ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Π. ΝΙΚΟΛΑΪΔΗΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Π. ΝΙΚΟΛΑΪΔΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2010-2011 ΑΡΙΘΜ. ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 2695 «ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΟΥΣ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΟΥ ΕΠΙΔΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΠΡΟΚΑΡΚΙΝΙΚΕΣ ΒΛΑΒΕΣ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΖΗΣΗ ΑΝΤΩΝΟΠΟΥΛΟΥ ΙΑΤΡΟΥ - ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΟΛΟΓΟΥ Διδακτορική διατριβή στα πλαίσια του ερευνητικού προγράμματος ΠΕΝΕΔ, Α.Π. 583/03 1

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΓΟΥΛΗΣ, ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΟΛΙΟΥΣΚΑΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΡΟ ΡΟΜΟΣ ΧΥΤΙΡΟΓΛΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΓΟΥΛΗΣ, ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΟΛΙΟΥΣΚΑΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΡΟ ΡΟΜΟΣ ΧΥΤΙΡΟΓΛΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΦΟΥΝΤΖΗΛΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΑΚΡΙΒΙΑ ΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΚΩΤΟΥΛΑ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΓΕΡΜΑΝΙ ΗΣ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ «Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (νόμος 5343/32, αρθρ.202 καιν.1268/82, αρθρ. 8 50) 2

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...5 2ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...9 ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ (ΚΠΕ)...11 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ... 11 ΦΥΣΙΚΗ ΙΣΤΟΡΙΑ - ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ... 11 ΘΕΡΑΠΕΙΑ... 12 ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΟΥ Η ΜΕΤΑΣΤΑΤΙΚΟΥ ΚΠΕ - ΝΕΟΤΕΡΕΣ, ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΕΣ ΘΕΡΑΠΕΙΕΣ... 13 ΥΠΟ ΟΧΕΑΣ ΤΟΥ ΕΠΙ ΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ (EGFR).25 ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΑΓΓΕΙΑΚΟΥ ΕΝ ΟΘΗΛΙΟΥ (VEGF)...29 ΣΧΕΣΕΙΣ ΤΟΥ EGFR ΜΕ ΤΟΝ VEGF...32 ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΟ ΜΑΤΙΣΜΑ ΚΑΙ ΙΣΟΜΟΡΦΕΣ ΤΟΥ VEGF... 34 ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙ-ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΟΥ VEGF (VEGF xxxb )... 38 ΆΛΛΑ ΜΟΡΙΑ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΤΟΝ EGFR...42 PDGF... 42 ΘΡΟΜΒΟΣΠΟΝΔΙΝΗ 1... 45 K-ras... 46 HIF1A... 49 3VEGF-C...51 ΜΕΘΟ ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ...53 ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ... 53 ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΤΡΑΝΣΚΡΙΠΤΑΣΗΣ-ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ... 55 ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ -ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ... 56 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...58 ΣΚΟΠΟΣ...60 ΥΛΙΚΟ...61 3

ΜΕΘΟ ΟΙ...62 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ...71 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...72 ΠΕΡΙΓΡΑΦΙΚΑ, ΔΗΜΟΓΡΑΦΙΚΑ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΑ... 72 ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΩΝ ΜΕ ΤΟΝ EGFR ΣΤΟ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ... 76 ΠΟΣΟΤΙΚΕΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ... 76 ΣΥΣΧΕΤΙΣΕΙΣ... 89 ΔΕΥΤΕΡΟΓΕΝΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΟΙΟΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΒΛΗΤΩΝ... 90 ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΩΝ ΜΕ ΤΟΝ EGFR ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ... 97 ΣΥΖΗΤΗΣΗ...101 ΈΚΦΡΑΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ ΣΤΟΝ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ ΚΑΙ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΣΤΑΔΙΟ ΤΗΣ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗΣ... 102 ΙΣΟΡΡΟΠΙΑ ΠΡΟ- ΚΑΙ ΑΝΤΙ-ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΟΥ VEGF ΣΤΑ ΔΙΑΦΟΡΑ ΣΤΑΔΙΑ ΤΗΣ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗΣ ΣΤΟΝ ΚΠΕ... 104 ΔΙΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΜΗ ΔΙΑΛΥΤΕΣ (ΔΕΣΜΕΥΜΕΝΕΣ ΣΤΟΝ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟ ΧΩΡΟ) ΙΣΟΜΟΡΦΕΣ ΤΟΥ VEGF. ΣΧΕΣΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΟΥΣ, ΜΕ ΚΛΙΝΙΚΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΥΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ... 107 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...112 ΚΥΡΙΟ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ... 112 ΔΕΥΤΕΡΕΥΟΝΤΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 112 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...114 ABSTRACT...116 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...118 4

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο καρκίνος του παχέος εντέρου (ΚΠΕ) παραμένει μια από τις πρώτες αιτίες θανάτου σε άντρες και γυναίκες, ιδίως στο δυτικό κόσμο. Η πρώιμη διάγνωση, η γνώση της φυσικής ιστορίας του και κυρίως, η αναγνώριση κλινικοπαθολογικών προγνωστικών παραγόντων με σκοπό την καλύτερη και πιο ορθολογική επιλογή των ασθενών που είναι υποψήφιοι για συμπληρωματική θεραπεία και η πρόβλεψη της απάντησης στην ενδεδειγμένη φαρμακευτική αγωγή αποτελούν στοιχεία-κλειδιά για την μείωση της θνησιμότητας. Τα τελευταία χρόνια, με την συσσωρευόμενη γνώση, από πειραματικές μελέτες, που αφορά την αναγνώριση και αποσαφήνιση των μοριακών, εξελικτικών σταδίων της καρκινογένεσης στο παχύ έντερο, επιχειρούνται μελέτες μεταφοράς και εφαρμογής των δεδομένων που προέκυψαν στην κλινική πράξη. Ήδη με τον τρόπο αυτό έχουν αναπτυχθεί νέες θεραπευτικές παρεμβάσεις που αποσκοπούν στην θεραπεία, πρώιμη διάγνωση και πρόληψη του ΚΠΕ και έχουν ως αποδέκτες διάφορες κατηγορίες ασθενών. Τα παραδείγματα από τον ευρύτερο τομέα της ογκολογίας του πεπτικού είναι πολλά με πιο χαρακτηριστικά τη θεραπεία ασθενών με προχωρημένους γαστρεντερικούς στρωματικούς όγκους με αναστολείς του υποδοχέα c-kit, την μείωση των υποτροπών των αδενωμάτων του παχέος εντέρου, σε ασθενείς με οικογενή σύνδρομα πολυποδιάσεως, με χορήγηση αναστολέων της COX-2 και την θεραπεία των ασθενών με μεταστατικό ΚΠΕ με μονοκλωνικά αντισώματα που αναστέλλουν τον αυξητικό παράγοντα VEGF ή τον υποδοχέα EGFR. Στις περισσότερες από τις ανωτέρω περιπτώσεις μεταφοράς των πειραματικών δεδομένων στην κλινική πράξη, το πρώτο στάδιο ήταν η αναγνώριση μορίων με κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη ΚΠΕ και στην εξέλιξή του μέσω των σταδίων καρκινογένεσης. Τέτοια παραδείγματα μορίων-δεικτών που σχετίζονται με την γένεση και εξέλιξη διαφόρων μορφών καρκίνου αποτελούν ο EGFR (υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα) και ο VEGF (αυξητικός παράγοντας του αγγειακού ενδοθηλίου). Ο EGFR φαίνεται ότι εκφράζεται σε υψηλό ποσοστό αδενοκαρκινωμάτων του παχέος εντέρου, αλλά και προκαρκινικών βλαβών και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξή τους, ενώ ήδη έχει αποτελέσει την βάση ανάπτυξης πολλών εξειδικευμένων θεραπευτικών παρεμβάσεων που αποσκοπούν κυρίως στην αναστολή του. Οι νεότερες αυτές φαρμακευτικές ουσίες-αναστολείς του EGFR φαίνεται να έχουν ευεργετικά αποτελέσματα και στους ασθενείς με ΚΠΕ και ανήκουν σε δύο αδρές κατηγορίες, στα μονοκλωνικά αντισώματα που συνδέονται ανταγωνιστικά με τον EGFR και στους αναστολείς τύπου τυροσινοκινάσης που 5

αναστέλλουν την ενεργοποίηση μέσω φωσφορυλίωσης του ενδοκυττάριου τμήματος του EGFR. Παρά την προώθησή τους όμως, σε κλινικές μελέτες υπάρχει ασάφεια και ελλιπής γνώση σε πολλούς τομείς που αφορούν τόσο τον ακριβή μηχανισμό ενεργοποίησης του EGFR και των αντίστοιχων ενδοκυττάριων μεταβολών που αυτή προκαλεί, όσο και στον ακριβή μηχανισμό δράσης των φαρμάκων αυτών. εν είναι ακόμα γνωστή η συσχέτιση του ποσοστού έκφρασης του EGFR με την απάντηση στους φαρμακευτικούς παράγοντες που τον αναστέλλουν, καθώς διαφαίνεται πρόσφατα ότι, ιδιαίτερα τα μονοκλωνικά αντισώματα, δρουν θεραπευτικά και σε όγκους που δεν εκφράζουν EGFR. Επίσης παρόλο που υπάρχουν σαφή δεδομένα συνηγορούντα υπέρ ευεργετικής επίδρασης των μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του EGFR στον ΚΠΕ, τα αποτελέσματα από την χορήγηση των αναστολέων των τυροσινοκινασών είναι μάλλον φτωχά, όπως συνάγεται από μελέτες φάσης Ι και ΙΙ, χωρίς να υπάρχει επί του παρόντος σαφής παθοφυσιολογική εξήγηση για την έλλειψη δράσης των φαρμάκων αυτών στον προχωρημένο ΚΠΕ. Πολλοί ασθενείς με ΚΠΕ ανθίστανται στις θεραπείες αναστολής του EGFR, πιθανά λόγω μεταλλάξεων ογκογονιδίων (π.χ. KRAS) ή μέσω ανάπτυξης κυτταρικών κλώνων που υπερεκφράζουν άλλους αυξητικούς ή αγγειογενετικούς παράγοντες (π.χ. VEGF). Ο VEGF επίσης έχει μελετηθεί εκτενώς τα τελευταία χρόνια και συσχετιστεί με την πρόγνωση το στάδιο και το μεταστατικό δυναμικό του ΚΠΕ. Ειδικά ο VEGF-A και οι υποδοχείς του συμμετέχουν σε ένα σύστημα ενδοκυττάριας μετάδοσης σήματος που ευοδώνει την ανάπτυξη αγγείων γύρω από τον όγκο που αναπτύσσεται με αποτέλεσμα να παίζει κυρίαρχο ρόλο στην επιβίωσή του. Και για το σύστημα αυτό έχουν αναπτυχθεί στοχευμένες θεραπείες (μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του αυξητικού παράγοντα, αναστολείς του υποδοχέα με ιδιότητες αναστολέων τυροσινοκινασών) οι οποίες ήδη έχουν περάσει στην κλινική πράξη. Ωστόσο η περιπλοκότητα των συστημάτων αυτών, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους, ο επηρεασμός τους από άλλους εξω- και ενδοκυτταρικούς παράγοντες ευθύνονται για την, μέχρι τώρα, ατελή κατανόησή τους και τα αντικρουόμενα αποτελέσματα των μελετών έκφρασης, κλινικών συσχετίσεων και θεραπειών. Οι θεραπείες που στοχεύουν τα συστήματα του EGFR και VEGF έχουν αποτελέσματα επί του παρόντος μη ικανοποιητικά, δεν υπάρχουν σαφείς κλινικοεργαστηριακοί δείκτες πρόβλεψης του αποτελέσματος τους και αυτό οφείλεται κατά μεγάλο μέρος στην ελλιπή κατανόηση των μηχανισμών δράσης των μορίων που σχετίζονται με την λειτουργία των δύο συστημάτων. Επίσης, το κόστος των ανωτέρω νέων βιολογικών θεραπειών είναι αυξημένο και για τον λόγο αυτό, υπάρχει επιτακτική ανάγκη ανεύρεσης μεθόδου αναγνώρισης ομάδων ασθενών που θα ωφελούνται περισσότερο από τα φάρμακα αυτά και θα υποβάλλονται σε πραγματικά «στοχευμένη» θεραπεία. 6

Με αφετηρία τους ανωτέρω προβληματισμούς αποφασίστηκε να διερευνηθούν οι δομικές και λειτουργικές αλλαγές του υποδοχέα EGFR και του αυξητικού παράγοντα VEGF, σε προοπτικά συλλεγόμενο ιστολογικό υλικό ασθενών με ΚΠΕ ή προκαρκινικές αλλοιώσεις (αδενωματώδεις πολύποδες και ιδιοπαθείς φλεγμονώδεις παθήσεις του εντέρου). Στα πλαίσια της ίδιας μελέτης έγινε προσπάθεια να συσχετιστούν οι αλλαγές αυτές με πιθανές διαταραχές σε ενδοκυττάρια συστήματα μετάδοσης σήματος, με διαταραχές έκφρασης άλλων ογκογονιδίων και αγγειογενετικών παραγόντων και με διάφορα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά του όγκου (στάδιο, εντόπιση, μέγεθος, επιθετικότητα, έκφραση άλλων καθιερωμένων δεικτών κ.α.). Η διερεύνηση των παραπάνω αποτέλεσε τον άξονα της παρούσας διατριβής η οποία με την σειρά της αποτέλεσε ένα τμήμα του ερευνητικού προγράμματος ΠΕΝΕ, Α.Π. 583/03 Η διατριβή αυτή θα ήταν αδύνατη χωρίς την συνεργασία πολλών ατόμων τα οποία αισθάνομαι την υποχρέωση να ευχαριστήσω θερμά. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, τον επιβλέποντα Επίκουρο Καθηγητή κ. Ιωάννη Γουλή, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. ημήτριο Κολιούσκα και τον Καθηγητή κ. Πρόδρομο Χυτίρογλου για την ανάθεση και επίβλεψη του θέματος αυτής της μελέτης. Ευχαριστώ εκ βαθέων για την συμπαράσταση και την ουσιαστική βοήθεια κατά την συλλογή του υλικού, την επεξεργασία των αποτελεσμάτων και την εξαγωγή συμπερασμάτων, τον επιβλέποντα Επίκουρο Καθηγητή κ. Ιωάννη Γουλή. Σε όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής αυτής στάθηκε αρωγός και ουσιαστικός καθοδηγητής, μέσα από συνεχείς συζητήσεις, διορθώσεις, επισημάνσεις πάνω σε θέματα που προέκυψαν στη διάρκεια της μελέτης. Θερμά ευχαριστώ τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. ημήτριο Κολιούσκα για τις παρατηρήσεις του σε σημαντικά θέματα που αναλύθηκαν κατά την διεξαγωγή των συμπερασμάτων και την πάντοτε ουσιαστική διάθεση να με βοηθήσει στις διάφορες φάσεις της εργασίας. Ο Καθηγητής κ. Πρόδρομος Χυτίρογλου, συνεισέφερε σημαντικά με τις επισημάνσεις, διορθώσεις και την συνεχή παρότρυνση κατά την διεξαγωγή της εργασίας και τον ευχαριστώ επίσης θερμά. Ευχαριστώ και τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς επιτροπής, τον Καθηγητή κ. Γεώργιο Φούντζηλα, τον Καθηγητή κ. Ευάγγελο Ακριβιάδη, τον Λέκτορα κ. Γεώργιο Γερμανίδη για την για την αµέριστη συµπαράσταση κι εµπιστοσύνη που µου έδειξαν κατά την διάρκεια της συνεργασίας µας. Ιδιαίτερα, όμως, ευχαριστώ την κ. Βασιλική Κωτούλα, Επ. Καθηγήτρια στην έδρα της Παθολογικής Ανατομικής και επισητμονικά υπέυθυνη του ΠΕΝΕ 583/03, στην οποία οφείλεται ουσιαστικά η πραγματοποίηση της παρούσας διατριβής, καθώς ήταν 7

ο κύριος εμπνευστής του θέματος αλλά και της μεθοδολογίας με βάση την οποία διενεργήθηκε το πειραματικό σκέλος. Η ολοκλήρωση της μελέτης ήταν αδύνατη χωρίς την καθοδήγηση και ουσιαστική συμβολή της, ιδίως σε ότι αφορά την ανάπτυξη και διεκπεραίωση των εργαστηριακών μεθόδων. Αποτέλεσε ειλικρινή αρωγό στην προσπάθειά μου, θέτοντας στην διάθεσή μου συµβουλές, γνώση, πείρα, καθώς και κάθε υλική και ηθική βοήθεια, μέσα από πολύωρες συζητήσεις και διεξοδική ανάλυση των διαφόρων παραμέτρων της μελέτης. Αισθάνομαι ευγνωμοσύνη επίσης και στο προσωπικό του μοριακού τμήματος του Εργαστηρίου Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής που με βοήθησαν αδιαμαρτύρητα σε διάφορα στάδια. Τέλος, σημαντική βοήθεια στην συλλογή και αρχική επεξεργασία του υλικού παρείχαν οι συνάδελφοι μου Γαστρεντερολόγοι από το Αντικαρκινικό Νοσοκομείο Θεαγένειο και κυρίως ο διευθυντής της Γαστρεντερολογικής κλινικής, κ. Ιωάννης Κάτσος, αλλά και συνάδελφοι από άλλες κλινικές, όπως η κ. Ευγενία Βέρρου, Αιματολόγος τους οποίους, εγκάρδια, ευχαριστώ. 8

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 9

10

Καρκίνος του παχέος εντέρου (ΚΠΕ) Επιδημιολογία Ο ΚΠΕ παραμένει μια από τις σημαντικότερες αιτίες θανάτου από καρκίνο. Υπολογίζονται περί τις 300.000 νέες περιπτώσεις και 200.000 θάνατοι στην Ευρώπη και Ηνωμένες Πολιτείες, κάθε χρόνο (2-3). Παγκοσμίως, ο ΚΠΕ αποτελεί την τέταρτη συχνότερη κακοήθη νόσο, με περίπου 1.023.000 νέες περιπτώσεις και 529.000 θανάτους κάθε χρόνο (3). Παρόλο που η 5-ετής επιβίωση ανέρχεται στο 90% όταν διαγιγνώσκεται σε πρώιμο στάδιο, σε ποσοστό άνω του 60% η διάγνωση γίνεται όταν ο καρκίνος έχει ήδη επεκταθεί σε εγγύς ή απομακρυσμένα όργανα. Φυσική ιστορία - παθοφυσιολογία Οι περισσότεροι καρκίνοι του παχέος εντέρου αναπτύσσονται από προϋπάρχοντες αδενωματώδεις πολύποδες και οι ακριβείς γενετικές και παθοφυσιολογικές αλλαγές που συνοδεύουν και συχνά ευθύνονται για την σταδιακή εξέλιξη από τον πολύποδα στο αδενοκαρκίνωμα είναι σε μεγάλο βαθμό αποσαφηνισμένες. Οι κληρονομικές μορφές ΚΠΕ (οικογενής πολυποδίαση και κληρονομικός μη πολυποδιασικός ΚΠΕ) είναι παθήσεις με σαφή μοριακό μηχανισμό καρκινογένεσης, που οφείλονται σε κληρονομούμενη (germ line) μονογονιδιακή αλλαγή, αλλά αποτελούν μικρό ποσοστό των περιστατικών ΚΠΕ. Στην πλειονότητα των περιστατικών ΚΠΕ δεν αναγνωρίζεται σαφής κληρονομικότητα. Για την παθογένεια της ογκογένεσης στις σποραδικές αυτές περιπτώσεις αναπτύσσονται θεωρίες μοριακών μηχανισμών που σε γενικές γραμμές περιλαμβάνουν σταδιακά συσσωρευμένες γονιδιακές αλλαγές και διαταραχές των ρυθμιστικών μηχανισμών διατήρησης της ακεραιότητας του γονιδιώματος που οδηγούν σε μετατροπή του φυσιολογικού επιθηλίου του παχέος εντέρου σε καρκίνο. Στις αρχές του 1990 αποδείχθηκε ότι ποσοστό των ΚΠΕ αναπτύσσονται ως αποτέλεσμα ενεργοποίησης ογκογονιδίων και απενεργοποίησης ογκοκατασταλτικών γονιδίων (4). Κατοπινές έρευνες έδειξαν ότι υπάρχουν πάνω από ένας μηχανισμοί που ενέχονται για την πρόκληση μεταλλαγών σε ομάδες καθορισμένων γονιδίων με αποτέλεσμα τις διαφορετικές βιολογικές συμπεριφορές που εμφανίζουν οι όγκοι από διαφορετικούς ασθενείς. Με ιστοπαθολογικούς όρους, οι ΚΠΕ προκύπτουν από τον φυσιολογικό βλεννογόνο μέσα από μια σειρά μεταπτώσεων, ξεκινώντας στην πλειονότητά τους ως αδενώματα, μερικά από τα οποία προοδευτικά γίνονται δυσπλαστικά και στο τέλος εμφανίζονται εστίες διηθητικού καρκινώματος μέσα σε αυτά. Οι πολυσταδιακές 11

αυτές ιστοανατομικές αλλαγές συνοδεύονται από την εμφάνιση γονιδιακών μεταλλαγών που συμβαίνουν σε καθορισμένα σημεία της προοδευτικής εξέλιξης από φυσιολογικό επιθήλιο σε αδενοκαρκίνωμα. Η βασική αυτή μοριακή παθοφυσιολογική προσέγγιση έχει τα τελευταία χρόνια συμπληρωθεί, ενώ αναγνωρίζονται και εναλλακτικοί μηχανισμοί ογκογένεσης. Ωστόσο δύο είναι οι μηχανισμοί αυτοί που είναι με σαφήνεια διατυπωμένοι και προήλθαν από την διερεύνηση των μηχανισμών καρκινογένεσης στα δύο κυρίαρχα κληρονομικά σύνδρομα, στην οικογενή πολυποδίαση και στον κληρονομικό μη πολυποδιασικό ΚΠΕ: η χρωμοσωμική αστάθεια (chromosomal instability CIN) και η μικροδορυφορική αστάθεια (microsatellite instability MIN), αντίστοιχα. Η αναγνώριση αυτή καθορισμένων προκαρκινικών βλαβών και ομάδων υψηλού κινδύνου και η αποσαφήνιση των μηχανισμών εξέλιξης από τον πολύποδα στην ανάπτυξη του καρκίνου και την εμφάνιση απομακρυσμένων μεταστάσεων, οδήγησε στην ανακάλυψη μοριακών δεικτών πρώιμης διάγνωσης και πρόβλεψης της επιθετικότητας αλλά και μορίων-στόχων για παρεμβάσεις πρόληψης και θεραπείας. Θεραπεία Στα τελευταία έτη αποδείχθηκε ο σημαντικός ρόλος της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας στον ΚΠΕ, ιδίως στους ασθενείς με επέκταση της νόσου σε περιοχικούς λεμφαδένες. Η ανάγκη αυτή χορήγησης συμπληρωματικής θεραπείας μετά από «μακροσκοπική» εκτομή του όγκου έκανε αναγκαία την ανακάλυψη δεικτών πρόβλεψης της συμπεριφοράς, ευαισθησίας στα χημειοθεραπευτικά φάρμακα και, γενικά, δεικτών επιλογής των κατάλληλων ασθενών, υποψηφίων για συμπληρωματική χημειοθεραπεία. Επί του παρόντος η επιλογή αυτή γίνεται με βάση κυρίως παθολογοανατομικά κριτήρια σταδιοποίησης (σύστημα σταδιοποίησης κατά Astler-Coller ή κατά ΤΝΜ) ενώ σημαντικοί είναι και επιπρόσθετοι «προβλεπτικοί» παθολογο-ανατομικοί δείκτες, όπως ενδείξεις διήθησης αιμοφόρων αγγείων ή λεμφαγγείων, ο βαθμός διαφοροποίησης, η συνοδεύουσα φλεγμονώδης αντίδραση κλπ (5). Μελετώνται επίσης διάφοροι μοριακοί δείκτες που πιθανά βοηθούν στην επιλογή ασθενών με υψηλό κίνδυνο υποτροπής, όπως επίσης και δείκτες πρόβλεψης απάντησης σε συγκεκριμένες θεραπείες, χωρίς ως τώρα κάποιοι από αυτούς να ενσωματωθούν στην καθ ημέρα κλινική πρακτική αντιμετώπισης ασθενών με ΚΠΕ. 12

Θεραπεία προχωρημένου ή μεταστατικού ΚΠΕ - Νεότερες, στοχευμένες θεραπείες Παρά την χειρουργική εκτομή και την καλή γενικά πρόγνωση του ΚΠΕ, περίπου 20-30% των ασθενών σταδίου ΙΙ και 50-80% σταδίου ΙΙΙ θα εμφανίσουν τοπική υποτροπή ή απομακρυσμένες μεταστάσεις. Η μακροχρόνια επιβίωση στο στάδιο IV φτάνει μόνο στο 4%, γεγονός που εξηγεί την ανάγκη ανακάλυψης νέων δραστικών θεραπευτικών παραγόντων. Πρόσφατα οι επιλογές στην παρηγορική θεραπεία των ασθενών με προχωρημένη νόσο έγιναν περισσότερες με την εισαγωγή νεότερων, στοχευμένων φαρμακευτικών παραγόντων η εξέλιξη των οποίων ήταν φυσικό επακόλουθο της κατανόησης της μοριακής παθοφυσιολογίας του ΚΠΕ. Έτσι, η επιβίωση των ασθενών με μεταστατική νόσο από 6 μήνες (με μόνο υποστηρικτική αγωγή), έχει ανέλθει στους 20-21 μήνες με τους συνδυασμούς εγχυόμενης 5-Fu (IFL) με Bevacizumab, ενός μονοκλωνικού αντισώματος έναντι του Αγγειακού Ενδοθηλιακού Αυξητικού Παράγοντα (VEGF), το οποίο έχει ήδη εγκριθεί για χρήση ως πρώτης γραμμής θεραπεία στον προχωρημένο ΚΠΕ (6). Ο υπερδιπλασιασμός αυτός της επιβίωσης είναι πρωτοφανής για τα δεδομένα της θεραπείας συμπαγών μεταστατικών όγκων και οδήγησε σε ενθουσιασμό και περαιτέρω ανάπτυξη και ανακάλυψη νέων βιολογικών «στοχευτικών» φαρμάκων με κύριους στόχους υποδοχείς της μεμβράνης των κυττάρων των όγκων του παχέος (EGFR) ή κυκλοφορούντες αυξητικούς και αγγειογενετικούς παράγοντες (VEGF) (7). εξής: Η μέχρι τώρα εμπειρία από τους νεότερους βιολογικούς παράγοντες είναι η Βιολογικοί παράγοντες που στοχεύουν στον EGFR Cetuximab Το Cetuximab (erbitux - C225, IMC-C225) είναι χιμαιρικό αντίσωμα που παρασκευάζεται από την συνένωση τμημάτων από την μεταβλητή (variable) περιοχή των αντισωμάτων μυός που προέρχονται από την κυτταρική σειρά μυελώματος 225 (myeloma cell line 225) με τμήματα παράγωγα του ανθρωπίνου γονιδίου της σταθερής περιοχής της ανοσοσφαιρίνης G (immunoglobulin G constant region gene segment). Η μεταβλητή περιοχή είναι ειδικά σχεδιασμένη ώστε να αναστέλλει την περιοχή σύνδεσης του συνδέτη στον υποδοχέα EGFR (8). Λειτουργεί ως μόριο που συνδέεται ανταγωνιστικά με τον ειδικό συνδέτη, τον EGF (5-10 μεγαλύτερη συνάφεια από τον EGF) στην εξωκυττάρια περιοχή του υποδοχέα EGFR. Η σύνδεση αυτή οδηγεί κυρίως σε μείωση της έκφρασης του EGFR με άγνωστο επακριβή μηχανισμό, εν μέρει εξηγούμενο από την παρατηρούμενη ενδοκυττάρωση του υποδοχέα που 13

ακολουθεί την ανταγωνιστική σύνδεση του cetuximab με τον EGFR. Με αυτόν τον τρόπο αναστέλλονται ενδοκυττάριες οδοί μετάδοσης σήματος, καθοριστικές για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όπως οι Ras-Raf-MAP, phosphatidylinositol 3- kinase, AKT, JAK/STAT, και η οδός της πρωτεϊνικής κινάσης C. Η αναστολή αυτών των οδών ακολουθείται από αναστολή του κυτταρικού κύκλου σε φάση G1 μέσω υποφωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης Rb, ενεργοποίηση προ-αποπτωτικών μορίων, καταστολή της έκφρασης του VEGF και αναστολή του μεταστατικού δυναμικού των κυττάρων μέσω μειωμένης παραγωγής μεταλλοπρωτεϊνασών (9). Εκτός των ανωτέρω, φαίνεται ότι το cetuximab μειώνει την εξαρτώμενη από τον EGFR ικανότητα επιβίωσης των κυττάρων μετά από επίδραση κυτταροτοξικών ή ακτινοβολίας, με αποτέλεσμα να παρατηρείται ενίσχυση της in vitro επίδρασης διαφόρων χημειοθεραπευτικών (doxorubicin, cisplatin, paclitaxel, docetaxel, gemcitabine) και της ακτινοβολίας σε ποικιλία καρκινικών ανθρωπίνων κυτταρικών σειρών (10-11). Το φάρμακο εγκρίθηκε σύντομα από το FDA, βάση μελετών φάσης ΙΙ και τυχαιοποιημένων φάσης ΙΙ, οι οποίες έδειξαν το cetuximab προκαλεί θετικές αποκρίσεις σε ασθενείς με ΚΠΕ ακόμα και ως μονοθεραπεία, αλλά ειδικά όταν συνδυάζεται με καμπτοθηκίνη (12-13). Ειδικά στην μελέτη των Cunningham και συνεργατών, η χορήγηση cetuximab σε ασθενείς με μεταστατικό ΚΠΕ και προηγούμενη αποτυχία στην θεραπεία με καμπτοθηκίνη οδήγησε σε εμφάνιση σημαντικής βελτίωσης στον έλεγχο της νόσου (ποσοστά απάντησης 10,8 και 22,9% για την χορήγηση του cetuximab ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με καμπτοθηκίνη, αντίστοιχα) και σε βελτίωση του μέσου χρόνου μέχρι την επιδείνωση της νόσου (1,5 και 4,1 μήνες για την μονοθεραπεία και τον συνδυασμό, αντίστοιχα). Ωστόσο, επί του παρόντος στοιχεία από μεγάλες μελέτες φάσης ΙΙΙ με την ένδειξη αυτή (προηγουμένως θεραπευμένοι, ανθεκτικοί μεταστατικοί ΚΠΕ) δεν υπάρχουν. Οι πιθανοί μηχανισμοί εξήγησης της υποβοήθησης της δράσης της καμπτοθηκίνης από το cetuximab είναι η ευόδωση της απόπτωσης και η μείωσης της ενδοκυττάριας κάθαρσης της καμπτοθηκίνης. Αξιοσημείωτη παρατήρηση της μελέτης των Cunningham και συνεργατών, που σχολιάστηκε και από τους ίδιους τους συγγραφείς ήταν η έλλειψη συσχέτισης της αποτελεσματικότητας του cetuximab με το ποσοστό έκφρασης του EGFR. Ακολούθησαν σποραδικές αναφορές απάντησης ασθενών με μεταστατικό ΚΠΕ, χωρίς ανοσοϊστοχημική έκφραση EGFR στα κύτταρα των όγκων τους, στην χορήγηση cetuximab ακόμα και σαν μονοθεραπεία. Oι Chung και συνεργάτες αναλύοντας αναδρομικά τα δεδομένα χορήγησης, σε εκτός μελέτης πλαίσια, του cetuximab σε ασθενείς που δεν εξέφραζαν τον EGFR παρατήρησαν αντικειμενικές απαντήσεις σε 4 από τους 16 ασθενείς που είχαν λάβει θεραπεία (14). 14

Φαίνεται λοιπόν, ότι παρόλο που αρχικά το cetuximab (και τα άλλα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του EGFR) πληρούσε τις προϋποθέσεις και αποτελούσε παράδειγμα πραγματικά «στοχευμένης» θεραπείας, οι αναδυόμενες κλινικές πληροφορίες διαψεύδουν αυτόν τον χαρακτηρισμό. Η ως τώρα χρησιμοποιούμενη μέθοδος επιλογής ασθενών που μπορούν να λάβουν θεραπεία με νέους βιολογικούς παράγοντες που να στοχεύει στον EGFR, δηλαδή η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του υποδοχέα αυτού, είναι μάλλον λανθασμένη. Οι πιθανοί λόγοι της έλλειψης προγνωστικής και προβλεπτικής στην απάντηση στην θεραπεία, αξίας της έκφρασης του EGFR είναι διάφοροι (πίνακας 1). Η εφαρμογή ανοσοϊστοχημικών μεθόδων σε αρχειακό υλικό ίσως να εμφανίζει εν γένει αδυναμίες λόγω της πρωτεϊνικής αποδόμησης του υποδοχέα, μετά την πάροδο χρόνου ή λόγω κακών χειρισμών κατά την μονιμοποίηση. Επίσης συχνά οι μεταστατικές εστίες εκφράζουν τον EGFR σε διαφορετικό βαθμό από τους πρωτοπαθείς όγκους και η προγνωστική αξία της ανίχνευσης του EGFR μπορεί να βελτιωθεί με την κατά ρουτίνα εφαρμογή της και σε βιοπτικό υλικό από τις μεταστατικές εστίες. Ποσοστό έκφρασης του υποδοχέα Μεταλλάξεις του υποδοχέα, τροποποιήσεις μετά την μεταγραφή ιαφορετική έκφραση στις μεταστατικές εστίες Ετεροδιμερισμός με συγγενείς υποδοχείς Αλληλεπίδραση με άλλους αυξητικούς παράγοντες ιασταυρούμενες ενδοκυττάριες οδοί μετάδοσης σήματος Αυτοκρινής υπερέκκριση συνδέτη Απώλεια ή αλλαγή του γονιδίου στόχου ή/και της πρωτεΐνης στόχου στα καρκινικά κύτταρα Απώλεια/απενεργοποίηση μορίων μετάδοσης ενδοκυτταρίου σήματος Επανενεργοποίηση οδών μετάδοσης σήματος με μηχανισμούς ανεξάρτητους του EGFR: - διαφορετικοί υποδοχείς αυξητικών παραγόντων (IGF-I) - οδός PTEN-PI3K-AKT - οδός Raf-ras-MEK-ERK - υπερπαραγωγή αγγειογενετικών παραγόντων (VEGF) Μοριακές αλλαγές στα καρκινικά κύτταρα που επηρεάζουν την πρόσληψη του αντι-egfr παράγοντα Πίνακας 1: Πιθανοί λόγοι αντίστασης θεραπείες που στοχεύουν στον EGFR (15-16) ιαφαίνεται πάντως ότι η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου δεν εξαρτάται μόνον από την ποσοτική έκφραση του EGFR και αυτός είναι ο πιθανότερος λόγος της αποτυχίας της χρήσης του ως απόλυτου δείκτη πρόβλεψης απάντησης στην θεραπεία. Θα πρέπει να καθοριστεί ποιες υπο-ομάδες όγκων εξαρτώνται από την λειτουργία του EGFR και ποιος είναι ο ακριβής ρόλος των αλλαγών σε μόρια-μέλη της ενδοκυττάριας συνέχειας μετάδοσης του σήματος. Επίσης ποιος είναι ο ρόλος 15

των μεταλλάξεων του εξωκυττάριου τμήματος του μορίου (παρόλο που δεν έχουν ακόμα περιγραφεί τέτοιες στον ΚΠΕ) και των μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων του μορίου. Ίσως επίσης καλύτερος τρόπος πρόβλεψης της απάντησης να είναι η ανίχνευση των αντιγράφων του γονιδίου του EGFR (EGFR copy number) όπως αυτή εκτιμάται με την χρήση ειδικών μεθόδων in situ υβριδισμού (FISH), αφού από πρόσφατη μελέτη ο αριθμός των αντιγράφων σχετίζεται καλά με την απάντηση στη θεραπεία(17). Επίσης ο EGFR μπορεί να ετεροδιμερίζεται με άλλους υποδοχείς με ιδιότητες τυροσινοκινασών και να αλληλεπιδρά με άλλους υποδοχείς της μεμβράνης όπως ο υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα ομοιάζοντος την ινσουλίνη (Insulinelike Growth Factor Receptor) οι οποίοι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση του παχέος εντέρου (18-19). Η ενεργοποίηση του EGFR οδηγεί σε φωσφορυλίωση ενδοκυττάριων μορίων που συμμετέχουν σε περισσότερα του ενός ενδοκυττάρια συστήματα μετάδοσης σήματος, δημιουργώντας πολύπλοκα δίκτυα αλληλεπίδρασης, ενώ η αυτοκρινής επίδραση του ίδιου του EGF στον υποδοχέα φαίνεται να αναστέλλει εν μέρει την δράση των μονοκλωνικών αντισωμάτων και ιδιαίτερα του cetuximab, γεγονός που ίσως να εξηγεί την διαφορετική απάντηση ασθενών με παρόμοια ποσοτική έκφραση EGFR στην φαρμακευτική αναστολή του. Ενδέχεται επίσης η αιτία μη απάντησης στην θεραπεία με cetuximab να είναι η επιλογή κλώνων που υπερεκφράζουν διαφορετικές ογκοπρωτεΐνες ή αναπτύσσουν τρόπους επιβίωσης ανεξάρτητους από την οδό EGFR (απουσία ενίσχυσης του EGFR, απώλεια PTEN, μεταλλάξεις BRAF, υπερέκφραση VEGF) (πίνακας 1) (16, 20-23). Τέλος, τα τελευταία χρόνια αποδείχθηκε ότι η ύπαρξη μεταλλαγμένου γονιδίου ras, είναι κακός προγνωστικός δείκτης απάντησης στην θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα και η γνώση αυτή εφαρμόζεται σήμερα στην επιλογή των ασθενών (24) (ο μηχανισμός ανάπτυξης αντίστασης στην θεραπεία μέσω του μεταλλαγμένου ras αναπτύσσεται παρακάτω). Panitumumab Το Panitumumab (ABX-EGF) είναι πλήρως ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα που επίσης στοχεύει στον EGFR. Η πρώτη μελέτη φάσης ΙΙ έδειξε αποτελέσματα παρόμοια με αυτά του cetuximab, δηλαδή περίπου 10% ποσοστό απάντησης όταν χορηγείται μόνο του σε ασθενείς με μεταστατική νόσο και πιθανά μικρότερα ποσοστά παρενεργειών, κυρίως αλλεργικών αντιδράσεων (25). Πιο πρόσφατες μελέτες φάσης ΙΙ και φάσης ΙΙΙ (σε σύγκριση με υποστηρικτική θεραπεία σε ασθενείς με ανθεκτικούς στην κλασσική χημειοθεραπεία όγκους ΚΠΕ) έδειξαν παρόμοια αποτελέσματα, δηλαδή ποσοστά απάντησης από 9 ως 10% (26-27). Επί 16

του παρόντος δεν υπάρχουν μελέτες φασης ΙΙ ή ΙΙΙ συνδυασμού του panitumumab με κλασσικά χημειοθεραπευτικά. Gefitinib-erlotinib Το gefitinib (Iressa - ZD-1839), όπως και το erlotinib (Tarceva - OSI- 774) αποτελούν νέους βιολογικούς παράγοντες με ικανότητα αναστολής των κυτταρικών υποδοχεών με δράση κινασών της τυροσίνης και ανήκουν σε ευρύτερη οικογένεια πρόσφατα αναπτυχθέντων μικρών μορίων με εύρος θεραπευτικών στόχων κυρίως σε διακυτταρικούς υποδοχείς με ικανότητα ενεργοποίησης του ενδοκυττάριου τμήματός τους μέσω φωσφορυλίωσης. Οι υποδοχείς αυτοί και η ενεργοποίησή τους διαδρματίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση διαφόρων τύπων ανθρωπίνων όγκων. Και τα δύο φάρμακα ανήκουν στις ανιλινο-κιναζολίνες (anilino-quinazolines), χορηγούνται per os και εμφανίζουν εκλεκτική, αναστρέψιμη αναστολή του τμήματος του EGFR με ιδιότητες τυροσινοκινάσης. Οι in vitro επιδράσεις των φαρμάκων αυτών είναι κυρίως κυτταροστατικές όταν χορηγούνται μόνα τους (28). Με δεδομένη την υπερέκφραση του EGFR σε ποικιλία ανθρώπινων όγκων και την ανεύρεση ενεργοποιητικών μεταλλάξεων του υποδοχέα αυτού σε συγκεκριμένους όγκους, οι αναστολείς αυτοί δοκιμάστηκαν ευρέως, τα τελευταία έτη σε κλινικές μελέτες. Ειδικότερα, το gefitinib μετά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα χορήγησής του σε ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα (ΜΜΚΠ), στα πλαίσια μελέτης φάσης Ι, δέχτηκε ταχεία έγκριση από το Food and Drug Administration (FDA) των Ηνωμένων Πολιτειών, τον Μάιο του 2003, για χορήγησή του σε ασθενείς με ΜΜΚΠ, με όγκους ανθεκτικούς σε προηγούμενη θεραπεία με συνδυασμούς docetaxel και platinum (29). Ωστόσο παρά τις αρχικές προσδοκίες για βελτίωση της επιβίωσης σε αυτή την κατηγορία ασθενών, το gefitinib δεν ανέδειξε πλεονέκτημα στην συνολική επιβίωση όταν δοκιμάστηκε σε μεγάλης κλίμακας τυχαιοποιημένες μελέτες (30). Από την άλλη το erlotinib έλαβε έγκριση τον Νοέμβριο του 2004 στις ΗΠΑ και τον Μάρτιο 2005 στην Ελβετία μετά από ενθαρρυντικά αρχικά αποτελέσματα, τα οποία όμως δεν επιβεβαιώθηκαν σε μεταγενέστερες τυχαιοποιημένες μελέτες φασης ΙΙΙ (31). Μετά την διαπίστωση της αποτελεσματικότητας της αντι-egfr θεραπείας με μονοκλωνικά αντισώματα στον ΚΠΕ, ακολούθησε δοκιμή των ανασταλτών των τυροσινοκινασών, σε ασθενείς με μεταστατική νόσο. Προηγουμένως, in vivo και in vitro δοκιμές είχαν δείξει αποτελεσματικότητα των φαρμάκων αυτών σε ευρεία γκάμα κυτταρικών σειρών ΚΠΕ και συνεργική δράση με κλασσικά χημειοθεραπευτικά, όπως οι ταξάνες, δοξορουμπικίνη, πλατίνα, VP16 και tomudex (32). 17

υστυχώς όμως, ως τώρα μελέτες φάσης ΙΙ που έχουν περατωθεί, δυστυχώς έδειξαν μικρή ή καμία αποτελεσματικότητα της μονοθεραπείας με gefitinib ή erlotinib ή των συνδυασμών τους με κλασσικά χημειοθεραπευτικά σχήματα στον προχωρημένο ΚΠΕ. Αντίθετα σε δόσεις που κυμαίνονταν από 250 ως 750mg ανά ημέρα και ιδιαίτερα στους συνδυασμούς με κλασσικά χημειοθεραπευτικά όπως 5- φθοριουρακίλη και oxaliplatin, παρατηρήθηκε μεγάλο ποσοστό παρενεργειών όπως εξανθήματα και διάρροια, γεγονός που υποδηλώνει συνεργική κυτταροτοξική δράση ή επίταση της κυτταροτοξικότητας των κλασσικών χημειοθεραπευτικών (33-38). Η έλλειψη αποτελεσματικότητας των αναστολέων τυροσινοκινασών στον ΚΠΕ, μπορεί εν μέρει να οφείλεται στην μη ύπαρξη μεταλλάξεων του EGFR που να τον ενεργοποιούν μέσω συνεχούς αυτοφωσφορυλίωσης, στον καρκίνο αυτόν. Σε μελέτη με διερεύνηση μεταλλάξεων του EGFR σε ασθενείς με ΚΠΕ, βρέθηκε ότι αυτές εμφανιζόταν μόνο στο 1% των όγκων υποδηλώνοντας ότι το gefitinib μπορεί να είναι αναποτελεσματικό σε αυτόν τον καρκίνο αφού ο στόχος του είναι οι ενεργοποιητικές μεταλλάξεις (39). Ωστόσο σε πιο πρόσφατη μελέτη ασθενών ασιατικής καταγωγής, βρέθηκαν μεταλλάξεις στην περιοχή με ιδιότητες κινάσης στο 12%, δείχνοντας ότι μπορεί να υπάρχουν δημογραφικές διαφορές στα ποσοστά απάντησης στα φάρμακα αυτά (40). Επιπρόσθετα η μελέτες των Loeffler-Ragg και συνεργατών (41) και των Ogino (42) και συνεργατών δείχνουν ότι ακόμα και στον ΚΠΕ κάποιοι πρωτεϊνικοί, ενδοκυττάριοι ή γονιδιακοί δείκτες μπορούν να προβλέψουν κατά ένα μέρος την απάντηση στην θεραπεία με αναστολείς τυροσινοκινασών. Ειδικά η δεύτερη μελέτη (42) έδειξε ότι, όπως και στην περίπτωση των μονοκλωνικών αντισωμάτων, η έκφραση του EGFR δεν σχετίζεται με την αποτελεσματικότητα των φαρμάκων αυτών σε αντίθεση με άλλους γονιδιακούς δείκτες, όπως η έκφραση του p21 και οι μεταλλάξεις του p53 που πιθανά να δηλώνουν συμμετοχή στην ογκογένεση, άλλων συστημάτων μετάδοσης σήματος, διαφορετικών από το σύστημα του EGFR. Συμπερασματικά και από τα πρώιμα αποτελέσματα της χρήσης των αναστολέων των τυροσινοκινασών στην θεραπεία του ΚΠΕ, φαίνεται ότι οι παράγοντες αυτοί είναι λιγότερο δραστικοί από τα μονοκλωνικά αντισώματα. Η απλούστερη εξήγηση είναι ότι τα μονοκλωνικά αντισώματα δρουν μέσω ανοσολογικών ή άλλων, ανεξάρτητων του EGFR μηχανισμών, όπως για παράδειγμα μέσω ενίσχυσης της αντισωματο-εξαρτώμενης κυτταροτοξικότητας μονοκυττάρων ή κυττάρων ΝΚ (Natural Killer cells), ιδιότητες που δεν εμφανίζουν τα φάρμακα που αναστέλλουν την περιοχή της κινάσης του EGFR. 18

Μελέτες φάσης II με αναστολείς τυροσινοκινασών στον ΚΠΕ (τροποποιημένο από (38) ΦΑΣΗ ΓΡΑΜΜΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΑΡ. ΑΣΘΕΝΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Gefitinib + sfolfox6 (Zampino et al., 2007) Gefitinib + FOLFOX4 (Fisher et al., 2008) GISCAD Gefitinib + FOLFOX4 (Cascinu et al., 2008) Gefitinib + FOLFOX4 (Kuo et al., 2005) II Πρώτη 56 RR-71%; SD-20% II Πρώτη 45 RR - 72% II Πρώτη 43 RR - 35%; SD - 28% II εύτερη 27 RR - 33%; SD - 44% Erlotinib + XELOX (Meyerhardt et al., 2006) II εύτερη 32 RR - 25%; SD - 44% Erlotinib (Townsley et al., 2006) II < εύτερη 39 RR - not reported; SD - 39% Gefitinib (Rothenberg et al., II > εύτερη 115 RR - 1% 2005) Gefitinib + FOLF1RI (Veronese II > εύτερη 13 RR - 8%; SD - 54% et al., 2005) Gefitinib + Irinotecan (Chau et al, 2007) I/II > εύτερη 27 RR - 11% Gefitinib + Oxaliplatin (Kindler et I/II < Τρίτη 14 No response al., 2005) Βιολογικοί παράγοντες που στοχεύουν σε μόρια που σχετίζονται με τον EGFR (VEGF-VEGFR) Bevacizumab Μετά την αποσαφήνιση του ρόλου της αιμάτωσης και νεοαγγειογένεσης στην ανάπτυξη, διασπορά και μεταστατικό δυναμικό των συμπαγών όγκων ανακαλύφθηκαν κυκλοφορούντες αυξητικοί παράγοντες, όπως ο VEGF, ο βασικός ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας (bfgf) και ο μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας β (TGF-β) με ιδιότητες προ-αγγειογενετικών ουσιών που ευοδώνουν την ανάπτυξη ενός χαώδους δικτύου αγγείων με αποτέλεσμα την αυξημένη ικανότητα επιβίωσης και ανάπτυξής των καρκινικών κυττάρων (43). Η παρατήρηση ότι, ιδιαίτερα ο VEGF υπερεκκρίνεται σε όγκους παχέος εντέρου και συσχετίζεται με αυξημένα ποσοστά υποτροπών και φτωχή επιβίωση, οδήγησε στην ανάπτυξη φαρμάκων με στόχο τον παράγοντα αυτό και κυρίως μονοκλωνικών αντισωμάτων όπως το Bevacizumab. Τα αποτελέσματα δύο τουλάχιστον μελετών φάσης ΙΙΙ υποστηρίζουν την χρήση του Bevacizumab σε συνδυασμό με καθιερωμένα χημειοθεραπευτικά, τόσο στην θεραπεία 1ης όσο και 2ης γραμμής στον μεταστατικό ΚΠΕ. Η πρώτη των Hurwitz και συνεργατών συνέκρινε την συνεχή έγχυση φθοριουρακίλης και 19

λευκοβορίνης (IFL) με ή χωρίς συνχορήγηση Bevacizumab και βρήκε τον δεύτερο συνδυασμό δραστικότερο καθώς ανέδειξε αύξηση της επιβίωσης (από 15,6 σε 20,3 μήνες), της χρόνου χωρίς επιδείνωση της νόσου (από 6,2 σε 10,6 μήνες) και καλύτερα ποσοστά απάντησης (44,8 έναντι 34,8%) (44). Η δεύτερη του Eastern Cooperative Oncology Group (E3200) μελέτησε την δραστικότητα του Bevacizumab στα πλαίσια θεραπείας 2ης γραμμής μετά από αποτυχία σε προηγούμενη θεραπεία με irinotecan και 5-Fu και έδειξε ότι η συνχορήγηση Bevacizumab οδηγεί σε σημαντική αύξηση της συνολικής επιβίωσης (από 10,7 σε 12,5 μήνες) (45). Παρά τον αρχικό ενθουσιασμό, σύντομα ανακαλύφθηκε ότι μεγάλο ποσοστό ασθενών με ΚΠΕ εμφανίζουν όγκους ανθεκτικούς στην αναστολή του VEGF με το bevacizumab, ενώ τα ποσοστά εμφάνισης παρενεργειών είναι υψηλά. Οι συχνότερες από αυτές είναι η εμφάνιση υπέρτασης, γαστρεντερικές διατρήσεις, προβλήματα επούλωσης τραυμάτων και θρομβοεμβολικά επεισόδια (46). Παρά την ευρεία χρήση του bevacizumab στον μεταστατικό ΚΠΕ και την κατανόηση του μηχανισμού δράσης του σε μεγάλο μέρος, δεν είναι γνωστοί οι μηχανισμοί πρόκλησης των παρενεργειών. Επίσης η βιβλιογραφία σε σχέση με τους μηχανισμούς ανάπτυξης αντίστασης στην θεραπεία με bevacizumab είναι ελάχιστη (47). Πιθανότατα, σημαντικός λόγος που μερικοί όγκοι ανθίστανται στην αναστολή της σύνδεσης VEGF-VEGFR1 και 2 από το bevacizumab είναι η υπερέκφραση της αντι-αγγειογενετικής ισομορφής VEGF xxxb σε βραδέως αναπτυσσόμενους καρκίνους, η οποία αποδεδειγμένα συνδέεται με την ίδια ικανότητα με το bevacizumab και πιθανά προκαλεί μείωση της δραστικότητάς του (1). Το θέμα αυτό αναλύεται περισσότερο παρακάτω, στο κεφάλαιο «VEGFxxx η οικογένεια προ-αγγειογενετικών πεπτιδίων». Άλλοι ανασταλτές του VEGF Παράγοντας Στόχος Φάση ανάπτυξης Ειδικά anti-vegf αντισώματα Bevacizumab (Avastin) VEGF-A III IMC-C1121b VEGFR-2 I-II VEGF Trap VEGF, PlGF, VEGF-B I Παράγοντες που στοχεύουν τους υποδοχείς VEGF (αναστολείς τυροσινοκινασών) Vatalanib (PTK787/ZK 222584) VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFR-β, III c-kit Sorafenib (BAY 43-9006) VEGFR-2, PDGFR-β, FLT3, c-kit, Raf III Sunitinib (SU11248) VEGFR2, PDGFR-β, FLT3, c-kit III Semaxanib (SU5416) VEGFR1, VEGFR2 AZD2171 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFR-β, I-II c-kit CEP-7055 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 I-II CHIR258 VEGFR1, VEGFR2, FGFR1, FGFR3 I-II CP-547632 VEGFR2 I-II GW786034 VEGFR2 I-II OSI-930 VEGFR, c-kit I-II ZK-CDK VEGFRs, PDGFR, CDKs I-II 20

AG013736 VEGFR, PDGFR-β, c-kit I-II AMG706 VEGFR1, VEGFR2, PDGFR-β, c-kit I-II KRN-951 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFR-β, I-II c-kit BMS-582664 VEGFR2, FGFR I-II XL999 FGFR, VEGFRs, PDGFR, FLT3 I-II vandetanib (Zactima - ZD6474) VEGFR2, EGFR, RET I-II AEE788 VEGFR1, VEGFR2, EGFR I-II Antisense ολιγονουκλεοτίδια Veglin (VEGF-AS) VEGF, VEGF-C, VEGF-D I Πίνακας 2 Θεραπείες με παράγοντες που αναστέλλουν τον VEGF και φάση δοκιμής τους (48). VEGF Trap. Η VEGF Trap είναι μια χιμαιρική πρωτεΐνη που συνδυάζει το τμήμα Fc της ανθρώπινης IgG1 με τις κυρίαρχες εξωκυττάριες περιοχές των VEGFR1 and VEGFR2 που συνδέονται με τον VEGF. H VEGF Trap συνδέεται σθεναρά με τον VEGF-A και εξουδετερώνει όλες τις κυκλοφορούσες ισομορφές του. Παρόλο που το φαρμακοκινητικό του προφίλ είναι παρόμοιο με αυτό άλλων μονοκλωνικών αντισωμάτων, η VEGF Trap συνδέεται με τον VEGF-A 100 με 1000-φορές πιο σταθερά από τα μέχρι τώρα μελετημένα μονοκλωνικά αντισώματα. Επί του παρόντος υπάρχουν μόνο μελέτες φάσης Ι για προσδιορισμό της δοσολογίας και τοξικότητας με καλό προφίλ τοξικότητας. Σε μικρή μελέτη 30 ασθενών με συμπαγείς όγκους, κανένας ασθενής δεν παρουσίασε αντικειμενική απάντηση, αλλά στο 46,7% η νόσος παρέμεινε σταθερή (SD) για 10 εβδομάδες (49). Semaxinib (SU5416) Εναλλακτική αντιαγγειογενετική προσέγγιση στην θεραπεία του ΚΠΕ είναι η καταστολή αμφότερων καρκινικών και ενδοθηλιακών κυττάρων με χρήση μικρών μορίων αναστολέων των τυροσινοκινασών που αντιτίθενται στην δράση συγγενικών υποδοχέων. Πολλοί τέτοιοι αναστολείς που στοχεύουν τον VEGFR δοκιμάστηκαν σε μελέτες φάσης ΙΙΙ σε συνδυασμό με παρηγορητική θεραπεία σε μεταστατικό ΚΠΕ. Το πρώτο μόριο που εισήχθη σε μελέτες, το Semaxinib, στοχεύει σε πολλαπλούς υποδοχείς (VEGFR-1, VEGFR-2 VEGFR-3, και PDGFR-β), αποσύρθηκε σύντομα λόγω έλλειψης υπεροχής έναντι της κλασσικής χημειοθεραπείας και κυρίως λόγω αυξημένης τοξικότητας (50). Sunitinib (SU11248) Το sunitinib είναι ένας από του στόματος αναστολέας τυροσινοκινάσης που στοχεύει και αναστέλλει τους υποδοχείς PDGFR,VEGFR-1,2 και 3, c-kit και FLT-3 (51). Μετά από ενθαρρυντικά αποτελέσματα μελετών φάσης ΙΙΙ, το φάρμακο εγκρίθηκε από το FDA το 2006 για θεραπεία στρωματικών όγκων και προχωρημένου καρκίνου νεφρού 21

(52). Αναμένονται αποτελέσματα μελετών φάσης ΙΙ σε ασθενείς με προχωρημένο ΚΠΕ. Sorafenib. Το Sorafenib (BAY 43-9006) είναι αναστολέας των raf κινασών και στοχεύει επίσης στον VEGFR-2 και PDGFR και με τον τρόπο αυτό αναφέρεται ότι έχει διπλή δράση στην αγγείωση των όγκων. εδομένα υποστηρίζουν ότι η μονοθεραπεία με Sorafenib είναι αποτελεσματική σε όγκους με wt και m-kras ή με μεταλλαγμένο B-raf. Το σκεύασμα αυτό έχει δείξει καλά αποτελέσματα ως μονοθεραπεία σε μελέτες φάσης Ι και ΙΙ σε διάφορους συμπαγείς όγκους, ενώ συνεχίζονται μελέτες φάσης ΙΙ σε ασθενείς με ΚΠΕ και καρκίνο μαστού (53). Vatalanib (PTK787/ZK 222584) Ένα άλλο παρόμοιο μόριο που μελετήθηκε είναι το vatalanib (PTK787/ZK222584), το οποίο αναδεικνύει κατασταλτική επίδραση σε πολλαπλούς υποδοχείς, όπως οι VEGFR-1 και VEGFR-2, αλλά και σε άλλους συγγενικούς, όπως ο PDGFR-β και ο c-kit. Επί του παρόντος, το valatinib έχει δοκιμαστεί σε μελέτες φάσης Ι και ΙΙ, μαζί με FOLFOX και FOLFIRI, ως θεραπεία πρώτης γραμμής σε ασθενείς με μεταστατικό ΚΠΕ (48). Έχοντας καλό προφίλ ασφαλείας, δοκιμάστηκε και σε 2 μελέτες φάσης ΙΙΙ, στην μία ως θεραπεία πρώτης γραμμής σε μεταστατικό ΚΠΕ και στην δεύτερη ως θεραπεία διάσωσης, με FOLFOX σε ασθενείς ανθεκτικούς στην καμπτοθηκίνη, χωρίς δυστυχώς να αναδείξει όφελος σε επιβίωση και επιβίωση χωρίς νόσο (48). Vandetanib (ZD6474) Ο αναστολέας αυτός στοχεύει οδούς αμφότερες τις οδούς VEGF και EGFR, με αποτέλεσμα να αναστέλλει την VEGF εξαρτώμενη αγγειογένεση και την EGFR και RET εξαρτώμενη ανάπτυξη και επιβίωση των καρκινικών κυττάρων (54). Μάλιστα, σε προκλινικά μοντέλα έδειξε ότι καταστέλλει όγκους που έχουν αντίσταση σε αντι- EGFR θεραπευτικούς παράγοντες (55-56). Το σκεύμασμα αυτό με την διπλή δράση είναι πιθανό να υπερβεί τα προβλήματα ανάπτυξης αντίστασης στις αντι-egfr στοχευμένες θεραπείες (πίνακας 1) και ήδη δοκιμάζεται σε ασθενείς με ΚΠΕ. Στην μελέτη φάσης Ι των Michael και συν, το σκεύασμα χορηγείται σε συνδυασμό με FOLFOX-6 σε ασθενείς με μεταστατικό ΚΠΕ, ως 1 ης ή 2 ης γραμμής θεραπεία (57) και στην μελέτη φάσης Ι των Saunders και συν, χορηγείται μαζί με FOLFIRI με την ίδια ένδειξη (58). Παρά το μικρό αριθμό ασθενών και στις δύο μελέτες το Vandetanib δείχνει καλό προφίλ ασφαλείας και ήδη αναφέρθηκαν ένας ασθενής με πλήρη ύφεση, 5 με μερική απάντηση και 9 με σταθερή νόσο. 22

Συνδυασμοί βιολογικών παραγόντων με σκοπό πολλαπλή στόχευση ογκογένεσης - αγγειογένεσης Είναι από δεκαετίας γνωστό ότι η διέγερση των καρκινικών κυττάρων μέσω του συστήματος EGFR μπορεί να προκαλέσει έκφραση προαγγειογενετικών μορίων και την επαγωγή της αγγειογένεσης (59). Επιπλέον πολλές μελέτες έδειξαν ότι αναστολείς του EGFR, ιδίως μόρια με ιδιότητες αναστολέων τυροσινοκινασών, όπως το gefinitib (Iressa - ZD1839), μειώνουν την αγγειογένεση μέσω καταστολής του VEGF (60-62). Με δεδομένη την σχετικά μικρή αποτελεσματικότητα των παραγόντων που δρουν ξεχωριστά στο σύστημα EGFR και VEGF, αλλά και την εμπλοκή των δύο συστημάτων, δοκιμάζονται θεραπείες που στοχεύουν σε αμφότερες τις οδούς. Είναι γνωστό άλλωστε ότι ασθενείς με προχωρημένους ΚΠΕ και με μετάλλαξη στο γονίδιο KRAS έχουν χειρότερη απάντηση στην θεραπεία με cetuximab σε σχέση με ασθενείς που έχουν φυσιολογικό (wild type) KRAS (63-66). Από την άλλη, σε πειραματικά μοντέλα συμπαγών όγκων η μετάλλαξη του KRAS οδηγεί σε υπερέκφραση αγγειογενετικών παραγόντων όπως ο VEGF (67-68) και η αγγειογενετική αυτή «διαφυγή» θα μπορούσε να εξηγήσει εν μέρει την αντοχή των όγκων με μεταλλαγμένο KRAS στις θεραπείες που στοχεύουν μόνο τον EGFR. Η πρώτη μελέτη στην οποία ελέγχθηκε η ασφάλεια και αποτελεσματικότητα της συνδυασμένης στόχευσης με bevacizumab και cetuximab ήταν η BOND-2 (69). Στην μελέτη αυτή ο συνδυασμός bevacizumab, cetuximab και καμπτοθηκίνης είχε ως αποτέλεσμα συνολική επιβίωση 14,5 μήνες, σημαντική σε σχέση με ιστορικά controls. υστυχώς και πάλι σε πολύ πρόσφατες μελέτες, τα ενθαρρυντικά αυτά αποτελέσματα διαψεύστηκαν. Σε ασθενείς με μεταστατικό ΚΠΕ που δεν είχαν λάβει θεραπεία, ο συνδυασμός capecitabine, oxaliplatin, bevacizumab και cetuximab είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη επιβίωση και αύξηση τοξικότητας σε σύγκριση με τον κλασσικό συνδυασμό capecitabine, oxaliplatin (XELOX) και bevacizumab (70). Σε δύο μεγάλες τυχαιοποιημένες, φάσης ΙΙΙ μελέτες, την PACCE (Panitumumab Advanced Colorectal Cancer Evaluation) και CAIRO2, τα αποτελέσματα της συνδυασμένης χορήγησης παραγόντων που αναστέλλουν αμφότερους τους EGFR και VEGF ήταν απογοητευτικά. Η προσθήκη μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του EGFR στην κλασσική χημειοθεραπεία (καμπτοθηκίνη ή οξαλιπλατίνα + bevacizumab) είχε ως αποτέλεσμα ίση ή χειρότερη επιβίωση και περισσότερες, σχετιζόμενες με τη θεραπεία, επιπλοκές (71) (εικόνα 1). 23

Εικόνα 1 Αποτελέσματα μελετών PACCE και CAIRO2. Άξονας x= μέση ολική επιβίωση σε μήνες. Ox=Οξαλιπλατίνα, Iri= καμπτοθηκίνη, Bev= Bevacizumab, Pmab= Panitumumab, Cap= Capecitabine (71). Η παρατήρηση ότι η επιβίωση παραμένει ίση ή είναι χειρότερη από την αναμενόμενη από προηγούμενες μελέτες με συνδυασμό bevacizumab και κλασσικών χημειοθεραπευτικών, είναι ανεξήγητη και μη προσδοκώμενη από την μέχρι τώρα εμπειρία και τα πειραματικά δεδομένα της χορήγησης θεραπειών στοχευτικών και στα δύο μόρια (VEGF και EGFR). Ωστόσο αναδεικνύει τις ελλείψεις στην κατανόηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο συστημάτων και την ανάγκη πιο λεπτομερούς διευκρίνισης των μηχανισμών της. Για την αυξημένη τοξικότητα του συνδυασμού υπάρχουν αρκετές πιθανές εξηγήσεις, όπως η φαρμακοδυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ των παραγόντων και η επίδραση του ενός αναστολέα σε μόρια μετάδοσης σήματος του άλλου συστήματος (για παράδειγμα η χορήγηση αντι EGFR παράγοντα μπορεί να τροποποιεί τις ενδοκυττάριες οδούς μετάδοσης σήματος μέσω του VEGF ή άλλα μόρια που είναι απαραίτητα για την δραση του bevacizumab). 24

Υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) Περιγραφή του EGFR Ο EGFR, όπως προαναφέρθηκε, αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα μορίου-δείκτη που συσχετίστηκε, με τη γένεση και εξέλιξη διαφόρων μορφών καρκίνου και αποτέλεσε έναυσμα για την ανάπτυξη πολλών νεότερων θεραπειών. Από μελέτες έκφρασης προέκυψε ότι δυσλειτουργεί και εκφράζεται σε ποικιλία παρασκευασμάτων ανθρώπινων όγκων (πίνακας 3). Ειδικά στον ΜΜΚΠ εκφράζεται σε υψηλά ποσοστά (43-83%), όπως και στα γλοιώματα (60%), όπου η υπερέκφραση φαίνεται να είναι αποτέλεσμα γονιδιακής ενίσχυσης. Αυξημένη έκφραση παρατηρείται και σε υψηλό ποσοστό αδενοκαρκινωμάτων του παχέος εντέρου (25-80%) (72-73). Είδος όγκου HER1/EGFR έκφραση (%) Πλακώδες κεφαλής - τραχήλου 70-100 Μη μικροκυτταρικός καρκίνος πνεύμονα 50-90 Προστάτη 40-70 Γλοίωμα 10-50 Στομάχου 30-60 Μαστού 35-70 Παχέος 25-80 Παγκρέατος 30-50 Ωοθηκών 35-60 Πίνακας 3 συχνότητα έκφρασης του EGFR σε επιλεγμένους ανθρώπινους όγκους Ο EGFR, ανήκει στην οικογένεια υποδοχέων, γνωστών ως υποδοχείς HER ή ErbB. Και τα 4 μέλη της οικογένειας αυτής (EGFR ή ErbB1 ή HER1, ErbB2 ή HER2/neu, ErbB3 ή HER3 και ErbB4 ή HER4) είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες και ανήκουν στις κινάσες της τυροσίνης υποτύπου Ι. Το γονίδιο για τον EGFR/HER1 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 17p12.3-p12.1. Ειδικότερα ο EGFR είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη μοριακού βάρους 170 kda, αποτελούμενη από ενδομεμβρανική περιοχή με δράση κινάσης της τυροσίνης και εξωκυττάρια περιοχή σύνδεσης, της οποίας αυτοκρινείς αγωνιστές είναι ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF) και ο μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας-άλφα (TGF-α), οι οποίοι περιγράφηκαν πριν από 20 χρόνια και είναι γνωστοί ενεργοποιητές σύνθεσης DNA και πολλαπλασιασμού κυττάρων σε ποικιλία ανθρωπίνων ιστών και σε όγκους του πεπτικού. Ο ενεργοποιημένος EGFR καταλύει την μεταφορά μορίων φωσφόρου από το ATP σε ενεργό περιοχή του ενδοκυττάριου τμήματός του με ιδιότητες 25

τυροσινοκινάσης, μεσολαβώντας έτσι στην μετάδοση σήματος και πυροδοτώντας μια σειρά ενδοκυττάριων αλλαγών σε καλά ταυτοποιημένα μόρια. Οι αλλαγές αυτές προστατεύουν το κύτταρο από την απόπτωση, διευκολύνουν την διηθητική ικανότητά του και προάγουν αγγειογενετικές διεργασίες (74). ράση του EGFR Μετά την σύνδεση του συνδέτη με τον EGFR, ο τελευταίος υπό φυσιολογικές συνθήκες ομοδιμερίζεται και ο ομοδιμερισμός αυτός πυροδοτεί την φωσφορυλίωση διαφόρων ενδοκυττάριων περιοχών με ιδιότητες κινάσης της τυροσίνης. Η περαιτέρω ενεργοποίηση ενδοκυττάριων μορίων περιλαμβάνει τις τις MAP κινάσες (οδός Ras/Raf/MAPK), την πρωτεΐνη AKT και ΡΙ3Κ (οδός Phosphatidylinositol 3- kinase/akt), τις πρωτεΐνες STAT, κινάσες της οικογένειας SRC,,και την PLC-γ, προάγοντας την μεταγραφή γονιδίων που υπεισέρχονται σε κυτταρικές διεργασίες όπως διαίρεση και επιβίωση (εικόνα 2) (75). Εικόνα 2 Οδοί μετάδοσης σήματος μετά την ενεργοποίηση του EGFR και τρόπος δράσης αναστολέων (75). Έχει αποδειχθεί επίσης ότι ο EGFR μπορεί να μεσολαβεί στην ενεργοποίηση και άλλων μελών υποδοχέων της οικογένειας ErbB, διαδραματίζοντας κεντρικό 26

ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη. Από τα ενδοκυττάρια μόρια που ενεργοποιούνται στην οδό του EGFR, ειδικά η AKT είναι μια καλά χαρακτηρισμένη αντι-αποπτωτική κινάση η οποία ευνοεί την κυτταρική επιβίωση μέσω ενεργοποίησης της κινάσης IκΒ η οποία με την σειρά της εμφανίζει ρυθμιστικό ρόλο στα επίπεδα του πυρηνικού παράγοντα NF-κΒ και οδηγεί σε μεταγραφή αντι-αποπτωτικών γονιδίων όπως επίσης ανταγωνίζεται την παύση της κυτταρικής διαίρεσης που μεσολαβείται από το P21. Επιπρόσθετα η κινάση AKT μπορεί να ενεργοποιήσει την ενδοθηλιακή συνθετάση του νιτρικού οξειδίου (NO), η οποία παίζει κυρίαρχο ρόλο στην αγγειογένεση. Τέλος η ΑΚΤ μπορεί επιτρέπει την ενεργοποίηση, μέσω φωσφορυλίωσης, της ανάστροφης μεταγραφάσης της ανθρώπινης τελομεράσης και προάγει γεγονότα διήθησης και μετάστασης ενεργοποιώντας κατηγορίες μεταλλοπρωτεϊνασών (76-78). Οι οδοί μετάδοσης σήματος των MAPΚ κινασών και της ΡΙ3Κ, που επίσης διεγείρονται από τον ενεργοποιημένο EGFR έχουν συσχετιστεί με αντι-αποπτωτικές επιδράσεις σε ορισμένους τύπους κυττάρων και πρόσφατες ενδείξεις υποδηλώνουν ότι η αντι-αποπτωτική δράση των υποδοχέων ErbB οφείλεται κυρίως σε ενεργοποίηση των οδών ΡΙ3Κ/ΑΚΤ (79). Οι οδοί αυτές επηρεάζουν και άλλες πρωτεΐνες που υπεισέρχονται στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Έτσι από την μία η ενεργοποιημένη οδός MAPΚ αυξάνει την έκφραση της πρωτεΐνης Mcl-1 και από την άλλη, η οδός της ΑΚΤ ενεργοποιεί την Mdm2, πρωτεΐνη που δρα συνεργικά με την προηγούμενη (80). Αξιοσημείωτο είναι ότι ο EGFR μπορεί επίσης να ετεροδιμερισθεί με άλλα μόρια της ίδιας οικογένειας, κατά προτίμηση με τον HER2 και να απαντήσει μετά από σύνδεση και με άλλους αυξητικούς παράγοντες, εκτός των δύο ειδικών συνδετών. Οι μοριακοί αυτοί δρόμοι ενεργοποιούνται ανάλογα με την διαθεσιμότητα και ακεραιότητα των ενδοκυτταρίων συστημάτων μεταβίβασης μηνύματος, την ακεραιότητα του υποδοχέα και ίσως και των λοιπών μελών HER (81). Στην εξέλιξη των καρκινωμάτων, ο φυσιολογικός EGFR (wtegfr) δεν φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό παθογενετικό ρόλο, παρόλο που θεωρείται απαραίτητος και συμμετέχει στην δημιουργία των προκαρκινικών βλαβών. Αντίθετα, σε σημαντικό ποσοστό εγκατεστημένων καρκινικών βλαβών, όπως π.χ. στο 60% των μη μικροκυτταρικών καρκίνων πνεύμονα και το 53% των γλοιοβλαστωμάτων, παράγεται μια αποκοµένη μορφή της πρωτεΐνης (EGFRvIII) λόγω γονιδιακού ανασυνδυασμού που συμβαίνει κατά την γονιδιακή ενίσχυση του EGFR, που συχνά παρατηρείται σε τέτοιους όγκους, ή λόγω εναλλακτικού splicing. Η πρωτεΐνη αυτή αυτοφωσφορυλιώνεται διαρκώς σε ορισμένη θέση και δρα πυρηνικά. Παρόλα αυτά, η δράση του EGFRvIII φαίνεται ότι εξαρτάται, τουλάχιστον εν μέρει, και από την παράλληλη έκφραση και του wtegfr (82). Όσον αφορά τον ΚΠΕ και από κλινικά 27

δεδομένα, φαίνεται ότι η παθολογική υπερενεργοποίηση του EGFR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη όγκων (83) και πιθανά στην ανάπτυξη απομακρυσμένων μεταστάσεων (84), ενώ δεν έχουν αποσαφηνιστεί, σε αυτή την μορφή καρκίνου, οι επακριβείς δομικές και λειτουργικές αλλαγές του συστήματος του EGFR. 28

Αυξητικός παράγοντας αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF) Περιγραφή και δράση του VEGF Σταθερό χαρακτηριστικό όλων των συμπαγών όγκων είναι η ικανότητά τους να αναπτύσσουν και συντηρούν αγγειακό δίκτυο ικανό να τους προσφέρει οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά και να εξασφαλίζει την ανάπτυξή τους. Αντίθετα, σε φυσιολογικές καταστάσεις, κατά την ενήλικο ζωή, η δημιουργία νέων αγγειακών δικτύων περιορίζεται στην επούλωση τραυμάτων, ανάπτυξη του πλακούντα, μυϊκή ανάπτυξη και στην εναπόθεση λιπώδους ιστού. Η δημιουργία νέων αγγείων είναι περίπλοκη διεργασία στην οποία συμμετέχουν πάνω από 50 ανεξάρτητοι αυξητικοί παράγοντες, υποδοχείς, κυτοκίνες και ένζυμα (85) που περιλαμβάνουν τις οικογένειες VEGF, αγγειοποιητινών και εφρινών (ephrins). Εξ αυτών, κυρίαρχος αγγειογενετικός παράγοντας είναι ο VEGF που δρα στους υποδοχείς VEGF-R1 και VEGF-R2 των ενδοθηλιακών κυττάρων, όχι μόνο ως προ-αγγειογενετικός παράγοντας αλλά και ως αυτοκρινής παράγοντας επιβίωσης σε πολλά είδη καρκινικών κυττάρων, ποδοκυττάρων, αιματοποιητικών προγονικών κυττάρων, οστεοβλαστών, οστεοκλαστών και μονοκυττάρων (86). H οικογένεια των αυξητικών παραγόντων VEFG αποτελείται από 7 γλυκοπρωτεΐνες που ονομάζονται VEGF-A (ο πρώτος παράγοντας που ανακαλύφθηκε, ονομαζόμενος εφεξής ως VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, placental growth factor (PlGF) και VEGF-F(87). Τα μόρια αυτά δρουν μέσω της σύνδεσής τους με ειδικούς υποδοχείς με ιδιότητες τυροσινοκινασών. Οι υποδοχείς που μέχρι τώρα αναγνωρίστηκαν και σχετίζονται με την οικογένεια VEGF είναι οι VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3. Επιπλέον, πολλοί συν-υποδοχείς έχουν αναγνωρισθεί, όπως οι νευροπιλίνες (neuropilins) NP-1 και NP-2 και διάφορες πρωτεογλυκάνες, οι οποίοι παίζουν ρόλο στην μετάδοση του σήματος μέσω των VEGFR υποδοχέων (88-89). Υπάρχει περίπλοκη σχέση των συνδετών με τους υποδοχείς τους (εικόνα 3). Ο VEGFR-1 (ή Flt-1) συνδέεται με τους VEGF, VEGF-B και PlGF και εκφράζεται, εκτός των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων και στα μονοκύτταρα, μακροφάγα και διάφορα μη ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο VEGFR-2 (ή Flk-1), είναι ο κυριότερος και καλύτερα μελετημένος υποδοχέας και εκφράζεται κυρίως στα ενδοθηλιακά αγγειακά κύτταρα αλλά και σε αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα. Ο VEGFR-3 ρυθμίζει την λεμφαγγειογένεση και η έκφρασή του περιορίζεται στα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα (90). 29