Μελέτη κυττάρων βιολογικών υγρών µε κυτταροµετρία ροής Κατερίνα Ψαρρά Τµήµα Ανοσολογίας Ιστοσυµβατότητας Γ.Ν.Α. «Ο Ευαγγελισµός»
Μέτρηση Ποσοτικοποίηση όσο το δυνατόν περισσοτέρων κυτταρικών συστατικών σε επίπεδο µεµονωµένων κυττάρων. Ποσοτική δοµική ανάλυση των κυτταρικών συστατικών και των αλληλεξαρτήσεών τους. Ποσοτικοποίηση των κυτταρικών λειτουργιών. Ποσοτικοποίηση των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων.
ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΗΤΗΣ ΡΟΗΣ Electronics Fluidics Light detectors FL3 PerCP, Cy5 FL2 PE Computer FL1 FITC Laser Light 488nm SSC FSC
O όρος κυτταροµετρία ροής αναφέρεται στη µέτρηση κυττάρων στην πραγµατοποίηση ευαίσθητων πολυπαραµετρικών οπτικών µετρήσεων σε δείγµα που «ρέει»
Πλεονεκτήµατα κυτταροµετρίας ροής Μέτρηση υψηλού αριθµού κυττάρων σε σύντοµο χρονικό διάστηµα Ανίχνευση σπανίων δεδοµένων (1: 100000) Ταυτόχρονη ανίχνευση δύο µορφοµετρικών και τεσσάρων (ή περισσοτέρων) παραµέτρων φθορισµού ανά κύτταρο ( > 6 παραµέτρους ανά κύτταρο) Η ανάλυση µέσω ηλεκτρονικού υπολογιστή επιτρέπει τυποποίηση των κυτταρικών πληθυσµών
Μερικά ακόµη πλεονεκτήµατα της πολυπαραµετρικής ΚΡ Περισσότερα αποτελέσµατα από λιγότερο δείγµα Ακριβέστερη ταυτοποίηση πληθυσµών µέσω αποκλεισµού ανεπιθύµητων κυτταρικών πληθυσµών Ταυτοποίηση κυττάρων µε πολύπλοκο ανοσοφαινότυπο
Ποια µόρια-ενώσεις µπορώ να προσδιορίσω µε την Κυτταροµετρία Ροής; Προσδιορίζονται όλες οι ενώσεις-αντιγόνα για τις οποίες υπάρχει το αντίστοιχο µονοκλωνικό αντίσωµα κυτταροκίνες οµής ένζυµα Μόρια Προσκόλλησης Υποδοχείς Υποδοχείς Μεταβολιτών
«Κλινική Κυτταροµετρία ροής» κατευθυντήριες γραµµές (guidelines) απαρίθµηση ή υπολογισµός αντιγονικά καθορισµένων κυτταρικών πληθυσµών τυποποίηση αιµατολογικών κακοηθειών
Τυποποίηση αιµατολογικών κακοηθειών σκοπός της ανάλυσης είναι να ταυτοποιηθεί η παρουσία παθολογικού πληθυσµού µε «άγνωστο» ανοσοφαινότυπο υπάρχουν πολλαπλοί παθολογικοί πληθυσµοί η απάντηση είναι η πολυπαραµετρική κυτταροµετρία ροής
Human CD Antigens B o n e m a rro w C F U -G M CD13, CD34, C D33, CD38, CD117 pluripotent Stem C ell CD34, CDw90, T h y m u s CFU-M CD13 CD33 CDw65 CD117 Monoblast CD13 CD15 CD33 CDw65 unreifer Monozyt CD13 CD33 CD64 CDw65 Monozyt CD13 CD15 CD64 CDw65 Blood CFU-G CD13 CD33 CDw65 CD117 cmpo Myeloblast CD13 CD33 CDw65 CD117 cmpo Myelozyt CD13 CD33 CD15 CDw65 cmpo Metam yelozyt CD13 CD33 CD15 CD65s cympo Granulozyt CD15 CD16 CD65s cympo CFU-Meg CD34 CD33 Megakoryblast CD34 CD61 Megakoryzyt CD41 CD42 CD61 Throm bozyt CD41 CD42 CD61 CFU-E CD34 CD33 Erythroblast CD34 CD36 Retikulozyt CD36 Glyko A Erythrozyt Glyko A? NK-Zelle +/-CD2 CD7 CD8 CD16 CD56 +/-CD 57 prä-prä-b-zelle CD19 ccd22 CD34 ccd79a TdT prä-b-zelle CD19 CD22 CD24 ccd79a cm unreife B-Zelle CD10 CD19 CD20 CD22 CD24 CD79a IgM B-Lym phozyt CD19 CD20 CD22 CD24 CD79a IgM/IgD CD34, TdT subkortikaler Thym ozyt ccd3 CD5 CD7 CD34 TdT cortiklaer Thym ozyt CD1 +/-CD2 ccd3 CD5 CD7 m edullärer Thymozyt CD2 CD3 CD5 CD7 +/-CD4 +/-CD8 T-Lymphozyt CD2 CD3 CD5 CD7 +/-CD4 +/-CD8
Εφαρµογές της Κυτταροµετρίας Ροής Αιµατολογία Ανοσολογία Λοιµωξιολογία Ογκολογία Ουρολογία Μαιευτική και Γυναικολογία Στον τοµέα των Μεταµοσχεύσεων Παιδιατρική Παθολογοανατοµία Κυτταρολογία Πνευµονολογία Νευρολογία Οφθαλµολογία Τυποποίηση Λευχαιµιών /Λεµφωµάτων Μελέτη της πλοειδίας και των φάσεων του κυτταρικού κύκλου των Αιµατολογικών κακοηθειών Παρακολούθηση Μεταµοσχεύσεων Παρακολούθηση θεραπειών Αυτοάνοσα Νοσήµατα HLA-τυποποίηση Διάγνωση PNH Ποσοτικοποίηση των Αρχέγονων Αιµοποιητικών κυττάρων Θετική διαλογή ρογονικών αιµο οιητικών κυττάρων Μέτρηση των ΔΕΚ Παρακολούθηση της Σήψης Οξειδωτική έκρηξη - Φαγοκυττάρωση Μελέτη του ανοσοφαινότυπου της Λευχαιµικής Υπολειµµατικής Νόσου Βασικός έλεγχος των HIV+ ατόµων Ανοσολογικές Ανε άρκειες Μελέτη της ενεργοποίησης των Αιµοπεταλίων DNA-Ανάλυση Μελέτη της αντοχής στα χηµειοθεραπευτικά Μελέτη της Απόπτωσης
δείγµατα αίµα µυελός οστών BAL αρθρικό υγρό πλευριτικό υγρό ασκιτικό υγρό περιτοναϊκό υγρό περικαρδιακό υγρό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) κύτταρα ιστών προαπαιτούµενο Ροή µεµονωµένων κυττάρων
Flow Cytometric Analysis of Cytologic Specimens in Hematologic Disease Curtis A. Hanson and Bertram Schnitzer Department of Pathology, University of Michigan Medical School, Ann Arbor, Michigan Journal of Clinical Laboratory Analysis 3:2-7 (1989)
Ιδιαιτερότητες «άλλων» βιολογικών υγρών Υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες «ράκη» νεκρών κυττάρων Αντιδραστική λεµφοκυττάρωση και µονοκυττάρωση Μεσοθηλιακά κύτταρα Ενδοθηλιακά κύτταρα Γρήγορος κυτταρικός θάνατος
πρόκληση Αποµόνωση ανίχνευση - αναγνώριση παθολογικού κακοήθους πληθυσµού που πιθανά συνυπάρχει σε µικρό ποσοστό. Διάκριση αιµοποιητικών µη αιµοποιητικών κυττάρων
ΕΝΥ Γρήγορος θάνατος κυττάρων (υποδιπλασιασµός ανά µισάωρο και πιθανή εκλεκτική απώλεια κυττάρων) Ταχύτατη µεταφορά δείγµατος στο εργαστήριο ή χρήση µονιµοποιητικού υγρού!!!! Πολύ µικρός αριθµός κυττάρων Αναζήτηση συγκεκριµένου πληθυσµού σύµφωνα µε κλινικά δεδοµένα Πρόσµειξη περιφερικού αίµατος
Journal of Clinical Laboratory Analysis 3:2-7 (1989)
Τι θέλουµε; να χαρακτηρίσουµε αναγνωρίσουµε περιγράψουµε τα κύτταρα να µετρήσουµε τον κάθε πληθυσµό
Μελέτη άλλων βιολογικών υγρών- εφαρµογές Στην πλειονότητα των περιπτώσεων η διαγνωστική σηµασία της ανοσοφαινοτυπικής µελέτης των υγρών αυτών έγκειται στην ανίχνευση διήθησης από αιµατολογικό νόσηµα. ΌΜΩΣ µπορεί να βοηθήσει στη µελέτη και κατανόηση νοσηµάτων µε παθολογικό ανοσιακό υπόστρωµα όπως: Πολλαπλή σκλήρυνση (µελέτη του ΕΝΥ) Σαρκοείδωση (µελέτη του BAL)
Κύτταρα φυσιολογικού/αντιδραστικού ΕΝΥ Ενήλικες Λεµφοκύτταρα/ Μονοκύτταρα: 70/30 Παιδιά: Λεµφοκύτταρα/ Μονοκύτταρα : από 20/80 0,5 0,4 Κύτταρα/µL 0,3 0,2 0,1 Σειρά1 0 T-λεµφοκύτταρα CD4+ CD8+ B-λεµφοκύτταρα NK-κύτταρα De Graaf et al. J. Neuroimmunology 2008
Πολλαπλή σκλήρυνση Β-λεµφοκυτταρικός τύπος ( B, Πλασµατοκύτταρα, IgG, Μονοκύτταρα) Χειρότερη πρόγνωση Μονοκυτταρικός τύπος Καλύτερη πρόγνωση ( B, Πλασµατοκύτταρα, IgG, Μονοκύτταρα) Cepok et al. Brain 2001
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ
Πλευριτικό υγρό
Πλευριτικό υγρό
Ασκιτικό υγρό - λεµφοκύτταρα
Εικόνα µελέτης BAL
ΕΝΥ DLBCL
Όγκος εγκεφάλου ΕΝΥ
Διήθηση πλασµατοκυττάρων σε δείγµα ΕΝΥ ασθενούς µε πολλαπλούν µυέλωµα
Ασθενής µε οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία ΕΝΥ 29-09-14
Ασθενής µε οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία ΕΝΥ 2-10-14
Ασθενής µε οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία ΕΝΥ 06-1014
09-10-14 22-10-14
Ασθενής µε NHL αµυγδαλής διάχυτο από µεγάλα κύτταρα -EΝΥ 29-09-14
Ασθενής µε προβ-ολλ
Ο δεύτερος πληθυσµός αποτελείται από ώριµα Τ λεµφοκύτταρα CD3+CD4+ και CD3+CD8+
Ασθενής µε ΟΜΛ CD7+ 18-06-14 ΕΝΥ
Ασθενής µε ΟΜΛ CD7+ 18-06-14 ΕΝΥ
Ασκιτικό υγρό - µονοκύτταρα
συµπερασµατικά Η πολυπαραµετρική κυτταροµετρία ροής αποτελεί πολύτιµο εργαλείο για τη µελέτη των κυττάρων όλων των βιολογικών υγρών, για τον χαρακτηρισµό τους, τη σχετική µέτρησή τους, τη διάγνωση διήθησης από κακόηθες νόσηµα.
ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ www.kyttarometria.gr
European Society of Clinical cell analysis www.escca.eu