ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟΣ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ - Ελεύθερο Εμβρυικό DNA: η χρήση στη Μαιευτική Νίκος Δ. Βραχνής Αρεταίειο Νοσοκομείο
Επίπτωση χρωμοσωμικών ανωμαλιών Πρόσφατα δεδομένα για χρωμοσωμικές ανωμαλίες 8 16 53 T21 5 T18 5 13 Major fetal aneuploidies T13 45,X Sex trisomy Other rare Data adapted from Wellesley, D, et al., Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from population-based congenital anomaly registers in Europe. Eur J of Hum Gen, 11 January 2012.
Ιστορία ανίχνευσης συνδρόμου Down 1980 : Αμνιοπαρακέντηση (προχωρημένη ηλικία μητέρας) 1990 : Τριπλό τεστ (T21, T18 and T13) 2000 : Έλεγχος α τριμήνου (T21, T18 and T13) 2012 : Έλεγχος α τριμήνου + NIPT (T21, T18 and T13) 2015 :?NIPT
Ιστορία ανίχνευσης συνδρόμου Down Triple screening ( > 1990) Ηλικία μητέρας Ορός: AFP, HCG, ελεύθερη λύθ οιστριόλη Συνδυασμένο τεστ ( > 2000) Ηλικία μητέρας Αυχενική διαφάνεια (NT) Ορός: ελεύθερη B-HCG, PAPP-AA
Προγεννητικός έλεγχος Down Syndrome Testing with 5% Screen Positive Rate Ποσοστό ανίχνευσης (%) 1 st Trimester NT Ultrasound 64-70 1 st Trimester 2 nd Trimester 2 nd Trimester 1 st Trimester Blood Screen NT Ultrasound Triple Screen Quadruple Screen 82-87 69 81 Integrated Screen 1 st Trimester Blood Screen NT Ultrasound 2 nd Trimester Blood Screen 94-96 Serum 1 st 2 Trimester Blood Screen nd Trimester Blood Integrated 85-88 Screen ACOG Practice Bulletin No. 77, January 2007.
Υπάρχουσες διαγνωστικές επιλογές - καρυότυπος Trimester Test Sensitivity Specificity 1 st CVS 99.25% 1 98.65% 1 2 nd Amniocentesis 99.4% 2 99.5% 2 Οριστικές απαντήσεις, αλλά είναι επεμβατική και συνδέονται με κίνδυνο για τον ασθενή Οι περισσότερες είναι περιττές λόγω του υψηλού αριθμού ψευδώς θετικών στη διαλογή 1. Hahnemann JM, Vejerslev LO. Accuracy of cytogenetic ti findings on chorionic i villus sampling (CVS)--diagnostic consequences of CVS mosaicism i and non-mosaic discrepancy in centres contributing to EUCROMIC 1986-1992. Prenat Diagn. 1997 Sep;17(9):801-20. 2. Mid-trimester amniocentesis for prenatal diagnosis. Safety and accuracy. JAMA. 1976 Sep 27; 236(13): 1471-6..
Κίνδυνος συνδρόμου Down ανάλογα με την ηλικία της μητέρας Age Frequency (live births) <35 < 0.3 % 37 0.5 % 40 1 % 50 10 %
NIPD NON INVASIVE PRENATAL DIAGNOSIS Έλεγχος για cff DNA (cell free fetal DNA) Από το μητρικό αίμα στην εγκυμοσύνη για τρισωμίες 21, 18 and 13
Δύο πηγές εμβρυικού DNA στη μητρική κυκλοφορία Εμβρυικά κύτταρα 1 /1.000.000 συνολικού κυτταρικού πληθυσμού Απαιτούν την απομόνωση με μηχανικά ή / και βιοχημικά μέσα Ελεύθερο DNA (cf DNA) Το μητρικό αίμα περιέχει τόσο μητρικό όσο και εμβρυικό ελεύθερο DNA.
Εμβρυικά κύτταρα στην μητρική κυκλοφορία
Ελεύθερο DNA στη μητρική κυκλοφορία Placenta Maternal plasma Maternal blood cells Τόσο το ελεύθερο εμβρυικό όσο και το ελεύθερο μητρικό DNA κυκλοφορούν στο μητρικό πλάσμα. Το ελεύθερο εμβρυικό και μητρικό DNA κυκλοφορούν στο πλάσμα ως σχετικά μικρά τμήματα (150-200 ζεύγη βάσεων) και αντιπροσωπεύουν ολόκληρο το γονιδίωμα. Εμβρυικό DNA προέρχεται κυρίως από τον πλακούντα. Μητρικό DNA προέρχεται κυρίως από μητρικά αιμοποιητικά κύτταρα. Εμβρυικό DNA είναι 5-25% του συνολικού ελεύθερου DNA (~10% κατά μέσο όρο).
Ελεύθερο Εμβρυικό DNA στο μητρικό αίμα Παράγεται λόγω απόπτωσης Εμβρυικό ελεύθερο λύθ DNA προέρχεται από τα κύτταρα τροφοβλάστης του πλακούντα Απελευθερώνεται στο αίμα σαν μικρά τμήματα DNA (150-200bp) Αξιόπιστη ανίχνευση μετά 7+ εβδομάδες κύησης Δεν ανιχνεύεται ώρες μετά τον τοκετό.
Ιστορία NIPD 1997 : Lo et al. :cff DNA στη μητρική κυκλοφορία 2001 : Εμβρυικό Rh(D) 2006 : Ανίχνευση φύλου: 1.X-linked γενετικές διαταραχές 2.Ανίχνευση φύλου (Κίνα) 2011 : Ανίχνευση τρισωμιών 21/18/13 2012 : > 100.000 γυναίκες ελέγχθηκαν σε Κίνα/ΗΠΑ 2013 : Καθημερινά > 2000 NIPD παγκοσμίως
Ελεύθερο εμβρυϊκό DNA (cffdna) στην κυκλοφορία της μητέρας (1) Ανιχνεύσιμο από την 5η εβδομάδα κύησης Απομακρύνεται από τη μητρική κυκλοφορία εντός 30 από τον τοκετό 3-10% του ολικού ελεύθερου (εκτός κυττάρων) DNA που υπάρχει στο μητρικό αίμα Προέρχεται από: - ελεύθερη είσοδο DNA από τη μητροπλακουντιακή μονάδα - απόπτωση πλακουντιακών κυττάρων (τροφοβλαστών) - καταστροφή & λύση ελεύθερων εμβρυϊκών κυττάρων στη μητρική κυκλοφορία
Ελεύθερο εμβρυϊκό DNA στη μητρική κυκλοφορία 300 292.2ge/ml 250 Εμβρυϊκό DNA 200 % ολικού DNA 150 100 50 0 25.4ge/ml 3.4% 6.2% 11η-17η εβδομάδα 37η-42η εβδομάδα ge= genome equivalent / ml Lo et al. 1998 Am J Hum Genet
Ελεύθερο εμβρυϊκό DNA (cffdna) στην κυκλοφορία της μητέρας (2) Η ποσότητα του γενομικού υλικού του εμβρύου στη μητρική κυκλοφορία με τη μορφή cffdna είναι πολύ μεγαλύτερη από την αντίστοιχη σε μορφή ελεύθερων κυττάρων (Lo et al, Am J Hum Genet 1998) Διαφορά στο μέγεθος εμβρυϊκού & μητρικού cffdna εμβρυϊκό cfdna: 80%<193 bp, 100%<300 bp μητρικό cfdna: μόνο 50%<300 bp διευκολύνει τον εμπλουτισμό & απομόνωσή του καθορίζει τη διαγνωστική του αξιοποίηση
ffdna στη μητρική κυκλοφορία & προγεννητικός έλεγχος δυσκολίες Χαμηλές συγκεντρώσεις: δυσκολίες ανίχνευσης & ενίσχυσης (amplification) Σημαντικά διαφορετικές συγκεντρώσεις μεταξύ υγιών ατόμων Σημαντικά μεγαλύτερες συγκεντρώσεις μητρικής προέλευσης ελεύθερου DNA (20:1) Το έμβρυο κληρονομεί το ήμισυ του γενετικού του Το έμβρυο κληρονομεί το ήμισυ του γενετικού του υλικού από τη μητέρα
Αξιοποίηση του ffdna στη μαιευτική καθιερωμένες & υπό μελέτη κλινικές εφαρμογές Σε ιστορικό γενετικών νοσημάτων 1. Φυλοσύνδετα νοσήματα: αναγνώριση φύλου εμβρύου 2. Διάγνωση μονογονιδιακών νοσημάτων: ανίχνευση πατρικά κληρονομούμενων μ αλληλίων Σε καταστάσεις/νοσήματα σχετιζόμενα με την κύηση 3. Παρουσία παράγοντα Rh σε Rh(-) έγκυες γυναίκες 4. Προγεννητικός έλεγχος ανευπλοειδίας: screening έλεγχος ή διάγνωση 5. Σε παθολογικές καταστάσεις κύησης
Στόχοι NIPD? Μείωση κινδύνου έκθεσης για έμβρυο Μείωση ψευδώς θετικών Μπορεί να εφαρμοσθεί εύκολα σε όλες τις έγκυες Εξασφαλίζει υψηλό ποσοστό ανίχνευσης.
NIPD χαρακτηριστικά 1. TEST : τρισωμία 21 (Down syndrome), τρισωμία18 (Edwards syndrome), τρισωμία 13 (Patau syndrome),καθορισμός φύλου. 2. Δείγμα: Απαιτούνται ειδικά kits από την εταιρεία 3. Χρόνος: > 10 η εβδ 4. Χρόνος αποτελέσματος: < 2 εβδ 5. Αξιοπιστία: > 99% για τρισωμία 21 6. Ενδείξεις: Αν και το NIPT μπορεί να πραγματοποιηθεί σε κάθε κύηση, ενδείκνυται σε: Αυξημένο κίνδυνο από το τριπλό τεστ ή το τεστ α τριμήνου Προχωρημένη ηλικία μητέρας Άγχος για επεμβατικές μεθόδους
Πρώτη δημοσίευση για γαανίχνευση τρισωμίας 21 PNAS 2008;105:15255 PNAS 2008;105:20458
Η National Society of Genetic Counselors (NSGC) υποστηρίζει σήμερα το Noninvasive Prenatal Testing/Noninvasive Prenatal Diagnosis (NIPT/NIPD) ως επιλογή για τους ασθενείς των οποίων οι κυήσεις θεωρούνται αυξημένου κινδύνου για ορισμένες χρωμοσωμικές ανωμαλίες. NSGC τονίζει ότι NIPT/NIPD πρέπει να προσφέρεται μόνο στο πλαίσιο της συναίνεσης και την παροχή συμβουλών από έναν αναγνωρισμένο και εκπαιδευμένο πάροχο. Ασθενείς των οποίων τα NIPT/NIPD αποτελέσματα δεν είναι φυσιολογικά ή έχουν ενδείξεις δίξ για χρωμοσωμικές ανωμαλίες, θα πρέπει να λαμβάνουν γενετική συμβουλευτική και να τους δίνεται η δυνατότητα επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου
Το ελεύθερο εμβρυικό DNA δεν θα πρέπει να είναι μέρος του καθιερωμένου προγεννητικού ελέγχου, αλλά πρέπει να είναι μια συνειδητή επιλογή των ασθενών μετά την κατάλληλη συμβουλευτική Το ελεύθερο εμβρυικό DNA δεν θα πρέπει να προσφέρεται ρ σε κυήσεις χαμηλού κινδύνου ή σε γυναίκες με πολύδυμη κύηση λόγω ανεπαρκών δεδομένων Αρνητικό ελεύθερο εμβρυικό δεν εξασφαλίζει απρόσμενη εγκυμοσύνη Γυναίκες με θετικό έλεγχο θα πρέπει να λαμβάνουν γενετική συμβουλευτική και να γίνεται επιβεβαίωση με επεμβατική μέθοδο. Ελεύθερο εμβρυικό DNA δεν αντικαθιστά την ακρίβεια της CVS και της αμνιοπαρακέντησης
Το Τ ελεύθερο λύθ εμβρυικό DNA θεωρείται αξιόπιστο ξό μόνο για τις τρισωμίες 21 και 18. Έχουν αναφερθεί αποτελέσματα και για την τρισωμία 13, αλλά ο αριθμός περιπτώσεων δεν είναι επαρκής και η αποτελεσματικότητα φαίνεται μικρότερη από ότι στις τρισωμίες 21 και 18. Για ανευπλοειδίες των φυλετικών χρωμοσωμάτων τα αποτελέσματα θεωρούνται εξαιρετικά χαμηλά. Δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα για να υποστηρίξουν αν μια μέθοδος είναι πιο αξιόπιστη από μια άλλη. Το τεστ δεν θα πρέπει να θεωρείται πλήρως διαγνωστικό και ως εκ τούτου δεν είναι μια αντικατάσταση της αμνιοπαρακέντησης και CVS. Αναλυτικές μελέτες έχουν κυρίως επικεντρωθεί σε εγκύους υψηλού κινδύνου. Η αποτελεσματικότητα α α δεν έχει αξιολογηθεί πλήρως σε πληθυσμού χαμηλού κινδύνου. ISPD Position Statement April 2013
Δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα για την εφαρμογή του τεστ σε πολύδυμες κυήσεις Σε ένα ποσοστό περιπτώσεων υπάρχει ανεπαρκές cfdna στο μητρικό δείγμα. Δεν έχουν καθορισθεί ακόμα συγκεκριμένες συνθήκες λειτουργίας και εφαρμογής της μεθόδου και κριτήρια ποιοτικού ελέγχου. ΗΗ μέθοδος ακόμη δεν προσφέρει τη δυνατότητα εφαρμογής στο σύνολο του πληθυσμού, με ταχύτητα και οικονομική απόδοση (cost effectiveness). ISPD Position Statement April 2013
Μελλοντικές προοπτικές Μεγάλες προοπτικές μελέτες σε πληθυσμό χαμηλού κινδύνου Μελέτες σε πολύδυμες μςκυήσεις Ανίχνευση υπο-χρωμοσωμικών μ ανωμαλιών cfdna και επιπλοκές κύησης
cffdna & επιπλοκές της κύησης
Cell-free fetal DNA in complicated pregnancies Background Ο πλακούντας αποτελεί την κύρια πηγή cffdna Συνεπώς ο προδιορισμός επιπέδων cffdna μπορεί να αξιοποιηθεί σαν δείκτης - προβλεπτικός - διαγνωστικός - προγνωστικός επιπλοκών της κύησης που σχετίζονται με πλακουντιακή δυσλειτουργία Preeclampsia (MoM) 5.0 4.0 Lo 1999 Zhong 2001 Preeclampsia Cell-free e fetal DNA 3.0 Zhong 2002 2.0 Levine 2004 Leung 2001 1.0 Crowley 2007 2 nd trimester
ffdna, προεκλαμψία & υπολειπόμενη ανάπτυξη αυξημένες συγκεντρώσεις ffdna σε κλινικά εγκατεστημένη προεκλαμψία & σε προεκλαμψία με IUGR (Lo et al, 1999; Smid et al, 2001; Snimada et al, 2004; Alberry et al, 2008) σχετίζεται με τη βαρύτητα της προεκλαμψίας (Swinkels et al, 2002; Farina et al, 2004) Αύξηση πριν την έναρξη των συμπτωμάτων (Leung et al, 2001; Zhong et al, 2002; Levine et al, 2004; Farina et al, 2004) αυξημένες συγκεντρώσεις σε κυήσεις με IUGR που δεν σχετίζονται με πλακουντιακή δυσλειτουργία (Alberry et al, 2008) Η αυξημένη συγκέντρωση του ffdna ενωρίς στην κύηση έχει προβλεπτική αξία για την μετέπειτα εμφάνιση προεκλαμψίας ή/και IUGR??? - ως μεμονωμένος δείκτης δί - σε συνδυασμό με άλλους δείκτες
Author Studies comparing maternal serum concentration of cffdna in pregnancies with preeclampsia and normotensive controls. During preeclampsia Mar ker Sampling (wks) Preeclampsia Controls N Genome equivalent /ml N Genome equivalent /ml Lo et al, 1999 9 SRY 32 (range 27-41) 20 381 (range 194-788) GE/mL 20 76 (range 54-163) GE/mL Zhong et al, 2001 10 SRY - (range 28-40) 39 1599 (range 0-7968) GE/mL 46 333 (range 0-1608) GE/mL Smid et al, 2001 11 SRY - (range 26-40) 17 256 (range 59-859) GE/mL 38 24 (range 0-138) GE/mL Swinkels et al, 2002 12 SRY 33 (range 27-34) 7 781 (95%CI 503-1212) GE/mL 10 128 (95%CI 96-170) GE/mL Lau et al, 2002 13 SRY 32 (range 30-37) 7 521 (range 274-3089) GE/mL 10 277 (34-468) GE/mL Sekizawa et al, 2003 14 DYS 35 (range 29-36) 9 2.1 (range 0.9-9) 9) MoM 20 1.0 (range 0.4-2.0) 0)MoM Shimada et al, 2004 15 SRY - (range 29-38) 15 173 (SEM 95) GE/mL 59 22 (SEM 9) GE/mL Farina et al, 2004 16 SRY 33.7 (SD 3.9) 34 2.6 (SD 2.7) MoM 102 1.0 (SD 1.5) MoM Zhong et al, 2005 17 SRY 30 (range 24-33) 36 (range 34-41) 11 12 Early-preeclampsia: 574 (range 113-7088) GE/mL Late-preeclampsia: 536 (range 61-1324) GE/mL 18 12 106 (range 47-269) GE/mL 125 (38-358) GE/mL Smid et al, 2006 18 SRY 32.5 (range 25-38) 33 (range 23-36) 28 15 PE no FGR: 195 (45 990) GE/mL PE and FGR: 304.1 (96.5-1682.3) GE/mL 89 58 (2-391) GE/mL Before preeclampsia Leung et al, 2001 19 SRY 17 (range 11-22) 18 42 (range 36-2375) GE/mL 33 22 (range 4.2-300) GE/mL Zhong et al, 2002 20 SRY 20 (range 19-25) 10 423 (range 97-1642) GE/mL 40 129 (range 31-318) GE/mL Levine et al, 2004 21 DYS - (range 17-28) 138 36 (SEM 6) GE/mL 137 16 (SEM 6) GE/mL Farina et al, 2004 22 DYS 20 (SD 2.08) 6 2.4 (SD 2.8) MoM 30 1.0 (SD 0.8) MoM Crowley et al, 2007 23 SRY 13 (range 10-20) 16 31 (range 0-214) GE/mL* 72 28 (range 0-1280) GE/mL * Not significantly different from controls, preeclampsia, IUGR= fetal growth restriction, GE = genome equivalents
First-trimester maternal serum cell free fetal DNA & preeclampsia p Maternal serum cell-free fetal Uterine artery PI DNA MoM Genome MoM equivalents /ml Unaffected 1.0 (0.60-1.65) 51.5 (31.1-84.9) 1.04 (0.82-1.25) Early 1.85 (1.41-95.5 (72.7-1.51 (1.02-1.70)* preeclampsi 2.74)* 140.9)* a Late 099(049 0.99 (0.49-50.8 (25.0-113(091142) 1.13 (0.91-1.42) preeclampsi 2.01) 103.8) a *Mann-Whitney U test, p<0.05 Sifakis S, Zaravinos A, Maiz N, Spandidos DA, Nicolaides KH (Am J Obstet Gynecol, 2009)
Sifakis S, Zaravinos A, Maiz N, Spandidos DA, Nicolaides KH (Am J Obstet Gynecol, 2009) Η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων cffdna στο μητρικό πλάσμα (log GE/mL) & του δείκτη παλμικότητας (PI) των μητριαίων αρτηριών σε φυσιολογικές (Α) και κυήσεις με προεκλαμψία (Β) 3.0 3.0 GE/mL) 2.5 GE/mL) 2.5 fetal DNA ( 2.0 fetal DNA ( 2.0 Log cell-free f 1.5 10 1.0 Log cell-free f 1.5 10 1.0 R 2 = 0.175 0.5 0.5-0.4-0.2 0.0 0.2 0.4-0.4-0.2 0.0 0.2 0.4 Log MoM uterine artery PI Log MoM uterine artery PI A B Στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ cffdna & UTA PI (p=0.038) στις κυήσεις με προεκλαμψία αλλά όχι στις φυσιολογικές (p=0.174) GE= genome equivalents
First trimester maternal plasma free fetal DNA and preeclampsia Σε κυήσεις που στη συνέχεια επιπλέκονται με πρώιμης έναρξης προεκλαμψία τα επίπεδα cffdna στο μητρικό πλάσμα είναι αυξημένα την 11η 13η εβδομάδα ο βαθμός στον οποίο το cffdna στο μητρικό πλάσμα αποτελεί δείκτη διαταραχής αρα της πλακουντοποίησης ο οίησης ή εάν αποτελεί εκδήλωση συμμετοχής στην παθογένεση της προεκλαμψίας απαιτεί περαιτέρω ρ διερεύνηση η η μέτρηση η των επιπέδων του cffdna & ο συνδυασμός του με το ιστορικό και την εκτίμηση του PI των μητριαίων αρτηριών δε βελτιώνει την αποτελεσματικότητα του screening της πρώιμηςέναρξης προεκλαμψίας
ffdna και άλλες επιπλοκές της κύησης Πρόωρος τοκετός Διεισδυτικός πλακούντας Εμβρυομητρική αιμορραγία Πολυάμνιο - λίγες μελέτες - μικρός αριθμός δειγμάτων - αντικρουόμενα αποτελέσματα - περαιτέρω διερεύνηση Υπερέμεση κύησης Ενδομήτρια υπολειπόμενη ανάπτυξη (μη σχετιζόμενη με προεκλαμψία) (Farina et al, 2004; Crowley et al, 2007; Wright & Burton 2008)
Συμπεράσματα Οι υπάρχουσες μέθοδοι προγεννητικής διάγνωσης έχουν 90% ποσοστό ανίχνευσης με 5% ψευδώς θετικά. Μέτρηση του ελεύθερου εμβρυικού DNA στη μητρική κυκλοφορία δίνει τη δυνατότητα για σημαντικά καλύτερη απόδοση διαλογής, ίσως ακόμη και από την επεμβατική διάγνωση. Περισσότερες χρωμοσωμικές ανωμαλίες θα πρέπει να είναι σε θέση να αναγνωρίζονται από αυτή την προσέγγιση. Άλλες γενετικές ανωμαλίες, συμπεριλαμβανομένων ς γ ς μ ς, μ ρ μβ μ μονογονιδιακών νοσημάτων, μπορεί επίσης να ταυτοποιηθούν στο μέλλον.