Ελεύθερο εμβρυϊκό DNA. Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος.

Transcript

1 Ελεύθερο εμβρυϊκό DNA. Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος. Παναγιώτης Μπεναρδής MD, DipFetMed(FMF) Μαιευτήρας-Γυναικολόγος Ειδικός στην Ιατρική Εμβρύου & Υπερηχογραφία Diploma in Fetal Medicine (FMF, London)

2 Αποποίηση ευθύνης: Δεν υφίσταται σύγκρουση συμφερόντων

3 Σκοποί

4 Παγκόσμιο μέγεθος 1.5 bn $ There s been about 800,000 women in the past year in the U.S. who have had an NIPT, Eric Topol, a professor of genomics at the Scripps Research Institute, told BuzzFeed News. That s a lot about 20% of the 4 million total babies born each year. It s the hottest molecular test ever in the history of medicine.

5 Ορισμοί Lo et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997; 350:485 Ο πλακούντας είναι ένας ψευδο-κακοήθης ιστός. Είναι διηθητικός, έχει αυξημένη ταχύτητα μιτώσεων και απόπτωσης, εκφράζει ογκογονίδια και χαίρει επιλεκτικής ανοσίας. NIPD (Non Invasive Prenatal Diagnosis) NIPS, NIPT (Non Invasive Prenatal Screening, Testing) cfdna (cell free DNA)

6 cfdna cfdna= cfmdna + cffdna cffdna= πλακουντιακό, ΟΧΙ εμβρυικό Εμβρυικό κλάσμα= 10-20% Ανιχνεύσιμο από 4 wks, 4% από 10 wks cffdna τμήματα= 150 bp, αντιπροσωπεύεται ολόκληρο το γονιδίωμα cffdna= σταθερό cffdna= μικρός χρόνος ημιζωής< 20 mins, δεν ανιχνεύεται εντός 2 hrs από τον τοκετό

7 Εμβρυικό κλάσμα (1)

8 Εμβρυικό κλάσμα (2) 3% 50% των Ελληνίδων είναι υπέρβαρες 20% των Ελληνίδων είναι παχύσαρκες

9 Εφαρμογές Rhesus Εμβρυικό φύλο Χρωμοσωμικές ανωμαλίες Αχονδροπλασία (NIPD!)? Κυστική ίνωση? Μεσογειακή αναιμία

10 11 wks Rhesus

11 Εμβρυικό φύλο DR= 99,5% Διαταραχές ανάπτυξης φύλου (DSDs) Duchenne MD, 50% άρρενα πάσχοντα CAH, άρρενα δεν πάσχουν

12 Γενετικά σύνδρομα ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΟ (δεν χρειάζεται ΑΜΝΙΟ) για: o Αχονδροπλασία o Θανατηφόρος δυσπλασία o Apert syndrome

13 Μέθοδοι NGS o Shotgun-MPS (Quantitive) MaterniT21 (Sequenom) Verifi (Illumina) PrenaTest (LifeCodexx) Prenatalis (Prenatalis) NIFTY (BGI) BambniTest (BerryGenomics) o Targeted-MPS (Quantitive) Harmony (Ariosa/ Roche) Clarigo (Multiplicom) o Targeted Capture sequences Veracity (NIPD Genetics) o SNP-Targeted (Qualitive) Panorama (Natera) o ION Semiconductor, Desktopbased NGS IONA test (Premaitha) NIFTY (BGI) Non-NGS (qpcr) o Methylation PrenaTest (LifeCodexx) Size based o? Other

14 Shotgun-MPS (MPSS) Μικρός αριθμός no call Δυνατότητα πρόσθεσης νέου περιεχομένου (microdeletions κλπ) Υψηλό κόστος Counting statistics, επιλογή πληθυσμού αναφοράς Χρειάζεται μεγάλος αριθμός DNA fragments Fetal fraction> 4% Διόρθωση για GC base content (T21/18= υψηλό GC, T13/XO= χαμηλό) Ποσότητα μη πληροφοριακών sequences Multiplexing με χρήση bar-codes

15 Targeted-MPS (CSS) Χαμηλότερο κόστος Μεγαλύτερος αριθμός no call Περιορισμένη δυνατότητα πρόσθεσης νέου περιεχομένου (microdeletions κλπ) Πολύπλοκα bioinformatics Απώλεια πληροφοριών Counting statistics, επιλογή πληθυσμού αναφοράς Fetal fraction> 4% Διόρθωση για GC base content (T21/18= υψηλό GC, T13/XO= χαμηλό)

16 SNP-Targeted Πληροφορίες γονότυπου: προέλευση ανευπλοειδίας, κληρονομικότητα Επεκτασιμότητα σε microdeletions κλπ Πολύπλοκα bioinformatics SNPs= 1.6% of genome enrichment, higher amplification, deeper sequencing Υψηλά no call rates Αποκάλυψη πληροφοριών πατρότητας/ συγγένειας Δυσκολία ανάλυσης σε καταστάσεις donor egg και διδύμων

17 Επιγενετική μέθοδος: o Differentially methylated regions (DMRs) o Methylation dependent immunoprecipitation (MeDIP) o Methylation specific PCR o Methylation Ratio Χαμηλό κόστος Ευκολία χρήσης σε τοπικά εργαστήρια Δυσκολία επιλογής ικανών DMRs Νέα μέθοδος: μικρός αριθμός ασθενών Methylation

18 Βήματα NGS Προετοιμασία + PCR Αλληλούχιση Αντιστοίχιση Μέτρημα Ερμηνεία + Αποτέλεσμα

19 Sequencing, mapping, counting, analysis

20 Πιστοποίηση CE PrenaTest, LifeCodexx IONA test, Premaitha Clarigo, Multiplicom Harmony, Ariosa/ Roche?Veracity, NIPD Genetics

21 Κριτήρια επιλογής test Κόστος Πιστοποίηση CE Reporting (εμβρυικό κλάσμα, % no-call, λεκτική διατύπωση)

22

23

24 Κλινική εφαρμογή

25 Αμνιοπαρακέντηση & λήψη τροφοβλάστης 2015 DR= 99,99% (99,98%) arraycgh NS NS

26 Δοκιμασίες ελέγχου

27 Επιδόσεις DR% FPR% LR+ve LR-ve T21 99,7 0, ,003 T18 98,2 0, ,018 T13 99,0 0, ,010 Accepted article, UOG Apr 2017 TL FPR= 0,13% T21, T18: επιδόσεις ανεξάρτητες μεθόδου (MPSS, CSS, SNP), ηλικίας κύησης και πληθυσμιακού κινδύνου Τ13: λίγα περιστατικά Φυλετικά χρωμοσώματα & δίδυμες κυήσεις: ανεπαρκής αριθμός περιστατικών

28 «Μη αποτέλεσμα»- No call result 1-5% σε μονήρεις, >5% σε δίδυμα Πιο συχνά σε υπέρβαρες/ παχύσαρκες, δίδυμα, IVF Αιτίες: xειρισμός δείγματος, αποτυχία αναλυτών, χαμηλό fetal fraction Επανάληψη εξέτασης: 100% επιτυχής σε χειρισμό δείγματος, 75% σε αποτυχία αναλυτών και 50% σε χαμηλό fetal fraction Χαμηλό fetal fraction σε T18, T13?AMNIO

29 «Μη αποτέλεσμα»

30 Κλινική εφαρμογή (1 ο μοντέλο) 5% Υψηλότερο ποσοστό ανίχνευσης ΑΛΛΑ με το υψηλότερο κόστος, υψηλότερο ποσοστό αμνιοπαρακεντήσεων (ΜΟΝΟ 1%) και χωρίς US στο 95% των γυναικών???

31 Κλινική εφαρμογή (2 ο μοντέλο) 3-5% 0,4% Χαμηλότερο κόστος, μικρότερο ποσοστό αμνιοπαρακεντήσεων ΑΛΛΑ και μικρότερο ποσοστό ανίχνευσης (ΠΕΡΙΠΟΥ ΙΔΙΟ ΜΕ ΑΔ+PAPPA)

32 Κλινική εφαρμογή (3 ο μοντέλο) Μεσαίο κόστος, μεσαίο ποσοστό ανίχνευσης και μεσαίο ποσοστό αμνιοπαρακεντήσεων (0,9%- ΣΧΕΔΟΝ ΙΔΙΟ ΜΕ ΤΟ 1%)

33 Δίδυμος κύηση (1)

34 Δίδυμος κύηση (2)

35 Ανευπλοϊδίες φύλου Το θανατηφόρο Turner είναι εύκολα ανιχνεύσιμο με U/S Οι περισσότερες άλλες ανωμαλίες είναι ήπιες & χωρίς πνευματική καθυστέρηση Το 50% των ανευπλοϊδιών είναι μωσαϊκά, με υψηλά ποσοστά μητρικού μωσαϊκισμού Οι επιδόσεις του ΝΙΡΤ είναι αμφίβολες: οι αποτυχίες είναι υψηλότερες της Τ21 η ανίχνευση είναι χαμηλότερη της Τ21 τα FPR είναι υψηλοτερα της Τ21 το PPV είναι σημαντικά χαμηλότερο της Τ21 Στο θετικό αποτέλεσμα υπάρχει ανάγκη αμνιοπαρακέντησης

36 Microdeletions (1)

37 Microdeletions (2)

38 Είναι το περισσότερο, καλύτερο;

39 Θετική προγνωστική αξία (PPV) 25 yo 40 yo Sens % Spec % PPV % PPV % T21 99,3 99, T18 97,4 99, T13 91,6 99, Sex chr 91 99, ACOG/SMFM Sep 2015

40 Προβληματισμοί (1) Νοητική υστέρηση σύνδρομο Down NIPT= screening, όχι διαγνωστικό - δεν αντικαθιστά την αμνιοπαρακέντηση NIPT= cfdna testing, όχι μη επεμβατικό αλλά ελάχιστα επεμβατικό, όχι το μοναδικό μη επεμβατικό (πχ US, βιοχημικά κλπ) No call = 50% ανωμαλίες (Τ18, triploidy) + 50% αποτυχία εργαστηρίου. Τα No call προσθέτουν 5,1% στο FPR. Τα microdeletions προσθέτουν τουλάχιστον 1% στο FPR. Επομένως το συνολικό FPR είναι μεγαλύτερο της ΑΔ+PAPPA

41 Προβληματισμοί (2) Πιθανότητα αποβολής μετά από αμνιοπαρακέντηση= 0,11% (ΟΧΙ 1%) και μάλιστα ΜΗ στατιστικά σημαντική από το background risk (CVS= 0,22%, μη στατιστικά σημαντική) Με βάση την πιθανότητα αποβολής 0,11%, οι μελέτες κόστους/όφελους για το NIPT (που γίνονται με την παραδοχή του ρίσκου 1%) ΔΕΝ ισχύουν

42 Προβληματισμοί (3) Στις μελέτες NIPT, τα δείγματα δεν εξετάσθηκαν τυφλά, τα κριτήρια επιλογής ασθενών και τα αποτελέσματα (outcomes) δεν περιγράφονται σαφώς Οι εταιρείες καθοδηγούν, χορηγούν και επιβλέπουν τόσο τις μελέτες όσο και την εφαρμογή στην πράξη Το NIPT διαφημίζεται στα ΜΜΕ ως αντικαταστάτης της αμνιοπαρακέντησης Η μεγάλη διαφήμιση και ταχεία προώθηση δεν επέτρεψε τη δομημένη εκπαίδευση ιατρών/μαιών Ελάχιστες μελέτες σε πληθυσμούς χαμηλού ρίσκου χωρίς σύγκριση ανάμεσα στα διάφορα test Δεδομένα μελετών παραμένουν σε περιορισμένη πρόσβαση/κρυφά

43 Προβληματισμοί (4) Εμπόδια στην πρόσβαση o Κόστος o Centralization of labs Microarrays o Amnio με microarrays o? NIPT με microarrays

44 Προβληματισμοί (5) Harmony Panorama MaterniT21 Verifi InformaSeq 2 μη έγκυες γυναίκες 44 ετών δηλωθείσες ως έγκυες 12 wks, Σεπ- Οκτ 2014 Το εγχείρημα ήταν χρηματοδοτούμενο από εταιρεία (Ariosa) Τα test δεν είναι σχεδιασμένα για μη έγκυες Άμεση ανάγκη για quality control / FDA

45 Κολλέγια/ Εταιρείες SOGC, Feb 2013: optional σε γυναίκες υψηλού ρίσκου RCOG, Mar 2014: εν αναμονή εξελίξεων RANZCOG, Mar 2015: εν αναμονή εξελίξεων ISUOG, Jun 2014: υπερηχογράφημα 1ου τριμήνου και μετά 3 επιλογές (combined test, NIPT, επεμβατικό)

46 Συστάσεις ACOG/SMFM Sep 2015 (1) Συζήτηση για πλεονεκτήματα, μειονεκτήματα και εναλλακτικές για όλες τις μεθόδους screening και διαγνωστικές (συμπεριλαμβανομένης και της επιλογής no testing) πρέπει να γίνεται με όλες τις ασθενείς Με βάση τις επιδόσεις του παραδοσιακού screening, τους περιορισμούς του cfdna και τα περιορισμένα στοιχεία για το κόστος σε χαμηλού ρίσκου πληθυσμούς, το παραδοσιακό screening παραμένει η μέθοδος επιλογής για screening πρώτης γραμμής στο γενικό πληθυσμό Παρότι κάθε γυναίκα μπορεί να επιλέξει το cfdna ως screening ανεξάρτητα από το risk status της, θα πρέπει να κατανοήσει τα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα αυτού του screening στα πλαίσια των υπόλοιπων επιλογών της (screening και διαγνωστικών) Το cfdna screening πρέπει να γίνεται μόνο για τις κοινές τρισωμίες και μόνο αν επιλέγεται για τα φυλετικά χρωμοσώματα

47 Συστάσεις ACOG/SMFM Sep 2015 (2) Δεν πρέπει να γίνεται routine cfdna screening για microdeletions Θετικό αποτέλεσμα cfdna πρέπει να επιβεβαιώνεται με διαγνωστική εξέταση Παράλληλο ή ταυτόχρονο screening με πολλαπλές μεθόδους δεν είναι cost-effective και δεν πρέπει να γίνεται Αποφάσεις αντιμετώπισης κύησης (συμπεριλαμβανομένης διακοπής) δεν πρέπει να βασίζονται μόνο στο cfdna screening Σε περίπτωση no call result (μη απάντηση, ακαθόριστη απάντηση κλπ) πρέπει να προσφέρεται περαιτέρω συμβουλευτική, υπερηχογραφική εκτίμηση και διαγνωστική εξέταση λόγω του αυξημένου κινδύνου τρισωμιών Το cfdna δεν συνιστάται σε πολύδυμες (και δίδυμες) κυήσεις

48 Συστάσεις ACOG/SMFM Sep 2015 (3) Όταν μία δομική ανωμαλία αναγνωρίζεται στο υπερηχογράφημα πρέπει να προσφέρεται διαγνωστική εξέταση και όχι cfdna Οι ασθενείς πρέπει να γνωρίζουν ότι αρνητική εξέταση cfdna δεν εξασφαλίζει μη πάσχον έμβρυο Το cfdna screening δεν υπολογίζει πιθανότητες για ανωμαλίες όπως πχ NTDs ή κοιλιακού τοιχώματος. Θα πρέπει επιπλέον να προσφέρεται AFP serum screening ή υπερηχογράφημα Οι ασθενείς μπορούν να αρνηθούν οποιαδήποτε μέθοδο screening ή διαγνωστική για ανευπλοειδίες

49 Εφαρμογή σε ιδιώτες ασθενείς Α: cfdna σε όλες τις γυναίκες ως πρωταρχικό 10wks και US 12 wks= υψηλότερο ποσοστό ανίχνευσης τρισωμιών (T21= 99%, T18/13= 95%, FPR= 1%), μειζόνων ανατομικών ανωμαλιών και υπολογισμός ρίσκου επιπλοκών κύησης B: Κάποιες γυναίκες ζητούν cfdna ως εναλλακτική μέθοδο των επεμβατικών μεθόδων όταν κάποια άλλη μέθοδος πρωταρχικού screening τις κατέταξε σε ομάδα υψηλού ρίσκου Γ: Κάποιες γυναίκες ζητούν cfdna ως μέθοδο περαιτέρω διαβεβαίωσης όταν κάποια άλλη μέθοδος πρωταρχικού screening τις κατέταξε σε ομάδα ενδιάμεσου ρίσκου

50 Εφαρμογή σε δημόσιο σύστημα (ΕΣΥ) Α: cfdna στις γυναίκες ενδιάμεσου ρίσκου με βάση την ΑΔ+PAPPA= καλύτερη σχέση κόστους/ επιδόσεων B: cfdna στις γυναίκες υψηλού ρίσκου με βάση την ΑΔ+PAPPA= ενδιάμεση σχέση κόστους/ επιδόσεων Γ: cfdna σε όλες τις γυναίκες ως πρωταρχικό 10wks και US 12 wks= υψηλότερο ποσοστό ανίχνευσης τρισωμιών (T21= 99%, T18/13= 95%, FPR= 1%), μειζόνων ανατομικών ανωμαλιών και υπολογισμός ρίσκου επιπλοκών κύησης αλλά και υψηλότερο κόστος

51 Κλινική εφαρμογή στο NHS (1) 2 Νοσοκομεία NHS, Oct 2013-Feb 2015, γυναίκες 1 η γραμμή screening με ΑΔ+ΡΑΡΡΑ: 1/100 high risk (3,9%), <1/2500 low risk (65,7%), 1/101-1/2500 intermediate risk (30,4%) Harmony, Ariosa ΑΔ+ΡΑΡΡΑ: Τ21= 87%, T18/13= 93%, FPR= 3,4% cfdna: T21= 98%, T18/13= 82%, FPR= 0,25%

52 Κλινική εφαρμογή στο NHS (2)

53 Κλινική εφαρμογή στο NHS (3) Το cfdna test μπορεί να εφαρμοστεί στην καθ ημέρα κλινική/ πραγματική πράξη Είναι καλοδεχούμενο από την πλειοψηφία των γυναικών Σημαντική μείωση επεμβατικών χωρίς μείωση ανίχνευσης Τ21 (>90%) Το 1/3 των γυναικών με σαφή διάγνωση Τ21, επιλέγουν να συνεχίσουν με την κύηση- άρα καλύτερα test δεν σημαίνουν κατ ανάγκη και αυξημένο αριθμό διακοπών κύησης και επιπλέον δεν είναι σαφή τα οικονομικά οφέλη Στην ομάδα high risk το 66% επιλέγει επεμβατικό test με το παραδοσιακό screening (ΑΔ+ΡΑΡΡΑ) ενώ με την προσφορά cfdna το ποσοστό αυτό μειώνεται στο 38%

54 Εφαρμογή σε όλες τις γυναίκες

55 Σας ευχαριστώ!