FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, High Molecular Weight Clone 34βE12 Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Κωδικός IS051 Προοριζόµενη χρήση Περίληψη και επεξήγηση Παρεχόµενο αντιδραστήριο Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, High Molecular Weight (HMW), Clone 34βE12 (1), Readyto-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus), προορίζεται για χρήση στην ανοσοϊστοχηµεία µαζί µε τα όργανα Dako Autostainer/Autostainer Plus. Το αντίσωµα αυτό είναι χρήσιµο για την αναγνώριση των βασικών κυττάρων και του πλακώδους επιθηλίου σε διάφορους ιστούς. Τα θετικά αποτελέσµατα υποβοηθούν τη διαφοροποίηση ανάµεσα στα καλοήθη δείγµατα προστάτη και προστατικού αδενοκαρκινώµατος, καθώς και την ανίχνευση της διαφοροποίησης του πλακώδους επιθηλίου σε ατελώς διαφοροποιηµένους όγκους. Η κλινική ερµηνεία της χρώσης ή της απουσίας χρώσης πρέπει να συµπληρώνεται µε µορφολογικές µελέτες που χρησιµοποιούν κατάλληλους µάρτυρες και πρέπει να αξιολογούνται στο πλαίσιο του κλινικού ιστορικού του ασθενούς και άλλων διαγνωστικών εξετάσεων από ειδικό παθολογοανατόµο. Οι κυτοκερατίνες είναι κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες των ενδιάµεσων ινιδίων, ζωτικής σηµασίας για την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων. Έχουν ταυτοποιηθεί περίπου είκοσι διαφορετικές κυτοκερατίνες, οι οποίες ταξινοµήθηκαν και απαριθµήθηκαν σύµφωνα µε τα µοριακά βάρη και τα ισοηλεκτρικά τους σηµεία (2). Γενικά, οι περισσότερες κυτοκερατίνες χαµηλού µοριακού βάρους (40 54 kda) κατανέµονται στο µη πλακώδες επιθήλιο και έχουν, στον κατάλογο του Moll, τους αριθµούς 7-8 ή/και 17-20 (3). Οι υψηλού µοριακού βάρους κυτοκερατίνες (48 67 kda) απαντούν στο πλακώδες επιθήλιο και στον κατάλογο του Moll έχουν τους αριθµούς 1-6 ή/και 9-16 (3). Ανατρέξτε στις Γενικές οδηγίες για την ανοσοϊστοχηµική χρώση της Dako ή στις οδηγίες του συστήµατος ανίχνευσης των διαδικασιών IHC. Έτοιµο προς χρήση µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικού που παρέχεται σε υγρή µορφή σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/l. Κλώνος: 34βE12(1) Ισότυπος: IgG 1, κάππα. Ανοσογόνο ιαλυτοποιηµένο εκχύλισµα ανοσογόνου κερατίνης από ανθρώπινη κεράτινη στοιβάδα (1). Ειδικότητα Προφυλάξεις Φύλαξη Έχει διαπιστωθεί ότι το Anti-Cytokeratin, High Molecular Weight (Anti-CK HMW), Clone 34βE12 αντιδρά µε τις πρωτεΐνες 66, 57, 51 και 49 kda σε στυπώσεις Western που αντιστοιχούν στις κυτοκερατίνες 1, 5, 10 και 14 του καταλόγου του Moll (1, 2, 4). 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Το προϊόν αυτό περιέχει νατραζίδιο (NaN 3), µια ιδιαίτερα τοξική χηµική ουσία σε καθαρή µορφή. Στις συγκεντρώσεις προϊόντος, παρόλο που δεν έχει ταξινοµηθεί ως επικίνδυνο, το νατραζίδιο ενδέχεται να αντιδράσει µε τις µολύβδινες ή χάλκινες υδραυλικές σωληνώσεις και να δηµιουργήσει ιδιαίτερα εκρηκτικές εναποθέσεις µεταλλικών αζιδίων. Κατά την απόρριψη, ξεπλύνετε µε άφθονο νερό για να αποτρέψετε τη συσσώρευση µεταλλικών αζιδίων στις σωληνώσεις. 3. Όπως ισχύει για κάθε προϊόν βιολογικής προέλευσης, πρέπει να εφαρµόζονται οι κατάλληλες διαδικασίες χειρισµού. 4. Πρέπει να φοράτε κατάλληλο εξοπλισµό προσωπικής προστασίας για να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. 5. Όσο διάλυµα δεν χρησιµοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς και κρατικούς κανονισµούς. Αποθηκεύστε σε θερµοκρασία 2 8 C. Μην το χρησιµοποιείτε µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στο φιαλίδιο. Αν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που προδιαγράφονται, ο χρήστης πρέπει να επαληθεύσει τις συνθήκες. εν υπάρχουν εµφανή σηµεία που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Για το λόγο αυτό, οι θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες πρέπει να εξετάζονται ταυτόχρονα µε τα δείγµατα ασθενών. Αν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη χρώση, που δεν µπορεί να εξηγηθεί από τις διακυµάνσεις των εργαστηριακών διαδικασιών και υπάρχουν υποψίες για πρόβληµα στο αντίσωµα, επικοινωνήστε µε το Τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako. (115645-002) 307118GR_002_IS051/2012.07 1/5
Σύντοµος οδηγός* Βήµα Σχόλια Μονιµοποίηση Φορµαλίνη Προκατεργασία EnVision FLEX, High ph (Κωδικός K8004) 20 λεπτά HIER, 3 σε 1 χρησιµοποιώντας PT Link και PT Link Rinse Station Εύρος αραίωσης Έτοιµο προς χρήση 20 λεπτά επώαση Ρυθµιστικό διάλυµα Προαραιωµένο αραίωσης Αρνητικός FLEX Negative Control, Mouse 20 λεπτά επώαση µάρτυρας (Κωδικός IS750) Εποπτική παρουσίαση EnVision FLEX, High ph (Κωδικός K8010) 20 min επώαση, 2x5 λεπτά επώαση µε DAB+ Αντίχρωση EnVision FLEX Hematoxylin (Κωδικός 5 λεπτά επώαση K8018) Ιστός µάρτυρα Αµυγδαλή Κυτταροπλασµατική χρώση Αντικειµενοφόρες/ Επικάλυψη FLEX IHC Microscope Slides (Κωδικός K8020) Συνιστάται για καλύτερη προσκόλληση. Απαιτείται µόνιµη επικάλυψη Εξοπλισµός οργάνων Dako Autostainer/Autostainer Plus Χρησιµοποιείτε φιαλίδια ειδικά για το όργανο (S3425) *Ο χρήστης πρέπει πάντοτε να διαβάζει το ένθετο της συσκευασίας για λεπτοµερείς οδηγίες σχετικά µε τη διαδικασία χρώσης και το χειρισµό του προϊόντος. Προετοιµασία των δειγµάτων ιαδικασία χρώσης Τοµές σε παραφίνη: Το αντίσωµα µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τη σήµανση τοµών ιστού µονιµοποιηµένων µε φορµαλίνη και εγκλεισµένων σε παραφίνη. Τα δείγµατα των ιστών πρέπει να κόβονται σε τοµές πάχους περίπου 4 µm. Προκατεργασία: Οι µονιµοποιηµένες µε φορµαλίνη και εγκλεισµένες σε παραφίνη τοµές ιστών πρέπει να υποβάλλονται σε κατεργασία µε θερµικώς επαγόµενη ανάκτηση επιτόπου (HIER). Τα βέλτιστα αποτελέσµατα λαµβάνονται όταν ο ιστός υφίσταται προκατεργασία µε HIER χρησιµοποιώντας αραιωµένο EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (Κωδικός K8004). Η αποπαραφίνωση, η επανυδάτωση και η ανάκτηση επιτόπου είναι δυνατόν να πραγµατοποιηθούν στο Dako PT Link (Κωδικός PT100/PT101). Ανατρέξτε στον Οδηγό χρήσης του PT Link για λεπτοµέρειες. Οι παρακάτω παράµετροι πρέπει να χρησιµοποιηθούν για το PT Link: Θερµοκρασία προθέρµανσης: 65 C, θερµική ανάκτηση επιτόπου και χρόνοι: 97 C για 20 (±1) λεπτά, αφήστε το να κρυώσει στους 65 C. Αφαιρέστε τη σχάρα των αντικειµενοφόρων από το δοχείο PT και αµέσως βυθίστε τις αντικειµενοφόρες σε δοχείο (π.χ. PT Link Rinse Station, Κωδικός PT109) που περιέχει αραιωµένο σε θερµοκρασία δωµατίου EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (Κωδικός K8007). Αφήστε τις αντικειµενοφόρες στο Wash Buffer για 1 5 λεπτά. Οι τοµές ιστού δεν πρέπει να στεγνώνουν κατά τη διάρκεια της κατεργασίας ή κατά τη διάρκεια των παρακάτω ανοσοϊστοχηµικών διαδικασιών χρώσης. Για καλύτερη προσκόλληση των τοµών ιστού στις υάλινες αντικειµενοφόρες πλάκες, συνιστάται η χρήση FLEX IHC Microscope Slides (Κωδικός K8020). Μετά τη χρώση, οι τοµές πρέπει να αφυδατωθούν, να υποστούν διαύγαση και να επικαλυφθούν χρησιµοποιώντας µέσα µόνιµης επικάλυψης. Εποπτική παρουσίαση: Το συνιστώµενο σύστηµα εποπτικής παρουσίασης είναι το EnVision FLEX, High ph (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Κωδικός K8010). Πρόγραµµα: Χρησιµοποιήστε το πρωτόκολλο που δίνεται παρακάτω. Τα αντιδραστήρια πρέπει να αραιώνονται κατάλληλα πριν τη χρήση. Όλα τα βήµατα πρέπει να πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). 1. Επωάστε την τοµή ιστού µε 200 µl EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (Κωδικός DM821) για 5 (±1) λεπτά 2. Ξεπλύνετε σε EnVision FLEX Wash Buffer (Κωδικός K8007) για 1 5 λεπτά 3. Επωάστε την τοµή ιστού µε 200 µl Primary Antibody (Κωδικός IS051) για 20 (±1) λεπτά 4. Ξεπλύνετε σε EnVision FLEX Wash Buffer (Κωδικός K8007) για 1 5 λεπτά 5. Επωάστε την τοµή ιστού µε 200 µl EnVision FLEX/HRP (Κωδικός DM822) για 20 (±1) λεπτά 6. Ξεπλύνετε σε EnVision FLEX Wash Buffer (Κωδικός K8007) για 1 5 λεπτά 7. Επωάστε την τοµή ιστού µε 200 µl EnVision FLEX Wash Buffer (Κωδικός K8007) για 5 (±1) λεπτά [βήµα Auxiliary (Βοηθητικό)] 8. Ξεπλύνετε σε EnVision FLEX Wash Buffer (Κωδικός K8007) για 1 5 λεπτά 9. Επωάστε την τοµή ιστού µε 200 µl EnVision FLEX Substrate Working Solution (Κωδικοί DM823 και DM827) για 5 (±1) λεπτά 10. Επωάστε την τοµή ιστού µε 200 µl EnVision FLEX Substrate Working Solution (Κωδικοί DM823 και DM827) για 5 (±1) λεπτά 11. Ξεπλύνετε σε EnVision FLEX Wash Buffer (Κωδικός K8007) για 1 5 λεπτά 12. Συνεχίστε µε αντίχρωση της αντικειµενοφόρου µε EnVision FLEX Hematoxylin (Κωδικός K8018) για 5 (±1) λεπτά 13. Ξεπλύνετε σε απιονισµένο νερό για 1 5 λεπτά 14. Επωάστε την τοµή ιστού µε 200 µl EnVision FLEX Wash Buffer (Κωδικός K8007) για 5 (±1) λεπτά 15. Ξεπλύνετε σε απιονισµένο νερό για 1 5 λεπτά 16. Επικαλύψτε τις αντικειµενοφόρες µε µόνιµο µέσο επικάλυψης ιάγραµµα προγραµµατισµού για τη συνιστώµενη δοκιµασία: (115645-002) 307118GR_002_IS051/2012.07 2/5
Το βήµα Auxiliary (Βοηθητικό) πρέπει να ρυθµιστεί στο «rinse buffer» (ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης) σε κύκλους χρώσης µε 10 αντικειµενοφόρες. Για κύκλους χρώσης µε περισσότερες από 10 αντικειµενοφόρες, το Auxiliary βήµα πρέπει να ρυθµιστεί στο «none» (κανένα). Αυτό εξασφαλίζει συγκρίσιµους χρόνους πλύσης. Για λεπτοµέρειες, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο χρήσης για το συγκεκριµένο όργανο. Εάν τα πρωτόκολλα δεν είναι διαθέσιµα στο εν χρήσει όργανο Dako Autostainer, επικοινωνήστε µε την τεχνική υπηρεσία της Dako. Αντίχρωση: Η συνιστώµενη αντίχρωση είναι EnVision FLEX Hematoxylin (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Κωδικός K8018). Συνιστάται η χρήση µη υδατικού µέσου µόνιµης επικάλυψης. Μάρτυρες: Αρνητικοί και θετικοί µάρτυρες πρέπει να αναλύονται ταυτόχρονα χρησιµοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο όπως και για τα δείγµατα των ασθενών. Ο θετικός ιστικός µάρτυρας πρέπει να περιλαµβάνει κύτταρα πλακώδους επιθηλίου, τα δε κύτταρα/δοµές πρέπει να παρουσιάζουν πρότυπα αντίδρασης όπως εκείνα που περιγράφονται στην ενότητα «Χαρακτηριστικά απόδοσης» σε όλα τα θετικά δείγµατα. Το προτεινόµενο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα είναι το FLEX Negative Control, Mouse (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Κωδικός IS750). Ερµηνεία χρώσης Χαρακτηριστικά απόδοσης Το πρότυπο κυτταρικής χρώσης είναι κυτταροπλασµατικό. Φυσιολογικοί ιστοί (5): Τύπος ιστού (Πλήθος που εξετάστηκε) Θετικά στοιχεία ιστού Τύπος ιστού (Πλήθος που εξετάστηκε) Θετικά στοιχεία ιστού Επινεφρίδιο (3) 0/3 Ωοθήκη (3) 3/3 Επιφανειακό επιθήλιο (80 100%), Μυελός των οστών (3) 0/3 Πάγκρεας (3) 3/3 Επιθήλιο παγκρεατικού πόρου (50 80%), Μαστός (2) 2/2 Επιθήλιο αδένων και πόρων Παραθυρεοειδής (3) 0/3 (80%), Παρεγκεφαλίδα (3) 0/3 Υπόφυση (3) 0/3 Κυρίως εγκέφαλος (3) 0/3 Προστάτης (3) 3/3 Βασικό επιθήλιο και επιθήλιο πόρου (90%), Τράχηλος της µήτρας (2) 2/2 Επιφανειακό πλακώδες επιθήλιο (100%), Σιελογόνος αδένας (3) 3/3 Επιθήλιο εκφορητικού πόρου (100%), Παχύ έντερο (3) 3/3 Επιφανειακό επιθήλιο (10%), έρµα (3) 3/3 Πλακώδες επιθήλιο (100%), Οισοφάγος (3) 3/3 Πλακώδες επιθήλιο (100%), 3/3 Επιθήλιο ιδρωτοποιών πόρων και αδένων (80 100%), Καρδιά (3/3) 0/3 1/3 Επιθήλιο σµηγµατογόνων αδένων (100%) Νεφρός (3) 3/3 Επιθήλιο νεφρικών σωληναρίων (10 30%), Λεπτό έντερο (3) 3/3 Επιθήλιο (20 50%), Ήπαρ (3) 3/3 Επιθήλιο χοληφόρου πόρου (50%), Σπλήνας (3) 0/3 (115645-002) 307118GR_002_IS051/2012.07 3/5
Πνεύµονας (3) 3/3 Βρογχικό επιθήλιο (10%), Στόµαχος (3) 3/3 Επιθήλιο γαστρικών κρυπτών και αδένων (10 30%), Όρχις (3) 0/3 3/3 Κυψελιδικό επιθήλιο (50%) Μεσοθηλιακά 2/2 Μεσοθήλιο (100%), Θύµος (3) 3/3 Πλακώδες επιθήλιο (100%), κύτταρα (2) Μυς, καρδιακός (3) 0/3 Θυρεοειδής (3) 1/3 Θυλακιώδη κύτταρα (5%), Μυς, σκελετικός (3) 0/3 Αµυγδαλή (3) 3/3 Πλακώδες επιθήλιο (100%), Νεύρο, περιφερικό (3) 0/3 Μήτρα (2) 2/2 Επιθήλιο του ενδοµητρίου (5 80%), Παθολογικοί ιστοί: Θετική ανοσοδραστικότητα µε αντίσωµα έναντι του CK HMW, 34βE12 έχει αναφερθεί για πορώδες καρκίνωµα, και καρκίνωµα πλακωδών ή µεταβατικών κυττάρων, τα οποία περιλαµβάνουν: καρκίνωµα πλακωδών κυττάρων του δέρµατος, του πνεύµονα και του ρινοφάρυγγα, πορώδες καρκίνωµα του µαστού, του παγκρέατος, του χοληφόρου πόρου και του σιελογόνου αδένα, όπως επίσης και καρκινώµατα των µεταβατικών κυττάρων της ουροδόχου κύστεως και του ρινοφάρυγγα καθώς και θυµώµατα (6-11). Έχει επίσης διαπιστωθεί ότι το αντι-ck HMW, 34βE12 αναγνωρίζει ως θετικά τα επιθηλιακά µεσοθηλιώµατα, αλλά δεν παρουσίασε αντίδραση µε σαρκωµατοειδή ή δεσµοπλαστικά µεσοθηλιώµατα (12). Μεταβλητή θετικότητα µε αντι-ck HMW 34βE12 έχει βρεθεί σε αδενοκαρκινώµατα της ωοθήκης, της γαστρεντερικής οδού και του θυρεοειδούς. Οι όγκοι που αναφέρθηκαν ότι είναι κατά ένα µεγάλο µέρος αδρανείς µε τον κλώνο 34βE12 περιλαµβάνουν αδενώµατα των ενδοκρινών οργάνων, καρκινώµατα του ήπατος (ηπατοκυτταρικό καρκίνωµα), όγκους του ενδοµητρίου, των νεφρών και νευροενδοκρινείς όγκους (6, 7, 11). Στον προστάτη, ο κλώνος 34βE12 επισηµαίνει θετικά τα βασικά κύτταρα καλοηθών αλλοιώσεων, συµπεριλαµβανοµένων της ατροφίας, της άτυπης αδενωµατώδους υπερπλασίας και της µετασκληρωτικής υπερπλασίας. Η απουσία χρώσης της βασικής στιβάδας µε αντι-ck HMW, 34βE12 υποδηλώνει τη διάγνωση καρκίνου του προστάτη, χωρίς όµως να αποτελεί διάγνωση κακοήθειας και απαιτεί άλλα µορφολογικά δεδοµένα (3, 7, 13-15). Ο κλώνος αντι-ck HMW 34βE12 έχει αναφερθεί ότι επισηµαίνει κύτταρα όγκου σε ένα υποσύνολο κυψελοειδών αδενοκαρκινωµάτων (3,15). Αναληθής ανοσοχρώση αστροκυττωµάτων έχει επίσης αναφερθεί µε τον κλώνο 34βE12 (7,16). Βιβλιογραφία 1. Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to intermediate filament proteins of human cells: Unique and cross-reacting antibodies. J Cell Biol 1982; 95:414-24. 2. Moll R, Franke WW, Schiller DL. The catalog of human cytokeratins: Patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982; 31:11-24. 3. Miettinen M. Keratin immunohistochemistry: update of applications and pitfalls. Pathol Ann 1993; 28:113-43. 4. Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to human intermediate filament proteins II. Distribution of filaments in normal human tissues. Amer J Pathol 1984; 114:309-21. 5. IR051(IHC003-D09346). 6. Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to human intermediate filament proteins. III. Analysis of tumors. Am J Clin Pathol.1985 Oct;84(4):413-24. 7. Diagnostic immunohistochemistry: theranostic and genomic applications. Dabbs, David J. 3rd ed. Philadelphia, PA : Saunders /Elsevier, 2010. 8. Hurlimann J, Gardiol D. Immunohistochemistry in the differential diagnosis of liver carcinomas. Amer J Surg Pathol 1991; 15:280-8. 9. Dairkee SH, Puett L, Hackett AJ. Expression of basal and luminal epithelium-specific keratins in normal, benign and malignant breast tissue. J Nat Can Inst 1988; 80:691-5. 10. Thike AA, Cheok PY, Jara-Lazaro AR, Tan B, Tan P, Tan PH. Triple-negative breast cancer: clinicopathological characteristics and relationship with basal-like breast cancer. Mod Pathol 2010;23(1):123-33. 11. Gown AM, Vogel AM. Anti-intermediate fillament monoclonal antibodies; tissue-specific tools in tumor diagnosis. Surv Synth Pathol Res. 1984;3:369-385. 12. Bolen JW, Hammar SP, McNutt MA. Reactive and neoplastic serosal tissue: a light-microscopic, ultrastructural, and immunocytochemical study. Amer J Surg Pathol 1986; 10:34-47. 13. Varma M, Amin MB, Linden MD, Zarbo RJ. Discriminant staining pattern of small glandular and preneoplastic lesions of the prostate using high molecular weight cytokeratin antibody A study of 301 consecutive needle biopsies. Mod Pathol 1997; 10:93A 14. O Malley FP, Grignon DJ, Shum DT. Usefulness of immunoperoxidase staining with high-molecular-weight cytokeratin in the differential diagnosis of small-acinar lesions of the prostate gland. Virch Arch Pathol Anat 1990; 417:191-6. 15. Brimo F, Epstein JI. Immunohistochemical pitfalls in prostate pathology. Hum Pathol 2012;43:313-24 16. Bacchi CA, Zarbo RJ, Jiang JJ, Gown AM. Do glioma cells express cytokeratin? Appl Immunohistochem 1995; 3:45-53. (115645-002) 307118GR_002_IS051/2012.07 4/5
Έκδοση 07/12 (115645-002) 307118GR_002_IS051/2012.07 5/5