ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ "ΚΛΙΝΙΚΕΣ - ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ"

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ "ΚΛΙΝΙΚΕΣ - ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ" ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Κ. ΖΟΥΜΠΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΣΥΜΒΟΛΗΣ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ HEAT SHOCK PROTEINS ΣΤΗ ΜΗ ΑΠΟΔΟΤΙΚΗ ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΜΥΕΛΟΔΥΣΠΛΑΣΤΙΚΟΥ ΣΥΝΔΡΟΜΟΥ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΠΡΟΟΔΟ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΜΙΧΑΛΟΠΟΥΛΟΥ Μ. ΣΩΤΗΡΙΑ ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2006 i

ii

ΜΕΛΗ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Νικόλαος Κ. Ζούμπος, Καθηγητής Παθολογίας - Αιματολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών επιβλέπων καθηγητής Ματσουκά Παναγιώτα, Αναπλ. Καθηγήτρια Παθολογίας - Αιματολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών μέλος Μουζάκη Αθανασία, Αναπλ. Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας - Αιμοδοσίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών μέλος ΜΕΛΗ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Νικόλαος Κ. Ζούμπος, Καθηγητής Παθολογίας - Αιματολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Ματσουκά Παναγιώτα, Αναπλ. Καθηγήτρια Παθολογίας - Αιματολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Μουζάκη Αθανασία, Αναπλ. Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας - Αιμοδοσίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Καρακάντζα Μαρίνα, Επίκ. Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας - Αιμοδοσίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Σπυριδωνίδης Αλέξανδρος, Επίκ. Καθηγητής Αιματολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Αντωνόπουλος Ανδρέας, Καθηγητής Παθολογίας - Ρευματολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Μοσχονάς Νικόλαος, Καθηγητής Βιολογίας - Μοριακής Γενετικής Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών iii

iv

Στο Στέλιο,στην Κατερίνα μας και στους γονείς μου με αγάπη v

vi

"Όσο ζούμε μιαν ευτυχία, δύσκολα τη νιώθουμε μονάχα όταν περάσει και κοιτάξουμε πίσω μας καταλαβαίνουμε ξαφνικά - και κάποτε με κατάπληξη- πόσο σταθήκαμε ευτυχισμένοι... " Ν. Καζαντζάκης "Men love to wonder, and that is the seed of science." Ralph Waldo Emerson "The most beautiful thing we can experience is the mysterious. It is the source of all true art and science." Albert Einstein "The scientist is not a person who gives the right answers; he's one who asks the right questions" Claude Lévi-Strauss "...η ζωή ετούτη είναι μοναδική για τον κάθε άνθρωπο, άλλη δεν έχει, ό,τι μπορείς να το χαρείς, εδώ θα το χαρείς, περνάει γρήγορα και δεν θα σου ξαναδοθεί, στην αιωνιότητα, άλλη ευκαιρία..." Ν. Καζαντζάκης vii

viii

Περιεχόμενα: Ευχαριστίες... 1 Πρόλογος... 5 σελ. I. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο... 9 1.1 Γενικά για το ΜΔΣ... 9 1.2 Δευτεροπαθή ή σχετιζόμενα με θεραπεία ΜΔΣ και λευχαιμία... 10 1.3 Κλινικές εκδηλώσεις ΜΔΣ... 12 1.4 Ταξινόμηση ΜΔΣ... 15 1.5 Παθογένεια ΜΔΣ... 19 2. Απόπτωση... 24 2.1 Κυτταρικός θάνατος: Ορισμοί-χαρακτηριστικά... 24 2.2 Μορφολογικές μεταβολές της απόπτωσης... 26 2.3 Βιοχημικές μεταβολές της απόπτωσης... 27 2.4 Μιτοχόνδρια... 30 2.5 Μεταβολές της κυτταρικής μεμβράνης... 34 2.6 Κυτταρικοί Υποδοχείς θανάτου και συνδέτες θανάτου... 35 2.7 Απόπτωση στην Αιματολογία... 40 3. Απόπτωση στο ΜΔΣ... 41 3.1 Γενικά... 41 3.2 Απόπτωση και παθογενετικός ρόλος στο ΜΔΣ... 43 3.3 Απόπτωση, προγονικά κύτταρα, κλωνογόνος ικανότητα... 43 3.4 Απόπτωση / πολλαπλασιασμός... 44 3.5 Απόπτωση στο ΜΔΣ: αφορά τα φυσιολογικά κύτταρα ή τα κύτταρα κλώνου;... 45 3.6 Μοριακή παθογένεια της απόπτωσης στο ΜΔΣ... 48 4. Heat Shock Proteins... 53 4.1 Γενικά... 53 4.2 Εισαγωγή στις Hsp70 και Hsp27... 57 4.3 Hsps: ρύθμιση έκφρασης... 58 i

4.4 Hsps, κυτταροπροστασία και απόπτωση... 62 4.5 Hsps, κυτταρικός κύκλος, διαφοροποίηση και κυτταρικός πολλαπλασιασμός... 68 4.6 Hsps και καρκινογένεση... 68 4.7 Hsps και αιματολογικές κακοήθειες... 71 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ.... 73 II. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Ασθενείς και μέθοδοι... 77 1.1 Ασθενείς και δότες φυσιολογικού μυελού... 79 1.2 Αντιδραστήρια και Αντισώματα... 79 1.3 Απομόνωση Μονοπύρηνων Κυττάρων Μυελού (BMMC)... 84 1.4 Εφαρμογή Θερμικού Shock (Heat Shock HS-) και προ-αποπτωτικής διέγερσης... 85 1.5 Ανίχνευση της απόπτωσης... 86 1.6 Προσδιορισμός Μιτοχονδρακού Διαμεμβρανικού Δυναμικού [ΔΨm]... 87 1.7 Έλεγχος κλωνογόνου ικανότητος αποπτωτικών και μη αποπτωτικών προγονικών CD34 + κυττάρων μυελού... 89 1.8 Προσδιορισμός ενδοκυττάριας έκφρασης Hsps... 90 1.9 Προσδιορισμός έκφρασης Hsp 72 επιφανείας.... 92 1.10 Στατιστική Ανάλυση... 92 2. Αποτελέσματα... 93 2.1 Απόπτωση σε φρέσκα δείγματα μυελού.... 95 2.2 Ανάλυση της απόπτωσης έπειτα από 24ωρη υγρή καλλιέργεια.... 99 2.3 Κλωνογόνος ικανότητα προγονικών κυττάρων... 100 2.4 Βασική ενδοκυττάρια έκφραση Hsps στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ... 102 2.5 Επαγωγή της έκφρασης των Hsps από την εφαρμογή θερμικού shock... 106 2.6 Συνδυασμένη επίδραση TNF-α+ IFN-γ στην έκφραση των Hsps... 108 2.7 Έντονη επαγωγή της έκφρασης των Hsps 72 και 27 απο συνδυασμένη επίδραση TNF-α+ IFN-γ σε ασθενή με RAEB-t στη φάση της λευχαιμικής εκτροπής... 108 2.8 Έκφραση και επαγωγή των Hsps σχετιζόμενη με την ηλικία... 118 ii

2.9 Έκφραση επιφανείας Hsp72.... 112 2.10 Συσχέτιση μεταξύ έκφρασης των Hsps και αυτόματης ή επαγόμενης απόπτωσης... 112 3. Συζήτηση.... 115 3.1 Απόπτωση στο ΜΔΣ... 117 3.1.1 Η σημασία της επιλογής της τεχνικής... 117 3.1.2 Αυτόματη Απόπτωση στο μυελό των ασθενών με ΜΔΣ.... 119 3.1.3 Προσδιοριζόμενη Απόπτωση και πραγματικός κυτταρικός θάνατος... 121 3.1.4 Συσχέτιση της απόπτωσης με την κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών μυελοδυσπλαστικών κυττάρων... 123 3.2 Heat Shock Proteins στο ΜΔΣ... 125 3.2.1 Η επιλογή της τεχνικής... 126 3.2.2 Ενδοκυττάρια έκφραση των Hsps στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ... 126 3.2.3 Hsps και πρόοδος της νόσου... 128 3.2.4 Hsps και κυτταροκίνες.... 129 3.2.5 Hsps και απόπτωση... 130 3.2.6 Hsps και γήρανση... 131 4. Συμπεράσματα... 133 Περίληψη... 137 Summary... 141 Συντομογραφίες... 145 Βιβλιογραφία.... 151 Δημοσιεύσεις... 169 iii

Ευχαριστίες: Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο του Αιματολογικού Τμήματος του Παθολογικού Τομέα της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Γράφοντας αυτές τις "τυπικές" για μια διατριβή σελίδες στο νου μου έρχονται εικόνες και συναισθήματα πολύ έντονα, όπως ο ενθουσιασμός της αρχικής ανάθεσης, η γνωριμία με το εργαστήριο, οι περιπέτειες των πειραμάτων, η διαρκής προσπάθεια, οι αντιξοότητες, οι αγωνίες, η ικανοποίηση για το πρώτο αποτέλεσμα, οι απογοητεύσεις, οι επιτυχίες. Μέσα από τη διαδρομή αυτή διδάχθηκα πολλά όχι μόνο σε επιστημονικό, αλλά και σε προσωπικό επίπεδο διευρύνοντας τους ορίζοντές μου σε διάφορους τομείς. Έτσι, πέρα από το τυπικό, έχοντας πλέον κλείσει αυτόν τον κύκλο, νιώθω πραγματικά την ανάγκη να ευχαριστήσω ιδιαίτερα κάποιους ανθρώπους που μου έδωσαν την δυνατότητα να ξεκινήσω αυτή την ερευνητική εργασία, με στήριξαν κατά τη διάρκειά της και με βοήθησαν να τη φέρω εις πέρας. Τον καθηγητή μου Νικόλαο Ζούμπο που μου έδωσε την ευκαιρία να πραγματοποιήσω αυτή τη διαδρομή. Τον ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντάς μου ένα θέμα που γνωρίζω ότι αγαπά ιδιαίτερα, για την προσπάθειά του να είναι παρών σε όλες τις περιστάσεις παρά τον εξαιρετικό φόρτο εργασίας του σε Νοσοκομείο και Πρυτανεία, για την προσανατολισμένη καθοδήγηση κατά την εξέλιξη των πειραμάτων, την εποικοδομητική κριτική και τη συνετή επιβράβευση. Κυρίως, όμως, εκτιμώ την ελευθερία που μου παρείχε στη διαχείριση του θέματος, που δημιουργούσε μεν άγχος και ευθύνη, συνέβαλλε όμως καθοριστικά στην ανάπτυξη υπευθυνότητας, πρωτοβουλίας και ώριμης ερευνητικής σκέψης, ίσως από τα πιο σημαντικά προσωπικά κέρδη. Τέλος, τον ευχαριστώ ιδιαίτερα για τη στήριξη και την ενθάρρυνση που μου προσέφερε στις δύσκολες στιγμές αυτής της πορείας, οι οποίες δεν ήταν λίγες ούτε ασήμαντες. Την καθηγήτρια Αντιγόνη Ζαχαροπούλου την οποία ευγνωμονώ που με μύησε στην έρευνα, με παρότρυνε στην ενασχόληση με το εργαστήριο και με εμπιστεύτηκε εξ'αρχής όσο λίγοι άνθρωποι έως τώρα. Δεν ξεχνώ την αμέριστη συμπαράσταση, τις φιλικές κουβέντες και τις πολύτιμες συμβουλές της που με βοήθησαν να κατανοήσω και να αντιμετωπίσω αναλόγως πολλές περιστάσεις στην πορεία. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας - Αιμοδοσίας Αθανασία Μουζάκη. Την ευχαριστώ θερμά για το ειλικρινές ενδιαφέρον, την ουσιαστική της επιστημονική συνεισφορά καθώς και για και τα "μαθήματα" συγγραφής επιστημονικών άρθρων, εις βάρος του ήδη αρκετά φορτωμένου προγράμματός της και πάντοτε πρόθυμα. 1

Κυρίως, όμως, δεν θα ξεχάσω την υποστήριξη και βοήθειά της σε μια περίσταση που φάνταζε αδιέξοδη. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Αιματολογίας Παναγιώτα Ματσουκά που ήταν πάντοτε πρόθυμη για εποικοδομητική συζήτηση σε οικείο κλίμα για τα εκάστοτε ευρήματα ή ανακύπτοντα προβλήματα, καταθέτοντας την επιστημονική της άποψη και τεκμηριώνοντάς την αναλόγως με τη σχετική βιβλιογραφία. Την Επίκουρη Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας - Αιμοδοσίας Μαρίνα Καρακάντζα για την εκπαίδευση και ουσιαστική καθοδήγηση κατά τα πρώτα μου βήματα στην Κυτταρομετρία Ροής, καθώς και για την παραγωγική και ιδιαίτερα ευχάριστη μετέπειτα συνεργασία. Με την εξαιρετική εμπειρία της, συνέβαλλε ουσιαστικά στην ανάπτυξη τεχνικών και πρωτοκόλλων που αποτέλεσαν τη βάση για την περαιτέρω πραγματοποίηση των πειραμάτων. Την αληθινή φίλη και συνερευνήτρια Ηλίνα Μίτσεβα για την ωραία μας συνεργασία, για τις αγωνίες, τις αναζητήσεις, τις απογοητεύσεις και τις επιτυχίες που ζήσαμε μαζί. Την ευχαριστώ ιδιαίτερα για την πολύτιμη βοήθεια που προσέφερε στο σχεδιασμό και την πραγματοποίηση των πειραμάτων με τη χρήση του FACSorter, αλλά και στην ερμηνεία και ανάλυση των αποτελεσμάτων. Όλους τους ιατρούς, βιολόγους και τεχνικούς του εργαστηρίου Αιματολογίας Αναστασία Γαλάνη, Θεοδώρα Κακαγιάννη, Ελένη Θανοπούλου, Ελένη Λαγκαδινού, Όλγα Τσοπρά, Ειρήνη Παπαπέτρου, Γεωργία Χατζή για την εκπαίδευση στις τεχνικές, την καλή συνεργασία και το δημιουργικό και ευχάριστο κλίμα. Όλους τους ιατρούς του Αιματολογικού Τμήματος της Παθολογικής Κλινικής του ΠΠΓΝΠ για την εξασφάλιση των δειγμάτων μυελού των ασθενών καθώς και των απαραίτητων κλινικών πληροφοριών. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αλεξάνδρα Κουράκλη-Συμεωνίδη πέρα από την προσπάθειά της για προσφορά ικανού αριθμού δειγμάτων μυελού ασθενών και μαρτύρων, για την ουσιαστική υποστήριξη και βοήθεια που παρείχε σε επιστημονικό αλλά και σε προσωπικό επίπεδο. Επίσης, ευχαριστώ τον Αργύρη Συμεωνίδη για την επιπλέον σημαντική βοήθεια που προσέφερε στην πρόσβαση σε πληροφορίες φακέλων των ασθενών. Τη γραμματέα του τμήματος Ελισάβετ Σκλίβα για την πάντοτε πρόθυμη και ικανή γραμματειακή και μη υποστήριξη. Κλείνοντας, θα ήθελα να αφιερώσω αυτή την προσπάθεια στο σύζυγό μου Στέλιο που έχει σταθεί δίπλα μου με ανεξάντλητη υπομονή και αγάπη στηρίζοντάς με σε όλα τα βήματα 2

της φοιτητικής, επαγγελματικής και προσωπικής μας ζωής, συνοδοιπόρος και σύντροφος στα απλά και τα δύσκολα, στις χαρές και τις απογοητεύσεις. Επίσης, στην λατρεμένη μου κόρη Κατερίνα που με γέμισε χαρά, αισιοδοξία και δύναμη να φθάσω ως το τέλος. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στους γονείς μου Μιχάλη και Ανδριάνα για την χωρίς ανταλλάγματα αφοσίωση και αγάπη τους, για τα εφόδια που πάσχισαν να μου εξασφαλίσουν, αλλά και για την πολύτιμη ηθική και ουσιαστική συμπαράστασή τους όλα τα χρόνια της ζωής μου. 3

4

Πρόλογος: Το Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο (ΜΔΣ) αποτελεί μια ετερογενή ομάδα κλωνικών αιματολογικών διαταραχών που προσβάλλει ως επί το πλείστον ηλικιωμένους. Κοινά χαρακτηριστικά των νοσημάτων αυτών αποτελούν η μη αποδοτική αιμοποίηση που εκδηλώνεται με δυσπλασίες των αιμοποιητικών κυττάρων και ανθεκτικές κυτταροπενίες στην περιφέρεια και ο υψηλός κίνδυνος εκτροπής προς οξεία λευχαιμία. Παρά την εντατική έρευνα που λαμβάνει χώρα τα τελευταία χρόνια στον τομέα της Αιματολογίας, εντούτοις η παθογένεια της μη αποδοτικής αιμοποίησης στο ΜΔΣ παραμένει αδιευκρίνιστη. Πρόκειται για νόσο που θεωρείται ότι εξορμάται από τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα των οποίων η απομόνωση και μελέτη είναι εξαιρετικά δυσχερής. Η αυξημένη απόπτωση προγονικών και ώριμων αιμοποιητικών κυττάρων που έχει αναδειχθεί στο μυελό των ασθενών με ΜΔΣ από πληθώρα μελετών έχει θεωρηθεί υπεύθυνη για το "παράδοξο" της συνύπαρξης πληθωρικού μυελού και κυτταροπενιών στην περιφέρεια. Εν τούτοις, πολλά ερωτηματικά έχουν ανακύψει σχετικά με το ρόλο της ανιχνευόμενης απόπτωσης στην παθογένεια του συνδρόμου. Εξαιρετική ετερογένεια παρατηρείται μεταξύ των διαφόρων πειραματικών δεδομένων ως προς το βαθμό της απόπτωσης στο δυσπλαστικό μυελό, ενώ δεν είναι καθόλου σπάνιες οι περιπτώσεις ασθενών όπου δεν ανιχνεύεται απόπτωση στο μυελό τους. Αντικρουόμενες, δε, είναι οι απόψεις των ερευνητών, με βάση τα πειραματικά δεδομένα, σχετικά με τον τύπο των κυττάρων που κατεξοχήν υπόκεινται σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Έτσι, ενώ η συμμετοχή των ώριμων αιμοποιητικών κυττάρων στην αποπτωτική διαδικασία θεωρείται αδιαμφισβήτητη, τα δεδομένα σχετικά με την ροπή προς απόπτωση των προγονικών κυττάρων του μυελού είναι αντικρουόμενα. Επιπλέον, ακόμη και στις περιπτώσεις εκείνες όπου η απόπτωση αφορά και τα προγονικά κύτταρα, από τα υπάρχοντα ερευνητικά δεδομένα δεν τεκμηριώνεται επαρκώς αιτιοπαθογενετική συσχέτιση με την ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα που θεωρείται η αιτία των κυτταροπενιών στο ΜΔΣ. Συνεπώς, η σημασία της παρουσίας αυξημένης απόπτωσης στο μυελό των ασθενών με ΜΔΣ και η συμβολή της στη μη αποδοτική αιμοποίηση του συνδρόμου μένει να διερευνηθεί. Η εξάπλωση του νεοπλασματικού κυτταρικού κλώνου που εκδηλώνει ανθεκτικότητα στην απόπτωση, εμφανίζοντας πλεονέκτημα επιβίωσης εις βάρος των φυσιολογικών αιμοποιητικών κυττάρων σε ένα προ-αποπτωτικό μικροπεριβάλλον μυελού οδηγεί στην πρόοδο του πρώιμου σε προχωρημένου τύπου ΜΔΣ και, συχνά, στην περαιτέρω εκτροπή της 5

νόσου προς οξεία λευχαιμία. Η κατάργηση των ρυθμιστικών μηχανισμών του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου στα νεοπλασματικά κύτταρα με αποτέλεσμα την ελαχιστοποίηση της απόπτωσης αλλά και την εκδήλωση ανθεκτικότητας στην επαγωγή της είναι ο προτεινόμενος μηχανισμός που υποστηρίζει την πρόοδο της νόσου. 'Έχει προταθεί ότι η αυξημένη έκφραση αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών όπως οι Bcl-2, Bcl-xL, IAPs, survivin συμμετέχει στην ανάπτυξη της αντίστασης στην απόπτωση στο προχωρημένο ΜΔΣ. Οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί, πάντως, που ευθύνονται για τη λευχαιμική εξέλιξη του συνδρόμου παραμένουν ασαφείς. Οι Heat Shock Proteins, πρωτεΐνες με ισχυρές αντι-αποπτωτικές και κυτταροπροστατευτικές ιδιότητες, έχει δειχθεί να υπερεκφράζονται σε αρκετά είδη συμπαγών όγκων αλλά και αιματολογικών κακοηθειών. Η υπερέκφραση των Hsps στα κακοήθη κύτταρα δεν είναι απλά επακόλουθο της διαδικασίας ογκογένεσης, αφού έχει δειχθεί ότι έχει αιτιοπαθογενετική σημασία. Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν, μάλιστα, χαρακτηρισθεί ως η αχίλλειος πτέρνα του καρκίνου και αποτελούν σύγχρονους μοριακούς στόχους για την πειραματική θεραπεία του. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η εκτίμηση της απόπτωσης στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ και η περαιτέρω διερεύνηση της ουσιαστικής συνεισφοράς του φαινομένου στην ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών κυττάρων και, κατ' επέκταση, στη μη αποδοτική αιμοποίηση που χαρακτηρίζει το σύνδρομο. Επιπλέον θελήσαμε να διερευνήσουμε την έκφραση των αντι-αποπτωτικών Heat Shock Proteins σε ένα νεοπλασματικό νόσημα όπως το ΜΔΣ και να προσδιορίσουμε τη συμβολή τους στις μεταβολές της απόπτωσης, στην πρόοδο της νόσου και στη λευχαιμική εκτροπή. 6

Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

8

Εισαγωγή 1. Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο 1.1 Γενικά για το ΜΔΣ Το Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο (ΜΔΣ) αποτελεί μια ετερογενή ομάδα κλωνικών διαταραχών της αιμοποίησης που αφορούν το αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο. Κοινό χαρακτηριστικό των νοσημάτων αυτών είναι η μη αποδοτική αιμοποίηση που οδηγεί σε ανθεκτική πενία της ερυθράς ή και περισσότερων (έως και όλων των) αιμοποιητικών σειρών. Τελικά, το αποτέλεσμα είναι μια παράδοξη συνύπαρξη ενός πληθωρικού ή νορμοκυτταρικού μυελού των οστών (σπάνια υποπλαστικού, και τότε πρόκειται για ξεχωριστή οντότητα: υποπλαστικό ΜΔΣ ) και κυτταροπενιών στην περιφέρεια. Το ΜΔΣ είναι δυνατό να οριστεί διττά: κλινικά, ως σύνδρομο μυελικής ανεπάρκειας (μη αποδοτική αιμοποίηση) με υψηλό κίνδυνο (~30%) εκτροπής σε Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία (ΟΜΛ) [στο παρελθόν έχει χαρακτηριστεί ως προλευχαιμία ], είτε ιστοπαθολογικά, ως δυσπλασία συμπεριλαμβάνοντας όλες τις μορφολογικές ανωμαλίες που επιδεικνύουν τα κύτταρα του μυελού αλλά και του περιφερικού αίματος των ασθενών αυτών. Το ΜΔΣ αποτελεί, ως επί το πλείστον, νόσο των ηλικιωμένων (συνήθης ηλικία εμφάνισης >60 έτη και μέσος όρος ηλικίας εμφάνισης τα 65 έτη), παρατήρηση που έχει διαμορφώσει την υπόθεση περί συμμετοχής της διαδικασίας της γήρανσης στην παθογένεση της νόσου. Πρόκειται για νόσημα με πολυπαραγοντική και αδιευκρίνιστη έως τώρα παθογένεια, που παραμένει υπό εντατική έρευνα, αλλά και εξαιρετική ετερογένεια ως προς τις εκδηλώσεις, την πορεία και πρόγνωση των ασθενών, καθώς και την ανταπόκρισή τους στις διάφορες θεραπευτικές παρεμβάσεις. Χαρακτηρίζεται από υψηλή νοσηρότητα και θνητότητα, ενώ η "φυσική ιστορία" της νόσου ποικίλει από χρόνια και ήπια, έως ραγδαία εξελισσόμενη προς λευχαιμία. Υπάρχουν δύο τύποι ΜΔΣ: Πρωτογενές Δευτεροπαθές 9

Εισαγωγή 1.2 Δευτεροπαθή ή σχετιζόμενα με θεραπεία ΜΔΣ και λευχαιμία (t- MDS/AML) Πρόκειται για διαταραχές που αφορούν ασθενείς με ιστορικό περιβαλλοντικής, επαγγελματικής ή θεραπευτικής έκθεσης σε τοξικό παράγοντα ή περιπτώσεις ΜΔΣ/ΟΛ με συγκεκριμένες κυτταρογενετικές ή μοριακές διαταραχές και υπαρκτό προδιαθεσικό παράγοντα. Έως σήμερα έχουν πρωτίστως ενοχοποιηθεί: κυτταροτοξικά φάρμακα, κυρίως αλκυλιούντες παράγοντες (συσχέτιση με ελλείψεις των χρωμοσωμάτων 5 & 7) και αναστολείς της Τοποϊσομεράσης ΙΙ (συσχέτιση με τις μεταθέσεις 11q23 21q22). έκθεση σε χημικά, όπως η βενζίνη και το αρσενικό. το κάπνισμα. φάρμακα όπως η χλωραμφαινικόλη και η φαινυλβουταζόνη. η έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία. η ανοσοκαταστολή. Άλλα χαρακτηριστικά των ασθενών της κατηγορίας αυτής αποτελούν: η προχωρημένη ηλικία η συχνή έκφραση του MDR γονιδίου, και η εκδήλωση χημειοανθεκτικότητος με πτωχή απόκριση στη θεραπεία και πτωχή πρόγνωση [1]. Η παρούσα εργασία ασχολείται αποκλειστικά με τη μελέτη του πρωτοπαθούς ΜΔΣ. 10

Εισαγωγή Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο Παράδοξο: Υπερκυτταρικός Μυελός των Οστών??? Κυτταροπενίες περιφερικού αίματος 11

Εισαγωγή 1.3 Κλινικές εκδηλώσεις ΜΔΣ Οι ασθενείς με ΜΔΣ συνήθως δεν εκδηλώνουν τυπική συμπτωματολογία ή σημειολογία που οδηγεί στη διάγνωση, εκτός ίσως από εκείνους που πάσχουν από CMML όπου η ηπατομεγαλία, η σπληνομεγαλία, η υπερτροφία των ούλων αλλά και η ανάπτυξη στείρων συλλογών στους ορογόνους (περικάρδιο, υπεζωκότας, περιτόναιο) έχουν συχνά περιγραφεί [2]. Γενικά, λοιπόν, οι ασθενείς με ΜΔΣ παραμένουν ασυμπτωματικοί, με την υποψία της νόσου συνήθως να τίθεται από ένα τυχαίο αιμοδιάγραμμα όπου διαπιστώνεται κυτταροπενία μιας ή περισσότερων σειρών, με τυπικότερο εύρημα την αναιμία. Τα συνήθη κλινικοεργαστηριακά ευρήματα είναι: Ανθεκτική αναιμία. Η αναιμία στο ΜΔΣ εγκαθίσταται βραδέως προκαλώντας αμβληχρά συμπτωματολογία, όπως εύκολη κόπωση. Η αναιμία στο ΜΔΣ έχει αποδοθεί στην παθολογική κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, ενώ έχει συσχετισθεί με την αυξημένη απόπτωση των προγονικών κυττάρων της ερυθράς σειράς. Μελέτες, μάλιστα, έχουν αναδείξει το ρόλο του Fas [3,4] και των μιτοχονδρίων, ενώ τα αυξημένα επίπεδα TNFα που περιγράφονται στο μυελό και το περιφερικό αίμα των ασθενών με ΜΔΣ έχουν συσχετισθεί με το βαθμό της αναιμίας [5]. Ερυθροποιητίνη μεμονωμένα ή σε συνδυασμό με G-CSF χορηγείται θεραπευτικά στους ασθενείς αυτούς, με μερική ανταπόκριση [6,7]. Συχνές και σοβαρές λοιμώξεις, αποστήματα, συχνά απουσία πυρετού. Οι λοιμώξεις στους ασθενείς με ΜΔΣ έχουν ποικίλη αιτιολογία: - ουδετεροπενία - δυσλειτουργία ουδετερόφιλων η οποία συμπεριλαμβάνει: μειωμένη ικανότητα προσκόλλησης, ανεπαρκή χημειοτακτική ικανότητα, μειωμένη περιεκτικότητα σε ένζυμα, υπολειπόμενη φαγοκυτταρική και μικροβιοκτόνο ικανότητα, ανεπαρκή ενεργοποίηση πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης από τον GM-CSF που έχει συσχετισθεί με μειωμένη έκφραση του υποδοχέα του G-CSF στην επιφάνεια των ουδετερόφιλων, πτωχή φλεγμονώδη απόκριση του μυελού σε ενδεχόμενη λοίμωξη και ανεπαρκή παραγωγή HGFs [8-10]. - δυσλειτουργία ΝΚ-κυττάρων: έχει δειχθεί ότι τα ΝΚ-κύτταρα στο ΜΔΣ είναι ποσοτικά ανεπαρκή και λειτουργικά ανώριμα, ενώ έχει περιγραφεί και διαταραχή στην ικανότητα παραγωγής IFN. - δυσλειτουργία μονοκυττάρων: έχει δειχθεί ότι τα μονοκύτταρα προέρχονται 12

Εισαγωγή από τον δυσπλαστικό κλώνο, διαθέτουν μειωμένη ικανότητα φαγοκυττάρωσης καθώς και γενικά παθολογική λειτουργικότητα. - αριθμητικές και ποιοτικές διαταραχές των δενδριτικών κυττάρων: σε αντιστοιχία με την ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, μελέτες έχουν δείξει την ανεπαρκή παραγωγή δενδριτικών κυττάρων από CD34 + κύτταρα in vitro, καθώς και την παθολογική γένεση αυτών από CD14 + κύτταρα και την ανεπαρκή τους ωρίμανση σε καλλιέργειες [11,12]. Αιμορραγικές εκδηλώσεις. Η αιτιολογία των αιμορραγικών εκδηλώσεων στο ΜΔΣ είναι πολυδιάστατη: θρομβοπενία, ποιοτικές διαταραχές αιμοπεταλίων, μειωμένη ικανότητα συσσώρευσης αιμοπεταλίων [13]. Αιμοχρωμάτωση. Οι πολλαπλές μεταγγίσεις και μια αναφερόμενη διαταραχή στο μεταβολισμό του σιδήρου οδηγούν συχνά στην ανάπτυξη αιμοχρωμάτωσης στους ασθενείς με ΜΔΣ. Σπληνομεγαλία. Αυτοάνοσες εκδηλώσεις. Πολλαπλές εκδηλώσεις αυτοανοσίας έχουν παρατηρηθεί στους ασθενείς με ΜΔΣ, όπως: αγγειίτιδα, περιφερική νευροπάθεια, χρόνια απομυελινωτική πολυνευροπάθεια, οξεία οροαρνητική αρθρίτιδα, φλεγμονώδης νόσος εντέρου, μυοσίτιδα, γαγγραινώδες πυόδερμα, ιδιοπαθής θρομβοπενία, αιμολυτική αναιμία, σπειραματονεφρίτιδα, νόσος του Addison, υποτροπιάζουσα πολυχονδρίτιδα, συνύπαρξη με κακοήθειες του λεμφικού ιστού (Χρόνια Λεμφογενής Λευχαιμία, Λευχαιμία εκ τριχωτών κυττάρων, πολλαπλούν μυέλωμα, λέμφωμα), συνύπαρξη με Απλαστική Αναιμία, PNH (Παροξυσμική Νυχτερινή Αιμοσφαιρινουρία) & LGL (Large granular lymphocytic leukaemia) [2]. Υψηλότερη επίπτωση κακοήθων όγκων, κυρίως του λεμφικού ιστού. Στην εικόνα 1 παρουσιάζεται και σχηματικά η παθοφυσιολογία του ΜΔΣ. 13

Εισαγωγή Ανθεκτική Αναιμία -Συνήθως ασυμπτωματική -Ζάλη Ουδετεροπενία Σιωπηλά αποστήματα, συχνά απουσία πυρετού Θρομβοπενία Σπληνομεγαλία (10%) Παράταση χρόνου bleeding άτυπων μεγακαρυοκυττάρων Αιμορραγία υσλειτουργία PLTs συσσώρευση PLTs Μη αποδοτική Αιμοποίηση: υπερκυτταρικός μυελός Απώλεια ελέγχου απόπτωσης Μ Σ ΟΜΛ Ανεπαρκής ανοσολογικός περιορισμός Μετανάστευση δυσλειτουργικών GC Λοίμωξη υσλειτουργία κοκκιοκυττάρων υσλειτουργικά μονοκύτταρα Πτωχή μυελική απάντηση στη φλεγμονή Αριθμητικές και ποιοτικές διαταραχές τωνnk και δενδριτικών κυττάρων Αυτοάνοσα Φαινόμενα Αυξημένη επίπτωση κακοήθων όγκων και λεμφωμάτων Εικόνα 1: Παθοφυσιολογία ΜΔΣ 14

Εισαγωγή 1.4 Ταξινόμηση ΜΔΣ Λόγω της εξαιρετικής ετερογένειας του Μυελοδυσπλαστικού συνδρόμου ως προς την κλινικο-εργαστηριακή εμφάνιση αλλά και ως προς την πρόγνωση το νόσημα διαιρείται σε αρκετούς υποτύπους (Πίνακας 1). Η πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενη ταξινόμηση είναι η κατά FAB [French American British Morphology group- 1982] που με βάση μορφολογικά χαρακτηριστικά στο περιφερικό αίμα και στο μυελό (ποσοστό βλαστών, ραβδία του Auer, δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες, ποσοστό μονοκυττάρων στην περιφέρεια) διαχωρίζει πέντε υποτύπους της νόσου: Ανθεκτική Αναιμία (RA) Ανθεκτική Αναιμία με δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες (RARS) Ανθεκτική Αναιμία με περίσσεια βλαστών (RAΕΒ) Ανθεκτική Αναιμία με περίσσεια βλαστών σε εξαλλαγή (RAΕΒ-t) Χρόνια Μυελομονοκυτταρική Λευχαιμία (CMML) Ως πρώιμη νόσος χαρακτηρίζεται το ΜΔΣ τύπου RA και RARS, ενώ ως προχωρημένη νόσος το ΜΔΣ τύπου RAEB και RAEB-t. Το 1999, μια ομάδα της WHO [World Health Organization] πρότεινε μια νέα ταξινόμηση των ΜΔΣ που αναθεωρεί την κατά FAB ταξινόμηση. Σύμφωνα με αυτή, οι κατηγορίες CMML και RAEB-t δεν συμπεριλαμβάνονται πλέον στο κλασσικό ΜΔΣ: η CMML ταξινομήθηκε στη νέα κατηγορία ΜΔΣ/ΜΥΣ (Μυελοδυσπλαστικών/ Μυελοϋπερπλαστικών διαταραχών), ενώ η RAEB-t ανήκει πια στην κατηγορία της ΟΜΛ, αφού η ελάχιστη απαιτούμενη διήθηση του μυελού από βλάστες για την διάγνωση της ΟΛ μειώθηκε από 30% σε 20%. Παρ όλ αυτά, από πολλές ερευνητικές ομάδες αμφισβητείται η επιστημονική ορθότητα της κατάργησης των RAEB-t ως κατηγορίας ΜΔΣ, αφού έχει δειχθεί ότι βιολογικά οι ασθενείς αυτοί αποτελούν ξεχωριστή κατηγορία από αυτούς με οξεία λευχαιμία [14,15]. Επίσης, οι ασθενείς με την κυτταρογενετική ανωμαλία del5q ταξινομήθηκαν σε ιδιαίτερη κατηγορία. Τέλος, δύο νέοι υπότυποι ΜΔΣ διαμορφώθηκαν με το νέο σύστημα ταξινόμησης: Ανθεκτική Αναιμία με δυσπλασία πολλαπλών σειρών (RCMD) και Ανθεκτική Αναιμία με δυσπλασία πολλαπλών σειρών με δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες (RCMD-RS) (Πίνακας 1). Το 1997 αναπτύχθηκε το διεθνές προγνωστικό σύστημα IPSS (International Prognostic Scoring System) για τους ασθενείς με ΜΔΣ. Έπειτα από μελέτη 816 ασθενών με ΜΔΣ δείχθηκε ότι καθοριστικοί παράγοντες για την πορεία της νόσου είναι ο βαθμός διήθησης του μυελού από βλάστες, ο τύπος των κυτταρογενετικών διαταραχών και ο αριθμός των σειρών 15

Εισαγωγή που βρίσκονται σε πενία. Επίσης, η προχωρημένη ηλικία και το άρρεν φύλο φαίνεται ότι επηρεάζουν δυσμενώς την πρόγνωση. Με βάση τους παράγοντες αυτούς το σύστημα βαθμολογεί και κατατάσσει τους ασθενείς σε χαμηλού, ενδιάμεσου και υψηλού κινδύνου ως προς την επιβίωσή τους και ως προς την πιθανότητα εκτροπής της νόσου προς ΟΛ (Πίνακας 2) [16]. Η μέση επιβίωση των ασθενών που κατατάσσονται στην χαμηλού κινδύνου κατηγορία ξεπερνά τα 5 χρόνια, ενώ εκείνων που ανήκουν στην υψηλού κινδύνου είναι μικρότερη των 6 μηνών. Πίνακας 1: Ταξινομήσεις ΜΔΣ FAB RA WHO RA (προσβολή μίας σειράς) 5q σύνδρομο RARS RAEB RCMD RARS (προσβολή μίας σειράς) RCMD (με RS) RAEB-I RAEB-II RAEB-t CMML AML MDS/MPD Αταξινόμητο Συντομογραφίες: ΜΔΣ (MDS), μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο; FAB, French-American-British; WHO, World Health Organization; RA, ανθεκτική αναιμία (refractory anemia); RCMD, ανθεκτική κυτταροπενία με δυσπλασία πολλών σειρών (refractory cytopenia with multilineage dysplasia); RARS, ανθεκτική αναιμία με δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες (RA with ringed sideroblasts); RS, δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες (ringed sideroblasts); RAEB, ανθεκτική αναιμία με περίσσεια βλαστών (RA with excess of blasts); RAEB-T, ανθεκτική αναιμία με περίσσεια βλαστών σε εξαλλαγή (RAEB in transformation); AML, οξεία μυελογενής λευχαιμία (acute myeloid leukaemia); CMML, χρόνια μυελομονοκυτταρική λευχαιμία (chronic myelomonocytic leukaemia); MPD, μυελοϋπερπλαστικού τύπου διαταραχή (myeloproliferative disorder). Απαιτεί > 6 μήνες αναιμίας που δε μπορεί να αποδοθεί σε άλλα αίτια < 5% βλάστες στο μυελό, μικρομεγακαρυοκύτταρα, θρομβοκυττάρωση. MDS: WBC < 13,000/mm3; MPD: WBC > 13,000/mm3. 16

Εισαγωγή Πίνακας 2: Διεθνές Προγνωστικό Βαθμολογικό Σύστημα [International Prognostic Scoring System (IPSS)] για το ΜΔΣ* Προγνωστική Μεταβλητή Βαθμολόγηση πιθανότητας επιβίωσης και εκτροπής προς ΟΜΛ (Survival and AML Evolution Score Value) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 Βλάστες μυελού (%) < 5 5-10 11-20 21-30 Καρυότυπος (πρόγνωση) Καλής Ενδιάμεσης Πτωχής Κυτταροπενίες 0-1 2-3 Κατηγορίες νόσου ανάλογα με τη βαθμολόγηση (Risk Category Combined Score) Low 0 Int-1 0.5-1.0 Int-2 1.5-2.0 High > 2.5 * Τροποποιημένο από τους Greenberg P, Cox C, Le Beau MM, και συν. International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes. Blood.1997;89:2079-2088. Συντομογραφίες: ΟΜΛ: οξεία μυελογενής λευχαιμία Καλής (good) = normal, Y, del(5q), del(20q); Πτωχής (poor) = πολλαπλές ( 3 ανωμαλίες) ή διαταραχές του χρωμοσώματος 7 Ενδιάμεσης (Intermediate) = other abnormalities. Ουδετερόφιλα < 1800/µL, αιμοσφαιρίνη < 10 g/dl, αιμοπετάλια < 100,000/µL. 17

Εισαγωγή Microarrays Η διάγνωση και ταξινόμηση του ΜΔΣ γίνεται, λοιπόν, έως σήμερα, με τη χρήση ενός συνδυασμού κλινικών και εργαστηριακών παραμέτρων. Τα τελευταία χρόνια, η συνεχής άθροιση γνώσης, αλλά και η εξαιρετική πρόοδος της τεχνολογίας, έχουν οδηγήσει στην στερεή πλέον αντίληψη, ότι ο περισσότερο αξιόπιστος τρόπος διάγνωσης και ταξινόμησης - και επομένως και πρόγνωσης- των αιματολογικών αυτών κακοηθειών, θα επιτευχθεί με τον προσδιορισμό του εκφραστικού προφίλ μιας σειράς γονιδίων τα οποία με άμεσο ή έμμεσο τρόπο είναι υπεύθυνα για την πρόκληση του νοσήματος, τις κλινικές εκδηλώσεις και την ανταπόκριση στη θεραπευτική αγωγή. Στην επικράτηση της άποψης αυτής, άλλωστε, συντελεί και η γνωστή ετερογένεια των κλινικών εκδηλώσεων και της απάντησης στη θεραπευτική αγωγή ασθενών που, με τα παραδοσιακά κριτήρια, ανήκουν στον ίδιο τύπο της νόσου. Η μοριακή, δηλαδή, ταξινόμηση θεωρείται ότι θα είναι εξαιρετικής σημασίας για τον προσδιορισμό της κατάλληλης θεραπευτικής αγωγής για τον κάθε ασθενή και αναμένεται να συμβάλει σημαντικά στην αύξηση της επιβίωσης. Μέχρι πολύ πρόσφατα η μεγαλύτερη δυσκολία στη χρησιμοποίηση μίας τέτοιας «μοριακού τύπου» προσέγγισης, ήταν η αδυναμία μελέτης της ταυτόχρονης έκφρασης των γονιδίων στα παθολογικά κύτταρα. Η έρευνα αφορούσε μόνον την έκφραση μεμονωμένων γονιδίων, κάτι που ναι μεν οδήγησε σε σημαντική αύξηση της γνώσης πάνω στη λευχαιμογένεση, αλλά είναι αδύνατο να χρησιμοποιηθεί για τους σκοπούς που προαναφέρθηκαν, δηλαδή για τον καθορισμό κριτηρίων μοριακής ταξινόμησης και πρόγνωσης. Η μεθοδολογία των μικροσυστοιχιών του DNA (DNA microarrays) που αναπτύχθηκε τα τελευταία χρόνια και με την οποία επιτυγχάνεται η ταυτόχρονη ανίχνευση της έκφρασης ενός εξαιρετικά μεγάλου αριθμού γονιδίων [17], άρχισε να εφαρμόζεται και για τους σκοπούς που περιγράφηκαν πιο πάνω. Το 1999 δημοσιεύθηκε στο Science από τους Golub T.R. et al μια έρευνα με εφαρμογή των κλασσικών μικροσυστοιχιών DNA, η οποία ανέδειξε την έκφραση 50 γονιδίων, από ένα σύνολο 6817 που μελετήθηκαν, να διαθέτει διαγνωστική σημασία και να δύναται να διακρίνει, ανεξάρτητα από τις καθιερωμένες παραμέτρους, τις περιπτώσεις οξείας μυελογενούς και οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας. Έως τότε δεν υπήρχε μελέτη για το Μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο, αλλά ούτε και εφαρμογή των τρισδιάστατων μικροσυστοιχιών DNA. 18

Εισαγωγή Οι κλασσικές μικροσυστοιχίες DNA συμπεριλαμβάνουν μονόκλωνα ή δίκλωνα τμήματα DNA ακινητοποιημένα σε επίπεδη επιφάνεια. Η τεχνολογία αυτή προϋποθέτει τη διάθεση ενός εξαιρετικά ακριβού εξοπλισμού τόσο για την επίθεση του DNA στις μικροσυστοιχίες (spotter), όσο και για την επακόλουθη ανίχνευση της γονιδιακής έκφρασης (scanner). Η εφαρμογή του συστήματος των μικροσυστοιχιών DNA σε ένα σύστημα μικροσφαιριδίων, έτσι ώστε η ανίχνευση της έκφρασης των γονιδίων να είναι δυνατή με τη χρήση κυτταρομετρητή ροής θα δώσει τη δυνατότητα ανίχνευσης της έκφρασης των γονιδίων με ένα σύστημα αξιόπιστο, και κυρίως, διαθέσιμο σήμερα σε πολλά ελληνικά κέντρα και νοσοκομεία. 1.5 Παθογένεια ΜΔΣ Παρά την εντατική έρευνα που λαμβάνει χώρα τις τελευταίες δεκαετίες στο χώρο της Αιματολογίας, εντούτοις λίγα είναι γνωστά για την παθογένεια της Μυελοδυσπλασίας με αρκετές υποθέσεις και μοντέλα να προτείνονται από τους ερευνητές [18-20], αλλά περιορισμένα ερευνητικά δεδομένα να θεμελιώνουν αυτές τις θεωρίες αρκετά συχνά, δε, από παράλληλες μελέτες προκύπτουν αντικρουόμενα αποτελέσματα. Επιπλέον, υπάρχει περιορισμένη συσχέτιση ανάμεσα στα in vitro και in vivo στοιχεία. Εν μέρει, αυτή η "ασυνέπεια" θα μπορούσε να αποδοθεί στην εξαιρετική ετερογένεια της νόσου. Είναι γενικά αποδεκτό ότι ένα αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο (stem cell) που υπέστη ανεπανόρθωτη βλάβη στο γενετικό του υλικό δίνει γένεση σε έναν κλώνο (ή και περισσότερους!) δυσπλαστικών κυττάρων που είναι ανθεκτικός στην απόπτωση, εμφανίζει πλεονέκτημα επιβίωσης σε ένα προ-αποπτωτικό μικροπεριβάλλον μυελού, επικρατεί εις βάρος των φυσιολογικών αιμοποιητικών κυττάρων και εξαπλώνεται. Η διήθηση του μυελού από τα κλωνικά κύτταρα και η συσσώρευση της γενωμικής βλάβης στους περισσότερο ώριμους απογόνους εκδηλώνεται με: μορφολογικές δυσπλασίες των κυττάρων του μυελού και της περιφέρειας αναστολή διαφοροποίησης με αποτέλεσμα ασυγχρονισμό πολλαπλασιασμούδιαφοροποίησης μη αποδοτική αιμοποίηση ποιοτικές διαταραχές των παραγόμενων κυττάρων γενετική αστάθεια 19

Εισαγωγή Σε ένα τέτοιο υπόστρωμα, ένα πρόσθετο επιγενετικό συμβάν πυροδοτεί την εκτροπή σε ΟΛ. Τα κύρια σημεία της παθογένειας του ΜΔΣ όπως προκύπτουν από τα υπάρχοντα ερευνητικά δεδομένα παρατίθενται συνοπτικά στη συνέχεια: Η μυελική ανεπάρκεια στο ΜΔΣ θεωρείται μάλλον το αποτέλεσμα μη αποδοτικής αιμοποίησης παρά έλλειψης αιμοποιητικής δραστηριότητος. Μελέτες έχουν δείξει υψηλό ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού στο μυελό των ασθενών αυτών, που μάλιστα περιορίζεται καθώς η νόσος εκτρέπεται προς οξεία λευχαιμία [21,22]. Αρκετά πρώιμα, μελέτες έδειξαν ότι η μυελοδυσπλασία χαρακτηρίζεται από διαταραχή και αναστολή της διαδικασίας ωρίμανσης και διαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων [23]. Αυτή η αναστολή ωρίμανσης αποδόθηκε σε ενδογενή "ελαττώματα" των κυττάρων του νεοπλασματικού κλώνου και, ως ένα βαθμό, ευθύνεται για τις μορφολογικές και λειτουργικές διαταραχές των παραγόμενων αιμοποιητικών κυττάρων [22]. Το επίπεδο στην ιεραρχία των αιμοποιητικών κυττάρων όπου συμβαίνει η εξαλλαγή έχει αποτελέσει το αντικείμενο πληθώρας μελετών έως σήμερα. Τα δεδομένα της μη συμμετοχής των ώριμων κυττάρων της λεμφικής σειράς στον κλώνο καθώς και της εξαιρετικά σπάνιας εκτροπής της νόσου σε οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία είχαν οδηγήσει στην καθιέρωση της άποψης ότι η εξαλλαγή συμβαίνει, γενικά, σε επίπεδο δεσμευμένων προς τη μυελική σειρά προγονικών κυττάρων [22]. Σχετικά πρόσφατα ερευνητικά δεδομένα, όμως, ανατρέπουν την άποψη αυτή, αφού οι Nilsson και συν, το 2000, έδειξαν σε ασθενείς με σύνδρομο del5q την παρουσία της συγκεκριμένης κυτταρογενετικής διαταραχής σε μη δεσμευμένα προγονικά (CD34 + CD38 - ) κύτταρα, καθώς και σε προ-β (CD34 + CD19 + ) κύτταρα [24]. Προτείνουν ότι η απουσία της ανωμαλίας από τα ώριμα κύτταρα της λεμφικής σειράς οφείλεται σε ενδεχόμενο "ασυμβίβαστο" της έλλειψης του 5q με την δυνατότητα διαφοροποίησης των προγονικών κυττάρων προς λεμφοκύτταρα ή με την επιβίωση των Τ και Β κυττάρων. Το 2002 η ίδια ομάδα δημοσιεύει, σε συνέχεια της προηγούμενης μελέτης, ότι η τρισωμία 8 αποτελεί πιο όψιμο συμβάν από την έλλειψη του 5q και δεν αφορά τα μη δεσμευμένα προγονικά κύτταρα, τα οποία, αν και δισωμικά, εν τούτοις δεν επιδεικνύουν φυσιολογική δραστηριότητα HSC in vitro [25]. Έτσι, διαμορφώνεται πλέον η αντίληψη ότι το πολυδύναμο αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο (stem cell) αποτελεί το στόχο του πρωτογενούς μετατρεπτικού συμβάντος, το οποίο κατόπιν ανεπανόρθωτης βλάβης στο DNA του "μεταμορφώνεται" και δίνει γένεση στον δυσπλαστικό κλώνο [26]. 20

Εισαγωγή Είναι γενικά αποδεκτό ότι κλωνικά και φυσιολογικά αιμοποιητικά κύτταρα συνυπάρχουν στο μυελοδυσπλαστικό μυελό, καθώς έχει δειχθεί η δυνατότητα επανεγκατάστασης της πολυκλωνικής αιμοποίησης, εφ όσον επιτευχθεί ύφεση της νόσου, κατόπιν χημειοθεραπείας [26,27]. Η ανεπαρκής κλωνογόνος ικανότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων θεωρείται ως η βάση των κυτταροπενιών στο ΜΔΣ, καθώς μελέτες έχουν δείξει το μειωμένο δυναμικό ανάπτυξης και σχηματισμού αποικιών των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων in vitro [28-31]. Πληθώρα μελετών έχει τεκμηριώσει την παρουσία αυξημένης απόπτωσης στο μυελό των ασθενών με ΜΔΣ [32-35]. Παρ όλ αυτά, η πραγματική σημασία της απόπτωσης στην παθογένεια του συνδρόμου δεν είναι ξεκάθαρη, καθώς οι μελέτες για την απόπτωση χαρακτηρίζονται από εξαιρετική ετερογένεια ως προς τα αποτελέσματά τους [36-38], ενώ αυξημένα επίπεδα προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου ανιχνεύονται εξ ίσου και στο μυελό ασθενών με άλλες διαταραχές [39-42]. Αρκετοί ερευνητές πρότειναν την αυξημένη απόπτωση ως την αιτία της ανεπαρκούς κλωνογόνου ικανότητας των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Νεότερα δεδομένα, όμως, θέτουν την ελκυστική αυτή θεωρία υπό αμφισβήτηση [43,44]. Τα δεδομένα για την απόπτωση και τον ρόλο της στην παθογένεια του ΜΔΣ συζητούνται εκτενώς σε επόμενο κεφάλαιο. Σε μοριακό επίπεδο, έχουν ενοχοποιηθεί από μελέτες η αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση ογκογονιδίων. Πιο συγκεκριμένα, έχουν περιγραφεί μεταλλάξεις του ογκογονιδίου N-ras [45], των ογκοκατασταλτικών γονιδίων p53 [46] και IRF-1 [47], του αντι-αποπτωτικού Bcl-2 γονιδίου [48], του γονιδίου-ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου p15 INK4b [49] και των μεταγραφικών παραγόντων EVI1 [50] and MLL [51]. Επιπλέον, τα κύτταρα του μυελού στους ασθενείς με ΜΔΣ έχει δειχθεί ότι χαρακτηρίζονται από γενετική αστάθεια [52]. Η διαδικασία της κακοήθους εξαλλαγής ενός προγονικού αιμοποιητικού κυττάρου συχνά οδηγεί στην δευτερογενή ανάπτυξη κυτταρογενετικών διαταραχών, χαρακτηριστικών της νόσου. Οι καρυοτυπικές ανωμαλίες δεν αποτελούν απλά δείκτες της κλωνικότητος της νόσου, αλλά σαφώς καθορίζουν και την εκάστοτε βιολογική συμπεριφορά της [22]. Έτσι, ασθενείς με έλλειψη του Υ χρωμοσώματος, έλλειψη 5q ή 20q, γενικά, έχουν καλύτερη πρόγνωση από εκείνους με πολλαπλές καρυοτυπικές ανωμαλίες ή διαταραχές που αφορούν το χρωμόσωμα 7. Η ανίχνευση διαταραχών της λειτουργίας των μιτοχονδρίων, μεταλλάξεων του 21

Εισαγωγή μιτοχονδριακού DNA και οι ενδείξεις της παρουσίας οξειδωτικού stress στα κύτταρα του μυελού των ασθενών με ΜΔΣ συνιστούν επίσης σημαντικά ερευνητικά στοιχεία που συμβάλλουν στην ερμηνεία της μη αποδοτικής αιμοποίησης αλλά και της αυξημένης απόπτωσης στο μυελοδυσπλαστικό μυελό [53-55]. Σχετικά με τη συμμετοχή του στρώματος στη μυελική ανεπάρκεια του συνδρόμου, μέσω διαταραχών του μικροπεριβάλλοντος τόσο σε κυτταρικό όσο και σε επίπεδο παραγωγής ανασταλτικών για την αιμοποίηση και προ-αποπτωτικών κυτταροκινών, τα πορίσματα των σχετικών μελετών είναι αντικρουόμενα: έτσι, πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι η απόπτωση αφορά και τα κύτταρα του στρώματος στο δυσπλαστικό μυελό [32], ενώ η υπολειπόμενη ανάπτυξη του στρώματος των ασθενών αυτών και η προτεινόμενη αδυναμία υποστήριξης φυσιολογικών προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων [56] αμφισβητείται από μελέτες που αποδεικνύουν τα αντίθετα [57]. Πάντως, αξίζει να αναφερθεί ότι ασθενείς με ΜΔΣ είναι δυνατό να θεραπευθούν με αλλογενή μεταμόσχευση μυελού των οστών υποδεικνύοντας στρώμα είτε άθικτο είτε, έστω, που φέρει διαταραχές αναστρέψιμες, υπό συγκεκριμένες συνθήκες. Τέλος, ανοσολογικές διαταραχές στους ασθενείς αυτούς συμπληρώνουν τα υπάρχοντα δεδομένα για την παθογένεια του συνδρόμου. Τα κύρια σημεία της παθογένειας του ΜΔΣ παρουσιάζονται σχηματικά στην Εικόνα 2. 22

Εισαγωγή Λιποκύτταρα Περιορισμός φυσιολογικής αιμοποίησης Ινοβλάστες και προσομοιάζοντα κύτταρα TNFa, IFNγ, IL6 ΑΠΟΠΤΩΣΗ Στρώμα μυελού ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA ROS Stem cells Μακροφάγα ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗ Ανεπάρκεια στρώματος, Αυξητικών παραγόντων Ενδογενή κυτταρικά ελλείμματα Ανεπαρκής κλωνογόνος ικανότητα Ανασταλτικές κυττοκίνες TNFa FasL VEGF Πρόοδος νόσου Μη αποδοτική Αιμοποίηση, ΒΛΑΣΤΕΣ κυτταροπενίες περιφέρειας Ανεπαρκής ανοσολογική καταστολή Πλεονέκτημα επιβίωσηςεπιλογή Αντίσταση στην απόπτωση Bcl-2 - υσπλασία - ιαταραχή διαφοροποίησης - Γενετική αστάθεια Επιγενετικό συμβάν Αναστολή διαφοροποίησης / Αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων Λευχαιμική εκτροπή Εικόνα 2: Παθογένεια ΜΔΣ 23

Εισαγωγή 2. Απόπτωση 2.1 Κυτταρικός θάνατος: Ορισμοί-χαρακτηριστικά Ο κυτταρικός θάνατος επιτελείται μέσω δύο κυρίαρχων μηχανισμών: 1) τη νέκρωση και 2) τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο ή απόπτωση. Η νέκρωση αποτελεί μη ειδικό ορισμό που περιλαμβάνει μια ποικιλία τύπων κυτταρικού θανάτου με κοινό χαρακτηριστικό τον παθητικό ρόλο του κυττάρου κατά την καταστροφή του. Πρόκειται για μία πάντοτε παθολογική διαδικασία που συνήθως ακολουθεί οξεία και μείζονα κυτταρική/ ιστική βλάβη, όπως υποξία, υπερθερμία, ιϊκή προσβολή, έκθεση σε τοξίνες ή σύνδεση του συμπληρώματος. Συνήθως αφορά κύτταρα συνεχή και εφαπτόμενα και προκαλεί διαταραχή της αρχιτεκτονικής του θιγόμενου ιστού. Χαρακτηρίζεται από πρώιμη εξοίδηση και ανεπάρκεια των μιτοχονδρίων, δυσλειτουργία της κυτταροπλασματικής μεμβράνης, απώλεια της κυτταρικής ομοιόστασης, κυτταρικό οίδημα και ρήξη. Η απελευθέρωση του κυτταρικού περιεχομένου, κυρίως πρωτεασών και λυσοσωμικών ενζύμων, στον εξωκυττάριο χώρο πυροδοτεί απελευθέρωση κυτταροκινών από τα γειτονικά κύτταρα (μακροφάγα) και τοπική φλεγμονώδη αντίδραση (Εικόνα 3α) [58,59]. Η απόπτωση αποτελεί μορφολογικά στερεότυπη μορφή κυτταρικού θανάτου, που επικρατεί σε πολυκυττάριους οργανισμούς και απομακρύνει μεμονωμένα κύτταρα από ζωντανούς ιστούς, χωρίς να διαταράσσει την αρχιτεκτονική τους. Ο ορισμός απόπτωση έχει ελληνική προέλευση και περιγράφει την πτώση των φύλλων από τα δέντρα ή των πετάλων. Πρόκειται για φαινόμενο πρωταρχικό και ουσιώδες για την ανάπτυξη των οργανισμών και για την διατήρηση της ομοιόστασης, καθώς αποτελεί το φυσιολογικό μηχανισμό της αθόρυβης απομάκρυνσης των κυττάρων που προσεγγίζουν το τέλος της προβλεπόμενης ζωής τους, έχουν υποστεί ανεπανόρθωτη βλάβη ή είναι σε περίσσεια. Σε αντίθεση με τη νέκρωση, η απόπτωση είναι ενεργητική κυτταρική διαδικασία που δεν πυροδοτεί φλεγμονώδη αντίδραση, καθώς τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνονται άμεσα από τα γειτονικά φαγοκύτταρα χωρίς την απελευθέρωση κυτοκινών αλλά ούτε και πρωτεολυτικών ενζύμων στον εξωκυττάριο χώρο (Εικόνα 3β) [58,59]. 24

Εισαγωγή α: Νέκρωση β: Απόπτωση Εικόνα 3: Μορφολογικές κυτταρικές μεταβολές κατά τη νέκρωση (α) και την απόπτωση (β). 25

Εισαγωγή 2.2 Μορφολογικές μεταβολές της απόπτωσης Τα κύτταρα που υφίστανται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο παρουσιάζουν διαδοχικές μεταβολές στον πυρήνα, στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη. Ο χρόνος που μεσολαβεί από την επίδραση του προ-αποπτωτικού ερεθίσματος έως την έναρξη της απόπτωσης ποικίλει, όμως οι μεταβολές συμβαίνουν εντός ολίγων λεπτών: αρχικά, τα αποπτωτικά κύτταρα χάνουν την επαφή με τα γειτονικά τους κύτταρα; στη συνέχεια πραγματοποιείται διαστολή του ενδοπλασματικού δικτύου και εξοίδηση της δεξαμενής του που σχηματίζει κυστίδια. Η απώλεια ύδατος και ιόντων έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του κυτταρικού όγκου και αύξηση της πυκνότητος του κυττάρου. Ο πυρήνας συμπυκνώνεται και η χρωματίνη σχηματίζει συμπυκνωμένες-συμπαγείς δομές κάτω από την, προς το παρόν, άθικτη πυρηνική μεμβράνη, ενώ ενδονουκλεάσες την αποδομούν. Στην επιφάνεια του κυττάρου οι κυτταρικές συνδέσεις καταργούνται, ενώ η κυτταροπλασματική μεμβράνη συσπειρώνεται και αποκτά φυσαλιδώδη εμφάνιση. Σε όλη αυτή τη διάρκεια, τα μιτοχόνδρια και τα ριβοσώματα διατηρούν αδρά τη δομή τους κι εν μέρει τη λειτουργικότητά τους. Προοδευτικά, καταστρέφεται ο κυτταροσκελετός και το κύτταρο συρρικνώνεται. Τελικά, ο πυρήνας κατακερματίζεται σε πολλαπλά τμήματα που περιβάλλονται από πυρηνική μεμβράνη. Ακολουθεί η διάσπαση του κυττάρου στα περίφημα αποπτωτικά σωμάτια που επίσης περιβάλλονται από κυτταροπλασματική μεμβράνη και κάποια από τα οποία εμπεριέχουν πυρηνικά θραύσματα (Εικόνα 3β). Τα αποπτωτικά σωμάτια φαγοκυτταρώνονται ταχέως από τα γειτονικά κύτταρα και μακροφάγα, χωρίς την ανάπτυξη φλεγμονώδους αντίδρασης και παραμένουν εντός των φαγοσωμάτων ορατά στο οπτικό μικροσκόπιο για λίγες ώρες [58,59]. Ειδικό μορφολογικό χαρακτηριστικό της απόπτωσης αποτελεί ο κατακερματισμός του DNA από ενδονουκλεάσες. Αρχικά ανιχνεύονται μεγάλου μεγέθους θραύσματα DNA, 50 έως 300 kbp, που είναι παροδικά και πιθανά αποτελούν ροζέτες και αγκύλες χρωματίνης που απελευθερώνονται από την καθηλωμένη πυρηνική μήτρα. Ταχέως, περαιτέρω κατακερματισμός του DNA στις ενδονουκλεοσωμικές συνδετικές περιοχές λαμβάνει χώρα δημιουργώντας πολλαπλά ολιγονουκλεοτίδια 180-200 bp (ένα νουκλεόσωμα = 180 bp). Τα θραύσματα αυτά του δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος απεικονίζονται χαρακτηριστικά ως DNA ladder κατά την ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης. Πρέπει να σημειωθεί ότι το μιτοχονδριακό DNA δεν καταστρέφεται κατά τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, υποδηλώνοντας ότι ο κατακερματισμός του DNA αποτελεί ειδικό πυρηνικό συμβάν [58]. 26

Εισαγωγή 2.3 Βιοχημικές μεταβολές της απόπτωσης Η διαδικασία της απόπτωσης είναι δυνατό να διαιρεθεί, προς ανάλυση, σε τρία στάδια: επαγωγή-εκκίνηση, δέσμευση και εκτέλεση. - Επαγωγή-εκκίνηση: Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος επάγεται από την επίδραση διαφόρων ερεθισμάτων, όπως κυτταροτοξικά φάρμακα, υπεριώδη ή γ- ακτινοβολία, ανασταλτικές κυτοκίνες (TNFα, lymphotoxin-β, Fas-Ligand, TGF-β), κυτταροτοξικά Τ-κύτταρα, στέρηση αυξητικών παραγόντων, ιούς, ερεθίσματα που προκαλούν οξειδωτικό stress. Οι διάφοροι αυτοί επιβλαβείς παράγοντες πυροδοτούν την απόπτωση είτε μέσω ενός ενδοκυττάριου καταρράκτη αντιδράσεων ( ενδογενής οδός ), που τροφοδοτεί με σήματα θανάτου το μιτοχόνδριο, είτε μέσω της εξωγενούς οδού, που μεταβιβάζει, μέσω ενεργοποίησης των υποδοχέων θανάτου (Fas/CD95, TNFR), σήματα από τους εξωκυττάριους συνδέτες θανάτου στο εσωτερικό του κυττάρου (FasLigand, TNFα, TRAIL/Apo2L, Apo3L) (Εικόνα 4). Υπάρχουν δύο σχετικά διακριτοί τύποι κυττάρων: τα κύτταρα τύπου Ι όπου η απόπτωση κυρίως πυροδοτείται μέσω της εξωγενούς οδού, χωρίς τη συμμετοχή των μιτοχονδρίων, και τα κύτταρα τύπου ΙΙ, όπου για την εκκίνηση της απόπτωσης απαιτείται η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια. Παρ όλ αυτά, σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων υφίσταται διασύνδεση μεταξύ των δύο οδών με κυρίαρχο μόριο το BID, έτσι ώστε οι δύο μηχανισμοί να είναι αλληλένδετοι και όχι ανεξάρτητοι [48,60]. - Δέσμευση: Το στάδιο της δέσμευσης, όπου διαδραματίζουν πολύ σημαντικό ρόλο τα μιτοχόνδρια και τα μέλη της οικογένειας Bcl-2 (προ- και αντι-αποπτωτικά), καταλήγει στην ενεργοποίηση των κασπασών, μιας οικογένειας κυστεϊν-ασπαρτικού οξέος πρωτεασών, που χαρακτηρίζονται ως εκτελεστικά μόρια του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Οι πρωτεΐνες αυτές υπάρχουν σε ανενεργό μορφή (ως προκασπάσες) στο κυτταρόπλασμα και κατά την πρόοδο της αποπτωτικής διεργασίας ενεργοποιούνται μέσω πρωτεόλυσης και, σε έναν καταρράκτη αντιδράσεων, ενεργοποιούν η καθεμία την επόμενη. Οι ενεργοποιημένες κασπάσες προκαλούν σταδιακή και εκλεκτική αποδόμηση-πρωτεόλυση των κυτταρικών συστατικών (Εικόνα 5). - Εκτέλεση: Τα επακόλουθα της ενεργοποίησης των κασπασών συνιστούν ουσιαστικά το εκτελεστικό μέρος της αποπτωτικής διαδικασίας. Πρέπει, πάντως, να σημειωθεί ότι το παλαιότερο δόγμα για μη αναστρέψιμη δέσμευση του κυττάρου στο θάνατο μετά την 27

Εισαγωγή ενεργοποίηση του καταρράκτη των κασπασών δεν ισχύει πλέον, μετά την ανάδειξη οικογένειας πρωτεϊνών που αναστέλλουν τις κασπάσες ακόμη και σε προχωρημένο στάδιο της απόπτωσης: πρόκειται για τους αναστολείς της απόπτωσης (Inhibitors of Apoptosis Proteins ή IAPs) καθώς και μέλη της οικογένειας των Heat Shock Proteins (Hsps). Τουλάχιστον πέντε διαφορετικές IAPs επιδεικνύουν αντι-αποπτωτική δραστηριότητα σε κυτταροκαλλιέργειες: X-linked ιnhibitor of apoptosis (XIAP, hilp), c-iap1 (HIAP2), c-iap2 (HIAP1), neuronal IAP, και η survivin. Όλες συνδέονται και αναστέλλουν την ενεργό κασπάση-3 και -7, καθώς και την προκασπάση-9, όχι όμως τις κασπάσες-1, -6, -8 ή -10 [61]. Εικόνα 4: Ενεργοποίηση "εξωγενούς οδού" απόπτωσης, μέσω διέγερσης υποδοχέα θανάτου (Fas) από το συνδέτη του (FasL), και "ενδογενούς οδού" απόπτωσης (απευθείας διέγερση των μιτοχονδρίων προς απελευθέρωση του κυτοχρώματος c). 28

Εισαγωγή Εικόνα 5: Επαγωγή της απόπτωσης μέσω των μιτοχονδρίων. Το κυτταρικό στρες επάγει τη μετακίνηση προ-αποπτωτικών μελών της Bcl-2 οικογένειας από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια όπου προάγουν την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c. Το κυτόχρωμα c καταλύει τον ολιγομερισμό του Apaf-1, ο οποίος οδηγεί στην ενεργοποίηση της προκασπάσης-9. Αυτή με τη σειρά της ενεργοποιεί την προ-κασπάση-3, οδηγώντας στην απόπτωση. 29

Εισαγωγή 2.4 Μιτοχόνδρια Πολλές μελέτες έχουν δείξει τον ουσιώδη ρόλο των μιτοχονδρίων σε πολλές μορφές απόπτωσης Θεωρείται ότι τα μιτοχόνδρια (ΜΧ) διαδραματίζουν κεντρικό και, ίσως, ρόλο κλειδί στην διαδικασία της απόπτωσης, καθώς αποτελούν κόμβο διασύνδεσης των δύο ξεχωριστών αποπτωτικών οδών: ενδογενούς και εξωγενούς. Καθοριστικής σημασίας γεγονότα στην εξέλιξη του κυτταρικού θανάτου είναι 1) η παραγωγή ΑΤΡ, και 2) η κατάργηση του ΔΨm και η απελευθέρωση προ-αποπτωτικών παραγόντων, όπως το κυτόχρωμα c από τον διαμεμβρανικό χώρο στο κυτταρόπλασμα για την ενεργοποίηση της περαιτέρω εκτελεστικής φάσης της απόπτωσης [62,63]. Σημαντικό ρόλο σε αυτές τις μιτοχονδριακές μεταβολές διαδραματίζουν τα μέλη της οικογένειας Bcl-2. - Bcl-2 πρωτεΐνες: Η πρωτεΐνη Bcl-2 ανακαλύφθηκε ως πρωτο-ογκογονίδιο των κυττάρων του οζώδους λεμφώματος εκ Β-κυττάρων. Στη συνέχεια και έως σήμερα έχουν ανακαλυφθεί τουλάχιστον 19 μέλη της οικογένειας Bcl-2 που περιέχουν στη δομή τους τουλάχιστον μία από τις τέσσερις συντηρημένες αλληλουχίες ΒΗ1-ΒΗ4, γνωστές ως Bcl-2 ομόλογες περιοχές. Τα μέλη της οικογένειας υποδιαιρούνται σε τρεις κατηγορίες: (1) Αντιαποπτωτικά μέλη, όπως Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, A1 (Bfl-1), NR-13, και Boo (Diva), τα οποία όλα περιέχουν τουλάχιστον τις περιοχές ΒΗ1 και ΒΗ2. (2) Προ-αποπτωτικά μέλη, όπως τα Bax, Bak, and Bok (Mtd), που έχουν ομολογία ως προς τις περιοχές BH1, BH2 και BH3, αλλά όχι στην BH4, και (3) BH3-προ-αποπτωτικά μέλη, που περιλαμβάνουν τα μόρια Bid, Bad, Bim, Bik, Blk, Hrk (DP5), Bnip3, BimL και Noxa, και περιέχουν στη δομή τους μόνο την κεντρική βραχεία BH3 περιοχή. Οι πρωτεΐνες Bcl-2 και Bcl-XL εδράζονται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, ενώ τα προ-αποπτωτικά μέλη στο κυτταρόπλασμα ή στη μιτοχονδριακή μεμβράνη. Κατά την εκκίνηση της απόπτωσης τα προ-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας ενεργοποιούνται και μεταναστεύουν στα μιτοχόνδρια. Η μετατόπιση των μορίων Bax (κατόπιν ολιγομερισμού), Bid, ή Bad στα μιτοχόνδρια προκαλούν την απελευθέρωση αποπτογόνων πρωτεϊνών, μέσω διαύλων, από τον διαμεμβρανικό μιτοχονδριακό χώρο στο κυτταρόπλασμα, μεταξύ των οποίων το κυτόχρωμα c, η Smac-DIABLO, ο Apoptosis Inducing Factor (AIF). Τα αντιαποπτωτικά μέλη της οικογένειας δρουν παρεμποδίζοντας την απελευθέρωση του κυτοχρώματος στο κυτταρόπλασμα [48,61]. - Mιτοχονδριακό Διαμεμβρανικό Δυναμικό (ΔΨm): Κατά την πρόοδο της αποπτωτικής διεργασίας σημαντικές μεταβολές συμβαίνουν στη μιτοχονδριακή δομή και λειτουργία, 30

Εισαγωγή όπως η κατάργηση του Μιτοχονδριακού Διαμεμβρανικού Δυναμικού (ΔΨm), αύξηση της απελευθέρωσης ενεργών ελεύθερων ριζών Οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS), όπως το ανιόν του σουπεροξειδίου, και οξείδωση της καρδιολιπίνης της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης από τις παραγόμενες ROS. Η κατάργηση του ΔΨm αντιπροσωπεύει την πλέον σημαντική μεταβολή κατά την εξέλιξη της απόπτωσης, ενώ συμβαίνει αρκετά πρώιμα. Η κατάργηση του ΔΨm σχετίζεται με την διάνοιξη μιτοχονδριακών Μεγα-Διαύλων, των Permeability Transition Pores (PTPs), μέσω των οποίων πραγματοποιείται η απελευθέρωση αποπτογόνων πρωτεϊνών ( κυτόχρωμα c, Smac- DIABLO, AIF) από τον διαμεμβρανικό μιτοχονδριακό χώρο στο κυτταρόπλασμα. Οι δίαυλοι αυτοί πιστεύεται σήμερα ότι αποτελούνται: από τον εξωτερικής ΜΧ μεμβράνης τασεο-εξαρτώμενο δίαυλο ανιόντων (mitochondrial outer membrane voltage-dependent anion channel - VDAC), την αδενινο-νουκλεοτιδ-τρανσλοκάση (ΑΝΤ) και το ΜΧ υποδοχέα βενζοδιαζεπινών. Οι πρωτεΐνες αυτές συνεργάζονται στο σχηματισμό ενός ευρέως διαύλου επικοινωνίας κι ευθύνονται για την permeability transition (PT) των μιτοχονδρίων. Ως ΡΤ ορίζεται η αιφνίδια αύξηση στη διαπερατότητα της ΜΧ μεμβράνης σε διαλύτες μοριακής μάζας <1.5kDa ως αποτέλεσμα της υπάρχουσας διαφοράς δυναμικού (ΔΨm) μεταξύ μιτοχονδριακής μήτρας και κυτταροπλάσματος. Η διάνοιξη των ΡΤΡ ρυθμίζεται τόσο από το ΔΨm (μείωση ΔΨm διάνοιξη ΡΤΡ) όσο και από το ph της μιτοχονδριακής μήτρας (όξινο ph κλείσιμο ΡΤΡ) [64]. Πρέπει, πάντως, να σημειωθεί ότι πέρα από τους ΡΤΡ, ο σχηματισμός διαύλων από μόρια Bax (4 Bax μόρια), πόροι Bax/Bid-lipidic και Bax-VDAC δίαυλοι έχουν περιγραφεί και έχει δειχθεί η μετακίνηση του κυτοχρώματος c μέσω αυτών [65-67]. Υπάρχουν τέσσερα μοντέλα διάνοιξης ΡΤΡs και επαγόμενης κατάργησης ΔΨm (Εικόνα 6) [64]: (α) Μοντέλο του ΡΤΡ-επαγόμενου μιτοχονδριακού οιδήματος ή μοντέλο διάνοιξης VDAC: το προ-αποπτωτικό ερέθισμα αλληλεπιδρά άμεσα με τους ΡΤΡ και προκαλεί τη διάνοιξη των διαύλων VDAC. Διαλύτες και Η2Ο εισέρχονται στο ΜΧ οδηγώντας σε ραγδαία απώλεια του ΔΨm, οίδημα της ΜΧ μήτρας και ρήξη της εξωτερικής ΜΧ μεμβράνης. Οι αποπτογόνοι παράγοντες cyto-c, Smac-Diablo και AIF απελευθερώνονται στο κυτταρόπλασμα. (β) Μοντέλο του ΡΤΡ-μη επαγόμενου ΜΧ οιδήματος: προσωρινή διάνοιξη των ΡΤΡ προκαλεί κατάργηση του ΔΨm μέσω μιας αντλίας πρωτονίων χωρίς πρόκληση ΜΧ οιδήματος. Η μείωση του ΔΨm οδηγεί στην πραγματοποίηση μεταβολών διάταξης 31