥΔ
Οφέλη διαπίστευσης Για το εργαστήριο: Απόδειξη ότι εφαρμόζει σύστημα ποιότητας, είναι τεχνικά επαρκές και παράγει αξιόπιστα αποτελέσματα σύμφωνα με διεθνή πρότυπα Ενισχύεται η αναγνώριση και το κύρος του (marketing) Μακροπρόθεσμα περιορίζει το «κόστος ποιότητας» Για τους ασθενείς: Διασφάλιση αξιοπιστίας αποτελεσμάτων Μικρότερη ανάγκη για επανέλεγχο Για τους κυβερνητικούς φορείς: Αυξημένη εμπιστοσύνη για λήψη αποφάσεων Μείωση «αβεβαιότητας» Αύξηση αποτελεσματικότητας ελέγχων
ISO 15189:2012 Ειδικό για διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων Διοικητικές απαιτήσεις (ISO 9001:2000) Οργάνωση ορισμός υπευθύνου ποιότητας Σύστημα ποιότητας και εγχειρίδιο ποιότητας Συμβάσεις, υπηρεσίες και προμήθειες Τήρηση και έλεγχος αρχείων Αρχείο παραπόνων Καταγραφή και έλεγχος μη συμμορφώσεων (non conformities) Διορθωτικές και προληπτικές ενέργειες Διεξαγωγή εσωτερικών επιθεωρήσεων (internal audits) Θέσπιση δεικτών ποιότητας (quality indicators) Ανασκόπηση από τη διοίκηση (management review)
Τεχνικές απαιτήσεις ISO 15189:2012 Υποδομή Εργαστηρίου Προσωπικό, περιγραφή ευθυνών συνεχιζόμενη εκπαίδευση Εγκαταστάσεις Εξοπλισμός-βαθμονόμηση-συντήρηση-διακρίβωση Επιλογή κατάλληλων μεθόδων και εφαρμογή Εγχειρίδιο μεθόδων, SOPs, GLP Έλεγχος προ- και μετα-αναλυτικών διαδικασιών Επικύρωση/επαλήθευση μεθόδων-ιχνηλασιμότητα Εσωτερικός έλεγχος ποιότητας Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας
Πορεία ελέγχου Αναλυτικών χαρακτηριστικών Ταξινόμηση: Εσωτερική (In house, LDT) Πρότυπη [CE-IVD ή FDA cleared/approved: 510(k)/PMA] Επικύρωση (Validation) Επαλήθευση (Verification) Ποσοτική Ποιοτική Ποσοτική Ποιοτική Γενικά: Επαλήθευση < < επικύρωση, ποιοτική < ποσοτική μέθοδος Γιατί επαλήθευση? Το εργαστήριο πρέπει να αποδείξει ότι στα «δικά του χέρια»: (στις δικές του εργασιακές συνθήκες, με το δικό του προσωπικό και εξοπλισμό!) μπορεί να επιτύχει τα ίδια ή καλύτερα αποτελέσματα στα χαρακτηριστικά επίδοσης από αυτά που αναφέρει ο κατασκευαστής!
Ιχνηλασιμότητα (traceability) Ιδιότητα του αποτελέσματος μιας μέτρησης ή της τιμής ενός βαθμονομητή (calibrator) να συσχετισθεί με γνωστά υλικά αναφοράς, συνήθως διεθνή πρότυπα, μέσω μιας άρρηκτης αλυσίδας συγκρίσεων που έχουν όλα γνωστές αβεβαιότητες Χρήση υλικού αναφοράς (reference material) Ποσοτικές αναλύσεις απαιτούν βαθμονομητή (calibrator) για την κατασκευή προτύπου καμπύλης Δείγματα εσωτερικού ελέγχου ποιότητας (controls) Ο όρος ιχνηλασιμότητα ενίοτε αναφέρεται και στη δυνατότητα να βρίσκεται στο σύστημα ποιότητας του εργαστηρίου ανά πάσα στιγμή το ποιος, πότε, που, έκανε κάτι κατά την προ-αναλυτική, αναλυτική και μετα-αναλυτική φάση μιας κλινικής δοκιμής (sample, document, instrument, material traceability)
Αλυσίδα ιχνηλασιμότητας https://repository.kallipos.gr/ Εργαστηριακές ασκήσεις Κλινικής Χημείας (Ελληνικά Ακαδημαϊκά ηλεκτρονικά συγγράματα και βοηθήματα) Κρούπης Χ. Κεφ.9 &10 «Εργαστηριακές Ασκήσεις Κλινικής Χημείας» (2015) Κάλλιπος
Ταξινόμηση κατάλληλων υλικών για επαλήθευση/επικύρωση μεθόδων Πιστοποιημένο Υλικό αναφοράς (Certified RM) Υλικό από εργαστήριο αναφοράς Υλικό από εξωτερικό έλεγχο ποιότητας Control (μέσω του κιτ ή εταιρείας με controls) Τιμή-στόχος ± αβεβαιότητα (ή ανοχή) ± 2 SD (95%)
Ορθότητα (trueness) Διαφορά του μέσου όρου των μετρήσεων από την αληθή τιμή λόγω συστηματικού σφάλματος (systematic error, SE) Μέτρα της μη-ορθότητας: απόλυτη διαφορά (bias), Β% -Με πιστοποιημένα υλικά αναφοράς -Με δείγματα controls -Με δείγμα από εξωτερικό έλεγχο ποιότητας Μεροληψία = διαφορά από αληθή τιμή
Πιστότητα (Precision) Διασπορά αποτελεσμάτων λόγω τυχαίου σφάλματος (random error, RE) Επαναληψιμότητα (Repeatability) Within-run Within-day Αναπαραγωγιμότητα (Reproducibility) Between-run, σε βάθος χρόνου Με κατάλληλα δείγματα εσωτερικού ελέγχου ποιότητας (n=20)
Πιστότητα Μέτρα της μη-πιστότητας (imprecision): -Τυπική απόκλιση SD (standard deviation) -Συντελεστής μεταβλητότητας CV (coefficient of variation)% [(SD/x ave ) 100] Πάντα: SD reproducibity > SD repeatability Προδιαγραφή γενική: CV 2 (1-0,5 logc)
Ακρίβεια (Accuracy) Για μία μέτρηση Ακρίβεια = Ορθότητα και πιστότητα (accuracy = trueness and precision) Μέτρο της ανακρίβειας (inaccuracy): μέγιστο Oλικό Σφάλμα = συστηματικό σφάλμα + 2 x τυχαίο σφάλμα (για διάστημα εμπιστοσύνης 95%)
Παράδειγμα για ακρίβεια μεθόδου ορθή χωρίς καλή πιστότητα ακριβής: ορθή και με καλή πιστότητα μη-ορθή με μέτρια πιστότητα μη-ορθή με καλή πιστότητα
ΑΣΚΗΣΗ ΟΛΙΚΟΥ ΣΦΑΛΜΑΤΟΣ Παγκόσμια προδιαγραφή ολικού σφάλματος στη μέτρηση χοληστερόλης < 9,01% Δύο εργαστήρια Κλινικής Βιοχημείας Α και Β παρέλαβαν πιστοποιημένο υλικό αναφοράς χοληστερόλης με τιμή στόχο 200 mg/dl. Τις επόμενες 10 ημέρες μέτρησαν το υλικό καθημερινά μία φορά στο βιοχημικό αναλυτή. Λήφθησαν οι ακόλουθες μετρήσεις: Εργ. Α Εργ. Β 210 206 198 205 193 204 203 205 194 204 202 205 201 205 190 207 191 208 Υπολογίστε το μέγιστο ολικό σφάλμα στη μέτρηση χοληστερόλης στα δύο εργαστήρια. Πληρούν τα δύο εργαστήρια την παγκόσμια προδιαγραφή? Ποιο από τα δύο εργαστήρια είναι «καλλίτερο» αναφορικά με τη μέτρηση χοληστερόλης?
Βιολογική μεταβλητότητα (biological variation) περιοδική και τυχαία διακύμανση γύρω από μια πραγματική τιμή in vivo ενδο-ατομική μεταβλητότητα (intra-individual, b i ή b w ) στο ίδιο άτομο (within) με τη πάροδο του χρόνου διατομική μεταβλητότητα (inter-individual, b g ή b b ) μεταξύ (between) διαφόρων ατόμων
Προδιαγραφές αναπαραγωγιμότητας Επιθυμητή αναλυτική αναπαραγωγιμότητα (CV a ): CV a < 0,5 Cv bi SD a < 0,5 SD bi CV bi =Ενδοατομική Βιολογική Μεταβλητότητα Προδιαγραφές ορθότητας Μέγιστη μεροληψία (bias%) Max Βias (%) < 0,25 (CV bi ) 2 + (CV bg ) 2 CV bi =Ενδοατομική Βιολογική Μεταβλητότητα CV bg = Διατομική Βιολογική Μεταβλητότητα
TE a, επιτρεπτό ολικό σφάλμα ΤΕ a < μέγιστο επιτρεπτό συστηματικό σφάλμα + 1,65 (μεγίστου επιτρεπτού τυχαίου σφάλματος) ΑΣΚΗΣΗ ΠΡΟΔΙΑΓΡΑΦΩΝ Βρείτε προδιαγραφές για το Ασβέστιο: CV bi = 2,1% - CV bg = 2,5% -Imprecision (I%) ή CVa < 0,5 2,1 = 1,05% -Β% < 0,25 (2,1 i ) 2 + (2,5) 2 = 0,82% -επιτρεπτό Ολικό σφάλμα ΤΕ a < 0,82 + 1,65 1,05 = 2,55%
Πίνακας βιολογικής μεταβλητότητας και προδιαγραφές για μέγιστο επιτρεπτό ολικό σφάλμα Ricos C et al.,current databases on biologic variation: pros, cons and progress. Scand J Clin Lab Invest (1999);59:491 500
Διαφορά (Δ) δύο μετρήσεων ασθενούς σε 2 τυχαίες ημέρες: Δ SD < 2,8 SD a 2 +SD bi 2 Δ CV < 2,8 CV a 2 +CV bi 2 (Το 2,8 προκύπτει από: t 2 =1,96 1,44 = 2,8 με στάθμη εμπιστοσύνης 95%) Άσκηση Για το Ασβέστιο ισχύει: CV bi = 2,1%. Το εργαστήριο δηλώνει τιμές αναφοράς 8,6-10,3 mg/dl και αναλυτική αναπαραγωγιμότητα CVa = 3%. Το ασβέστιο ασθενούς σε 2 συνεχόμενες ημέρες είναι 8,5 και 9,6 mg/dl. Είναι στατιστικά σημαντική η διαφορά? Δ = 9,6 8,5 = 1,1 mg/dl CV = 8,59% Δ CV =2,8 CV 2 a +CV 2 bi = 2,8 (3) 2 + (2,1) 2 = 10,2% Οι τιμές δεν είναι στατιστικά διαφορετικές
Όριο Ανίχνευσης (Αναλυτική Ευαισθησία) (όπου είναι κλινικά σημαντικό) Όριο ανίχνευσης (LOD, limit of detection)=3 SD blank [για στάθμη εμπιστοσύνης 99,7%] Με στατιστικό τρόπο και μέτρηση τυφλών ή πολύ αραιών δειγμάτων (n=20) Με εμπειρικό τρόπο και μέτρηση αραιών δειγμάτων: συγκέντρωση της μετρούμενης παραμέτρου η οποία μπορεί να μετρηθεί στο 95% των μετρήσεων (19 στις 20 προσπάθειες)
Όριο ποσοτικοποίησης (LOQ, limit of quantification ή LLQ, lower limit of quantification): 3,3 LOD συγκέντρωση παραμέτρου όπου CV=20% Γραμμικότητα-αναλυτικό εύρος (measuring range): Σε τουλάχιστον 5 δείγματα με σειριακή αραίωση πυκνού βαθμονομητή εις τριπλούν Έλεγχος γραμμικής παλινδρόμησης κλίση 0,95-1,05 r 2 0,99 όταν το μοντέλο γραμμικότητας είναι καλό (απόρριψη των σημείων μη-γραμμικότητας)
Αναλυτική ειδικότητα Αναλυτική ειδικότητα (specificity) Ικανότητα της δοκιμασίας να προσδιορίζει εκλεκτικά μόνο την προς ανάλυση ουσία (χωρίς παρεμποδίσεις), τυπικά εκφράζεται και ως % διασταυρούμενη δραστικότητα (cross-reactivity)
Σύγκριση μεθόδων (comparison) (n=40, εις διπλούν) Ποσοτική ευρύ πεδίο τιμών Γραμμική παλινδρόμηση (ή Deming ή Passing-Bablock) κλίση (0,95-1,05) δεν υπάρχει αναλογικό bias t-test intercept - όχι σταθερό bias r>0,975 αποδεκτό εύρος τιμών Difference plot (Bland-Altman) Ποσοτική μικρό εύρος τιμών t-test Ποιοτική % Concordance (συμφωνία θετικά/αρνητικά) kappa (>0,8) ή Mc Nemar s τεστ
Εσωτερικός έλεγχος Ποιότητας (ή ενδο-εργαστηριακός) Χρήση δειγμάτων ελέγχου (controls): συνήθως δύο επιπέδων με τιμή-στόχο ± SD (σε υγρή μορφή ή λυοφιλιωμένη) Έλεγχος μέσω στατιστικής επεξεργασίας
Κατασκευή διαγραμμάτων Levey-Jennings +3SD +2SD -2SD -3SD
Έλεγχος Levey-Jennings Άριστο διάγραμμα: μόνο 1 στις 20 τιμές (5%) αναμένεται εκτός ορίων x ± 2SD (με βάση κανονική Gauss κατανομή)
Είδη αναλυτικών σφαλμάτων Μηχανικά (στον αναλυτή) Χημικά (στα δείγματα ελέγχου, βαθμονομητές, αντιδραστήρια) Τυχαία Δεν μπορούν να προβλεφθούν, μπορούν να περιορισθούν (π.χ. ανάλυση εις διπλούν) Ογκομέτρηση δείγματος ή αντιδραστηρίου Ανεπαρκή ανάδευση ορού ελέγχου Αυξομειώσεις τάσης ρεύματος Συστηματικά Πρόβλημα βαθμονόμησης (πχ. αλλαγή lot αντιδραστηρίου) Σφάλμα στην ανασύσταση βαθμονομητών και αντιδραστηρίων Αλλοίωση τους λόγω ακατάλληλης συντήρησης Πηγή φωτός ή θερμοκρασίας
Μέθοδος πολλαπλών κανόνων κατά Westgard Προειδοποίηση!!
Κριτήριο ελέγχου 1 3s Τυχαίο σφάλμα
Κριτήριο ελέγχου 2 2s Συστηματικό σφάλμα
Κριτήριο ελέγχου R 4s Τυχαίο σφάλμα
Κριτήριο ελέγχου 4 1S Συστηματικό σφάλμα
Κριτήριο ελέγχου 10 Χ Συστηματικό σφάλμα
Εφαρμογή κριτηρίων ελέγχου Επιτυχημένο σύστημα: μεγάλη πιθανότητα ανίχνευσης σφάλματος και μικρή πιθανότητα λανθασμένης απόρριψης
Εναλλακτικές μέθοδοι εσωτερικού ελέγχου ποιότητας Έλεγχος με προηγούμενη τιμή ασθενούς Delta check (έλεγχος % διαφοράς με προηγούμενη τιμή ασθενούς) Μέθοδος ημερήσιας φυσιολογικής τιμής ασθενών (εξωτερικών νοσηλευόμενων) Οι τελευταίες δύο μέθοδοι εντοπίζουν και προ- ή μετααναλυτικά σφάλματα
Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας (External Quality Control) Συμμετοχή σε διεργαστηριακά σχήματα (EQAs, External Quality Assessment schemes ή αλλιώς, PT, Proficiency Testing) υποχρεωτική για τις δοκιμασίες υπό διαπίστευση κατά ISO Μη-επιτυχής επίδοση του εργαστηρίου σε αυτόν τον τομέα: σοβαρή μη-συμμόρφωση Αποτελεί σημαντικότατο τρόπο ελέγχου της ορθότητας των μεθοδολογιών του εργαστηρίου Πρώτα διεργαστηριακά σχήματα: 1952 (ΗΠΑ), 1957 (Ολλανδία)
Οργάνωση διεργαστηριακών σχημάτων -από έναν ανεξάρτητο επιστημονικό ή ιδιωτικό ή κρατικό φορέα ο οποίος προετοιμάζει κατάλληλα και αποστέλλει υπό ελεγχόμενες συνθήκες έναν κοινό αριθμό ομοιογενών και σταθερών δειγμάτων στα συμμετέχοντα εργαστήρια Ιδανική μορφή των δειγμάτων: ανάλογα του υποστρώματος (matrix) που αναλύεται από την εργαστήρια στην καθημερινή ρουτίνα ωστόσο και άλλες μορφές μπορούν να γίνουν αποδεκτές (π.χ. λυοφιλοποιημένοι οροί) αρκεί να αποδειχθεί ισοδυναμία (commutability) Τα συμμετέχοντα εργαστήρια έχουν συγκεκριμένο χρονικό όριο για να αναλύσουν τα δείγματα τους -ιδανικά αναλύονται παράλληλα με τα δείγματα ρουτίνας και με τον ίδιο επακριβώς τρόπο- και για να στείλουν τα αποτελέσματά τους σε έντυπη ή ηλεκτρονική μορφή
Έλεγχος αποτελεσμάτων EQA Τιμή-στόχος (target value) ενός αποσταλλέντος δείγματος: -assigned τιμή-στόχο με αβεβαιότητα (uncertainty) -εάν είναι μετρολογικά ιχνηλάσιμο -με ανάλυσή του σε εργαστήριο αναφοράς με μέθοδο αναφοράς ή -με σύγκριση με πιστοποιημένο υλικό αναφοράς (CRM, certified reference material) -consensus τιμή: προκύπτει μετά τη συλλογή όλων των αποτελεσμάτων των συμμετεχόντων εργαστηρίων, απόρριψη των ακραίων τιμών (outliers) και κατάλληλη στατιστική επεξεργασία Η επίδοση του εργαστηρίου κρίνεται με εχεμύθεια
Ιστόγραμμα κατανομής Κρεατινίνη ΕΣΕΑΠ Εθνικό Σύστημα Εξωτερικής Αξιολόγησης Ποιότητας Έλεγχος ορθότητας Σύγκριση με άλλες μεθόδους
Δείκτης SDI (Standard Deviation Index) σε ποσοτικές παραμέτρους Αποτέλεσμα SDI : <1: Ιδανικό 1-2: Ικανοποιητικό 2-3: Οριακό >3: Μη αποδεκτό ΕΣΕΑΠ (από 1994) SDI= (Αποτέλεσμα εργαστηρίου Τιμή στόχος) ----------------------------------------------------- SD μετρήσεων
Διαγράμματα Levey-Jennings - Διαχρονική επίδοση του εργαστηρίου - έλεγχος αναπαραγωγιμότητας (ίδια δείγματα σε τακτά χρονικά διαστήματα) και γραμμικότητας (αραιωμένα δείγματα)