ΤΟΥΡΝΗΣ Σ.

Conflict of interest: none to declare

Outline Διαγνωστική προσέγγιση ομοιοστασίας ασβεστίου Κλινική χρήση οστικών βιοχημικών δεικτών

Ομοιόσταση Ασβεστίου Κύτταρα, ιστούς, όργανα Νεφρός, Έντερο, Οστά (πλακούντας/μαστός) Ορμόνες PTH, Calcitriol, FGF23, PTHrp Αισθητήρες CaSR Phosphate sensor

Ομοιόσταση ασβεστίου Προσαρμογή του οργανισμού σε περιβάλλον αφθονίας ασβεστίου Ανάπτυξη μηχανισμών προστασίας από «δηλητηρίαση από ασβέστιο» και όχι από έλλειψη ασβεστίου Η περίσσεια προσλαμβανόμενου ασβεστίου δεν αποθηκεύεται αλλά αποβάλλεται Η καθαρή απορρόφηση Ca ποικίλει μόλις 10% υπό συνήθεις συνθήκες Φτωχή αυτορρύθμιση του ασβεστίου ούρων 24h από ορμονικούς παράγοντες. Κύρια επηρεάζεται από διατροφικούς παράγοντες. Καμία αυτορρύθμιση της ημερήσιας απώλειας από το δέρμα

Evolution of Calcium Homeostasis From water to land Parathyroids Fish: excess calcium, low phosphate Conserve Calcium Amphibians- : low calcium, excess phosphate Protect from excess phosphate Skin: Vitamin D Renal Tubule Increased flow Tubule: became complex Endocrine control: PTHR1, CaSR, 1a and 24-hydroxylase, FGF-Klotho

Ομοιόσταση ασβεστίου

Ομοιόσταση ασβεστίου Ca

Ομοιόσταση ασβεστίου PTH Ca

Ομοιόσταση ασβεστίου PTH Ca Ca, P

Ομοιόσταση ασβεστίου PTH Ca Ca, P P, Ca

Ομοιόσταση ασβεστίου PTH Ca Ca, P 1,25 (OH)2D 25 (OH)D P, Ca

Ομοιόσταση ασβεστίου PTH Ca Ca, P FGF23 1,25 (OH)2D 25 (OH)D P, Ca

Πηγές βιταμίνης D Vitamin D2 (Εργοκαλσιφερόλη - Φυτικής προέλευσης) (C24 methyl group and a double bond between C22 and C23) Vitamin D3 (Χοληκαλσιφερόλη - Ζωικής προέλευσης)

Η έκθεση στον ήλιο Η χρήση αντιηλιακών Ένδυση Mελανίνη Eποχή του έτους Γεωγραφικό Πλάτος Ηλικία Παχυσαρκία VDBP CYP 2R1 (ήπαρ και όρχι) από την calcitriol Σοβαρή ηπατική ανεπάρκεια Επαγωγή P450 PTH Υποασβεστιαμία Υποφωσφοραιμία Calcitonin PRL VDR FGF23 Υπερασβεστιαιμία Υπερφωσφοραιμία Calcitriol υπερφωσφοραιμία, calcitriol PTH Idiopathic infantile hypercalcemia (NEJM 2011;365:410-421) Local 1-OHase

Βιταμίνη D και ομοιοστασία ασβεστίου Λεπτό έντερο Απορρόφηση ασβεστίου Απορρόφηση φωσφόρου Νεφρό Επαναρρόφηση ασβεστίου Οστά Συζευτικό χόνδρο Οστεοβλάστες-οστεοκύτταρα Παραθυρεοειδείς αδένες Αναστέλλει τη σύνθεση PTH

JBMR 2007;22:1668-1671

Προσδιορισμός βιταμίνης D

Προσδιορισμός ασβεστίου Αιμοληψία χωρίς φλεβική στάση Ολονύκτια Νηστεία (νυχθημερινός ρυθμός 0.5 mg/dl: peak 13.00, nadir: 03.00) Παρατεταμένη ορθοστασία-αφυδάτωση ( 0,4-0,6 mg/dl) Διαταραχές συγκέντρωσης αλβουμίνης ( 1 gr/dl albumin > 4 gr/dl tot Ca 0.8 mg/dl) Διαταραχές του ph ( 0.1 ph prot-bound Ca 0.12 mg/dl) Μετατροπές: mmol/l * 4 = mg/dl meq/l*2 = mg/dl Ιονισμένο ασβέστιο Δυσχερής προσδιορισμός, μειωμένη διαθεσιμότητα Ορισμένες μέθοδοι απαιτούν αναερόβιες συνθήκες, διατήρηση σε πάγο, ταχεία ανάλυση Επίδραση από μεταβολές του ph, νυχθημερινός ρυθμός

Παθοφυσιολογία Υπερασβεστιαιμία Αυξημένη είσοδος ασβεστίου στην κυκλοφορία (οστάέντερο) Μειωμένη απομάκρυνση ασβεστίου Συνδυασμός αυτών Κατάταξη PTH-εξαρτώμενη PTH-ανεξάρτητη

Διαγνωστική προσέγγιση υπερασβεστιαιμίας

Υπασβεστιαμία Παθοφυσιολογία Ελαττωμένη είσοδος ασβεστίου στην κυκλοφορία Από το πεπτικό Από τα οστά Αυξημένη έξοδος ασβεστίου από την κυκλοφορία λόγω δέσμευσής του Εξωαγγειακά (μαλακά μόρια, οστεοειδές, σαπωνοποίηση λίπους) Ενδοαγγειακά (αλκάλωση, μεταγγίσεις, φάρμακα) Κατάταξη PTH: μειωμένη-ανάρμοστα φυσιολογική PTH: αυξημένη

Ανεπάρκεια βιταμίνης D Μειωμένη δερματική σύνθεση Χρήση αντιηλιακών Ηλικία Εγκαύματα Μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα Σύνδρομα δυσαπορρόφησης Παχυσαρκία Αυξημένος καταβολισμός Αντιεπιληπτικά, γλυκοκορτικοειδή, HAART, ισονιαζίδη Διαταραχή 25-υδροξυλίωσης Ηπατική ανεπάρκεια Αυξημένες απώλειες Νεφρωσικό σύνδρομο Μειωμένη σύνθεση 1,25 (ΟΗ)2 D Χρόνια νεφρική νόσος Κληρονομικές μορφές ραχίτιδος Ανθεκτική στη βιταμίνη D Τύπου 1,2,3 XLHR ADHR Επίκτητες υποφωσφοραιμικές διαταραχές ΤΙΟ PTH-ανεξάρτητη Διαταραχές δέσμευσης Ca Υπερφωσφοραιμία Οστεοβλαστικές μεταστάσεις Σύνδρομο πεινασμένων οστών Παγκρεατίτιδα Ραβδομυόλυση Αλκάλωση Μεταγγίσεις Φάρμακα Νεογνική Άλλες αιτίες Βαρέος πάσχοντες

ΥΠΟΠΑΡΑΘΥΡΕΟΕΙΔΙΣΜΟΣ Αφαίρεση/καταστροφή παραθυρεοειδών Μετεγεχειρητικός Ακτινοβολία Μεταστατική διήθηση παραθυρεοειδών Εναπόθεση βαρέων μετάλλων Αιμοχρωμάτωση/θαλασαιμία Νόσος Wilson Αυτοάνοσος Μεμονωμένος Πολλαπλές ενδοκρινικές ανεπάρκειες Διαταραχή έκκρισης της PTH με ακέραιη εκκριτική ικανότητα Υπομαγνησιαιμία Υπερμαγνησιαιμία Ενεργοποίηση CaSR (κληρονομική/επίκτητη) Γενετικές διαταραχές σύνθεσης της PTH ή της διάπλασης των παραθυρεοειδών Μεμονωμένος υποπαραθυρεοειδισμός Υποπαραθυρεοειδισμός με επιπρόσθετες εκδηλώσεις Αντίσταση στη δράση της PTH-Ψευδοϋποπαραθυρεοειδισμός 1a, 1b, 1c, 2 PHP Χονδροδυσπλασία του Blomstrand

Διάγνωση J Clin Endocrinol Metab. 2016

Ομοιόσταση ασβεστίου PTH Ca Ca, P FGF23 1,25 (OH) 2 D 25 (OH)D P, Ca

Ομοιόσταση ασβεστίου FGF23 PTH Ca Ca, P PHPT Ca P PTH Uca 25D 1.25(OH) 2 D HYPOP Ca P PTH Uca 25D 1.25(OH) 2 D 1,25 (OH) 2 D PHP Ca P PTH Uca 25D 1.25(OH) 2 D 25 (OH)D P, Ca

Ομοιόσταση ασβεστίου PTH Ca Ca, P CKD PTH Ca P Uca / 25D 1.25(OH) 2 D FGF23 1,25 (OH) 2 D VITD DEF PTH Ca P Uca 25D / 1.25(OH) 2 D 25 (OH)D P, Ca

Ομοιόσταση ασβεστίου FGF23 PTH Ca Ca, P VITD INTOXICATION Ca P PTH Uca 25D 1.25(OH) ΤΟΥΡΝΗΣ 2 D Σ. 1,25 (OH) 2 D VDRR 1 Ca P PTH Uca 25D 1.25(OH) 2 D 25 (OH)D P, Ca

Ομοιόσταση ασβεστίου PTH Ca Ca, P FGF23 1,25 (OH) 2 D 25 (OH)D 24(OH)DEFIC Ca P PTH Uca 25D P, Ca 1.25(OH) 2 D 25(OH)/24,25(OH) > 80

Ομοιόσταση ασβεστίου Cancer-Related Ca P PTH Uca 25D 1.25(OH) 2 D FGF23 PTH Ca Ca, P 1,25 (OH) 2 D 25 (OH)D P, Ca

Ομοιόσταση ασβεστίου PTH Ca Ιστορικό -Κλινική εικόνα Ca, P Cancer-Related Ca P Βαρύτητα PTH FGF23 Uca 25D 1.25(OH) 2 D Ταχύτητα εγκατάστασης 1,25 (OH) 2 D Ιεραρχία οργάνων-συστημάτων 25 (OH)D P, Ca

Biochemical Markers HbA 1 c (Diabetes Mellitus) Tg (follow-up of Differentiated thyroid Cancer) CT (medullary thyroid cancer)

ΔBS (m/y) = Ac.f (/y) (W.Th - E.De) (m)

Role of bone remodeling Calcium and phosphate homeostasis Damage repair

Biochemical Markers of Bone Turnover BTM are enzymes found in bone cells and constituents of the bone matrix that are released into the circulation during bone turnover. They are not specific for a disease or a specific skeletal cite Markers of Bone Formation BSAP Osteocalcin PINP PICP Novel markers Sclerostin Dkk-1 FGF23 Periostin sfrp S1P Markers of Bone Resorption CTX CTX-MMP NTX TRACP5b Cathepsin-K

Table 1: Available laboratory test for bone turnover markers (BTM). (The nomenclature is based on recommendations of the Committee of Scientific Advisors of the International Osteoporosis Foundation). BTM Abbreviation Tissue of origin Analytical method Sample type/storage Bone formation markers Osteocalcin OC Bone, platelets Serum/ <-80 o C Undercarboxylated osteocalcin ucoc Total osteocalcin Total OC RIA, IRMA, ELISA, CLIA ECLIA Total alkaline phosphatase Total ALP Bone, liver, other sources Colorimetric activity Bone alkaline phosphatase Bone ALP bone Electrophoresis, IRMA, CLIA ELISA Procollagen type I N propeptide PINP Bone, soft tissue, skin Serum, plasma/<- 20 o C Serum, plasma/<- 20 o C Intact procollagen type I N propeptide Intact PINP ECLIA Serum, plasma/<- 20 o C Monomer of procollagen type I N mon PINP propeptide Total procollagen type I N propeptide Total PINP CLIA Serum, plasma/<- 20 o C Procollagen type I C propeptide PICP Bone soft tissue, skin RIA ELISA Serum, plasma/<- 20 o C Levels influenced Renal function, hemolysis Liver function Liver function Liver function Liver function Liver function Comment Synthesized by osteoblasts. Many immunoreactive forms exist in blood Intact [OC(1 49)] + N-mid fragment [OC(1 43)] Some commercial assays recognize both intact and large N-Mid osteocalcin fragments with equal affinity while other detect only intact OC. Synthesized by osteoblasts Specific product of proliferating osteoblasts and fibroblasts. Partly incorporated into bone extracellular matrix. Also called N-terminal extension peptide of type I collagen Refers to the trimmer of two pro-α1 chains and one pro-α2 chain Thought to be a single pro-α1 chain Monomer + trimmer Small circadian rhythms Specific product of proliferating osteoblasts and fibroblasts. Small circadian rhythms Tournis ΤΟΥΡΝΗΣ S, Makris Σ. K. Reference Module in Biomedical Science 2017, in press

Bone resorption markers Deoxypyridinoline DPD Bone ELISA Urine/<-20 o C Circadian rhythms- UV light N-terminal cross-linking telopeptide of type I collagen NTX-I All tissues containing type I collagen Serum-NTX sntx ELISA Serum, or plasma/ <-20oc Liver function, circadian rhythms Urinary-NTX untx ELISA urine/ <-20oc Liver function, circadian rhythms C-terminal cross-linking telopeptide of type I collagen CTX-I All tissues containing type I collagen Serum-CTX sctx ELISA CLIA ECLIA Serum or plasma/ <-20oc Total or free. Must be adjusted to urinary Creatinine levels In publications concerning bone, the I can be omitted. Urinary levels must be adjusted to urinary Creatinine levels. In publications concerning bone, the I can be omitted. Liver /renal Measures the β (beta) isomerised unless otherwise specified function/food intake Urinary-CTX uctx ELISA urine/ <-20oc Circadian rhythms Measures the non-isomerised unless otherwise specified (some Immunoassays measure both). Urinary levels must be adjusted to urinary Creatinine levels. Osteoclastic enzymes Tartrate-resistant acid phosphatase TRACP5b Bone, blood ELISA, RIA, colorimetry Serumplasma/Up 2 years at <-80 o C Hemolysis, blood clotting, circadian rhythms Bone specific isoform of acid phosphatase secreted by osteoclast Cathepsin K Primarily in osteoclasts ELISA Commercial assays are not clear if they detect proenzyme or active form of enzyme or both. Major difficulty the very low levels in circulation degradation by other enzymes Osteocyte activity markers Osteoprotegerin OPG Secreted by osteoblasts ELISA Serum or plasma/<-70 o C up to six months Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B Ligand RANKL Produced by osteoblasts, activated by B and T cells ELISA Serum or plasma/<-70 o C up to six months Sclerostin SCL Secreted by osteocytes ELISA Serum or plasma/<-70 o C Dickkopf-related protein 1 DKK1 Produced by osteocytes ELISA Serum or plasma/<-70 o C Fibroblast Growth Factor 23 FGF23 Circulating factor predominately expressed in osteocytes ELISA Serum or plasma/<-70 o C up to six months Seasonal variation Is elevated in CKD One immunoassay recognizes the intact molecule of sclerostin while others measure fragments of sclerostin Assay needs standardization before introduction to clinical practice Two immunoassays exist. One is measuring the intact FGF molecule and the other the C-terminal molecule Tournis ΤΟΥΡΝΗΣ S, Makris Σ. K. Reference Module in Biomedical Science 2017, in press

Περιορισμοί χρήσης των ΒΔΟA στην κλινική πράξη Απουσία αξιόπιστων δεδομένων αναφορικά με τις φυσιολογικές τιμές Η μεταβλητότητα των δεικτών καθιστά δύσκολη την χρήση των δεδομένων των μελετών στον μεμονωμένο ασθενή Απουσία προγραμμάτων ποιοτικού ελέγχου

Study protocol for IFCC-IOF WG-SBMA for assessment of comparability between clinical laboratory CTx and PINP assays in postmenopausal patients presenting to an osteoporotic clinic Professor Etienne Cavalier, University of Liège, CHU Sart-Tilman, B- 4000 Liège, Belgium Dt Konstantinos Makris & Dr Symeon Tournis, Clinical Biochemistry Department & LRMS, KAT General Hospital, 14651, Athens, Greece Professor Richard Eastell, Metabolic Bone Centre, Northern General Hospital, Sheffield, UK. Professor Howard Morris, University of South Australia, Adelaide, Australia

ΜΕΤΑΒΛΗΤΟΤΗΤΑ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ Pre-analytical phase Technical ( collection, processing, storage) Biological (controllable, unconctrollable) Analytical phase Random error Systemic error (bias) Post-analytical phase RCV = 2 1/2 * Z * (CV 2 A + CV I2 ) 1/2 [ RCV: reference change value/least significance change, CV A is the analytical coefficient of variation, CV I = within subject biological variation]

If the CV for a PTH method is 6% and the laboratory has a bias of 2%, the total error for this method will be of z 6+2=11.9 % for z=1.65. In other words, if a PTH result provided by this lab is 65 pg/ml (the upper reference limit), there is 95 % of chance that if we repeat the measurement, the value will be anything from 57 to 73 pg/ml and a value measured in a patient could alternatively be considered as normal or elevated

Random error Systemic error Preanalytical (controllable) Postanalytical Variability around the setpoint

Βιολογική μεταβλητότητα βιοχημικών δεικτών οστικής εναλλαγής Ελεγχόμενους Μεταβολικά νοσήματα των οστών Νυχθημερινός ρυθμός Καταμμήνιος κύκλος Άσκηση Ακινητοποίηση Εποχή του έτους Μη ελεγχόμενους Ηλικία Φύλο Φυλή Πρόσφατο κάταγμα Εγκυμοσύνη Γαλουχία οστικής εναλλαγής οστική εναλλαγή Αποσύζευξη ΧΝΝ Φάρμακα Στεροειδή Αντιοστεοκλαστικά Αντιεπιληπτικά Αντιπηκτικά Αναστολείς αρωματάσης Γλιταζόνες

Νυχθημερινός ρυθμός δεικτών οστικής απορρόφησης Wickers M, Clin Chem 1999; 45:1858-60. Christgau S, Clin Chem 2000;46:431

Diagnosis of osteoporosis Prediction of Bone loss Fracture prediction Selection of treatment Monitoring End-point D BMD (%) End-point fracture Compliance Adverse effects Drug development New treatments Clinical use of BTM

Rapid Bone Loss LSC of BTM and BMD. Different rate of bone loss at different sites Cut-off of high bone turnover? Different rate of bone loss during follow-up

P1NP CTX

uντχ ARR:4% NNT:25 ARR:7.1% NNT:15 ARR:7.1% NNT:16 ARR:8.3% NNT:13 Papapoulos S, Makras P. Nat Clin ΤΟΥΡΝΗΣ Pract Endocrinol Σ. Metab. 2008 Sep;4(9):514-23

Treatment Selection Antifracture efficacy of current treatments is independent of baseline bone turnover Its use identifies pts at higher fracture risk that might benefit more from the intervention.

On treatment BTM and antifracture efficacy Change in BMD Takes about 2 yrs Different between treatments (SERMS vs. BSP vs. Denosumab) LSC Different association with antifracture efficacy Change in BMT > LSC Earlier (3-6 months) Differ by drug, dose, mode of administration

Πρόγνωση της ανταπόκρισης της θεραπείας με αντικαταβολικούς παράγοντες Delmas PD. Osteoporos Int 2000;6:S66-76.

Effect of osteoporosis treatment on BTM

N Engl J Med 2004;350:1189-99.

N Engl J Med 2009;361:756-65.

Effect of teriparatide/pth on BTM Ann Intern Med. 2007;146:326-339. N Engl J Med 2007;357:2028-39.

Which is the optimal on treatment change of BTM? Absolute value % change from baseline Both > of LSC Different target level according to treatment? End point BMD Fracture Compliance Safety

sensitivity specificity Ideal marker False negative True positive True negative False positive

sensitivity specificity False negative True positive True negative False positive

Six and twelve month changes in bone turnover are related to reduction in vertebral fracture risk during 3 years of raloxifene treatment in postmenopausal osteoporosis. Bjarnason NH, et al. Osteoporos Int 2001;12:922-930 OC 9,3 ng/ml RR 0,69. BAP 5,91 ng/ml RR 0,75.

56% 38%

LSC/PRE MEAN Ctx:56%, 32 ng/l, PINP:38%, 28 μg/l

Beyond 5 years of BSP

Conclusions BTM could be useful for the prediction of fracture risk in untreated postmenopausal women Early reduction of BTM under antiresorptive treatment predicts increase in BMD, reduction in fracture risk and compliance. Early increase in PINP predicts an adequate response under teriparatide treatment. They might be useful to establish the optimal dose for new treatments or act as surrogate markers for fracture