Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Χειμερινό Ακαδημαϊκό Εξάμηνο 2016_17 11 ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Χρήσεις των κυτταροκαλλιεργειών με σημαντικές προεκτάσεις στην αντιμετώπιση της ανθρώπινης παθοφυσιολογίας Αμανατιάδου Π. Έλσα, PhD eamanat@pharm.auth.gr
Χρήσεις των κυτταροκαλλιεργειών με σημαντικές προεκτάσεις στην αντιμετώπιση της ανθρώπινης παθοφυσιολογίας Α. Χρήση κυτταροκαλλιεργειών στην παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων (Υβριδικές κυτταρικές σειρές β λεμφοκυττάρων-καρκινικών κυττάρων, Χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων στη Μοριακή ανίχνευση - Διάγνωση - Θεραπεία) Β. Χρήση κυτταροκαλλιεργειών κατά το σχεδιασμό και την ανάπτυξη νέων φαρμάκων (Έλεγχος υποψήφιων φαρμάκων, Μελέτες μοριακού μηχανισμού δράσης, Μελέτες βιοσυμβατότητας, Μελέτες πρόσληψης και διαπερατότητας) Γ. Χρήση κυτταροκαλλιεργειών στο καινοτόμο πεδίο της κυτταρικής θεραπείας (Bλαστικά κύτταρα, Aναγεννητική ιατρική, ips κύτταρα) 2/21
Εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα (ES cells) Ικανότητα της απεριόριστης αναπαραγωγής (self-renewal) ενώ διατηρούν την πολυδυναμικότητά τους (pluripotency) και την ικανότητα διαφοροποίησης σε κάθε κυτταρικό τύπο Γονιμοποίηση ωαρίου Σχηματισμός βλαστοκύστης 4-5 ημέρες 50-150 κύτταρα http://www.intechopen.com/books/pluripotent-stem-cells/dedifferentiation-of-somatic-cells-to-a-pluripotent-state https://www.youtube.com/watch?v=2-3j6jgn-_y&feature=youtu.be Εσωτερική μάζα κυττάρων ICM (Inner cell mass), εμβρυοβλάστη απομόνωση πολυδύναμων βλαστοκυττάρων 3/21
Ενήλικα βλαστικά κύτταρα: το παράδειγμα του αιμοποιητικού συστήματος Τα έμμορφα στοιχεία του αίματος έχουν περιορισμένο χρόνο ζωής στη γενική κυκλοφορία και ανανεώνονται ομοιοστατικά ή υπό την επίδραση ενδογενών και εξωγενών ερεθισμάτων από τα αρχέγονα αιμοποιητικά στελεχιαία κύτταρα (Hematopoietic Stem Cells, HSCs). Στον ενήλικα, τα HSCs εδράζονται στο μυελό των οστών, σε μικροπεριβάλλοντα που υποστηρίζουν την επιβίωση και λειτουργία τους, τα οποία αναφέρονται ως αιμοποιητικές φωλιές (hematopoietic niche). Οι ιδιότητες που τοποθετούν τα HSCs στην κορυφή της ιεραρχίας στο αιμοποιητικό σύστημα, είναι η ικανότητα της αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης προς όλους τους τύπους αιμοποιητικών κυττάρων Μεταγραφικοί παράγοντες που καθορίζουν τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων. Η δέσμευση για διαφοροποίηση, των HSCs και των πρώιμων προγεννητόρων (CLP, CMP, GMP, MEP), προς τις διαφορετικές αιμοποιητικές κυτταρικές σειρές, καθορίζεται δραστικά από τη συνεργιστική δράση ή τον ανταγωνισμό μεταγραφικών παραγόντων. (HSC: Hematopoietic Stem Cell, CLP: Common Lymphoid Progenitor, CMP:Common Myeloid Progenitor, GMP: Granulocyte Macrophage Progenitor, MEP: Megakaryocyte Erythroid Progenitor, ΝΚ: Natural Killer cells, RBC: Red Blood Cells) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21720200 4/21
Επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα Induced Pluripotent Cells (ips cells) Προηγούμενες παρατηρήσεις: Σωματικά κύτταρα μπορούν να επαναπρογραμματιστούν σε πολυδύναμα κύτταρα με μεταφορά του πυρηνικού περιεχομένου τους σε ωοκύτταρα ή μέσω σύζευξης με ES κύτταρα Ερώτημα: Παράγοντες που παίζουν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της ταυτότητας των ES κυττάρων (όπως Sox2, Nanog) μπορούν να επαναπρογραμματίσουν σωματικά κύτταρα σε πολυδύναμα? Yamanaka factors: Oct3/4, Sox2, c-myc, Klf4 https://www.nobelprize.org/mediaplayer/index.php?id=1866 5/21
Induced Pluripotent Cells (ips cells) Ιϊκή μεταγωγή 24 επιλεγμένων παραγόντων σε ινοβλάστες ποντικού αν οι ινοβλάστες αποκτήσουν πολυδύναμο χαρακτήρα θα εμφανίσουν αντίσταση στο αντιβιοτικό G418 (αποικίες) Μορφολογία κυττάρων Δυναμικό αναπαραγωγής Έκφραση δεικτών ES κυττάρων Συνδυασμός απαραίτητων παραγόντων.. 6/21
Induced Pluripotent Cells (ips cells) Σχηματισμός και ανάλυση τερατωμάτων σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια (δείκτης πολυδυναμικότητας) Συνεισφορά και ανίχνευση ips κυττάρων στην ανάπτυξη του εμβρύου μετά από τη μεταφορά τους σε βλαστοκύστη ποντικού Σχηματισμός embryoid bodies (τρισδιάστατα συσσωματώματα πολυδύναμων κυττάρων) - διαφοροποίηση 7/21
Εξέλιξη της τεχνολογίας των ips κυττάρων -Μπορούν και ανθρώπινα σωματικά κύτταρα να επαναπρογραμματιστούν? -Ποιες κατηγορίες σωματικών κυττάρων μπορούν να επαναπρογραμματιστούν? Σε τι κύτταρα μπορούν στη συνέχεια να διαφοροποιηθούν? -Νέες μεθοδολογίες επαναπρογραμματισμού σωματικών κυττάρων (π.χ. συνδυασμοί παραγόντων & μηχανισμός, απόδοση, ιϊκή μεταγωγή) Ηθικές προεκτάσεις της χρήσης ανθρώπινων βλαστικών κυττάρων ips κύτταρα και ενήλικα βλαστοκύτταρα ως απάντηση στα ηθικά διλήμματα & την έλλειψη αφθονίας που χαρακτηρίζει τη χρήση ανθρώπινων εμβρυονϊκών βλαστοκυττάρων.. https://www.pinterest.com/pin/210402613818972468/ 8/21
Προσεγγίσεις στη χρήση των ips κυττάρων Καθιέρωση ips κυτταρικών σειρών in vitro Εκτός από το σημαντικό πλεονέκτημα της ομόλογης μεταμόσχευσης μετά από επιδιόρθωση της βλάβης (κύτταρα εξειδικευμένα για κάθε ασθενή- μικρή πιθανότητα απόρριψης) Σημαντικά μοντέλα για την προσομοίωση παθολογικών καταστάσεων (τα κύτταρα φέρουν τη βλάβη του ιστού προέλευσης) και τον έλεγχο και την ανάπτυξη νέων φαρμάκων (drug screening) 9/21
ips και ES κύτταρα Ομοιότητες σε μορφολογία, τρόπο συντήρησης in vitro (feeder layer dependence), έκφραση επιφανειακών δεικτών, in vivo σχηματισμό τερατωμάτων Λειτουργική ισοδυναμία? ips κύτταρα: Διαφορές στο δυναμικό in vitro διαφοροποίησης, π.χ. μειωμένη απόδοση στην παραγωγή νευρικών και καρδιαγγειακών προγεννητόρων, προγεννήτορες του αιμοποιητικού συστήματος και ενδοθηλιακά κύτταρα όπου επέρχεται πρόωρη γήρανση κ.ά. Προφίλ γονιδιακής έκφρασης φαίνεται όμοιο ανάμεσα στους δύο κυτταρικούς τύπους Διαφορές σε έκφραση κάποιων mrnas, micro RNAs, επιγενετική μνήμη (π.χ. ανάλογα με την προέλευση τους από ινοβλάστες, κερατινοκύτταρα) Τεχνολογίες omics για τη σύγκριση.. 10/21
Βλαστικά κύτταρα για κυτταρικές θεραπείες Εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα (ES) (υψηλό δυναμικό διαφοροποίησης, σχετικά εύκολη in vitro συντήρηση - μεγάλος αριθμός κυττάρων, πιθανότητα απόρριψης, πιθανότητα εκτροπής σε καρκίνο, ηθικά διλήμματα) Ενήλικα βλαστικά κύτταρα (όπως HSCs) (περιορισμένο δυναμικό διαφοροποίησης, σπάνια, δύσκολη απομόνωση και in vitro συντήρηση μικρός αριθμός κυττάρων, μικρότερη πιθανότητα απόρριψης) Επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (ips) (χαμηλότερο δυναμικό διαφοροποίησης και αναπαραγωγής σε σχέση με τα εμβρυονικά κύτταρα μικρότερος αριθμός κυττάρων, μικρότερη πιθανότητα απόρριψης, ηθική χρήση) http://www.slideshare.net/miltiadiskitsos1/stem-cells-53239009 11/21
Κυτταρικές θεραπείες Για τις ανάγκες της μεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων θα πρέπει επαναλήψιμα να επιτυγχάνεται: Δυνατότητα πολλαπλασιασμού και δημιουργία μεγάλου αριθμού κυττάρων για την αποκατάσταση του ιστού Διαφοροποίηση στον επιθυμητό τύπο κυττάρου/κυττάρων Επιβίωση μετά από τη μεταμόσχευση στον δέκτη Προσαρμογή στον περιβάλλοντα ιστό μετά τη μεταμόσχευση Μακροπρόθεσμη λειτουργικότητα κατά τη διάρκεια της ζωής του δέκτη Ασφάλεια του δέκτη Επί του παρόντος οι πιο επικρατείς προσεγγίσεις αφορούν κύτταρα του μυελού των οστών, περιφερικά κύτταρα αίματος, μεσεγχυματικά κύτταρα απομονωμένα από ασθενείς ή υγιείς δότες για αυτόλογη ή αλλογενή μεταμόσχευση π.χ. μεταμόσχευση αιμοποιητικών στελεχιαίων κυττάρων για την αποκατάσταση του αιμοποιητικού συστήματος: λευχαιμία, λέμφωμα, μυέλωμα, δρεπανοκυτταρική αναιμία κ.ά. http://www.nature.com/nmat/journal/v13/n2/full/nmat3868.html?message-global=remove 12/21
Θεραπευτικές εφαρμογές πολυδύναμων κυττάρων Εκφυλισμός ωχράς Βλάβη μυελού κηλίδας Πάρκινσον των οστών Διαβήτης Έμφραγμα μυοκαρδίου http://www.nature.com/nrm/journal/v17/n3/pdf/nrm.2016.10.pdf 13/21
Σύντομη ανασκόπηση των διαλέξεων 1-6 Διάλεξη 1 η Εισαγωγικά στοιχεία μαθήματος «Κυτταροκαλλιέργειες» Διάλεξη 2 η Προέλευση και κατηγοριοποίηση κυτταροκαλλιεργειών- Κριτήρια επιλογής κυτταροκαλλιέργειας ως κατάλληλο πειραματικό μοντέλο Διάλεξη 3 η Υποδομή μονάδας κυτταροκαλλιεργειών Μέρος Α: Οργάνωση του χώρου και απαραίτητη οργανολογία Διάλεξη 4 η Υποδομή μονάδας κυτταροκαλλιεργειών Μέρος Β: Υλικά και θρεπτικά μέσααντιδραστήρια Διάλεξη 5 η Διάλεξη 6 η Διάλεξη 7 η Μολύνσεις κυτταροκαλλιεργειών Πρότυπες συνθήκες συντήρησης κυτταροκαλλιεργειών Σχεδιασμός πειραμάτων με τη χρήση κυτταροκαλλιεργειών - Παραδείγματα 14/21
Άσκηση 1η Μετά την επαναφορά της κυτταρικής σειράς MCF7 (άνθρωπος, καρκίνος μαστού) από την τράπεζα υγρού αζώτου, συνεχίζετε να συντηρείτε τα κύτταρα σας με κατάλληλους χειρισμούς (ποιους??) σε πρότυπες συνθήκες (ποιες??). Η συγκέντρωση της αρχικής καλλιέργειας MCF7 που αναπτύσσεται σε πιάτο μέσα στον επωαστήρα προσδιορίστηκε με τη χρήση αιμοκυτταρόμετρου (πώς? χειρισμοί??) και οι τιμές παρουσιάζονται παρακάτω. Ο πειραματικός σας σχεδιασμός απαιτεί να ετοιμάσετε 4 νέες πανομοιότυπες καλλιέργειες MCF7 κυττάρων με αρχική συγκέντρωση 10⁵κυτ/ml και τελικό όγκο 10 ml. Κάνετε τους κατάλληλους υπολογισμούς και περιγράψτε τον τρόπο που θα ετοιμάσετε τις 4 νέες καλλιέργειες. Συγκέντρωση αρχικής καλλιέργειας κυττάρων MCF7 (Cαρχ) 48 56 52 65 63 42 57 55 Πλάκα Neubauer (αιμοκυτταρόμετρο) 15/21
Απάντηση 1η Cαρχ x Vαρχ = Cτελ x Vτελ Cαρχ, V H Cαρχ προσδιορίστηκε με αιμοκυτταρόμετρο = 48 + 56 + 52+ 65+ 63+ 42+ 57+ 55 8 x 10⁴ κυτ/ml Άρα Vαρχ = 1,827 ml (είναι ο όγκος από την αρχική καλλιέργεια που χρειάζεται να μεταφέρετε σε κάθε νέο πιάτο) (Cτελ, Vτελ) x 4 Ο υπόλοιπος όγκος για κάθε νέα καλλιέργεια (έως τα 10ml) θα πληρωθεί με φρέσκο θρεπτικό υλικό.. V θρεπτ = (10 Vαρχ) ml = 8,173ml 16/21
Άσκηση 2η Θέλετε να μελετήσετε το φυσιολογικό ρόλο ενός γονιδίου. Έχετε στη διάθεσή σας κύτταρα τα οποία επιμολύνατε με κατάλληλο φορέα έκφρασης (με ποιες μεθόδους??) ώστε να υπερεκφράζουν σταθερά την αντίστοιχη πρωτεΐνη. Υποψιάζεστε (οπτική παρατήρηση, μικροσκόπιο) ότι η αφθονία της πρωτεΐνης ενδοκυττάρια μπορεί να προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Σχεδιάστε ένα απλό πείραμα που μπορεί να σας δώσει μια πρώτη ένδειξη για τη συμπεριφορά των κυττάρων σας. Ποιες θα είναι οι καλλιέργειες αναφοράς στο συγκεκριμένο πείραμα? Απάντηση 2 η Η πιο απλή εφαρμογή για το συσχετισμό της υπερέκφρασης του γονιδίου με το δυναμικό αναπαραγωγής των κυττάρων θα ήταν η καταγραφή της καμπύλης ανάπτυξης των μετασχηματισμένων κυττάρων σε ένα χρονοεξαρτώμενο πείραμα. Σε αυτή την περίπτωση, καλλιέργειες αναφοράς θα αποτελούσαν α) τα μητρικά μη μετασχηματισμένα κύτταρα, β) μετασχηματισμένα κύτταρα με κενό φορέα έκφρασης (αρνητικό control) και πιθανόν επίσης γ) μετασχηματισμένα κύτταρα με διαφορετικό γονίδιο που είναι γνωστό ότι προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στο συγκεκριμένο κυτταρικό μοντέλο (θετικό control) 17/21
Άσκηση 3η Λευχαιμικά κύτταρα MEL (ποντικός, ερυθρολευχαιμία) και K562 (άνθρωπος, χρόνια μυελογενής λευχαιμία) αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε φλάσκες με αρχική συγκέντρωση Cαρχ= 10 5 κύτταρα/ml για χρονικό διάστημα t=0-120 ώρες. Οι τιμές μετρήσεων της κυτταρικής ανάπτυξης σε συνάρτηση με το χρόνο παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. Α) Προσδιορίστε γραφικά το χρόνο διπλασιασμού για κάθε κυτταρική σειρά. Β) Που μπορεί να οφείλεται η διαφορά στις τιμές του χρόνου διπλασιασμού που θα διαπιστώσετε? Time (hrs) MEL (x10⁴cells/ml) K562 (x10⁴cells/ml) 0 10 10 24 62 23 48 258 84 72 460 258 96 520 321 120 487 342 18/21
Cell density (x 10⁴cells/ml) Cell density (x 10⁴cells/ml) Απάντηση 3η 600 400 200 0 MEL K562 Cell growth 0 24 48 72 96 120 Time (hrs) 1000 100 50 10 1 Log scale Cell growth K562 doubling time MEL K562 0 24 48 72 96 120 Time (hrs) 19/21
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Η χρήση των κυτταροκαλλιεργειών διευρύνεται συνεχώς και εμφανίζει καινοτομία εφαρμογών με τελικό στόχο τον άνθρωπο (Διαφάνειες: 9, 15-19!) Μπορείτε να δείτε & Διαφάνεια 21 Επόμενη Διάλεξη: Δευτέρα 09 Ιανουαρίου 2017 (επανάληψη) Καλή ξεκούραση και καλές γιορτές!
Προσεγγίσεις στη χρήση των ips κυττάρων Adult somatic cells (unipotent) from any patient can be reprogrammed into induced pluripotent stem (ips) cells. After inducing differentiation in vitro, human ips cells form specialized cells that have several applications. α) Human ips cells can be used in disease modelling to understand the molecular mechanisms underlying disease phenotypes, for example the molecular causes for arrhythmia in cardiomyocytes or for defects in neurogenic differentiation. b) Another application of human ips cells is in drug screening and discovery, to determine the effects of candidate drugs and new compounds and identify target pathways. c) Human ips cells are also valuable in cardiac, neural and liver toxicity tests to assess cellular toxic responses. Drug screening and toxicity tests together represent human preclinical 'trials in a tube' that allow the introduction of 'the patient' in early stages of the drug discovery process. http://www.nature.com/nrm/journal/v13/n11/fig_tab/nrm3448_f1.html 21/21