Ανάλυση αυθεντικότητας προϊόντων κρέατος με μεθόδους DNA: Η περίπτωση νοθείας με κρέας αλόγου Στέλιος Σπανιόλας Τεχνολόγος Τροφίμων, MSc PhD 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η σημασία της νοθείας των τροφίμων, τόσο από την οπτική γωνία μιας ελεγκτικής υπηρεσίας που προστατεύει την υγεία και τα δικαιώματα του καταναλωτή, όσο και από αυτήν της βιομηχανίας, θεωρούμε ότι είναι προφανής. Ο διοικητικός έλεγχος που διενεργεί ένα κλιμάκιο ελεγκτών στα διάφορα εμπορικά παραστατικά για την καταπολέμησή της απαιτεί αρκετές φορές πολλές ανθρωποώρες εργασίας, χωρίς ωστόσο να επιτυγχάνονται πάντα τα επιθυμητά αποτελέσματα. Αντιθέτως, μια εργαστηριακή ανάλυση του «ύποπτου» προϊόντος μπορεί να οδηγήσει στο επιθυμητό αποτέλεσμα πολύ πιο γρήγορα και με μικρότερο κόστος από αυτό ενός ενδελεχούς διοικητικού ελέγχου. Η επιστημονική βιβλιογραφία έχει να επιδείξει έναν μεγάλο αριθμό πρωτοκόλλων ανάλυσης για μια πληθώρα νοθειών διαφόρων κατηγοριών σε πολλά είδη τροφίμων, επεξεργασμένα και μη. Κατά συνέπεια, τα αναλυτικά «εργαλεία» που είναι διαθέσιμα για την ανίχνευση της νοθείας είναι αρκετά και σε συνδυασμό με συγκεκριμένα μόρια ή ομάδα μορίων στόχων συνήθως καλύπτουν όλες τις περιπτώσεις. Ενδεικτικά, για την περίπτωση της μερικής ή ολικής αντικατάστασης ενός είδους από ένα άλλο, αναφέρουμε τα εξής: α) αναλογία ισοτόπων με φασματομετρία μάζας, β) φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού, γ) φασματοσκοπία υπερύθρου, δ) ανοσοενζυμικές τεχνικές και ε) τεχνικές διαχωρισμού (ηλεκτροφόριση, υγρή/αέρια χρωματογραφία). Ειδικότερα, για την ταυτοποίηση της ταξινομικής προέλευσης των οργανισμών που απαρτίζουν ένα τρόφιμο, τα μόρια στόχοι που αρχικά χρησιμοποιήθηκαν είναι, μεταξύ άλλων, τα αμινοξέα, οι πολυφαινόλες, τα καροτενοειδή και οι ανθοκυαννίνες, τα λιπαρά, οξέα, οι στερόλες, τα τριγλυκερίδια καθώς και τα πρωτεϊνικά προφίλ. Στις περισσότερες των περιπτώσεων όμως, και ειδικότερα στην διαφοροποίηση των ποικιλιών ενός φυτικού είδους, τα προφίλ μεταβολιτών επηρεάζονται άμεσα από διάφορους εξωγενείς παράγοντες, όπως η γεωγραφική προέλευση, οι περιβαλλοντικές συνθήκες, οι καλλιεργητικές πρακτικές κλπ. Κατά συνέπεια, η αποτελεσματική τους χρήση απαιτεί τεράστια βάση δεδομένων, ενώ πολλές φορές περιορίζεται σε τρόφιμα μιας ποικιλίας και όχι μίγματος ποικιλιών. Στην περίπτωση των ζωικών τροφίμων οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται κατά την θερμική επεξεργασία ενώ η έκφρασή τους πολλές φορές σχετίζεται με το είδος του ζωικού ιστού. Κατά την ανάλυση όμως του DNA οι παραπάνω περιορισμοί δεν υφίστανται μιας και αυτό είναι πιο σταθερό στην θερμική επεξεργασία από ότι οι πρωτεΐνες, ανιχνεύεται σε όλους τους ιστούς Σελίδα 1 από 6
(Lockley & Bardsley, 2000), δεν εξαρτάται από εξωγενείς παράγοντες όπως τα προφίλ μεταβολιτών, ενώ η ανάλυσή του μπορεί να πραγματοποιηθεί από έναν αρκετά ικανοποιητικό αριθμό συνδυασμών μεθόδων απομόνωσης, ενζυμικής επεξεργασίας, διαχωρισμού και ανίχνευσης. 2. ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ ΒΑΣΙΣΜΕΝΕΣ ΣΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ DNA 2.1. Απομόνωση DNA Οι περισσότερες - αν όχι όλες DNA αναλυτικές προσεγγίσεις περιλαμβάνουν σε κάποιο στάδιο τον πολλαπλασιασμό του θραύσματος προς ανάλυση μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Αυτό σημαίνει ότι η ποιότητα του απομονωθέντος DNA είναι ιδιαίτερα κρίσιμη και έγκειται κυρίως στην απουσία αναστολέων της PCR και την όσο το δυνατόν μεγαλύτερη ποσότητα και ακεραιότητά του. Αυτές οι απαιτήσεις αν και είχαν αρχικά επισημανθεί για την ανίχνευση των γενετικά τροποποιημένων οργανισμών στα τρόφιμα (Zimmermann, Luthy & Pauli, 1998), ισχύουν για κάθε περίπτωση ανάλυσης νοθείας βασισμένης στο DNA. Ως εκ τούτου, πριν την οποιαδήποτε προσπάθεια ανάπτυξης μιας αντίστοιχης αναλυτικής μεθόδου από κάποιο εργαστήριο, συνιστάται η αφιέρωση μερικών ημερών στην σύγκριση και εύρεση του καταλληλότερου πρωτοκόλλου απομόνωσης DNA από το είδος του τροφίμου που μελετάται (Csaikl et al. 1998). Στο παρελθόν έχει δημοσιευθεί σχετική μελέτη στη οποία προτείνεται με τη χρήση του λογισμικού πακέτου Design Expert μια γενικευμένη προσέγγιση μαθηματικής αξιολόγησης μεθόδων απομόνωσης DNA, με κριτήρια την ποσότητα και την καθαρότητά του (αναστολείς της PCR). Η εφαρμογή της σε πέντε (5) διαφορετικά πρωτόκολλα απαιτεί 40 ανθρωποώρες περίπου (Spaniolas et al., 2008). Πέρα των κριτηρίων αυτών, υπάρχουν και άλλα με βάση τα οποία μπορεί να γίνει μια αντίστοιχη αξιολόγηση, όπως το κόστος του πρωτοκόλλου, η ευκολία εκτέλεσής του, η ικανότητα αυτοματοποίησης και εκτέλεσής του σε μεγάλη κλίμακα κλπ. 2.2. Μόρια στόχοι για την ανάλυση αυθεντικότητας Κατά την ανάλυση του DNA, τα θραύσματα στόχοι είναι α) πυρηνικές αλληλουχίες γονιδίων που απαντώνται σε συγκεκριμένο είδος, ή β) πολυμορφικές περιοχές, κοινές για όλα τα εμπλεκόμενα είδη, οι οποίες εκτός από πυρηνικό DNA μπορεί να προέρχονται από μιτοχονδριακό ή πλαστιδιακό DNA, για ζωικά ή φυτικά είδη, αντίστοιχα. Η πρώτη περίπτωση αναφέρεται στην διαφοροποίηση οργανισμών με σχετικά μεγάλη ταξινομική απόσταση μεταξύ τους, όπως είναι η περίπτωση της ανίχνευσης των αλλεργιογόνων τροφίμων (Brezna, Hudecova & Kuchta, 2006), ή των γενετικά τροποποιημένων οργανισμών (Meyer, 1999). Η δεύτερη περίπτωση περιλαμβάνει κυρίως την διαφοροποίηση πολύ συγγενικών Σελίδα 2 από 6
ειδών ή ποικιλιών, χωρίς να αποκλείει και την διαφοροποίηση μη συγγενικών ειδών, και αναφέρεται κυρίως στη χρήση μοριακών δεικτών ή συντηρημένων περιοχών (conserved regions) όπως είναι κάποιες μιτοχονδριακές ή χλωροπλαστικές περιοχές. Το μιτοχονδριακό DNA έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στο παρελθόν για φυλογενετικές αναλύσεις, καθώς και για μελέτες πληθυσμών και δικαστικής. Ιδιαίτερα για την περίπτωση της φυλογένεσης η χρήση/σύγκριση του μιτοχονδριακού DNA θεωρείται πολύ πιο αποτελεσματική από ότι η χρήση ενός πυρηνικού γονιδίου (Boore, Macey & Medina, 2005). Επιπλέον, τα αντίγραφα ενός μιτοχονδριακού θραύσματος είναι πολύ περισσότερα από αυτά ενός πυρηνικού στόχου, ανά κύτταρο. Αυτό σημαίνει ότι το σήμα της PCR θα είναι πολύ πιο έντονο, καθιστώντας την ανίχνευση ενός είδους πολύ πιο εύκολη. Ο μεγάλος αριθμός των μιτοχονδριακών αντιγράφων αν και αποτελεί πλεονέκτημα για ποιοτική ανάλυση, εντούτοις, δεν ενδείκνυται για ποσοτικό προσδιορισμό διότι δεν είναι γνωστός αφού κυμαίνεται από ένα έως μερικές χιλιάδες αντίγραφα ανά κύτταρο, ενώ εξαρτάται και από το είδος του ιστού. Αυτό δεν ισχύει για τα πυρηνικά γονίδια όπου ο αριθμός των αντιγράφων τους ανά κύτταρο είναι πάντα ο ίδιος, και κατά συνέπεια ενδείκνυνται για ποσοτική ανάλυση. 3. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΖΩΟΛΟΓΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΤΟΥ ΚΡΕΑΤΟΣ Κατά το παρελθόν, έχουν δημοσιευθεί αρκετά αναλυτικά πρωτόκολλα αυθεντικότητας προϊόντων κρέατος, νωπών και θερμικά επεξεργασμένων (Bellagamba et al., 2001; Sun and Lin, 2003; Peter et al., 2004; Maede, 2006; Fajardo et al., 2006). Σε όλες τις παραπάνω ενδεικτικές περιπτώσεις ο DNA στόχος ήταν τα μιτοχονδριακά γονίδια cyt b ή 12S rdna, ενώ σε μία περίπτωση χρησιμοποιήθηκε και χρωμοσωμικό γονίδιο αυξητικής ορμόνης. Η ακολουθούμενη μέθοδος ήταν η PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), τα προϊόντα της οποίας ανιχνεύθηκαν σε πηκτή αγαρόζης ή σε σύστημα τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης. Πιο πρόσφατες δημοσιεύσεις πάνω στην αυθεντικότητα των προϊόντων κρέατος περιλαμβάνουν πλέον και την ανίχνευση μιτοχονδριακού DNA αλόγου. Συγκεκριμένα, οι Martin et al. (2009) ανέπτυξαν επιτυχώς PCR εκκινητές αποκλειστικά για DNA αλόγου, στοχεύοντας το μιτοχονδριακό γονίδιο 12S rrna και επιτυγχάνοντας όριο ανίχνευσης (LOD) 1g/kg. Οι Kesmen et al. (2009) ανέπτυξαν ειδικούς εκκινητές και μόρια ανιχνευτές TaqMan για την ανίχνευση DNA αλόγου, γαϊδουριού και χοιρινού μέσω Real-Time PCR, στοχεύοντας στα μιτοχονδριακά γονίδια ATP 6-8, ND2 και ND5, αντίστοιχα. Σε αντίθεση με τις Σελίδα 3 από 6
προηγούμενες δημοσιεύσεις, οι Koppel Ruf & Rentsch (2011) ανέπτυξαν ποσοτική μέθοδο τετραπλής Real-Time PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση βόειου, χοιρινού, πρόβειου και αλογίσιου κρέατος σε προϊόντα κρέατος, στοχεύοντας αυτή τη φορά σε χρωμοσωμικά γονίδια. Αυτά ήταν η β-ακτίνη για το βόειο και το χοιρινό κρέας, ο υποδοχέας της προλακτίνης για το πρόβειο κρέας και ο υποδοχέας αυξητικής ορμόνης για το αλογίσιο κρέας. Εκτεταμένη βιβλιογραφική μελέτη σχετικά έχει δημοσιευτεί από τους Fajardo et al. (2010). 4. ΕΠΙΛΟΓΟΣ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Από την υπάρχουσα βιβλιογραφία προκύπτει ένας σεβαστός αριθμός PCR εκκινητών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση του είδους του κρέατος σε νωπά και επεξεργασμένα προϊόντα, αναδεικνύοντας την PCR σαν την «χρυσή» μέθοδο επιλογής. Αυτό ενισχύεται και από το γεγονός ότι τα προϊόντα της PCR μπορούν να αναλυθούν και να ανιχνευτούν με αρκετούς συνδυασμούς αναλυτικών συστημάτων που απευθύνονται τόσο σε υπερεξοπλισμένα αναλυτικά εργαστήρια μοριακής βιολογίας όσο και σε σχετικά μικρά εργαστήρια χαμηλού κόστους. Έτσι, ένα εργαστήριο μοριακής βιολογίας, μπορεί να επιλέξει μια τέτοια αναλυτική προσέγγιση που να είναι ανάλογη του εξοπλισμού και του ανθρώπινου δυναμικού που διαθέτει. Για παράδειγμα, το προϊόν μιας PCR-RFLP προσέγγισης είτε μπορεί να διαχωριστεί με μια ηλεκτροφόριση σε πηκτή αγαρόζης και να αναλυθεί με τον πιο απλό σκοτεινό UV θάλαμο, είτε να διαχωριστεί και να αναλυθεί σε σύστημα τριχοειδούς ηλεκτροφόρισης. Η ανάλυση σε ένα τέτοιο σύστημα μπορεί να προχωρήσει και με άλλες τεχνικές που ενισχύουν την αρχική προσέγγιση, όπως είναι οι τεχνικές ανάλυσης πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (SNPs Single Nucleotide Polymorphisms) σε συνδυασμό και με την ανάλυση του μήκους του προϊόντος της PCR πριν την πέψη της με περιοριστικά ένζυμα (Spaniolas et al., 2010). Ιδιαίτερα οι τεχνικές ανάλυσης των πολυμορφισμών SNPs δίνουν έναν ιδιαίτερα μεγάλο αριθμό επιλογών στο αναλυτικό εργαστήριο (Syvanen, 2001). Πέρα των ήδη δημοσιευμένων αναλυτικών πρωτοκόλλων και δεδομένου του πλήθους των διαθέσιμων εργαλείων βιοπληροφορικής και βιολογικών δεδομένων (γονιδιακές αλληλουχίες οργανισμών κλπ) διάφορων ηλεκτρονικών βάσεων δεδομένων όπως αυτή του NCBI (National Center for Biotechnology Information), θεωρούμε ότι ο in silico σχεδιασμός μιας DNA αναλυτικής προσέγγισης για την διάκριση οργανισμών σε επίπεδο είδους είναι σχετικά εύκολος και τα Σελίδα 4 από 6
προσδοκώμενα αποτελέσματα, στις περισσότερες των περιπτώσεων, επαληθεύονται επιτυχώς στο εργαστήριο. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ BELLAGAMBA, F., V. M. MORETTI, S. COMINCINI AND F. VALFRE (2001). "Identification of species in animal feedstuffs by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis of mitochondrial DNA." Journal of Agricultural and Food Chemistry 49(8):3775-3781. BOORE, J. L., J. R. MACEY AND M. MEDINA (2005). Sequencing and comparing whole mitochondrial genomes of animals. In: Molecular Evolution: Producing The Biochemical Data, Part B. (Eds. E. A. Zimmer and E. Roalson), Methods in Enzymology volume 395, Elsevier, Massachusetts, pp. 311-348. BREZNA, B., L. HUDECOVA AND T. KUCHTA (2006). "A novel real-time polymerase chain reaction (PCR) method for the detection of walnuts in food." European Food Research and Technology 223(3):373-377. CSAIKL, U. M., H. BASTIAN, R. BRETTSCHNEIDER, S. GAUCH, A. MEIR, M. SCHAUERTE, F. SCHOLZ, C. SPERISEN, B. VORNAM AND B. ZIEGENHAGEN (1998). "Comparative analysis of different DNA extraction protocols: A fast, universal maxi-preparation of high quality plant DNA for genetic evaluation and phylogenetic studies." Plant Molecular Biology Reporter 16(1):69-86. FAJARDO, V., I. GONZALEZ, I. LOPEZ-CALLEJA, I. MARTIN, P. E. HERNANDEZ, T. GARCIA AND R. MARTIN (2006). "PCR-RFLP authentication of meats from red deer (Cervus elaphus), fallow deer (Dama dama), roe deer (Capreolus capreolus), cattle (Bos taurus), sheep (Ovis aries), and goat (Capra hircus). " Journal of Agricultural and Food Chemistry 54(4):1144-1150. FAJARDO, V., I. GONZALEZ, M. ROJAS, T. GARCIA AND R. MARTIN (2010) "A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species" Trends in Food Science & Technology 21: 408-421. KESMEN, Z., A. GULLUCE, F. SAHIN AND H. YETIM (2009) "Identification of meat species by TaqMan-based real-time PCR assay" Meat Science 82: 444-449. KOPPEL, R., J., RUF AND J. RENTSCH (2011). "Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef, pork, horse and sheep" European Food Research and Technology 232:151-155. Σελίδα 5 από 6
LOCKLEY, A. K. AND R. G. BARDSLEY (2000a). "DNA-based methods for food authentication." Trends in Food Science & Technology 11(2):67-77. MAEDE, D. (2006). "A strategy for molecular species detection in meat and meat products by PCR-RFLP and DNA sequencing using mitochondrial and chromosomal genetic sequences." European Food Research and Technology 224(2):209-217. MARTIN I., T. GARCIA, V. FAJARDO, M. ROJAS, P.E. HERNANDEZ, I. GONZALEZ AND R. MARTIN (2009) "Detection of horse DNA in food and feedstuffs using a polymerase chain reaction assay" Journal of Science of Food and Agriculture 89: 1202-1206. MEYER, R. (1999). "Development and application of DNA analytical methods for the detection of GMOs in food." Food Control 10(6):391-399. PETER, C., C. BRUNEN-NIEWELER, K. CAMMANN AND T. BORCHERS (2004). "Differentiation of animal species in food by oligonucleotide microarray hybridization." European Food Research and Technology 219(3):286-293. ZIMMERMANN, A., J. LUTHY AND U. PAULI (1998). "Quantitative and qualitative evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean food samples." Zeitschrift Fur Lebensmittel-Untersuchung Und-Forschung a-food Research and Technology 207(2):81-90. SPANIOLAS S., M. TSACHAKI, M.J. BENNETT AND G.A. TUCKER (2008) "Evaluation of DNA extraction methods from green and roasted coffee beans" Food Control 19(3):257-262. SPANIOLAS S., C. BAZAKOS, T. SPANO, C. ZOGHBY AND P. KALAITZIS (2010) "The potential of plastid trnl (UAA) intron polymorphisms for the identification of the botanical origin of plant oils" Food Chemitry 122(3):850-856. SUN, Y. L. AND C. S. LIN (2003). "Establishment and application of a fluorescent polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method for identifying porcine, caprine, and bovine meats." Journal of Agricultural and Food Chemistry 51(7):1771-1776. SYVANEN, A. C. (2001). "Accessing genetic variation: Genotyping single nucleotide polymorphisms." Nature Reviews Genetics 2(12):930-942. Σελίδα 6 από 6