ΕΝΟΤΗΤΑ Η ΠΕΠΤΙΔΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ

- 70 - ΕΝΟΤΗΤΑ Η ΠΕΠΤΙΔΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ Τα πεπτίδια αποτελούνται από αμινοξέα τα οποία συνδέονται μεταξύ τους σε αλυσίδες μέσω ενός αμιδικού δεσμού, ο οποίος ονομάζεται πεπτιδικός δεσμός. H H H H R 1 H R 2 H R 3 Ο εξέχων ρόλος των πεπτιδίων στη λειτουργία κάθε οργανισμού στον πλανήτη μας, αποτέλεσε την κινητήρια δύναμη για την ανάπτυξη της πεπτιδικής σύνθεσης, αφού με τον τρόπο αυτό θα είναι εφικτή : (i) η συνθετική παρασκευή μεγάλων ποσοτήτων πεπτιδίων με ιδιαίτερα σημαντικά χαρακτηριστικά και (ii) η σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων με ενισχυμένες βιολογικές ιδιότητες που θα τους επιτρέπουν να χρησιμοποιηθούν ως χρήσιμα φαρμακευτικά εργαλεία. Στη φύση η σύνθεση των πεπτιδίων ακολουθεί μια βήμα προς βήμα διαδικασία, όπου η αμινομάδα του ενός αμινοξέος συνδέεται με την καρβοξυλομάδα ενός άλλου, σχηματίζοντας έτσι ένα διπεπτίδιο. Η παραπάνω διαδικασία, η οποία συνοδεύεται βέβαια από την απομάκρυνση ενός μορίου νερού, συνεχίζεται μέχρις ότου σχηματιστεί το συγκεκριμένο πεπτίδιο. Στο εργαστήριο η σύνθεση ενός έστω διπεπτιδίου αποδεικνύεται πολύ πιο σύνθετη διαδικασία, αφού πρέπει να ληφθούν υπ' όψιν σημαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν το τελικό αποτέλεσμα.

- 71 - Η στρατηγική της πεπτιδικής συνθέσεως περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1. Παροδική προστασία της α-αμινομάδας του Ν-τελικού αμινοξέος με κατάλληλη ομάδα. 2. Παροδική προστασία του καρβοξυλίου του -τελικού αμινοξέος με κατάλληλη ομάδα 3. Παροδική προστασία των δραστικών ομάδων της πλευρικής αλυσίδας R των αμινοξέων. 4. Σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού. 5. Εκλεκτική απομάκρυνση της Ν α -προστατευτικής ομάδας έναντι άλλων προστατευτικών ομάδων, στην περίπτωση αυξήσεως της πεπτιδικής αλυσίδας. Στο Σχήμα 1 παρουσιάζεται συνοπτικά η διαδικασία σύνθεσης ενός διπεπτιδίου. H 2 -HR 1 2 H H 2 -HR 2 2 H i i P 1 -HHR 1 2 H H 2 -HR 2 2 P 2 ii P 1 -HHR 1 2 X H 2 -HR 2 2 P 2 iii iv H 2 HR 1 HHR 2 2 H Ν-τελικό αμινοξύ -τελικό αμινοξύ Σχήμα 1: Συνοπτική παρουσίαση σύνθεσης ενός διπεπτιδίου. Συνθήκες: i προστασία, ii ενεργοποίηση, iii σύζευξη, iv αποπροστασία

- 72 - Η ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας, δηλαδή η ενσωμάτωση των αμινοξέων στην επιθυμητή αλληλουχία, μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο διαφορετικούς τρόπους: α. πεπτιδική σύνθεση κατά στάδια (step by step) Η μέθοδος αυτή περιλαμβάνει την ανοικοδόμηση του πεπτιδικού σκελετού με την προσθήκη ενός, κάθε φορά, προστατευμένου αμινοξέος στο δημιουργούμενο μόριο. H προσθήκη μπορεί θεωρητικά να συμβεί και προς τις δυο διευθύνσεις είτε από το Ν- τελικό τμήμα του μορίου προς το -τελικό, είτε αντίστροφα από το -τελικό προς το Ν- τελικό. Στη φύση η πρωτεϊνική σύνθεση ακολουθεί την πρώτη διαδικασία, στο εργαστήριο όμως κάτι τέτοιο είναι πρακτικά αδύνατο, εξαιτίας των διαφόρων παρατηρούμενων παράπλευρων αντιδράσεων. Έτσι η σύνθεση κατά στάδια, ξεκινώντας από το -τελικό άκρο, παρότι σα διαδικασία είναι πιο επίπονη (μεγάλος αριθμός διαδοχικών αντιδράσεων προστασίας, αποπροστασίας και σύζευξης) χρησιμοποιείται σχεδόν αποκλειστικά. β. πεπτιδική σύνθεση μέσω συμπύκνωσης πεπτιδικών τμημάτων (fragment or segment condensation) Στη μέθοδο αυτή κατάλληλα προστατευμένα πεπτίδια δύο ή περισσοτέρων αμινοξέων (fragments) συνδέονται μέσω πεπτιδικού δεσμού προς μεγαλύτερα τμήματα συνθέτοντας έτσι τον πεπτιδικό σκελετό. H μέθοδος αυτή παρουσιάζει συγκεκριμένα πλεονεκτήματα, όπως σχετικά εύκολη παρασκευή, καθαρισμό και ταυτοποίηση των μικρών πεπτιδικών τμημάτων και συγκριτικά εύκολο διαχωρισμό των τμημάτων που δεν έχουν αντιδράσει. Η επιλογή κατάλληλων πεπτιδικών τμημάτων, τα οποία έχουν σαν -τελικό αμινοξύ γλυκίνη (αμινοξύ χωρίς ασύμμετρο άτομο άνθρακα) ή προλίνη (αμινοξύ οπτικά σταθερό) επιτρέπει την ευρεία χρησιμοποίηση της συγκεκριμένης μεθόδου, ειδικά για σύνθεση μεγάλων πεπτιδικών μορίων. Οι ομάδες προστασίας οι οποίες χρησιμοποιούνται κατά τη διαδικασία της πεπτιδικής συνθέσεως πρέπει να πληρούν ορισμένες προϋποθέσεις, όπως: να εισάγονται εύκολα και σε ικανοποιητική απόδοση, να είναι σταθερές στις συνθήκες της πεπτιδικής συνθέσεως, να επιτρέπουν την εκλεκτική απομάκρυνση άλλων προστατευτικών ομάδων, να απομακρύνονται ποσοτικά, εύκολα και χωρίς δευτερογενείς επιδράσεις στο πεπτίδιο. Ένας από τους βασικούς στόχους της στρατηγικής και τακτικής της πεπτιδικής συνθέσεως είναι η διατήρηση της στερεοχημικής διατάξεως των αμινοξέων, εις τρόπον ώστε τα τελικά προϊόντα να είναι ομογενή και απαλλαγμένα της παρουσίας

- 73 - στερεοϊσομερών. Η απώλεια της οπτικής καθαρότητας (ρακεμίωση) των σχηματιζόμενων πεπτιδίων αποτελεί σημαντικό πρόβλημα της πεπτιδικής σύνθεσης. Η έκταση της ρακεμίωσης εξαρτάται από τη φύση του διαλύτη, τη θερμοκρασία, τη φύση της πλευρικής αλυσίδας των αμινοξέων, την Ν α -προστατευτική ομάδα και το είδος της χρησιμοποιούμενης βάσεως. Η ρακεμίωση λαμβάνει χώρα με τρεις μηχανισμούς: 1. Με απευθείας απόσπαση α-πρωτονίου 2. Με αντιστρεπτή β-απόσπαση 3. Με ενδιάμεσο σχηματισμό 5 (4Η)-οξαζολόνης (αζλακτόνης) Για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των αμινοξέων χρησιμοποιείται ευρέως η αντίδραση της νινυδρίνης. Η νινυδρίνη αντιδρά με τα αμινοξέα προς παραγωγή εγχρώμων ενώσεων. Όλα τα αμινοξέα δίνουν κυανό χρώμα εκτός από την Pro και την Hyp που δίνουν κίτρινο. H 2 -H(R)-H Αμινοξύ Νινυδρίνη H H -= H RH 2 Εγχρωμο παράγωγο Με έκθεση σε ατμόσφαιρα χλωρίου και ψεκασμό με διάλυμα μίγματος 1% αμύλου - 1% KJ (1:1 v/v) ανιχνεύεται ο πεπτιδικός δεσμός.

- 74 - ΑΣΚΗΣΗ 1 ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ Ν α -ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΜΕΝΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Επειδή η α-αμινομάδα των αμινοξέων παρουσιάζει τη γενική συμπεριφορά των αμινών (πυρηνόφιλος χαρακτήρας) κατά τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης η προστασία της Ν α -αμινομάδας θεωρείται απαραίτητη για να αποφεύγεται η συμμετοχή της σε διάφορες παράπλευρες αντιδράσεις. Η προστασία πρέπει να είναι παροδική και η αποπροστασία εύκολη και εκλεκτική, ενώ οι συνθήκες αποπροστασίας δεν πρέπει να επηρεάζουν την καρβοξυ-προστατευτική ομάδα και τις υπόλοιπες πλάγιες προστατευτικές ομάδες. Μερικές ευρέως χρησιμοποιούμενες προστατευτικές ομάδες της Ν α -αμινομάδας είναι: i) η καρβοβενζoξυ-ομάδα (bz ή Z), η οποία απομακρύνεται με καταλυτική υδρογόνωση, με επίδραση νατρίου σε υγρή αμμωνία ή τέλος με επίδραση διαλύματος HBr σε οξικό οξύ ii) η τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλομάδα (Boc), η οποία είναι περισσότερο ευαίσθητη σε οξέα από τη Ζ-ομάδα και απομακρύνεται με ψυχρό F 3 H ή διάλυμα Hl σε οργανικό διαλύτη iii) η τριφαινυλο-μεθυλομάδα (Trt), η οποία απομακρύνεται με καταλυτική υδρογόνωση και επίδραση αραιών διαλυμάτων οξέων και iv) η 9- φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα (Fmoc), η οποία είναι πολύ σταθερή σε όξινα αντιδραστήρια και απομακρύνεται με επίδραση ασθενών βάσεων. H 2 H 3 H 3 H 3 Ζ Boc H H 2 --- Trt Fmoc

- 75 - ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Χοάνη εκχυλίσεως Κωνικές φιάλες Ποτήρια ζέσεως Διάταξη διηθήσεως Αναδευτήρας Υλικά και αντιδραστήρια Αμινοξέα Τριτ.βουτυλοξυκαρβονυλοανυδρίτης (Boc 2 Ο) 9-φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλοηλεκτριμίδιο (Fmoc-Su) αοη 1Ν Κιτρικό οξύ Αιθέρας Οξικός αιθυλεςτέρας a 2 S 4 KHS 4 Διοξάνη Πειραματική πορεία 1. Σύνθεση Ν α -τριτ. Βουτυλοξυκαρβονυλο-L-αμινοξέος (Boc-αμινοξύ) Ποσότητα αμινοξέως (10 mmol) διαλύεται σε μίγμα ΝαΟΗ 1Ν (20 ml) και Η 2 Ο (10 ml). Στο υπό ανάδευση διάλυμα [Σχήμα Π2] προστίθεται, μέσα σε χρονικό διάστημα 45 λεπτών και στους 0, ποσότητα Boc 2 (3,3 g, 15 mmol) διαλυμένη σε 20 ml διοξάνης. Μετά την πάροδο των 45 λεπτών το μίγμα αναδεύεται 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης ελέγχεται το ph και διατηρείται στην περιοχή 7,5-8 με την προσθήκη διαλύματος ΝαΟΗ 1Ν. Εν συνεχεία το διάλυμα συμπυκνώνεται, υπό κενό [Σχήμα Π9], μέχρι να ελαττωθεί ο όγκος του σε περίπου 10-15 ml. Ακολουθεί ψύξη του διαλύματος στους 0 και οξίνιση με διάλυμα 20% ΚΗS 4 μέχρι ph 2-3. Κατόπιν το μίγμα μεταφέρεται σε διαχωριστική φιάλη [Σχήμα Π6] και εκχυλίζεται δύο φορές με 50 ml οξικού αιθυλεστέρα. Οι οργανικές φάσεις ενώνονται και πλένονται 2 φορές με 80 ml νερό. Ακολουθεί ξήρανση με άνυδρο a 2 S 4, διήθηση μέσω πτυχωτού ηθμού εντός υάλινου χωνιού [Σχήμα Π8] και συμπύκνωση του οξικού αιθυλεστέρα, υπό ελαττωμένη Πριν τη συμπύκνωση η πορεία της αντίδρασης παρακολουθείται με TL. Εάν δεν έχει ολοκληρωθεί προστίθεται μια περίσσεια Boc 2 και το μίγμα αφήνεται να αναδεύεται και άλλη ώρα σε θερμοκρασία δωματίου

- 76 - πίεση [Σχήμα Π9]. Το λαμβανόμενο από τη συμπύκνωση ελαιώδες προϊόν κρυσταλλώνεται από μίγμα κατάλληλων διαλυτών. 2. Σύνθεση Ν α -9-φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλο-L-αμινοξέος (Fmoc-αμινοξύ) Ποσότητα αμινοξέως (10 mmol) διαλύεται σε διάλυμα a 2 3 10% (40 ml). Στο υπό ανάδευση διάλυμα [Σχήμα Π2] προστίθεται, μέσα σε χρονικό διάστημα 60 λεπτών, ποσότητα Fmoc-Su (3,97 g, 11 mmol) διαλυμένη σε 30 ml διοξάνης. Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης προστίθεται διάλυμα a 2 3 10% προκειμένου το ph του διαλύματος να διατηρείται στην περιοχή 8-9. Μετά το πέρας της μιας ώρας, το μίγμα της αντίδρασης μεταφέρεται σε διαχωριστική φιάλη [Σχήμα Π6] και εκχυλίζεται δύο φορές με 50 ml αιθέρα. Κατόπιν η υδατική φάση οξινίζεται με τη βοήθεια διαλύματος κιτρικού οξέος 20% (ph ~3-4) και μεταφέρεται σε διαχωριστική φιάλη όπου εκχυλίζεται 2 φορές με 50 ml οξικού αιθυλεστέρα. Οι οργανικές φάσεις ενώνονται και πλένονται 2 φορές με 80 ml νερό. Ακολουθεί ξήρανση με άνυδρο a 2 S 4, διήθηση μέσω πτυχωτού ηθμού εντός υάλινου χωνιού [Σχήμα Π8] και συμπύκνωση του οξικού αιθυλεστέρα, υπό ελαττωμένη πίεση [Σχήμα Π9]. Το λαμβανόμενο από τη συμπύκνωση ελαιώδες προϊόν κρυσταλλώνεται από μίγμα κατάλληλων διαλυτών. ΑΣΚΗΣΗ 2 ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΚΑΡΒΟΞΥ-ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΜΕΝΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Η καρβοξυλομάδα του -τελικού αμινοξέος, κατά τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης, πρέπει να προστατεύεται κατάλληλα προς αποφυγή δημιουργίας παραπροϊόντων από την προσβολή του καρβονυλίου από διάφορα πυρηνόφιλα αντιδραστήρια, συμπεριλαμβανομένων και των ελεύθερων αμινομάδων. Η καρβοξυ-προστατευτική ομάδα η οποία θα επιλεγεί θα πρέπει να χαρακτηρίζεται από υψηλή σταθερότητα καθ' όλην τη διάρκεια της Κατάλληλα μίγματα διαλυτών είναι: αιθέρας-πετρελαϊκός αιθέρας/ αιθέρας-εξάνιο/ οξικός αιθυλεστέραςπετρελαϊκός αιθέρας/ οξικός αιθυλεστέρας-εξάνιο, κ.ά. Για να διαλυθεί η ποσότητα του Fmoc-Su ίσως απαιτηθεί ελαφριά θέρμανση

- 77 - σύνθεσης. Ο πιο απλός και συνηθισμένος τρόπος προστασίας του -τελικού καρβοξυλίου είναι η εστεροποίησή του. Οι συχνότερα χρησιμοποιούμενοι εστέρες είναι: i) οι μεθυλεστέρες (-Me) και αιθυλεστέρες (-Et), οι οποίοι απομακρύνονται με αλκαλική υδρόλυση ii) οι βενζυλεστέρες, (-Bzl), οι οποίοι απομακρύνονται με καταλυτική υδρογόνωση ή επίδραση νατρίου σε υγρή H 3 και iii) οι τριτοταγείς βουτυλεστέρες (-Bu t ), οι οποίοι απομακρύνονται με ήπιες όξινες συνθήκες (Hl σε οργανικό διαλύτη). Άλλη δυνατότητα προστασίας του καρβοξυλίου είναι η μετατροπή του σε αμίδιο και υδραζίδιο. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Κωνικές φιάλες Ποτήρια ζέσεως Διάταξη διηθήσεως Αναδευτήρας Υλικά και αντιδραστήρια Αμινοξέα ΜeH Θειονυλοχλωρίδιο Μεθανόλη Αιθανόλη Αιθέρας Πειραματική πορεία Σύνθεση υδροχλωρικού μεθυλεστέρα ή αιθυλεστέρα L-αμινοξέος Σε 30 ml μεθανόλης ή αιθανόλης προστίθενται στάγδην, υπό ανάδευση [Σχήμα Π2] και υπό ψύξη, 8 ml θειονυλοχλωριδίου. Στο προκύπτον διάλυμα προστίθενται 10 mmol αμινοξέος και το μίγμα αναδεύεται επί 1 / 2 h στους 0 και επί δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν το διάλυμα συμπυκνώνεται, υπό κενό [Σχήμα Π9], και το ελαιώδες υπόλειμμα στερεοποιείται με αιθέρα. Το στερεό συλλέγεται με διήθηση, υπό κενό, σε ηθμό με πορώδες (Νο.2) [Σχήμα Π16Β], εκπλένεται με αιθέρα, ξηραίνεται, υπό κενό, υπεράνω P 2 5 και ανακρυσταλλώνεται από μεθανόλη-αιθέρα ή αιθανόλη-αιθέρα. Η προσθήκη του Sl 2 πρέπει να γίνεται με προσοχή διότι η διάλυσή του στη μεθανόλη ή αιθανόλη είναι αρκετά βίαιη Πριν τη συμπύκνωση η πορεία της αντίδρασης παρακολουθείται με TL. Εάν δεν έχει ολοκληρωθεί προστίθεται περίσσεια θειονυλοχλωριδίου και το μίγμα αφήνεται να αναδεύεται και άλλη ώρα σε θερμοκρασία δωματίου

- 78 - ΑΣΚΗΣΗ 3 ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΙΠΕΠΤΙΔΙΟΥ Ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας του προστιθέμενου αμινοξέος και τη νουκλεόφιλη προσβολή του παραπάνω ενδιαμέσου από την ελεύθερη αμινομάδα. R 1 H R 1 X R 1 H R 2 + HX.. R 2 H 2 Οι κυριότερες μέθοδοι δημιουργίας πεπτιδικού δεσμού αναφέρονται παρακάτω: Μέθοδος των Καρβοδιιμιδίων Η χρησιμοποίηση των καρβοδιιμιδίων έχει αποτελέσει από τα μέσα της δεκαετίας του '50 τη δημοφιλέστερη επιλογή στο χώρο των αντιδραστηρίων σύζευξης. Το δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμίδιο (D ή DI) θεωρείται ο κυριότερος εκπρόσωπος των αντιδραστηρίων της κατηγορίας αυτής. D Καλύτερα αποτελέσματα τόσο στον τομέα της απόδοσης, όσο και στον τομέα της οπτικής καθαρότητας των προϊόντων επιτυγχάνονται με τη χρήση πρόσθετων πυρηνόφιλων αντιδραστηρίων, όπως τα παρακάτω: H 1-υδροξυ-βενζοτριαζόλιο ή HBt H Ν-υδροξυ-ηλεκτριμίδιο ή HSu H 1-υδροξυ-7-αζαβενζοτριαζόλιο ή HAt

- 79 - Μέθοδος των ανυδριτών Η χρήση ανυδριτών, συμμετρικών ή ασυμμέτρων, για την ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας του Ν α -προστατευμένου αμινοξέος είναι πολύ διαδεδομένη. Εξαιρετικά αποτελέσματα επετεύχθησαν όταν χρησιμοποιήθηκαν ως δραστικά ενδιάμεσα οι μικτοί ανυδρίτες των Ν α -προστατευμένων αμινοξέων και αλκυλοχλωροκαρβονικών οξέων. Η χρήση των ισοβουτυλ- ή δευτεροταγών βουτυλοκαρβονικών ανυδριτών οδήγησε σε υψηλές αποδόσεις και ελαχιστοποίηση των παραπροϊόντων. Μέθοδος ενεργών εστέρων Ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας επιτυγχάνεται και με την μετατροπή του Ν α - προστατευμένου αμινοξέος στον αντίστοιχο ενεργό εστέρα R 1 -H-HR--Y, όπου Υ ομάδα η οποία έλκει ηλεκτρόνια. Μεγάλη ποικιλία ενεργών εστέρων αναφέρεται στη βιβλιογραφία. Ανάμεσα σ αυτούς μεγάλη πρακτική εφαρμογή βρίσκουν οι π- νιτροφαινυλεστέρες (-ΟΝp) και οι 2,4,5 τριχλωροφαινυλεστέρες (-TP). R 2 R l l l R-p R-TP Μέθοδος των Φωσφονικών και Ουρονικών Παραγώγων Τα παράγωγα αυτά είναι αντιδραστήρια με δυνατότητα in situ δημιουργίας ενεργοποιημένων παραγώγων (Πίνακας Ι) Ορισμένα πλεονεκτήματα των αντιδραστηρίων αυτών είναι: i) η σταθερότητα και η ευκολία χρήσης, ii) η πραγματοποίηση της αντίδρασης σε ένα στάδιο, σε θερμοκρασία δωματίου, σε σύντομο χρονικό διάστημα και με υψηλή απόδοση, iii) η δυνατότητα χρήσης, τόσο σε υγρή, όσο και σε στερεή φάση, είτε πρόκειται για σταδιακή σύνθεση πεπτιδίων, είτε για σύζευξη πεπτιδικών κλασμάτων και iv) η μείωση των παράπλευρων αντιδράσεων Οι ενώσεις αυτές αντιδρούν μόνο με καρβοξυλικά ανιόντα και όχι με καρβοξυλικά οξέα. Για το λόγο αυτό είναι απαραίτητη η προσθήκη μιας οργανικής βάσης. Έχει βρεθεί ότι καλύτερα αποτελέσματα όσον αφορά τη διατήρηση της στερεοχημικής διατάξεως των

- 80 - αμινοξέων δίνει η χρήση της διισοπροπυλο-αιθυλαμίνης (DIEA). Ταυτόχρονα η χρησιμοποίηση πρόσθετων αντιδραστηρίων, όπως για παράδειγμα 1-υδροξυβενζοτριαζόλιο, συνεισφέρει στον τομέα αυτό. Μερικά χαρακτηριστικά παραδείγματα τέτοιων ενώσεων δίδονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας Ι. Φωσφονικά και ουρονικά παράγωγα Ονομασία Εξαφθοροφωσφορικό άλας του βενζοτριαζολυλοξυ-τρις(διμεθυλαμινο)- φωσφονίου (BΟΡ) Χημικός Τύπος P [(H 3 ) 2 ] 3.PF 6 Εξαφθοροφωσφορικό άλας του βενζοτριαζολυλοξυ-τρις-πυρρολιδινοφωσφονίου (PyBP) [καλύτερες ιδιότητες σε σχέση με το BP] P.PF 6 3 Εξαφωσφορικό άλας της 2-(1Hβενζοτριαζολυλ)-1,1,3,3-Τετραμεθυλουρίας (HBTU) [μειωμένο ποσοστό ρακεμίωσης κατά την συμπύκνωση πεπτιδικών κλασμάτων σε υγρή και στερεή φάση] Τετραφθοροβορικό άλας της 2-(1Hβενζοτριαζολυλ)-1,1,3,3-Τετραμεθυλουρίας (TBTU) [μειωμένο κόστος παρασκευής σε σχέση με HBTU] [(H 2 ) 3 ] 2.PF 6 [(H 2 ) 3 ] 2.BF 4

- 81 - ΑΣΚΗΣΗ 3a ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΙΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΣΕ ΥΓΡΗ ΦΑΣΗ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΩΝ ΦΩΣΦΟΝΙΚΩΝ ΚΑΙ ΟΥΡΟΝΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ Η πεπτιδική σύνθεση πραγματοποιείται είτε σε υγρή φάση (solution peptide synthesis), είτε επί στερεάς φάσεως (solid phase peptide synthesis). Το κύριο πλεονέκτημα της υγρής φάσης είναι η δυνατότητα καθαρισμού και ταυτοποιήσεως των προϊόντων όλων των ενδιαμέσων σταδίων. Αντιθέτως, στη σύνθεση επί στερεάς φάσεως ο καθαρισμός γίνεται στο τελικό στάδιο, διαδικασία όχι εύκολη εφ όσον το επιθυμητό προϊόν συχνά συνοδεύεται από πεπτίδια παρομοίου μήκους και δομής. Από την άλλη πλευρά η σύνθεση σε υγρή φάση είναι μέθοδος χρονοβόρος με σχετικά υψηλό κόστος, ενώ η σύνθεση επί στερεάς φάσεως είναι γρήγορη και μειωμένου κόστους. Επιπλέον στη σύνθεση επί στερεάς φάσεως ελαχιστοποιούνται ορισμένα προβλήματα τα οποία παρουσιάζονται στην υγρή φάση, όπως η μειωμένη διαλυτότητα των ενδιαμέσων προϊόντων μεγάλου μοριακού βάρους ή η απομάκρυνσή τους από το προϊόν της αντιδράσεως. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Χοάνη εκχυλίσεως Κωνικές φιάλες Ποτήρια ζέσεως Διάταξη διηθήσεως Αναδευτήρας Υλικά και αντιδραστήρια Ν α -προστατευμένο αμινοξύ Υδροχλωρικός μεθυλεστέρας ή αιθυλεστέρας αμινοξέος Διχλωρομεθάνιο (DM) Διισοπροπυλο-αιθυλαμίνη (DIEA) Αντιδραστήριο σύζευξης (PyBP ή TBTU) 1-υδροξυβενζοτριάλιο (HBt) Οξικός αιθυλεστέρας Κιτρικό οξύ Όξινο ανθρακικό νάτριο Εξάνιο Θειικό νάτριο

- 82 - Πειραματική πορεία Σε μια σφαιρική φιάλη προστίθεται ποσότητα Ν α -βουτυλοξυκαρβονυλο-αλανίνης (1mmol, 182.21 mg), υδροχλωρικού αιθυλεστέρα της φαινυλαλανίνης (1.10 mmol, 252.68 mg, 10% περίσσεια), PyBP (1 mmol, 540 mg) ή TBTU (1 mmol, 321.1 mg), HBt (1 mmol, 153 mg) και 5 ml DM. Το αιώρημα παγώνεται στους 0 και προστίθεται DIEA (2.10 mmol, 0.37 ml). Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύεται 10 λεπτά [Σχήμα Π2] στους 0 και 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης ελέγχεται το ph και διατηρείται στην περιοχή 7.5 8 με την προσθήκη DIEA. Εν συνεχεία το διάλυμα συμπυκνώνεται, υπό κενό [Σχήμα Π9] και το ελαιώδες υπόλειμμα μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη [Σχήμα Π6] με 60 ml οξικού αιθυλεστέρα. Η οργανική φάση πλένεται διαδοχικά με διάλυμα 5% κιτρικού οξέος (2x50 ml), νερό (2x50 ml), διάλυμα 5% ah 3 (2x50 ml), νερό (2x50 ml), ξηραίνεται με a 2 S 4, διηθείται μέσω πτυχωτού ηθμού εντός υάλινου χωνιού [Σχήμα Π8] και συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού, υπό ελαττωμένη πίεση. Το λαμβανόμενο προϊόν, ελαιώδους υφής στερεό κρυσταλλώνεται από εξάνιο. Η καθαρότητά του ελέγχεται με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας και με σύστημα διαλυτών οξικού αιθυλεστέρα/ πετρ.αιθέρα (1:1, v/v). Για τον περαιτέρω καθαρισμό του υποβάλλεται σε χρωματογραφία στήλης (flash column) με silica (230-400 mesh) και διαλύτη έκλουσης το σύστημα οξικού αιθυλεστέρα/ πετρ.αιθέρα (1:1, v/v). Τα κλάσματα που περιέχουν το προϊόν σε καθαρή μορφή συλλέγονται μαζί και συμπυκνώνονται, υπό ελαττωμένη πίεση, μέχρι ξηρού. ΑΣΚΗΣΗ 3β ΣΥΝΘΕΣΗ ΔΙΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΣΕ ΣΤΕΡΕΗ ΦΑΣΗ Η εισαγωγή της μεθόδου σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεή φάση πραγματοποιήθηκε από τον Merrifield στις αρχές της δεκαετίας του 1960. Η βασική αρχή της μεθόδου είναι αρκετά απλή. Η ανάπτυξη της πεπτιδικής αλυσίδας πραγματοποιείται αφού το -τελικό αμινοξύ συνδεθεί μέσω ομοιοπολικού δεσμού με μια χαρακτηριστική ομάδα (linker) ενός αδιάλυτου, στις συνθήκες της σύνθεσης, στερεού υποστρώματος. Η όλη διαδικασία χαρακτηρίζεται από διαδοχικούς κύκλους αντιδράσεων, οι οποίοι περιλαμβάνουν απομάκρυνση της Ν α -προστατευτικής ομάδας και σύζευξη με το επόμενο αμινοξύ. Στη

- 83 - διάρκεια του κάθε κύκλου πραγματοποιούνται συνεχείς εκπλύσεις με κατάλληλους διαλύτες, προκειμένου να απομακρυνθούν τα τυχόν αδιάλυτα παραπροϊόντα, αλλά και να προετοιμαστεί κατάλληλα η ρητίνη για την επόμενη, κάθε φορά, αντίδραση. Στο Σχήμα 3 παρουσιάζεται η σύνθεση ενός διπεπτιδίου πάνω στο αδιάλυτο πολυμερές. X H H H + A H 2 P R 1 Y 1 X H H H 2 P R 1 Y 1 Αποπροστασία Κύκλος επαναλαμβανόμενος n φορές Σύζευξη X H H R 2 B + H 2 H R 1 H 2 P Y 2 Y 1 X H H H H H 2 P Απομάκρυνση του πεπτιδίου από τη ρητίνη και αποπροστασία των πλευρικών ομάδων R 2 Y 2 R 1 Y 1 H 2 H... H H H H R n R 2 R 1 H Σχήμα 3: Συνοπτική παρουσίαση της σύνθεσης ενός διπεπτιδίου σε στερεή φάση

- 84 - ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Σφαιρικές φιάλες Ογκομετρικοί κύλινδροι Χοάνη εκχυλίσεως Κωνικές φιάλες Ποτήρια ζέσεως Διάταξη διηθήσεως Υλικά και αντιδραστήρια Ν α -προστατευμένο αμινοξύ Διχλωρομεθάνιο (DM) Διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) Ισοπροπανόλη (i-prh) 1-υδροξυβενζοτριάλιο (HBt) Διισοπρπυλοκαρβοδιϊμίδιο (DI) Διισοπροπυλο-αιθυλαμίνη (DIEA) Πιπεριδίνη Τριφθοροαιθανόλη (TFE) Οξικό οξύ (AcH) Μεθανόλη Εξάνιο Πειραματική πορεία Εστεροποίηση του πρώτου αμινοξέος στην 2-χλωρο-τριτυλο-ρητίνη l l 2-χλωρο-τριτυλο (lt) ρητίνη 1. Σε ένα αντιδραστήρα στερεής φάσης προστίθεται 1 g ρητίνης (1.0-2.0 mmol χλωρίου/g ρητίνης) 10 ml διχλωρομεθανίου και το περιεχόμενο του αντιδραστήρα αφού αναδευτεί 5 λεπτά διηθείται. 2. Προστίθεται στη ρητίνη ένα διάλυμα 2 mmol Fmoc-αμινοξέος, 5 mmol DIEA διαλυμένα σε 8 ml DM. Το περιεχόμενο του αντιδραστήρα αναδεύεται 30 λεπτά και εν συνεχεία διηθείται. 3. Η ρητίνη πλένεται 2 φορές με 10 ml DMF και διηθείται

- 85-4. Προστίθεται στη ρητίνη 10 ml μίγματος DM/MeH/DIEA (85:15:5) και το περιεχόμενο του αντιδραστήρα αφού αναδευτεί 10 λεπτά διηθείται. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται άλλη μια φορά 5. Η ρητίνη πλένεται 3 φορές με 10 ml DMF και διηθείται. 6. Προστίθεται στη ρητίνη 10 ml διαλύματος 25% πιπεριδίνης σε DMF και το περιεχόμενο του αντιδραστήρα αφού αναδευτεί 5 λεπτά διηθείται. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται άλλη μια φορά για 20 λεπτά. 7. Η ρητίνη πλένεται 6 φορές με 10 ml DMF, 3 φορές με 10 ml ισοπροπανόλης και 4 φορές με εξάνιο, διηθείται και ξηραίνεται καλά αρχικά στον αέρα και εν συνεχεία υπό κενό Ενεργοποίηση και διαδικασία σύζευξης Ξεκινάμε με 2g ρητίνης με υποκατάσταση 0.5 mmol/g Ποσότητα Fmoc-αμινοξέος (3 mmol, τριπλάσια περίσσεια από την υποκατάσταση της ρητίνης) και 1-HBt (4.5 mmol) διαλύονται υπό ανάδευση σε DMF (4 ml). Το διάλυμα παγώνεται στους 0 και προστίθεται DI (3.3 mmol). Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύεται 10 λεπτά στους 0 και 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Εν συνεχεία το μίγμα μεταφέρεται στον αντιδραστήρα στερεής φάσης όπου περιέχει τη ρητίνη. Έπειτα από 2 ώρες το διάλυμα διηθείται και η ρητίνη πλένεται διαδοχικά 3x DMF, 3x iprh, 2x DMF, 2xiPrH και 2x hexane. Η πρόοδος της σύζευξης ελέγχεται με test Kaiser και TL. Σε περίπτωση μη ολοκλήρωσης της σύζευξης η διαδικασία επαναλαμβάνεται χρησιμοποιώντας τις μισές ποσότητες αμινοξέων και των λοιπών αντιδραστηρίων σύζευξης. Απομάκρυνση της Fmoc-ομάδας Η απομάκρυνση της Fmoc-ομάδας επιτυγχάνεται με κατεργασία της ρητίνης σε θερμοκρασία δωματίου με διάλυμα 20% πιπεριδίνης σε DMF (10 ml) για 10 λεπτά. Aκολουθεί (μετά την απομάκρυνση της πρώτης ποσότητας του διαλύματος) μια δεύτερη κατεργασία της ρητίνης με το ίδιο διάλυμα για 25 λεπτά. Στη συνέχεια η ρητίνη πλένεται διαδοχικά 3x DMF, 3x iprh, 2x DMF, 2x iprh και 2x hexane. Απομάκρυνση του πεπτιδίου από την ρητίνη H ρητίνη αναδεύεται σε μια σφαιρική φιάλη, για 2 h σε θερμοκρασία δωματίου, με 25 ml διαλύματος DM/TFE/AcH (7:2:1, v/v). Εν συνεχεία διηθείται και το διήθημα συμπυκνώνεται υπό κενό. Το προϊόν καταβυθίζεται με προσθήκη διαιθυλαιθέρα, συλλέγεται με διήθηση στον ηθμό, πλένεται με αιθέρα και ξηραίνεται υπό κενό, πάνω

- 86 - από P 2 5. Η καθαρότητα του πεπτιδίου ελέγχεται με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPL). Έλεγχος της Αντίδρασης Σύζευξης (Kaiser Test) Ο έλεγχος της αντίδρασης σύζευξης γίνεται με τη μέθοδο Kaiser. Σύμφωνα με αυτή σε ένα δείγμα πεπτιδίου-ρητίνης (3 έως 5 mg) προστίθονται κατά σειρά 2-3 σταγόνες από τα παρακάτω διαλύματα: Διάλυμα 1: 500 mg νινυδρίνης σε 10 ml 1-βουτανόλης Διάλυμα 2: 80 g φαινόλης σε 20 ml 1-βουτανόλης Διάλυμα 3: 2 ml υδατικού διαλύματος 0,001 M K σε 98 ml πυριδίνης Το μίγμα θερμαίνεται για 5 λεπτά στους 100. Στην περίπτωση όπου το διάλυμα παραμένει κίτρινο και οι κόκκοι της ρητίνης λευκοί, η δοκιμή θεωρείται αρνητική ως προς την ύπαρξη ελεύθερης αμινομάδας. Αν το χρώμα των κόκκων, του διαλύματος ή και των δύο γίνεται μπλε προς μωβ, η δοκιμή κρίνεται θετική οπότε απαιτείται επανασύζευξη. Η προλίνη, ως δευτεροταγές αμινοξύ, δε δίνει θετική αντίδραση. Μερικά αμινοξέα με ελεύθερη αμινομάδα όπως η σερίνη, η ασπαραγίνη και το ασπαραγινικό μπορεί να μη δώσουν το τυπικό μπλέ χρώμα των πρωτοταγών αμινών. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Μ. Bodanszky, Peptide hemistry, Second, Revised Edition, Springer-Verlag, Berlin (1993). 2. Μ. Bodanszky and A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Second Edition, Springer-Verlag, Berlin (1994). 3. J. Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, xford University Press, xford (1992).